分子抗原阵列
阅读：998发布：2021-07-06
专利汇可以提供分子抗原阵列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及分子 生物 学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种包含有序、重复的 抗原 或抗原决定簇阵列的组合物。本发明还提供一种产生呈有序、重复阵列的抗原或抗原决定簇的方法。有序、重复的抗原或抗原决定簇可用于生产 治疗 传染病、治疗变态反应的 疫苗 ，以及作为药物 预防 或治疗癌症，有效地诱发自身特异性免疫应答，特别是 抗体 应答。，下面是分子抗原阵列专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包含：
(a)一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种核心颗粒，和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接，所述核心颗粒是一种噬菌体 的含有重组蛋白或其片段的病毒样颗粒；
(b)一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
所述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
2.权利要求1的组合物，其中所述结合是通过至少一个共价键。
3.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基，所 述第二附着位点是半胱氨酸残基。
4.权利要求1的组合物，其中所述第二附着位点含有或是巯基或半 胱氨酸残基。
5.权利要求1的组合物，其中所述噬菌体是一种RNA噬菌体。
6.权利要求5的组合物，其中所述RNA噬菌体选自下组：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；和
(l)噬菌体PP7。
7.权利要求5的组合物，其中所述重组蛋白包含具有选自下组的氨 基酸序列的外壳蛋白：
a)SEQ ID NO：159的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：160的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：161的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：162的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：163的氨基酸序列；
f)SEQ ID NO：164的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：165的氨基酸序列；
h)SEQ ID NO：166的氨基酸序列；
i)SEQ ID NO：167的氨基酸序列；
j)SEQ ID NO：215的氨基酸序列；
k)SEQ ID NO：253的氨基酸序列；
l)SEQ ID NO：217和其突变体的氨基酸序列；和
m)SEQ ID NO：254的氨基酸序列。
8.权利要求5的组合物，其中所述重组蛋白包含突变型外壳蛋白。
9.权利要求8的组合物，其中所述突变型外壳蛋白已经通过置换除 去至少一个赖氨酸残基、或通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修 饰。
10.权利要求8的组合物，其中所述突变型外壳蛋白已经通过缺失 至少一个赖氨酸残基、或以插入的方式添加至少一个赖氨酸残基而被修 饰。
11.权利要求1的组合物，其中所述噬菌体是噬菌体Qβ。
12.权利要求1的组合物，其中所述噬菌体是噬菌体fr。
13.权利要求11的组合物，其中所述重组蛋白包含具有SEQ ID NO： 159的氨基酸序列的外壳蛋白，或者具有SEQ ID NO：159氨基酸序列的 外壳蛋白和具有SEQ ID NO：217或SEQ ID NO：217突变体的氨基酸序 列的外壳蛋白的混合物。
14.权利要求1的组合物，其中所述核心颗粒是基本由具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的外壳蛋白组成，或者基本由具有SEQ ID NO： 217或SEQ ID NO：217突变体的氨基酸序列的外壳蛋白和具有SEQ ID NO：159氨基酸序列的外壳蛋白的混合物组成的一种噬菌体Qβ病毒样 颗粒。
15.权利要求11的组合物，其中所述重组蛋白包含突变型Qβ外壳 蛋白。
16.权利要求15的组合物，其中所述突变型Qβ外壳蛋白已经通过 置换除去至少一个赖氨酸残基、或通过置换添加至少一个赖氨酸残基而 被修饰。
17.权利要求15的组合物，其中所述突变型外壳蛋白已经通过缺失 至少一个赖氨酸残基、或以插入的方式添加至少一个赖氨酸残基而被修 饰。
18.权利要求15的组合物，其中所述突变型Qβ外壳蛋白包含具有 选自下组的氨基酸序列的蛋白质：
a)SEQ ID NO：255的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：256的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：257的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：258的氨基酸序列；和
e)SEQ ID NO：259的氨基酸序列。
19.权利要求1的组合物，其中所述核心颗粒是基本由具有选自下 组之氨基酸序列的突变型Qβ外壳蛋白组成的噬菌体Qβ的病毒样颗粒：
a)SEQ ID NO：255的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：256的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：257的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：258的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：259的氨基酸序列；和
f)a)-e)之一与相应的A1蛋白的混合物。
20.权利要求11的组合物，其中所述形成体是所述噬菌体Qβ或所 述噬菌体fr的组成部分。
21.权利要求1的组合物，其中所述核心颗粒是由噬菌体重组蛋白 组成的一种病毒样颗粒。
22.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点和/或所述第二附 着位点包含：
(a)抗原和其抗体或抗体片段；
(b)生物素和亲和素；
(c)链霉亲和素和生物素；
(d)受体与其配体；
(e)配体结合蛋白与其配体；
(f)相互作用的亮氨酸拉链多肽；
(g)氨基和对其有反应性的化学基团；
(h)羧基和对其有反应性的化学基团；
(i)巯基和对其有反应性的化学基团；或
(j)它们的组合。
23.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，所述第 二附着位点是巯基。
24.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
25.权利要求1的组合物，其中所述第二附着位点不是所述抗原或 抗原决定簇中天然存在的。
26.权利要求25的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，所述第 二附着位点是巯基。
27.权利要求25的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
28.权利要求25的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
29.权利要求25的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
30.权利要求29的组合物，其中所述氨基酸接头与所述抗原或所述 抗原决定簇通过至少一个共价键结合。
31.权利要求29的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
32.权利要求31的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
33.权利要求31的组合物，其中所述氨基酸接头选自下组：
(a)CGG；
(b)N端γ1-接头；
(c)N端γ3-接头；
(d)Ig铰链区；
(e)N端甘氨酸接头；
(f)(G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；
(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；
(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；
(i)GGC；
(k)GGC-NH2；
(l)C端γ1-接头；
(m)C端γ3-接头；
(n)C端甘氨酸接头；
(o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；
(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；
(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2， o＝0-8。
34.权利要求1的组合物，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一种 自身抗原或其片段、一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片段。
35.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是一种选自下组的蛋 白质、肽或其片段：
a)淋巴毒素；
b)淋巴毒素受体；
c)RANKL；
d)VEGF；
e)VEGFR；
f)白介素-5；
g)白介素-17；
h)白介素-13；
i)血管紧张肽；
k)CCL21；
l)CXCL12；
m)SDF-1；
n)MCP-1；
o)Endoglin；
p)抵抗素；
q)GHRH；
r)LHRH；
s)TRH；
t)MIF；
u)嗜酸细胞活化趋化因子；
v)缓激肽；
w)BLC；
x)肿瘤坏死因子α(TNFα)；
y)淀粉样β肽(Aβ1-42)；和
z)人IgE。
36.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是一种血管紧张肽或 其片段。
37.权利要求36的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
38.权利要求36的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
39.权利要求36的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
40.权利要求39的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
41.权利要求40的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
42.权利要求36的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述血管 紧张肽具有选自下组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列CGGDRVYIHPF；
b)氨基酸序列CGGDRVYIHPFHL；
c)氨基酸序列DRVYIHPFHLGGC；和
d)氨基酸序列CDRVYIHPFHL。
43.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是一种人VEGFR-II 肽或其片段。
44.权利要求43的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
45.权利要求43的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
46.权利要求43的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
47.权利要求46的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
48.权利要求47的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
49.权利要求43的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述 VEGFR-II肽具有氨基酸序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK。
50.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是肿瘤坏死因子α (TNFα)或其片段或TNFα肽。
51.权利要求50的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
52.权利要求50的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
53.权利要求50的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
54.权利要求53的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
55.权利要求54的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
56.权利要求50的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述肿瘤 坏死因子α(TNFα)或其片段或TNFα肽具有选自下组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ；
b)氨基酸序列SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGC；和
c)氨基酸序列CGGQLQWLNRRANA。
57.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是抵抗素或其片段。
58.权利要求57的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
59.权利要求57的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
60.权利要求57的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
61.权利要求60的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
62.权利要求61的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
63.权利要求57的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述抵抗 素蛋白或其片段具有选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：325的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：326的氨基酸序列；和
c)SEQ ID NO：327的氨基酸序列。
64.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是选自下组的淋巴毒 素或其片段：
a)淋巴毒素α(LTα)
b)淋巴毒素β(LTβ)
c)LTα和LTβ的混合物或组合。
65.权利要求64的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
66.权利要求64的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
67.权利要求64的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
68.权利要求67的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
69.权利要求68的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
70.权利要求64的组合物，其中所述自身抗原是淋巴毒素β或其片 段，其中带有所述第二附着位点的所述淋巴毒素β具有选自下组的氨基 酸序列：
a)SEQ ID NO：346的氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO：347的氨基酸序列。
71.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是人MIF或其片段。
72.权利要求71的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
73.权利要求71的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基或 半胱氨酸残基。
74.权利要求71的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
75.权利要求74的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
76.权利要求75的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
77.权利要求71的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述人 MIF蛋白或其片段具有选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：310的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：311的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：312的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：313的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：314的氨基酸序列；和
f)SEQ ID NO：315的氨基酸序列。
78.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是人RANKL或其片 段。
79.权利要求34的组合物，其中所述自身抗原是人RANKL的胞外 域部分或其片段。
80.权利要求78或79的组合物，其中所述第二附着位点不是在所 述抗原或抗原决定簇中天然存在的。
81.权利要求78或79的组合物，其中所述第二附着位点包含或是 巯基或半胱氨酸残基。
82.权利要求78或79的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
83.权利要求82的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
84.权利要求83的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
85.权利要求78的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述人 RANKL或其片段具有SEQ ID NO：320或其片段的氨基酸序列。
86.权利要求39、46、53、60、67、74或82的组合物，其中所述 氨基酸接头选自下组：
(a)CGG；
(b)N端γ1-接头；
(c)N端γ3-接头；
(d)Ig铰链区；
(e)N端甘氨酸接头；
(f)(G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；
(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；
(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；
(i)GGC；
(k)GGC-NH2；
(l)C端γ1-接头；
(m)C端γ3-接头；
(n)C端甘氨酸接头；
(o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；
(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；
(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2， o＝0-8。
87.一种组合物，其包含：
(a)一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种选自下组的核心颗粒：
(1)一种非天然来源的核心颗粒，和
(2)一种天然来源的核心颗粒；和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接；
(b)一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇是一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片 段，所述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
88.权利要求87的组合物，其中所述结合是通过至少一个共价键。
89.权利要求87的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
90.权利要求87的组合物，其中所述核心颗粒选自：
i)一种病毒；
ii)一种病毒样颗粒；
iii)一种噬菌体；
iv)一种细菌菌毛；
v)一种病毒衣壳颗粒；和
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的重组形式。
91.权利要求87的组合物，其中所述核心颗粒选自：
i)一种病毒样颗粒；
ii)一种细菌菌毛；和
iii)一种RNA噬菌体的病毒样颗粒。
92.权利要求91的组合物，其中所述病毒样颗粒包含选自下列的重 组蛋白或其片段：
(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；
(b)麻疹病毒的重组蛋白；
(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；
(d)轮状病毒的重组蛋白；
(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；
(f)逆转录病毒的重组蛋白；
(g)诺沃克病毒的重组蛋白；
(h)甲病毒的重组蛋白；
(i)人乳头瘤病毒的重组蛋白；
(j)多瘤病毒的重组蛋白；
(k)噬菌体的重组蛋白；和
(l)RNA-噬菌体的重组蛋白；
(m)Qβ-噬菌体的重组蛋白；
(n)GA-噬菌体的重组蛋白；
(o)fr-噬菌体的重组蛋白；和
(β)Ty的重组蛋白。
93.权利要求91的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上由 一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。
94.权利要求91的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上由 一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，该噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；和
(l)噬菌体PP7。
95.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由噬菌体Qβ或噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
96.权利要求87的组合物，其中所述第二附着位点不是在所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
97.权利要求96的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
98.权利要求97的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第 二附着位点组成。
99.权利要求98的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或一 个半胱氨酸残基。
100.一种组合物，其包含：
(a)一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种选自下组的核心颗粒：
(1)一种非天然来源的核心颗粒，和
(2)一种天然来源的核心颗粒；和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接；
(b)一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇是一种自身抗原或其片段，所述第二附 着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
101.权利要求100的组合物，其中所述结合是通过至少一个共价键。
102.权利要求100的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
103.权利要求100的组合物，其中所述核心颗粒选自：
i)一种病毒；
ii)一种病毒样颗粒；
iii)一种噬菌体；
iv)一种细菌菌毛；
v)一种病毒衣壳颗粒；和
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的重组形式。
104.权利要求103的组合物，其中所述形成体是一种多肽或其残基， 所述第二附着位点是一种多肽或其残基。
105.权利要求100或103的组合物，其中所述核心颗粒是一种病毒 样颗粒。
106.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒是包含SEQ ID NO：158的氨基酸1-147的多肽的二聚体或多聚体。
107.权利要求106的组合物，其中所述病毒样颗粒是包含SEQ ID NO：158的氨基酸1-152的多肽的二聚体或多聚体。
108.权利要求105的组合物，其中所述第一附着位点包含或者是一 个氨基，第二附着位点包含或者是一个巯基。
109.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒是一种乙型肝炎 病毒衣壳蛋白。
110.权利要求109的组合物，其中所述第一附着位点包含或者是一 个赖氨酸残基，所述第二附着位点包含或者是一个半胱氨酸残基。
111.权利要求110的组合物，其中所述乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一 个或多个半胱氨酸残基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
112.权利要求110的组合物，其中所述乙型肝炎病毒衣壳蛋白包含 一种选自下列的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：89的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：90的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：93的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：98的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：99的氨基酸序列；
f)SEQ ID NO：102的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：104的氨基酸序列；
h)SEQ ID NO：105的氨基酸序列；
i)SEQ ID NO：106的氨基酸序列；
j)SEQ ID NO：119的氨基酸序列；
k)SEQ ID NO：120的氨基酸序列；
l)SEQ ID NO：123的氨基酸序列；
m)SEQ ID NO：125的氨基酸序列；
n)SEQ ID NO：131的氨基酸序列；
o)SEQ ID NO：132的氨基酸序列；
p)SEQ ID NO：134的氨基酸序列；
q)SEQ ID NO：157的氨基酸序列；和
r)SEQ ID NO：158的氨基酸序列。
113.权利要求112的组合物，其中所述乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一 个或多个半胱氨酸残基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
114.权利要求113的组合物，其中对应于SEQ ID NO：134的氨基 酸48和107的半胱氨酸残基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
115.权利要求112的组合物，其中所述乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一 个或多个赖氨酸残基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
116.权利要求100的组合物，其中所述核心颗粒是一种细菌菌毛。
117.权利要求116的组合物，其中所述细菌菌毛是大肠杆菌1型菌 毛。
118.权利要求117的组合物，其中所述1型菌毛的菌毛蛋白亚单位 包含SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列。
119.权利要求100的组合物，其中所述核心颗粒包含一种细菌菌毛 蛋白多肽。
120.权利要求119的组合物，其中所述细菌菌毛蛋白多肽包含SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列。
121.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒包含选自下列的 重组蛋白或其片段：
(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；
(b)麻疹病毒的重组蛋白；
(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；
(d)轮状病毒的重组蛋白；
(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；
(f)逆转录病毒的重组蛋白；
(g)诺沃克病毒的重组蛋白；
(h)甲病毒的重组蛋白；
(i)人乳头瘤病毒的重组蛋白；
(j)多瘤病毒的重组蛋白；
(k)噬菌体的重组蛋白；和
(l)RNA-噬菌体的重组蛋白；
(m)Qβ-噬菌体的重组蛋白；
(n)GA-噬菌体的重组蛋白；
(o)fr-噬菌体的重组蛋白；和
(p)Ty的重组蛋白。
122.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。
123.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，该噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；和
(l)噬菌体PP7。
124.权利要求105的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由噬菌体Qβ或噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
125.权利要求100的组合物，其中所述核心颗粒选自：
i)一种病毒样颗粒；
ii)一种细菌菌毛；和
iii)一种RNA噬菌体的病毒样颗粒。
126.权利要求105、109、112、116、122、123或124的组合物， 其中所述第二附着位点不在所述抗原或抗原决定簇内天然存在。
127.权利要求126的组合物，其中所述组合物包含一个氨基酸接头。
128.权利要求127的组合物，其中所述氨基酸接头与所述抗原或抗 原决定簇通过至少一个共价键结合。
129.权利要求128的组合物，其中所述共价键是一种肽键。
130.权利要求127的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述 第二附着位点组成。
131.权利要求130的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或 一个半胱氨酸残基。
132.权利要求130的组合物，其中所述氨基酸接头选自：
(a)CGG；
(b)N端γ1-接头；
(c)N端γ3-接头；
(d)Ig铰链区；
(e)N端甘氨酸接头；
(f)(G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；
(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；
(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；
(i)GGC；
(k)GGC-NH2；
(l)C端γ1-接头；
(m)C端γ3-接头；
(n)C端甘氨酸接头；
(o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；
(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；
(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2， o＝0-8。
133.权利要求100的组合物，其中所述自身抗原是一种选自下组的 蛋白质：
a)淋巴毒素；
b)淋巴毒素受体；
c)RANKL；
d)VEGF；
e)VEGFR；
f)白介素-5；
g)白介素-17；
h)白介素-13；
i)CCL21；
k)CXCL12；
l)SDF-1；
m)MCP-1；
n)抵抗素；
o)GHRH；
p)LHRH；
q)TRH；
r)MIF；
s)嗜酸细胞活化趋化因子；
t)BLC；
u)人IgE。
134.权利要求100的组合物，其中所述自身抗原是一种选自下组的 蛋白质、肽或其片段：
a)淋巴毒素；
b)淋巴毒素受体；
c)RANKL；
d)VEGF；
e)VEGFR；
f)白介素-5；
g)白介素-17；
h)白介素-13；
i)血管紧张肽；
k)CCL21；
l)CXCL12；
m)SDF-1；
n)MCP-1；
o)Endoglin；
p)抵抗素；
q)GHRH；
r)LHRH；
s)TRH；
t)MIF；
u)嗜酸细胞活化趋化因子；
v)缓激肽；
w)BLC；
x)肿瘤坏死因子α(TNFα)；
y)淀粉样β肽(Aβ1-42)；和
z)人IgE。
135.一种组合物，其包含：
(a)一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种选自下组的核心颗粒：
(1)一种非天然来源的核心颗粒，和
(2)一种天然来源的核心颗粒；和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接；其中所述核心颗粒是一种含 有噬菌体重组蛋白或其片段的病毒样颗粒；
(b)一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，
所述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
136.权利要求135的组合物，其中所述结合是通过至少一个共价键。
137.权利要求136的组合物，其中所述共价键是一种非肽键。
138.权利要求135的组合物，其中所述核心颗粒选自：
i)一种病毒；
ii)一种病毒样颗粒；
iii)一种噬菌体；
iv)一种细菌菌毛；
v)一种病毒衣壳颗粒；和
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的重组形式。
139.权利要求135的组合物，其中所述核心颗粒选自下组：
i)一种病毒样颗粒；
ii)一种细菌菌毛；和
iii)一种RNA噬菌体病毒样颗粒。
140.权利要求139的组合物，其中所述病毒样颗粒包含选自下列的 重组蛋白或其片段：
(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；
(b)麻疹病毒的重组蛋白；
(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；
(d)轮状病毒的重组蛋白；
(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；
(f)逆转录病毒的重组蛋白；
(g)诺沃克病毒的重组蛋白；
(h)甲病毒的重组蛋白；
(i)人乳头瘤病毒的重组蛋白；
(j)多瘤病毒的重组蛋白；
(k)噬菌体的重组蛋白；和
(l)RNA-噬菌体的重组蛋白；
(m)Qβ-噬菌体的重组蛋白；
(n)GA-噬菌体的重组蛋白；
(o)fr-噬菌体的重组蛋白；和
(p)Ty的重组蛋白。
141.权利要求139的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。
142.权利要求139的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由一种RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，该噬菌体选自：
(a)噬菌体Qβ；
(b)噬菌体R17；
(c)噬菌体fr；
(d)噬菌体GA；
(e)噬菌体SP；
(f)噬菌体MS2；
(g)噬菌体M11；
(h)噬菌体MX1；
(i)噬菌体NL95；
(k)噬菌体f2；和
(l)噬菌体PP7。
143.权利要求139的组合物，其中所述病毒样颗粒包含或者基本上 由噬菌体Qβ或噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
144.权利要求135的组合物，其中其中所述第一附着位点和/或所 述第二附着位点包含：
(k)抗原和其抗体或抗体片段；
(l)生物素和亲和素；
(m)链霉亲和素和生物素；
(n)受体与其配体；
(o)配体结合蛋白与其配体；
(p)相互作用的亮氨酸拉链多肽；
(q)氨基和对其有反应性的化学基团；
(r)羧基和对其有反应性的化学基团；
(s)巯基和对其有反应性的化学基团；或
(t)它们的组合。
145.权利要求135的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，所述 第二附着位点是巯基。
146.权利要求135的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
147.权利要求135的组合物，其中所述第二附着位点不是所述抗原 或抗原决定簇中天然存在的。
148.权利要求147的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，所述 第二附着位点是巯基。
149.权利要求147的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基， 所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
150.权利要求147的组合物，其中所述第二附着位点包含或是巯基 或半胱氨酸残基。
151.权利要求147的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头。
152.权利要求150的组合物，其中所述氨基酸接头与所述抗原或所 述抗原决定簇通过至少一个共价键结合。
152.权利要求151的组合物，其中所述氨基酸接头包含或者由所述 第二附着位点组成。
153.权利要求152的组合物，其中所述氨基酸接头包含一个巯基或 一个半胱氨酸残基。
154.权利要求152的组合物，其中所述氨基酸接头选自下组：
(a)CGG；
(b)N端γ1-接头；
(c)N端γ3-接头；
(d)Ig铰链区；
(e)N端甘氨酸接头；
(f)(G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；
(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；
(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；
(i)GGC；
(k)GGC-NH2；
(l)C端γ1-接头；
(m)C端γ3-接头；
(n)C端甘氨酸接头；
(o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；
(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；
(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2， o＝0-8。
155.权利要求135的组合物，其中所述抗原是一种选自下组的蛋白 质或其片段：
(a)适于诱发抗癌细胞的免疫应答的蛋白质；
(b)适于诱发抗传染病的免疫应答的蛋白质；
(c)适于诱发抗变应原的免疫应答的蛋白质；和
(d)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的蛋白质。
156.权利要求155的组合物，其中所述抗原是：
(a)HIV的重组蛋白，
(b)流感病毒的重组蛋白，
(c)丙型肝炎病毒的重组蛋白，
(d)弓形虫的重组蛋白，
(e)恶性疟原虫的重组蛋白，
(f)间日疟原虫的重组蛋白，
(g)卵形疟原虫的重组蛋白，
(h)三日疟原虫的重组蛋白，
(i)乳腺癌细胞的重组蛋白，
(j)肾癌细胞的重组蛋白，
(k)前列腺癌细胞的重组蛋白，
(l)皮肤癌细胞的重组蛋白，
(m)脑癌细胞的重组蛋白，
(n)白血病细胞的重组蛋白，
(o)重组抑制蛋白，
(p)蜂毒变态反应的重组蛋白，
(q)坚果变态反应的重组蛋白，
(r)食物变态反应的重组蛋白，
(s)哮喘的重组蛋白，或
(t)衣原体的重组蛋白。
157.权利要求135的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是一种选 自下组的肽、蛋白质或蛋白质片段：
(a)一种磷脂酶A2蛋白；
(b)一种人IgE；
(c)一种淋巴毒素；
(d)流感M2蛋白；和
(e)Der pI肽。
158.权利要求157的组合物，其中所述抗原和所述抗原决定簇是 Der pI肽或其片段。
159.权利要求158的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述 Der pI肽具有选自下组的氨基酸序列：
a)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH；和
b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA。
160.权利要求157的组合物，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一 种磷脂酶A2蛋白或其片段。
161.权利要求160的组合物，其中所述磷脂酶A2蛋白具有选自下 组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：168的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO：169的氨基酸序列；
c)SEQ ID NO：170的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：171的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：172的氨基酸序列；
f)SEQ ID NO：173的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：174的氨基酸序列；和
h)SEQ ID NO：175的氨基酸序列。
162.权利要求157的组合物，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一 种人IgE或其片段。
163.权利要求162的组合物，其中人IgE具有SEQ ID NO：176的 氨基酸序列。
164.权利要求163的组合物，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一 种流感M2蛋白或其片段。
165.一种组合物，其含有已通过共价键与选自噬菌体外壳蛋白、细 菌菌毛、HbcAg和其片段的一种蛋白质连接的流感M2蛋白或其片段。
166.权利要求165的组合物，其中所述蛋白质是一种噬菌体外壳蛋 白或其片段。
167.权利要求165的组合物，其中所述蛋白是一种细菌菌毛。
168.权利要求165的组合物，其中所述蛋白质是HbcAg，所述共 价键不是肽键。
169.权利要求165的组合物，其中如果所述蛋白质是噬菌体外壳蛋 白或其片段、细菌菌毛或其片段，则所述共价键为非肽键。
170.权利要求165的组合物，其中如果所述蛋白质是噬菌体外壳蛋 白或其片段、或是细菌菌毛或其片段，则所述共价键是肽键。
171.权利要求165的组合物，其中所述噬菌体外壳蛋白包含选自下 组的噬菌体的外壳蛋白：
a)噬菌体Qβ；
b)噬菌体R17；
c)噬菌体fr；
d)噬菌体GA；
e)噬菌体SP；
f)噬菌体MS2；
g)噬菌体M11；
h)噬菌体MX1；
i)噬菌体NL95；
k)噬菌体f2；和
l)噬菌体PP7。
172.权利要求171的组合物，其中所述噬菌体外壳蛋白包含噬菌体 Qβ。
173.一种药物组合物，其含有
a)权利要求1、87、100、135或165的组合物；和
b)可接受的药物载体。
174.一种免疫方法，包括给患者施用权利要求1、87、100、135 或165的组合物。
175.一种疫苗组合物，其包含权利要求1、87、100、135或165 的组合物。
176.权利要求160的疫苗组合物，其还含有佐剂。
177.一种生产非天然存在的、有序、重复的抗原阵列的方法，包括：
(a)提供一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种选自如下的核心颗粒：
(1)一种非天然来源的核心颗粒；和
(2)一种天然来源的核心颗粒；和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接；和
(b)提供一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，其 中所述抗原或抗原决定簇是一种自身抗原或其片段，所述第二附着位点 选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
(c)结合所述非天然分子支架和所述抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
178.权利要求177的方法，其中所述形成体是一种多肽或其残基， 所述第二附着位点是一种多肽或其残基。
179.权利要求177或178的方法，其中所述核心颗粒是一种病毒样 颗粒。
180.权利要求179的方法，其中所述核心颗粒是一种病毒样颗粒， 是包含SEQ ID NO：158的氨基酸1-147的多肽的二聚体或多聚体。
181.权利要求179的方法，其中所述病毒样颗粒是包含SEQ ID NO： 158的氨基酸1-152的多肽的二聚体或多聚体。
182.权利要求180的方法，其中所述多肽的一个或多个半胱氨酸残 基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
183.权利要求181的方法，其中对应于SEQ ID NO：134的氨基酸 48和107的半胱氨酸残基已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
184.权利要求182的方法，其中所述多肽的一个或多个赖氨酸残基 已经缺失或者被置换为另一种氨基酸残基。
185.权利要求177的方法，其中所述结合是通过至少一个共价键。
186.权利要求185的方法，其中所述共价键是一种非肽键。
187.一种生产非天然存在的、有序、重复的抗原阵列的方法，包括：
(a)提供一种非天然分子支架，其包含：
(i)一种核心颗粒；和
(ii)一种包含至少一个第一附着位点的形成体，其中所述形成体 与所述核心颗粒通过至少一个共价键连接；所述核心颗粒是一种含有噬 菌体重组蛋白或其片段的病毒样颗粒；
(b)提供一种含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇，所 述第二附着位点选自：
(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和
(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，
其中所述第二附着位点能够通过至少一个非肽键与所述第一附着位 点结合；和
(c)结合所述非天然分子支架和所述抗原或抗原决定簇，
其中所述抗原或抗原决定簇与所述支架通过所述结合相互作用，形 成一种有序、重复的抗原阵列。
188.权利要求187的组合物，其中所述结合是通过至少一个共价键。
189.权利要求188的组合物，其中所述共价键是一种非肽键。
190.一种能够形成衣壳的外壳蛋白，其含有具有选自下组的氨基酸 序列的突变型Qβ外壳蛋白：
a)氨基酸序列SEQ ID NO：255；
b)氨基酸序列SEQ ID NO：256；
c)氨基酸序列SEQ ID NO：257；
d)氨基酸序列SEQ ID NO：258；和
e)氨基酸序列SEQ ID NO：259。
191.权利要求190的外壳蛋白，其中它结合了至少一种抗原或抗原 决定簇。
192.一种能够形成衣壳的外壳蛋白，其基本由具有选自下组的氨基 酸序列的突变型Qβ外壳蛋白组成：
a)氨基酸序列SEQ ID NO：255；
b)氨基酸序列SEQ ID NO：256；
c)氨基酸序列SEQ ID NO：257；
d)氨基酸序列SEQ ID NO：258；
e)氨基酸序列SEQ ID NO：259；和
f)a)-e)之一与相应的A1蛋白的混合物。
193.权利要求192的外壳蛋白，其中它结合了至少一种抗原或抗原 决定簇。
194.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种淋巴毒 素蛋白、肽或其片段。
195.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种淋巴毒 素受体蛋白、肽或其片段。
196.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种RANKL 蛋白、肽或其片段。
197.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种VEGF 蛋白、肽或其片段。
198.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种VEGF-R 蛋白、肽或其片段。
199.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种白介素 5蛋白、肽或其片段。
200.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种白介素 17蛋白、肽或其片段。
201.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种白介素 13蛋白、肽或其片段。
202.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种血管紧 张肽的蛋白、肽或其片段。
203.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种CCL21 蛋白、肽或其片段。
204.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种CXCL12 蛋白、肽或其片段。
205.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种SDF-1 蛋白、肽或其片段。
206.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种MCP-1 蛋白、肽或其片段。
207.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种Endoglin 蛋白、肽或其片段。
208.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种抵抗素 蛋白、肽或其片段。
209.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种GHRH 蛋白、肽或其片段。
210.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种LHRH 蛋白、肽或其片段。
211.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种TRH 蛋白、肽或其片段。
212.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种MIF 蛋白、肽或其片段。
213.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种嗜酸细 胞活化趋化因子的蛋白、肽或其片段。
214.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种缓激肽 的蛋白、肽或其片段。
215.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种BLC 蛋白、肽或其片段。
216.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种肿瘤坏 死因子α(TNFα)蛋白、肽或其片段。
217.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种淀粉样 β肽(Aβ1-42)的蛋白、肽或其片段。
218.权利要求1或100的组合物，其中所述自身抗原是一种人IgE 的蛋白、肽或其片段。
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供 一种包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物。本发明还提供 一种产生呈有序、重复阵列的抗原或抗原决定簇的方法。有序、重复的 抗原或抗原决定簇可用于生产治疗传染病、治疗变态反应的疫苗，以及 作为药物预防或治疗癌症、有效地诱发自身特异性免疫应答，特别是抗 体应答。
背景技术
WO 003227描述了生产有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合 物和方法。这些组合物可用于生产预防传染病、治疗变态反应和治疗癌 症的疫苗。这些组合物包含一个核心颗粒，如病毒或病毒样颗粒，至少 一种抗原或抗原决定簇通过至少一种非肽键与之结合，产生有序、重复 的抗原阵列。
病毒样颗粒(VLP)由于其结构特征和非传染性，在疫苗生产领域 得到应用。VLP是由一种或多种类型的许多蛋白质分子以对称方式建立 的超分子结构。它们缺乏病毒基因组，因此没有传染性。VLP通常能通 过异源表达大量产生，且易于纯化。
VLP的例子包括：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182 (1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德 毕斯病毒、轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)、口蹄疫病毒 (Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺沃克病毒(Jiang X. 等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest. 87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白、逆转录病毒GAG蛋白(WO 96/30523)、逆转录转座子Ty蛋白p1、乙型肝炎病毒(WO 92/11291) 和人乳头瘤病毒(WO 98/15631)的表面蛋白。
由于免疫耐受，通常难以诱发针对自体分子的免疫应答。特别是， 如果通过常规接种策略触发，具有自体分子特异性的淋巴细胞通常是低 反应性的，甚至无反应性。
淀粉样B肽(Aβ1-42)在阿耳茨海默病的神经病理学中起主要作用。 Aβ肽的区域特异性的胞外积累伴随着小神经胶质增生、细胞骨架改变、 营养不良性神经炎和突触丢失。一般认为这些病理学改变与定义该疾病 的认知缺陷有关。
在一种阿耳茨海默病小鼠模型中，产生Aβ1-42的工程转基因动物 (PDAPP-小鼠)在脑中形成斑和神经元损伤。最近的研究表明，用Aβ1-42 免疫幼年PDAPP-小鼠可使斑形成和相关的营养不良性神经炎受到抑制 (Schenk，D.等人，Nature 400：173-77(1999))。
此外，免疫已经发生AD样神经病理学的PDAPP小鼠也可降低神经 病理学的程度和进展。这些研究的免疫方案如下：肽溶解于水缓冲液中， 与完全弗氏佐剂1∶1混合(初次剂量)，得到100μg/剂的肽浓度。之后的 加强用不完全弗氏佐剂。小鼠在11个月内接受11次免疫。达到并保持 了大于1∶10000的抗体效价。因此，免疫可能是阿耳茨海默病的一种有 效的预防和治疗方法。
在另一项研究中，外周施用的抗Aβ1-42抗体能够穿过血脑屏障，结 合Aβ肽，诱导清除已经存在的淀粉样蛋白(Bard，F等人，Nature Medicine 6：916-19(2000))。该研究采用抗Aβ1-42的多克隆抗体，或抗来源于 Aβ不同区的合成片段的单克隆抗体。因此，抗体的诱导可以认为是阿耳 茨海默病的一种可能的治疗方法。
已经确定，单独施用纯化的蛋白质通常不足以引起强免疫应答；分 离的抗原一般必须与被称为佐剂的辅助物质结合。佐剂保护施用的抗原 免于快速降解，而且佐剂可以使得长时间内释放低水平的抗原。
如前所述，阿耳茨海默病(AD)的重要事件之一是淀粉样蛋白沉积 为不可溶的纤维块(淀粉样蛋白产生)，在大脑血管壁周围形成胞外神 经炎斑和沉积物(综述见Selkoe，D.J.(1999)Nature 399，A23-31)。神 经炎斑和亲刚果红(congophilic)血管病的主要成分是淀粉样蛋白β (Aβ)，尽管这些沉积物也含有其它蛋白质，如糖胺聚糖和载脂蛋白。 Aβ是从一种被称为淀粉样前体蛋白(APP)的大糖蛋白上蛋白水解切割 下来的，它包含695-770个氨基酸的同种型，具有一个疏水性跨膜区。 Aβ形成一组长度最高达43个氨基酸的肽，它们显示相当大的氨基端和 羧基端异质性(截短)以及修饰(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.& Ball， M.J.(1998)J.Cell Biol.107，2703-2716；Roher，A.E.，Palmer，K.C.， Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.& Greeberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61， 1916-1926)。主要的同种型是Aβ1-40和1-42。它高度倾向于形成可聚 集为原纤维的β折叠，最终产生淀粉样蛋白。最近的研究证实，接种诱 发的脑淀粉样沉积物减少导致认知能力提高(Schenk，D.，Barbour，R.， Dunn，W.，Gordon，G.，Grajeda，H.，Guido，T.，Hu，K.，Huang，J.， Johnson-Wood，K.，Khan，K.等人(1999)Nature 400，173-177)。
我们惊奇地发现，存在于高度有序、重复阵列中的自体分子或自身 抗原能够有效地诱发自体特异性免疫应答，特别是抗体应答。而且，甚 至在没有非特异性激活抗原递呈细胞和其它免疫细胞的佐剂时，也能诱 发这种应答。
发明概述
本发明提供包含高度有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物， 及其生产方法和用途。因此，本发明的组合物可用于生产预防传染性疾 病、治疗变态反应和癌症、有效诱发自体特异性免疫应答、特别是抗体 应答的疫苗。
第一方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1) 非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；(ii)包含至少一 个第一附着位点的形成体(organizer)，其中该形成体与该核心颗粒通过 至少一个共价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种自身抗原或其片段， 具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非 天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。 通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发明提 供一种有序、重复的自身抗原阵列。因此，通过第一附着位点与第二附 着位点的结合，自身抗原或自身抗原决定簇与非天然分子支架结合在一 起，形成一种有序、重复的抗原阵列。
第二方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒和(ii)包含至少 一个第一附着位点的形成体，其中该核心颗粒是一种病毒样颗粒，包含 一种噬菌体的重组蛋白或其片段，其中该形成体与该核心颗粒通过至少 一个共价键连接。该抗原或抗原决定簇具有至少一个第二附着位点，该 位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；(ii)该抗 原或抗原决定簇天然存在的附着位点。通过第二附着位点与第一附着位 点经由至少一个非肽键结合，本发明提供一种有序、重复的抗原阵列。
第三方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1) 非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和(ii)具有至少 一个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗粒通过至少一个 共价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种淀粉样β肽(Aβ1-42)或其片段， 具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非 天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。 通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发明提 供一种有序、重复的抗原阵列。
第四方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天然 分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1)非 天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和(ii)具有至少一 个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗粒通过至少一个共 价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片 段，具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定 簇非天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位 点。通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发 明提供一种有序、重复的抗原阵列。
在下文中，特别是通过发明详述、实施例和权利要求书，本发明的 其它方面以及优选实施方案和优点将更加明显。
在本发明的一个优选实施方案中，核心颗粒是一种包含RNA-噬菌 体重组蛋白的病毒样颗粒，这种蛋白优选地选自：a)噬菌体Qβ；b)噬 菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2； g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1) 噬菌体PP7。最优选的是噬菌体Qβ和噬菌体fr。
在本发明的另一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的重组蛋白包括野 生型外壳蛋白。
在本发明的又一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的重组蛋白包括突 变的外壳蛋白。
在另一个实施方案中，核心颗粒包含或由一种或多种不同的肝炎核 心(衣壳)蛋白(HBcAg)组成。在一个相关实施方案中，这些HBcAg 的一个或多个半胱氨酸残基缺失，或被置换为另一种氨基酸残基(例如 丝氨酸残基)。在一个具体实施方案中，用来制备本发明的组合物的 HBcAg的半胱氨酸残基(对应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基48和 107)缺失，或被置换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
此外，用来制备本发明组合物的HBcAg变体通常是保持与其它 HBcAg结合的能力的变体，它们能形成二聚体或多聚体结构，呈现有序、 重复的抗原或抗原决定簇阵列。
在另一个实施方案中，非天然分子支架包含或由下列成分组成：由 菌毛蛋白产生的或从细菌中收获的菌毛或菌毛样结构。当利用菌毛或菌 毛样结构制备本发明的组合物时，它们可以由细菌细胞中天然存在的、 但是通过遗传工程(例如通过同源重组)修饰的菌毛蛋白基因或导入这 些细胞中的菌毛蛋白基因的产物组成。
在一个相关实施方案中，核心颗粒包含或由下列成分组成：由菌毛 蛋白制备的或从细菌中收获的菌毛或菌毛样结构。这些核心颗粒可以由 细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因的产物组成。
在一个特别实施方案中，形成体可包含至少一个第一附着位点。第 一和第二附着位点是本发明组合物的特别重要的元件。在本发明的不同 实施方案中，第一和/或第二附着位点可以是抗原和其抗体或抗体片段； 生物素和亲和素(avidin)；链霉亲和素和生物素；受体与其配体；配体结 合蛋白与其配体；相互作用的亮氨酸拉链多肽；氨基和对其有反应性的 化学基团；羧基和对其有反应性的化学基团；巯基和对其有反应性的化 学基团；或它们的组合。
在另一个优选的实施方案中，该组合物还包含一个氨基酸接头。该 氨基酸接头优选地包含或由第二附着位点组成。第二附着位点分别介导 抗原与核心颗粒的定向且有序的缔合和结合。氨基酸接头的一个重要功 能是进一步确保第二附着位点的适当展示和可接近性，从而促进抗原与 核心颗粒的结合，特别是通过化学交联结合。氨基酸接头的另一个重要 特性是进一步确保第二附着位点的最佳可接近性，特别是反应性。氨基 酸接头的这些特性对于蛋白质抗原来说更重要。
在另一个优选实施方案中，氨基酸接头选自：(a)CGG；(b)N端 γ1-接头；(c)N端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N端甘氨酸接头；(f) (G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；(h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；(i)GGC；(k) GGC-NH2；(1)C端γ1-接头；(m)C端γ3-接头；(n)C端甘氨酸接头； (o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；(q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
甘氨酸接头和甘氨酸丝氨酸接头的一个重要特性是其柔性，特别是 其结构柔性，这允许形成多种构象，不倾向于折叠为可阻止第二附着位 点可接近性的结构。因为甘氨酸接头和甘氨酸丝氨酸接头不含或只含数 量有限的侧链残基，它们与抗原广泛相互作用的倾向小，从而进一步确 保第二附着位点的可接近性。甘氨酸丝氨酸接头内的丝氨酸残基使这些 接头的溶解度提高。因此，本发明的内容中也包括将一个或两个氨基酸， 特别是极性或带电氨基酸残基，串联或分开插入甘氨酸或甘氨酸丝氨酸 接头中。
在又一个优选的实施方案中，氨基酸接头是GGC-NH2、GGC-NMe、 GGC-N(Me)2、GGC-NHET或GGC-N(Et)2，其中GGC半胱氨酸残基的 C端被酰胺化。特别是对于肽抗原，尤其是具有第二附着位点的抗原或 抗原决定簇包含Aβ肽或其片段的实施方案中，优选这些氨基酸接头。 特别优选的是GGC-NH2。在另一个实施方案中，氨基酸接头是一种免 疫球蛋白(Ig)铰链区。Ig铰链区的片段以及用甘氨酸残基修饰的Ig铰 链区也属于本发明的范围内。优选地，Ig铰链区只含一个半胱氨酸残基。 应当理解，Ig铰链区氨基酸接头的该单一半胱氨酸残基可位于接头序列 内的几个位点处，本领域技术人员在本发明指导下将知道如何选择它 们。
在一个实施方案中，本发明提供将几乎所有选择的抗原与病毒、细 菌菌毛、细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒或病毒衣壳颗 粒表面偶联的方法。为了产生针对所展示的抗原的高效免疫应答，即接 种，本发明通过使一种抗原形成准晶体“病毒样”结构，利用宿主的强烈 抗病毒免疫反应。
在另一个实施方案中，抗原可以选自：(1)适于诱发抗癌细胞免疫 应答的蛋白质；(2)适于诱发抗传染病免疫应答的蛋白质；(3)适于诱 发抗变应原免疫应答的蛋白质；(4)适于诱发强抗自身抗原应答的蛋白 质；和(5)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的蛋白质。在另一个实 施方案中，第一附着位点和/或第二附着位点选自：(1)遗传工程赖氨酸 残基和(2)遗传工程半胱氨酸残基，这两种残基可以通过化学方法连 接在一起。
在又一个优选的实施方案中，第一附着位点包含或者是一个氨基， 第二附着位点包含或者是一个巯基。优选地，第一附着位点包含或者是 一个赖氨酸残基，而第二附着位点包含或者是一个半胱氨酸残基。
本发明也包括如下的实施方案：形成体颗粒只有一个第一附着位点， 抗原或抗原决定簇只有一个第二附着位点。因此，当用这种实施方案制 备有序、重复的抗原阵列时，每个形成体将与一个抗原或抗原决定簇结 合。
另一方面，本发明提供包含或由下列成分组成的组合物：(a)一种 非天然分子支架，其包含：(i)一种核心颗粒，其选自非天然来源的核 心颗粒和天然来源的核心颗粒；(ii)包含至少一个第一附着位点的形成 体，其中该核心颗粒包含或由下列成分组成：病毒样颗粒、细菌菌毛、 菌毛样结构或修饰的HBcAg或其片段，而该形成体与该核心颗粒通过 至少一个共价键连接；(b)具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决 定簇，该第二附着位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非天然存在的附 着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中第二附着 位点能够通过至少一个非肽键与第一附着位点结合，而抗原或抗原决定 簇与支架通过结合相互作用，形成一种有序、重复的抗原阵列。
本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法和应用此处 所述疫苗组合物的医学治疗方法。
应当理解，以上的概述和下面的详述都只是代表性和说明性的，旨 在进一步说明如权利要求所限定的本发明。
另一方面，本发明提供一种组合物，它包含通过共价键与磷脂酶A2 蛋白或其片段连接的噬菌体Qβ外壳蛋白。在一个优选实施方案中，磷 脂酶A2蛋白或其片段与噬菌体Qβ外壳蛋白通过共价键相互作用，形成 一种有序、重复的抗原阵列。在另一个优选实施方案中，该共价键不是 肽键。在另一个优选实施方案中，磷脂酶A2蛋白包含选自下列的氨基酸： SEQ ID NO：168的氨基酸序列、SEQ ID NO：169的氨基酸序列、SEQ ID NO：170的氨基酸序列、SEQ ID NO：171的氨基酸序列、SEQ ID NO： 172的氨基酸序列、SEQ ID NO：173的氨基酸序列、SEQ ID NO：174 的氨基酸序列和SEQ ID NO：175的氨基酸序列。
本发明也提供一种生产该组合物的方法，包括将噬菌体Qβ外壳蛋白 与磷脂酶A2蛋白组合，其中噬菌体Qβ外壳蛋白与磷脂酶A2蛋白相互 作用，形成一种抗原阵列。
另一方面，本发明也提供一种组合物，其包含一种含有噬菌体Qβ 外壳蛋白的非天然分子支架，和一种含有至少一个第一附着位点的形成 体，其中该形成体与噬菌体Qβ外壳蛋白通过至少一个共价键连接；和 具有至少一个第二附着位点的磷脂酶A2蛋白或其片段或其变体，该第二 附着位点选自：磷脂酶A2蛋白或其片段非天然存在的附着位点；磷脂酶 A2蛋白或其片段天然存在的附着位点，其中该第二附着位点与第一附着 位点通过至少一个非肽键结合，而抗原或抗原决定簇与支架通过这种结 合相互作用，形成一种有序、重复的抗原阵列。在一个优选实施方案中， 磷脂酶A2蛋白包含选自下列的氨基酸：SEQ ID NO：168的氨基酸序列、 SEQ ID NO：169的氨基酸序列、SEQ ID NO：170的氨基酸序列、SEQ ID NO：171的氨基酸序列、SEQ ID NO：172的氨基酸序列、SEQ ID NO： 173的氨基酸序列、SEQ ID NO：174的氨基酸序列和SEQ ID NO：175 的氨基酸序列。
本发明也提供一种生产该组合物的方法，包括将噬菌体Qβ外壳蛋白 与磷脂酶A2蛋白组合，其中噬菌体Qβ外壳蛋白与磷脂酶A2蛋白相互 作用，形成一种抗原阵列。该抗原阵列优选地是有序和/或重复的。
本发明也提供一种药物组合物，其包含磷脂酶A2蛋白和一种药物可 接受的载体。本发明也提供一种包含磷脂酶A2蛋白的疫苗组合物。在一 个优选实施方案中，权利要求31的疫苗组合物还包含至少一种佐剂。
本发明也提供一种治疗蜂毒引起的变态反应的方法，包括对患者施 用所述药物组合物或疫苗组合物。这种施用的结果是，患者显示对蜂毒 的免疫应答降低。
本发明也涉及一种疫苗，它通过诱导抗淋巴毒素β、抗淋巴毒素α或 抗淋巴毒素β受体抗体，用来预防朊病毒介导的疾病。该疫苗含有对于 被免疫的人或动物而言外源的蛋白质载体，该载体与淋巴毒素β或其片 段、淋巴毒素α或其片段或淋巴毒素β受体或其片段偶联。给人或动物注 射该疫苗，以便诱导对内源淋巴毒素β、淋巴毒素α或淋巴毒素β受体特 异的抗体。诱导的抗淋巴毒素β、淋巴毒素α或抗淋巴毒素β受体抗体减 少或清除了淋巴器官中存在的滤泡状树突细胞库。由于在没有滤泡状树 突细胞的情况下，朊病毒在淋巴器官中的复制以及向中枢神经系统的转 运受到影响，这种治疗抑制了朊病毒介导的疾病的发展。另外，阻断淋 巴毒素β对自身免疫病(如I型糖尿病)患者有益。
附图简述
图1A-1C：用于表达本发明抗原的模块真核表达载体；
图2A-2C：抵抗素的克隆、表达以及与Qβ衣壳蛋白的偶联；
图3A-3B：为了与病毒样颗粒和菌毛偶联，淋巴毒素β构建体的克隆 和表达。
图4A-4B：MIF构建体的克隆、表达以及与Qβ衣壳蛋白的偶联。
图4C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF蛋白免疫的小鼠血清中， MIF特异的IgG抗体的ELISA分析。
图5：通过SDS-PAGE分析的，MIF构建体与fr衣壳蛋白以及与 HBcAg-lys-2Cys-Mut衣壳蛋白的偶联。
图6：人C-RANKL的克隆与表达。
图7：朊病毒蛋白的克隆与表达。
图8A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio I”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio II”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio III”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8D：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio IV”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图9A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der pI肽免疫的小鼠血清中， “Der pI p52”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图9B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der pI肽免疫的小鼠血清中， “Der pI p117”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图10A：在利用与I型菌毛蛋白偶联的人VEGFR II肽和人VEGFR II 胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II肽特异的IgG抗体的ELISA分 析。
图10B：在利用与I型菌毛蛋白偶联的人VEGFR II肽和人VEGFR II 胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II胞外域特异的IgG抗体的ELISA 分析。
图11：在对全长HBc-TNF免疫的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特异 的IgG抗体的ELISA分析。
图12：在利用与3’TNF II肽偶联的2cysLys-mut HBcAgl-149免疫 的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特异的IgG抗体的ELISA分析。
图13A：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13B：“Aβ33-42”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13C：“Aβ1-27”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13D：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂Sulfo-GMBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图13E：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂Sulfo-MBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图14A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-15”免疫的小鼠血清中， “Aβ1-15”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图14B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”免疫的小鼠血清中， “Aβ1-27”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图14C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ33-42”免疫的小鼠血清中， “Aβ33-42”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图15A：pCC2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图15B：pCA2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图15C：pCB2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图16：朊病毒肽与Qβ衣壳蛋白的偶联；SDS-PAGE分析。
图17A：IL-5在细菌中表达的SDS-PAGE分析。
图17B：IL-5和IL-13在真核细胞中表达的Western-Blot分析。
图18A：鼠VEGFR-2肽与菌毛偶联的SDS-PAGE分析。
图18B：鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图18C：鼠VEGFR-2肽与HBcAg-lys-2cys-Mut偶联的SDS-PAGE 分析。
图18D：在利用与菌毛偶联的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血清中，鼠 VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图18E：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血 清中，鼠VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图18F：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut偶联的鼠VEGFR-2肽免疫 的小鼠血清中，鼠VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图19A：Aβ1-15肽与HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣壳蛋白偶联的 SDS-PAGE分析。
图19B：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut或fr衣壳蛋白偶联的Aβ1-15 肽免疫的小鼠血清中，Aβ1-15特异的IgG抗体的ELISA分析。
图20：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的人Aβ肽免疫的转基因APP23 小鼠血清中，人Aβ特异的IgG抗体的ELISA分析。
图21：Fab抗体片段与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图22A：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂sulfo GMBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图22B：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂sulfo MBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图22C：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图22D：PLA2-cys蛋白与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联 的SDS-PAGE分析。
图23：利用与突变Qβ衣壳蛋白和fr衣壳偶联的M2肽免疫的ELISA 分析。
图24：DER p1，2肽与突变Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图25A：利用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2对过敏小鼠的脱敏：温 度测量。
图25B：利用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2-cys对过敏小鼠的脱敏： IgG 2A和IgE效价。
图26：PLA2-cys与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析和 Western-blot分析。
图27A：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut、Qβ衣壳蛋白、fr衣壳蛋白、 HBcAg-lys-1-183偶联的M2肽和与HBcAg 1-183融合的M2肽免疫的小 鼠血清中，M2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图28A：抗独特型IgE mimobody VAE051与Qβ衣壳蛋白偶联的 SDS-PAGE分析。
图28B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的VAE051免疫的小鼠血清中， 抗独特型抗体VAE051和人IgE特异的Ig抗体的ELISA分析。
发明详述
1.定义
甲病毒：如此处所用的，术语“甲病毒”是指甲病毒属所包括的所有 RNA病毒。Strauss和Strauss，Microbiol.Rev.，58：491-562(1994)中描 述了该属的成员。甲病毒的例子包括：奥拉病毒、比巴鲁病毒、犰狳病 毒、屈曲病毒、东方马脑炎病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、克泽拉格齐 病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎博病毒、恩杜姆病毒、皮克孙 纳病毒、托纳特病毒、特里尼蒂病毒、乌纳病毒、西方马脑炎病毒、沃 达罗河病毒、辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞 拉马脑炎病毒(VEE)和罗斯河病毒。
抗原：如此处所用的，术语“抗原”是能够被抗体结合的分子。抗原 还能诱发体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-淋巴细胞和/或T-淋 巴细胞的产生。抗原可能含有一种或多种表位(B-表位和T-表位)。上 述特异反应的含义是，抗原将以高度选择性的方式与其相应抗体反应， 而不与其它抗原诱导产生的多数其它抗体反应。
抗原决定簇：如此处所用的，术语“抗原决定簇”是指被B-淋巴细胞 或T-淋巴细胞特异识别的抗原部分。B-淋巴细胞通过产生抗体对外源抗 原决定簇起反应，而T-淋巴细胞是细胞免疫的介体。因此，抗原决定簇 或表位是被抗体识别的抗原部分，或者对于MHC而言，是被T细胞受 体识别的抗原部分。
结合：如此处所用的，当用于第一和第二附着位点时，术语“结合” 是指至少一个非肽键。结合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极 性的或它们的任何组合。
第一附着位点：如此处所用的，短语“第一附着位点”是指“形成体” 的一个元件，它本身以非随机方式与核心颗粒结合，位于抗原或抗原决 定簇上的第二附着位点可以与它结合。第一附着位点可以是蛋白质、多 肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化 合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰 氟)或其组合，或其化学反应性基团。在重复构型中，非天然分子支架 表面上存在多个第一附着位点。
第二附着位点：如此处所用的，短语“第二附着位点”是指与抗原或 抗原决定簇有关的一种元件，位于非天然分子支架表面上的“形成体”的 第一附着位点可以与之结合。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是 蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或 化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺 酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少 一个第二附着位点。因此，术语“含有至少一个第二附着位点的抗原或抗 原决定簇”是指至少包含抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗 原结构。然而，尤其是对于非天然存在于抗原或抗原决定簇内的第二附 着位点，这些抗原或抗原结构包含一种“氨基酸接头”。这种氨基酸接头， 或者在本说明书中也称为“接头”，可结合抗原或抗原决定簇和第二附着 位点，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，一般但不是必 须-是一个氨基酸残基，优选地是半胱氨酸残基。然而，如此处所用的 术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成， 尽管由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨 基酸接头中的氨基酸残基优选地由本领域公知的天然存在的氨基酸或 非天然氨基酸组成，均为L型或均为D型或是其混合物。然而，本发明 也包括含有带巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。这种分子优选 地包含C1-C6烷基-、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。抗原或抗 原决定簇或任选地第二附着位点优选地通过至少一个共价键与氨基酸 接头结合，更优选地通过至少一个肽键结合。
结合的：如此处所用的，术语“结合的”是指结合或附着，其可以是 共价的，例如化学偶联，或是非共价的，例如离子相互作用、疏水作用、 氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳 -硫键、碳-磷键等。术语“结合的”比例如“偶联的”、“融合的”和“附着的” 等术语更加广义，并且包括后者。
核心颗粒：如此处所用的，术语“核心颗粒”是指具有固有的重复组 织的刚性结构，它为“形成体”的附着提供基础。如此处所用的核心颗粒 可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
外壳蛋白：如此处所用的，术语“外壳蛋白”是指能参加噬菌体或 RNA-噬菌体衣壳装配的噬菌体或RNA-噬菌体的蛋白质。然而，当指 RNA-噬菌体外壳蛋白基因的特定基因产物时，使用术语“CP”。例如， RNA-噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物被称作“Qβ CP”，而噬 菌体Qβ的“外壳蛋白”包括“Qβ CP”以及A1蛋白。
顺式作用：如此处所用的，术语“顺式作用”序列是指复制酶与之结 合从而催化RNA分子的RNA依赖性复制的核酸序列。这些复制事件导 致全长和部分RNA分子复制，因此，甲病毒亚基因组启动子也是一种“顺 式作用”序列。顺式作用序列可以位于或靠近核酸分子的5’端、3’端或两 端，以及内部。
融合：如此处所用的，术语“融合”是指通过其编码核苷酸序列的阅 读框内组合不同来源的氨基酸序列组合在一条多肽链中。术语“融合”除 了与其末端之一融合之外，显然还包括内部融合，即不同来源的序列插 入多肽链内。
异源序列：如此处所用的，术语“异源序列”是指本发明载体中存在 的第二核苷酸序列。术语“异源序列”也指本发明的载体中包含的异源 DNA序列编码的任何氨基酸或RNA序列。异源核苷酸序列能编码通常 在含有该序列的细胞类型中表达的蛋白质或RNA分子，或在其中通常 不表达的分子(例如辛德毕斯结构蛋白)。
分离的：如此处所用的，当术语“分离的”用于分子时，该术语的含 义是，该分子已经从它的天然环境中移出。例如，活动物中自然存在的 多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与自然状态的共存物质分离的同一多 核苷酸或多肽是“分离的”。此外，对于本发明而言，载体中包含的重组 DNA分子被认为是分离的。分离的RNA分子包括DNA和RNA分子的 体内或体外RNA复制产物。分离的核酸分子还包括合成产生的分子。 另外，重组宿主细胞中包含的载体分子也是分离的。因此，不是所有“分 离的”分子都需要“纯化”。
免疫治疗剂：如此处所用的，术语“免疫治疗剂”是用于治疗疾病或 紊乱的组合物。更具体而言，该术语用来指变态反应的治疗方法或癌症 的治疗方法。
个体：如此处所用的，术语“个体”是指多细胞生物，包括植物和动 物。优选的多细胞生物是动物，更优选的是脊椎动物，更加优选的是哺 乳动物，最优选的是人。
低或不可检测的：如此处所用的，当用于基因表达水平时，短语“低 或不可检测的”是指表达水平显著低于该基因最大诱导时所见(例如，至 少低5倍)，或者通过下列实施例部分使用的方法不易检测到。
凝集素：如此处所用的，是指尤其从豆科植物的种子中，以及从其 它多种植物和动物来源获得的蛋白质，它们含有特定单糖或寡糖的结合 部位。例子包括伴刀豆球蛋白A和麦芽凝集素，它们在糖蛋白研究中广 泛用作分析和制备的试剂。
模拟位：如此处所用的，术语“模拟位”是指可诱发对抗原或抗原决 定簇的免疫应答的物质。术语模拟位一般用于特定抗原。例如，激发抗 磷脂酶A2(PLA2)抗体产生的肽是抗原决定簇的一种模拟位，该抗体 能与之结合。模拟位与其诱发的免疫应答所针对的抗原或抗原决定簇可 能有或者可能没有实质性结构相似性，或者共有或不共有结构特征。生 成和鉴定可诱发针对特定抗原或抗原决定簇之免疫应答的模拟位的方 法在本领域中公知，并在本文的其它部分描述。
天然来源：如此处所用的，术语“天然来源”的含义是其整体或部分 都不是合成的，而是天然存在或产生的。
非天然的：如此处所用的，该术语通常指不是来自自然的，更具体 而言，该术语是指来自人工的。
非天然来源：如此处所用的，术语“非天然来源”通常是指合成的或 者不是来自自然的，更具体而言，该术语是指来自人工的。
非天然分子支架：如此处所用的，短语“非天然分子支架”是指人工 制备的、可以用来产生第一附着位点的刚性、重复阵列的任何产物。理 想地但不是必须地，这些第一附着位点具有几何顺序。非天然分子支架 部分地或者整体上可以是有机或无机的，可以是化学合成的或通过生物 学方法合成的。非天然分子支架的组成为：(a)一种核心颗粒，是天然 或非天然来源的；和(b)一种形成体，其本身包含至少一个第一附着 位点，并与核心颗粒通过至少一个共价键连接。在一个特别实施方案中， 非天然分子支架可以是病毒、病毒样颗粒、细菌菌毛、病毒衣壳颗粒、 噬菌体、其重组形式，或合成颗粒。
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列：如此处所用的，术语“有序、 重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的一种重复 模式，其特征在于抗原或抗原决定簇相对于非天然分子支架均匀地空间 排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。 合适的有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的例子是那些具有抗原或抗 原决定簇以5-15纳米间隔严格重复的次晶顺序的阵列。
形成体：如此处所用的，术语“形成体”是指以非随机方式与核心颗 粒结合的一种元件，它为产生有序、重复的抗原阵列提供成核位点。形 成体是包含至少一个第一附着位点的任何元件，它通过至少一个共价键 与核心颗粒结合。形成体可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸(即蛋白质、 多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或 化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺 酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。因此，形成体进一步确保形成 本发明的有序、重复的抗原阵列。在本发明的典型实施方案中，核心颗 粒例如通过遗传工程或化学反应修饰，产生包含核心颗粒和形成体的非 天然分子支架，其中形成体通过至少一个共价键与核心颗粒连接。然而 在本发明的某些实施方案中，选择的形成体为核心颗粒的一部分。因此， 对于这些实施方案，产生包含核心颗粒和形成体的非天然分子支架以及 确保形成有序、重复的抗原阵列不一定需要修饰核心颗粒。
许可温度：如此处所用的，短语“许可温度”是指一种酶具有相对高 水平的催化活性时的温度。
菌毛：如此处所用的，术语“菌毛”(单数为pilus)是指由蛋白质单 体(例如菌毛蛋白单体)组成的细菌细胞的胞外结构，它们是以有序、 重复的模式组织的。而且，菌毛是参与以下过程的结构：例如细菌细胞 与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的 例子包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。下文描述 了菌毛的其它例子。
菌毛样结构：如此处所用的，短语“菌毛样结构”是指具有类似于菌 毛的特征并且由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个例子是表 达修饰菌毛蛋白的细菌细胞形成的一种结构，该菌毛蛋白不形成与天然 菌毛基本相同的有序、重复的阵列。
多肽：如此处所用的，术语“多肽”是指由氨基酸残基，通常是天然 氨基酸残基，通过肽键连接在一起组成的聚合物。尽管多肽不必限制其 大小，但是术语多肽通常用于大小约为10-50个氨基酸的肽。
蛋白质：如此处所用的，术语蛋白质是指大小一般为20个以上、尤 其是50个以上氨基酸残基的多肽。蛋白质一般具有确定的三维结构， 尽管它们不一定必须如此，通常称为折叠的，相反，通常不具有确定的 三维结构、而是采取大量不同构象的肽和多肽，称为非折叠的。蛋白质 的确定的三维结构对于核心颗粒与抗原之间的结合特别重要，这种结合 由第二附着位点介导，特别是利用化学交联剂通过第一与第二附着位点 之间的化学交联。在本发明的某些方面，氨基酸接头也与蛋白质的结构 特征密切相关。
纯化的：如此处所用的，当术语“纯化的”用于一种分子时，它的含 义是被纯化的该分子相对于自然环境中与它结合的分子浓度提高。自然 结合的分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖，但一般不包括为了保持完整 性或有利于分子纯化而添加的水、缓冲液和试剂。例如，在oligo dT柱 层析中，即使mRNA用水溶剂稀释，如果自然结合的核酸和其它生物分 子不与该柱结合并与目的mRNA分子分离，则该mRNA分子通过这种 层析被纯化。
受体：如此处所用的，术语“受体”是指能与被称为配体的另一种分 子相互作用的蛋白质或糖蛋白或其片段。配体可属于任何类别的生物化 学或化学化合物。受体不一定必须是膜结合蛋白。可溶性蛋白，例如麦 芽糖结合蛋白或视黄醇结合蛋白，也是受体。
残基：如此处所用的，术语“残基”的含义是多肽骨架或侧链中的特 定氨基酸。
重组宿主细胞：如此处所用的，术语“重组宿主细胞”是指已经导入 一种或多种本发明的核酸分子的宿主细胞。
重组病毒：如此处所用的，短语“重组病毒”是指人工遗传修饰的病 毒。该短语包括本领域公知的所有病毒。更具体而言，该短语是指人工 遗传修饰的甲病毒，最具体而言，该短语是指人工遗传修饰的辛德毕斯 病毒。
限制性温度：如此处所用的，短语“限制性温度”是指一种酶具有水 平较低或不可检测的催化活性时的温度。“热”和“冷”敏感性突变体均周 知，因此，限制性温度可高于或低于许可温度。
RNA依赖性RNA复制事件：如此处所用的，短语“RNA依赖性RNA 复制事件”是指用一种RNA分子作为模板导致一种RNA分子形成的过 程。
RNA依赖性RNA聚合酶：如此处所用的，短语“RNA依赖性RNA 聚合酶”是指催化由一种RNA分子产生另一种RNA分子的聚合酶。该 术语在此与术语“复制酶”同义。
RNA-噬菌体：如此处所用的，术语“RNA-噬菌体”是指感染细菌的 RNA病毒，优选地是指感染细菌的单链正义RNA病毒。
自身抗原：如此处所用的，术语“自身抗原”是指由宿主的DNA编码 的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物定义为自身的。 另外，两种或几种自体分子组合产生的蛋白质或是自体分子的一部分的 蛋白质，以及与上述自体分子具有高同源性(＞95％)的蛋白质，也可以 被认为是自身的。
温度敏感的：如此处所用的，短语“温度敏感的”是指一种酶，它在 一种温度下容易催化一种反应，但在另一种温度下催化同一反应较慢或 者根本不能催化。温度敏感酶的一个例子是pCYTts载体编码的复制酶 蛋白，在低于34℃的温度下它具有容易检测到的复制酶活性，在37℃ 时活性较低或检测不到。
转录：如此处所用的，术语“转录”是指在RNA聚合酶催化下，由 DNA模板产生RNA分子。
非翻译RNA：如此处所用的，短语“非翻译RNA”是指一种RNA序 列或分子，它不编码一种开放阅读框，或者编码一种开放阅读框或其部 分但为一种无法产生氨基酸序列的形式(例如不含起始密码子)。这类 分子的例子有tRNA分子、rRNA分子和核酶。
载体：如此处所用的，术语“载体”是指用来将遗传物质转移到宿主 细胞中的试剂(例如质粒或病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。
病毒样颗粒：如此处所用的，术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病 毒颗粒的结构。而且，本发明的病毒样颗粒是非复制型和非传染性的， 因为它缺乏所有或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制和感染成 分。本发明的病毒样颗粒可含有不同于其基因组的核酸。
噬菌体的病毒样颗粒：如此处所用的，术语“噬菌体的病毒样颗粒” 是指一种类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，是非复制型和非传染性的， 至少缺乏编码噬菌体复制机器的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或 进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括这样的噬菌体的病毒样 颗粒，其中上述基因仍然存在但是失活，因此，也产生非复制型和非传 染性的噬菌体病毒样颗粒。
病毒颗粒：如此处所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。 在某些病毒类型中，病毒颗粒包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的 具有附加的结构(例如被膜、尾等)。
一个：当本公开内容中使用术语“一个”(“one”，“a”，“an”)时，除 非另外说明，其含义是“至少一个”或“一个或多个”。
2.有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物及其制备方法
本发明提供包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物。此 外，本发明能使技术人员方便地构建有序、重复的抗原或抗原决定簇阵 列，用于不同的治疗目的，包括传染病的预防、变态反应的治疗和癌症 的治疗。
本发明的组合物基本包含或者由下列两种元件组成：(1)一种非天 然分子支架；和(2)一种抗原或抗原决定簇，它含有至少一个第二附 着位点，该位点能通过至少一个非肽键与第一附着位点结合。
本发明的组合物也包含或者由下列成分组成：直接连接了抗原或抗 原决定簇的细菌菌毛蛋白。
这种非天然分子支架包含或者由下列元件组成：(a)一种核心颗粒， 其选自：(1)非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和 (b)至少包含一个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗 粒通过至少一个共价键连接。
本发明的组合物也包含或者由下列成分组成：直接连接了抗原或抗 原决定簇的核心颗粒。
该抗原或抗原决定簇含有至少一个第二附着位点，该位点选自：(a) 该抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；(b)该抗原或抗原决定簇 天然存在的附着位点。
通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发 明提供一种有序、重复的抗原阵列。因此，通过第一附着位点与第二附 着位点的这种结合，抗原或抗原决定簇与非天然分子支架结合在一起， 形成一种有序、重复的抗原阵列。
技术人员可以特别设计抗原或抗原决定簇和第二附着位点，使得与 非天然分子支架-或者在某些实施方案中与核心颗粒-结合的所有抗原或 抗原决定簇的排列是均一的。例如，可以将单一的第二附着位点置于抗 原或抗原决定簇的羧基端或氨基端，从而通过设计确保与非天然分子支 架附着的所有抗原或抗原决定簇分子都以统一的方式定位。因此，本发 明提供了一种以形成重复模式的方式将任何抗原或抗原决定簇以确定 的顺序置于非天然分子支架上的便利方法。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技 术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白在 原核和真核细胞中的表达，等等。这些方法是本领域技术人员周知的， 在出版的实验室方法手册中可以方便地查到(例如：Sambrook，J.等人编 写的《分子克隆：实验室手册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分 子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。采用组织培养细 胞系进行研究的基本实验室技术(Celis，J.编写的《细胞生物学》， Academic Press，第2版，(1998))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane， D.，《抗体：实验室手册》；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，《酶学方法》， 128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，“蛋白质纯化原理 与实践”，第3版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有充 分描述，这些文献均在此引用作为参考。
A.核心颗粒和非天然分子支架
本发明的某些组合物的一种元件是一种非天然分子支架，其包含或 者由一种核心颗粒和一种形成体组成。如此处所用的，短语“非天然分子 支架”是指可以用来提供第一附着位点的刚性、重复阵列的任何人工生产 的产物。更具体而言，非天然分子支架包含或由下列元件组成：(a)一 种核心颗粒，其选自：(1)非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的 核心颗粒；和(b)包含至少一个第一附着位点的形成体，其中该形成 体与该核心颗粒通过至少一个共价键连接。
本领域技术人员容易认识到，本发明非天然分子支架的核心颗粒不 限于任何特定形式。核心颗粒可以是有机或无机的，可以是化学合成或 通过生物学方法合成的。
在一个实施方案中，非天然核心颗粒可以是一种合成的聚合物、脂 微团或金属。这种核心颗粒是本领域周知的，为建立本发明的新型非天 然分子支架提供基础。例如，美国专利号5,770,380描述了合成聚合物 或金属核心颗粒，公开了与多个肽环连接的calixarene有机支架在生产 “拟抗体”中的用途，美国专利号5,334,394描述了用作病毒诱饵的纳米晶 体颗粒，它由多种无机材料组成，包括金属或陶瓷。合适的金属包括铬、 铷、铁、锌、硒、镍、金、银、铂。该实施方案中合适的陶瓷材料包括 二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化钌和氧化锡。该实施方案的核心颗 粒可以由包括碳(金刚石)在内的有机物制成。合适的聚合物包括聚苯 乙烯、尼龙和硝化纤维素。对于这种类型的纳米晶体颗粒，也可以使用 由氧化锡、二氧化钛或碳(金刚石)制成的颗粒。脂微团可以用本领域 周知的任何方法制备。例如，微团可以通过下列方法制备：Baiselle和 Millar(Biophys.Chem.4：355-361(1975))或Corti等人(Chem.Phys. Lipids 38：197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426：314-318(1998)) 或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.213：29-35(1999))或 Morein等人(Nature 308：457-460(1984))的方法，这些文献均在此 引用作为参考。
核心颗粒也可以通过生物学方法生产，可以是天然的或非天然的。 例如，这种实施方案可以包括一种包含或者由病毒、病毒样颗粒、细菌 菌毛、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式组成的核心颗粒。在一个更 具体的实施方案中，核心颗粒可以包含或者由下列成分组成：轮状病毒 的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、形成细菌菌 毛或菌毛样结构的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重 组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白(例如HBcAg)、烟草花叶病毒的重 组蛋白、禽兽棚病毒的重组蛋白和人乳头瘤病毒的重组蛋白。核心颗粒 还可包含或由下列成分组成：这些蛋白质的一个或多个片段，以及这些 蛋白质的变体，它们保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或抗原决定 簇阵列的能力。
如下文更详细地说明的，保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或 抗原决定簇阵列的能力的蛋白质变体与它们的野生型对应物在氨基酸 水平上可能有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。 以含有SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的HBcAg为例说明，本发明包 括含有HBcAg多肽的疫苗组合物，该HBcAg多肽包含或者由下列成分 组成：与SEQ ID NO：89所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列，和必要时加工除去N端前导序列的蛋白 质形式。这些变体通常能够结合形成二聚体或多聚体结构。能用来确定 蛋白质是否形成这种结构的方法包括凝胶过滤、琼脂糖凝胶电泳、蔗糖 梯度离心和电子显微镜术(例如：Koschel，M.等人，J.Virol 73：2153-2160 (1999))。
保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列能力的蛋 白质片段可以包含或由下列多肽组成：长度为15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190或200个氨基酸的多肽。这类蛋白质片 段的例子包括此处所述的适于制备核心颗粒和/或非天然分子支架的蛋 白质片段。
无论是天然的还是非天然的，本发明的核心颗粒通常具有一种形成 体，它通过至少一个共价键与天然或非天然核心颗粒连接。该形成体是 一种以非随机方式与核心颗粒结合的元件，为产生有序、重复的抗原阵 列提供核化位点。理想地，但不是必需的，该形成体与核心颗粒以几何 顺序结合。该形成体至少包含一个第一附着位点。
在本发明的一些实施方案中，有序、重复的阵列通过(1)核心颗粒 或非天然分子支架与(2)(a)一种抗原或抗原决定簇或(b)一种或多 种抗原或抗原决定簇之间的结合而形成。例如，细菌菌毛或菌毛样结构 由组织成有序、重复结构的蛋白质组成。因此，在许多情况下，通过将 这些成分与细菌菌毛或菌毛样结构直接连接或通过一种形成体连接，能 形成抗原或抗原决定簇的有序阵列。
如前所述，形成体可以是包含至少一个第一附着位点的任何元件， 它通过至少一个共价键与核心颗粒结合。形成体可以是蛋白质、多肽、 肽、氨基酸(即蛋白质、多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合 成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒 苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。在一 个更具体的实施方案中，形成体可包含第一附着位点，包括：抗原、抗 体或抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、 配体结合蛋白、相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、对氨基有反应性的 化学基团、羧基、对羧基有反应性的化学基团、巯基、对巯基有反应性 的化学基团，或它们的组合。
在一个实施方案中，非天然分子支架的核心颗粒包含一种病毒、细 菌菌毛、由细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳 颗粒或其重组形式。可以选择本领域周知的具有有序且重复的外壳和/ 或核心蛋白结构的任何病毒作为本发明的非天然分子支架。合适的病毒 的例子包括：辛德毕斯病毒和其它甲病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎 病毒)、小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)、披膜病毒(例 如风疹病毒)、正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、禽瘟病毒)、 多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、鸟多瘤病毒BFDV)、细 小病毒、轮状病毒、噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体M11、噬菌体MX1、 噬菌体NL95、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2、噬菌 体f2、噬菌体PP7、诺沃克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎 病毒、烟草花叶病毒、禽兽棚病毒和人乳头瘤病毒(例如，参见Bachman， M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17：553-558(1996)中的表1)。
在一个实施方案中，本发明利用病毒的基因工程产生有序、重复的 病毒被膜蛋白与包含所选择的异源蛋白质、肽、抗原决定簇或反应性氨 基酸残基的形成体的融合体。在非天然分子支架的构建中可以包括本领 域技术人员周知的其它遗传操作；例如，可希望通过遗传突变限制重组 病毒的复制能力。选择用于与形成体(即第一附着位点)蛋白融合的病 毒蛋白应当具有组织的、重复的结构。这种组织的、重复的结构包括在 病毒表面上间隔5-15nm的次晶组织。这种融合蛋白的产生将在病毒表 面产生多个有序、重复的形成体。因此，由此产生的第一附着位点的有 序、重复组织反映天然病毒蛋白的正常结构。
如将在本说明书中更详细地描述的，在本发明的另一个实施方案中， 非天然分子支架是一种重组甲病毒，更具体而言，是一种重组辛德毕斯 病毒。甲病毒是正链RNA病毒，在感染细胞的细胞质中完整地复制其 基因组RNA，而没有DNA中间产物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol. Rev.58：491-562(1994))。甲病毒家族的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong， C.等人，Science 243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol. 11：18-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestr_m，P.& Garoff， H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等 人，Virology 171：189-204(1989))，作为多种不同蛋白质的基于病 毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8：578-582(1997)； Liljestr_m，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))以及作为研 制疫苗的候选物，已经受到极大的关注。最近，颁布了一些关于甲病毒 在异源蛋白质表达和疫苗研制中应用的专利(参见美国专利号 5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。本发明的 甲病毒支架的构建可以利用重组DNA技术领域周知的方法进行，如上 述文章所述，在此引用作为参考。
能够利用多种不同的重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒，用于 抗原或抗原决定簇附着。例如，已知甲病毒具有广泛的宿主范围；辛德 毕斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞、以及某些昆 虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51：645(1973)；Leake，C.，J.Gen. Virol.35：335(1977)；Stollar，V.，《披膜病毒》，R.W.Schlesinger编， Academic Press，(1980)，583-621页)。因此，在本发明的实施过程中可 使用大量重组宿主细胞。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO细胞特别适 于生产异源蛋白质，因为它们具有以类似于人类细胞的方式糖基化异源 蛋白质的能力(Watson，E.等人，Glycobiology 4：227，(1994))，并且能 够被选择(Zang，M.等人，Bio/Technology 13：389(1995))或遗传改造 (Renner W.等人，Biotech.Bioeng.4：476(1995)；Lee K.等人，Biotech. Bioeng.50：336(1996))以在无血清培养基及悬液中生长。
向宿主细胞中导入多核苷酸载体能够利用标准实验室手册所述的方 法完成(参见，例如：Sambrook，J.等人编写的《(分子克隆：实验室手册》， 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)，第9章；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如电穿孔、DEAE-葡聚糖 介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂介导的转染、转导、刮刀载入、 冲击导入、感染等方法。Felgner，P.等人的美国专利5,580,859描述了向 宿主细胞中导入外源DNA序列的方法。
也可以用包装的RNA序列感染宿主细胞。通过将这些包装的RNA 序列添加到培养基中，能将它们导入宿主细胞中。例如，多篇文献资料 中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括“辛德毕斯病毒表达系统”， C版(Invitrogen目录号K750-1)。
当采用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒 时，这些细胞通常在组织培养物中生长。在培养物中培养细胞的方法在 本领域众是周知的(参见，例如：Celis，J.编写的《细胞生物学》，Academic Press，第2版，(1998)；Sambrook，J.等人编写的《(分子克隆：实验室手 册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞的培养》，Alan R.Liss，Inc. (1983))。
本领域技术人员可以理解，第一附着位点可以是能使选择的抗原或 抗原决定簇与非天然分子支架特异结合的任何合适的蛋白质、多肽、糖、 多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合， 或是它们的一部分。在一个实施方案中，附着位点是可选自本领域周知 范围的蛋白质或肽。例如，第一附着位点可选自：配体、受体、凝集素、 亲和素、链霉亲和素、生物素、表位如HA或T7标签、Myc、Max、免 疫球蛋白域和本领域公知的能作为第一附着位点的其它任何氨基酸序 列。
本领域技术人员还应当理解，在本发明的另一个实施方案中，可以 在构建用于与衣壳蛋白框内融合的形成体(即蛋白质或多肽)时附带产 生第一附着位点。例如，一种蛋白质可以用于与被膜蛋白融合，该被膜 蛋白具有已知以特定方式糖基化的氨基酸序列，添加的糖部分于是可以 通过与作为抗原第二附着位点的凝集素结合，作为病毒支架的第一附着 位点。此外，形成体序列可以在体内生物素化，生物素部分可以作为本 发明的第一附着位点，或者可以对形成体序列进行不同氨基酸残基的体 外化学修饰，这种修饰作为第一附着位点。
在本发明的另一个实施方案中，选择与乙型肝炎衣壳(核心)蛋白 (HBcAg)框内融合的JUN-FOS亮氨酸拉链蛋白域作为第一附着位点。 然而，本领域所有人员都应当清楚，为了使第一附着位点位于本发明的 非天然分子支架内，可以在融合蛋白构建体中使用其它病毒衣壳蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，选择与HBcAg框内融合的赖氨酸或 半胱氨酸残基作为第一附着位点。然而，本领域所有人员都应当清楚， 为了使第一附着位点位于本发明的非天然分子支架内，可以在融合蛋白 构建体中使用其它病毒衣壳蛋白或病毒样颗粒。
用于第一附着位点的JUN氨基酸序列如下： CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(SEQ ID NO： 59)
在这种情况下，抗原上预期的第二附着位点是FOS亮氨酸拉链蛋白 域，其氨基酸序列如下： CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(SEQ ID NO： 60)
这些序列来源于转录因子JUN和FOS，侧翼均为一条在两端含有半 胱氨酸残基的短序列。已知这些序列能够彼此相互作用。最初假定的 JUN-FOS二聚体的结构是，一个单体的疏水侧链与另一个单体的相应侧 链以类似于拉链的方式交错(Landschulz等人，Science 240：1759-1764 (1988))。然而，已经证明这种假设是错误的，已知这些蛋白质形成一 种α-螺旋形卷曲螺旋(O’Shea等人，Science 243：538-542(1989)；O’Shea 等人，Cell 68：699-708(1992)；Cohen & Parry，Trends Biochem.Sci.11： 245-248(1986))。因此，更多的是由于历史的原因而不是结构上的原因， 术语“亮氨酸拉链”通常用来指这些蛋白质域。在本专利中，术语“亮氨酸 拉链”是指上述序列或者与上述之一基本上类似的序列。术语JUN和FOS 用于指各自的亮氨酸拉链域，而不是完整的JUN和FOS蛋白。
如前所述，本发明包括基于病毒的核心颗粒，其包含或由病毒、病 毒样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式组成。技术人员知道如 何生产这种核心颗粒并与形成体附着。WO 00/32227的实施例17-22公 开了作为核心颗粒的乙型肝炎病毒样颗粒和麻疹病毒衣壳颗粒的生产， 在此引用作为参考。在这些实施方案中，JUN亮氨酸拉链蛋白域或FOS 亮氨酸拉链蛋白域可以作为本发明的非天然分子支架的形成体，从而作 为第一附着位点。
实施例23-29详细描述了生产携带含反应性赖氨酸残基的框内融合 肽的乙型肝炎核心颗粒和携带遗传融合的半胱氨酸残基的抗原，分别作 为第一和第二附着位点。
在其它实施方案中，本发明的组合物采用的核心颗粒由乙型肝炎衣 壳(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或者能形成有序阵列的其它 蛋白质或肽组成，它们经修饰后去除了游离半胱氨酸残基或减少了它们 的数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，去除天然 存在的半胱氨酸残基的修饰的HBcAg保留了结合并形成多聚体结构的 能力。因此，适用于本发明的组合物的核心颗粒包括含有修饰HBcAg 或其片段的核心颗粒，其中一个或多个天然存在的半胱氨酸残基缺失或 者被置换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的一种蛋白质。 已经鉴定了HBcAg的多种同种型。例如，含有SEQ ID NO：132所示氨 基酸序列的HBcAg蛋白的长度为183个氨基酸，是通过加工212个氨 基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。这种加工导致从乙型肝炎核 心抗原前体蛋白的N端除去29个氨基酸。类似地，含有SEQ ID NO： 134所示氨基酸序列的HBcAg蛋白长度为185个氨基酸，是通过加工 214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。与SEQ ID NO：132 所示的氨基酸序列相比，SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列在SEQ ID NO：134的位点152和153处含有一个两氨基酸的插入。
在大多数情况中，本发明的疫苗组合物用HBcAg的加工后形式(即 已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列(例如SEQ ID NO： 134所示的前29个氨基酸残基)的HBcAg)制备。
此外，在不发生加工的条件下生产HBcAg时，HBcAg通常以“加工 后的”形式表达。例如，细菌系统，如大肠杆菌，一般不除去通常在真核 细胞中表达的蛋白质的前导序列，也被称为“信号肽”。因此，当利用大 肠杆菌表达系统产生本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含 乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的形式。
在本发明的一个实施方案中，利用含有SEQ ID NO：134所示氨基 酸序列的修饰HBcAg或其部分制备非天然分子支架。具体而言，适于 实施本发明的修饰HBcAg包括如下蛋白质：其中在对应于含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的蛋白质的位点48、61、107和185的位点处， 一个或多个半胱氨酸残基缺失或被置换为其它氨基酸残基(例如丝氨酸 残基)。本领域技术人员可以认识到，在氨基酸序列与SEQ ID NO：134 所示不同的HBcAg变体的相似位置处，半胱氨酸残基也可以缺失或被 置换为其它氨基酸残基。然后可利用这种修饰的HBcAg变体制备本发 明的疫苗组合物。
本发明也包括如下修饰的HBcAg变体，它们缺失或置换一个或多个 在含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的多肽中不存在的其它半胱氨 酸残基。这种HBcAg变体的例子含有SEQ ID NO：90和132所示的氨 基酸序列。这些变体在对应于SEQ ID NO：134氨基酸残基147的位点 处含有半胱氨酸残基。因此，本发明的疫苗组合物包括含有如下HBcAg 的组合物，其中SEQ ID NO：134所示氨基酸序列中不存在的半胱氨酸 残基已经删除。
在某些情况下(例如当使用异双功能交联剂使抗原或抗原决定簇附 着于非天然分子支架时)，据信HBcAg中存在游离半胱氨酸残基导致毒 性成分与核心颗粒共价偶联，以及单体交联形成不确定的形式。
另外，在许多情况下，对本发明的组合物进行测定可能无法检测出 这些毒性成分。这是因为毒性成分与非天然分子支架的共价偶联将导致 不同种产物的形成，其中毒性成分与HBcAg的不同半胱氨酸残基连接， 或者在某些情况下不含半胱氨酸残基。换句话说，每个HBcAg的每个 游离半胱氨酸残基不与毒性成分共价连接。此外，在许多情况下，特定 HBcAg的半胱氨酸残基都不与毒性成分连接。因此，可能难以检测这些 毒性成分的存在，因为它们存在于混合分子群体中。然而，对个体施用 含有毒性成分的HBcAg种可能导致可能十分严重的不利反应。
本领域公知，游离半胱氨酸残基能够参与多种化学副反应。这些副 反应包括：二硫化物交换，在与其它物质的联合治疗中与(例如)注射 或形成的化学物质或代谢物反应，或者直接氧化，以及在暴露于紫外线 后与核苷酸反应。这样可能产生毒性加合物，特别是由于HBcAg具有 结合核酸的强烈倾向。利用以含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和异双 功能交联剂制备的衣壳，难以检测抗原-衣壳偶联物中的这种毒性产物， 因为这将导致宽范围分子量的产物分布。因此毒性加合物将分布于多种 产物之间，它们可能分别以低浓度存在，但当在一起时达到毒性水平。
鉴于上述情况，在疫苗组合物中使用经修饰去除天然存在的半胱氨 酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着于非天然分 子支架时，毒性物能够结合的位点在数量上减少，或者全部去除。而且， 也可以用高浓度的交联剂生产高度修饰的颗粒，这没有产生HBcAg单 体的多种不确定交联产物(即，交联的单体HBcAg的多种混合物)的 缺点。
已经鉴定了大量适用于本发明的天然存在的HBcAg变体。例如， Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ ID NO：134中97位处的异亮氨酸残基被替换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残 基的变体。在下列GenBank报告中公开了多种HBcAg变体以及几种乙 型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列：AAF121240(SEQ ID NO：89)、 AF121239(SEQ ID NO：90)、X85297(SEQ ID NO：91)、X02496(SEQ ID NO：92)、X85305(SEQ ID NO：93)、X85303(SEQ ID NO：94)、 AF151735(SEQ ID NO：95)、X85259(SEQ ID NO：96)、X85286(SEQ ID NO：97)、X85260(SEQ ID NO：98)、X85317(SEQ ID NO：99)、 X85298(SEQ ID NO：100)、AF043593(SEQ ID NO：101)、M20706 (SEQ ID NO：102)、X85295(SEQ ID NO：103)、X80925(SEQ ID NO： 104)、X85284(SEQ ID NO：105)、X85275(SEQ ID NO：106)、X72702 (SEQ ID NO：107)、X85291(SEQ ID NO：108)、X65258(SEQ ID NO： 109)、X85302(SEQ ID NO：110)、M32138(SEQ ID NO：111)、X85293 (SEQ ID NO：112)、X85315(SEQ ID NO：113)、U95551(SEQ ID NO： 114)、X85256(SEQ ID NO：115)、X85316(SEQ ID NO：116)、X85296 (SEQ ID NO：117)、AB033559(SEQ ID NO：118)、X59795(SEQ ID NO：119)、X85299(SEQ ID NO：120)、X85307(SEQ ID NO：121)、 X65257(SEQ ID NO：122)、X85311(SEQ ID NO：123)、X85301(SEQ ID NO：124)、X85314(SEQ ID NO：125)、X85287(SEQ ID NO：126)、 X85272(SEQ ID NO：127)、X85319(SEQ ID NO：128)、AB010289 (SEQ ID NO：129)、X85285(SEQ ID NO：130)、AB010289(SEQ ID NO：131)、AF121242(SEQ ID NO：132)、M90520(SEQ ID NO：135)、 P03153(SEQ ID NO：136)、AF110999(SEQ ID NO：137)和M95589 (SEQ ID NO：138)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg 变体在氨基酸序列上有多个位点不同，包括对应于位于SEQ ID NO：134 中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、 49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、 97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、 135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基 酸残基。
适用于本发明的HBcAg可以来源于任何生物，只要它们能够结合形 成有序、重复的抗原阵列。
如上所述，在本发明的疫苗组合物中一般使用加工后的HBcAg(即 缺乏前导序列的HBcAg)。因此，当用含有SEQ ID NO：136、137或138 所示氨基酸序列的HBcAg制备本发明的疫苗组合物时，通常分别去掉 这些蛋白质的N端30、35-43或35-43个氨基酸残基。
本发明包括疫苗组合物，以及应用这些组合物的方法，其中使用上 述变异HBcAg制备非天然分子支架。
本发明的范围内还包括能够结合形成二聚体或多聚体结构的其它 HBcAg变体。因此，本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物， 该多肽包含或者由下列氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：89-132和 134-138所示任何氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％ 相同的氨基酸序列，和必要时除去N端前导序列的这些蛋白质的加工后 形式。
多肽的氨基酸序列是否含有与SEQ ID NO：89-132和134-138所示 氨基酸序列之一或其部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相 同的氨基酸序列，可用已知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利 用Bestfit或其它任何一种序列比对程序确定一种特定序列与本发明的参 照氨基酸序列是否(例如)95％相同时，设置参数，使得在全长参照氨 基酸序列上计算百分同一性，并允许最高达参照序列中氨基酸残基总数 5％的同源性缺口。
含有SEQ ID NO：89-132和134-136所示氨基酸序列的HBcAg变 体和前体彼此相对类似。因此，所谓位于对应于SEQ ID NO：134特定 位点处的HBcAg变体的氨基酸残基，是指在SEQ ID NO：134所示氨基 酸序列中该位点处存在的氨基酸残基。在可感染哺乳动物的乙型肝炎病 毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性大多足够高，因此本领域技术 人员查阅SEQ ID NO：134所示氨基酸序列和特定HbcAg变体的氨基酸 序列以及鉴定“相应”氨基酸残基没有什么困难。例如，SEQ ID NO：135 所示的HBcAg氨基酸序列，它显示来源于一种感染土拨鼠的病毒的 HBcAg氨基酸序列，与含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的HBcAg 有足够的同源性，很明显地在相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基155 与156之间在SEQ ID NO：135中存在3个氨基酸残基的插入。
感染雪雁和鸭的乙型肝炎病毒的HBcAg与感染哺乳动物的乙型肝 炎病毒的HBcAg的氨基酸序列相当不同，因此这些蛋白质形式与SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的比对比较困难。然而，本发明包括含有 感染鸟类的乙型肝炎病毒HBcAg变体的疫苗组合物，以及含有这些 HBcAg变体的片段的疫苗组合物。适用于制备本发明疫苗组合物的 HBcAg片段包括含有如下多肽片段的组合物，该多肽片段包含或由选自 下列的氨基酸残基组成：SEQ ID NO：137的36-240、36-269、44-240、 44-269、36-305和44-305，或SEQ ID NO：138的36-240、36-269、44-240、 44-269、36-305和44-305。本领域技术人员会认识到，在包含于本发明 的疫苗组合物之前，这些多肽中天然存在的一个、两个、三个或多个半 胱氨酸残基(例如，位于SEQ ID NO：137的153位或SEQ ID NO：138 的34、43和196位的半胱氨酸残基)可以被置换为另一种氨基酸残基， 或者缺失。
在一个实施方案中，含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的蛋白 质的48和107位处的半胱氨酸残基缺失或被置换为另一种氨基酸残基， 但是61位处的半胱氨酸保留。然后用该修饰的多肽制备本发明的疫苗 组合物。
如以下实施例31所述，例如，可以通过定点诱变去除溶剂可达的 48和107位处的半胱氨酸残基。发明人还发现，如实施例31所述构建 的Cys-48-Ser，Cys-107-Ser HBcAg双突变体能够在大肠杆菌中表达。
如上所述，游离半胱氨酸残基的去除减少了毒性成分能够与HBcAg 结合的位点数量，也去除了相同或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨 酸残基能够发生交联的位点。61位处的半胱氨酸参与二聚体形成，并与 另一个HBcAg的61位半胱氨酸形成二硫键，它通常保持完整，以稳定 本发明的HBcAg二聚体和多聚体。
如实施例32所述，用(1)含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和(2) 利用碘代乙酰胺使游离半胱氨酸残基无反应性的HBcAg进行的交联实 验表明，HBcAg的游离半胱氨酸残基通过异双功能交联剂衍生的赖氨酸 侧链与游离半胱氨酸残基之间的反应，负责HBcAg之间的交联。实施 例32也表明，HBcAg亚单位的交联导致形成大小不确定的高分子量产 物，它们不能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析出来。
当抗原或抗原决定簇与非天然分子支架通过一个赖氨酸残基连接 时，置换或删除在对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天然存在的赖 氨酸残基之一或这两者、以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基可 能是有利的。这些赖氨酸残基的去除导致除去了可能破坏有序阵列的抗 原或抗原决定簇结合部位，应当能提高最终疫苗组合物的质量和均一 性。
在许多情况中，当去除了对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天 然存在的两个赖氨酸残基时，向HBcAg中导入另一个赖氨酸作为抗原 或抗原决定簇的附着位点。例如，下文实施例23描述了插入这种赖氨 酸残基的方法。当例如改变对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天然 存在的两个赖氨酸残基，并且试图利用异双功能交联剂使抗原或抗原决 定簇附着于非天然分子支架时，向HBcAg内导入一个赖氨酸残基通常 是有利的。
已经显示，HBcAg的C端指导该蛋白质的核定位(Eckhardt等人， J.Virol.65：575-582(1991))。另外也认为该蛋白质的该区域使HBcAg 具有结合核酸的能力。
在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物含有具有核酸结合活性的 HBcAg(例如含有天然存在的HBcAg核酸结合域)。含有一个或多个核 酸结合域的HBcAg可用于制备T细胞刺激活性提高的疫苗组合物。因 此，本发明的疫苗组合物包括含有具有核酸结合活性的HBcAg的组合 物。还包括其中HBcAg与核酸结合的疫苗组合物以及这些组合物在接 种方法中的应用。这些HBcAg可以在对个体施用之前结合核酸，或者 可以在施用后结合核酸。
在其它实施方案中，本发明的疫苗组合物含有C端区(例如SEQ ID NO：134的氨基酸残基145-185或150-185)已经去除并且不能结合核 酸的HBcAg。因此，适用于本发明的另外的修饰HBcAg包括C端截短 的突变体。合适的截短突变体包括从C端除去1、5、10、15、20、25、 30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
适用于本发明的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变 体包括从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的 修饰HBcAg。
适用于本发明的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截 短突变体包括从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨 基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、 39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的 氨基酸序列组成。
如上所述，在本发明的某些实施方案中，向一种形成非天然分子支 架的多肽中导入一个赖氨酸残基作为第一附着位点。在优选实施方案 中，用包含或者由SEQ ID NO：134的氨基酸1-144或氨基酸1-149组 成的HBcAg制备本发明的疫苗组合物，该序列经过修饰，使得对应于 79和80位的氨基酸被置换为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQ ID NO：158)的肽，48和107位处的半胱氨酸残基缺失或置换为另一 种氨基酸残基，而61位处的半胱氨酸保留。本发明还包括含有如下多 肽的相应片段的疫苗组合物，该多肽含有SEQ ID NO：89-132和135-136 任一所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改变。
本发明还包括含有如下HBcAg片段的疫苗组合物，该片段包含或者 由不同于SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列组成，其中在SEQ ID NO： 134的相应位点处不存在的半胱氨酸残基已经被删除。这种片段的一个 例子是包含或者由SEQ ID NO：132的氨基酸1-149组成的多肽，其中 147位处的半胱氨酸残基被置换为另一种氨基酸残基或者缺失。
本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：134的氨基酸1-144或1-49， 和包含SEQ ID NO：89-132或134-136任一所示氨基酸序列的相应部分， 以及SEQ ID NO：158的氨基酸1-147或1-152至少80％、85％、90％、 95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
本发明也包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由下列氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：137的氨基酸36-240、36-269、 44-240、44-269、36-305和44-305或SEQ ID NO：138的氨基酸36-240、 36-269、44-240、44-269、36-305和44-305至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列。
本发明的疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗 组合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备含有“野 生型”HBcAg和其中一个或多个氨基酸残基改变(例如：缺失、插入或 置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。然而在大多数应用中，只使用一 种类型的HBcAg，或者至少含有基本相同的第一附着位点的多种 HBcAg，因为用这些HBcAg制备的疫苗呈现高度有序、重复的抗原或 抗原决定簇阵列。此外，本发明的优选疫苗组合物是呈现高度有序、重 复抗原阵列的组合物。
本发明还包括如下疫苗组合物，其中的非天然分子支架利用与另一 种蛋白质融合的HBcAg制备。如上所述，适用于本发明疫苗组合物的 HBcAg融合蛋白的其它例子包括添加了有助于HBcAg二聚体和多聚体 形成和/或稳定的氨基酸序列的融合蛋白。附加的氨基酸序列可以与 HBcAg的N端或C端融合。这种融合蛋白的一个例子是HBcAg与酿酒 酵母GCN4螺旋区(GenBank登录号P03069(SEQ ID NO：154))的融 合体。
GCN4蛋白的螺旋域通过非共价相互作用形成同型二聚体，它能用 来制备和稳定HBcAg二聚体和多聚体。
在一个实施方案中，本发明提供利用HBcAg融合蛋白制备的疫苗组 合物，该融合蛋白包含HBcAg或其片段，和与C端融合的含有SEQ ID NO：154氨基酸残基227-276序列的GCN4多肽。该GCN4多肽也可以 与HBcAg的N端融合。
也可以用HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白制备本发明的疫苗组 合物。SH3域是在多种蛋白质中发现的相对较小的域，它提供与蛋白质 结合配偶体中的特异富含脯氨酸序列相互作用的能力(参见McPherson， Cell Signal 11：229-238(1999))。可以以几种方式应用HBcAg/SH3融 合蛋白。第一，SH3域能形成第一附着位点，可与抗原或抗原决定簇的 第二附着位点相互作用。类似地，也可以向HBcAg中添加另一种富含 脯氨酸的氨基酸序列，并作为第一附着位点用于抗原或抗原决定簇的 SH3域第二附着位点。第二，SH3域能与导入HBcAg中的富含脯氨酸 区结合。因此，可以将SH3域和富含脯氨酸SH3相互作用位点插入相 同或不同的HBcAg中，用来形成和稳定本发明的二聚体和多聚体。
在其它实施方案中，利用细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白部分或含有 细菌菌毛蛋白或其部分的融合蛋白制备本发明的疫苗组合物。菌毛蛋白 的例子包括大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈 瑟菌(Neisseria meningitidis)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)产生的菌毛蛋白。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包 括GenBank报告AJ000636(SEQ ID NO：139)、AJ132364(SEQ ID NO： 140)、AF229646(SEQ ID NO：141)、AF051814(SEQ ID NO：142)、 AF051815(SEQ ID NO：143)和X00981(SEQ ID NO：155)所述的 那些，其完整公开内容在此引用作为参考。
在蛋白质输出到细菌周质中之前，细菌菌毛蛋白通常被加工，以去 除N端前导序列。本领域技术人员会认识到，用来制备本发明疫苗组合 物的细菌菌毛蛋白通常不含天然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体例子是大肠杆菌的P-菌毛蛋白 (GenBank报告AF237482(SEQ ID NO：144))。适用于本发明的1型 大肠杆菌菌毛蛋白的一个例子是含有GenBank报告P04128所述氨基酸 序列(SEQ ID NO：146)的一种菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603 所述核苷酸序列(SEQ ID NO：145)的核酸编码。这些GenBank报告 的完整公开内容在此引用作为参考。一般用上述蛋白质的成熟形式制备
本发明的疫苗组合物。
适用于本发明的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白部分通常能够结合，形成 非天然分子支架。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法在本领域是已知的。例如， Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12890-12895(1996)描述了 大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。另外，Eshdat等人，J.Bacteriol.148： 308-314(1981)描述了适于解离大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。 简言之，这些方法如下：通过在饱和盐酸胍中37℃孵育，解离菌毛。然 后通过层析纯化菌毛蛋白，之后对5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人也发现，在对含有5 mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋 白二聚体重新装配，形成菌毛。
此外，例如利用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋 白，使其含有第一附着位点，抗原或抗原决定簇通过第二附着位点与该 第一附着位点连接。或者，抗原或抗原决定簇也能通过第二附着位点与 这些蛋白质中天然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然 后可用于本发明的疫苗组合物中。
用来制备本发明疫苗组合物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处关于 HBcAg所述的方式修饰。例如，半胱氨酸和赖氨酸残基可以删除，或者 可以置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位 点。而且，菌毛蛋白可以以修饰的形式表达，或者可以在表达后化学修 饰。类似地，可以从细菌中收获完整菌毛，然后化学修饰。
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛 样结构，用来组成本发明的疫苗组合物。适于制备疫苗组合物的菌毛的 一个例子是大肠杆菌1型菌毛，它是由具有SEQ ID NO：146所示氨基 酸序列的菌毛蛋白单体构成的。
本领域已知多种收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski (Biophys.J.74：623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌 毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多毛大肠杆菌上 剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循环纯化。下文实施例 33描述了一种类似的纯化方法。
收获后，可用多种方法修饰菌毛或菌毛样结构。例如，可向菌毛中 添加第一附着位点，抗原或抗原决定簇可以通过第二附着位点与之结 合。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，形成非天然分 子支架。
也可以在不含非天然形成体的情况下，通过抗原或抗原决定簇的附 着修饰菌毛或菌毛样结构。例如，抗原或抗原决定簇可与天然存在的半 胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这种情况中，天然存在的氨基酸残基 的高度有序和重复性将指导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶 联。例如，利用异双功能交联剂，可将菌毛或菌毛样结构与抗原或抗原 决定簇的第二附着位点连接。
当利用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的疫苗组合物 时，遗传构建这些生物使它们产生具有所希望特征的结构通常是有利 的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，为了产生具有所希望特征的结 构，可以修饰将要从中收获菌毛的大肠杆菌。菌毛蛋白可能的修饰的例 子包括一个或多个赖氨酸残基的插入，一个或多个天然存在的赖氨酸残 基的缺失或置换，和一个或多个天然存在的半胱氨酸残基(例如SEQ ID NO：146中44和84位处的半胱氨酸残基)的缺失或置换。
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有不是赖氨酸残 基的第一附着位点(例如FOS或JUN域)的表达产物。当然，合适的 第一附着位点一般只限于那些不能阻止菌毛蛋白形成适于本发明疫苗 组合物的菌毛或菌毛样结构的第一附着位点。
细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因可在体内修饰(例如通过同源 重组)，或者可将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入这些细胞中。例如， 可将菌毛蛋白基因作为可复制克隆载体或可插入细菌染色体内之载体 的一部分导入细菌细胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调节控制 序列(例如1ac操纵子)连接。
在大多数情况中，本发明的疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构 由一种菌毛蛋白亚单位组成。一般使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛 样结构，因为预计它们能形成呈现高度有序、重复抗原阵列的结构。
然而，本发明的组合物也包括包含由不同种菌毛蛋白亚单位组成的 菌毛或菌毛样结构的疫苗。构成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单 位可由细菌细胞中天然存在的基因表达，或者可以将基因导入细胞中。 在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达天然存在的菌毛蛋白基因和导 入的基因时，产物通常是由这些菌毛蛋白的混合物组成的结构。另外， 当细菌细胞表达两种或多种菌毛蛋白基因时，各种菌毛蛋白基因的相对 表达一般是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比例的一种 因素。
当希望获得具有特定混合菌毛蛋白亚单位组成的菌毛或菌毛样结构 时，可用一种异源诱导型启动子调节至少一种菌毛蛋白基因的表达。可 用这种启动子以及其它遗传元件调节细菌细胞中不同菌毛蛋白亚单位 的相对含量，从而调节菌毛或菌毛样结构的组成。
另外，在大多数情况中，抗原或抗原决定簇通过肽键之外的键与细 菌菌毛或菌毛样结构连接，可以遗传改造产生本发明组合物中使用的菌 毛或菌毛样结构的细菌细胞，以产生与抗原或抗原决定簇融合的菌毛蛋 白。形成菌毛或菌毛样结构的这些融合蛋白适用于本发明的疫苗组合 物。
如上所述，病毒衣壳可以用于(1)抗原或抗原决定簇的递呈，和(2) 本发明的疫苗组合物的制备。在本发明的实施中有用的尤其是病毒衣壳 蛋白，在此也称为“外壳蛋白”，它们在表达后形成衣壳或衣壳样结构。 因此，这些衣壳蛋白可形成核心颗粒和非天然分子支架。这些衣壳或衣 壳样结构通常形成有序、重复的阵列，能用于抗原或抗原决定簇的递呈 和本发明的疫苗组合物的制备。
可以利用多种方法使一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)抗原 或抗原决定簇附着于一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)可形成衣 壳或衣壳样结构的蛋白质(例如噬菌体外壳蛋白)及其它蛋白质上。例 如，可以利用第一和第二附着位点使抗原或抗原决定簇附着于核心颗 粒。此外，也可以用一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)异双功能 交联剂使抗原或抗原决定簇附着于一种或多种可形成病毒衣壳或衣壳 样结构的蛋白质上。
例如，可以利用病毒衣壳蛋白或其片段制备本发明的核心颗粒和疫 苗组合物。噬菌体Qβ外壳蛋白例如可以在大肠杆菌中重组表达。而且， 这些蛋白质在表达后自动形成衣壳。而且，这些衣壳形成有序、重复的 抗原或抗原决定簇阵列，后者可用于抗原递呈和疫苗组合物的制备。如 下文实施例38所述，可用噬菌体Qβ外壳蛋白制备引发对抗原决定簇之 免疫应答的疫苗组合物。
可用来制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括下列噬 菌体的外壳蛋白：RNA噬菌体，如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：159，关于 Qβ CP的PIR数据库登录号为VCBPQβ，和SEQ ID NO：217，关于Qβ A1蛋白的登录号为AAA16663)、噬菌体R17(SEQ ID NO：160；PIR 登录号VCBPR7)、噬菌体fr(SEQ ID NO：161；PIR登录号VCBPFR)、 噬菌体GA(SEQ ID NO：162；GenBank登录号NP-040754)、噬菌体 SP(SEQ ID NO：163，关于SP CP的GenBank登录号CAA30374，和 SEQ ID NO：254，关于SP A1蛋白的登录号)、噬菌体MS2(SEQ ID NO： 164；PIR登录号VCBPM2)、噬菌体M11(SEQ ID NO：165；GenBank 登录号AAC06250)、噬菌体MX1(SEQ ID NO：166；GenBank登录号 AAC14699)、噬菌体NL95(SEQ ID NO：167；GenBank登录号 AAC14704)、噬菌体f2(SEQ ID NO：215；GenBank登录号P03611)、 噬菌体PP7(SEQ ID NO：253)。本领域技术人员会认识到，本发明疫 苗组合物的制备可以使用可形成衣壳或衣壳样结构的任何蛋白质。而 且，在Qβ外壳蛋白的衣壳装配中可以掺入噬菌体Qβ的A1蛋白或C 端缺少多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式。为了含有第二 附着位点的抗原的附着，A1蛋白也可以与一种形成体融合，因而与第一 附着位点融合。为了确保衣壳形成，衣壳组件中A1蛋白相对于Qβ CP 的百分比是有限的。A1蛋白的登录号为AAA16663(SEQ ID NO：217)。
也曾经发现，当Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时，自装配成衣壳 (Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。获得的衣壳或病 毒样颗粒显示一种二十面体噬菌体样衣壳结构，直径为25nm，T＝3准 对称。而且已解析了噬菌体Qβ的晶体结构。衣壳含有180个拷贝的外 壳蛋白，它们通过二硫键以共价五聚体和六聚体的形式连接 (Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。其它RNA 噬菌体外壳蛋白也显示在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA.等人， Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)， Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol. Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白之外还含有 所谓的通读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1是通过UGA终止密码子处的抑 制产生的，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳 蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的 外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，能与复制酶基因的核糖体结合位点的 茎环相互作用，在病毒生命周期中作为一种翻译阻抑物。这种相互作用 的序列和结构成分已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。 已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
蛋白质或蛋白质域对颗粒结构和装配的影响要大于短肽的影响。一 个例子是，当Qβ颗粒表达时，含有二硫键的抗原在大肠杆菌的细胞质 中一般不可能正确折叠。同样，在原核表达系统中糖基化一般是不可能 的。因此，从已经装配的颗粒和分离的抗原开始将抗原附着于颗粒上， 是此处所述的本发明的一个优点。这允许颗粒和抗原在表达宿主中表 达，保证抗原的正确折叠和颗粒的正确折叠和装配。
本发明的一个发现是，一个或几个抗原分子可以附着于RNA噬菌 体外壳蛋白的衣壳的一个亚单位上。RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳，尤其 是Qβ衣壳的一个具体特征是每个亚单位可能偶联几个抗原。这可产生 密集的抗原阵列。通过化学交联共价结合抗原的其它病毒衣壳，如主要 免疫显性区(MIR；WO 00/32227)中一个赖氨酸残基修饰的HBcAg， 显示每个亚单位最多0.5个抗原的偶联密度。HBcAg的刺突之间的距离 (对应于MIR)为50A(Wynne，SA.等人，Mol.Cell 3：771-780(1999))， 因此不能产生间距小于50A的抗原阵列。
Qβ外壳蛋白的衣壳在其表面上展示数量确定的赖氨酸残基，具有确 定的拓扑学，3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它 4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。这些确定的特征有利于抗原附着于颗 粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的内部。其他RNA噬菌体 外壳蛋白的衣壳在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基 也具有确定的拓扑学。来源于RNA噬菌体的衣壳有另一个优点，即在 细菌中的高表达量，这允许以经济的成本生产大量物质。
Qβ外壳蛋白的衣壳的另一个特征是其稳定性。Qβ亚单位之间通过 二硫键彼此结合，共价连接亚单位。Qβ衣壳蛋白也显示对有机溶剂和 变性剂的非凡的抗性。我们惊奇地看到，能够采用高达30％的DMSO和 乙腈浓度和高达1M的胍盐浓度，而不影响衣壳的稳定性或形成抗原阵 列的能力。因此，可以用这些有机溶剂偶联疏水性肽。Qβ外壳蛋白衣 壳的高度稳定性是一个重要特征，特别适用于哺乳动物和人类的免疫和 接种。衣壳对有机溶剂的抗性使得能够偶联在水性缓冲液中不可溶的抗 原。
向RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端β发夹中插入半胱氨酸残基 已经在专利申请US/5,698,424中描述过。但是我们注意到，衣壳中存在 暴露的游离半胱氨酸残基可通过形成二硫键导致衣壳的寡聚化。专利申 请US/5,698,424中所述的其它附着包括抗原与Qβ颗粒之间二硫键的形 成。含巯基的分子易于发生这种附着。
Qβ上半胱氨酸残基形成的已有二硫键与含有游离巯基残基的抗原 之间的反应释放非抗原性的含巯基物质。这些新形成的含巯基物质能够 再次与颗粒上存在的其它二硫键反应，从而建立一种平衡。在与颗粒上 形成的二硫键反应时，抗原可以与来自颗粒的半胱氨酸残基或者与在颗 粒上形成原二硫键的离去基团分子的半胱氨酸残基形成二硫键。而且， 所述的其它附着方法，利用异双功能交联剂一端与Qβ颗粒上的半胱氨 酸反应、另一端与抗原上的赖氨酸残基反应，导致抗原在颗粒上的随机 定向。
我们还注意到，与Qβ和Fr外壳蛋白的衣壳不同，专利申请 US/5,698,424中描述的重组MS-2基本不含核酸，而上述两种衣壳内包 装有RNA。
我们描述了本发明的新型组合物，它们可形成抗原密度可变的强抗 原阵列。我们证明，能够达到比用其它VLP通常获得的高得多的表位密 度。我们也公开了以适当间隔同时展示几种抗原的组合物，和以合适和 希望的方式添加辅助分子、提高溶解度或修饰衣壳的组合物。
本申请中公开了具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳组 合物的制备。本领域技术人员会理解，有序、重复抗原阵列的装配条件 相当部分取决于抗原和抗原上第二附着位点的选择。在没有有用的第二 附着位点的情况下，必须为抗原构建这种第二附着位点。
设计第二附着位点的一个前提是选择融合、插入或者通常是改造的 位置。本领域技术人员知道如何获得选择第二附着位点位置的指南。抗 原的晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可接近性(例如取决于它 们对于溶剂的可接近性)或者关于适于作为第二附着位点的残基(如半 胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。暴露的二硫键，象Fab片段的情况一 样，也可以是第二附着位点的来源，因为它们通常能通过温和还原转化 为一个半胱氨酸残基。在自身抗原免疫旨在抑制这种自身抗原与其天然 配体相互作用的情况下，通常添加第二附着位点，以便产生针对与天然 配体的相互作用位点的抗体。因此，选择第二附着位点的位置，以避免 第二附着位点或含有第二附着位点的任何氨基酸接头的空间位阻。在其 它实施方案中，希望针对不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点 的位点发生抗体应答。在这些实施方案中，可以选择第二附着位点，使 其能阻止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚化状态、寡聚化 位点、辅因子的存在和抗原结构和序列中实验证据揭示性位点是否存 在，其中抗原的修饰与自身抗原的功能相一致，或者与可识别自身抗原 的抗体的产生相一致。
在某些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要根据本发明公 开内容融合一种氨基酸接头，该接头含有适于作为第二附着位点的氨基 酸。在一个优选实施方案中，该氨基酸是半胱氨酸。氨基酸接头的选择 取决于自身抗原的性质，其生物化学性质，如pI、电荷分布、糖基化。 通常柔性氨基酸接头是有利的。氨基酸接头的例子有免疫球蛋白的铰链 区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n和甘氨酸接头(G)n，它们全都含有一个 半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地还含有甘氨酸残基。以下是所 述氨基酸接头的例子：
N端γ1：CGDKTHTSPP
C端γ1：DKTHTSPPCG
N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP
C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG
N端甘氨酸接头：GCGGGG
C端甘氨酸接头：GGGGCG
对于肽而言，已经表明肽C端的GGCG接头或N端的CGG是有用 的。通常在体积大的氨基酸与用作第二附着位点的半胱氨酸之间插入甘 氨酸残基。
抗原与VLP附着，特别是与RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳附着的一 种特别优选的方法是将RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳表面上的赖氨酸残 基与抗原上的半胱氨酸残基连接。为了有效地作为第二附着位点，巯基 必须是偶联可用的。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即必须有含 有游离巯基的半胱氨酸或半胱氨酸残基可以利用。在作为第二附着位点 的半胱氨酸残基为氧化形式的情况下，如果它例如要形成二硫键，需要 用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。
本申请的一项发现是，通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节 RNA噬菌体外壳蛋白衣壳上的表位密度。例如，在相同反应条件下，交 联剂Sulfo-GMBS和SMPH可比交联剂Sulfo-MBS获得更高的表位密度。 高浓度的反应物对衍生化有积极影响，并且可以通过操作反应条件控制 与RNA噬菌体外壳蛋白，特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的抗原数量。
根据理论计算，大小为17kDa的球形蛋白质抗原可以达到的最大数 量不超过0.5。因此，Qβ外壳蛋白衣壳的几个赖氨酸残基会被交联剂 分子衍生，但是不含连接抗原。这导致正电荷消失，这可能不利于偶联 物的溶解性和稳定性。如同公开的Qβ外壳蛋白突变体中那样，通过用 精氨酸置换某些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过度消失，因为精氨 酸残基不与交联剂反应。
在其它实施方案中，我们公开了一种含有其它赖氨酸残基的Qβ突 变外壳蛋白，它适于获得高密度抗原阵列。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人， Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，本领域技术人员能容易 地鉴定表面暴露的残基，并修饰噬菌体外壳蛋白，以便插入一个或多个 反应性氨基酸残基。因此，本领域技术人员能容易地生产和鉴定可用于 实施本发明的噬菌体外壳蛋白的修饰形式。因此，也可以用形成衣壳或 衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬 菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的疫苗组 合物。
尽管上述变异蛋白质的序列与它们的野生型对应物不同，但是这些 变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包 括含有可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的疫苗组合物，以及制备 这些疫苗组合物的方法，用来制备这些疫苗组合物的单个蛋白质亚单位 和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括如下 野生型蛋白质的变体形式，它们可形成有序、重复的抗原阵列(例如， 可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体)，并保留结合并形成衣壳或衣 壳样结构的能力。
因此，本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物，该蛋白质包含 或者由与可形成有序阵列的野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列组成。在许多情况中，需要加工这些蛋白 质，以去除信号肽(例如，异源信号肽)。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明的疫苗组合物的蛋白质 的核酸分子。
在特别实施方案中，本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物， 该蛋白质含有或者由与SEQ ID NO：159-167任一所示氨基酸序列至少 80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，或是必要 时去除N端前导序列的这些蛋白质的加工后形式。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构以及其它有 序阵列的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具 有SEQ ID NO：159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从C端除 去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。在本发明的实 施中使用的C端截短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的 N端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQ ID NO： 159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从N端除去了1、2、5、7、 9、10、12、14、15或17个氨基酸。在在本发明的实施中使用的N端截 短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质还包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白 质的N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括具有SEQ ID NO： 159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从N端除去了1、2、5、7、 9、10、12、14、15或17个氨基酸，并且从C端除去了1、2、5、7、9、 10、12、14、15或17个氨基酸。在本发明的实施中使用的N端和C端 截短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物，该蛋白质包含或者由 与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨 基酸序列组成。
本发明因此包括由可形成有序阵列的蛋白质制备的疫苗组合物，由 单个蛋白质亚单位制备疫苗组合物的方法，制备这些单个蛋白质亚单位 的方法，编码这些亚单位的核酸分子，以及应用本发明的疫苗组合物接 种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
B.具有第二附着位点的抗原或抗原决定簇的构建
本发明的组合物中的第二种成分是具有至少一个第二附着位点的抗 原或抗原决定簇，该位点能够通过至少一个非肽键与非天然分子支架的 第一附着位点结合。根据希望的治疗效果而选择的抗原或抗原决定簇， 本发明提供不同的组合物。通过改变为第二附着位点选择的分子，可提 供其它组合物。
然而，当用细菌菌毛或菌毛样结构、菌毛蛋白制备本发明的疫苗组 合物时，抗原或抗原决定簇可以通过菌毛蛋白/抗原融合蛋白的表达与菌 毛蛋白结合。类似地，当用菌毛蛋白之外的蛋白质(例如病毒衣壳蛋白) 制备本发明的疫苗组合物时，抗原或抗原决定簇可以通过非菌毛蛋白/ 抗原融合蛋白的表达与这些非菌毛蛋白结合。抗原或抗原决定簇也可以 通过非肽键与细菌菌毛、菌毛样结构、菌毛蛋白和可形成有序阵列的其 它蛋白质结合。
本发明的抗原可以选自：(a)适于诱发抗癌细胞免疫应答的蛋白质； (b)适于诱发抗传染病免疫应答的蛋白质；(c)适于诱发抗变应原的免 疫应答的蛋白质；(d)适于在家畜中诱发免疫应答的蛋白质；(e)(a)- (d)所述任一种蛋白质的片段(例如域)。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇可用于传染病 的预防。这种治疗方法可用于治疗影响多种宿主(例如人、牛、绵羊、 猪、狗、猫、其它哺乳动物种和非哺乳动物种)的多种传染病。本领域 技术人员周知可以治疗的传染病，例子包括：病毒病原的感染，如HIV、 流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘 等；或细菌病原的感染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病原的感染， 如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。因此，在医学领域 众所周知那些为本发明的组合物而选择的抗原或抗原决定簇；抗原或抗 原决定簇的例子包括：HIV抗原gp140和gp160；流感抗原血凝素、M2 蛋白和神经氨酸酶、乙型肝炎表面抗原、疟疾的环子孢子蛋白。
在特定实施方案中，本发明提供适于在预防和/或减弱由“自身”基因 产物(例如肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病或症状的方法中使用的疫 苗组合物。因此，本发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或减弱由 “自身”基因产物引起或加重的疾病或症状的抗体的组合物。这类疾病或 症状的例子包括：移植物抗宿主病、IgE介导的变态反应、过敏症、成 人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、变应性哮喘、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、Graves病、系统性红斑狼疮(SLE)、 炎性自身免疫病、重症肌无力、免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)、血 管免疫增生性淋巴结病(AIL)、免疫母细胞淋巴结病(IBL)、类风湿 性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、阿耳茨海默病和骨质疏松症。
在有关实施方案中，本发明的组合物是免疫治疗剂，可用于治疗变 态反应或癌症。
治疗变态反应的医学领域的技术人员知道如何选择用于制备组合物 和在治疗变态反应的方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原 决定簇的代表性例子包括：蜂毒磷脂酶A2、BetvI(桦树花粉变应原)、 5DolmV(白面胡蜂毒变应原)、蜂毒肽和Der pI(屋尘螨变应原)以 及能引发免疫应答的它们的片段。
如上所述，一种优选的抗原或抗原决定簇是Der pI。Der pI是在屋 尘螨粪便颗粒中发现的一种25kD的蛋白酶。Der pI是屋尘螨的主要变 态反应分子。因此，80％的螨虫变态反应患者含有抗-Der pI IgE抗体。 尤其是，已知肽p52-72和p117-133等含有可被天然Der pI特异性抗体 识别的表位。在对完整抗原的多克隆应答中产生的IgE抗体可与肽区 59-94高亲和力结合(L.Pierson-Mullany等人，(2000)《分子免疫学》)。 其它区也可与IgE高亲和力结合。肽p117-133在N端含有一个游离半胱 氨酸，优选地作为本发明的第二附着位点。3D模型将肽p52-72和 p117-133分配在全蛋白质的表面。然而，Der pI蛋白的其它片段可含有
优选用于本发明的B细胞表位。
治疗癌症的医学领域的技术人员知道如何选择用于制备组合物和在 癌症治疗方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代 表性例子包括：Her2(乳腺癌)、GD2(神经母细胞瘤)、EGF-R(恶性 胶质母细胞瘤)、CEA(甲状腺髓样癌)和CD52(白血病)、人黑素瘤 蛋白gp100、人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1、酪氨酸酶、NA17-Ant蛋 白、MAGE-3蛋白、p53蛋白、HPV16 E7蛋白以及能引发免疫应答的它 们的片段。可用来治疗癌症的组合物和方法的另外的优选抗原决定簇是 参与血管形成的分子和抗原决定簇。血管形成-新血管的形成-在生理 和病理生理过程(分别如创伤愈合和实体瘤生长)中起重要作用 (Folkman，J.(1995)Nat.Medicine 1，27-31；Folkman，J.和Klagsbrun，M. (1987)Science 235，442-446；Martiny-Baron，G.和Marmé，D.(1995) Curr.Opin.Biotechnol.6，675-680；Risau，W.(1997)Nature 386，671-674)。 快速生长的肿瘤始于并依靠血管的形成提供所需的血液供应。因此，抗 血管生成剂可以作为有效的抗癌治疗。
在迄今鉴定的几种推定的血管生成因子中，血管内皮生长因子 (VEGF)是一种强内皮细胞特异性有丝分裂原，是多种实体瘤的血管 生成的一种主要刺激物。尽管最近的发现表明，一组血管生成因子必须 完美配合才能形成功能性血管，但是甚至一种生长因子的阻断似乎也可 限制疾病诱导的血管生长。因此，VEGF的阻断可能是肿瘤诱导的血管 生成中的首要干预目标。最近已经把靶向内皮而不是肿瘤本身作为治疗 肿瘤的一种新策略(Millauer，B.，Shawver，L.K.，Plate，K.H.，Risau，W.和 Ullrich，A.(1994)Nature 367，576-579；Kim，J.，Li，B.，Winer，J.，Armanini， M.，Gillett，N.，Phillip，H.S.，Ferrara，N.(1993)Nature 362，841-844)。与 免疫系统识别的靶结构容易突变的肿瘤不同，内皮细胞通常不能逃脱免 疫系统或其它治疗方案。
已经公开了一种抗-VEGFR-II抗体(IMC-1C11)和一种抗VEGF抗 体(Lu，D.，Kussie，P.，Pytowski，B.，Persaud，K.，Bohlen，P.，Witte，L.，Zhu， Z.(2000)J.Biol.Chem.275，14321-14330；Presta，L.G.，Chen，H.，O’Connor， SJ.，Chisholm，V.，Meng，YG.，Krummen，L.，Winkler，M.，Ferrara N.(1997) Cancer Res.47，4593-4599)。前一种中和单克隆抗-VEGFR-2抗体识别一 种被确定为推定VEGF/VEGFR-II结合位点的表位(Piossek，C.， Schneider-Mergener，J.，Schirner，M.，Vakalopoulou，E.，Germeroth，L.， Thierauch，K.H.(1999)J Biol Chem.274，5612-5619)。
因此，在本发明的另一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是一 种来源于VEGFR-II接触位点的肽。这提供了一种根据本发明的组合物 和疫苗组合物，它可能具有抗血管生成的特性，可用于癌症治疗。用 VEGFR-2特异的血清抑制小鼠肿瘤生长已经得到证实(Wei，YQ.，Wang， QR.，Zhao，X.，Yang，L.，Tian.L.，Lu，Y.，Kang，B.，Lu，CJ.，Huang，MJ.，Lou， YY.，Xiao，F.，He，QM.，Shu，JM.，Xie，XJ.，Mao，YQ.，Lei，S.，Luo，F.，Zhou， LQ.，Liu，CE.，Zhou，H.，Jiang，Y.，Peng，F.，Yuan，L P.，Li，Q.，Wu，Y.，Liu，JY. (2000)Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，适用于本发明的组合物 和根据本发明的抗血管生成疫苗组合物的另外优选的抗原决定簇包括 具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR-II衍生 肽，和/或具有序列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK的鼠 VEGFR-II衍生肽，和/或VEGFR-II的相关胞外球形域1-3。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，疫苗组合物包含一种选自 病毒样颗粒或细菌菌毛的核心颗粒和VEGFR-II衍生肽或其片段作为本 发明抗原或抗原决定簇。
治疗相关疾病的医学领域的技术人员知道如何选择用于治疗其它自 身抗原相关疾病或症状的组合物和方法的抗原或抗原决定簇。这类抗原 或抗原决定簇的代表性例子有，如：淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)、 淋巴毒素β(LTβ))和淋巴毒素受体、核因子KB配体的受体激活物 (RANKL)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体 (VEGF-R)、白介素-5、白介素-17、白介素-13、CCL21、CXCL12、SDF-1、 MCP-1、Endoglin、抵抗素、GHRH、LHRH、TRH、MIF、嗜酸细胞活 化趋化因子(Eotaxin)、缓激肽、BLC、肿瘤坏死因子α和淀粉样β肽 (Aβ1-42)(SEQ ID NO：220)，以及能引发免疫应答的它们的片段。在 一个优选实施方案中，抗原是淀粉样β肽(Aβ1-42) (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) (SEQ ID NO：220)或其片段。淀粉样β蛋白是SEQ ID NO：218。淀 粉样β前体蛋白是SEQ ID NO：219。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种血管 紧张肽或其片段。如此处所用的术语“血管紧张肽”包括含有血管紧张肽 原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其片段的任何肽。序列如下： 血管紧张肽原：DRVYIHPFHLVIHN；血管紧张肽I：DRVYIHPFHL； 血管紧张肽II：DRVYIHPF。通常在血管紧张肽序列的C端或N端添加 一个或多个其它氨基酸。血管紧张肽的序列对应于人序列，与鼠序列相 同。因此，分别用含有这种血管紧张肽作为本发明抗原决定簇的疫苗或 组合物免疫人或小鼠是针对自身抗原的接种。这些其它氨基酸对于与核 心颗粒的定向和有序结合特别有价值。
优选地，血管紧张肽具有选自下列的氨基酸序列：a)氨基酸序列 CGGDRVYIHPF；b)氨基酸序列CGGDRVYIHPFHL；c)氨基酸序列 DRVYIHPFHLGGC；和d)氨基酸序列CDRVYIHPFH。血管紧张肽I 是用肾源酶肾素从血管紧张肽原(14个氨基酸)上切下的。血管紧张肽 I是一种10个氨基酸的无生物活性肽。血管紧张肽转化酶(ACE)在N 端进一步切割，产生具有生物活性的8个氨基酸的血管紧张肽II。该肽 可与血管紧张肽受体AT1I和AT2结合，导致血管收缩和醛甾酮释放。
本发明的一种疫苗包含可用于治疗高血压的至少一种血管紧张肽。
在本发明的一个特别实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：(a)HIV 的重组蛋白，(b)流感病毒的重组蛋白(例如流感病毒M2蛋白或其片 段)，(c)丙型肝炎病毒的重组蛋白，(d)弓形虫(Toxoplasma)的重组 蛋白，(e)恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的重组蛋白，(f)间 日疟原虫(Plasmodium vivax)的重组蛋白，(g)卵形疟原虫(Plasmodium ovale)的重组蛋白，(h)三日疟原虫(Plasmodium malariae)的重组蛋 白，(i)乳腺癌细胞的重组蛋白，(j)肾癌细胞的重组蛋白，(k)前列 腺癌细胞的重组蛋白，(l)皮肤癌细胞的重组蛋白，(m)脑癌细胞的重 组蛋白，(n)白血病细胞的重组蛋白，(o)重组抑制蛋白(profiling)， (p)蜂毒变态反应的重组蛋白，(q)坚果变态反应的重组蛋白，(r) 食物变态反应的重组蛋白，(s)哮喘的重组蛋白，(t)衣原体(Chlamydia) 的重组蛋白，和(u)(a)-(t)所示任何蛋白质的片段。
选择组合物的抗原或抗原决定簇后，即可在制备过程中向分子上添 加至少一个第二附着位点，构建与本发明的非天然分子支架结合的有组 织的、重复的阵列。本领域技术人员知道什么能构成合适的第二附着位 点。第二附着位点的代表性例子包括但不限于：抗原、抗体或抗体片段、 生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、配体结合蛋白、 相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、对氨基有反应性的化学基团、羧基、 对羧基有反应性的化学基团、巯基、对巯基有反应性的化学基团，或其 组合。
第一与第二附着位点的结合将取决于选择的各个分子的特性，但是 将包含至少一个非肽键。根据第一和第二附着位点的组合，这种结合的 性质可能是共价的、离子性的、疏水性的、极性的或其组合。
在本发明的一个实施方案中，第二附着位点可以是FOS亮氨酸拉链 蛋白域或JUN亮氨酸拉链蛋白域。
在本发明的一个更具体的实施方案中，选择的第二附着位点是FOS 亮氨酸拉链蛋白域，它与本发明的非天然分子支架上的JUN亮氨酸拉链 蛋白域特异结合。JUN与FOS亮氨酸拉链蛋白域的结合为在支架表面形 成有组织的、重复的抗原或抗原决定簇阵列提供了基础。FOS亮氨酸拉 链蛋白域可以与选择的抗原或抗原决定簇在氨基端、羧基端或(希望时) 在蛋白质内部框内融合。
为了举例说明，列出了几种FOS融合构建体。人生长激素(实施例 4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA2)(实施例9)、卵白蛋白(实施例10)和HIV gp140(实施例12)。
为了简化FOS融合构建体的生成，公开了几种载体，这为抗原或抗 原决定簇的设计和构建提供了选择(参见实施例6)。载体pAV1-4设计 用于在大肠杆菌中表达FOS融合体；载体pAV5和pAV6设计用于在真 核细胞中表达FOS融合蛋白。这些载体的特性简述如下：
1.pAV1：该载体设计用于向大肠杆菌周质间隙中分泌在C端含有 FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的StuI/NotI位点。
2.pAV2：该载体设计用于向大肠杆菌周质间隙中分泌在N端含有 FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/EcoRV(或 NotI/HindIII)位点。
3.pAV3：该载体设计用于在大肠杆菌的细胞质中产生C端含有FOS 的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的EcoRV/NotI位点。
4.pAV4：该载体设计用于在大肠杆菌的细胞质中产生N端含有FOS 的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/EcoRV(或 NotI/HindIII)位点。在蛋白质合成后蛋白水解除去N端甲硫氨酸残基 (Hirel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8247-8251(1989))。
5.pAV5：该载体设计用于真核产生C端含有FOS的融合蛋白。目 的基因(g.o.i)可以通过连接到该载体的Eco47III/NotI位点内插入在编 码hGH信号序列的序列与编码FOS域的序列之间。或者，含有自身信 号序列的基因也可通过连接到StuI/NotI位点内与FOS编码区融合。
6.pAV6：该载体设计用于真核产生N端含有FOS的融合蛋白。目 的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/StuI(或NotI/HindIII)位点。
本领域技术人员会理解，FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白的构 建可包括添加特定的遗传元件，以促进重组蛋白的产生。实施例4为添 加特定大肠杆菌翻译调节元件提供了指导，实施例7为添加真核信号序 列提供了指导。也可根据技术人员的特殊需要选择其它遗传元件。
本发明也包括在细菌(实施例5)或真核细胞(实施例8)中产生 FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白。本领域技术人员知道选择何种 细胞类型表达融合蛋白，这取决于多种因素，例如在组合物的设计中， 翻译后修饰是否是一个重要的考虑因素。
如前所述，本发明公开了利用pAV载体构建FOS-抗原或FOS-抗原 决定簇融合蛋白的多种方法。除了允许原核和真核表达外，这些载体还 能使技术人员选择向抗原的N端还是C端添加FOS亮氨酸拉链蛋白域。 提供了具体实例，其中与PLA2(实施例9)和卵白蛋白(实施例10) 形成N端和C端FOS融合体。实施例11证实了PLA2和卵白蛋白FOS 融合蛋白的纯化。
在一个更具体的实施方案中，本发明涉及HIV基因组编码的抗原或 抗原决定簇。更具体而言，这种HIV抗原或抗原决定簇是gp140。如实 施例11-15所述，HIV gp140可以制备成带有FOS亮氨酸拉链蛋白域的 形式，合成并纯化该融合蛋白，用来与本发明的非天然分子支架附着。 本领域技术人员会知道，在生产本发明的组合物时也可以使用其它HIV 抗原或抗原决定簇。
在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种流感病毒 核酸编码的抗原或抗原决定簇的疫苗组合物，和这种疫苗组合物在引发 免疫应答中的应用。在一个更具体的实施方案中，流感抗原或抗原决定 簇可以是一种M2蛋白(例如具有SEQ ID NO：213所示氨基酸序列的 M2蛋白，GenBank登录号P06821，或SEQ ID NO：212，PIR登录号 MFIV62)，或其片段(例如SEQ ID NO：213中约2-24个氨基酸，SEQ ID NO：212的氨基酸序列)。此外，流感抗原或抗原决定簇也可以通过 肽键或非肽键与非天然分子支架或核心颗粒偶联。当流感抗原或抗原决 定簇通过肽键与非天然分子支架或核心颗粒偶联时，通常将形成融合蛋 白表达产物形式的有序、重复阵列的分子。然而，更优选的实施方案是 一种如下组合物，其中M2肽通过化学交联与本发明公开的Qβ衣壳蛋 白、HBcAg衣壳蛋白或菌毛偶联。
适用于本发明的M2蛋白的(例如具有SEQ ID NO：213氨基酸序 列的M2蛋白)以及寻求免疫应答的其它蛋白质的不同部分，可以包含 或者由长度为任意氨基酸数量、但长度通常至少6个氨基酸的肽组成(例 如长度为6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95或97个氨基酸的肽)。
在本发明的另一个具体实施方案中，选择的第二附着位点是一个半 胱氨酸残基，它与本发明的非天然分子支架或核心颗粒的一个赖氨酸残 基特异性结合，或者选择的第二附着位点是一个赖氨酸残基，它与本发 明的非天然分子支架或核心颗粒的一个半胱氨酸残基特异性结合。赖氨 酸残基(Lys)与半胱氨酸残基(Cys)的化学连接为在支架或核心颗粒 表面上形成有组织的、重复抗原或抗原决定簇阵列提供了基础。半胱氨 酸或赖氨酸残基可以通过基因工程方法在选择的抗原或抗原决定簇在 氨基端、羧基端或(希望时)蛋白质内部框内构建。例如，为PLA2和 HIV gp140提供一个半胱氨酸残基，用来与赖氨酸残基第一附着位点连 接。在其它具体实施方案中，本发明提供适于在预防和/或减弱变态反应 (如导致过敏反应的变态反应)的方法中使用的疫苗组合物。因此，本 发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或减弱变态反应的抗体的组 合物。因此，在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括引发针对一 种变应原的免疫应答的组合物。这类变应原的例子包括磷脂酶如Apis mellifera(SEQ ID NO：168，GenBank登录号443189；SEQ ID NO：169， GenBank登录号229378)、Apis dorsata(SEQ ID NO：170，GenBank登 录号B59055)、Apis cerana(SEQ ID NO：171，GenBank登录号A59055)、 Bombus pennsylvanicus(SEQ ID NO：172，GenBank登录号B56338) 和Heloderma suspectum(SEQ ID NO：173，GenBank登录号P80003； SEQ ID NO：174，GenBank登录号S14764；SEQ ID NO：175，GenBank 登录号226711)的磷脂酶A2(PLA2)蛋白。
以Apis mellifera的PLA2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：168)为 例，在预防和/或减弱变态反应的组合物中也可使用代表完整PLA2序列 任何部分的长度至少约为60个氨基酸的肽。这类肽的例子包括含有SEQ ID NO：168的氨基酸1-60、SEQ ID NO：168的氨基酸1-70、SEQ ID NO： 168的氨基酸10-70、SEQ ID NO：168的氨基酸20-80、SEQ ID NO：168 的氨基酸30-90、SEQ ID NO：168的氨基酸40-100、SEQ ID NO：168 的氨基酸47-99、SEQ ID NO：168的氨基酸50-110、SEQ ID NO：168 的氨基酸60-120、SEQ ID NO：168的氨基酸70-130或SEQ ID NO：168 的氨基酸90-134的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白)的 相应部分。这类肽的其它例子包括含有SEQ ID NO：168的氨基酸1-10、 SEQ ID NO：168的氨基酸5-15、SEQ ID NO：168的氨基酸10-20、SEQ ID NO：168的氨基酸20-30、SEQ ID NO：168的氨基酸30-40、SEQ ID NO：168的氨基酸40-50、SEQ ID NO：168的氨基酸50-60、SEQ ID NO： 168的氨基酸60-70、SEQ ID NO：168的氨基酸70-80、SEQ ID NO：168 的氨基酸80-90、SEQ ID NO：168的氨基酸90-100、SEQ ID NO：168 的氨基酸100-110、SEQ ID NO：168的氨基酸110-120或SEQ ID NO： 168的氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白) 的相应部分。
适用于本发明的PLA2部分以及寻求其免疫应答的其它蛋白质的部 分可包含或者由长度一般为至少6个氨基酸的肽(例如长度为6、7、8、 9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95或100个氨基酸的肽)组成。
PLA2肽(例如上述全长PLA2蛋白及其部分)也可以与能形成有序、 重复的抗原阵列的任何物质(例如Qβ衣壳蛋白或其片段)偶联。
在本发明的另一方面，本发明提供特别适于治疗和/或预防“自身”基 因产物所致或加重的疾病的组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，抗原决定簇是RANKL(NFKB配 体的受体激活物)。RANKL也被称为TRANCE(TNF相关激活诱导的 细胞因子)、ODF(破骨细胞分化因子)或OPGL(Osteoprotegerin配体)。 人RANKL胞外部分的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：221 (RNAKL human：TrEMBL：O14788)，而一种人同种型的氨基酸序列 显示于SEQ ID NO：222。鼠RNAKL和一种同种型的胞外部分的序列 分别显示于SEQ ID NO：223(RANKL mouse：TrEMBL：O35235)、 SEQ ID NO：224(RANKL mouse剪接形式：TrEMBL：Q9JJK8和 TrEMBL：Q9JJK9)。
已经表明，RANKL是破骨细胞生成中的一个重要因子。抑制 RANKL与其受体RNAK的相互作用能抑制破骨细胞生成，从而提供了 一种防止可见于骨质疏松和其它疾病的过量骨吸收的方法。 RANKL/RANK相互作用受RANK-Fc融合蛋白或RANKL的可溶性诱饵 受体(称为osteoprotegerin OPG)抑制。
在免疫系统中，RANKL在T细胞上表达，而RANK发现于抗原递 呈细胞上。RANKL-RANK相互作用对于不依赖CD40L的T辅助细胞激 活非常重要(Bachmann等人，J.Exp.Med.7：1025(1999))，并且延长 树突细胞的寿命并增强其佐剂特性(Josien等人，J Exp Med.191：495 (2000))。
在骨骼中，RANKL在基质细胞或成骨细胞上表达，而RANK在破 骨细胞前体上表达。RANK与RANKL的相互作用对于破骨细胞前体发 育为成熟破骨细胞至关重要。osteoprotegerin能阻断这种相互作用。
OPG-缺陷小鼠会患骨质疏松，这可通过注射重组OPG拯救。这意 味着OPG能够逆转骨质疏松。因此，通过注射本发明的这一特别实施 方案的组合物抑制RANK-RANKL相互作用可以逆转骨质疏松。
另外，在OPG敲除小鼠中也观察到动脉钙化，注射OPG能够逆转 (Min等人，J.Exp.Med.4：463(2000))。在佐剂诱导的关节炎模型上， 注射OPG能够阻止骨损失和软骨破坏，但不能阻止炎症(爪肿胀)。假 定激活的T细胞导致RANKL介导的破骨细胞产生增多和骨损失。OPG 可抑制前列腺癌诱导的破骨细胞生成，并阻止前列腺癌在小鼠骨骼中的 生长。在小鼠中，OPG能够减轻晚期骨癌的疼痛。
RANKL是一种245个氨基酸的跨膜蛋白，属于TNF超家族。TACE 样蛋白酶能够释放其胞外区部分(178个氨基酸)(Lum等人，J Biol Chem.274：13613(1999))。另外，也曾描述了缺乏跨膜域的剪接变体 (Ikeda等人，Endocrinology 142：1419(2001))。释放的部分含有与可 溶性TNF-α高度同源的域。RANKL的这种胞外域形成可见于TNF-α的 同型三聚体。其C端似乎与三聚体接触位点有关。该序列区内含有一个 半胱氨酸。
我们建立了RANKL相应区的三维结构模型，发现在与本发明的载 体上的第一附着位点相互作用的折叠结构中，天然存在的半胱氨酸可能 不可接近。优选在N端附着含有一个氨基酸接头的第二附着位点，其中 含另一个半胱氨酸残基。一种人-RANKL构建体是本发明的一个非常优 选的实施方案，其中含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头与RANKL胞 外部分融合。然而，含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头作为第二附着 位点与RANKL序列或RANKL胞外部分的C端融合构成本发明另外的 优选实施方案。
人-RANKL构建体，如SEQ ID NO：320所确定的，根据实施例6 所公开的内容制备，本领域技术人员能够通过蛋白质序列比对比较鼠与 人RANKL序列，以鉴定将要克隆入实施例6所述载体中的人-RANKL 序列部分。含有氨基酸138-317并对应于人RANKL胞外域C端区的片 段是本发明特别优选的实施方案，可以被修饰用于如本发明要求的与 VLP和菌毛偶联。然而，为在以下所述适当宿主中表达也可采用其它适 当的载体。本发明的范围内还包括其它人-RANKL构建体，特别是包含 能被TACE样蛋白酶释放的胞外区部分(178个氨基酸)或其片段(Lum 等人，J Biol Chem.274：13613(1999))的那些，或者包含对应于缺乏 跨膜域的其他剪接变体之序列及其保守片段的那些。包含氨基酸165-317 的人C端片段也是本发明的实施方案。或者，本发明的范围内也包括包 含整个胞外区(氨基酸71-317)的片段，可将其修饰以便如本发明所要 求的与VLP和菌毛偶联。
RANKL已经在不同系统中表达(大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物 细胞)，并且显示具有活性，因此，生产组合物的抗原可以采用多种表 达系统。在蛋白质的表达定向于大肠杆菌周质的情况中，RANKL的或 由蛋白质胞外部分组成的RANKL构建体的信号肽被替换为细菌信号 肽，这两种蛋白都可能被修饰，以便包含一个根据本发明的第二附着位 点。为了在大肠杆菌细胞质中表达蛋白质，RANKL构建体应不含信号 肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是MIF或其片段。 MIF是一种细胞因子，最早在1966年对其作为巨噬细胞迁移抑制剂的 功能由过描述。它也被称为延迟早期反应蛋白6(DER6)、糖基化抑制 因子或苯丙酮酸互变异构酶。最后一个名称起因于MIF的酶活性，然而 其内源底物尚未确定。
已经表明MIF与多种疾病有关。在结核菌素诱导的迟发型超敏 (DTH)反应中MIF(mRNA和蛋白质)被正调节，抗-MIF抗体抑制 该DTH反应。在同种异体肾移植排斥中MIF也被正调节。在眼自身免 疫病—实验自身免疫眼色素层视网膜炎(EAU)-的一个模型中，抗 MIF治疗使EAU发展延迟。患者血清中MIF升高，在Behcet病患者和 虹膜睫状体炎患者中也是如此。MIF免疫可能是一种治疗类风湿性关节 炎的方法。
在特应性皮炎患者中发现有高血清MIF浓度。在皮肤损伤中，MIF 广泛表达，而不是象对照中一样在基细胞层中发现。MIF浓度在类固醇 治疗后降低，这与MIF在炎症中的作用一致。也发现MIF对肾小球肾 炎的发生有作用。用抗MIF抗体治疗的动物显示肾小球肾炎明显缓解。 MIF是垂体产生、分泌的，例如在LPS刺激后产生，并且加重内毒素血 症。因此，抗-MIF单克隆抗体抑制内毒素血症和脓毒性休克，而重组 MIF显著提高腹膜炎的致死性。MIF也是一种糖皮质激素诱导的细胞因 子产生调节剂，并且促发炎症。
MIF由T细胞(Th2)产生，支持T细胞的增殖，抗MIF治疗降低 T细胞增殖和IgG水平。在多发性硬化症和神经Behcet病患者的脑脊液 中MIF浓度升高。在长期银屑病患者的血清中也发现高MIF水平。在 溃疡性结肠炎患者的血清中也发现高MIF水平，但在节段性肠炎患者中 未发现。
在支气管哮喘患者的血清中发现高MIF水平。在类风湿性关节炎患 者的滑液中MIF也被正调节。在小鼠和大鼠模型中，抗-MIF治疗可有 效缓解类风湿性关节炎(Mikulowska等人，J.Immunol.158：5514-7 (1997)；Leech等人，Arthritis Rheum.41：910-7(1998)；Leech等 人，Arthritis Rheum.43：827-33(2000)；Santos等人，Clin.Exp.Immunol. 123：309-14(2001))。因此，旨在应用包含MIF作为抗原决定簇的 组合物抑制MIF活性的治疗可能有利于上述疾病。
来自小鼠、大鼠和人的MIF由114个氨基酸组成，含有三个保守半 胱氨酸，如SEQ ID NO：225(MIF rat：SwissProt)、SEQ ID NO：226 (MIF mouse：SwissProt)和SEQ ID NO：227(MIF human：SwissProt) 所示。三个亚单位构成一个同型三聚体，它不是被二硫键稳定的。已解 析了X-射线结构，显示有三个游离半胱氨酸(Sun等人，PNAS 93： 5191-96(1996))，而一些文献数据宣称存在二硫键。但是，没有半胱氨 酸暴露得足以与载体上可能的第一附着位点最佳相互作用。因此，因为 蛋白质的C端在三聚体结构中暴露，为了在本发明的优选实施方案中产 生第二附着位点，优选地在蛋白质的C端添加一个含有游离半胱氨酸残 基的氨基酸接头，如实施例4关于大鼠-MIF所述。
小鼠-MIF与大鼠-MIF之间只有一个氨基酸改变，类似地，人-MIF 与大鼠MIF或人-MIF与小鼠-MIF之间也有极高的序列同源性(约90％ 序列相同)。根据本发明的人-MIF和小鼠-MIF构建体在实施例4中描述， 并且能如所公开的产生。为了证实与本发明的核心颗粒结合的MIF蛋白 或其片段具有诱导自身特异性免疫应答的高效能，给小鼠注射与Qβ衣 壳蛋白偶联的大鼠-MIF构建体。用大鼠-MIF免疫小鼠获得高抗体效价， 这表明，用与病毒样颗粒、特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF构建体免 疫克服了对自身抗原免疫的耐受(实施例4)。因此，包含与核心颗粒结 合的，优选地与菌毛或病毒样颗粒结合的，更优选地与RNA-噬菌体的 病毒样颗粒结合的，再更优选地与RNA-噬菌体Qβ或fr结合的人-MIF 蛋白的本发明组合物，是本发明极其优选的实施方案。
然而，在MIF序列的N端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头产 生本发明另外的优选实施方案。MIF已经在大肠杆菌中表达、纯化，并 且显示具有全部功能(Bernhagen等人，Biochemistry 33：14144-155 (1994))。因此，对于产生本发明的优选实施方案，MIF优选地可以在 大肠杆菌中表达。
如果未从构建体上切下起始甲硫氨酸，MIF的互变异构酶活性受到 抑制。在大肠杆菌中表达的、实施例4描述的MIF构建体显示互变异构 酶活性。已切除起始甲硫氨酸并且序列中起始甲硫氨酸之后的脯氨酸残 基突变为丙氨酸的MIF突变体不显示互变异构酶活性，是本发明的其它 实施方案，包括于本发明的范围内。在某些特别实施方案中，用无互变 异构酶活性的MIF突变体免疫。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是白介素-17 (IL-17)。人IL-17是一种32kDa的、二硫键连接的、具有可变糖基化 的同型二聚体蛋白(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486(1995)； Fossiez，F.等人，J.Exp.Med.183：2593-2603(1996))。该蛋白质包含 155个氨基酸，包含19-23个残基的N端分泌信号序列。IL-17的氨基酸 序列仅类似于疱疹病毒蛋白(HSV13)，与其它细胞因子或已知蛋白质 没有相似性。人IL-17的氨基酸序列在SEQ ID NO：228(登录号 AAC50341)中显示，小鼠蛋白质序列在SEQ ID NO：229(登录号 AAA37490)中显示。在所评价的大量组织和细胞系中，只在激活的T 细胞和12-十四酸13-乙酸佛波酯/离子霉素刺激的外周血单核细胞中检 测到编码IL-17的mRNA转录物(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486 (1995)；Fossiez，F.等人，J.Exp.Med.183：2593-2603(1996))。人 和小鼠序列都含有6个半胱氨酸残基。
IL-17受体在许多组织和细胞型中广泛表达(Yao，Z.等人，Cytokine 9：794-800(1997))。尽管根据人IL-17受体的氨基酸序列(866个氨基 酸)可以预测一种含有一个跨膜域和一个525个氨基酸长胞内域的蛋白 质，但是该受体序列是独特的，与来自细胞因子/生长因子受体家族的任 何受体的序列没有相似性。IL-17本身与其它已知蛋白质缺乏相似性， 这些事实结合起来表明，IL-17及其受体可能是一种新的信号蛋白和受 体家族的一部分。临床研究表明，IL-17可能与多种炎症疾病有关。IL-17 由类风湿性关节炎患者的滑膜T细胞分泌，并刺激炎症介质的产生 (Chabaud，M.等人，J.Immunol.161：409-414(1998)；Chabaud，M.等 人，Arthritis Rheum.42：963-970(1999))。在类风湿性关节炎患者中报 告有高水平的IL-17(Ziolkowska等人，J.Immunol.164：2832-8(2000))。
已经显示，白介素17对鼠膝关节中的蛋白聚糖降解有影响(Dudler J.等人，Ann Rheum Dis.59：529-32(2000))，并且促使滑膜基质破坏 (Chabaud M.等人，Cytokine.12：1092-9(2000))。有相关动物关节炎 模型用来检测MIF免疫的效果(Chabaud M.等人，Cytokine.12：1092-9 (2000))。在多发性硬化症患者的单核细胞中发现IL-17mRNA水平升 高(Matusevicius，D.等人，Mult.Scler.5：101-104(1999))。在系统性 红斑狼疮患者中也发现血清IL-17水平升高(Wong C.K.等人，Lupus9： 589-93(2000))。另外，在从损伤性银屑病皮肤分离的T细胞中，IL-17 mRNA水平也升高(Teunissen，M.B.等人，J.Invest.Dermatol.111：645-649 (1998))。
IL-17与肾移植排斥的相关性也已经得到证实(Fossiez，F.等人，Int. Rev.Immunol.16：541-51(1998))。Antonysamy等人(J.Immunol.162： 577-84(1999))提出了IL-17在器官异体移植排斥中作用的证据，他们 证明IL-17促进树突细胞祖细胞的功能分化。他们的发现提示IL-17在 异体T细胞增殖中的作用，这可通过对DC的成熟诱导作用部分介导。 此外，同-小组报告(Tang J.L等人，Transplantation 72：348-50(2001)) 了IL-17在急性血管排斥的免疫发病机理中的作用，其中白介素-17的拮 抗作用抑制急性血管排斥但不抑制慢性血管排斥。IL-17似乎具有作为 同种异体移植中治疗干预新靶标的潜力。
上述发现提示IL-17在炎症反应的开始或持续中可能起关键性作用 (Jovanovic，D.V.等人，J.Immunol.160：3513-3521(1998))。
抗-IL-17单克隆抗体mAb5(Schering-Plough研究所)能够完全抑制 50ng/mlIL-17诱导后类风湿性关节炎(RA)滑膜上清液中IL-6的产生。 一种无关的mAb MX1在该试验中没有作用。mAb5是在用人rIL-17(r＝ 重组)免疫后获得的一种小鼠IgG1。在该试验系统中，浓度为1μg/ml 的mAb5能够完全抑制IL-6的产生(Chabaud M.等人，J.Immunol.161： 409-414(1998))。因此，IL-17免疫提供了一种治疗上述多种疾病的方 法。
因此，在本发明的另一个优选实施方案中，组合物包含一种接头， 该接头含有一个第二附着位点，并与重组IL-17的C端融合。然而在本 发明的其他优选的实施方案中，含有一个游离半胱氨酸的氨基酸接头与 对应于加工后蛋白序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式序列 的N端、信号肽的C端插入。对于真核表达系统，如此处所述的其它自 身抗原一样，必要时可以将IL-17基因的信号肽替换为另一种信号肽。 对于细菌中的表达，为了在周质中可溶性表达，将信号肽替换为细菌信 号肽，或者为了在细胞质中表达，将其删除。缺乏信号肽的人IL-17的 构建体优选地含有残基24-155、22-155、21-155或20-155。缺乏信号肽 的小鼠IL-17的构建体优选地含有残基26-158、25-158、24-158或27-155。 人IL-17可以在CV1/EBNA细胞中表达；重组hIL-17显示以糖基化及非 糖基化形式分泌(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486(1995))。 IL-17也能表达为hIL-17/Fc融合蛋白，然后从融合蛋白上切下IL-17蛋 白。IL-17也可以在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达(Murphy K.P. 等人，Protein Expr Purif.12：208-14(1998))。人IL-17也可以在大肠杆 菌中表达。当IL-17在大肠杆菌中的表达定向于周质时，将IL-17的信 号肽替换为细菌信号肽。为了在大肠杆菌细胞质中表达蛋白质，IL-17 构建体应当不含信号肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是白介素-13 (IL-13)。IL-13是由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，主要影响 单核细胞、巨噬细胞和B细胞。前体人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO： 230中显示，加工后的人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO：231中显示。 前体蛋白的前20个氨基酸对应于信号肽，在加工后的蛋白质中不存在。 小鼠序列也已经报道，加工后的氨基酸序列在SEQ ID NO：232中显示 (Brown K.D.等人，J.Immunol.142：679-687(1989))。根据表达宿主， 例如为了在真核宿主中表达和分泌，IL-13构建体将包含前体蛋白的序 列，或者例如为了在大肠杆菌中细胞质表达，由成熟蛋白质组成。为了 在大肠杆菌周质中表达，IL-13的信号肽替换为细菌信号肽。
IL-13是一种T辅助细胞2产生的细胞因子(类似于IL-4、IL-5)， 最近表明它与变态反应气管反应(哮喘)有关。在多种肿瘤类型(例如 何杰金淋巴瘤)中发现了IL-13和IL-13受体的正调节。白介素13由何 杰金和里-施细胞分泌并刺激它们的生长(Kapp U等人，J Exp Med.189： 1939-46(1999))。因此，IL-13免疫提供了一种治疗上述疾病(如哮 喘或何杰金淋巴瘤)的方法。
优选地，该组合物包含一种氨基酸接头，该接头含有一个游离半胱 氨酸残基并与成熟IL-13序列的N端或C端融合，以在该蛋白质内引入 一个第二附着位点。在其他优选的实施方案中，向IL-13成熟形式的N 端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头，因为根据IL-13的NMR结 构，该N端可以自由接近(Eisenmesser，E.Z.等人，J.Mol.Biol.310：231 (2001)。在进一步优选的实施方案中，含游离半胱氨酸的氨基酸接头 与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式 的序列N端、信号肽的C端插入。在进一步优选的实施方案中，向该蛋 白质的C端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头。
IL-13可以在大肠杆菌(Eisenmesser，E.Z.等人，Proten Expr.Purif.20： 186-95(2000))或NS-0细胞(真核细胞系)(Cannon-Carlson S.等人， Protein Expr.Purif.12：238-48(1998))中表达。实施例9描述了与含半 胱氨酸残基的氨基酸接头融合的鼠IL-13的构建体和该构建体在细菌和 真核宿主中的表达。人IL-13构建体可以按照实施例9所述制备，融合 蛋白表达并分别用因子Xa和肠激酶切割后，产生蛋白质人C-IL-13-F (SEQ ID NO：330)和人C-IL-13-S(SEQ ID NO：331)。这样产生的 蛋白质能与VLP和菌毛偶联，产生本发明的优选实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，抗原决定簇是白介素-5(IL-5)。IL-5 是用于嗜酸性粒细胞生成(eosinophilopoiesis)的一种谱系特异性细胞因 子，在与嗜酸性粒细胞数量升高有关的疾病(如哮喘)中起重要作用。 前体和加工后人IL-5的序列分别在SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：234 中列出，加工后的小鼠氨基酸序列在SEQ ID NO：235中显示。
在几项研究中显示了IL-5的生物学功能(Coffman R.L.等人，Science 245：308-10(1989)；Kopf等人，Immunity 4：15-24(1996))，指出了 在嗜酸性粒细胞介导的疾病中抑制IL-5功能的有利作用。IL-5作用的抑 制提供了一种治疗哮喘和与嗜酸性粒细胞有关的其它疾病的方法。
IL-5通过一个二硫键共价连接形成一种二聚体。曾经报告了一种单 链(sc)构建体，其中两个IL-5单体通过一个肽接头连接。
在本发明的优选实施方案中，在IL-5加工后形式的序列N端添加一 个含游离半胱氨酸的肽接头。优选地也可以在scIL-5加工后形式的序列 N端添加一个含游离半胱氨酸的接头。在其他优选的实施方案中，含游 离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融合， 或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。
在另外优选的实施方案中，含游离半胱氨酸的接头与IL-5序列的C 端融合，或者与scIL-5序列的C端融合。
曾经描述了可用于IL-5的多种表达系统，它们可以用于制备本发明 的组合物。Proudfoot等人(Biochem J.270：357-61(1990))描述了一 种采用大肠杆菌的细菌表达系统。如果在大肠杆菌的细胞质中表达IL-5， IL-5构建体不含信号肽。为了制备本发明的组合物，也可以用昆虫细胞 生产IL-5构建体(Pierrot C.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.253： 756-60(1998))。同样，也可以采用杆状病毒表达系统(sf9细胞；Ingley E.等人，Eur.J.Biochem.196：623-9(1991)和Brown P.M.等人，Protein Expr.Purif.6：63-71(1995))。最后，也曾报告哺乳动物表达系统(CHO 细胞)，并可用于制备本发明的组合物(Kodama S等人，J.Biochem. (Tokyo)110：693-701(1991))。
也已报道了用于小鼠IL-5的杆状病毒表达系统(Mitchell等人， Biochem.Soc.Trans.21：332S(1993)；Kunimoto DY等人，Cytokine 3： 224-30(1991))和采用CHO细胞的哺乳动物细胞表达系统(Kodama S 等人，Glycobiology 2：419-27(1992))。
实施例10描述了鼠IL-5构建体的表达，其中为了与VLP和菌毛偶 联，IL-5序列在其N端与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合。人构建 体可按照实施例10所述制备，产生适于与VLP和菌毛偶联从而产生本 发明优选实施方案的蛋白质人C-IL-5-E(SEQ ID NO：335)、人C-IL-5-F (SEQ ID NO：336)和人C-IL-5-S(SEQ ID NO：337)。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是CCL-21。CCL-21 是CC亚家族的一种趋化因子，也被称为诱导型小细胞因子A21、 exodus-2、SLD(次级淋巴细胞细胞因子)、TCA4(胸腺来源的趋化剂4) 或6Ckine。
CCL21抑制血细胞生成并刺激胸腺细胞、激活的T细胞和树突细胞 的趋化性，但不刺激B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的趋化性。它显 示对幼稚T细胞具有优先活性。它也是一种肾小球系膜细胞的强化学引 诱剂。CCL21可结合趋化因子受体CCR7和CXCR3(取决于物种)。它 能在生理剪切下触发依赖整联蛋白的淋巴细胞翻滚的快速终止，并由高 内皮微静脉高度表达。
在人肺癌SCID小鼠模型(Arenberg等人，Cancer Immunol. Immunother.49：587-92(2001))和小鼠结肠癌肿瘤模型(Vicari等人， J.Immunol.165：1992-2000(2001))中，鼠CCL21抑制肿瘤生长和血 管生成。在大鼠角膜微袋试验中也检测到了鼠CCL21的血管抑制活性 (Soto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8205-10(1998))。
已经表明，在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4被正调 节，其各自的配体CCL21和CXCL12在作为乳腺癌第一转移目标的器 官中高度表达(Müller等人，Nature 410：50-6(2001))。体外CCL21 介导的趋化作用能被中和性抗-CCL21抗体阻断，正如CXCR4-介导的趋 化作用能被对应的抗体阻断。因此，CCL21免疫提供了一种治疗癌症(更 具体而言是乳腺癌)转移扩散的方法。
分泌的CCL21在小鼠和人类中分别由110或111个氨基酸组成。其 各自的序列在SEQ ID NO：236(Swissprot：SY21 human)和SEQ ID NO： 237(Swissprot：SY21 mouse)中显示。与其它CC细胞因子不同，CCL21 在C端延伸区内含有两个额外的半胱氨酸。假定所有半胱氨酸都参与二 硫键。
下文描述了用来制备包含CCL21抗原决定簇的本发明组合物的构 建体和表达系统。在同源蛋白质嗜酸细胞活化趋化因子的NMR结构中， N端和C端都暴露于溶剂。在某些具体实施方案中，在蛋白质C端添加 一个含游离半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头。曾经表达了一种 含碱性磷酸酶(在CCL21的C端)的融合蛋白，显示具有功能性，表 明在CCL21的C端融合与受体结合相容。在其它具体实施方案中，含 游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融 合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。
曾经描述了用于生产CCL21的几种表达系统(例如，Hedrick等人， J Immunol.159：1589-93(1997))。例如，可以在杆状病毒系统中表达 (Nagira等人，J.Biol.Chem.272：19518-24(1997))。
在一个相关的优选实施方案中，抗原决定簇是基质衍生因子-1 (SDF-1)，现在称为CXCL12。CXCL12是骨髓基质细胞产生的一种趋 化因子，最初被确定为前B细胞的一种刺激因子。
如上所述，已经表明，在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4 被正调节，而其各自的配体CCL21和SDF-1在作为乳腺癌转移第一目 标的器官中高度表达(Müller等人，Nature 410：50-6(2001))。体外 SDF-1/CXCR4介导的趋化作用能被中和性抗-SDF-1抗体和抗-CXCR4- 抗体抑制。
在采用人MDA-MB-231乳腺癌细胞系的SCID小鼠乳腺癌转移模型 中，当用抗-CXCR4抗体处理小鼠时，观察到肺转移显著减少。在引流 的淋巴结中，观察到向腹股沟和腋窝淋巴结的转移减少(38％转移，而 在对照中为100％)。因此，CXCL12免疫提供了一种治疗癌症(特别 是乳腺癌)转移的方法。
已经表明，SDF-1/CXCR4趋化因子受体对能提高更多原始造血祖细 胞向骨髓归巢的效能。另外，还推断CXCR4和SDF-1能影响慢性淋巴 细胞白血病细胞的分布。这些细胞不停地浸润患者的骨髓，显示它们在 骨髓中的迁移是依赖于CXCR4的。慢性淋巴细胞白血病细胞经历凋亡， 除非它们与基质细胞共培养。SDF-1阻断抗体能抑制基质细胞的这种保 护作用(Burger等人，Blood 96：2655-63(2000))。因此CXCL12免疫 提供了一种治疗慢性淋巴细胞白血病的方法。
已经表明，CXCR4是HIV进入T细胞的一种共同受体。SDF-1抑 制CD4+细胞的X4(CXCR4依赖的)HIV株感染(Oberlin等人，Nature 382：833-5(1996)；Bleul等人，Nature 382：829-33(1996)；Rusconi 等人，Antivir.Ther.5：199-204(2000))。已证明SDF-1的合成肽类似 物可有效抑制HIV-1通过CXCR4受体进入并感染(WO059928A1)。因 此，CXCL12免疫提供了一种阻断HIV进入T细胞的方法，因而提供了 一种治疗AIDS的方法。
也曾报告SDF-1-CXCR4相互作用在类风湿性关节炎滑膜中的CD4+ T细胞积累中起关键作用(Nanki等人，2000)。因此SDF-1免疫提供了 一种治疗类风湿性关节炎的方法。
已知人和鼠SDF-1通过一种基因的不同剪接以两种形式存在 -SDF-1α和SDF-1β。它们的不同在于4个C端氨基酸，在SDF-1β中存 在(74个氨基酸)而在SDF-1α中不存在(70个氨基酸)。人SDF-1序 列在SEQ ID NO：238中显示(Swissprot：SDF1 human)，鼠SDF-1序 列在SEQ ID NO：239中显示(Swissprot：SDF1 mouse)。SDF-1含有4 个保守半胱氨酸，形成两个分子内二硫键。SDF的晶体结构显示为一种 非共价连接的二聚体(Dealwis等人，PNAS 95：6941-46(1998))。SDF-1 结构也显示长N端延伸。
利用丙氨酸扫描诱变鉴定了SDF-1上的(部分)受体结合位点 (Ohnishi等人，J.Interferon Cytokine Res.20：691-700(2000))，Elisseeva 等人(J.Biol.Chem.275：26799-805(2000))和Heveker等人(Curr.Biol. 8：369-76(1998))描述了抑制受体结合(和HIV进入)的SDF-1衍生 的肽。
下文描述了适于生产与SDF-1有关的本发明组合物的构建体和表达 系统。SDF-1的N端和C端暴露于溶剂。在具体实施方案中，含有一个 半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头与蛋白质序列的C端融合，而 在其它具体实施方案中，含有一个半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸 接头与蛋白质序列的N端融合。含有一个游离半胱氨酸的氨基酸接头与 对应于加工后蛋白质序列的序列的N端融合，或在蛋白质成熟形式的序 列的N端、信号肽的C端插入。编码这些特定构建体的基因可以克隆到 适当的表达载体中。
已报道了SDF-1在鸡胚成纤维细胞仙台病毒系统中的表达(Moriya 等人，FEBS Lett.425：105-11(1998))以及在大肠杆菌中的表达(Holmes 等人，Prot.Expr.Purif.21：367-77(2001))和SDF-1的化学合成(Dealwis 等人，PNAS 95：6941-46(2001))。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是BLC。B淋巴细 胞化学引诱剂(BLC，CXCL13)在脾脏、派尔结和淋巴结中表达(Gunn 等人，1998)。它在生发中心的表达最强烈，在这里B细胞经历体细胞 突变和亲和力成熟。它属于CXC趋化因子家族，其最接近的同源物是 GROα(Gunn等人，Nature 391：799-803(1998))。人BLC与鼠BLC 64％同源。其受体为CXCR5。BLC与IL-8也有同源性。BLC向次级淋 巴器官(如脾脏和派尔结)的滤泡中补充B细胞。向富含滤泡状树突细 胞(FDC)的淋巴结区室中补充B细胞也需要BLC(Ansel等人，Nature 406：309-314(2000))。BLC也诱导淋巴毒素α1β2(LT？α1β2)在补充 的B细胞上的增强表达。这提供了一种正反馈环，因为LT？α1β2促进 BLC表达(Ansel等人，Nature 406：309-314(2000))。BLC也显示能 诱导淋巴新生(Luther等人，Immunity 12：471-481(2000))。FDC似 乎也表达BLC。因此BLC免疫可提供一种治疗与淋巴新生有关的自身 免疫病(如类风湿性滑膜炎和类风湿性关节炎或I型糖尿病)的方法。 已经描述了携带C端his尾的一种BLC构建体，它具有功能性(Ansel， K.M.等人，J.Exp.Med.190：1123-1134(1999))。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含一种接头，该 接头含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点，并在BLC序列的C端 融合。
在与BLC同源的IL-8中，N端和C端都是游离的。因此在另一个 优选实施方案中，向BLC的N端添加一个含有半胱氨酸作为第二附着 位点的氨基酸接头，产生本发明的这种具体组合物。
在本发明的另一些优选的实施方案中，组合物包含一种含游离半胱 氨酸的氨基酸接头，该接头与对应于加工后蛋白质序列的序列的N端融 合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。编码 这些具体构建体的基因可以克隆到适当的表达载体中，并相应地表达。 人BLC的序列在SEQ ID NO：240中显示(登录号：NP_006410)。该 序列的氨基酸1-22是信号肽。鼠序列在SEQ ID NO：241中显示(登录 号：NP_061354)。氨基酸1-21是信号肽。为了产生本发明的组合物， 含有BLC作为抗原决定簇的本发明组合物优选地采用蛋白质的成熟形 式。
在另一个具体实施方案中，抗原决定簇是嗜酸细胞活化趋化因子。 嗜酸细胞活化趋化因子是趋化因子受体3特异的一种趋化因子，存在于 嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞上。然而，嗜酸细胞活化趋化 因子似乎是嗜酸性粒细胞高度特异的(Zimmerman等人，J.Immunol. 165：5839-46(2000))。在嗜酸细胞活化趋化因子-1敲除小鼠中，嗜酸 性粒细胞的迁移减少70％，然而其仍能发展为嗜酸性细胞增多症 (Rothenberg等人，J.Exp.Med.185：785-90(1997))。IL-5似乎负责 嗜酸性粒细胞从骨髓向血液中的迁移，嗜酸细胞活化趋化因子负责在组 织中的局部迁移(Humbles等人，J.Exp.Med.186：601-12(1997))。
人类基因组含有3种嗜酸细胞活化趋化因子基因：嗜酸细胞活化趋 化因子1-3。它们彼此具有30％的同源性。迄今为止知道在小鼠中有两 种基因：嗜酸细胞活化趋化因子1和嗜酸细胞活化趋化因子2 (Zimmerman等人，J.Immunol.165：5839-46(2000))。它们具有38％ 的同源性。鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2与人嗜酸细胞活化趋化因子-2有 59％的同源性。在小鼠中，嗜酸细胞活化趋化因子-1似乎在胃肠道中普 遍表达，而嗜酸细胞活化趋化因子-2似乎主要在空肠中表达(Zimmerman 等人，J.Immunol.165：5839-46(2000))。在支气管-肺泡液中存在嗜酸 细胞活化趋化因子-1(Teixeira等人，J.Clin.Invest.100：1657-66(1997))。 人嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在SEQ ID NO：242中显示(氨基酸 1-23对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID NO： 243中显示(氨基酸1-26对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-3 的序列在SEQ ID NO：244中显示(氨基酸1-23对应于信号肽)，小鼠 嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在SEQ ID NO：245中显示(氨基酸1-23 对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID NO： 246中显示(氨基酸1-23对应于信号肽)。
嗜酸细胞活化趋化因子的分子量为8.3kDa。它在多种条件下在单体 与二聚体之间取得平衡，在37℃下估计的Kd为1.3mM(Crump等人， J.Biol.Chem.273：22471-9(1998))。然而单体形式是主要的。嗜酸细 胞活化趋化因子的结构已经通过NMR波谱法阐明。与其受体CCR3的 结合部位位于N端，第一个半胱氨酸之前的区域是非常重要的(Crump 等人，J.Biol.Chem.273：22471-9(1998))。与嗜酸细胞活化趋化因子 结合的趋化因子受体肽证实了这一发现。嗜酸细胞活化趋化因子含有4 个半胱氨酸，形成2个二硫键。因此，在一个优选实施方案中，本发明 的组合物包含一种含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点的氨基酸 接头，优选地与嗜酸细胞活化趋化因子序列的C端融合。在其它优选实 施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列 的序列的N端融合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的 C端插入。将编码这些特定构建体的基因克隆到适当的表达载体中。
嗜酸细胞活化趋化因子能够化学合成(Clark-Lewis等人， Biochemistry 30：3128-3135(1991))。也描述了嗜酸细胞活化趋化因子 -1在大肠杆菌细胞质中的表达(Crump等人，J.Biol.Chem.273：22471-9 (1998))。曾经描述了嗜酸细胞活化趋化因子-2在大肠杆菌中表达为随 后重折叠的包涵体(Mayer等人，Biochemistry 39：8382-95(2000))， 和昆虫细胞表达(Forssmann等人，J.Exp.Med.185：2171-6(1997))， 而且可用来实现本发明的特定实施方案。
在本发明的另一个具体实施方案中，抗原决定簇是巨噬细胞集落刺 激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-1是巨噬细胞及其骨髓祖细 胞增殖、分化和存活的一种调节剂。M-CSF的受体是一种细胞表面酪氨 酸激酶受体，由原癌基因cfms编码。M-CSF及其受体表达增强与几种 上皮癌(如乳腺癌、子宫癌和卵巢癌)的预后不良有关。易患乳癌的转 基因小鼠(PyMT)与在csf-1基因中含有隐性无效突变的小鼠杂交，产生 一种小鼠品种，用该小鼠品种研究肿瘤的进展。与PyMT小鼠相比，这 些小鼠显示晚期侵袭性癌症和肺转移均减弱(Lin等人，J.Exp.Med.193： 727-739(2001))。原因似乎是没能向肿瘤组织中补充巨噬细胞。Lewis 肺癌的皮下生长在csf.1裸鼠中也减弱。推断巨噬细胞增强肿瘤生长的机 制是通过巨噬细胞产生的血管生成因子、生长因子和蛋白酶。
已经有M-CSF可溶性形式的结构数据(晶体结构：Pandit等人， Science 258：1358-62(1992))，表明蛋白质的N端和C端都可以接近。 然而，N端靠近与受体相互作用的部分。另外，M-CSF以可溶性和细胞 表面两种形式存在，跨膜区位于C端。因此，在本发明的一个优选实施 方案中，本发明的组合物包含一种含有一个半胱氨酸的氨基酸接头，优 选地在M-CSF或其片段的C端添加，或者优选地在M-CSF可溶性形式 或其片段的C端添加。在另外的优选实施方案中，含有游离半胱氨酸的 氨基酸接头与对应于加工后蛋白质或该蛋白质可溶性形式序列的序列N 端融合，或者在该蛋白质成熟形式或该蛋白质可溶性形式序列的N端、 信号肽的C端插入。M-CSF是一种二聚体，其中两个单体通过一个链间 二硫键连接。
曾经描述了用于M-CSF N端149个氨基酸片段(功能性)的一种大 肠杆菌表达系统(Koths等人，Mol.Reprod.Dev.46：31-37(1997))。 M-CSF的这种片段，优选如上所述修饰修饰过的，是本发明的一种优选 的抗原决定簇。
人序列在SEQ ID NO：247中显示(登录号：NP 000748)。本发明 另外优选的抗原决定簇包括由SEQ ID NO：247的残基33-181或33-185 组成的N端片段，这对应于该受体的可溶性形式。
小鼠序列(登录号：NP 031804)在SEQ ID NO：248中显示。成 熟序列从氨基酸33开始。因此，本发明的一种优选抗原决定簇包括氨 基酸33-181或33-185。
在另一个具体实施方案中，抗原决定簇是抵抗素(Res)。用细菌中 表达产生的、针对小鼠抵抗素(mRes)与GST融合蛋白的兔多克隆抗 体进行被动免疫研究。在动物肥胖症/II型糖尿病模型上，这种被动免疫 导致葡萄糖摄取增强(Steppan等人，Nature 409：307-12(2001))。
抵抗素(Res)是约12 KD的一种114个氨基酸的肽类激素。它含 有11个半胱氨酸，其中最N端的一个显示负责蛋白质的二聚化，其它 10个被认为参与分子内二硫键(Banerjee和Lazar，J.Biol.Chem.276： 25970-3(2001))。第一个半胱氨酸突变为丙氨酸破坏了mRes的二聚化。
已经显示，在一动物模型中，在C端含有FLAG尾的mRes仍保留 活性(Steppan等人，Nature 409：307-12(2001))，类似地，C端具有 HA尾(血凝素尾)的抵抗素形式在组织培养测定中有活性(Kim等人， J.Biol.Chem.276：11252-6(2001))，这提示C端对引入修饰不是特别 敏感。因此，在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含一种含有半 胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头，其融合在抵抗素序列的C端。 在另外的优选实施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加 工后蛋白质序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式序列的N端、 信号肽的C端插入。
作为本发明的一个优选实施方案，MRes或huRes也可以在真核表 达系统中表达为Fc融合分子，其在抵抗素与构建体Fc部分之间，优选 地在融合蛋白Fc部分铰链区的一个或多个半胱氨酸残基的C端，含有 一个蛋白酶切割位点，或者更优选地按照实施例2的描述和公开内容表 达。切割融合蛋白释放出抵抗素，它还包含一个如实施例2所述的含有 半胱氨酸残基的氨基酸接头，或含有融合蛋白Fc部分的部分或全部铰 链区，后者在C端含有半胱氨酸残基，适于与VLP或菌毛偶联。人抵 抗素序列在SEQ ID NO：249中显示(登录号：AF323081)。小鼠序列 在SEQ ID NO：250中显示(登录号：AF323080)。本发明的一个优选 实施方案是在C端与一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头融合的人抵抗素 蛋白。人抵抗素构建体可以按照实施例2的公开内容制备，并通过蛋白 质序列比对比较鼠与人抵抗素序列，确定将要按照实施例2所述克隆到 实施例1和实施例2所述载体或其它适当表达载体中的人抵抗素序列的 部分。适用于生产本发明组合物的人抵抗素构建体的例子有人抵抗素 -C-Xa(SEQ ID NO：325)、人抵抗素-C-EK(SEQ ID NO：326)和人抵 抗素-C(SEQ ID NO：327)。
这样产生的人抵抗素构建体是本发明的一个优选实施方案。因此应 用上述本发明的组合物进行抵抗素接种可以提供一种治疗II型糖尿病和 肥胖症的方法。
在另一个实施方案中，抗原决定簇是淋巴毒素-β。淋巴毒素-β免疫 可用于治疗朊病毒介导的疾病。羊瘙痒病(一种朊病毒介导的疾病)病 原体复制被认为主要在淋巴组织中发生，并且依赖于表达朊病毒-蛋白质 的滤泡状树突细胞(FDC)(Brown等人，Nature Med.11：1308-1312 (1999))。随后表明，缺乏功能性滤泡状树突细胞的小鼠显示脾脏中 的朊病毒复制减弱，神经侵袭(略微)延迟(Montrasio等人，Science 288： 1257-1259(2000))。给小鼠注射可溶性淋巴毒素-β受体-Fc-融合蛋白 (LTβR-Fc)可实现这一点。这种可溶性受体构建体通过干扰T、B或 NK细胞上淋巴毒素-β与FDC前体细胞上淋巴毒素-β受体的相互作用， 抑制FDC的发育。因此，淋巴毒素-β(也称为TNFγ)接种可以提供一 种治疗或预防克-雅氏病(变型)或其它朊病毒介导的疾病的疫苗，从而 防止朊病毒复制和神经侵袭。
淋巴毒素-β免疫也可以提供一种治疗糖尿病的方法。在不肥胖的糖 尿病NOD小鼠中转基因表达可溶性LTβR-Fc融合蛋白阻止了糖尿病发 展，但不能阻止胰岛炎的发展(Ettinger等人，J.Exp.Med.193：1333-40 K(2001))。Wu等人(J.Exp.Med.193：1327-32(2001))也采用NOD 小鼠研究淋巴毒素-β的作用，但他们不采用转基因动物，而是注射 LTβR-Fc融合蛋白。他们观察到糖尿病发展的强烈抑制和胰岛炎的抑制。 最令人感兴趣的是，通过融合蛋白治疗甚至能逆转业已存在的胰岛炎。 胰脏中淋巴滤泡结构的形成于是能被逆转。因此，淋巴毒素-β接种提供 了一种治疗I型糖尿病的方法。
人淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO：250中显示 (TNFC_human)，鼠淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO：251中显 示(TNFC_mouse)。
在又一个优选的实施方案中，本发明组合物包含一种含有一个游离 半胱氨酸的氨基酸接头，其添加于对应于淋巴毒素-β加工后形式序列的 N端，或者插入对应于该蛋白质成熟形式的序列N端与信号肽之间，或 在信号肽的C端侧。在本发明另外的优选实施方案中，淋巴毒素-β的胞 外部分表达为一种融合蛋白，它含有在N端与淋巴毒素-β融合的谷胱甘 肽-S-转移酶，或者含有在N端与淋巴毒素-β胞外部分融合的6组氨酸 尾，其后为myc-尾。含有蛋白酶切割位点的氨基酸间隔区以及在蛋白酶 切割位点的C端含有一个游离半胱氨酸作为第二附着位点的接头序列与 淋巴毒素-β胞外部分序列的N端融合。优选地，淋巴毒素-β的胞外部 分由对应于淋巴毒素-β氨基酸49-306或126-306的片段组成。本发明的 这些具体组合物可以在pCEP-Pu真核载体中克隆并表达。在另外的优选 实施方案中，本发明组合物包含一种氨基酸接头，该接头含有一个适于 作为第二附着位点的游离半胱氨酸残基，该接头与淋巴毒素-β或淋巴毒 素-β片段的C端融合。在一个特别优选的实施方案中，氨基酸序列 LACGG与淋巴毒素-β胞外部分或淋巴毒素-β胞外部分之片段的N端融 合，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接头ACGG，该接头本身含有一个 可与VLPS和菌毛偶联的半胱氨酸残基，在用肠激酶切割如实施例3所 述在载体pCEP-SP-GST-EK或载体pCP-SP-his-myc-EK中表达的相应融 合蛋白后，产生蛋白质人C-LT·49-306(SEQ ID NO：346)和人C-LT·126-306 (SEQ ID NO：347)。
在一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是朊病毒蛋白、其片段， 特别是朊病毒蛋白的肽。在一个实施方案中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋 白。在整个说明书特别是在实施例7中提供了关于如何修饰人朊病毒蛋 白以便与核心颗粒结合的指南。小鼠朊病毒蛋白构建体已经公开，也可 以建立人朊病毒蛋白构建体，并且含有例如SEQ ID NO：348的序列。 其它构建体包含人朊病毒蛋白完整序列或人朊病毒蛋白的其它片段，它 们是本发明的其它组合物。朊病毒蛋白免疫可以提供一种治疗或预防克 -雅氏症(变型)或其它朊病毒蛋白引起的疾病的方法。用包含朊病毒蛋 白的本发明组合物免疫可以提供一种治疗其它动物中朊病毒介导的疾 病的方法，牛和绵羊的朊病毒蛋白构建体的相应序列分别在SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：350中列出。对应于实施例8所述鼠肽的人朊 病毒蛋白的肽，和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(“人 cprplong”)和CGSDYEDRYYRENMHR(“人cprpshort”)的肽，是本发明 的优选实施方案。这些肽包含用于与VLP和菌毛偶联而添加的一个N 端半胱氨酸残基。相应的牛和绵羊的肽是 CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(“牛cprplong”)和 CGNDYEDRYYRENMHR(“牛cprpshort”)、 CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(“绵羊cprplong”)和 CGNDYEDRYYRENMYR(“绵羊cprpshort”)，均为本发明的实施方案。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是肿瘤坏死因子α (TNF-α)、其片段或TNF-α的肽。特别是，通过分别用包含本发明的这 些肽或片段的疫苗和组合物免疫人或动物，能用TNF-α的肽或片段诱导 针对整个蛋白质的自身特异性免疫应答。优选地，用VLP、噬菌体或细 菌菌毛作为核心颗粒，TNF-α、其肽或片段根据本发明与之附着。
下列鼠肽是人肽的鼠同源物，它们显示能被中和TNF-α活性的抗体 结合(Yone等人，J.Biol.Chem.270：19509-19515)，在本发明的另一 个优选的实施方案中，为了与VLP、噬菌体或细菌菌毛偶联，将其用半 胱氨酸残基修饰。
MuTNF-α肽：在由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基22-32组成的表位 N端添加序列CGG：CGGVEEQLEWLSQR。
3’TNF II肽：序列CGG在由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基4-22组成 的表位C端融合，21位谷氨酰胺突变为甘氨酸。产生的肽的序列为： SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC。
5’TNF II肽：一个半胱氨酸残基与由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基 4-22组成的表位N端融合，21位谷氨酰胺突变为甘氨酸。产生的肽的 序列为：CSSQNSSDKPVAHVVANHGV。
4-22表位相应的人序列是SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ。如鼠 序列一样，为了根据本发明与VLP、噬菌体或细菌菌毛共价偶联，一个 半胱氨酸优选地在该表位的N端融合，或者序列GGC在该表位的C端 融合。然而，本发明的范围内也包括其他含有半胱氨酸的序列在表位N 端或C端融合。通常，优选地在添加的半胱氨酸残基与表位序列之间插 入一个或两个甘氨酸残基。然而，也可以插入其它氨基酸代替甘氨酸残 基，这些氨基酸残基优选地是小氨基酸，如丝氨酸。
对应于氨基酸残基22-32的人序列是QLQWLNRRANA。优选地， 为了根据本发明与VLP或细菌菌毛共价偶联，序列CGG在表位的N端 融合。适用于本发明的其它TNF-α表位也已经被描述并公开，例如Yone 等人(J.Biol.Chem.270：19509-19515)所述。
本发明还包括含有此处所述抗原或抗原决定簇的模拟位的组合物。
本发明的该具体组合物包含在病毒样颗粒或菌毛上呈现的抗体或 (优选地)抗体片段，以诱导针对该抗体的免疫应答。为了诱发针对淋 巴瘤的保护性免疫应答，可以选择淋巴瘤细胞产生的抗体或抗体片段， 与病毒样颗粒附着并免疫。
在其它实施方案中，模拟一种抗原的抗体或抗体片段与颗粒附着。 这种模拟的抗体或抗体片段可以按如下产生：用本领域公知的任何已知 方法免疫、随后分离模拟抗体或抗体片段，这类方法包括，例如：杂交 瘤技术(Gherardi，E.等人，J.Immunol.Methods 126：61-68(1990))、 噬菌体展示(Harrison等人，Methods Enzymol.267：83-109(1996))、 核糖体展示(Hanes，J.等人，Nat.Biotechnol.18：1287-1292(2000))、 酵母双杂交(Visintin，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11723-11728 (1999))、酵母表面展示(Boder，ET.& Wittrup，KD.Methods.Enzym. 328：430-444(2000))、细菌表面展示(Daugherty，PS.等人，Protein Eng. 12：613-621(1999))。模拟抗体也可以用本领域公知的方法(如上述方 法)从抗体库或原初抗体库中分离。
在另一个实施方案中，可以使用一种可识别另一种抗体的结合部位 的抗体，即抗独特型抗体，也称为免疫性抗体。可被抗独特型抗体识别 的抗体也称为中和抗体。因此，通过抗独特型抗体免疫，具有中和抗体 特异性的分子在原处产生；我们将产生的这些抗体称为诱导抗体。在另 一个优选实施方案中，选择免疫抗体，与免疫靶分子的配体分子相互作 用。配体分子可以是与靶分子相互作用的任何分子，但优先与需要产生 抗体以抑制其功能的靶分子的位点相互作用。配体分子可以是靶分子的 天然配体，或者可以是任何改构、设计或分离的具有适当结合特性的配 体。
免疫性抗体可以是来源于人的，如从原初或免疫人抗体库中分离， 或者可以从另一种动物来源(例如鼠源)的文库中分离。
抗体或抗体片段与VLP或菌毛的偶联如下实现：有限还原暴露的二 硫键(例如Fab片段中CH1与Cκ或Cλ之间的链间二硫键)，或者含有 一个游离半胱氨酸的接头在抗体或抗体片段C端融合。在另一个实施方 案中，为了与VLP或菌毛蛋白附着，含有一个游离半胱氨酸残基的接头 与抗体或抗体片段的N端融合。
本领域公知一些采用模拟位的疫苗组合物，以及生产并鉴定特定表 位的模拟位的方法。例如，Arnon等人，Immunology 101：555-562(2000) 描述了针对曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的基于模拟位肽的疫苗， 其完整公开内容在此引用作为参考。这些疫苗采用的模拟位如下获得： 筛查固相8mer随机肽库，鉴定可被针对曼氏血吸虫的保护性单克隆抗 体识别的表位的模拟位。类似地，Olazewska等人，Virology 272：98-105 (2000)描述了模拟麻疹病毒融合蛋白表位的合成肽的鉴定，以及这些 肽在免疫小鼠中的应用，其完整公开内容在此引用作为参考。另外， Zuercher等人，Eur.J.Immunol.30：128-135(2000)描述了利用表位展 示性噬菌体进行口服抗-IgE免疫的组合物和方法，其完整公开内容在此 引用作为参考。特别是，表位展示性M13噬菌体被用作一种口服抗-IgE 疫苗的载体。试验的疫苗组合物含有单克隆抗-IgE抗体BSW17的模拟 位和表位。
本发明因此包括含有可引发针对特定抗原的免疫应答的模拟位的疫 苗组合物，以及组成这些疫苗组合物的具体模拟位/核心颗粒偶联物和具 体模拟位/非天然分子支架偶联物，本发明还包括这些疫苗组合物引发针 对特定抗原或抗原决定簇的免疫应答的用途。模拟位也可以是多肽，如 抗独特型抗体。因此，在本发明的又一个优选的实施方案中，抗原或抗 原决定簇是一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片段。
本发明还包括含有此处所述抗原或抗原决定簇的模拟位的组合物。
特定抗原的模拟位可以用多种方法产生或鉴定，包括筛查随机肽噬 菌体展示文库(参见，例如：PCT公布号WO97/31948，其完整内容在 此引用作为参考)。为了鉴定可结合一种或多种具有特定抗原特异性的 抗体的肽，通常进行这些文库的筛查。
适用于本发明疫苗组合物的模拟位可以是线性或环状的肽。作为线 性或环状肽的模拟位可以通过一个肽键以外的键与非天然分子支架或 核心颗粒连接。
如上所述，已经鉴定了一些可引发针对人IgE分子的免疫应答的人 IgE模拟位和表位(参见，例如：PCT公开号WO97/31948)。因此，在 某些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括可引发针对免疫球蛋白分子 (例如IgE分子)的免疫应答的组合物。
可用来引发这种免疫应答的肽包括蛋白质、蛋白质亚单位、IgE分 子的结构域和能诱导产生具有IgE分子特异性的抗体的模拟位。用来制 备疫苗组合物的IgE分子部分通常来源于将要施用该组合物的物种的 IgE分子。例如，准备对人类施用的疫苗组合物通常含有人IgE分子的 一个或多个部分，和/或一个或多个能引发针对人IgE分子的免疫应答的 模拟位。
在具体实施方案中，用于人的本发明疫苗组合物含有SEQ ID NO： 176；登录号AAB59424(SEQ ID NO：176)所示IgE重链恒定区的至 少一部分。在更特别的实施方案中，用来制备本发明疫苗组合物的IgE 肽包含或者由具有下列氨基酸序列的肽组成：CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO：178)。
在其它具体实施方案中，本发明疫苗组合物含有至少一种模拟位， 该模拟位能引发可产生具有特定抗原特异性的抗体的免疫应答。
适于制备本发明疫苗组合物的IgE模拟位的例子包括具有下列氨基 酸序列的肽： 模拟位 SEQ ID NO 模拟位 SEQ ID NO INHRGYWV RNHRGYWV RSRSGGYWLW VNLTWSRASG C.H3表位 VNLPWSRASG VNLTW SFGLE VNLPWSFGLE C.H3模拟位 VNRPWSFGLE 179 180 181 182 183 184 185 186 VKLPWRFYQV VWTACGYGRM GTVSTLS LLDSRYW QPAHSLG LWGMQGR LTLSHPHWVLNHFVS SMGPDQTLR VNLTWS GEFCINHRGYWVCGDPA 187 188 189 190 191 192 193 194 195 216
C.α疫苗颗粒的制备
本发明提供用于构建有序、重复抗原阵列的新型组合物和方法。本 领域技术人员会知道，有序、重复抗原阵列的装配条件很大程度上取决 于具体非天然分子支架的第一附着位点的选择和具体抗原或抗原决定 簇的第二附着位点的选择。因此，技术人员在组合物设计中的选择(即 第一和第二附着位点、抗原和非天然分子支架的选择)将决定α疫苗颗 粒(结合后的有序、重复的抗原阵列与非天然分子支架)装配的具体条 件。技术人员知道关于α疫苗颗粒装配的信息，并且有大量参考文献可 以帮助技术人员(例如，Sambrook，J.等人编写的《分子克隆：实验室手 册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Celis，J.编写的《细胞生物学》，Academic Press， 第2版，(1998)；Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)，均在此引用作 为参考)。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的第一和第二附着位点分 别采用JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白域。在α疫苗颗粒的制备中，必须 在促进有序、重复抗原阵列在非天然分子支架上装配的条件下产生和纯 化抗原。在JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白域实施方案中，应当用还原剂(例 如二硫苏糖醇，DTT)处理FOS-抗原或FOS-抗原决定簇，以减少或消 除形成二硫键的机会(实施例15)。
为了制备JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白域实施方案的非天然分子支架 (即重组辛德毕斯病毒)，重组E2-JUN病毒颗粒应当浓缩、中和，并用 还原剂处理(见实施例16)。
JUN/FOS实施方案中有序、重复抗原阵列的装配在氧化还原复性液 (shuffle)存在下进行。E2-JUN病毒颗粒与240倍摩尔过量的FOS-抗原或 FOS-抗原决定簇在4℃下结合10小时。随后通过层析浓缩并纯化α疫 苗颗粒(实施例16)。
在本发明的另一个实施方案中，非天然分子支架与抗原或抗原决定 簇的偶联可以通过化学交联实现。在一个特定实施方案中，化学剂是一 种异双功能交联剂，如ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Tanimori 等人，J.Pharm.Dyn.4：812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45： 195(1981))，其含有(1)一个与氨基具有反应性的琥珀酰亚胺基，和 (2)一个与SH基具有反应性的马来酰亚胺基。可以构建第一附着位点 的异源蛋白质或多肽，使之含有一个或多个赖氨酸残基，作为异双功能 交联剂琥珀酸亚胺部分的反应部位。一旦与异源蛋白质的赖氨酸残基化 学偶联，异双功能交联剂的马来酰亚胺基团将可以用于与抗原或抗原决 定簇上的半胱氨酸残基的SH基团反应。在这种情况下，抗原或抗原决 定簇的制备可能需要将半胱氨酸残基构建到选作第二附着位点的蛋白 质或多肽中，使它可以与已与非天然分子支架的第一附着位点结合的交 联剂上的游离马来酰亚胺功能基团反应。因此，在这种情况下，异双功 能交联剂与非天然分子支架的第一附着位点结合，并将该支架与抗原或 抗原决定簇的第二附着位点相连接。
3.组合物、疫苗及其给药，以及治疗方法
本发明提供可用于预防和/或缓解疾病或症状的疫苗组合物。本发明 还提供用于预防和/或缓解个体的疾病或症状的接种方法。
在一个实施方案中，本发明提供用于在广泛物种(特别是哺乳动物 种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)中防治传染病的疫苗。疫苗可 以设计为用来治疗病毒病原的感染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、 EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌病原的感染，如 肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病原的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼 病、滴虫病、阿米巴病等。
在另一个实施方案中，本发明提供用于在广泛物种(特别是哺乳动 物种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)中防治癌症的疫苗。疫苗可 以设计为用于治疗所有癌症类型：淋巴瘤、癌、肉瘤、黑素瘤等。
在本发明的另一个实施方案中，可以在治疗变态反应的疫苗的设计 中使用本发明的组合物。IgE同种型抗体是变态反应中的重要成分。肥 大细胞在其表面结合IgE抗体，并在特异性抗原与结合于肥大细胞表面 的IgE分子结合后释放组胺和其它变态反应介质。因此，抑制IgE抗体 的产生是保护免于变态反应的一个有前途的目标。获得希望的T辅助细 胞应答后这将成为可能。T辅助细胞应答可分为1型(TH1)和2型(TH2) T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today 18：263-266(1997))。TH1 细胞分泌干扰素-γ和能触发B细胞产生IgG1-3抗体的其它细胞因子。相 反，TH2细胞产生的一种重要细胞因子是IL-4，它使B细胞产生IgG4 和IgE。在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展互相排斥，因为TH1 细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，触发强TH1应答的抗原同 时抑制TH2应答的发展，从而抑制IgE抗体的产生。有趣的是，实际上 所有病毒都在宿主中诱发TH1应答，而不能触发IgE抗体的产生 (Coutelier等人，J.Exp.Med.165：64-69(1987))。这种同种型模式不 限于活病毒，在灭活的或重组的病毒颗粒上也能观察到(Lo-Man等人， Eur.J.Immunol.28：1401-1407(1998))。因此，利用本发明的方法(例 如α疫苗技术)，可以为病毒颗粒加装多种变应原，并用于免疫。由于 获得的变应原的“病毒结构”，将引发TH1应答，产生“保护性”IgG1-3抗 体，而阻止可引起变态反应的IgE抗体的产生。由于变应原由可被一组 不同辅助T细胞识别的病毒颗粒递呈而不是变应原本身递呈，甚至在携 带已存在的变应原特异性TH2细胞的过敏个体中也可能诱导产生变应原 特异的IgG1-3抗体。高浓度IgG抗体的存在可阻止变应原与结合IgE的 肥大细胞结合，从而抑制组胺的释放。因此，IgG抗体的存在可以保护 免于IgE介导的变态反应。引起变态反应的典型物质包括：草、豚草、 桦树或杉树花粉、屋尘、螨、动物皮屑、霉菌、昆虫毒液或药物(如青 霉素)。因此，不仅在变态反应发生之前而且在发生之后，用含有变应 原的病毒颗粒免疫个体都是有利的。
在具体实施方案中，本发明提供预防和/或缓解由“自身”基因产物 (例如肿瘤坏死因子)(即，如此处所用的“自身抗原”)所致或加重的疾 病或症状的方法。在有关实施方案中，本发明提供诱发个体的如下免疫 应答的方法，其导致可预防和/或缓解由“自身”基因产物所致或加重的疾 病或症状的抗体产生。这类疾病或症状的例子包括：移植物抗宿主病、 IgE介导的变态反应、过敏性反应、成人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、 变应性哮喘、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、 Graves病、炎性自身免疫病、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、 免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)、血管免疫增生性淋巴结病(AIL)、 免疫母细胞性淋巴结病(IBL)、类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬 化症、骨质疏松症和阿耳茨海默病。
本领域技术人员会理解，当对个体施用本发明的组合物时，组合物 中可含有盐、缓冲液、佐剂或能提高组合物效能的其它物质。大量资料 中提出了适于在制备药物组合物中使用的物质的例子， 包括 《REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES》(Osol，A.编著， Mack Publishing Co.，(1990))。
如果接受个体能耐受本发明的组合物的给药，则本发明的组合物可 以说是“药理学可接受的”。此外，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即 产生希望的生理效应的量)给药。
本发明的组合物可以用本领域公知的多种方法给药，但通常通过注 射、输液、吸入、口服或其它合适的物理方法给药。此外，组合物也可 以肌内、静脉内或皮下给药。用于给药的组合物成分包括无菌水溶液(例 如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二 醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。可用载体或封闭 包衣/敷料提高皮肤通透性并增强抗原吸收。
朊病毒介导的疾病对社会的威胁日益增大。具体而言，朊病毒诱导 的牛BSE是长期被忽视但是可以影响整个欧洲的大量动物的一种疾病。 而且，CJD的一种变形是由于人类食用朊病毒感染的牛肉后感染引起的。 尽管迄今为止感染的人数相对较低，但这种疾病似乎可能成为流行病。 然而，vCJD发展的长期预后可能特别困难，因为感染与明显发病之间 的潜伏期极长(估计为10年)。
朊病毒是在大多数哺乳动物种类中存在的细胞蛋白质。朊病毒蛋白 以两种形式存在-通常存在于健康人体中的一种正常折叠的形式 (PrPc)，和引起疾病的一种错误折叠的形式(PrpSc)。当前的朊病毒假 说认为，错误折叠的朊病毒形式PrpSc能催化健康朊病毒Prpc重新折叠 为致病PrpSc(A.Aguzzi，Haematologica 85，3-10(2000))。在一些罕见的 情况下，这种转变也可能自发发生，在人体中引起经典CJD。prpSc中的 一些突变与这种自发转变的增多有关，引起不同形式的家族性CJD。然 而，PrpSc也可能是传染性的，可通过输血或通过食物链传播。后一种类 型的朊病毒介导的疾病被称为库鲁病，常常在食人者中发生。然而，由 于食用自己个体的物种不多，这种经口传播的疾病类型非常罕见，对其 它物种没有记载。
在整个欧洲，大量用牛肉制品饲养母牛改变了感染传播性致BSE PrpSc的母牛的状况和数量，这在最近几年显著增多，影响到数十万母牛。 大量患BSE的母牛的突然出现在人群中引起了极大恐慌，担心在人类中 可能诱发一种类似的疾病。的确，在1996年报告了第一例变型CJD， 可能是由于食用感染PrpSc的牛肉引起的。直到今天，这种恐惧仍进一步 增长，因为在随后几年感染的人数不断增加，而且未见治愈。而且，因 为绵羊可患有一种被称为羊瘙痒病的朊病毒介导的疾病，其它哺乳动物 种类也能感染PrpSc。
从实验来看，BSE样疾病也可能在其它物种中发生。已经极其详细 地研究了朊病毒的传播机制。现在清楚，朊病毒首先在感染小鼠的淋巴 器官中复制，然后转移到中枢神经系统中。对于朊病毒蛋白在淋巴器官 中的复制和向中枢神经系统内的转运，滤泡状树突细胞(FDC)-淋巴 器官中的一种极少的细胞群-似乎是必需的(S.Brandner，M.A.Klein，A. Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23(1999)；F.Montrasio等人，Science 288， 1257-9(2000))。FDC是研究较少的一种细胞类型，但是现在清楚它们 的发育依赖于B细胞产生淋巴毒素和/或TNF(F.Mackay，J.L.Browning， Nature 395，26-27(1998))。确实，缺乏淋巴毒素的小鼠不显示FDC(M.S. Matsumoto等人，Science 264，703-707(1996))。而且，它们不能有效 地感染朊病毒，并且不会患病。除了FDC之外，抗体也可能在疾病进展 中起作用(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23 (1999))。
最近表明，利用Ltb受体Fc融合分子阻断LTb途径不仅清除了小鼠 中的FDC，而且也阻断了PrpSc的感染(F.Montrasio等人，Science 288， 1257-9(2000))。因此，可诱导LTb或其受体之特异性抗体的疫苗可能 阻断PrpSc从一个个体传播给另一个个体，或者从周围向中枢神经系统传 播。
然而，通常难以(甚至不可能)通过常规接种诱发对自体分子的抗 体应答。提高接种效率的一种方法是提高所用抗原的重复程度：与分离 的蛋白质不同，在有及没有T细胞辅助时，病毒能在不含任何佐剂的情 况下诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann & Zinkermagel，Ann.Rev. Immunol.15：235-270(1991))。尽管病毒经常很少含蛋白质，但是它 们能比其分离的成分触发更强的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒 免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒显示一 种准晶体表面，该表面上展示规则排列的表位，这些表位可有效交联B 细胞上表位特异的免疫球蛋白(Bachmann & Zinkermagel，Immunol. Today 17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是直 接诱导细胞周期进行和产生IgM抗体的一种强激活信号。此外，这些触 发的B细胞能够激活T辅助细胞，随后诱导B细胞从生产IgM转换为 生产IgG，以及长期B细胞记忆的产生-这是所有接种的目标(Bachmann & Zinkermagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至 与自身免疫病中抗-抗体的产生有关，并且作为对病原体的自然应答的一 部分(见Fehr，T.等人，J Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，高 度组织的病毒表面呈现的抗体能够诱发强烈的抗-抗体应答。
免疫系统通常不能产生抗自身结构的抗体。对于低浓度存在的可溶 性抗原，这是由于在Th细胞水平上的耐受性。在这些条件下，自身抗 原与能输送T辅助细胞的载体的偶联可以破坏耐受。对于高浓度存在的 可溶性蛋白质或低浓度的膜蛋白，B细胞和Th细胞可以是耐受的。然 而，B细胞的耐受可能是可逆的(无反应性的)，并且能通过施用以高度 组织方式与外源载体偶联的抗原而被破坏(Bachmann & Zinkermagel， Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。因此，象病毒、病毒样颗粒 或细菌菌毛一样高度组织的LTb、LTa或LTb受体可能破坏B细胞耐受， 并诱导产生这些分子特异的抗体。
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供 一种促进诱导产生内源淋巴毒素(LT)b、LTa或LTb受体的特异性抗 体的方法。本发明也提供一种生产如下抗原或抗原决定簇的方法，该抗 原或抗原决定簇能够诱导产生LTb、LTa或LTb受体特异的抗体，可用 于预防和治疗朊病毒介导的疾病，如变型克-雅氏症(vCJD)或牛海绵 状脑病(BSE)，并清除自身免疫病组织中的淋巴器官样结构。
本发明的目的在于提供一种能够诱导LTb、LTa或LTb受体特异的 抗体、从而从淋巴器官中清除FDC的疫苗。这种治疗可以防止感染PrpSc 或PrpSc从周围神经系统向中枢神经系统扩散。另外，这种治疗也能阻止 在自身免疫病累及的器官中产生淋巴器官样结构，并且可以溶解已经存 在的这种结构，改善疾病症状。
LTb、LTa或LTb受体或其片段与对于宿主而言外源的蛋白质载体偶 联。在本发明的一个优选实施方案中，为了使LTb、LTa或LTb受体或 其片段高度重复且有组织，将这些分子与高度组织化的结构偶联。高度 组织化的结构可以是细菌菌毛、下列重组蛋白产生的病毒样颗粒(VLP)： 噬菌体Qβ的重组蛋白、轮状病毒的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、 甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重组蛋白、 乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花叶病毒的重组蛋白、禽兽棚病毒的重 组蛋白和人乳头瘤病毒的重组蛋白。为了优化LTb、LTa或LTb受体或 其片段在高度组织的结构上的三维排列，向该高度组织的结构中引入附 着位点，如化学反应性氨基酸(除非天然存在)，并且在LTb、LTa或LTb 受体或其片段上引入结合位点，如化学反应性氨基酸(除非天然存在)。 高度组织的结构上存在附着位点而LTb、LTa或LTb受体或其片段上存 在结合位点将使这些分子以定向、有序的方式与重复结构偶联，这是诱 发有效B细胞应答所必需的。
在一个同样优选的实施方案中，向重复结构中引入的附着位点是可 特异结合链霉亲和素的生物素。生物素可以通过化学修饰引入。LTb、 LTa或LTb受体或其片段可以与链霉亲和素融合或连接，并与生物素化 的重复结构结合。
本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法和应用这些 组合物的医学治疗方法。应当理解，以上的一般性描述和下面的详述只 是代表性和说明性的，旨在进一步说明本发明。
除了疫苗技术之外，本发明的其它实施方案还涉及癌症和变态反应 的医学治疗方法。
此处提到的所有专利和出版物都在此完整引用作为参考。
实施例
下列实验中使用的酶和试剂包括：T4 DNA连接酶，获自New England Biolabs；Taq DNA聚合酶，QIAprep Spin质粒试剂盒，QIAGEN 质粒Midi试剂盒，QiaExII凝胶提取试剂盒，QIAquick PCR纯化试剂 盒，均获自QIAGEN；QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒，获自 Pharmacia；SuperScript一步法RT PCR试剂盒、胎牛血清(FCS)、细菌 用胰蛋白胨和酵母提取物，获自Gibco BRL；寡核苷酸，获自Microsynth (瑞士)；限制性核酸内切酶，获自Boehringer Mannheim，NewEngland Biolabs或MBI Fermentas；Pwo聚合酶和dNTPs，获自Boehringer Mannheim。HP-1培养基获自Cell Culture Technologies(Glattbrugg，瑞 士)。所有标准化学试剂都从Fluka-Sigma-Aldrich获得，所有细胞培养 材料都从TPP获得。
DNA操作按照标准技术进行。按照使用说明书，利用QIAprep Spin 质粒试剂盒由2ml细菌培养物制备DNA，或利用QIAGEN质粒Midi 试剂盒由50ml培养物制备DNA。对于限制性内切酶消化，DNA与浓 度为5-10单位(U)酶/mg DNA的适当的限制性内切酶在厂商推荐条件 下(缓冲液和温度)至少孵育2小时。如果反应条件适于所有酶，则用 一种以上的酶同时进行消化，或者连续进行消化。为了进一步操作，消 化下来的DNA片段通过0.7-1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下， 按照厂商提供的说明书用QiaExII凝胶提取试剂盒纯化。对于DNA片段 的连接，100-200pg纯化载体DNA与3倍摩尔过量的插入片段在16℃ 和存在1 U T4 DNA连接酶的条件下在厂商提供的缓冲液中孵育过夜(总 体积：10-20μl)。用一等份(0.1-0.5μl)连接反应液转化大肠杆菌 XL1-Blue(Stratagene)。利用Gene Pulser(BioRAD)和0.1cm Gene Pulser 池(BioRAD)，在200 Ohm、25μF、1.7kV下，通过电穿孔进行转化。 电穿孔后，细胞在1ml S.O.B.培养基(Miller，1972)中振摇孵育1小时， 之后平板接种于选择性S.O.B.琼脂上。
实施例1
用于抗原与VLP偶联的模块真核表达系统
该系统是为了与VLP化学偶联，在抗原上添加含有半胱氨酸残基的 不同氨基酸接头序列而产生的。
A.编码含半胱氨酸氨基酸接头和可切割Fc-尾的EBNA衍生表达系统 的构建
用Kpn I和Bam HI消化pCep-Pu(Wuttke等人，J.Biol.Chem.276： 36839-48(2001))，用退火的寡核苷酸PH37(SEQ ID NO：270)和PH38 (SEQ ID NO：271)引入一个新的多克隆位点，产生pCep-MCS。
如下产生一种模块系统，其含有一个侧翼为几个甘氨酸的游离半胱 氨酸、一个蛋白酶切割位点和人IgG1恒定区。用Bsp120I和Hind III消 化pSec2/Hygro B(Invitrogen目录号V910-20)，与退火的寡核苷酸SU7 (SEQ ID NO：278)和SU8(SEQ ID NO：279)连接，产生构建体 pSec-B-MCS。然后用NheI和HindIII消化pSec-B-MCS，并与退火的寡 核苷酸PH29(SEQ ID NO：264)和PH30(SEQ ID NO：265)连接， 产生构建体pSec 29/30。构建体pSec-FL-EK-Fc*通过下列三个片段的连 接产生：用Eco RI和Hind III消化的第一pSec 29/30，退火的寡核苷酸 PH31(SEQ ID NO：266)和PH32(SEQ ID NO：267)，以及含有人 IgG1恒定区修饰形式的质粒(pSP-Fc*-C1)的Bgl I/EcoRI片段(关于 hu IgG1序列的细节见最终构建体pCep-Xa-Fc*的序列，图1A-1C)。 pCep-Xa-Fc*的完整序列在SEQ ID NO：283中列出。产生的构建体命名 为pSec-FL-EK-Fc*。通过Nhe I/Pme I消化该质粒，从该质粒上切下接 头区和人IgG1 Fc部分，克隆入用Nhe I和Pme I消化的pCep-MCS，产 生构建体pCep-FL-EK-Fc*。这样产生一种模块载体，其中接头序列和蛋 白酶切割位点位于Nhe I与Hind III位点之间，容易与退火的寡核苷酸 交换。为了产生可切割的融合蛋白，用Nhe I和Hind III消化载体 pCep-FL-EK-Fc*，用退火的寡核苷酸PH35(SEQ ID NO：268)和PH36 (SEQ ID NO：269)导入N端一侧为氨基酸GGGGCG的因子Xa切割 位点，用退火的寡核苷酸PH39(SEQ ID NO：272)和PH40(SEQ ID NO： 273)导入N端一侧为GGGGCG的肠激酶位点，分别产生构建体 pCep-Xa-Fc*(见图1A)和pCep-EK-Fc*(见图1B)。另外还含有真核 信号肽的构建体pCep-SP-EK-Fc*(见图1C)通过下列三个片段的连接 严生：Kpn I/Bam HI消化的pCep-EK-Fc*，退火的寡核苷酸PH41(SEQ ID NO：274)和PH42(SEQ ID NO：275)，以及退火的寡核苷酸PH43 (SEQ ID NO：276)和PH44(SEQ ID NO：277)。
B.融合蛋白的大规模制备
为了大规模地制备不同融合蛋白，利用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies)，根据厂商推荐，用不同pCep表达质粒转染293-EBNA 细胞(Invitrogen)。转染24-36小时后，细胞在嘌呤霉素(1μg/ml)选 择下以1∶3的比例分到补充有10％FCS的DMEM中。然后在选择培养 基中扩增耐药性细胞。为了收获融合蛋白，将耐药性细胞群传代到聚L- 赖氨酸覆盖的平皿上。细胞一旦长满，即用PBS洗涤2次，并向平板中 添加无血清培养基(DMEM)。在最长达1个月的时期内，每2-4天收集 一次组织培养上清液，更换为新鲜的DMEM培养基。收获的上清液保 存于4℃。
C.融合蛋白的纯化
重组Fc-融合蛋白用蛋白A Sepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech AG)通过亲和层析纯化。简言之，向层析柱上填充1-3ml蛋白 A树脂，用蠕动泵以0.5-1.5ml/min的流速使含有重组蛋白的组织培养上 清液上柱。然后用20-50ml PBS洗柱。根据融合蛋白的不同，在柱上进 行蛋白酶切割，或如下所述洗脱蛋白质。用含有150mM NaCl的柠檬酸 /磷酸缓冲液(pH3.8)洗脱重组融合蛋白，合并含蛋白质的级分，用 ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩。
D.重组融合蛋白的蛋白酶切割(因子Xa，肠激酶)
洗脱的含肠激酶(EK)切割位点的重组融合蛋白用EKmax系统 (Invitrogen)根据厂商推荐切割。通过与蛋白A孵育，除去切割的融合 蛋白的Fc部分。然后用EK-Away系统(Invitrogen)根据厂商推荐除去 肠激酶。类似地，根据厂商推荐，含因子Xa(Xa)切割位点的融合蛋 白通过限制性蛋白酶因子Xa切割和去除试剂盒(Roche)切割。通过与 蛋白A孵育，除去切割的Fc部分，用试剂盒附带的链霉亲和素树脂除 去蛋白酶。
不同融合蛋白用ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩，用紫外分光 光度法定量，用于随后的偶联反应。
图1A-1C显示所用的不同真核表达载体的部分序列。只显示修饰的 序列。
图1A：pCep-Xa-Fc*：序列从BamHI位点向前显示，在翻译序列之 上显示不同特征。箭头所指为因子Xa蛋白酶切割位点。
图1B：pCep-EK-Fc*：序列从BamHI位点向前显示，在翻译序列之 上显示不同特征。箭头所指为肠激酶切割位点。Hind III位点下游序列 与图1A所示相同。
图1C：pCep-SP-EK-Fc*：序列从信号肽的开始处向前显示，在翻译 序列之上显示不同特征。用信号肽酶切下的信号肽序列以粗体显示。箭 头所指为肠激酶切割位点。Hind III位点下游序列与图1A所示相同。
实施例2
小鼠抵抗素的真核表达以及与VLP和菌毛的偶联
A.小鼠抵抗素的克隆
用Qiagen RNeasy试剂盒根据厂商推荐从60mg小鼠脂肪组织中分 离总RNA。用40μl H2O洗脱RNA。然后用该总RNA进行反转录，该 反应使用oligo dT引物和ThermoScroptTM RT-PCR系统(Life Technologies)，根据厂商推荐进行。样品在50℃下孵育14时，加热到 85℃5分钟，在37℃下用RNAseH处理20分钟。
用2μl RT反应液进行小鼠抵抗素的PCR扩增。PCR用Platinium TAQ (Life Technologies)根据厂商推荐进行，使用引物PH19(SEQ ID NO： 260)和PH20(SEQ ID NO：261)。引物PH19(SEQ ID NO：260)对 应于小鼠抵抗素序列的58-77位，引物PH20(SEQ ID NO：261)对应 于454-435位。PCR混合物首先在94℃下变性2分钟，然后如下进行35 个循环：94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟，最后样品在72℃下放 置10分钟。纯化PCR片段，通过TA克隆亚克隆入pGEMTeasy载体 (Invitrogen)，产生pGEMT-mRes。为了添加合适的限制性酶切位点， 利用如上所述的相同循环程序，用引物PH21(SEQ ID NO：262)和PH22 (SEQ ID NO：263)对pGEMT-mRes进行第二次PCR。正向引物(PH21 (SEQ ID NO：262))含有一个BamHI位点和小鼠抵抗素序列的核苷酸 81-102。反向引物(PH22(SEQ ID NO：263))含有一个Xba I位点和 小鼠抵抗素序列的核苷酸426-406。所述位点参照小鼠抵抗素序列基因 登录号AF323080。纯化PCR产物，用Bam HI和Xba I消化，亚克隆入 经Bam HI和Xba I消化的pcmv-Fc*-C1，产生构建体pcmv-mRes-Fc*。
通过Bam HI/Xba I消化从pcmv-mRes-Fc*上切下抵抗素开放阅读 框，克隆入Bam HI和Nhe I消化的pCep-Xa-Fc*和pCep-EK-Fc*(见实 施例1，B部分)，分别产生构建体pCep-mRes-Xa-Fc*和 pCep-mRes-EK-Fc*。
B.抵抗素的制备、纯化和切割
然后用pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*构建体转染 293-EBNA细胞，以制备如实施例1部分B所述的重组蛋白。组织培养 上清液如实施例1部分C所述纯化。然后如实施例1部分D所述切割纯 化的蛋白质。根据所用的载体，产生的重组蛋白命名为“抵抗素-C-Xa”， 或“Res-C-Xa”和“抵抗素-C-EK”或“Res-C-EK”(见图2A和图2B)。
图2A和图2B显示用于表达和进一步偶联的重组小鼠抵抗素蛋白的 序列。Res-C-Xa(图2A)和Res-C-EK(图2B)显示翻译的DNA序列。 在蛋白质分泌后被信号肽酶切割的抵抗素信号序列以斜体显示。信号肽 酶和特异性蛋白酶(因子Xa或肠激酶)切割后产生的氨基酸序列以粗 体显示。粗体序列对应于实际用于偶联的氨基酸蛋白质序列，即SEQ ID NO：280和SEQ ID NO：281。SEQ ID NO：282对应于另一种抵抗素蛋 白构建体，根据本发明它也能用来与病毒样颗粒和菌毛偶联。
C.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液0.2ml与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下对用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。8μl透析的Qβ反应混合物与32μl抵抗 素-C-Xa溶液(产生终浓度为0.39mg/ml的抵抗素)、13μl Qβ反应混合 液与27μl抵抗素-C-EK溶液(产生终浓度为0.67mg/ml的抵抗素)在 25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析(见图2C)。偶 联反应液中有另一条24kDa的带，但在衍生的Qβ和抵抗素中没有。24 kDa的大小对应于偶联产物24kDa的预期大小(14kDa的Qβ分别加 10kDa抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK)。
图2C显示抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与Qβ的偶联结果。偶联产 物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。第1道：分子量标准。 第2道：偶联前的抵抗素-C-EK。第3道：偶联后的抵抗素-C-EK-Qβ。 第4道：衍生的Qβ。第5道：偶联前的抵抗素-C-Xa。第6道：偶联后 的抵抗素-C-Xa-Qβ。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。偶联带用箭 头指示。
D.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与fr衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液0.2ml中与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25 ℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。8μl透析的fr衣壳蛋白反应混合物 与32μl抵抗素-C-Xa溶液(产生终浓度为0.39mg/ml的抵抗素)、13μl fr衣壳蛋白反应混合液与27μl抵抗素-C-EK溶液(产生终浓度为0.67 mg/ml的抵抗素)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
E.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
将2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液0.2ml与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶 液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。8μl透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut 反应混合物与32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl HBcAg-Lys-2cys-Mut反应 混合液与27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃摇床上反应4小时。偶联产物 通过SDS-PAGE分析。
F.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与菌毛的偶联
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液 400μl与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce) 在摇床上室温反应60分钟。将反应混合物过PD-10柱 (Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质 级分，8μl脱盐的衍生菌毛蛋白与32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl脱盐 的衍生菌毛蛋白与27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物通过SDS-PAGE分析。
实施例3
A.含半胱氨酸接头的引入，小鼠淋巴毒素-β的表达与纯化
重组表达小鼠淋巴毒素-·(LT-·)的胞外部分，其在N端含有一个 CGG氨基酸接头。该接头含有一个用来与VLP偶联的半胱氨酸。为了 便于纯化，该蛋白质的长(氨基酸49-306)和短(氨基酸126-306)形 式在N端与谷胱甘肽S-转移酶(GST)或组氨酸-myc尾融合。为了切 割该尾，插入一个肠激酶(EK)切割位点。
C-LT·49-306和C-LT·126-306的构建
利用PCR方法，以寡核苷酸5’LT·和3’LT·为引物从插入到 pFB-LIB中的小鼠脾脏cDNA文库中扩增小鼠LT·49-306。对于PCR 反应，在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs 和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板DNA。温度循环 如下：94℃ 2分钟，然后94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分钟) 25个循环，之后68℃ 10分钟。PCR产物用T4激酶磷酸化，连接到EcoRV 酶切并去磷酸化的pEntry1A(Life Technologies)中。产生的质粒命名为 pEntry1A-LT·49-306。
以pEntry1A-LT·49-306作为模板，分别用寡核苷酸5’LT·long-NheI 和3’LT·stop-NotI以及5’LT·short-NheI和3’LT·stop-NotI进行第二次 PCR反应。寡核苷酸5’LT·long-NheI和5’LT·short-NheI含有一个 内部的NheI位点，并含有Cys-Gly-Gly接头的密码子，3’LT·stop-NotI 含有一个内部NotI位点，并含有终止密码子。对于第二次PCR反应， 在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和150ng模板DNA。温度循环如下：94℃ 2分钟，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分钟)5个循环， 然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分钟)20个循环，之后68℃ 10分钟。
PCR产物用NheI和NotI消化，插入pCEP-SP-GST-EK或 pCEP-SP-his-myc-EK(Wuttke等人，J.Biol.Chem.276：36839-48(2001)) 中。产生的质粒分别命名为pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、 pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306、 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·126-306。GST为谷胱甘肽一S-转移酶，EK 为肠激酶，his为六组氨酸尾，myc为抗c-myc表位。C表示另含有半胱 氨酸的CGG接头。
其它所有步骤都按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸序列： 5’LT·： 5’-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3’(SEQ ID NO：284) 3’LT·： 5’-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3’(SEQ ID NO：285) 5’LT·long-NheI： 5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3’(SEQ ID NO：286) 5’LT·shorr-NheI： 5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGG ATT C-3’(SEQ ID NO：287) 3’LT·stop-NotI： 5’-CAA TGA CTG CGG CCG CTT ACC CCA CCA TCA CCG-3’(SEQ ID NO： 288)。
GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306
和his-myc-EK-C-LT·126-306的表达和制备
为了如实施例1所述制备蛋白质，用质粒 pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306和 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·126-306转染293-EBNA细胞(Invitrogen)。 制备的蛋白质命名为GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、 his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306。
LT·融合蛋白的蛋白质序列由下列cDNA序列翻译而来：
GST-EK-C-LT·49-306：SEQ ID NO：289
GST-EK-C-LT·126-306：SEQ ID NO：290
his-myc-EK-C-LT·49-306：SEQ ID NO：291
his-myc-EK-C-LT·126-306：SEQ ID NO：292
融合蛋白在还原条件下在12％SDS-PAGE上分析。将凝胶印迹到硝 酸纤维素膜上。将膜封闭，与单克隆小鼠抗-myc抗体或与抗-GST抗体 孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG或辣根过氧 化物酶偶联的兔抗山羊IgG孵育。结果显示在图3中。GST-EK-C-LT·49-306 和GST-EK-C-LT·126-306可用抗-GST抗体检测，分子量分别为62kDa和 48kDa。his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306可用抗-myc 抗体检测，分别为40-56kDa和33-39kDa。
图3A和图3B显示LT·融合蛋白的表达结果，LT·融合蛋白在还 原条件下在12％SDS-PAGE上分析。将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。将 膜封闭，与单克隆小鼠抗-myc抗体(1∶2000稀释)(图3A)或与抗-GST 抗体(1∶2000稀释)(图3B)孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联 的山羊抗小鼠IgG(1∶4000稀释)(图3A)或辣根过氧化物酶偶联的兔 抗山羊IgG(1∶4000稀释)(图3B)孵育。A：第1、2道： his-myc-EK-C-LT·126-306。第3、4道：his-myc-EK-C-LT·49-306。B：第 1、2道：GST-EK-C-LT·126-306。第3、4道：GST-EK-C-LT·49-306。标 准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
B.GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306 和his-myc-EK-C-LT·126-306的纯化
GST-EK-C-LT·49-306和GST-EK-C-LT·126-306用谷胱甘肽-Sepharose 柱纯化，his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306用Ni-NTA sepharose柱纯化，均使用标准纯化方法。纯化的蛋白质用肠激酶切割， 并在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。
C.C-LT·49-306和C-LT·126-306与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃摇床 上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各24时。透析的Qβ反应混合物与C-LT·49-306和 C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM Qβ，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306) 在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
D.C-LT·49-306和C-LT·126-306与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃摇床 上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合物与 C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM fr，60μM C-LT·49-306 和C-LT·126-306)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
E.C-LT·49-306和C-LT·126-306与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut 反应混合物与C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃摇床 上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
F.C-LT·49-306和C-LT·126-306与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与DMSO 贮存液稀释的50倍摩尔过量的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室温反 应60分钟。反应混合物用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱 盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与 C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM C-LT·49-306 和C-LT·126-306)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
实施例4
A.含半胱氨酸接头的引入，大鼠巨噬细胞迁移抑制因子MIF的表达、
纯化以及与Qβ的偶联
重组表达大鼠巨噬细胞迁移抑制因子(rMIF)，其在C端融合三种 不同的氨基酸接头C1、C2和C3。每个接头含有一个半胱氨酸用于与 VLP偶联。
rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3的构建
通过将NdeI位点与XhoI位点之间的原始序列替换为退火的寡核苷 酸引物MCS-1F和MCS-1R(在15mM TrisHCl pH8缓冲液中退火)，使 pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改变为GTTTAACTTT AAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACG GCGGCCGCATGCACC。产生的质粒命名为pMod00，它在MCS中含有 NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制性酶切位点。退火的 Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R寡核苷酸对和退火的 oligo1F-C-甘氨酸-接头和oligo1R-C-甘氨酸-接头对一起连接到 BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC1，它含有一个N端 六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和含有一个半胱氨酸残基的C端氨基 酸甘氨酸接头。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe R寡核苷 酸对与退火的oligo1F-C-γ1-接头和oligo1R-C-γ1-接头对一起连接到 BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC2，它含有一个N端 六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和来源于人免疫球蛋白γ1铰链区并含 有一个半胱氨酸残基的C端·1接头。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和 Bamhis6-EK-Nhe R寡核苷酸对、退火的oligo1FA-C-γ3-接头和 oligo1RA-C-γ3-接头对以及退火的oligo1FB-C-γ3-接头和oligo1RB-C-γ3- 接头对一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC3， 它含有一个N端六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和来源于小鼠免疫球 蛋白·3铰链区并含有一个半胱氨酸残基的C端·3接头。
用寡核苷酸rMIF-F和rMIF-Xho-R通过PCR扩增了含有大鼠MIF cDNA的pBS-rMIF。rMIF-F含有一个内部NdeI位点，rMIF-Xho-R含有 一个内部XhoI位点。PCR产物用NdeI和XhoI消化，连接到用相同酶 消化的pModEC1、pModEC2和pModEC3中。产生的质粒分别命名为 pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3。
对于PCR反应，在50·1反应混合液(2单位PFX聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各15pmol引物和1ng模板DNA。温度 循环如下：94℃2分钟，然后94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30 秒)30个循环，之后68℃ 2分钟。
其它所有步骤都按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸序列：
引物MCS-1F： 5’-TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCA T-3’(SEQ ID NO：293)
引物MCS-1R： 5’-TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GAT CCA-3’(SEQ ID NO：294)
Bamhis6-EK-Nhe-F： 5’-GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GAT GAC AAA GCG CTA GCC C-3’(SEQ ID NO：295)
Bamhis6-EK-Nhe-R： 5’-TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGG TGG TGG TGG TGG TGT G-3’(SEQ ID NO：296)
oligo 1F-C-甘氨酸-接头： 5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO：297)
oligo 1R-C-甘氨酸-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3’(SEQ ID NO：298)
oligo 1F-C-γ1-接头： 5’-TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO：299)
oligo 1R-C-γ1-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGG GTT TTA TCC-3’(SEQ ID NO：300)
oligo 1FA-C-γ3-接头： 5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ ID NO：301)
oligo 1RA-C-γ3-接头： 5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’ (SEQ ID NO：302)
oligo 2FB-C-γ3-接头： 5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’ (SEQ ID NO：303)
oligo 2RB-C-γ3-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQ ID NO：304)
rMIF-F： 5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3’(SEQ ID NO：305)
rMIF-Xho-R： 5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO：306)
rMIF-C的表达与纯化
用质粒pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3转化感受 态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。含氨苄青霉素(Amp)琼脂平板上的单 个菌落在液体培养基中扩增(含150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp， 0.5％葡萄糖的SB)，并在220rpm振摇和30℃下孵育过夜。然后用过夜 培养液1∶50v/v接种于1 L SB(150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp)， 在30℃下培养至OD600＝2.5。用2mM IPTG诱导表达。过夜培养并以 6000rpm离心后收集细胞。将细胞沉淀悬浮于含0.8mg/ml溶菌酶的裂 解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％ Tween-20)中，超声处理并用benzonase处理。然后将2ml裂解液过20 ml Q XL-柱和20ml SP XL-柱。蛋白质rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3 流出。
rMIF-C的蛋白质序列由cDNA序列翻译而来。
rMIF-C1：SEQ ID NO：307
rMIF-C2：SEQ ID NO：308
rMIF-C3：SEQ ID NO：309
rMIF-C1与Q·衣壳蛋白的偶联
将6mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.48ml与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM 贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0透析2次各3小时。将3.6mg/ml rMIF-C1 蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.3ml与9.6μl TCEP(Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下反应1小时。 130μl衍生并透析的Q与129μl还原的rMIF-C1在241μl 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.0中25℃反应过夜。
rMIF-C2与Q·衣壳蛋白的偶联
将5.5mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中 的溶液0.9ml与9μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM贮 存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.80mg/ml rMIF-C2蛋白在 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液850μl与8.5μl TCEP (Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在室温下反应1小时。80μl 衍生并透析的Q·与85μl还原的rMIF-C2在335μl 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2中25℃反应过夜。
rMIF-C3与Q·衣壳蛋白的偶联
将6mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.48ml与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM 贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0透析2次3小时。将5.98mg/ml rMIF-C3蛋 白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液720μl与9.5μl TCEP (Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下反应1小时。130 μl衍生并透析的Q与80μl还原的rMIF-C3在290μl 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.0中25℃反应过夜。
所有三种偶联产物都在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。 凝胶用考马斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆 兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀释)或纯化的兔抗-MIF抗体(Torrey Pines Biolabs，Inc.)(1∶2000稀释)孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联 的山羊抗兔IgG(1∶2000稀释)孵育。结果显示在图4A和图4B中。偶 联产物能在考马斯染色凝胶中检测到(图4A)，用·抗-Qβ·抗血清和 抗-MIF抗体(图4B)能清楚地证实所有三种rMIF变体与Qβ·衣壳蛋 白的共价偶联。
图4A显示MIF构建体与Qβ的偶联。偶联产物在还原条件下在16％ SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分子量 示于左侧空白处。
图4B显示MIF-C1与Qβ的偶联。偶联产物在还原条件下在16％ SDS-PAGE凝胶上分析。第1道：偶联前的MIF-C1。第2道：偶联前的 衍生Qβ。第3-5道：Qβ-MIF-C1。第1-3道用考马斯亮蓝染色。第4、5 道是分别用抗-MIF抗血清和抗Qβ抗血清显色的偶联反应的Western印 迹。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
B.用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1免疫小鼠
给雌性Balb/c小鼠接种未添加佐剂的与Qβ衣壳蛋白偶联的 MIF-C1。每种样品25μg总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0天和第14 天皮下注射(100ml，于腹部两侧)。小鼠在第31天眼眶后放血，其血 清用MIF特异的ELISA分析。
C.ELISA
ELISA板用浓度为5μg/ml的MIF-C1包被。封闭ELISA板，然后 与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检 测。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。结果显示在图4C中。与 Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1的小鼠抗血清具有明显的反应性，而免疫前 血清不与MIF反应(图4C，数据未显示)。在与Qβ衣壳蛋白偶联的 MIF-C1的抗血清的稀释系列中，在1∶84000时达到最大半数效价 (half-maximal titer)。
图4C显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1接种的小鼠血清获得的 ELISA信号。第0天和第14天给雌性Balb/c小鼠皮下接种PBS中的25 μg疫苗。第31天测定抗MIF-C1血清IgG。分析其中一只小鼠的免疫前 血清作为对照。所述血清稀释的结果显示为450nm下的光密度。所有 接种的小鼠都形成高抗体效价。在对照中未检测到MIF特异性抗体。
实施例5 rMIF-C1与fr衣壳蛋白和HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联 rMIF-C1与fr衣壳蛋白的偶联
将3.1mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与3μl 100mM溶解于DMSO的SMPH贮存液(Pierce)在 25℃下反应30分钟。在平行反应中，fr衣壳蛋白首先用碘乙酰胺烷基化， 然后在上述相同反应条件下与SMPH反应。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.7mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液80μl与1μl 36mM溶于H2O的TCEP(Pierce)贮存液在25℃下反应1小时。50μl 衍生并透析的fr衣壳蛋白和50μl衍生、烷基化并透析的fr衣壳蛋白分 别与17μl还原的rMIF-C1在25℃下反应2小时。
偶联产物在16％SDS-PAGE凝胶上分析(图5)。在偶联反应中能检 测到预期大小为27kDa(rMIF-C1：表观分子量13kDa，fr衣壳蛋白的 表观分子量14kDa)和29kDa(rMIF-C1的表观分子量13kDa， HBcAg-Lys-2cys-Mut的表观分子量15kDa)的带，但在fr衣壳蛋白和 rMIF-C1溶液中未检测到，这明确证实了偶联。
rMIF-C1与肝炎HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联
将1.2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白在20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2中的溶液100μl与1.4μl SMPH(Pierce)(来自溶解于 DMSO的100mM贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃ 下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.7 mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液80 μl与1μl TCEP(Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下 反应1小时。然后60μl衍生并透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白与 20μl还原的rMIF-C1在25℃下反应2小时。
偶联产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析(图5)。在偶 联反应中能检测到预期大小约为28kDa(rMIF-C1：表观分子量13kDa， HBcAg-Lys-2cys-Mut：表观分子量15kDa)的一条额外的带，但在衍生 的HBcAg-Lys-2cys-Mut或rMIF-C1溶液中未检测到，明确证实了偶联。
加至图5的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：偶联前的rMIF-C1。第3道：偶联 后的rMIF-C1-fr衣壳蛋白。第4道：衍生的fr衣壳蛋白。第5道：与烷 基化fr衣壳蛋白偶联后的rMIF-C1-fr。第6道：烷基化并衍生的fr衣壳 蛋白。第7道：偶联后的rMIF-HBcAg-Lys-2cys-Mut。第8、9道：衍生 的HBcAg-Lys-2cys-Mut。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分子量 示于左侧空白处。
实施例6
A.含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，小鼠RANKL的表达与 纯化
重组表达核因子κb配体受体激活物(RANKL，也被称为破骨细胞 分化因子、osteoprotegerin配体和肿瘤坏死因子相关激活诱导的细胞因 子)的一个片段，其具有含有一个半胱氨酸的N端接头，用于与VLP 偶联。
表达质粒的构建
用寡核苷酸RANKL-UP和RANKL-DOWN PCR扩增RANKL基因 的C端编码区。RANKL-UP含有一个内部ApaI位点，RANKL-DOWN 含有一个内部XhoI位点。PCR产物用ApaI和XhoI消化，连接到 pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。产生的质粒命名为pGEX-RANKL。 所有步骤均按标准分子生物学方法进行，并证实序列。质粒 pGEX-RANKL编码谷胱甘肽S-转移酶-Prescission切割位点-含半胱氨酸 的氨基酸接头-RANKL(GST-PS-C-RANKL)融合蛋白。含半胱氨酸的 氨基酸接头具有序列GCGGG。该构建体在含半胱氨酸的氨基酸接头与 RANKL序列之间还含有一个六组氨酸尾。
寡核苷酸：
RANKL-UP： 5’-CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACC AGCGCTTCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO：316)
RANKL-DOWN： 5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’(SEQ ID NO： 317)
GST-PS-C-RANKL的蛋白质序列(SEQ ID NO：318)和 GST-PS-C-RANKL的cDNA序列(SEQ ID NO：319)
1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E
1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaa
26 E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L
76 gaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttg
51 E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I R Y I
151 gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatata
76 A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L
226 gctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg
101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K
301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaag
126 L P E M L K M F E D R L C H K T Y L N G D H V T H
376 ctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccat
151 P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A F P K
451 cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaa
176 L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A
526 ttagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca
201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D L E V L F
601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttc
226 Q G P G C G G G H H H H H H Q R F S G A P A M M E
676 cagGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAGCTCCAGCTATGATGGAA
251 G S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T I N A A
751 GGCTCATGGTTGGATGTGGCCCAGCGAGGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTTGCACACCTCACCATCAATGCTGCC
276 S I P S G S H K V T L S S W Y H D R G W A K T S N
826 AGCATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAAC
301 M T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F R
901 ATGACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACCTGTACGCCAACATTTGCTTTCGG
326 H H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I K
976 CATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATGGTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAA
351 I P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F Y
1051 ATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGGAGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTAT
376 S I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S H P S L
1126 TCCATAAATGTTGGGGGATTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTG
401 L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I D
1201 CTGGATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACTAACTCGAGCGG
C-RANKL的表达与纯化
用质粒pGEX-RANKL转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)Gold pLys 细胞。含卡那霉素和氯霉素琼脂平板上的单个菌落在液体培养基中扩增 (LB培养基，30μg/ml卡那霉素，50μg/ml氯霉素)，并在220rpm振 摇和30℃下孵育过夜。然后用过夜培养液1∶100v/v接种于1L LB(含 30μg/ml卡那霉素)，在24℃下培养至OD600＝1。用0.4mM IPTG诱导 表达。16小时后以5000rpm离心收集细胞。将细胞沉淀悬浮于裂解缓 冲液(50mM Tris-HCl，pH8；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mM DTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4U/ml DNAse)中30分钟。加 入2.5倍体积的缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0；1％ Triton X100；100 mM NaCl；0.1％NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，在37℃下孵育15 分钟。超声处理细胞，以9000rpm沉淀15分钟。将上清液立即进行GST- 亲和层析。
5ml GST-TrapFF柱(Amersham Pharmacia)用PBS pH7.3(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)平衡。上清液上样 到5ml GST-Trap FF柱上，随后用5倍柱体积的PBS洗柱。用含有10mM GSH的50mM Tris-HCl，pH＝8.0洗脱蛋白质GST-PS-C-RANKL。
纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白用蛋白酶PreScission(Amersham Pharmacia)消化。消化在37℃下进行1小时，GST-PS-C-RANKL与 PreScission的摩尔比为500/1。
此外，用HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia)对蛋白酶消 化反应进行缓冲液交换，合并含有蛋白质的级分，立即用以前报告的相 同条件进行GST亲和层析的另一步骤。在还原条件下用SDS-PAGE凝 胶分析C-RANKL的纯化，如图6所示。标准蛋白质的分子量示于图中 凝胶左侧空白处。凝胶用考马斯亮蓝染色。切割的C-RANKL在流出液 (未结合的级分)中存在，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的 GST-PS和PreScission与柱结合。获得高纯度的预期大小为22kDa的 C-RANKL蛋白。
加样至图6的凝胶上的样品如下：
第1道：低分子量标准。第2、3道：0.4mM IPTG诱导16小时后， 空载体pGEX6p1和pGEX-RANKL分别转化的BL21/DE3细胞的裂解液 的上清液。第4道：过GST-Trap FF柱后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。 第5道：GST-Trap FF柱未结合的级分。第6道：PreScission蛋白酶切 割后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。第7道：上样GST-RANKL消化 液的GST-Trap FF柱的未结合级分，含有纯化的C-RANKL。第8道： 上样GST-PS-C-RANKL消化液并用GSH洗脱的GST-Trap FF柱的结合 级分。
B.C-RANKL与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与C-RANKL溶 液(终浓度：60μM Qβ，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
C.C-RANKL与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl(pH7.2)中的 溶液与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25 ℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合液与 C-RANKL溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM C-RANKL)在25 ℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
D.C-RANKL与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与C-RANKL溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
E.C-RANKL与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH在摇床上室温反应60 分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合 并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与C-RANKL溶 液(终浓度：60μM菌毛，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小 时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
实施例7
A.含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，小鼠朊病毒蛋白截短形式的
表达与纯化
重组表达小鼠朊病毒蛋白(称为mPrPt)的截短形式(氨基酸 121-230)，其在C端融合一个GGGGCG氨基酸接头，用于与VLP和菌 毛偶联。为便于纯化，该蛋白质与人Fc-片段的N端融合。为了在纯化 后切割融合蛋白的Fc部分，向肠激酶(EK)切割位点之后引入一个EK 切割位点。
mPrPt-EK-Fc*的构建
以质粒pBPCMVPrP-Fc为模板，用引物5’PrP-BamHI和3’PrP-NheI PCR扩增小鼠PrPt。pBPCMVPrP-Fc含有小鼠朊病毒蛋白的野生型序列。 5’PrP-BamHI含有一个内部BamHI位点，并且含有一个ATG，3’PrP-NheI 含有一个内部NheI位点。
对于PCR反应，在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶， 0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板 DNA。温度循环如下：94℃2分钟，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、 68℃(45秒)5个循环，然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45 秒)20个循环，之后68℃10分钟。
PCR产物用BamHI和NheI消化，插入在EK切割序列5’端含有 GGGGCG接头序列的pCEP-SP-EK-Fc*中。得到的质粒命名为 pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*。
其它所有步骤均按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸：
引物5’PrP-BamHI
5’-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3’(SEQ ID NO： 321)
引物3’PrP-NheI
5’-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3’(SEQ ID NO：322)
mPrPt-EK-Fc*的表达与纯化
用质粒pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*转染293-EBNA细胞(Invitrogen)， 如实施例1所述用蛋白A-sepharose柱纯化。
mPrPt-EK-Fc*的蛋白质序列在SEQ ID NO：323中列出。
切割后的mPrPt含有SEQ ID NO：324所示的序列，在其C端含有 GGGGCG接头。
纯化的融合蛋白mPrPt-EK-Fc*用肠激酶切割，并在肠激酶切割之前 及之后在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马斯亮蓝 染色。结果显示在图7中。标准蛋白质的分子量示于图中凝胶左侧空白 处。mPrPt-EK-Fc*融合蛋白可被检测到，为一条50kDa的带。含有与其 C端融合的GGGGCG氨基酸接头的切割的mPrPt蛋白可被检测到，为 一条18-25kDa的宽带。mPrPt的身份通过Western印迹证实(数据未显 示)。因此，能够表达并纯化具有一个含半胱氨酸残基的C端氨基酸接 头的mPrPt，用来与VLP和菌毛偶联。
加载到图7的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：切割前的mPrPt-EK-Fc*。第3道： 切割后的mPrPt。
B.mPrPt与Qβ衣壳的偶联
120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与25 倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反 应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与mPrPt溶液(终浓度： 60μM Qβ，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
C.mPrPt与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与mPrPt溶液(终 浓度：60μM fr，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
D.mPrPt与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与mPrPt溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联 产物经SDS-PAGE分析。
E.mPrPt与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与mPrPt 溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
实施例8
A.朊病毒肽与Qβ衣壳蛋白的偶联：朊病毒肽疫苗
化学合成下列朊病毒肽：CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR (“cprplong”)和CGNDWEDRYYRENMYR(“cprpshort”)，为了与VLP 和菌毛偶联，它们包含一个添加的N端半胱氨酸残基，用于如以下所述 与Qβ进行化学偶联。
将140μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液5ml与108μl 65mM SMPH水溶液(Pierce)在25℃摇床上反应30 分钟。反应溶液随后在4℃下用5L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液与1.35μl 2mM肽cprpshort 贮存液(溶解于DMSO)(1∶2肽/Q·衣壳蛋白比)或者与2.7μl相同贮 存溶液(1∶1肽/Q·比)反应。1μl 10mM肽cprplong贮存溶液(溶解 于DMSO)与100μl透析的反应混合液反应。偶联反应在15℃水浴中 进行过夜。反应混合液随后在4℃下用2×5 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析24小时。
离心偶联产物，上清液和沉淀在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶 上分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。结果显示在图16中。标准蛋白质的 分子量示于图中凝胶左侧空白处。分子量为16.5-25kDa之间的带清楚 地证实了肽cprpshort和cprplong与Q·衣壳蛋白的共价偶联。
加载到图16A的凝胶上的样品如下：
第1道：纯化的Q·衣壳蛋白。第2道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋 白。第3-6道：以1∶2肽/Q·比(第3、4道)和1∶1肽/Q·比(第5、6 道)进行的Qβ衣壳蛋白-cprpshorr偶联。显示可溶性级分(第3、5道) 和不可溶性级分(第4、6道)。
加载到图16B的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋白。第3、 4道：Qβ衣壳蛋白-cprplong偶联反应物。显示可溶性级分(第3道)和 不可溶性级分(第4道)。
B.朊病毒肽与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与等摩尔浓度的 肽cprpshort或以1∶2cprplong/fr的比例在16℃摇床上反应过夜。偶联 产物经SDS-PAGE分析。
C.朊病毒肽与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应 混合液与等摩尔浓度的肽cprpshort或以1∶2 cprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mut的比例在16℃摇床上反应过夜。偶联产物 经SDS-PAGE分析。
D.朊病毒肽与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与朊病 毒肽等摩尔或以1∶2的肽/菌毛比在16℃摇床上反应过夜。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
实施例9
与VLP和菌毛偶联的IL-13的克隆、表达和纯化
A.白介素13(IL-13)的克隆与表达，为与VLP和菌毛偶联，其在N 端氨基酸接头处含有一个半胱氨酸残基
a)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳动物细胞中作为Fc 融合蛋白表达
通过RT-PCR从体外激活的脾细胞中分离用于克隆IL-13的DNA， 这些脾细胞用如下方法获得：从小鼠脾脏细胞中分离CD4+T细胞，在 预先用抗CD3和抗CD28抗体包被的6孔板中在IMDM(+5％FCS+10 ng/mlIL4)中孵育3天。用这些细胞的RNA通过一步法RT-PCR(Qiagen 一步法PCR试剂盒)扩增IL13。RNA的反转录使用引物XhoIL13-R， IL13 cDNA的PCR扩增使用引物NheIL13-F(SEQ ID NO：338)和 XhoIL 13-R(SEQ ID NO：339)。扩增的IL13 cDNA利用NheI/XhoI限 制性酶切位点连接到pMOD载体中(产生载体pMODB1-IL13)。用 BamHI/XhoI消化pMODB1-IL13，将含IL-13的片段连接到预先用 BamHI/XhoI消化的pCEP-SP-XA-Fc*(Δxho)载体中，该载体与 pCEP-SP-XA-Fc*的结构类似，但除去了Fc序列末端的一个XhoI位点。 对连接后产生的质粒(pCEP-SP-IL13-Fc)测序，用来转染HEK-293T细 胞。该质粒编码的IL 13构建体在IL-13成熟序列N端融合有氨基酸序 列ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，它的 侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。IL13-Fc可用蛋白A树脂从 pCEP-SP-IL13-Fc转染细胞的上清液中纯化。表达结果显示在图17B中 (样品的描述见实施例10)。用因子Xa切割融合蛋白释放N端与上述 氨基酸序列融合的成熟IL-13，获得以下称为“小鼠C-IL-13-F”的一种蛋 白质，其具有SEQ ID NO：328的序列。图17B的结果清楚地证实了IL-13 构建体的表达。
b)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳动物细胞中表达， 其在N端融合有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)
用于克隆N端含有GST的IL-13的cDNA如上(a)所述由TH2激 活的T细胞的cDNA获得。使用引物Nhelink1IL13-F和 IL13StopXhoNot-R从该cDNA中扩增IL-13。PCR产物用NheI和XhoI 消化，连接到预先用NheI/XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK载体中。用可 从所述连接反应分离的质粒(pCEP-SP-GST-IL13)转染HEK-293T细胞。 获得的由该质粒编码的IL13构建体在IL-13成熟序列N端融合了氨基酸 序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序列ACGGGGG，其侧翼为 克隆过程中引入的其它氨基酸。用pCEP-SP-GST-IL13转染的细胞的培 养上清液含有融合蛋白GST-IL13，该融合蛋白能按照标准方法通过谷胱 甘肽亲和层析纯化。用肠激酶切割该融合蛋白释放在N端与上述氨基酸 序列融合的成熟IL-13，获得以下称为“小鼠C-IL-13-S”的一种蛋白质， 其具有SEQ ID NO：329的序列。
B.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与25 倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反 应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与小鼠C-IL-13-F或小鼠 C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F 或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE 分析。
C.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合液与小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM 小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物 经SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶 联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶 液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-13-F或小 鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
实施例10
为了与VLP和菌毛偶联而含有一个含半胱氨酸残基的N端氨基酸接头
的白介素5(IL-5)的克隆与表达
A.IL-5的克隆，用于在大肠杆菌中作为包涵体表达
使用下列两种引物从ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC号：37562) 中PCR扩增IL-5：Spelinker3-F1(SEQ ID NO：340)和IL5StopXho-R (SEQ ID NO：342)。用该PCR产物作为模板进行第二次PCR，使用引 物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO：341)和IL5StopXho-R。插入片段用 SpeI和NotI消化。将该插入片段连接入预先用NheI和NotI消化(未磷 酸化)的pET载体衍生物(pMODEC3-8载体)中，转化大肠杆菌TG1 细胞。克隆到pMODEC3-8载体中产生的IL5构建体在其N端含有一个 六组氨酸尾，随后是一个肠激酶位点，一个含有半胱氨酸残基的N端γ3 氨基酸接头(其C端一侧为序列AS，N端一侧为序列ALV)，和IL5基 因的成熟形式。肠激酶切割释放的蛋白质被称为“小鼠C-IL-5-E”(SEQ ID NO：332)。产生的克隆pMODC6-IL5.2(也称为pMODC6-IL5)的质粒 DNA通过DNA测序证实其序列，用它转化大肠杆菌BL21株。
克隆pMODC6-IL5/BL21在含1mg/L氨苄青霉素的5ml LB中生长 过夜。2ml培养液用含有1mg/L氨苄青霉素的100ml培养液(TB)稀 释。当培养液达到光密度OD600＝0.7时，加入0.1ml 1M异丙基β-D-硫 代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)溶液诱导培养。每2小时采集10ml样品。 样品以4000xg离心10分钟。沉淀重悬浮于0.5ml含50mM Tris-HCl、 2mM EDTA、0.1％triton X-100的裂解缓冲液(pH8)中。加入20μl 溶菌酶(40mg/ml)并在4℃下孵育试管30分钟后，超声处理细胞2分 钟。加入100μl 50mM MgCl2溶液和1ml benzonase。然后在室温下孵 育细胞30分钟，以13000×g离心15分钟。
弃上清液，沉淀在100μl SDS加样缓冲液中98℃煮沸5分钟。溶于 加样缓冲液的10μl样品在还原条件下通过SDS-PAGE分析(图17A)。 图17A的凝胶清楚地证实了IL-5构建体的表达。加载到图17A的凝胶 上的样品如下：
M道：标准分子量蛋白质(NEB，宽范围预染色标准蛋白)。第1 道：诱导前1ml培养液的细胞提取物。第2道：诱导4小时后1ml培 养液的细胞提取物。
B.IL-5的克隆，用于在哺乳动物细胞(HEK-293T)中表达
a)在N端与一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头融合且在C端与Fc 片段融合的IL-5
用(A)所述的模板(ATCC克隆37562)克隆下列构建体。质粒 pMODB1-IL5(一种pET衍生物)用BamHI/XhoI消化，产生一个小片 段，其编码与含有半胱氨酸的N端氨基酸接头融合的IL5。将该片段连 接到预先用BamHI和XhoI消化的载体pCEP-SP-XA-Fc*(ΔXho)中。 连接物通过电穿孔进入大肠杆菌TG1株，产生的克隆pCEP-SP-IL5-Fc.2 的质粒DNA通过DNA测序证实其序列，用它来转染HEK-293T细胞。 该质粒编码的IL5构建体包含在IL-5成熟序列N端融合的氨基酸序列 ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，其含有 一个半胱氨酸，侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。用因子-Xa切割 该融合蛋白释放的IL-5蛋白在下文中称为“小鼠C-IL-5-F”(SEQ ID NO： 333)。
转染并在嘌呤霉素上筛选后，利用与辣根过氧化物酶偶联的抗-His (小鼠)和抗-小鼠IgG抗体，通过Western印迹分析培养上清液(图17B)。 与辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgG抗体也能检测Fc-融合蛋白。用蛋 白A树脂通过亲和层析进行蛋白质纯化。图17B的结果清楚地证实了 IL-5构建体的表达。
加载到图17B的Western印迹上的样品如下：
第1道：表达IL5-Fc的HEK培养上清液(20μl)。SDS-PAGE在还 原条件下进行。第2道：表达IL13-Fc的HEK培养上清液(20μl)。 SDS-PAGE在非还原条件下进行。第3道：表达IL5-Fc的HEK培养上 清液(20μl)。SDS-PAGE在非还原条件下进行。
b)克隆的IL-5，其含有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)和在N端融合 的一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头
用引物Nhe-link1-IL13-F和IL5StopXho-R扩增IL-5(ATCC 37562)。 用NheI和XhoI消化后，将插入片段连接到预先用NheI和XhoI消化的 pCEP-SP-GST-EK中。对产生的质粒pCEP-SP-GST-IL5测序，并用于转 染HEK-293T细胞。得到的该质粒编码的IL-5构建体含有在IL-5成熟 序列的N端融合的氨基酸序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序 列ACGGGGG，其含有一个半胱氨酸残基，侧翼为克隆过程中引入的其 它氨基酸。肠激酶切割释放的蛋白质在下文中称为“小鼠C-IL-5-S”(SEQ ID NO：334)。产生的蛋白质用谷胱甘肽亲和树脂通过亲和层析进行纯 化。
C.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
D.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
E.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液 (终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠 C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
F.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与小鼠 C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
实施例11
含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，鼠血管内皮生长因子-2
(mVEGFR-2，FLK1)片段的表达、纯化和偶联
将包含第二和第三胞外域的鼠血管内皮生长因子-2(mVEGFR-2， FLK1)的构建体重组表达为一种Fc-融合蛋白，为与VLP和菌毛偶联， 它在C端包含一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头。mVEGFR-2(2-3)的蛋 白质序列由小鼠FLK-1的cDNA序列翻译而来(Matthews等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88：9026-9030(1991)：登录号X59397；Ig样C2型域2： 氨基酸143-209；Ig样C2型域3：氨基酸241-306)。mVEGFR-2(2-3)构 建体包含mVEGFR-2从脯氨酸126到赖氨酸329之间的序列(前体蛋白 的编号)。该构建体除了免疫球蛋白样C2型域2和3之外，为了添加氨 基酸间隔区，还包含mVEGFR-2序列中域2之前和域3之后的侧翼区。 含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头通过克隆入pCEP-SP-EK-Fc*载体 (实施例1)内与mVEGFR-2序列的C端融合。克隆入pCEP-SP-EK-Fc* 载体内的mVEGFR-2的片段编码下列氨基酸序列(SEQ ID NO：345)： PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK RFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSH HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCV ASSGRMIKRN RTFVRVHTKP
重组mVEGFR-2(2-3)在真核细胞中的表达
利用pCEP-SP-EK-Fc*载体在EBNA 293细胞中表达重组 mVEGFR-2(2-3)。pCEP-SP-EK-Fc*载体含有一个BamHI和一个NheI位 点，编码含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头、一个肠激酶切割位点和 C端的一个人Fc区。用引物对BamHI-FLK1-F和NheI-FLK1-B从小鼠7 天胚胎cDNA(Marathon-Ready cDNA，Clontech)中PCR扩增 mVEGFR-2(2-3)。对于PCR反应，在50·1反应混合液(1·1 Advantage 2聚合酶混合物(50×)，0.2mM dNTPs和5·110×cDNA PCR反应缓冲 液)中使用各10pmol引物和0.5ng cDNA(小鼠7天胚胎cDNA， Marathon-Ready cDNA，Clontech)。温度循环如下：94℃ 1分钟，94℃ 30 秒、54℃30秒、72℃1分钟5个循环，之后94℃(30秒)、54℃(30 秒)、70℃(1分钟)5个循环，之后94℃(20秒)、54℃(30秒)、68℃ (1分钟)30个循环。PCR产物用BamHI和NheI消化，插入用相同酶 消化的pCEP-SP-EK-Fc*载体中。产生的质粒命名为 mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc。其它所有步骤都按标准分子生物学方法进 行。
寡核苷酸：
1.引物BamHI-FLK1-F
5’-CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC-3’(SEQ ID NO：343)
2.引物NheI-FLK1-B
5’-CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC-3’(SEQ ID NO：344)
重组mVEGFR-2(2-3)的转染和表达
用上述mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc构建体转染EBNA 293细胞， 收集细胞无血清上清液，用于如实施例1所述纯化。
重组mVEGFR-2(2-3)的纯化
表达的Fc-EK-mVEGFR-2(2-3)蛋白的蛋白A纯化如实施例1所述进 行。随后，在融合蛋白与蛋白A结合后，利用肠激酶(肠激酶Max， Invitrogen)从与蛋白A结合的Fc部分上切下mVEGFR-2(2-3)。在37℃ 下消化过夜(2.5单位肠激酶/100μl结合融合蛋白的蛋白A珠)。通过层 析柱(Micro Bio Spin，Biorad)的短暂离心将释放的VEGFR-2(2-3)与 仍与蛋白A结合的Fc部分分离。为了除去肠激酶，流出液用肠激酶away (Invitrogen)按照使用说明书处理。
实施例12
鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白、HbcAg-lys-2cys-Mut与菌毛的偶联，用
VLP-肽和菌毛-肽疫苗免疫小鼠
A.鼠VEGFR-2肽与VLP和菌毛的偶联
化学合成下列肽(由比利时Eurogenetic合成)：鼠VEGFR-2肽 CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK，用于如下所述与菌毛化学偶 联。
鼠VEGFR-2肽与菌毛的偶联：将1mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液1400μl与85μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在 摇床上室温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐，合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分(约含1.4mg蛋白质)， 并与2.5倍摩尔过量(终体积)的鼠VEGFR-2肽反应。例如，向200μl 约含0.2mg衍生菌毛的洗脱液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶解于 DMSO)。混合液在25℃摇床上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析过夜。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析， 显示于图18A中。将每种样品的上清液(S)和沉淀(P)以及菌毛和 Sulfo-MBS交联剂(Pierce)衍生的菌毛加样到凝胶上。加载到图18A 的凝胶上的样品如下：
第1道：标准蛋白质；第2-5道：偶联的样品(菌毛鼠：与鼠肽偶 联的菌毛；菌毛人：与人肽偶联的菌毛)；第6道：用Sulfo-MBS交联 剂衍生的菌毛；第7-9道：PD-10柱洗脱液的三种级分。级分2是峰级 分，级分1和3是在峰缘采集的级分。偶联带在凝胶上清晰可见，证实 鼠VEGFR-2与菌毛成功偶联。
鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白的偶联：将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml与20μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。反应溶液随后 在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析两次各2小时。1000μl透析的 反应混合液与12μl 10mM肽溶液(溶解于DMSO)在25℃摇床上反应 4小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析2×2小 时。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析，显示于图18B中。将 每种样品的上清液(S)以及Qβ衣壳蛋白和Sulfo-MBS交联剂(Pierce) 衍生的Qβ衣壳蛋白加样到凝胶上。偶联一式两份进行。下列样品被加 载到凝胶上：
第1道：标准蛋白质；第2、5道：Qβ衣壳蛋白；第3、6道：用 Sulfo-MBS交联剂衍生的Qβ衣壳蛋白；第4、7道：与鼠VEGFR-2肽 偶联的Qβ衣壳蛋白。偶联带在凝胶上清晰可见，证实鼠VEGFR-2与 Qβ衣壳蛋白成功偶联。
鼠VEGFR-2肽与HbcAg-lys-2cys-Mut的偶联：将0.9mg/ml无半 胱氨酸的HbcAg衣壳蛋白(实施例31)在PBS pH7.4中的溶液3ml与 37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。 反应溶液随后用2 L 20mM Hepes pH7.4透析过夜。更换缓冲液后，反 应溶液用相同缓冲液再透析2小时。透析的反应混合液与3μl 10mM肽 溶液(溶解于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃ 下用2 L 20mM Hepes pH7.4透析过夜，然后更换缓冲液，用相同缓冲 液再透析2小时。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析，显示于 图18C中。将每种样品的上清液(S)以及HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白和 Sulfo-MBS交联剂衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白加样到凝胶上。偶联 一式两份进行。偶联反应在2.5倍和10倍摩尔过量的肽中进行。下列样 品被加载到凝胶上：
第1道：标准蛋白质；第2、4、6、8道：与10倍摩尔过量的肽进 行偶联反应的上清液(S)和沉淀(P)；第3、5、7、9道：与2.5倍摩 尔过量的肽进行偶联反应的上清液(S)和沉淀(P)；第10道：Sulfo-MBS 衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut；第11道：HbcAg-lys-2cys-Mut。
偶联带在凝胶上清晰可见，证实鼠VEGFR-2与HbcAg-lys-2cys-Mut 蛋白成功偶联。
B.小鼠的免疫：
菌毛-肽疫苗：
给雌性C3H-HeJ(缺乏Toll样受体4)和C3H-HeN(野生型)小鼠 接种不含佐剂的与菌毛蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg 总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、 28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分 析。
Qβ衣壳蛋白-肽疫苗：
给雌性Black 6小鼠接种含及不含佐剂(氢氧化铝)的与Qβ衣壳蛋 白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg总蛋白用PBS稀释为200 μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、28、42天眼眶后放血， 第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分析。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗：
给雌性Black 6小鼠接种含及不含佐剂(氢氧化铝)的与 HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg总 蛋白用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、 28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分 析。
C.ELISA
通过ELISA用固定化的鼠VEGFR-2肽检测免疫小鼠的血清。利用 化学交联剂Sulfo-SPDP使鼠VEGFR-2肽与牛RNAseA偶联。ELISA板 用浓度为10μg/ml的偶联RNAse A包被。封闭ELISA板，然后与连续 稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也 检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。用未偶联载体免疫的小鼠的血清 进行对照ELISA实验，结果显示，检测的抗体是各自肽特异的。结果显 示在图4-6中。
菌毛-肽疫苗：
ELISA的结果如图18D所示。所述血清稀释液的结果显示为450nm 下的光密度。三只小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有 小鼠都产生抗鼠VEGFR-2肽的IgG抗体效价。缺乏Toll样受体4的小 鼠与野生型小鼠之间未见差异，证实了当与菌毛偶联时，自身抗原鼠 VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相应血清 命名。
Qβ衣壳蛋白-肽疫苗：
所述血清稀释液的结果在图18E中显示为450nm下的光密度。两只 小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生抗鼠 VEGFR-2肽的IgG抗体效价，证实了当与Qβ衣壳蛋白偶联时，自身抗 原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相 应血清命名。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗：
所述血清稀释液的结果在图18F中显示为450nm下的光密度。三只 小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生抗鼠 VEGFR-2肽的IgG抗体效价，证实了当与Qβ衣壳蛋白偶联时，自身抗 原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相 应血清命名。
实施例13
Aβ1-15肽与HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣壳蛋白的偶联
化学合成下列Aβ肽(DAEFRHDSGYEVHHQGGC)，该肽包含人 Aβ残基1-15的氨基酸序列，为了与VLP和菌毛偶联，在其C端与序列 GGC融合。
A.a)Aβ1-15肽利用交联剂SMPH与HBcAg-lys-2cys-Mut的偶联
将1.2mg/ml HBcAg-lys-2cys-Mut蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液833.3μl与17μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为 10000 Da的透析管中用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析两次 各2小时。833.3μl透析的反应混合液与7.1μl 50mM肽贮存液(溶解 于DMSO中的肽贮存液)在15℃摇床上反应2小时。反应混合液随后 在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜。样品等量 分装后液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
b)Aβ1-15肽利用交联剂SMPH与fr衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液500μl与23μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30 分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为10000 Da的透析管中用 1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析两次各2小时。500μl透析 的反应混合液与5.7μl 50mM肽贮存液(溶解于DMSO中的肽贮存液) 在15℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析过夜。样品等量分装后液氮冻结，贮存于-80℃， 直到用于免疫小鼠。偶联反应的样品在还原条件下通过SDS-PAGE分析。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示于图19A中。对应于 Aβ1-15与fr衣壳蛋白或与HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶联的偶联带在凝胶上 清晰可见，在图中以箭头指出，证实Aβ1-15与fr衣壳蛋白及与 HBc-Ag-lys-2cys-Mut衣壳蛋白成功偶联。Aβ1-15与fr衣壳蛋白偶联可 见多条偶联带，而与HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶联主要可见一条偶联带。
下列样品加载到图19A的凝胶上。
1：蛋白质标准(kDa标准7708S BioLabs。凝胶上的分子量标准带 从上往下为：175，83，62，47.5，32.5，25，16.5，6.5kDa)。2：衍生 的HBc-Ag-lys-2cys-Mut。3：与Aβ1-15偶联的HBc-Ag-lys-2cys-Mut， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的上清液。4：与Aβ1-15偶联的 HBc-Ag-lys-2cys-Mut，在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。5： 衍生的fr衣壳蛋白。6：与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白，在偶联反应结 束时采集并离心的样品的上清液。7：与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。
B.Balb/c小鼠的免疫
雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天两次皮下接种用无菌PBS稀释 的10μg与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白(Fr-Aβ1-15)或10μg与Aβ1-15 偶联的HBc-Ag-lys-2cys-Mut(HBc-Aβ1-15)。对小鼠在第22天眼眶后 放血，用Aβ-1-15特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
利用化学交联剂Sulfo-SPDP使Aβ1-15与牛RNAse A偶联。ELISA 板用浓度为10μg/ml的Aβ1-15-RNAse偶联物包被。封闭ELISA板， 然后与连续稀释的血清样品孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗 体检测。也检测来自未免疫小鼠的血清作为对照。
图19B显示在第22天获得的ELISA信号，应用分别以疫苗Fr-Aβ 1-15和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括来自未免疫小鼠的对照 血清(免疫前血清)。不同血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。 三只接种小鼠的平均值均被显示。接种的所有小鼠在血清中都含有Aβ 1-15特异的IgG抗体。
实施例14
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽与1型菌毛的偶联
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽利用交联剂SMPH与菌毛的偶联。
化学合成下列Aβ肽： DAEFRHDSGYEVHHQGGC(“Aβ1-15”)，该肽包含人Aβ氨基酸残基 1-15的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其C端与序列GGC融 合； DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC(“Aβ1-27”)，该肽包含 人Aβ氨基酸残基1-27的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其C 端与序列GGC融合；以及 CGHGNKSGLMVGGVVIA(“Aβ 33-42”)，该肽包含人Aβ氨基酸残基 33-42的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其N端与序列 CGHGNKS融合。所有这三种肽都如下所述与菌毛化学偶联。
将2mg/ml菌毛在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液2ml 与468μl 33.3mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应45分钟。 将反应溶液上样到PD10柱(Pharmacia)上，用6×500μl 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4洗脱。洗脱级分通过在硝酸纤维素(Schleicher & Schuell)上斑点杂交分析，并用Amidoblack染色。合并级分3-6。然后 将样品等量分装冻存于液氮中，贮存于-80℃，直到用于偶联。
200μl融化的脱盐反应混合液与200μl DMSO和各2.5μl相应的50 mM肽DMSO贮存液在摇床上室温反应3.5小时。400μl反应混合液随 后在4℃下在分子量排阻值为10000 Da的透析管中用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析三次各1小时。然后将样品等量分装冻存于液 氮中，贮存于-80℃。
用于SDS-PAGE的样品制备如下进行：100μl透析的偶联反应液在 10％TCA中冰上孵育10分钟，然后离心。沉淀重悬浮于50μl 8.5M盐 酸胍溶液中，在70℃下孵育15分钟。然后用乙醇沉淀样品，在第二次 离心步骤后，沉淀重悬浮于样品缓冲液中。
偶联实验的结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析。所有三种肽的 偶联带均清晰可见，证实Aβ肽与菌毛成功偶联。
实施例15
用与Qβ衣壳蛋白偶联的Aβ肽接种APP23小鼠
A.APP23小鼠的免疫
三种不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2； H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) 与Qβ衣壳蛋白偶联。产生的疫苗命名为“Qb-Ab 1-15”、“Qb-Ab 1-27”和 “Qb-Ab 33-42”。接种使用8个月大的携带人APP转基因的雌性APP23 小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292 (1997))。给小鼠皮下注射无菌PBS稀释的25μg疫苗，14天后用相同 量的疫苗加强。在开始免疫前和加强注射7天后，从小鼠尾静脉取血。 通过ELISA分析血清。
B.ELISA
Aβ1-40和Aβ1-42肽贮存液用DMSO配制，使用前用包被缓冲液 稀释。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封闭ELISA 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也包括接种前获得的血清作为对照。显示平均值高于基线3 个标准差的血清稀释度被计算并定义为“ELISA滴度”。测试的所有3种 疫苗在APP23小鼠中都有免疫原性，并且诱导出针对Aβ1-40和/或Aβ 1-42的高抗体效价。结果显示在图20中。在同一小鼠的免疫前血清中 未检测到特异性抗体(数据未显示)。
图20显示在第22天获得的ELISA信号，应用分别以疫苗Fr-Aβ1-15 和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括来自未免疫小鼠的对照血清 (免疫前血清)。不同血清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。三 只接种小鼠的平均值均被显示。
小鼠A21-A30接受疫苗Qb-Ab 1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab 1-27， 小鼠A41-49接受Qb-Ab 33-42。每只小鼠在第21天通过ELISA测定Aβ 1-40和Aβ1-42肽特异的血清抗体滴度。每只小鼠显示的ELISA滴度定 义为平均值高于基线3个标准差的血清稀释度。接种Qb-Ab 1-15或 Qb-Ab 1-27的小鼠产生抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗体滴度，而接种 Qb-Ab 33-42的小鼠只产生抗Aβ1-42肽的高抗体滴度。
实施例16
Fab抗体片段与Qβ衣壳蛋白的偶联
4.0mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶 液与2.8mM SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的贮存液)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
用木瓜蛋白酶消化人IgG产生的人IgG的Fab片段购自Jackson Immunolab。该溶液(11.1mg/ml)用20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 稀释为2.5mg/ml的浓度，使之与不同浓度(0-1000μM)的二硫苏糖醇 (DTT)或三羧乙基磷化氢(TCEP)在25℃下反应30分钟。
混合衍生并透析的Qβ衣壳蛋白溶液与未还原或还原的Fab溶液(终 浓度：1.14mg/ml Qβ和1.78mg/ml Fab)诱导偶联，在25℃摇床上反应 过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色。结果显示在图21中。
在偶联之前用25-1000μM TCEP和25-100μM DTT还原Fab的样品 中能检测到约40kDa的偶联产物(图21，箭头)，而用10μM TCEP、 10μM DTT或1000μM DTT还原则检测不到。偶联带也与抗-Qβ抗血清 反应(数据未显示)，清楚地证实了Fab片段与Qβ衣壳蛋白的共价偶联。
加载到图21的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2、3道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋白。第 4-13道：Fab还原后的Qβ-Fab偶联反应，其中4：用10μM TCEP还原 Fab后的Qβ-Fab偶联反应；5：用25μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应；6：用50μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；7：用100 μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；8：用1000μM TCEP还原 Fab后的Qβ-Fab偶联反应；9：用10μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应；10：用25μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；11：用50 μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；12：用100μM DTT还原Fab 后的Qβ-Fab偶联反应；13：用1000μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应。14：偶联前的Fab。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分 子量示于左侧空白处。箭头所指为偶联带。
实施例17
用与Qβ衣壳蛋白偶联的Aβ肽接种APP23小鼠
A.APP23小鼠的免疫
三种不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2； H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ 33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) 与Qβ衣壳蛋白偶联。产生的疫苗命名为“Qb-Ab 1-15”、“Qb-Ab 1-27”和 “Qb-Ab 33-42”。接种使用8个月大的携带人APP转基因的雌性APP23 小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292 (1997))。给小鼠皮下注射无菌PBS稀释的25μg疫苗，14天后用相同 量的疫苗加强。在开始免疫前和加强注射7天后，从小鼠尾静脉取血。 通过ELISA分析血清。
B.ELISA
Aβ1-40和Aβ1-42肽贮存液用DMSO配制，在使用前用包被缓冲 液稀释。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封闭ELISA 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也包括接种前获得的血清作为对照。平均值高于基线3个标 准差的血清稀释度被计算并定义为“ELISA滴度”。测试的所有3种疫苗 在APP23小鼠中都是免疫原性的，并且诱导产生抗Aβ1-40和/或Aβ1-42 的高抗体效价。结果显示在图20中。在同一小鼠的免疫前血清中未检 测到特异性抗体(数据未显示)。
图20显示在第22天获得的ELISA信号，其应用分别以疫苗Qb-Ab 1-15、Qb-Ab 1-27和Qb-Ab 33-42免疫的小鼠的血清。小鼠A21-A30接 受疫苗Qb-Ab 1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab 1-27，小鼠A41-49接受 Qb-Ab 33-42。每只小鼠在第21天通过ELISA测定Aβ1-40和Aβ1-42 肽特异的血清抗体滴度。每只小鼠显示的ELISA滴度定义为平均值高于 基线3个标准差的血清稀释度。接种Qb-Ab 1-15或Qb-Ab 1-27的小鼠 形成抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗体滴度，而接种Qb-Ab 33-42的小鼠 只有抗Aβ1-42肽的高抗体滴度。在表达人Aβ转基因的转基因小鼠中 用人Aβ肽获得极强的免疫应答，证明通过Aβ肽与Qβ衣壳蛋白偶联， 能够克服对自身抗原的耐受。
实施例18
Qβ外壳蛋白突变型的构建、表达与纯化
pQβ-240的构建
用质粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene 137：133-137)作为构 建pQβ-240的初始质粒。突变Lys13→Arg通过反向PCR产生。反向引 物设计为反向尾-尾方向：
5’-GGTAACATCGG AGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3’和
5’-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCT CCGATGTTACC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-240 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：255) AKLETVTLGNIG DGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-243的构建
用质粒pQβ10作为构建pQβ-243的初始质粒。突变Asn10→Lys通 过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向：
5’-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3’和
5’-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-243 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：256) AKLETVTLG IGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250的构建
用质粒pQβ-240作为构建pQβ-250的初始质粒。突变Lys2→Arg通 过定点诱变产生。突变PCR片段的合成使用上游引物 5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物 5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，导入pQβ-185表达载体的仅有的限 制性酶切位点NcoI和HindIII中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂 商推荐方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-250 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：257) A LETVTLGNIG DGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251的构建
用质粒pQβ10作为构建pQβ-251的初始质粒。突变Lys16→Arg通 过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向：
5’-GATGGA CAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3’和
5’-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTG TCCATC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-251 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。获得的由该构建 体编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：259中显示。
pQβ-259的构建
用质粒pQβ-251作为构建pQβ-259的初始质粒。突变Lys2→Arg通 过定点诱变产生。突变PCR片段的合成使用上游引物 5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物 5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，导入pQβ-185表达载体的仅有的限 制性酶切位点NcoI和HindIII中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂 商推荐方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-259 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：258) AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
Qβ和Qβ突变体的表达和纯化的一般方法
表达
用Qβ表达质粒转化大肠杆菌JM109。用Qβ表达质粒转化的克隆 接种于5ml含20·g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。不加振摇在37℃ 下孵育16-24小时。
用制备的细菌培养液以1∶100接种于100-300ml含20·g/ml氨苄青 霉素的LB培养基。不加振摇在37℃下孵育过夜。用制备的细菌培养液 以1∶50接种于烧瓶中的M9+1％酪蛋白氨基酸+0.2％葡萄糖培养基， 37℃振摇孵育过夜。
纯化
用于纯化过程的溶液和缓冲液
1.裂解缓冲液LB
50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鲜制 备的PMSF，至5μg/ml。不含溶菌酶和DNAse。
2.SAS
饱和硫酸铵水溶液
3.缓冲液NET
20mM Tris-HCl pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG
溶解于NET中的40％(w/v)聚乙二醇6000
破碎与裂解
冷冻的细胞以2ml/g细胞重悬浮于LB中。混合物以22kH超声处 理5次各15秒，间隔1分钟，溶液在冰上冷却。然后用Janecki K60转 子以14000rpm离心裂解液1小时。除非另外指出，以下所述的离心步 骤均用相同转子进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤两次。 离心后，合并裂解液的上清和洗涤液。
分级分离
在搅拌下向上述合并的裂解液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。将SAS 的体积调节为总体积的1/5，获得20％饱和。溶液静置过夜，次日以14000 rpm离心20分钟。沉淀用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的 上清液，逐滴加入SAS，获得40％饱和。溶液静置过夜，次日以14000mm 离心20分钟。获得的沉淀用NET缓冲液溶解。
层析
将重新溶解于NET缓冲液中的衣壳蛋白上样到Sepharose CL-4B柱 上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个主要含有膜和膜片段，不收集。 衣壳包含在第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。 合并峰级分，将NaCl浓度调节为0.65M的终浓度。在搅拌下逐滴 加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。溶液不加搅拌静置过夜。 以14000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后溶解于最小体积的NET 中，再次上样到Sepharose CL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和(w/v) 的硫酸铵沉淀。离心并重新溶解于NET缓冲液后，衣壳蛋白上样到 Sepharose CL-6B柱上重新进行层析。
透析与干燥
合并如上获得的峰级分，对无菌水充分透析，冻干保存。
Qβ-240的表达与纯化
将细胞(质粒pQβ-240转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中， 超声处理5次各15秒(水冰夹套)，以13000rpm离心1小时。上清液 保存于4℃，直到进一步处理，而碎片用9ml LB洗涤2次，最后用溶 于LB的9ml 0.7M尿素洗涤。合并所有上清液，上样到Sepharose CL-4B 柱上。合并的峰级分用硫酸铵沉淀并离心。然后用Sepharose 2B柱进一 步纯化再次溶解的蛋白质，最后用Sepharose 6B柱纯化。衣壳峰最后用 水充分透析，如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显微镜检查 证实。
Qβ-243的表达与纯化
将细胞(大肠杆菌RR1)重悬浮于LB中，并如一般方法所述处理。 蛋白质用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱通过连续凝胶 过滤步骤纯化。合并峰级分，如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过 电子显微镜检查证实。
Qβ-250的表达与纯化
将细胞(pQβ-250转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，并如 上所述处理。蛋白质用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱 通过凝胶过滤纯化，并如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显 微镜检查证实。
Qβ-259的表达与纯化
将细胞(pQβ-259转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，并超 声处理。碎片用10ml LB洗涤一次，第二次用溶于LB的10ml 0.7M尿 素洗涤。蛋白质用Sepharose CL-4B柱通过两次凝胶过滤层析步骤纯化。 如上所述透析并冻干蛋白质。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显微镜检查 证实。
实施例19
用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2使变应性小鼠脱敏
A.通过接种使变应性小鼠脱敏
雌性CBA/J小鼠(8周龄)用PLA2致敏：每只小鼠，通过振荡30 分钟使0.1μg PLA2(Latoxan，法国)吸附到1mg明矾(Imject，Pierce) 上，总体积为66μl，然后皮下注射。该步骤每14天重复一次，总共4 次。这种处理导致PLA2-特异的血清IgE的产生，但不产生IgG2a抗体。 最后一次致敏1个月后，小鼠皮下注射10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联 的重组PLA2的疫苗。1周及2周后，再次用相同量的疫苗处理。最后 一次处理1周后，从小鼠采血，然后用25μg PLA2(Latoxan)腹膜内 攻击，用校准的数字温度计测量直肠温度。未用Qβ衣壳蛋白-PLA2处 理的致敏小鼠作为对照。虽然所有对照小鼠都经历了过敏反应，表现为 PLA2攻击后直肠温度显著降低，而接种的小鼠完全或至少部分受到保 护。结果显示在图25A中。
B.ELISA
ELISA板(Maxisorp，Nunc)用5μg/ml PLA2(Latoxan)包被。封 闭平板，然后与连续稀释的血清孵育。为了检测IgE抗体，血清在室温 下在摇床上用蛋白G珠(Pharmacia)预处理60分钟。离心除去珠，用 上清液进行ELISA。与PLA2结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG2a或IgE 抗体检测。ELISA滴度在半数最大光密度(OD50％)时测定，对于IgG2a 表示为100倍预稀释的血清的-log5，对于IgE表示为10倍预稀释的血 清的-log5。对于所有小鼠，在疫苗处理之前及结束时测定血清中PLA2 特异的IgG2a和IgE。接种导致PLA2特异性IgG2a显著增多，而注意 到IgE滴度没有与之一致的改变。这些结果表明，接种导致诱导Th1样 免疫应答(反映为IgG2a产生)。结果显示在图25B中。
接种和未接种小鼠的过敏反应显示在图25A中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2 的疫苗皮下处理3次。对照小鼠致敏但不接种。最后一次接种1周后， 所有小鼠都用25μg PLA2腹膜内攻击，通过测量直肠温度60分钟监测 过敏反应。虽然所有对照小鼠都显示体温显著降低，但接种的小鼠完全 或至少部分受到免于过敏反应的保护。
接种对PLA2特异性IgG2a的诱导显示在图25B中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2 的疫苗处理3次。对照小鼠致敏但不接种。处理开始前和处理结束后、 攻击前采集致敏小鼠的血清。在接种的小鼠中(图左边)，观察到PLA2 特异性IgG2a显著增多。
实施例20
PLA2-Cys(也称为PLA2融合蛋白)的表达、
重折叠、纯化和偶联
A.包涵体的表达和制备
用含有实施例xxx的PLA2-Cys基因的pET11a质粒转化大肠杆菌 BL21DE3Rill(Stratagene)。过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素和 15μg/ml氯霉素的dYT培养基中生长。培养液用含氨苄青霉素和氯霉素 的新鲜dYT培养基稀释，在37℃下生长，直到OD600nm＝1。培养液用1mM IPTG诱导，再培养4小时。离心收集细胞，重悬浮于含有0.5mg/ml溶 菌酶的PBS缓冲液中。在冰上孵育后，细胞在冰上超声处理，加入MgCl2至10mM的浓度。向细胞裂解液中添加6μl Benzonase(Merck)，裂解 液在室温下孵育30分钟。添加Triton至终浓度为1％，裂解液在冰上再 孵育30分钟。13000g离心10分钟收集包涵体(IB)沉淀。包涵体沉淀 用含有20mM Tris，23％蔗糖，1mM EDTA，pH8.0的洗涤缓冲液洗涤。 将包涵体溶解于含200mM DTT的6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0中。 溶解的包涵体以50000g离心，上清液用6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0 透析，随后用含有0.1mM DTT的相同缓冲液透析。添加氧化的谷胱甘 肽至终浓度为50mM，溶解的包涵体在室温下孵育1小时。溶解的包涵 体用6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0透析。通过Bradford分析和 SDS-PAGE估计包涵体溶液的浓度。
B.重折叠和纯化
将包涵体溶液每24小时分三部分缓慢加入含有2mM EDTA，0.2 mM苯甲脒，0.2mM 6氨基己酸，0.2mM盐酸胍，0.4M L-精氨酸，pH6.8 的重折叠缓冲液中，至终浓度为3μM，在重折叠开始前，在4℃下向其 中添加5mM还原谷胱甘肽和0.5mM氧化谷胱甘肽。利用YM10膜 (Millipore)超滤将重折叠溶液浓缩为其体积的一半，并用含有0.1mM DTT的PBS，pH7.2透析。通过超滤进一步浓缩蛋白质，在4℃下上样到 用20mM Hepes，150mM NaCl，0.1mM DTT平衡的Superdex G-75柱 (Pharmacia)上进行纯化。在室温下将平衡缓冲液的pH调节为7.2。合 并单成分的级分(monomeric fractions)。
C.偶联
将1.5mg Qβ在0.75mL 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中的溶 液与0.06mL Sulfo-SMPB(Pierce；31mM水贮存液)在室温下反应45 分钟。反应混合液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析过夜，0.75 mL该溶液与1.5mL PLA2-Cys在0.1mM DTT中的溶液(62μM)和0.43 mL在室温下调节为pH7.4的20mM Hepes，150mM NaCl，137μM DTT 混合。偶联反应在室温下继续4小时，利用分子量截断值为300 000Da 的Spectra Por透析管(Spectrum)，反应混合液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析过夜。偶联反应通过SDS-PAGE考马斯蓝染色和 Western印迹分析，使用兔抗蜂毒抗血清(1∶10000稀释)，用山羊抗兔 碱性磷酸酶偶联物(1∶10000稀释)显色；或者使用兔抗Qβ抗血清 (1∶5000)，用山羊抗兔碱性磷酸酶偶联物(1∶10000稀释)显色。在这 两种情况下，样品都在还原条件下进行反应。
偶联反应的结果显示在图26中。对应于Qβ衣壳蛋白与PLA2-Cys 偶联产物的带在Qβ衣壳蛋白与PLA2-Cys间偶联反应的考马斯蓝染色 SDS-PAGE(左图)、抗-Qβ Western印迹(中图)和抗-PLA2 Western印 迹(右图)中清晰可见，在图中用箭头指出。15μl偶联反应液和50μl 透析的偶联反应液加样到凝胶上。
第1道：蛋白质标准。2：透析的偶联反应液1。3：偶联反应1。4： 偶联反应2。5：偶联反应2。6：偶联反应1。7：透析的偶联反应液1。 8：蛋白质标准。9：偶联反应2。10：偶联反应1。11：透析的偶联反应 液1。12：蛋白质标准。
实施例21
抗独特型IgE mimobody VAE051与Qβ的偶联、
小鼠的免疫和抗血清的检测
4.0mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶 液与10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO中的100mM 贮存液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。VAE051溶液(2.4mg/ml) 在25℃下用等摩尔浓度的TCEP还原60分钟。
46μl透析的Qβ反应混合液与340μl TCEP处理的VAE05l溶液(2.4 mg/ml)在总体积为680μl的50mM乙酸钠缓冲液中在16℃摇床上反应 2小时。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色。偶联反应中的另外两条带(在VAE或Qβ溶液中没有)代 表与Qβ偶联的VAE051的重链和轻链(图28A)。分别用重链和轻链特 异的抗体通过Western印迹证实这两条带的身分。
小鼠的免疫
利用截断值为300000Da的膜，Qβ-VAE051偶联溶液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析。在第0天和第14天给两只雌性Balb/c 小鼠腹膜内注射50μg Qβ-VAE051。将小鼠在第28天眼眶后放血，其血 清用IgE-和VAE051-特异的ELISA分析。
ELISA
ELISA板用浓度为0.8μg/ml的人IgE或10μg/ml的VAE051包被。 封闭ELISA板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记 的抗小鼠IgG抗体检测(图28B)。
两只小鼠都显示对VAE051以及人IgE的强反应性。同一小鼠的免 疫前血清不显示对VAE051和IgE的任何反应性(图28B)。这证实产生 了针对抗独特型IgE mimobody VAE051的抗体，该抗体也识别“亲本”分 子IgE。
实施例22
利用交联剂SMPH的DerpI肽与野生型Qβ衣壳蛋白
的高占用率偶联
化学合成Derp 1，2肽，为便于偶联，该肽在N端添加一个半胱氨酸， 其具有下列序列：H2N-CQIYPPNANKIREALAQTHSA-COOH。该肽用 来与野生型Qβ衣壳蛋白化学偶联，如下所述。
D.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
浓度为2mg/ml的Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中 的溶液与5倍或20倍过量的交联剂SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析2次各2小时。透析的反应混合液与5倍过量的Derp 1，2肽在25℃ 摇床上反应2小时。
偶联反应的结果如图24所示。分别对应于每个亚单位1、2、3条肽 的偶联带在凝胶上清晰可见，如箭头所指。平均每个亚单位两条肽在衣 壳上展示。
加载到图24的凝胶上的样品如下：
第1道：蛋白质标准。2：用5倍过量的SMPH衍生的Qβ衣壳蛋白。 3：用20倍过量的SMPH衍生的Qβ衣壳蛋白。4： 5倍衍生的Qβ衣壳 蛋白的偶联反应。5： 20倍衍生的Qβ衣壳蛋白的偶联反应。
实施例23
含赖氨酸残基的肽向HBcAg(1-149)c/e1表位中的插入
HBcAg的c/e1表位(残基72-88)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg) 表面的顶端区中。该区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)被遗传工程 置换为肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys构建体)。引入的赖氨酸残 基在其侧链上含有一个反应性氨基，能用于HBcAg颗粒与含有游离半 胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
具有SEQ ID NO：158所示氨基酸序列的HBcAg-LysDNA通过PCR 产生：编码HBcAg片段(氨基酸残基1-78和81-149)的两个片段分别 通过PCR扩增。这些PCR中使用的引物也引入编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly 肽的DNA序列。HBcAg(1-78)片段利用引物EcoRIHBcAg(s)和 Lys-HBcAg(as)从pEco63中扩增。HBcAg(81-149)片段利用引物 Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63中扩增。引物 Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两种PCR产物的末端引入互补DNA 序列，使两种PCR产物在随后的装配PCR中融合。装配的片段利用引 物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)通过PCR扩增。
对于PCR反应，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng模板 DNA。两种反应的温度循环如下进行：94℃ 2分钟；94℃(1分钟)、50℃ (1分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
引物序列：
EcoRIHBcAg(s)： (5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO：79)；
Lys-HBcAg(as)： (5’- CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAG GTAGC-3’)(SEQ ID NO：80)；
Lys-HBcAg(s)： (5’- GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT GTC-3’)(SEQ ID NO：81)；
HBcAg(1-149)Hind(as)： (5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ ID NO：82).
为了通过PCR融合两种PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1 mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol引物 EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，含100ng两种纯化的PCR片 段。PCR循环条件为：94℃ 2分钟；94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、 72℃(2分钟)30个循环。装配的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析， 纯化，并在含EcoRI和HindIII限制性内切酶的适当缓冲液中消化19小 时。消化的DNA片段连接到EcoRI-HindIII消化的pKK载体中，产生 pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制性酶切和插入片段 的DNA测序分析PCR产物向载体中的插入。
实施例24
HBcAg-Lys的表达与部分纯化
用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌XL-1blue株。将1ml细菌过夜培 养液接种于含100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基。该培养物在 37℃下培养4小时，直到600nm下的OD值达到约0.8。添加IPTG至1 mM终浓度诱导HBcAg-Lys的合成。诱导后，细菌在37℃下继续振摇 16小时。以5000×g离心15分钟收集细菌。沉淀冻存于-20℃。融解沉 淀，重悬浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细 菌裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，pH7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20， 10mM EDTA，10mM DTT)中。细胞在室温下孵育30分钟，用弗氏压 碎器破碎。向裂解液中添加Triton X-100至终浓度为0.2％，裂解液在偶 尔振荡的条件下在冰上孵育30分钟。IPTG诱导携带pKK-HBcAg-Lys 表达质粒或一种对照质粒的大肠杆菌细胞表达HBcAg-Lys。在添加IPTG 前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒和携带对照质粒的细菌培养液中采样。 添加IPTG后16小时，再从含有pKK-HBcAg-Lys的培养液和对照培养 液中采样。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色监测蛋白质的表达。
然后为了除去不可溶的细胞碎片，以12000×g离心裂解液30分钟。 应用抗HBcAg的单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical and Scientifc Corp.，Westbury，NY，USA)通过Western印迹分析上清液和沉 淀，显示有相当量的HBcAg-Lys蛋白是可溶的。简言之，以14000×g 离心表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和对照细胞的裂解液30分钟。分 离上清液(＝可溶性部分)和沉淀(＝不可溶部分)，并用SDS样品缓冲 液等体积稀释。通过SDS-PAGE及之后利用抗-HBcAg单克隆抗体YVS 1841的Western印迹分析样品。
使用由覆盖3ml 15％蔗糖溶液的4ml 65％蔗糖溶液组成的蔗糖分级 梯度液，随后加入4ml细菌裂解液，对澄清的细胞裂解液进行分步梯度 离心。样品在4℃下以100000×g离心3小时。离心后，从梯度液顶部采 集1ml级分，通过SDS-PAGE考马斯蓝染色分析。HBcAg-Lys蛋白通 过考马斯蓝染色检测。
HBcAg-Lys蛋白在15％与65％蔗糖间的界面处富集，表明已经形成 衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质保留在不含蔗糖的梯度上层，因此分级梯 度离心HBcAg-Lys颗粒导致颗粒的富集和部分纯化。
实施例25
利用异双功能交联剂SPDP，FLAG肽与HBcAg-Lys的化学偶联
为了引发针对FLAG肽的免疫应答，将氨基端含有一个半胱氨酸残 基的合成FLAG肽(氨基酸序列CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO：147)) 与纯化的HBcAg-Lys颗粒进行化学偶联。600ml 95％纯度的HBcAg-Lys 颗粒溶液(2mg/ml)在室温下与异双功能交联剂3-(2-吡啶二硫)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(0.5mM)孵育30分钟。反应完成后，混合 液用1升含有150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析过夜， 以除去游离的SPDP。为了防止金属催化的巯基氧化，在10mM EDTA 存在下，500ml衍生的HBcAg-Lys衣壳(2mg/ml)与0.1mM FLAG肽 (含有一个氨基端半胱氨酸)混合。由于SPDP与肽的游离半胱氨酸反 应后释放吡啶-2-硫酮，故根据溶液在343nm下光密度的提高监测反应。 衍生的Lys残基与肽的反应约30分钟后完成。
给小鼠注射FLAG修饰的颗粒。
实施例26
pMPSV-gp140cys的构建
利用寡核苷酸gp140CysEcoRI和SalIgp140由pCytTSgp140FOS通 过PCR扩增gp140基因。对于PCR，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸 和50ng模板DNA。两种反应的温度循环如下进行：94℃2分钟；94℃ (0.5分钟)、55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
PCR产物用QiaEXII试剂盒纯化，用SalI/EcoRI消化，连接到用相 同酶酶切的载体pMPSVHE中。
寡核苷酸序列：
gp140CysEcoRI： 5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ ID NO： 83)
SalIgp 140： 5’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO：84)。
实施例27
pMPSVgp140cys的表达
通过限制性内切酶消化使pMPSVgp140cys(20μg)线性化。通过 苯酚/氯仿抽提终止反应，随后异丙醇沉淀线性化的DNA。限制性内切 酶消化通过琼脂糖凝胶电泳评价。对于转染，5.4μg线性化 pMPSVgp140cys与0.6μg线性化pSV2Neo在30μl H2O中混合，然后添 加30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)后，振荡溶液5秒钟，随后在室温下 孵育25秒。立即将溶液加到2ml含2％FCS的HP-1培养基(2％FCS 培养基)中。然后将生长至80％汇合度的BHK21细胞的培养基(6孔板) 更换为含DNA的培养基。在CO2孵箱中37℃孵育5小时后，除去含 DNA的培养基，更换为2ml含15％甘油的2％FCS培养基。孵育30秒 后除去含甘油培养基，用5ml含10％FCS的HP-1培养基漂洗细胞。最 后加入2ml含10％FCS的新鲜HP-1培养基。
筛选稳定转染的细胞，在37℃ CO2孵箱中在选择培养基(加入G418 的HP-1培养基)中生长。当混合群体生长至汇合时，将培养液分到两 个平皿上，然后在37℃下生长12小时。将一个细胞平皿转移到30℃下， 诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一个平皿保持于37℃。
可溶性GP140-Cys的表达通过Western印迹分析确定。用甲醇/氯仿 沉淀培养基(0.5ml)，将沉淀重悬浮于SDS-PAGE加样缓冲液中。将样 品在95℃下加热5分钟，之后加样到15％丙烯酰胺凝胶上。如Bass和 Yang在Creighton，T.E.编著的《蛋白质功能：实用方法》第二版，IRL Press， Oxford(1997)，29-55页中所述，在SDS-PAGE后，将蛋白质转移到Protan 硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，德国)。膜用溶解于TBS(每升 10×TBS：87.7g NaCl，66.1g盐酸Trizma(Sigma)和9.7g Trizma碱 (Sigma)，pH7.4)的1％牛白蛋白(Sigma)在室温下封闭1小时，然 后与抗-GP140或GP-160抗体孵育1小时。印迹用TBS-T(含0.05％ Tween20的TBS)洗涤3次各10分钟，与碱性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人 IgG偶联物孵育1小时。用TBS-T洗涤2次各10分钟并用TBS洗涤2 次各10分钟后，用碱性磷酸酶检测试剂(10ml AP缓冲液(100mM Tris/HCl，100mM NaCl，pH9.5))与50μl NBT溶液(溶于70％二甲基甲 酰胺的7.7％硝基蓝四唑(Sigma))和37μl X-磷酸溶液(溶于二甲基甲 酰胺的5％5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)进行显色反应。
实施例28
gp140Cys的纯化
将抗-gp120抗体与NHS/EDC激活的葡聚糖共价偶联，并填充层析 柱。将含GP140Cys的上清液加载上柱，充分洗涤后，用0.1M HCl洗 脱GP140Cys。收集过程中在收集管内用1M Tris pH7.2直接中和洗脱液。
在纯化过程中可能形成二硫键，因此用溶于10mM Tris pH7.5的10 mM DTT在25℃下处理收集的样品2小时。
随后用10mM Mes；80mM NaCl pH6.0透析除去DTT。最后如实施 例16所述，GP140Cys与在E2中含有JUN残基的甲病毒颗粒混合。
实施例29
PLA2-Cys的构建
利用寡核苷酸EcoRIPLA和PLA-Cys-hind由pAV3PLAfos通过PCR 扩增PLA2基因。对于PCR，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs 和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng 模板DNA。反应的温度循环如下进行：94℃ 2分钟；94℃(0.5分钟)、 55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
PCR产物用QiaEXII试剂盒纯化，用EcoRI/HindIII消化，连接到相 同酶酶切的载体pAV3中。
寡核苷酸
EcoRIPLA： 5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO：85)
PLA-Cys-hind： 5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG’3’(SEQ ID NO： 86)。
实施例30
PLA2-Cys的表达与纯化
为了在细胞质中产生含Cys尾的蛋白质，用载体pAV3∷PLA和 pPLA-Cys转化大肠杆菌XL-1 Blue株。培养液在37℃振摇下在含氨苄 青霉素的富集培养基中孵育。在光密度(550nm)＝时，添加1mM IPTG， 继续孵育5小时。离心收集细胞，重悬浮于含DNAse、RNAse和溶菌酶 的适当缓冲液(例如，Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl)中，通过弗氏压 碎器破碎。离心(Sorvall RC-5C，SS34转子，1500rpm，10min，4℃)后， 沉淀在4℃下重悬浮于25ml包涵体洗涤缓冲液(20mM tris-HCl，23％蔗 糖，0.5％Triton X-100，1mM EDTA，pH8)中，如上所述再次离心。重复 这-步骤直到离心后上清液基本澄清。包涵体在室温下重悬浮于20ml 溶解缓冲液(5.5M盐酸胍，25mM tris-HCl，pH7.5)中，离心除去不可 溶物质，然后使上清液通过无菌滤器(0.45μm)。该蛋白质溶液在10mM EDTA和100mM DTT存在下在4℃下至少保持静置10小时，然后用10 倍体积的5.5M盐酸胍，25mM tris-HCl，10mM EDTA，pH6透析3次。 该溶液用含有适当氧化还原复性剂(shuffle)(氧化的谷胱甘肽/还原的 谷胱甘肽；胱氨酸/半胱氨酸)的5L 2M尿素，4mM EDTA，0.1M NH4Cl， 20mM硼酸钠(pH8.3)透析2次。对重折叠的蛋白质进行离子交换层 析。蛋白质在含2-10mM DTT、pH高于7的适当缓冲液中保存，使半 胱氨酸残基保持还原状态。在蛋白质与甲病毒颗粒偶联之前，使蛋白质 溶液通过Sephadex G-25凝胶过滤柱除去DTT。
实施例31
不含游离半胱氨酸残基而含有一个插入的赖氨酸残
基的HBcAg的构建
在对应于SEQ ID NO：134的48和107位点处不含半胱氨酸残基， 而含有一个插入的赖氨酸残基的肝炎核心抗原(HBcAg)，在此称为 HBcAg-lys-2cys-Mut，用下列方法构建。
首先用下列PCR引物组合分别扩增如实施例23所述制备的 HBcAg-Lys基因的三个片段，引入两个突变。PCR方法基本如实施例1 所述，用常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
简言之，用下列引物制备片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s) CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO：148)
引物2：48as GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQ ID NO： 149)
用下列引物制备片段2：
引物3：48s GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQ ID NO：150)
引物4：107as CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO：151)
用下列引物制备片段3：
引物5：HBcAg149hind-as CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG (SEQ ID NO：152)
引物6：107s GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO：153)。
然后将片段1和2利用引物EcoRIHBcAg(s)和107as通过PCR结合， 产生片段4。片段4和片段3利用引物EcoRIHBcAg(s)和 EcoRIHBcAghind-as通过PCR结合，产生全长基因。然后用EcoRI (GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全长基因，克隆到在相同限 制性酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例32
封闭HBcAg的游离半胱氨酸残基然后交联
如上实施例23所述制备的HBcAg-Lys的游离半胱氨酸残基用碘乙 酰胺封闭。然后用异双功能交联剂m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰 亚胺酯(Sulfo-MBS)将封闭的HBcAg-Lys与FLAG肽交联。
封闭游离半胱氨酸残基及交联HBcAg-Lys的方法如下。在1ml的总 体积中，HBcAg-Lys(550μg/ml)与在磷酸缓冲液(PBS)(50mM磷酸 钠，150mM氯化钠，pH7.2)中浓度为50mM的碘乙酰胺(Fluka Chemie， Brugg，瑞士)在室温下反应15分钟。这样修饰的HBcAg-Lys立即与浓 度为330μM的Sulfo-MBS(Pierce)直接在步骤1的反应混合液中在室 温下反应1小时。然后在冰上冷却反应混合液，用1000倍体积的PBS pH 7.2透析。透析的反应混合液最后与300μM FLAG肽(CGGDYKDDDDK (SEQ ID NO：147)，为了与活化的HBcAg-Lys偶联，该FLAG肽含有 一个N端游离半胱氨酸)反应，并且加样到SDS-PAGE上进行分析。
在SDS-PAGE凝胶上获得的条带模式显示有另一条清晰的条带，它 的迁移慢于交联剂衍生化、但是没有与FLAG肽反应的对照HBcAg-Lys。 不用碘乙酰胺预先封闭半胱氨酸，在相同条件下反应，HBcAg-Lys单体 完全交联形成较高分子量的分子。
实施例33
大肠杆菌1型菌毛的分离以及利用异双功能交联剂
与FLAGE肽的化学偶联
A.前言
细菌菌毛或伞毛是多种细菌产生的丝状表面细胞器。这些细胞器介 导细菌与宿主细胞表面受体的附着，是发生多种细菌感染(如膀胱炎、 肾盂肾炎、新生儿脑膜炎和腹泻)所需的。
根据受体特异性(来自不同种的血细胞的凝集)、装配途径(胞外核 化、一般分泌、伴侣蛋白/导引蛋白(usher)、备选伴侣蛋白)和形态学特 征(刚性粗菌毛；柔性细菌毛；非典型结构，包括囊；卷曲毛；等等)， 菌毛可分为不同类别。通过所谓的伴侣蛋白/导引蛋白途径装配并介导与 宿主糖蛋白的粘附、形成右手螺旋的刚性粗菌毛的例子包括1型菌毛、 P-菌毛、S-菌毛、F1C-菌毛和987P-菌毛。这类菌毛中最突出并且最具特 征的成员是P-菌毛和1型菌毛(关于粘附结构、装配和相关疾病的综述 见Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999)；Bullitt & Makowski，Biophys.J.74：623-632(1998)；Hung，D.L. & Hultgren，S.J.， J.Struct.Biol.124：201-220(1998))。
1型菌毛是大肠杆菌表面上的长丝状多聚蛋白结构。它们具有粘附 特性，能与特定宿主组织表面上存在的含甘露糖受体结合。全部大肠杆 菌分离株中的70-80％能表达1型菌毛，一个大肠杆菌细胞能携带最高达 500根菌毛。1型菌毛的长度一般达到0.2-2μM，平均数量为1000个蛋 白质亚单位，这些亚单位结合为右手螺旋，每圈3.125个亚单位，直径 6-7nm，中心孔为2.0-2.5nm。
1型菌毛的主要成分FimA占总菌毛蛋白质的98％，是一种15.8kDa 的蛋白质。次要的菌毛成分FimF、FimG和FimH在顶端以固定距离沿 菌毛轴掺入(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”，《菌毛》， Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。FimH是一种29.1kDa 的蛋白质，显示是1型菌毛的甘露糖结合粘附素(Krogfelt，K.A.等人， Infect.Immun.58：1995-1998(1990)；Klemm，P.等人，Mol.Microbiol.4： 553-560(1990)；Hanson，M.S.& Brinton，C.C.J.，Nature 17：265-268 (1988))，FimG和FimH可能有利于它的掺入(Klemm，P.& Christiansen， G.，Mol.Gen.Genetics 208：439-445(1987)；Russell，P.W.& Orndorff，P.E.， J.Bacteriol.174：5923-5935(1992))。最近表明，FimH可能也在菌毛末 端形成一种尖细的纤毛(Jones，C.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92： 2081-2085(1995))。不同成熟菌毛的主要和次要成分的顺序极其相似， 表明高度有序的装配过程(Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181： 1059-1071(1999))。
大肠杆菌的P-菌毛具有极其相似的结构，直径为6.8nm，轴孔为1.5 nm，每圈3.28个亚单位(Bullitt & Makowski，Biophys.J.74：623-632 (1998))。16.6kDa的PapA是这种菌毛的主要成分，显示与FimA有 36％的序列同一性和59％的相似性(见表1)。如1型菌毛中那样，36.0kDa P-菌毛粘附素PapG和特化的衔接蛋白只占总菌毛蛋白的极小部分。与1 型菌毛最明显的不同是粘附素不作为菌毛杆的组成部分，以及它只位于 端部菌毛中，后者通过1型菌毛没有的特化衔接蛋白与菌毛杆连接 (Hultgren，S.J.等人，Cell 73：887-901(1993))。
表1：1型菌毛和P-菌毛的几种结构菌毛蛋白之间的相似性和同一性 (百分数)。忽略粘附素。
相似性
FimA PapA FimI FimF FimG PapE PapK PapH PapF
FimA 59 57 56 44 50 44 46 46
PapA 36 49 48 41 45 49 49 47
FimI 35 31 56 46 40 47 48 48
同 FimF 34 26 30 40 47 43 49 48
一 FimG 28 28 28 26 39 39 41 45
性 PapE 25 23 18 28 22 43 47 54
PapK 24 29 25 28 22 18 49 53
PapH 22 26 22 22 23 24 23 41
PapF 18 22 22 24 28 27 26 21
1型菌毛是非常稳定的异型寡聚复合物。SDS处理和蛋白酶消化、 煮沸或添加变性剂都不能使1型菌毛分离成单个的蛋白质成分。最初发 现不同方法的组合，如在100℃和pH1.8下孵育，可以解聚并分离成分 (Eshdat，Y.等人，J.Bacteriol.148：308-314(1981)；Brinton，C.C.J.，Trans， N.Y.Acad.Sci.27：1003-1054(1965)；Hanson，A.S.等人，J.Bacteriol.，170： 3350-3358(1988)；Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛” 《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。有趣的是， 1型菌毛在机械搅拌后显示在FimH掺入位点处断裂的倾向，产生在其 顶端呈现FimH粘附素的片段。这可以解释为细菌在机械应力下将菌毛 剪短为有效长度的一种机制(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1 型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。尽 管它们特别稳定，但在50％甘油存在下，1型菌毛还是部分解开；它们 丧失螺旋结构，形成一种延长的、柔性的、2nm宽的蛋白质链(Abraham， S.N.等人，J.Bacteriol.174：5145-5148(1992))。
P-菌毛和1型菌毛由大约10kb的大肠杆菌染色体上的单基因簇编码 (Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P. 编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26；Omdorff，P.E.& Falkow，S.，J. Bacteriol.160：61-66(1984))。在1型菌毛基因簇中总共发现了9个基 因，在P-菌毛簇中发现了11个基因(Hultgren，S.J.等人，Adv.Prot.Chem. 44：99-123(1993))。这两种簇的构成非常相似。
前两个fim基因-fimB和fimE，编码参与调节菌毛表达的重组酶 (McClain，M.S.等人，J.Bacteriol.173：5308-5314(1991))。主要结构 菌毛蛋白由该簇的下一个基因fimA编码(Klemm，P.，Euro.J.Biochem. 143：395-400(1984)；Orndorff，P.E.& Falkow，S.，J.Bacteriol.160：61-66 (1984)；Orndorff，P.E.& Falkow，S.，J.Bacteriol.162：454-457(1985))。 fimI的确切作用还不清楚。曾经报告它也掺入菌毛中(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。相邻的fimC不编码成熟菌毛的结构成分，而是 编码菌毛装配必需的所谓的菌毛伴侣蛋白(Klemm，P.，Res.Microbiol. 143：831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90： 8397-8401(1993))。
成熟菌毛锚定的细菌外膜中的装配平台由fimD编码(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990))。1型菌毛的 三种次要成分——FimF、FimG和FimH，由该簇的最后三种基因编码 (Klemm，P.& Christiansen，G，Mol.Gen.Genetics 208：439-445(1987))。 除了fimB和fimE之外，所有基因都编码通过分泌途径分泌到周质中的 前体蛋白。
在伴侣蛋白/导引蛋白途径后不同菌毛之间的相似性不限于它们的 形态学特征。它们的基因也以极其相似的方式排列。编码主要结构亚单 位的基因通常位于基因簇的开始处调节元件的直接下游，其后为编码另 一种结构亚单位的基因(对于1型菌毛为fimI，对于P-菌毛为papH)。 PapH显示能够终止菌毛装配，而推断FimI也能够如此(Hultgren，S.J. 等人，Cell 73：887-901(1993))。指导菌毛形成过程的两种蛋白质，即 特化的菌毛伴侣蛋白和外膜装配平台，相邻地位于下游。在基因簇的末 端编码数量不定的次要菌毛成分，包括粘附素。形态学结构、序列(见 表1)、基因组织和调节的相似性表明这些细胞器有一种紧密的进化关系 和相似的装配过程。
产生1型菌毛的细菌显示所谓的相变异。细菌完全有菌毛或者无菌 毛。这通过含有fimA启动子的314bp基因组DNA片段的颠倒实现， 从而诱导菌毛基因的“全开”或“全关”表达(McClain，M.S.等人，J. Bacteriol.173：5308-5314(1991))。其它结构菌毛基因的表达与fimA 表达的偶联通过一种仍然未知的机制实现。然而，大量研究阐明了影响 这两种表型转换的机制。
1型菌毛基因簇的前两种基因fimB和fimE编码可识别二重对称的9 bp DNA片段的重组酶，其侧翼为可颠倒的fimA启动子。FimB切换菌 毛形成“开”，而FimE以“关”的方向打开启动子。因此fimB或fimE表 达的正调节或负调节控制所谓的“fim-开关”位置(McClain，M.S.等人，J. Bacteriol.173：5308-5314(1991)；Blomfield，I.C.等人，J.Bacteriol.173： 5298-5307(1991))。
两种调节蛋白fimB和fimE由不同的启动子转录，它们的转录受多 种不同因子的影响，包括整合宿主因子(IHF)(Blomfield，I.C.等人， Mol.Microbiol.23：705-717(1997))和亮氨酸反应性调节蛋白(LRP) (Blomfield，I.C.等人，J.Bacteriol.175：27-36(1993)；Gally，D.L.等人， J.Bacteriol.175：6186-6193(1993)；Gally，D.L.等人，Microbiol.21： 725-738(1996)；Roesch，R.L.& Blomfield，I.C.，Mol.Microbiol.27： 751-761(1998))。前者的突变使细菌锁定为“开”或“关”状态，而LRP 突变体转换的频率降低。另外也显示了leuX对菌毛生物发生的影响。该 基因位于染色体上的fim基因附近，编码UUG密码子的次要亮氨酸 tRNA(minor leucine tRNA)。fimB含有5个UUG密码子，而fimE只 含两个，leuX转录增强将更有利于FimB表达而不是FimE表达(Burghoff， R.L.等人，Infect.Immun.61：1293-1300(1993)；Newman，J.V.等人，FEMS Microbiol.Lett.122：281-287(1994)；Ritter，A.等人，Mol.Microbiol.25： 871-882(1997))。
此外，温度、培养基组成和其它环境因素也能影响FimB和FimE的 活性。最后，曾经报告了fimA启动子的自发、统计学上的转换。这种 自发转换的频率约为每一代10-3(Eisenstein，B.I.，Science 214：337-339 (1981)；Abraham，S.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 82：5724-5727 (1985))，但受上述因素的强烈影响。
基因fimI和fimC也从fimA启动子开始转录，但在fimA直接下游 鉴定了一个DNA片段，它具有形成二级结构的强烈倾向，可能是一种 部分转录终止子(Klemm，P.，Euro.J.Biochem.143：395-400(1984))； 因此推测它严重减少fimI和fimC的转录。在fimC的3’端，有另一种启 动子控制fimD转录；在fimD的3’端有一种最新知道的fim启动子，它 调节FimF、FimG和FimH的水平。因此，所有次要1型菌毛蛋白都转 录为一种mRNA(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌 毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。这确保mRNA 水平上的1∶1∶1化学计量，这很可能在蛋白质水平上保持。
对于P-菌毛，当测定不同P-菌毛基因的mRNA的半衰期时，我们发 现了另外的调节机制。papA的mRNA非常长寿，而papB(一种调节菌 毛蛋白)的mRNA由短寿的mRNA编码(Naurec kiene，S.& Uhlin，B.E.， Mol.Microbiol.21：55-68(1996)；Nilsson，P.等人，J.Bacteriol.178： 683-690(1996))。
对于1型菌毛，1型菌毛伴侣蛋白FimC的基因开始于GTG而不是 ATG密码子，导致翻译效率下降。最后，对fimH基因的分析显示fimH mRNA具有形成茎-环的倾向，这可能严重阻碍翻译。总之，细菌菌毛的 生物发生由作用于蛋白质生物合成所有水平的多种不同机制调节。
周质菌毛蛋白通常合成为前体，含有一个N端信号序列，它允许利 用分泌装置通过内膜转运。转运后，前体通常被信号肽酶I切割。1型 菌毛结构亚单位通常含有二硫键，它们的形成由DsbA催化并且可能由 DsbC和DsbG基因产物催化。
1型菌毛伴侣蛋白FimC缺乏半胱氨酸残基。相反，P-菌毛的伴侣蛋 白PapD是菌毛伴侣蛋白家族的唯一含有二硫键的成员，P-菌毛对DsbA 的依赖性已经确定(Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：11552-11556(1994))。PapD在ΔdsbA株的周质中不积累，表明缺 乏伴侣蛋白导致P-菌毛装配机制受阻碍(Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc. Nat.Acad.Sci.USA 91：11552-11556(1994))。这与以下发现一致：1 型菌毛在ΔdsbA株中仍然装配，但水平降低(Hultgren，S.J.等人，“细菌 粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press， (1996)pp.2730-2756)。
1型菌毛以及P-菌毛98％由分别被称为FimA和PapA的单一或主要 的结构亚单位组成。这两种蛋白质的大小均为～15.5kDa。两种菌毛基因 簇编码的其它次要成分非常相似(见表1)。除粘附素外其它亚单位的序 列和大小的相似性提示它们全都共有相同的折叠基序，只是彼此间的亲 和力不同。特别是这些蛋白质的N端和C端区非常保守，推测在菌毛内 的伴侣蛋白/亚单位相互作用以及亚单位/亚单位相互作用中起重要作用 (Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999))。有趣 的是，在菌毛粘附素的中间能发现保守N端片段，表明粘附素有两个结 构功能域，其中由保守基序开始的C端功能域相当于结构菌毛亚单位， 而N端域负责宿主细胞受体的识别(Hultgren，S.J.等人，Proc.Nat.Acad. Sci.USA 86：4357-4361(1989)；Haslam，D.B.等人，Mol.Microbiol.14： 399-409(1994)；Soto，G.E.等人，EMBO J.17：6155-6167(1998))。不 同亚单位也显示影响菌毛的形态学特征。据报告，去除几种基因可减少 1型或P-菌毛的数量或增加它们的长度(fimH，papG，papK，fimF，fimG) (Russell，P.W.& Orndorff，P.E.，J.Bacteriol.174：5923-5935(1992)； Jacob-Dubuisson，R.等人，EMBO J.12：837-847(1993)；Soto，G.E. & Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999))；基因缺失组合扩大 了这种影响，或者导致完全不能形成菌毛(Jacob-Dubuisson，R.等人， EMBO J.12：837-847(1993))。
在也是通过伴侣蛋白/导引蛋白系统装配的非菌毛粘附细胞细胞器 如Myf菌毛和CS3菌毛中，保守的C端区不同。这间接证明了这些C 端亚单位片段对于四级结构相互作用的重要性(Hultgren，S.J.等人，“细 菌粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)。
基因缺失研究证实，除去菌毛伴侣蛋白导致P-菌毛和1型菌毛完全 不能形成(Lindberg，F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058(1989)；Klemm， P.，Res.Microbiol.143：831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.Acad Sci.USA 90：8397-8401(1993))。ΔfimC株的周质提取物显示主要亚单 位FimA聚集，但无法检测到菌毛(Klemm，P.，Res.Microbiol.143： 831-838(1992))。过量表达单一P-菌毛亚单位的尝试失败，在不含PapD 时只能检测到蛋白水解的形式；另外，在不含伴侣蛋白的情况下从内膜 级分纯化了P-菌毛粘附素(Lindberg，F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058 (1989))。然而，对于FimC/FimH复合物以及不同Pap-蛋白-包括粘附 素PapG和主要亚单位PapA，结构菌毛蛋白及其伴侣蛋白的共表达使周 质中能检测到伴侣蛋白/亚单位复合物(Tewari，R.等人，J.Biol.Chem. 268：3009-3015(1993)；Lindberg.F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058 (1989))。也在体外研究了伴侣蛋白/亚单位复合物对其装配平台的亲和 力，发现非常不同(Dodson等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：3670-3674 (1993))。根据这些结果，提示菌毛伴侣蛋白具有下列功能。
假定它们能识别未折叠的菌毛亚单位，阻止它们凝集，提供指导形 成天然结构的“折叠模板”。
折叠亚单位在折叠后展示可允许亚单位/亚单位相互作用的表面，预 计它们受到保护而不会与其它亚单位相互作用，并保持单体、可装配的 状态。
最后，推测菌毛伴侣蛋白在外膜装配部位触发亚单位的释放，通过 以不同效率触发，影响成熟菌毛的组成和顺序(参见以下单独的部分)。
在外膜上释放亚单位后，伴侣蛋白是游离状态，以便参与另一轮底 物结合、帮助折叠、亚单位通过周质转运以及向装配部位特异输送。由 于周质缺乏能量来源，如ATP，整个菌毛装配过程必须要热力学驱动 (Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 91：11552-11556 (1994))。菌毛伴侣蛋白的多种不同功能涉及极精细调节的级联步骤。
然而，有几项发现不易用上述菌毛伴侣蛋白功能模型解释。一个例 子是多聚伴侣蛋白/亚单位复合物的存在(Striker，R.T.等人，J.Biol.Chem. 269：12233-12239(1994))，其中一个伴侣蛋白与亚单位二聚体或三聚 体结合。难以想象一种折叠模板能被“双重利用”。关于伴侣蛋白/亚单位 相互作用的分子细节的研究(见下文)部分支持上述功能，但也出现了 新的问题。
迄今为止，通过遗传研究或序列分析鉴定的所有31种周质伴侣蛋白 都是约25kDa的蛋白质，具有10左右的极高pI值。这些伴侣蛋白中的 10种帮助杆状菌毛的装配，4种参与细菌毛的形成，10种对于非典型细 结构(包括荚膜样结构)的生物发生非常重要，2种粘附结构迄今为止 尚未确定(Holmgren，A.等人，EMBO J.11：1617-1622(1992)；Bonci，A. 等人，J.Mol.Evolution 44：299-309(1997)；Smyth，C.J.等人，FEMS Immun.Med.Microbiol.16：127-139(1996)；Hung，D.L.& Hultgren，S.J.， J.Struct.Biol.124：201-220(1998))。这些伴侣蛋白和PapD之间的逐 对序列同一性为25-56％，表明总体折叠相同(Hung，D.L.等人，EMBO J. 15：3792-3805(1996))。
关于伴侣蛋白/底物识别的第一项研究是基于所有已知菌毛伴侣蛋 白的C端都极其相似这一发现。ELISA测定显示，对应于P-菌毛蛋白C 端的合成肽结合PapD(Kuehn，M.J.等人，Science 262：1234-1241(1993))。 最重要的是，解析了两种复合物的X-射线结构，其中PapD与对应于粘 附素PapG或次要菌毛成分PapK的C端的19个残基的肽共结晶(Kuehn， M.J.等人，Science 262：1234-1241(1993)；Soto，G.E.等人，EMBO J.17： 6155-6167(1998))。这两种肽在伸展构象中都与伴侣蛋白N端功能域 中朝向域间隙的β链结合，从而用另外一条链使β折叠延长。肽的C端羧 酸基团通过氢键锚定于Arg8和Lys112上，这两个残基在菌毛伴侣蛋白 家族中恒定。诱变研究证实了它们的重要性，因为它们与丙氨酸的交换 导致无功能菌毛伴侣蛋白在周质中的聚积(Slonim，L.N.等人，EMBO J. 11：4747-4756(1992))。PapD的晶体结构表明，Arg8或Lys112都与伴 侣蛋白的稳定无关，但是完全暴露于溶剂(Holmgren，A.& Branden，C.I.， Nature 342：248-251(1989))。据报告，在底物上的C端PapA残基的 交换阻止P-菌毛形成，对P-菌毛粘附素PapG的保守C端片段的类似实 验阻止它掺入P-菌毛中(Hultgren，S.J.等人，“细菌粘附及其装配”，《大 肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996) pp.2730-2756)。因此，所有证据都表明菌毛亚单位的识别是通过亚单位 的C端片段。
最近关于P-菌毛粘附素PapG的C端氨基酸交换的一项研究给出了 更详细的信息。在相对于C端的位点-2、-3、-6、-8处的氨基酸置换均 是耐受的，但改变了菌毛稳定性(Soto，G.E.等人，EMBO J.17：6155-6167 (1998))。
但是，当更仔细地研究这一模型时，出现了一些问题。不装配为刚 性、杆状菌毛的粘附细菌结构缺乏保守的C端片段(Hultgren，S.J.等人， “细菌粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)，尽管它们也依赖于相关菌毛伴侣蛋白的存 在。这表明菌毛亚单位的C端片段具有不同的作用，即成熟菌毛中四级 结构相互作用的介导。而且，由于伴侣蛋白复合物中C端肽与伴侣蛋白 的结合很弱，通过NMR解析其结构的尝试严重受阻(Walse，B.等人， FEBS Lett.412：115-120(1997))；而C端片段对于伴侣蛋白识别的一 个主要贡献是相对较高的亲和作用。
如果考虑不同亚单位之间的变异性，又出现了另一个问题。虽然C 端片段保守，但是发现了多种保守置换。例如，在与PapD共结晶的两 种肽之间，19个氨基酸残基中的15个不同(Soto，G.E.等人，EMBO J.17： 6155-6167(1998))。这曾经用伴侣蛋白与底物之间的相互作用类型来解 释，主要通过主链相互作用发生，而不是通过侧链相互作用特异性发生。 而且，伴侣蛋白对某些底物的特异性不易解释。与前述相反，保守残基 已经被视为特异性的证据(Hultgren，S.J.等人，“细菌粘附及其装配”，《大 肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996) pp.2730-2756)。
外膜装配平台，在文献中也被称为“导引蛋白(usher)”，在1型和 P-菌毛中分别是由FimD或PapC的同型寡聚体形成的(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990)；Thanassi，D.G. 等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151(1998))。通过电子显微 镜术对1型菌毛延长的研究证实菌毛从底部延长(Lowe，M.A.等人，J. Bacteriol.169：157-163(1987))。与未折叠亚单位向周质间隙中的分泌 不同，完全折叠的蛋白质必须通过外膜转移，可能是以寡聚形式转移 (Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151(1998))。 这首先需要一个允许通过的足够宽的膜孔，其次需要一种热力学驱动的 转运机制(Jacob-Dubuisson，F.等人，J.Biol.Chem.269：12447-12455 (1994))。
已显示，单独的FimD表达不利于细菌生长，菌毛亚单位的共表达 能恢复细菌正常生长(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990))。据此推断，导引蛋白可能形成完全被菌毛填满 的孔。电子显微镜观察结合PapC的膜泡，证实存在一种内径为2nm的 成孔结构(Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151 (1998))。由于孔的内径太小，菌毛杆不能通过，提出在细菌表面外形 成成熟菌毛的螺旋排列。发现甘油使菌毛解散，然后形成一条约2nm 的蛋白质链，这一发现很好地符合该假说，因为在孔中可形成一条延长 的亚单位链作为第一步(Abraham，S.N.等人，J.Bacteriol.174：5145-5148 (1992)；Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151 (1998))。在细菌膜外形成的螺旋菌毛杆可能是使生长的菌毛通过膜转 移的驱动力。
也已经证实，1型和P-菌毛的导引蛋白形成以不同亲和力与伴侣蛋 白/亚单位复合物结合的三元复合物(Dodson，K.W.等人，Proc.Nat.Acad. Sci.USA 90：3670-3674(1993)；Saulino，E.T.等人，EMBO J.17：2177-2185 (1998))。这可解释为使菌毛蛋白在菌毛中具有确定顺序的“动力学分 配”。而且也提出，结构蛋白可能呈现一个只与另外一种菌毛蛋白相容的 结合表面；这将是在成熟菌毛中获得高度固定顺序亚单位的另一种机制 (Saulino，E.T.等人，EMBO J.17：2177-2185(1998))。
B.大肠杆菌1型菌毛的制备
将大肠杆菌W3110株涂布于LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，pH7.5，1％琼脂(w/v))平板上，在37℃下孵育过夜。 然后用单菌落接种5ml LB起始培养液(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提 取物，5g/L NaCl，pH7.5)。在有利于细菌产生1型菌毛的条件下(37℃， 不搅拌)孵育24小时后，5只含有1升LB的摇瓶各接种1ml初始培养 液。然后细菌培养液不加搅拌地在37℃下再孵育48-72小时。离心收集 细菌(5000rpm，4℃，10分钟)，得到的沉淀重悬浮于250ml 10mM Tris/HCl，pH7.5中。在普通混合器中以17000rpm搅拌5分钟从细菌上 分离菌毛。在4℃下以10000rpm离心10分钟后，收集含菌毛上清液， 添加1M MgCl2至终浓度为100mM。溶液在4℃下静置1小时，然后离 心沉淀(10000rpm，20分钟，4℃)菌毛。将沉淀重悬浮于10mM HEPES， pH7.5中，然后通过最后的离心步骤除去残余细胞碎片，澄清菌毛溶液。
C.利用m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯 (sulfo-MBS)FLAG与纯化的大肠杆菌1型菌毛的偶联
600μl 95％纯度的细菌1型菌毛溶液(2mg/ml)在室温下与异双功 能交联剂sulfo-MBS(0.5mM)孵育30分钟。随后，混合液用1升含 150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析过夜，除去游离的 sulfo-MBS。然后为了防止金属催化的巯基氧化，在10mM EDTA存在 下，将500μl衍生的菌毛(2mg/ml)与0.5mM FLAG肽(含有一个氨 基端半胱氨酸)混合。未偶联的肽通过排阻层析除去。
实施例34
用于表达大肠杆菌1型菌毛的表达质粒的构建
GenBank登录号U14003(其全部公开内容在此引用作为参考)中公 开的DNA序列含有产生1型菌毛所需的所有大肠杆菌基因，从核苷酸 233947到核苷酸240543(fim基因簇)。该部分序列含有基因fimA、fimI、 fimC、fimD、fimF、fimG和fimH的序列。为了扩增这部分大肠杆菌基 因组，如下所述进行三次不同的PCR，随后克隆入pUC19(GenBank登 录号L09137和X02514)。
PCR模板如下制备：将10ml大肠杆菌W3110株的甘油贮存液与90 ml水混合，95℃煮沸混合液10分钟，然后用台式离心机以14000rpm 离心10分钟，收集上清液。
10ml上清液与如下所述的50pmol PCR引物一和50pmol PCR引物 二混合。加入5ml 10×PCR缓冲液，0.5ml Taq-DNA-聚合酶和水，加 至总共50ml。所有PCR都按照下列方案进行：94℃ 2分钟，然后94℃ 20秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟30个循环。然后通过1％琼脂糖凝胶电 泳纯化PCR产物。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸233947到核苷酸235863 的序列，其中包括fimA、fimI和fimC基因： TAGATGATTACGCCAAGCTTATAATAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGC AGCATG(SEQ ID NO：196)和 GTCAAAGGCCTTGTCGACGTTATTCCATTACGCCCGTCATTTTGG(SEQ ID NO：197)
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和SalI将扩 增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMAIC(SEQ ID NO：198)。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸235654到核苷酸238666 的序列，其中包括fimD基因： AAGATCTTAAGCTAAGCTTGAATTCTCTGACGCTGATTAACC(SEQ ID NO：199)和 ACGTAAAGCATTTCTAGACCGCGGATAGTAATCGTGCTATC(SEQ ID NO：200)。
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和XbaI将 扩增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMD(SEQ ID NO：201)。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸238575到核苷酸240543 的序列，其中包括fimF、fimG和fimH基因： AATTACGTGAGCAAGCTTATGAGAAACAAACCTTTTTATC(SEQ ID NO： 202)和 GACTAAGGCCTTTCTAGATTATTGATAAACAAAAGTCACGC(SEQ ID NO：203)。
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和XbaI将 扩增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMFGH (SEQ ID NO：204)。
然后进行以下克隆程序，产生含有上述所有fim基因的质粒。
pFIMAIC用EcoRI和HindIII消化(2237-3982)，pFIMD用EcoRI 和SstII消化(2267-5276)，pFIMFGH用SstII和HindIII消化(2327-2231)。 然后将片段连接，产生的含有菌毛形成所需全部fim基因的质粒命名为 pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)。
实施例35
用于表达缺少粘附FimH的大肠杆菌
1型菌毛的表达质粒的构建
将质粒pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)用KpnI消化，之后经 0.7％琼脂糖凝胶电泳分离由核苷酸8895-8509组成的片段，并通过自身 连接环化。产生的质粒命名为pFIMAICDFG(SEQ ID NO：206)，它缺 少fimH基因，可用来产生不含FIMH的1型菌毛。
实施例36
利用质粒pFIMAICDFGH表达1型菌毛
大肠杆菌W3110株用pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)转化， 涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，pH7.5，1％琼脂(w/v))平板上，在37℃下孵育过夜。 然后用单菌落接种50ml LB-葡萄糖起始培养液(10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，1％(w/v)葡萄糖，5g/L NaCl，pH7.5，100mg/ml氨苄 青霉素)。在37℃下以150rpm孵育12-16小时后，含有2升LB-葡萄糖 的5升摇瓶接种20ml起始培养液。细菌培养液然后在37℃搅拌下(150 rpm)再孵育24小时。离心收集细菌(5000rpm，4℃，10分钟)，得到的 沉淀重悬浮于250ml 10mM Tris/HCl，pH8中。在普通混合器中以17000 rpm搅拌5分钟从细菌上分离菌毛。在4℃下以10000 rpm离心10分钟 后，收集含菌毛上清液，添加1M MgCl2至终浓度为100mM。溶液在4℃ 下静置1小时，然后离心沉淀(10000rpm，20分钟，4℃)沉淀出的菌 毛。将沉淀重悬浮于10mM HEPES，30mM EDTA，pH7.5中，室温下30 分钟，然后通过最后的离心步骤除去残余细胞碎片，澄清菌毛溶液。所 得制品然后用20mM HEPES，pH7.4透析。
实施例37
IgE表位和模拟位与大肠杆菌1型菌毛的偶联
将66μl等份100μM异双功能交联剂sulfa-MBS溶液加到400μl 95％纯度的细菌1型菌毛溶液(2.5mg/ml，20mM HEPES，ph7.4)中， 随后在搅拌下室温孵育45分钟。之后，利用PD-10柱通过大小排阻层 析除去过量的sulfa-MBS。此外，也可以通过透析除去交联剂。向1ml 等份衍生菌毛(1-1.25mg/ml，20mM HEPES pH7.4)中加入1.3μl含1.1 mg/ml肽Ce3epi(CGGVNLTWSRA SG(SEQ ID NO：207))或肽Ce3Mim (CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO：208))的溶液。样品在室温下孵 育4小时，用2L含20mM HEPES的缓冲液(pH7.4)透析2次除去未 偶联的肽。此外也可以通过大小排阻层析除去未偶联的肽。
实施例38
用与Qβ衣壳蛋白偶联的蜂毒磷酯酶A2
(PLA2)融合蛋白免疫小鼠
A.制备用于细胞质表达PLA2基因催化失活变体的替代载体，该变 体与氨基酸序列AAASGGCGG(SEQ ID NO：209)融合
利用寡核苷酸ecori_Ndel_pla(序列见下)和PLA-Cys-hind(实施例 29)由pAV3PLAfos通过PCR扩增实施例9的PLA2基因构建体。对于 PCR反应，在50μl含1.2单位Pfx DNA聚合酶(Gibco)、1mM MgSO4和200μM dNTPs和10倍稀释的Pfx增强溶液(Gibco)的反应混合液 中使用各100pmol引物和约1μg PAV3PLAfos DNA。反应的温度循环如 下进行：94℃ 2分钟，92℃(0.5分钟)、58℃(0.5分钟)、68℃(1分 钟)5个循环；92℃(0.5分钟)、63℃(0.5分钟)、68℃(1分钟)25 个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，随后用Qiagen Qiaquick 试剂盒分离该片段，用酶NdeI和HindIII消化，克隆入用相同酶消化的 PET11a载体(Novagen)。
寡核苷酸：ecori_Ndel_pla TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAACATATGGCTATCATCTACC(SEQ ID NO：214)
该载体编码具有下列氨基酸序列的融合蛋白： MAIIYPGTLWCGHGNKSSGPNELGRFKHTDACCRTQDMCPDVMSAG ESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTK CYKLEHPVTGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKYAAASGGCG G(SEQ ID NO：210)
PLA2融合蛋白与Qβ衣壳蛋白的偶联
600μl Qβ衣壳蛋白溶液(2mg/ml溶于20mM Hepes，pH7.4)与 176μl Sulfo-MBS(13mg/ml水溶液)在室温下反应60分钟，在4℃下 用1L 20mM Hepes pH7.4 O/N透析。次日，将500μl含0.1mM DTT 的PLA2溶液(2.5mg/ml)过5ml Hi-Trap柱(Pharmacia)脱盐。还原 并脱盐的PLA2(60μl约0.5mg/ml溶液)与活化并透析的Qβ衣壳(25 μl 1.5mg/ml溶液)混合，在室温下反应4小时。
在与PLA2偶联之前和之后采集的Qβ衣壳蛋白的电子显微镜图像 上，直径25-30nm的衣壳清晰可见。
C.用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2免疫小鼠
雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg与PLA2偶联的Qβ衣壳蛋白静脉 内免疫，在第14天用相同量的抗原加强。在第20天从小鼠取血，用ELISA 分析血清。获得1∶5000的抗PLA2滴度。
实施例39
IgE模拟位和表位与Qβ衣壳蛋白的偶联
利用N端半胱氨酸残基将具有下列氨基酸序列的人IgE表位与Qβ 衣壳蛋白偶联：
Ce3表位：CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO：207)
Ce3模拟位：CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO：208)
用Sulfo-MBS活化的Qβ衣壳蛋白进行偶联反应，随后透析除去过 量的交联剂。将表位或模拟位分别稀释到含活化Qβ衣壳的反应混合液 中，在室温下反应4小时。最后反应混合液用PBS透析4小时，注射给 小鼠。
下列环状模拟位也与Qβ衣壳蛋白偶联：
Ce4模拟位：GEFCINHRGYWVCGDPA(SEQ ID NO：211)。
为了向模拟位中引入一个受保护的巯基，模拟位首先与化学基团N- 琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸(SATA)反应。然后用羟胺处理以除去保 护基团，立即与活化的Qβ衣壳蛋白在室温下反应4小时。最后将反应 混合液透析4小时，注射给小鼠。
实施例40
用与M2肽偶联的HBcAg-Lys免疫小鼠
A.M2肽与HBcAg-Lys衣壳蛋白的偶联
为了引发抗M2肽的免疫应答，在C端含有一个半胱氨酸残基、对 应于流感M2蛋白N端片段的合成M2肽 (SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC(SEQ ID NO：212))与纯化 的HBcAg-Lys颗粒化学偶联。Sulfo-MBS(232μl，3mM)与1.4ml HBcAg-Lys在PBS中的溶液(1.6mg/ml)反应。混合液用磷酸缓冲液 (PBS)透析过夜。M2肽用DMSO稀释为24mg/ml的浓度；5μl该溶 液用300μl PBS稀释，取188μl加入312μl透析并活化的HBcAg-Lys 溶液中。向反应混合液中加入EDTA(10μl 1M溶液)，反应在室温下继 续4小时。
用与M2肽偶联的HBcAg-Lys免疫小鼠
雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg HBcAg-Lys-M2或单独的M2肽静 脉内免疫，10天后用相同量的抗原加强。再过10天，给小鼠鼻内感染 流感病毒(50pfu，PR/8)，监测感染小鼠的存活。另外，也测定肺中的 病毒滴度。用M2-HBcAg-Lys肽预处理的小鼠完全受到保护，至第7天 病毒被清除。
实施例41 M2肽与菌毛、Qβ和无半胱氨酸的HBcAg衣壳蛋白的偶联，用这些偶 联的菌毛和衣壳免疫小鼠获得的抗体效价与用M2肽与HBcAg1-183的
N端融合蛋白免疫小鼠获得的效价进行比较
A.M2肽与菌毛、Qβ和无半胱氨酸的HBcAg-衣壳蛋白的偶联
Qβ：将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液1ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室 温反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析过夜。然后透析的反应混合物与25mM M2肽(SEQ ID NO：212) 在DMSO中的贮存液58.8μl在摇床上室温反应4小时。反应混合液随 后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过夜。
无半胱氨酸的HBcAg：将0.8mg/ml无半胱氨酸的HBcAg衣壳蛋 白(实施例31)在PBS pH7.2中的溶液1.25ml与93μl 13nmg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应30分钟。反应溶液随后 用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过夜。透析的反应混合物 与25mM M2肽(SEQ ID NO：212)在DMSO中的贮存液58.8μl在摇 床上室温反应4小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析过夜。
菌毛：将2.5mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液400μl 与60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。 反应溶液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐，从柱上洗脱 的500μl蛋白质的第二级分(约含1g蛋白质)与25mM M2肽(SEQ ID NO：212)在DMSO中的贮存液58.8μl在摇床上室温反应4小时。反 应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过 夜。
M2肽与HBcAg1-183的基因融合
M2与Hbc基因融合：如Neirynck等人，Nature Medicine 5：1157 (1999)所述，在Hbc的N端克隆M2。MD-HBc在大肠杆菌中表达， 通过凝胶层析纯化。通过Edman测序证实在M2-HBc的N端含有M2 肽。
小鼠的免疫：
对雌性Balb/c小鼠接种不加佐剂的与菌毛、Qβ和无半胱氨酸HbcAg 蛋白偶联的M2肽和与Hbc免疫原基因融合的M2肽。在第0天和第14 天腹膜内注射35μg每种样品蛋白质。将小鼠在第27天放血，用M2肽 特异的ELISA分析血清。
ELISA
ELISA板用10μg/ml与RNAse偶联的M2肽包被。封闭平板，然 后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体 检测。也检测免疫前的血清作为对照。用与Hbc或其它载体交联的无关 肽免疫小鼠，对其血清进行的对照ELISA实验显示，检测到的抗体是 M2肽特异的。结果显示在图27A和B中。
实施例42
血管紧张肽I和血管紧张肽II与Qβ的偶联，
以及用Qβ-血管紧张肽疫苗免疫小鼠
A.血管紧张肽I和血管紧张肽II与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，如下所述与Qβ化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液5ml与507μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 透析两次各2小时。665ml透析的反应混合物与2.8ml各种相应的100 mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液 随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小 时。
小鼠的免疫：
雌性Balb/c小鼠不加佐剂接种与Qβ衣壳蛋白偶联的4种血管紧张 肽之一。每种样品50μg总蛋白质用PBS稀释为200ml，在第0天和第 14天皮下注射(腹部两侧100ml)。对小鼠在第21天放血，其血清用血 管紧张肽特异的ELISA分析。
ELISA
利用化学交联剂sulfo-SPDP将所有4种血管紧张肽分别与牛RNAse A偶联。ELISA板用浓度为10mg/ml的偶联RNAse制剂包被。封闭平 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。用与Qβ或其它载 体交联的无关肽免疫小鼠，对其血清进行的对照ELISA实验显示，检测 到的抗体是各自肽特异的。结果显示在图8A-8D中。
图8A、8B、8C、8D分别显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio I-IV 免疫的小鼠血清中“Angio I”、“Angio II”、“Angio III”和“Angio IV”特异 性IgG抗体的ELISA分析。图中所用的Qβ-Angio I、Q β3-Angio II、Q β-Angio III和Qβ-Angio IV代表给小鼠注射的疫苗，根据上述血管紧 张肽的定义从这些小鼠获得血清。
在第0天、第14天，用溶于PBS的50mg疫苗皮下免疫雌性Balb/c 小鼠。第21天测定接种Qβ-Angio I、Qβ-Angio II、Qβ-Angio III和 Qβ-Angio IV的小鼠血清中抗所有4种肽(与RNAse A偶联的)，即 “Angio I”(图8A)、“Angio II”(图8B)、“Angio III”(图8C)和“Angio IV”(图8D)的IgG抗体。也分析同一小鼠的免疫前血清作为对照。指 定的血清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。3只小鼠的平均值(包 括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生针对检测的所有4种肽的 高IgG抗体效价。在对照(免疫前小鼠)中未检测到血管紧张肽特异的 抗体。
实施例43 血管紧张肽I和血管紧张肽II与HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即无半胱氨
酸的HBcAg)的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即无 半胱氨酸的HBcAg)化学偶联。
将0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白(参见实施例31) 在PBS pH7.4中的溶液1.25ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce) 水溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析过夜。更换缓冲液后，对反应溶液再透析2小 时。透析的反应混合物与1.8μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)在25 ℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析过夜，更换缓冲液，再透析2小时。
实施例44
血管紧张肽I和血管紧张肽II与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Anguo III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶联。
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与 60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液400μl在摇床上室温反应60 分钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合 并从柱上洗脱下来的含蛋白质的级分(约含1mg蛋白质，即衍生的菌 毛)，与3倍摩尔过量的肽反应。例如，向约含1mg衍生菌毛的500μl 洗脱液中添加2.34μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)。混合液在25℃ 摇床上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析过夜。
实施例45
Der p I肽与Qβ的偶联以及用Qβ-Der p I疫苗免疫小鼠
Der p I肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成下列来自居室尘埃的螨变应原Der p I的肽： CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(“Der p I p52”；氨基酸55-72，在N 端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头)、CQIYPPNANKIREALAQTHSA (“Der p I p 117”；氨基酸117-137)。这些肽如下所述与Qβ化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析两次各2小时。440μl透析的反应混合物与1.9μl 100mM肽 贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4 ℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
小鼠的免疫：
对雌性Balb/c小鼠接种不加佐剂的与Qβ衣壳蛋白偶联的2种Der p I肽之一。每种疫苗用两只小鼠。每种样品30μg总蛋白质用PBS稀释 为200μl，在第0天和第14天皮下注射。对小鼠在第21天眼眶后放血， 其血清用Der p I肽特异的ELISA分析。
ELISA
利用化学交联剂sulfo-SPDP将Der p I肽“Der p I p52”和“Der p I p117”分别与牛RNAse A偶联。ELISA板用浓度为10mg/ml的偶联 RNAse制剂包被。封闭平板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的 抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也检测同一小鼠的免疫前血清作 为对照。用与Qβ或其它载体交联的无关肽免疫小鼠，对其血清进行的 对照ELISA实验显示，检测到的抗体是各自肽特异的。结果显示在图 9A和9B中。
图9A和图9B显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der p I肽免疫的小鼠血 清中“Der p I p52”特异性(图9A)和“Der p I p117”(图9B)特异性IgG 抗体的ELISA分析。图9A和图9B中使用的“p52”和“p117”代表给分离 血清的小鼠注射的疫苗。
分析同一小鼠的免疫前血清(第0天)作为对照。指定血清稀释度 的结果显示为450nm下的光密度。第21天，接种的所有小鼠都产生所 接种的Der p I肽特异性的IgG抗体，但是没有另一个Der p I肽特异性 的抗体。在接种前(第0天)未检测到Der p I肽特异的抗体。
这两种Der p I肽疫苗在不含佐剂时都具有高度免疫原性。接种的所 有小鼠都对疫苗制剂中的肽产生良好的特异性抗体应答。
实施例46
Der p I肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut
(即无半胱氨酸的HBcAg)的偶联
化学合成下列来自居室灰尘的螨变应原Der p I的肽：Der p I p52(氨 基酸55-72，在N端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(氨基酸117-137)： CQIYPPNANKIREALAQTHSA。这些肽用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut (即无半胱氨酸的HBcAG)化学偶联。
将0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白(实施例31)在PBS pH7.4中的溶液1.25ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜。更换缓冲液后反应溶液再透析2小时。透析的反 应混合物与1.8μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应 2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4透析过夜，更换缓冲液，再透析2小时。
实施例47
Der p I肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成下列来自居室尘埃螨变应原Der p I的肽：Der p I p52(氨 基酸55-72，在N端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(氨基酸117-137)： CQIYPPNANKIREALAQTHSA。这些肽用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶 联。
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液400 μl与60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应60分 钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并 从柱上洗脱下来的含蛋白质的级分(约含1mg蛋白质，即衍生的菌毛)， 与3倍摩尔过量的肽反应。例如，向500μl约含1mg衍生菌毛的洗脱 液中添加2.34μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)。混合液在25℃摇床 上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析过夜。
实施例48 人VEGFR-II肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联以及用包含大肠杆菌1型菌
毛-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR II肽，用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶联。
将1mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液1400μl与85 μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应60分钟。反应 混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗 脱下来的含蛋白质的级分(约含1.4mg蛋白质)，与2.5倍摩尔过量(终 体积)的人VEGFR-II肽反应。例如，向200μl约含0.2mg衍生菌毛的 洗脱液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶于DMSO)。混合液在25℃摇床 上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析过夜。
小鼠的免疫：
对雌性C3H-HeJ(缺乏Toll样受体4，LPS非应答小鼠)和C3H-HeN (野生型)小鼠接种不加佐剂的与1型菌毛蛋白偶联的人VEGFR-II肽。 每种样品约100μg总蛋白质用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮 下注射。将小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特异的 ELISA分析。
ELISA
用固定化的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II胞外域(R&D Systems GmbH，Wiesbaden)以ELISA检测免疫小鼠的血清。
利用化学交联剂sulfo-SPDP将人VEGFR-II肽与牛RNAse A偶联。 ELISA板用浓度为10μg/ml的偶联RNAse A包被。人VEGFR-II胞外域 以2μg/ml的浓度吸附到平板上。封闭平板，然后与连续稀释的小鼠血 清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也检测同一小鼠 的免疫前血清作为对照。用未偶联的载体免疫小鼠，对其血清进行对照 ELISA实验显示，检测到的抗体是各自肽特异的。与1型菌毛偶联的人 VEGFR-II肽的结果显示在图10中。具体而言，图10A和图10B分别显 示用与1型菌毛蛋白偶联的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域免 疫的小鼠血清中人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域特异的IgG抗 体的ELISA分析。
对雌性C3H-HeJ(Toll样受体4缺乏，LPS非应答)和C3H-HeN(野 生型)小鼠在第0、14、28天皮下接种溶于PBS的100μg疫苗。在第 42天测定抗人VEGFR-II肽(与RNAse A偶联的)和人VEGFR-II肽胞 外域的血清IgG抗体。也分析同一小鼠的免疫前血清作为对照。指定血 清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。3只小鼠的平均值均被显示 (包括标准差)。接种的所有小鼠都产生抗人VEGFR-II肽和人VEGFR-II 肽胞外域(KDR)的高IgG抗体效价，在缺乏Toll样受体4的小鼠与野 生型小鼠之间未观察到差异。这一点是值得注意的，因为已经证实，抗 人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域的高IgG抗体效价的形成与内 毒素污染无关。
实施例49
人VEGFR-II肽与Qβ衣壳蛋白的偶联以及用
包含Qβ衣壳蛋白-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR-II肽，用来与Qβ衣壳蛋白化学偶联。
将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与20μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应 45分钟。反应溶液随后在4℃下对2L 20mM Hepes pH7.4透析两次各2 小时。1000μl透析的反应混合物与12μl 10mM人VEGFR-II肽溶液(溶 于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃下对2L 20 mM Hepes pH7.4透析2次各2小时。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析两次各2小时。440μl透析的反应混合物与1.9μl 100mM肽 贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4 ℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
小鼠的免疫：
对C57BL/6小鼠接种不加佐剂的与Qβ蛋白偶联的人VEGFR-II肽。 每种样品约50μg总蛋白质用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮 下注射。将小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特异的 ELISA分析。
实施例50
人VEGFR-II肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白 (即无半胱氨酸的HBcAg)的偶联，以及用包含HBcAg-149-lys-2cys-Mut
衣壳蛋白-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR-II肽，用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白化学偶联。
将0.9mg/ml无半胱氨酸的HbcAg衣壳蛋白(参见实施例31)在PBS pH7.4中的溶液3ml与37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇 床上室温反应45分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes pH7.4透析过 夜。更换缓冲液后反应溶液再透析2小时。透析的反应混合物与3μl 10 mM人VEGFR-II肽溶液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反 应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析过夜，更换缓冲 液，再透析2小时。
实施例51
HBcAg1-183Lys的构建
对肝炎核心抗原(HBcAg)1-183如实施例23所述修饰。将c/e1表 位(氨基酸残基72-88)区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)基因工程 置换为肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAgl-183Lys构建体)。引入的赖氨 酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，能用于HBcAg颗粒与含有游 离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。PCR方法基本如实施例 1所述，用常规克隆技术制备HBcAgl-183Lys基因。
如实施例23所述，通过由pEco63扩增HBcAg基因的两个不同片 段，插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列，然后通过PCR融合这两个片段， 装配为全长基因。使用下列PCR引物组合：
片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(见实施例23)
引物2：Lys-HBcAg(as)(见实施例23)
片段2：
引物3：Lys-HBcAg(s)(见实施例23)
引物4：HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
装配：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(见实施例23)
引物2：HBcAgwtHindIII
装配的全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消 化，克隆入在相同限制性酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)。
实施例52
muTNFα肽与HBcAg1-183Lys的偶联，以及用包含
HBcAg1-183Lys-muTNFα肽阵列的疫苗免疫小鼠
A.muTNFα肽与HBcAg1-183Lys的偶联
浓度为0.6mg/ml(29μM)的HBcAg1-183Lys如实施例32所述用 碘乙酰胺处理。HBcAg1-183Lys然后如实施例32所述与5倍过量的交 联剂Sulfo-MBS反应，并在4℃下用20mM Hepes pH7.2透析过夜。活 化(衍生)的HBcAg1-183Lys与5倍摩尔过量的肽muTNFα(序列 CGGVEEQLEWLSQR，直接稀释到DMSO中的100mM HBcAg1-183Lys贮存液溶液中)室温下反应4小时。偶联反应液(约1 ml溶液)在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析2次各4小时。透析 的偶联反应液等量分装液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
免疫：
对两只小鼠(雌性Balb/c)在第0天和第14天不加佐剂静脉内免疫， 每只动物100μg与muTNFα肽偶联的HBcAg1-183Lys。在第21天通过 ELISA测定血清中muTNFα肽(作为核糖核酸酶A配合物包被)和天 然TNFα蛋白(Sigma)特异的抗体。
ELISA
鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的浓度包被。检测同一小鼠的免 疫前血清作为对照。图14显示ELISA实验的结果，证实用与muTNFα 肽偶联的HBcAg1-183Lys(全长HBc-TNF)免疫产生鼠TNFα蛋白特异 的免疫应答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3种不 同稀释度检测。每个条图是两只小鼠血清信号的平均值。因为muTNFα 肽的氨基酸序列来源于小鼠TNFα蛋白的序列，因此，接种与muTNFα 肽偶联的HBcAg1-183Lys诱导了针对自身抗原的免疫应答。
实施例53
3’TNFII肽与2cysLys-mut HBcAg1-149的偶联，以及
用包含2cysLys-mut HBcAg1-149-3’TNF II肽阵列的疫苗免疫小鼠
3’TNF II肽与2cysLys-mut HBcAg1-149的偶联
浓度为2mg/ml的2cysLys-mut HBcAg1-149与50倍过量的交联剂 在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中在室温下反应30分钟。通过透 析过夜除去过量的交联剂，活化(衍生)的2cysLys-mut HBcAg1-149衣 壳蛋白与10倍过量的3’TNF II肽(SEQ： SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC，由溶于DMSO的100mM贮存液稀 释)在室温下反应4小时。反应混合液然后在分子量排阻值为50000Da 的透析管中透析过夜，液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
小鼠的免疫：
对3只8周龄雌性C3H/HeN小鼠接种不加佐剂的与2cysLys-mut HBcAg1-149偶联的3’TNF II肽。50μg总蛋白质用PBS稀释为200μl， 在第0天和第14天皮下注射(腹部两侧100μl)。将小鼠在第0天和 第21天眼眶后放血，其血清用鼠TNFα蛋白特异的ELISA分析。
ELISA
鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的浓度包被。检测同一小鼠的免 疫前血清作为对照。图15显示ELISA实验的结果，证实用与3’TNF II 肽偶联的2cysLys-mut HBcAg1-149免疫产生鼠TNFα蛋白特异的免疫应 答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3种不同稀释度 检测。每个条图是3只小鼠血清信号的平均值。因为3’TNF II肽的氨基 酸序列来源于鼠TNFα蛋白的序列，因此，接种与3’TNF II肽偶联的 2cysLys-mut HBcAg1-149诱导了自身抗原特异的免疫应答。
实施例54
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽与Qβ的偶联，以及用包含
Qβ-Aβ肽阵列的疫苗免疫小鼠
A.利用交联剂SMPH偶联Aβ1-15和Aβ33-42肽与Qβ衣壳蛋白
化学合成下列Aβ肽：DAEFRHDSGYEVHHQGGC(简称为“Aβ 1-15”)，该肽包含人Aβ1-15残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣壳蛋白偶 联，在其C端与序列GGC融合；和CGHGNKSGLMVGGVVIA(简称 为“Aβ33-42”)，该肽包含人Aβ33-42残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣 壳蛋白偶联，在其N端与序列CGHGNKS融合。这两种肽都如下所述 与Qβ衣壳蛋白化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.5ml与16.6μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。450μl含有活 化(衍生)的Qβ的透析反应混合液与6.5μl 50mM每种相应的肽贮存 液(溶于DMSO)在15℃摇床上反应2小时。200μl反应混合液随后用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜，次日清晨更换缓冲液 继续2小时。反应混合液然后等量分装液氮冻结，贮存于-80℃，直到用 于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13A和图13B中。 箭头所指为对应于一个Qβ亚单位偶联两个肽的带(图13A)或一个Qβ 亚单位偶联一个肽的带(图13B)。标准蛋白质的分子量示于图13A和 图13B的左侧空白处。
加载到图13A的凝胶上的样品如下：
1：衍生的Qβ；2：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集 并离心的样品的上清液；3：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时 采集并离心的样品的沉淀；4：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在4℃下静置24 小时、未透析但是离心的样品的上清液；5：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在 4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀；6：与“Aβ1-15”偶 联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清液。
加载到图13B的凝胶上的样品如下：
1：衍生的Qβ；2：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集 并离心的样品的上清液；3：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在偶联反应结束 时采集并离心的样品的沉淀；4：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在4℃下静置 24小时、未透析但是离心的样品的上清液；5：与“Aβ33-42”偶联的Qβ， 在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀；6：与“Aβ33-42” 偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清液。
B.利用交联剂SMPH偶联“Aβ1-27”肽与Qβ衣壳蛋白
化学合成下列Aβ肽(“Aβ1-27”)： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC。该肽包含人Aβ1-27 残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣壳蛋白偶联，在其C端与序列GGC 融合。
第一批与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”，在下文简称为“Qβ-Aβ1-27 第1批”，如下制备：
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.5ml与16.6μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中 用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。450μl透 析的反应混合液然后与6.5μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15℃摇 床上反应2小时。200μl样品等量分装，液氮冻结，贮存于-80℃，直到 用于免疫小鼠。
第二批与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”，在下文简称为“Qβ-Aβ1-27 第2批”，如下制备：
将Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液500 μl与11.3μl 32.5mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30分钟。 反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为3500Da的透析管(SnakeSkin， Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。 透析的反应混合液然后与3.6μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15 ℃摇床上反应2小时。反应混合液用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4透析1小时，在最后一次更换缓冲液后，用50000Da排阻值的透析 膜(Spectrpor，Spectrum)透析过夜。然后反应混合液等量分装液氮冻结， 贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。“Qβ-Aβ1-27第1批”用于第一次免疫， 而“Qβ-Aβ1-27第2批”用于加强。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13C中。箭头所指 为对应于一个Qβ亚单位偶联一个肽的带。
加载到图13C的凝胶上的样品如下：
M：蛋白质标准。1：Qβ衣壳蛋白。2：衍生的Qβ，在衍生反应结 束时采集并离心的样品的上清液。3：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采 集并离心的样品的沉淀。4：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应结束时 采集并离心的样品的上清液。5：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应结 束时采集并离心的样品的沉淀。6：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应 液透析后采集并离心的样品的上清液。7：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶 联反应液透析后采集并离心的样品的沉淀。
C.利用交联剂Sulfo-GMBS偶联“Aβ1-15”肽与Qβ衣壳蛋白
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液500μl与5.5μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。然后500μl透 析的反应混合液与6.5μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15℃摇床上 反应2小时。200μl反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜，次日清晨更换缓冲液继续透析2小时。然后反应 混合液等量分装并液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13D中。箭头所指 为分别对应于与一个Qβ亚单位偶联一个、两个和三个肽的带。
加载到图13D的凝胶上的样品如下：
M：蛋白质标准。1：衍生的Qβ。2：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶 联反应结束时采集并离心的样品的上清液。3：与“Aβ1-15”偶联的Qβ， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。4：与“Aβ1-15”偶联的Qβ， 在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的上清液。5：与“Aβ1-15” 偶联的Qβ，在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀。6： 与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清 液。
D.利用交联剂Sulfo-MBS偶联“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白
500μl Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液 与14.7μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30分 钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为3500Da的透析管(SnakeSkin， Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。 透析的反应混合液然后与7.2μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15 ℃摇床上反应2小时。然后反应混合液用50000Da排阻值的透析膜 (Spectrpor，spectrum)用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析3 次4小时。反应混合液然后等量分装并液氮冻结，贮存于-80℃，直到用 于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13E中。箭头所指 为对应于与一个Qβ亚单位偶联一个肽的带。
加载到图13E的凝胶上的样品如下：
1：Qβ衣壳蛋白。2：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采集并离心的 样品的上清液。3：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采集并离心的样品的 沉淀。4：衍生的Qβ，在衍生反应液透析结束时采集并离心的样品的上 清液。5：衍生的Qβ，在衍生反应液透析结束时采集并离心的样品的沉 淀。6：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集并离心的样品的 上清液。7：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集并离心的样 品的沉淀。8：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心 的样品的上清液。
E.小鼠的免疫
对5组8周龄雌性C57BL/6小鼠，每组3只，接种不加佐剂的5种 Aβ肽-Qβ衣壳蛋白偶联物之一。每种样品25μg总蛋白质用PBS稀释 为200μl，在第0天和第14天皮下注射。将小鼠在第0天(免疫前)和 第21天眼眶后放血，其血清用ELISA分析。利用3种不同的交联剂使 “Aβ1-15”肽与Qβ偶联，产生3种不同的疫苗制剂(“Qβ-Aβ1-15 SMPH”、 “Qβ-Aβ1-15 SMBS”、“Qβ-Aβ1-15 SGMBS”，结果参见ELISA部分)。
F.ELISA
如下所述，利用化学交联剂SPDP将所有3种Aβ肽分别与牛RNAse A偶联：10mg RNAse在2mL PBS(50mM磷酸缓冲液，150mM NaCl， pH7.2)中的溶液与100μl 20mM SPDP在DMSO中的溶液在25℃摇床 上反应60分钟。利用PD10柱(Pharmacia)通过凝胶过滤将活化(衍 生)的RNAse与过量的交联剂分离。合并含蛋白质的级分，用离心滤器 (5000MWCO)浓缩为2ml体积。333μl衍生的RNAse A溶液与2μl 肽贮存液(50mM溶于DMSO)反应。用分光光度法检测偶联反应。
ELISA板用浓度为10μg/ml的与肽偶联的RNAse A包被。封闭平 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。免疫前血清或使用与Qβ偶联的无关肽免疫的小鼠的对照血 清显示，检测到的抗体是各自肽特异的。图14A、图14B和图14C分别 显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”分别免 疫的小鼠血清中，“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”特异的IgG抗体的 ELISA分析。横坐标的单位代表给采集血清的小鼠注射的疫苗，描述用 来制备各疫苗的肽和交联剂。所有血清都用与RNAse A偶联的三种肽测 定，结果表明，抗肽1-15与抗1-27抗体之间有交叉反应性，而抗33-42 抗体没有观察到这种交叉反应性，证明了免疫应答的特异性。同样，获 得的ELISA滴度(表示为产生高于背景3个标准差的ELISA信号的血 清稀释度)极高，为60000-600000。在对照(免疫前小鼠)中未检测到 Aβ肽特异的抗体。
实施例55
含半胱氨酸接头的引入，抗独特型IgE mimobody的
表达与纯化，以及与Qβ衣壳蛋白的偶联
A.mimobody表达质粒的构建，用于与Qβ衣壳蛋白偶联
所述质粒基于表达质粒VAE051-pASK116。该质粒含有mimobody 的重链和轻链的编码区。为了在重链C端引入含半胱氨酸的接头，使用 下列引物：
引物CA2F： CGGCTCGAGCATCACCATCACCATCACGGTGAAGTTAAACTGCAGCTGG AGTCG
引物CA1R： CATGCCATGGTTAACCACAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTC AAC
引物CB1R： CATGCCATGGTTAACCACACGGCGGAGAGGTGTGGGTTTTATCACAAGA TTTGGGCTCAAC
引物CC1R： CCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGGCTAGCACAAGATTTG GGCTCAACTC
引物CC1F： CGCCGGGTTCTTCTGGTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAACCATGGAG AAAATAAAGTG
引物CCR2： CTCCCGGGTAGAAGTCAC
A.1.pCA2的构建
用引物CA2F和CA1R扩增编码重链部分的741bp片段，该片段含 有编码含半胱氨酸接头序列的延伸序列。VAE-pASK116作为Pfx聚合酶 (Roche)的模板，使用PCR仪(Robo)，开始在92℃下变性，循环： 92℃30s，48℃30s，68℃60s，5个循环，然后92℃30s，58℃30s， 68℃1min，30个循环。适当大小的PCR产物用Qiagen PCR纯化试剂 盒纯化，按照厂商推荐(Gibco)用XhoI和NcoI消化。用Qiagen凝胶 提取试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化产物。平行地，质粒VAE-pASK116用 XhoI和NcoI酶切，从琼脂糖凝胶中纯化3.7kb带。利用T4 DNA连接 酶，按照厂商说明(Gibco)，在16℃下将适量等份的XhoI-NcoI消化的 PCR产物与质粒连接过夜。用连接产物转化感受态大肠杆菌XL-1细胞， 后者接种于含氯霉素的琼脂糖平板上。单菌落在LB/氯霉素培养基中扩 增，制备质粒(Qiagen mini质粒试剂盒)，用适当的酶消化后检测 XhoI-NcoI插入片段的存在。相应的阳性质粒命名为pCA2，对两条链测 序，证实含半胱氨酸接头的质粒的身份。
A.2.pCB2的构建
在与A.1.部分所述相同的条件下，用引物CA2F和CB1R在重链编 码序列的5’端引入接头2。产生的PCR产物为750bp，克隆入如A.1. 部分所述的VAE051-pASK116中。
A.3.pCC2的构建
质粒pCC2分两步构建：用引物CA2F和CC1R扩增754bp的第一 次PCR产物。用引物CC1F和CC2R产生560bp的第二次PCR产物。 两次PCR都用VAE051-pASK116作为模板，条件如A.1部分所述。这 两种PCR产物都从琼脂糖凝胶中分离，与引物CA2F和CC2R混合，进 行第三次PCR，产生1298bp的片段。分离该片段，用XhoI和NcoI消 化。产生的780bp片段如A.1部分所述克隆入VAE-pASK100中。
B.mimobody的表达
用质粒pCA2、pCB2和pCC2转化感受态大肠杆菌W3110细胞。来 自氯霉素琼脂糖平板的单菌落在液体培养基(LB+15μg/ml氯霉素)中 37℃扩增过夜。然后1L TB培养基以1∶50v/v接种过夜培养物，在28℃ 下生长至OD600＝3。用1mg/l无水四环素诱导表达。过夜培养并以6000 rpm离心后收集细胞。细胞沉淀在添加硫酸多粘菌素B的裂解缓冲液中 4℃孵育2小时，从中分离周质。以6000rpm离心分离球芽。获得的上 清液含有mimobody，用20mM Tris，pH8.0透析。
C.mimobody的纯化
按照厂商推荐，引入的his6-尾使mimobody pCA2和pCB2可以通过 Ni-NTA fast flow(Qiagen)层析纯化。如必要，在蛋白G fast flow柱 (Amersham Pharmacia Biotech)上进行再纯化步骤。Mimobody用0.1M 甘氨酸pH2.7洗脱，立即加入NaOH中和，用20mM Hepes，150mM NaCl， pH7.2透析。
pCC2仅通过蛋白G亲和层析纯化。纯度通过SDS-PAGE分析。
Mimobody的蛋白质序列由cDNA序列翻译而来。通过对pCA2和 pCB2进行Edman测序证实其N端序列。
pCA2、pCB2和pCC2的轻链序列相同，如下：
DIELVVTQPASVSGSPGQSITISCTGTRSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKL
MIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTL
GVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQ
VTHEGSTVEKTVAPTECS
pCA2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHC
G
pCB2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTS
PPCG
pCC2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYTYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCASPKPS
TPPGSSGGAPGGC
D.mimobody与Qβ衣壳蛋白的偶联
D.1.mimobody pCC2与Qβ衣壳蛋白的偶联
将4.5mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.25ml与40μl SMPH溶液(Pierce)(溶于DMSO的100mM贮存 液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。然后6μl透析的反应混 合液与30μl pCC2溶液(2.88mg/ml)在25℃摇床上反应过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qb抗 血清(1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-Fab-mAb抗体(Jackson ImmunoResearch)(1∶2000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根过氧化物 酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶7000 稀释)孵育。
结果显示在图13A中。偶联产物和离析物在还原条件下在 16％SDS-PAGE凝胶上分析。在图13A中，“pCC2”对应于偶联前的 mimobody。“Qβ衍生”代表偶联前衍生的Qβ，“Qβ-pCC2”代表偶联反 应的产物。凝胶用考马斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭， 与多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-Fab-mAb (Jackson ImmunoResearch)(1∶2000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根 过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG(1∶7000稀释)孵育。用增强化学发光试剂(Amersham Pharmacia ELC 试剂盒)显示免疫反应条带。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
能够检测到约40kDa的偶联产物(图13A，箭头)。它与抗-Qβ抗 血清和可识别mimobody的抗-Fab的反应性清楚地证实了mimobody与 Qβ的共价偶联。
D.2.mimobody pCA2和pCB2与Qβ衣壳蛋白的偶联
将4.5mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.25ml与40μl SMPH溶液(Pierce)(来自溶于DMSO的100mM 贮存液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。pCA2(1.2mg/ml)在 25℃下用20mM TCFP还原30分钟，pCB2(4.2mg/ml)在37℃下用 50mM巯基乙胺还原。然后这两种mimobody都在4℃下用20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次。向30μl mimobody中添加6μl衍生的 Qβ，在25℃摇床上进行偶联过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qβ抗 血清(Cytos，1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-his6-mAb抗体(Qiagen) (1∶5000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔 IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释)孵育。
结果显示在图13B和图13C中。偶联产物和离析物在还原条件下在 16％SDS-PAGE凝胶上分析。在图15A和图15B中，“pCA2”和“pCB2” 对应于偶联前的mimobody。“Qβ衍生”代表偶联前衍生的Qβ， “Qβ-pCA2”和“Qβ-pCB2”代表偶联反应的产物。凝胶用考马斯亮蓝染色 或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000 稀释)或小鼠单克隆抗-his6-mAb抗体(Qiagen)(1∶5000稀释)孵育。 随后印迹分别与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶 偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释)孵育。用增强化学发光试剂 (Amersham Pharmacia ELC试剂盒)显示免疫反应条带。标准蛋白质的 分子量示于左侧空白处。
pCA2和pCB2偶联都能够检测到约40kDa的偶联产物(图15A和 图15B，箭头所指)。它与抗-Qβ抗血清和可识别mimobody重链的抗-his6 抗体的反应性清楚地证实了mimobody与Qβ的共价偶联。
实施例56
利用交联剂Sulfo-GMBS，Flag肽与野生型和
突变Qβ衣壳蛋白偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与野生型Qβ衣壳蛋 白和突变型Qβ衣壳蛋白进行化学偶联。
A.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上 反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100 mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随 后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
C.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
D.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2 小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图22A中。加样模式如下：
1，衍生的Qβ-240；2，与Flag肽偶联的Qβ-240；3，衍生的Qβ-250； 4，与Flag肽偶联的Qβ-250；5，衍生的Qβ-259；6，与Flag肽偶联的 Qβ-259；7，衍生的野生型Qβ；8，与Flag肽偶联的野生型Qβ；9，蛋 白质标准。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变体和野生型，对应 于每个亚单位1条和2条肽的偶联带都是可见的。对应于未偶联的Qβ 亚单位的带极弱，表明几乎所有亚单位都与至少一条Flag肽反应。对于 Qβ-250突变和野生型Qβ，可见对应于每个亚单位3条肽的带。对应于 每个亚单位2条肽的带与对应于每个亚单位1条肽的带的强度比，野生 型最高，比例为1∶1。Qβ-250突变体的这一比例也较高，但是Qβ-240 突变体明显较弱，Qβ-259突变体最弱。
实施例57
利用交联剂Sulfo-MBS，Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与野生型Qβ衣壳蛋 白和突变型Qβ衣壳蛋白化学偶联。
A.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上反 应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在 4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上反 应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在 4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
C.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床 上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
D.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床 上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图1中。加样模式如下：
1.蛋白质标准；2.衍生的Qβ-240；3与Flag肽偶联的Qβ-240；4. 衍生的Qβ-250；5.与Flag肽偶联的Qβ-250；6.衍生的Qβ-259；7.与Flag 肽偶联的Qβ-259；8.衍生的野生型Qβ；9与Flag肽偶联的野生型Qβ。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变型和野生型，可见 对应于每个亚单位1条肽的偶联带。对于突变型Qβ-250和野生型Qβ， 对应于每个亚单位2条肽的带也可见。对应于每个亚单位1条肽的带与 对应于未偶联的亚单位的带的强度比，Qβ-250突变体和野生型Qβ较高。 对于Qβ-240突变体，可见一条对应于每个亚单位2条肽的弱带。
实施例58
利用交联剂SMPH，Flag肽与Qβ突变体偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与Qβ突变体化学偶 联。
A.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl 50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 然后反应混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
C.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl 50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 然后反应混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图1中。加样模式如下：1.蛋白质标准；2与Flag 偶联的Qβ-240，偶联反应的沉淀；3与Flag偶联的Qβ-240，偶联反应 的上清液；4.SMPH衍生的Qβ-240；5与Flag偶联的Qβ-250，偶联反应 的沉淀；6.与Flag偶联的Qβ-250，偶联反应的上清液；7.SMPH衍生的 Qβ-250；8与Flag偶联的Qβ-259，偶联反应的沉淀；9与Flag偶联的 Qβ-259，偶联反应的上清液；10.SMPH衍生的Qβ-259。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变体，对应于每个亚 单位1条和2条肽的偶联带都是可见的。对于Qβ-250突变体，对应于 每个亚单位3条和4条肽的带也是可见的。
实施例59
PLA2-Cys蛋白与突变型Qβ衣壳蛋白的偶联
冻干的突变型Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中 溶解过夜。
A.PLA2-Cys蛋白与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与146 μl20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
B.PLA2-Cys蛋白与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液与146 μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
C.PLA2-Cys蛋白与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液与146 μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
通过SDS-PAGE分析的偶联实验结果显示在图1中。加样模式如下： 1.蛋白质标准。2.衍生的Qβ-240；3与PLA2-Cys偶联的Qβ-240，偶联 反应的上清液；4与PLA2-Cys偶联的Qβ-240，偶联反应的沉淀；5.衍生 的Qβ-250；6与PLA2-Cys偶联的Qβ-250，偶联反应的上清液；7与 PLA2-Cys偶联的Qβ-250，偶联反应的沉淀；8.衍生的Qβ-259；9与 PLA2-Cys偶联的Qβ-259，偶联反应的上清液；10与PLA2-Cys偶联的 Qβ-259，偶联反应的沉淀；11.PLA2-Cys。
所有突变体的偶联带(图中箭头所指)均可见，表明PLA2-Cys蛋 白能与所有突变型Qβ衣壳蛋白偶联。
此处提到的所有专利和出版物均引入本文作为参考。
1999年11月30日提交的美国申请号09/449,631和WO 00/3227的 全部公开内容均在此完整地引用作为参考。上文提及的所有出版物和专 利均在此完整引用作为参考。
序列表 <110>赛托斯生物技术公司
Renner，Wolfgang A.
Bachmann，Martin
Tissot，Alain
Maurer，Patrick
Lechner，Franziska
Sebbel，Peter
Piossek，Christine
Ortmann，Rainer
Luond，Rainer
Staufenbiel，Matthias
Frey，Peter <120>分子抗原阵列 <130>1700.019PC07 <140>PCT/IB02/00168 <141>2002-01-21 <150>US 60/262,379 <151>2001-01-19 <150>US 60/288,549 <151>2001-05-04 <150>US 60/326,998 <151>2001-10-05 <150>US 60/331,045 <151>2001-11-07 <160>350 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>1 ggggacgcgt gcagcaggta accaccgtta aagaaggcacc 41 <210>2 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>2 ggtggttac ctgctgcacg cgttgcttaa gcgacatgta gcgg 44 <210>3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>3 ccatgaggcc tacgataccc 20 <210>4 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>4 ggcactcacg gcgcgcttta caggc 25 <210>5 <211>47 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>5 ccttctttaa cggtggttac ctgctggcaa ccaacgtggt tcatgac 47 <210>6 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>6 aagcatgctg cacgcgtgtg cggtggtcgg atcgcccggc 40 <210>7 <211>90 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>olginucleotide primer <400>7 gggtctagat tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc 60 catcgtctgc accagctggc ctttgacacc 90 <210>8 <211>108 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>8 gggtctagaa ggaggtaaaa aacgatgaaa aagacagcta tcgcgattgc agtggcactg 60 gctggtttcg ctaccgtagc gcaggccttc ccaaccattc ccttatcc 108 <210>9 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>9 cccgaattcc tagaagccac agctgccctc c 31 <210>10 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>10 cctgcggtgg tctgaccgac accc 24 <210>11 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>11 ccgcggaaga gccaccgcaa ccaccgtgtg ccgccaggat g 41 <210>12 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>12 ctatcatcta gaatgaatag aggattcttt aac 33 <210>13 <211>15 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>修饰过的核糖体结合位点 <400>13 aggaggtaaa aaacg 15 <210>14 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>信号肽 <400>14 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala
20 <210>15 <211>46 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>修饰的Fos构建体 <400>15 Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu 1 5 10 15 Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu
20 25 30 Leu Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys
35 40 45 <210>16 <211>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>肽接头 <400>16 Ala Ala Ala Ser Gly Gly 1 5 <210>17 <211>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>肽接头 <400>17 Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 <210>18 <211>256 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>18 gaattcagga ggtaaaaaac gatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggct 60 ggtttcgcta ccgtagcgca ggcctgggtg ggggcggccg cttctggtgg ttgcggtggt 120 ctgaccgaca ccctgcaggc ggaaaccgac caggtggaag acgaaaaatc cgcgctgcaa 180 accgaaatcg cgaacctgct gaaagaaaaa gaaaagctgg agttcatcct ggcggcacac 240 ggtggttgct aagctt 256 <210>19 <211>52 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>19 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lyg Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>20 <211>261 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(22)..(240) <400>20 gaattcagga ggtaaaaaac g atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg 51
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc tgc ggt ggt ctg acc 99 Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr
15 20 25 gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc gcg 147 Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala
30 35 40 ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg gag 195 Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu
45 50 55 ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct 240 Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
60 65 70 gggtgtgggg atatcaagct t 261 <210>21 <211>73 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>21 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu
20 25 30 Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala
35 40 45 Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
50 55 60 Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala 65 70 <210>22 <211>196 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(34)..(189) <400>22 gaattcagga ggtaaaaaga tatcgggtgt ggg gcg gcc gct tct ggt ggt tgc 54
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys
1 5 ggt ggt ctg acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac 102 Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp
10 15 20 gaa aaa tcc gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa 150 Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys
25 30 35 gaa aag ctg gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc taagctt 196 Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys 40 45 50 <210>23 <211>52 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>23 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>24 <211>204 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>24 gaattcagga ggtaaaaaac gatggcttgc ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa 60 accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa 120 gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg gcacacggtg gttgcggtgg ttctgcggcc 180 gctgggtgtg gggatatcaa gctt 204 <210>25 <211>56 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>25 Lys Thr Met Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 1 5 10 15 Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn
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35 40 45 Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
50 55 <210>26 <211>26 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>26 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
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20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>29 <211>261 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(7)..(240) <400>29 gaattc atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc 48
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly
1 5 10 ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa gag ggc agc gct tgc ggt ggt ctg 96 Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu 15 20 25 30 acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc 144 Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser
35 40 45 gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg 192 Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu
50 55 60 gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct 240 Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
65 70 75 gggtgtggga ggcctaagct t 261 <210>30 <211>78 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>30 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp
20 25 30 Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu
35 40 45 Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lyg Glu Lys Leu Glu Phe
50 55 60 Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala 65 70 75 <210>31 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>31 cctgggtggg ggcggccgct tctggtggtt gcggtggtct gacc 44 <210>32 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>32 ggtgggaatt caggaggtaa aaagatatcg ggtgtggggc ggcc 44 <210>33 <211>47 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>33 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatgg cttgcggtgg tctgacc 47 <210>34 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>34 gcttgcggtg gtctgacc 18 <210>35 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>35 ccaccaagct tagcaaccac cgtgtgc 27 <210>36 <211>54 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>36 ccaccaagct tgatatcccc acacccagcg gccgcagaac caccgcaacc accg 54 <210>37 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>37 ccaccaagct taggcctccc acacccagcg gc 32 <210>38 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>38 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatg 29 <210>39 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>39 ggtgggaatt caggcctatg gctacaggct cc 32 <210>40 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>40 ggtgggaatt catggctaca ggctccc 27 <210>41 <211>59 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>41 gggtctagaa tggctacagg ctcccggacg tccctgctcc tggcttttgg cctgctctg 59 <210>42 <211>58 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>42 cgcaggcctc ggcactgccc tcttgaagcc agggcaggca gagcaggcca aaagccag 58 <210>43 <211>402 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>修饰的蜂毒磷脂酶A2 <220> <221>CDS <222>(1)..(402) <400>43 atc atc tac cca ggt act ctg tgg tgt ggt cac ggc aac aaa tct tct 48 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 ggt ccg aac gaa ctc ggc cgc ttt aaa cac acc gac gca tgc tgt cgc 96 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg
20 25 30 acc cag gac atg tgt ccg gac gtc atg tct gct ggt gaa tct aaa cac 144 Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His
35 40 45 ggg tta act aac acc gct tct cac acg cgt ctc agc tgc gac tgc gac 192 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp
50 55 60 gac aaa ttc tac gac tgc ctt aag aac tcc gcc gat acc atc tct tct 240 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 tac ttc gtt ggt aaa atg tat ttc aac ctg atc gat acc aaa tgt tac 288 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr
85 90 95 aaa ctg gaa cac ccg gta acc ggc tgc ggc gaa cgt acc gaa ggt cgc 336 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg
100 105 110 tgc ctg cac tac acc gtt gac aaa tct aaa ccg aaa gtt tac cag tgg 384 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp
115 120 125 ttc gac ctg cgc aaa tac 402 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr
130 <210>44 <211>134 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>修饰的蜂毒磷脂酶A2 <400>44 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg
20 25 30 Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His
35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp
50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr
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100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp
115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr
130 <210>45 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>45 ccatcatcta cccaggtac 19 <210>46 <211>34 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>46 cccacaccca gcggccgcgt atttgcgcag gtcg 34 <210>47 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>47 cggtggttct gcggccgcta tcatctaccc aggtac 36 <210>48 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>48 ttagtatttg cgcaggtcg 19 <210>49 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>49 ccggctccat cggtgcag 18 <210>50 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>50 accaccagaa gcggccgcag gggaaacaca tctgcc 36 <210>51 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>51 cggtggttct gcggccgctg gctccatcggtgcag 35 <210>52 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>52 ttaaggggaa acacatctgc c 21 <210>53 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>53 actagtctag aatgagagtg aaggagaaat atc 33 <210>54 <211>42 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>54 tagcatgcta gcaccgaatt tatctaattc caataattct tg 42 <210>55 <211>51 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>55 gtagcaccca ccaaggcaaa gctgaaagct acccagctcg agaaactggc a 51 <210>56 <211>48 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>56 caaagctcct attcccactg ccagtttctc gagctgggta gctttcag 48 <210>57 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>57 ttcggtgcta gcggtggctg cggtggtctg accgac 36 <210>58 <211>37 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>58 gatgctgggc ccttaaccgc aaccaccgtg tgccgcc 37 <210>59 <211>46 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>JUN氨基酸序列 <400>59 Cys Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln
20 25 30 Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Gly Cys
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180 <210>126 <211>212 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>126 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
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195 200 205 Glu Ser Gln Cys
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195 200 205 Glu Ser G1n Cys
210 <210>130 <211>212 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>130 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
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165 170 175 Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
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195 200 205 Glu Ser Gln Cys
210 <210>131 <211>183 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>131 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
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165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 <210>132 <211>183 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>132 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
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Met Asp Ile Asp Pro
1 5 tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg cct tct 1963 Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser
10 15 20 gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac acc gcc tca gct ctg 2011 Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu
25 30 35 tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc tca cct cac cat act 2059 Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr
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105 110 115 tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gcc tat aga 2299 Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
120 125 130 cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg gaa act act gtt gtt 2347 Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
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185 tattcctcta cagtacctat ctttaatcct gaatggcaaa ctccttcctt tcctaagatt 2558 catttacaag aggacattat tgataggtgt caacaatttg tgggccctct cactgtaaat 2618 gaaaagagaa gattgaaatt aattatgcct gctagattct atcctaccca cactaaatat 2678 ttgcccttag acaaaggaat taaaccttat tatccagatc aggtagttaa tcattacttc 2738 caaaccagac attatttaca tactctttgg aaggctggta ttctatataa gagggaaacc 2798 acacgtagcg catcattttg cgggtcacca tattcttggg aacaagagct acagcatggg 2858 aggttggtca ttaaaacctc gcaaaggcat ggggacgaat ctttctgttc ccaaccctct 2918 gggattcttt cccgatcatc agttggaccc tgcattcgga gccaactcaa acaatccaga 2978 ttgggacttc aaccccatca aggaccactg gccagcagcc aaccaggtag gagtgggagc 3038 attcgggcca gggctcaccc ctccacacgg cggtattttg gggtggagcc ctcaggctca 3098 gggcatattg accacagtgt caacaattcc tcctcctgcc tccaccaatc ggcagtcagg 3158 aaggcagcct actcccatct ctccacctct aagagacagt catcctcagg ccatgcagtg 3218 gaa 3221 <210>134 <211>185 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>134 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
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180 185 <210>135 <211>188 <212>PRT <213>土拨鼠乙型肝炎病毒 <400>135 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu 1 5 10 15 Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
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165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys
180 185 <210>136 <211>217 <212>PRT <213>地松树乙型肝炎病毒 <400>136 Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
20 25 30 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
35 40 45 Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
50 55 60 Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro 65 70 75 80 His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
85 90 95 Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
100 105 110 Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
115 120 125 Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln His Thr Val
130 135 140 Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
165 170 175 Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
180 185 190 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
195 200 205 Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
210 215 <210>137 <211>262 <212>PRT <213>雪雁乙型肝炎病毒 <400>137 Met Asp Val Asn Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile Glu Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp
20 25 30 Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu
35 40 45 Ile Ala Thr His Phe Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr
50 55 60 Gln Gly Met His Glu Ile Ala Glu Ala Ile Arg Ala Val Ile Pro Pro 65 70 75 80 Thr Thr Ala Pro Val Pro Ser Gly Tyr Leu Ile Gln His Asp Glu Ala
85 90 95 Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp Leu Phe Lys Glu Gln Glu Glu Arg Ile
100 105 110 Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His
115 120 125 Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg
130 135 140 Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Thr 145 150 155 160 Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu
165 170 175 Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro
180 185 190 Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly Arg Lys Thr Ser Thr Ala Thr Arg Lys
195 200 205 Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val
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245 250 255 Ser Pro Ser Pro Arg Lys
260 <210>138 <211>305 <212>PRT <213>Duck hepatitis virus <400>138 Met Trp Asp Leu Arg Leu His Pro Ser Pro Phe Gly Ala Ala Cys Gln 1 5 l0 15 Gly Ile Phe Thr Ser Ser Leu Leu Leu Phe Leu Val Thr Val Pro Leu
20 25 30 Val Cys Thr Ile Val Tyr Asp Ser Cys Leu Cys Met Asp Ile Asn Ala
35 40 45 Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro
50 55 60 Lys Ile Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr 65 70 75 80 Trp Arg Asn Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe
85 90 95 Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu
100 105 110 Ile Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ile Ile Pro Ala Thr Thr Ala Pro Val
115 120 125 Pro Gln Gly Phe Leu Val Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu
130 135 140 Gly Glu Leu Phe Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Leu Thr Asn Phe Gln Pro 145 150 155 160 Asp Tyr Pro Val Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala
165 170 175 Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp
180 185 190 His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Pro Asn Val Thr Asn Tyr Ile
195 200 205 Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Lys
210 215 220 Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln 225 230 235 240 Gly Gly Arg Asn Lys Thr Gln Gly Val Arg Lys Ser Arg Gly Leu Glu
245 250 255 Pro Arg Arg Arg Arg Val Lys Thr Thr Ile Val Tyr Gly Arg Arg Arg
260 265 270 Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser
275 280 285 Pro Leu Pro Arg Thr Ser Arg Asp His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg
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180 185 190 Thr Gly Val Ala Glu Ala Gly Lys Val Pro Ser Ser Val Asn Ser Gln
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210 <210>140 <211>139 <212>PRT <213>施氏假单胞菌 <400>140 Met Lys Ala Gln Met Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile 1 5 10 15 Val Val Ala Ile Ile Gly Ile Leu Ala Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr
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Met Lys Ile Lys Thr
1 5 ctg gca atc gtt gtt ctg tcg gct ctg tcc ctc agt tct acg acg gct 343 Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ser Ser Thr Thr Ala
10 15 20 ctg gcc gct gcc acg acg gtt aat ggt ggg acc gtt cac ttt aaa ggg 391 Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr Val His Phe Lys Gly
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275 280 <210>155 <211>181 <212>PRT <213>大肠杆菌 <400>155 Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr
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ttcgtcgtag cgcgaattct ctgacgctga ttaacccgac accctattac 4020 ctgacggtaa cagagttgaa tgccggaacc cgggttcttg aaaatgcatt ggtgcctcca 4080 atgggcgaaa gcacggttaa attgccttct gatgcaggaa gcaatattac ttaccgaaca 4140 ataaatgatt atggcgcact tacccccaaa atgacgggcg taatggaata acgcaggggg 4200 aatttttcgc ctgaataaaa agaattgact gccggggtga ttttaagccg gaggaataat 4260 gtcatatctg aatttaagac tttaccagcg aaacacacaa tgcttgcata ttcgtaagca 4320 tcgtttggct ggtttttttg tccgactcgt tgtcgcctgt gcttttgccg cacaggcacc 4380 tttgtcatct gccgacctct attttaatcc gcgcttttta gcggatgatc cccaggctgt 4440 ggccgattta tcgcgttttg aaaatgggca agaattaccg ccagggacgt atcgcgtcga 4500 tatctatttg aataatggtt atatggcaac gcgtgatgtc acatttaata cgggcgacag 4560 tgaacaaggg attgttccct gcctgacacg cgcgcaactc gccagtatgg ggctgaatac 4620 ggcttctgtc gccggtatga atctgctggc ggatgatgcc tgtgtgccat taaccacaat 4680 ggtccaggac gctactgcgc atctggatgt tggtcagcag cgactgaacc tgacgatccc 4740 tcaggcattt atgagtaatc gcgcgcgtgg ttatattcct cctgagttat gggatcccgg 4800 tattaatgcc ggattgctca attataattt cagcggaaat agtgtacaga atcggattgg 4860 gggtaacagc cattatgcat atttaaacct acagagtggg ttaaatattg gtgcgtggcg 4920 tttacgcgac aataccacct ggagttataa cagtagcgac agatcatcag gtagcaaaaa 4980 taaatggcag catatcaata cctggcttga gcgagacata ataccgttac gttcccggct 5040 gacgctgggt gatggttata ctcagggcga tattttcgat ggtattaact ttcgcggcgc 5100 acaattggcc tcagatgaca atatgttacc cgatagtcaa agaggatttg ccccggtgat 5160 ccacggtatt gctcgtggta ctgcacaggt cactattaaa caaaatgggt atgacattta 5220 taatagtacg gtgccaccgg ggccttttac catcaacgat atctatgccg caggtaatag 5280 tggtgacttg caggtaacga tcaaagaggc tgacggcagc acgcagattt ttaccgtacc 5340 ctattcgtca gtcccgcttt tgcaacgtga agggcatact cgttattcca ttacggcagg 5400 agaataccgt agtggaaatg cgcagcagga aaaaacccgc tttttccaga gtacattact 5460 ccacggcctt ccggctggct ggacaatata tggtggaacg caactggcgg atcgttatcg 5520 tgcttttaat ttcggtatcg ggaaaaacat gggggcactg ggcgctctgt ctgtggatat 5580 gacgcaggct aattccacac ttcccgatga cagtcagcat gacggacaat cggtgcgttt 5640 tctctataac aaatcgctca atgaatcagg cacgaatatt cagttagtgg gttaccgtta 5700 ttcgaccagc ggatatttta atttcgctga tacaacatac agtcgaatga atggctacaa 5760 cattgaaaca caggacggag ttattcaggt taagccgaaa ttcaccgact attacaacct 5820 cgcttataac aaacgcggga aattacaact caccgttact cagcaactcg ggcgcacatc 5880 aacactgtat ttgagtggta gccatcaaac ttattgggga acgagtaatg tcgatgagca 5940 attccaggct ggattaaata ctgcgttcga agatatcaac tggacgctca gctatagcct 6000 gacgaaaaac gcctggcaaa aaggacggga tcagatgtta gcgcttaacg tcaatattcc 6060 tttcagccac tggctgcgtt ctgacagtaa atctcagtgg cgacatgcca gtgccagcta 6120 cagcatgtca cacgatctca acggtcggat gaccaatctg gctggtgtat acggtacgtt 6180 gctggaagac aacaacctca gctatagcgt gcaaaccggc tatgccgggg gaggcgatgg 6240 aaatagcgga agtacaggct acgccacgct gaattatcgc ggtggttacg gcaatgccaa 6300 tatcggttac agccatagcg atgatattaa gcagctctat tacggagtca gcggtggggr 6360 actggctcat gccaatggcg taacgctggg gcagccgtta aacgatacgg tggtgcttgt 6420 taaagcgcct ggcgcaaaag atgcaaaagt cgaaaaccag acgggggtgc gtaccgactg 6480 gcgtggttat gccgtgctgc cttatgccac tgaatatcgg gaaaatagag tggcgctgga 6540 taccaatacc ctggctgata acgtcgattt agataacgcg gttgctaacg ttgttcccac 6600 tcgtggggcg atcgtgcgag cagagtttaa agcgcgcgtt gggataaaac tgctcatgac 6660 gctgacccac aataataagc cgctgccgtt tggggcgatg gtgacatcag agagtagcca 6720 gagtagcggc attgttgcgg ataatggtca ggtttacctc agcggaatgc ctttagcggg 6780 aaaagttcag gtgaaatggg gagaagagga aaatgctcac tgtgtcgcca attatcaact 6840 gccaccagag agtcagcagc agttattaac ccagctatca gctgaatgtc gttaaggggg 6900 cgtgatgaga aacaaacctt tttatcttct gtgcgctttt ttgtggctgg cggtgagtca 6960 cgctttggct gcggatagca cgattactat ccgcggctat gtcagggata acggctgtag 7020 tgtggccgct gaatcaacca attttactgt tgatctgatg gaaaacgcgg cgaagcaatt 7080 taacaacatt ggcgcgacga ctcctgttgt tccatttcgt attttgctgt caccctgtgg 7140 taatgccgtt tctgccgtaa aggttgggtt tactggcgtt gcagatagcc acaatgccaa 7200 cctgcttgca cttgaaaata cggtgtcagc ggcttcggga ctgggaatac agcttctgaa 7260 tgagcagcaa aatcaaatac cccttaatgc tccatcgtcc gcgctttcgt ggacgaccct 7320 gacgccgggt aaaccaaata cgctgaattt ttacgcccgg ctaatggcga cacaggtgcc 7380 tgtcactgcg gggcatatca atgccacggc taccttcact cttgaatatc agtaactgga 7440 gatgctcatg aaatggtgca aacgtgggta tgtattggcg gcaatattgg cgctcgcaag 7500 tgcgacgata caggcagccg atgtcaccat cacggtgaac ggtaaggtcg tcgccaaacc 7560 gtgtacggtt tccaccacca atgccacggt tgatctcggc gatctttatt ctttcagtct 7620 tatgtctgcc ggggcggcat cggcctggca tgatgttgcg cttgagttga ctaattgtcc 7680 ggtgggaacg tcgagggtca ctgccagctt cagcggggca gccgacagta ccggatatta 7740 taaaaaccag gggaccgcgc aaaacatcca gttagagcta caggatgaca gtggcaacac 7800 attgaatact ggcgcaacca aaacagttca ggtggatgat tcctcacaat cagcgcactt 7860 cccgttacag gtcagagcat tgacagtaaa tggcggagcc actcagggaa ccattcaggc 7920 agtgattagc atcacctata cctacagctg aacccgaaga gatgattgta atgaaacgag 7980 ttattaccct gtttgctgta ctgctgatgg gctggtcggt aaatgcctgg tcattcgcct 8040 gtaaaaccgc caatggtacc gagctcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 8100 tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 8160 tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 8220 ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 8280 atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 8340 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 8400 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 8460 cgcg 8464 <210>207 <211>13 <212>PRT <213>Ce3表位 <400>207 Cys Gly Gly Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly 1 5 10 <210>208 <211>13 <212>PRT <213>Ce3模拟位 <400>208 Cys Gly Gly Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu 1 5 10 <210>209 <211>9 <212>PRT <213>蜂毒磷脂酶A2克隆载体 <400>209 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly 1 5 <210>210 <211>145 <212>PRT <213>PLA2融合蛋白 <400>210 Met Ala Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys
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340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
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770 <210>219 <211>82 <212>PRT <213>β淀粉样肽前体(Homo Sapiens) <400>219 Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys 1 5 10 15 Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
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50 55 60 Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val 65 70 75 80 Val Glu <210>220 <211>42 <212>PRT <213>β淀粉样肽 <400>220 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
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35 40 221： RANKL_human：TrEMBL：O14788：胞外域 YFRAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK QAFQGAVQKE LQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGF FKLRSGEEIS IEVSNPSLLD PDQDATYFGA FKVRDID 222： RANKL_human：剪接同种型TrEMBL：O14788 MDPNRISEDG THCIYRILRL HENADFQDTT LESQDTKLIP DSCRRIKQAF QGAVQKELQH IVGSQHIRAE KAMVDGSWLD LAKRSKLEAQ PFAHLTINAT DIPSGSHKVS LSSWYHDRGW AKISNMTFSN GKLIVNQDGF YYLYANICFR HHETSGDLAT EYLQLMVYVT KTSIKIPSSH TLMKGGSTKY WSGNSEFHFY SINVGGFFKL RSGEEISIEV SNPSLLDPDQ DATYFGAFKV RDID 223： RANKL_mouse：TrEMBL：O35235：胞外域 YFRAQMDPNRI SEDSTHCFYR ILRLHENAGL QDSTLESEDT LPDSCRRMKQ AFQGAVQKEL QHIVGPQRFS GAPAMMEGSW LDVAQRGKPE AQPFAHLTIN AASIPSGSHK VTLSSWYHDR GWAKISNMTL SNGKLRVNQD GFYYLYANIC FRHHETSGSV PTDYLQLMVY VVKTSIKIPS SHNLMKGGST KNWSGNSEFH FYSINVGGFF KLRAGEEISI QVSNPSLLDP DQDATYFGAF KVQDID 224： RANKL_mouse剪接同种型：TrEMBL：Q9JJK8 MKQAFQGAVQ KELQHIVGPQ RFSGAPAMME GSWLDVAQRG KPEAQPFAHL TINAASIPSG SHKVTLSSWY HDRGWAKISN MTLSNGKLRV NQDGFYYLYA NICFRHHETS GSVPTDYLQL MVYVVKTSIK IPSSHNLMKG GSTKNWSGNS EFHFYSINVG GFFKLRAGEE ISIQVSNPSL LDPDQDATYF GAFKVQDID 225： MIF_at：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTSDPCALCS LHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYD MNAANVGWNG STFA 226： MIF_mouse：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTNDPCALCS LHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYDMNAANVGWNG STFA 227： MIF_human：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCS LHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFA 228： 人IL-17 登录号：AAC50341 1 mtpgktslvs lllllsleai vkagitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihnrntntnp 61 krssdyynrs tspwnlhrne dperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil 121 vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpi vhhva 229： 小鼠IL-17
登录号：AAA37490 1 mspgrassvs lmlllllsla atvkaaaiip qssacpntea kdflqnvkvn lkvfnslgak 61 vssrrpsdyl nrstspwtlh rnedpdryps viweaqcrhq rcvnaegkld hhmnsvliqq 121 eilvlkrepe scpftfrvek mlvgvgctcv asivrqaa 230： 人IL-13(前体) MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSG CSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN 231： 人IL-13(加工后) GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLL HLKKLFREGR FN 232： 小鼠IL-13(加工后) GPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNR KAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF 233： 人IL-5(前体) MRMLLHLSLL ALGAAYVYAI PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNH QLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES 234： 人IL-5(加工后) I PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNH QLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQ EFLGVMNTEW IIES 235： 小鼠IL-5(加工后) MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKK YIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG 236： CCL21 Swissprot：SY21_human：切割信号肽后的序列： SDGGAQD CCLKYSQRKI PAKVVRSYRK QEPSLGCSIP AILFLPRKRS QAELCADPKE LWVQQLMQHL DKTPSPQKPA QGCRKDRGAS KTGKKGKGSK GCKRTERSQT PKGP 237： CCL21 Swissprot：SY21_mouse：切割信号肽后的序列： SDGGGQD CCLKYSQKKI PYSIVRGYRK QEPSLGCPIP AILFSPRKHS KPELCANPEE GWVQNLMRRL DQPPAPGKQS PGCRKNRGTS KSGKKGKGSK GCKRTEQTQP SRG 238： Swissprot：SDF1_human：切割信号肽后的序列： DGKPVSLSYRC PCRFFESHVA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQ EYLEKALNKR FKM 239： Swissprot：SDF1_mouse：切割信号肽后的序列： DGKPVSLSYRC PCRFFESHIA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQ EYLEKALNK 240： BLC序列：人：登录号：NP_006410 氨基酸1-22为信号肽。 MKFISTSLLL MLLVSSLSPV QGVLEVYYTS LRCRCVQESS VFIPRRFIDR IQILPRGNGC PRKEIIVWKK NKSIVCVDPQ AEWIQRMMEV LRKRSSSTLP VPVFKRKIP 241： BLC序列：小鼠：登录号：NP_061354 氨基酸1-21为信号肽。 MRLSTATLLL LLASCLSPGH GILEAHYTNL KCRCSGVIST VVGLNIIDRI QVTPPGNGCP KTEVVIWTKM KKVICVNPRA KWLQRLLRHV QSKSLSSTPQ APVSKRRAA 242： 人嗜酸细胞活化趋化因子-1 1-23为信号肽 1 mkvsaallwl lliaaafspq glagpasvpt tccfnlanrk iplqrlesyr ritsgkcpqk 61 avifktklak dicadpkkkw vqdsmkyldq ksptpkp 243： 人嗜酸细胞活化趋化因子-2 1-26为信号肽 1 maglmtivts llflgvcahh iiptgsvvip spccmffvsk ripenrvvsy qlssrstclk 61 agvifttkkg qqfcgdpkqe wvqrymknld akqkkaspra ravavkgpvq rypgnqttc 244： 人嗜酸细胞活化趋化因子-3 1-23为信号肽 1 mmglslasav llasllslhl gtatrgsdis ktccfqyshk plpwtwvrsy eftsnscsqr 61 avifttkrgk kvcthprkkw vqkyisllkt pkql 245： 小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-1 1-23为信号肽 1 mqsstallfl lltvtsftsq vlahpgsipt sccfimtskk ipntllksyk ritnnrctlk 61 aivfktrlgk eicadpkkkw vqdatkhldq klqtpkp 246： 小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2 1-25为信号肽 1 magsativag llllvacacc ifpidsvtip sscctsfisk kipenrvvsy qlangsicpk 61 agvifitkkg hkictdpkll wvqrhiqkld akknqpskga kavrtkfavq rrrgnstev 247： M-CSF序列：人：该构建体将为由33-181或33-185残基组成的N-端片段， 相应于受体的可溶形式。 登录号：NP_000748 MTAPGAAGRC PPTTWLGSLL LLVCLLASRS ITEEVSEYCS HMIGSGHLQS LQRLIDSQME TSCQITFEFV DQEQLKDPVC YLKKAFLLVQ DIMEDTMRFR DNTPNAIAIV QLQELSLRLK SCFTKDYEEH DKACVRTFYE TPLQLLEKVK NVFNETKNLL DKDWNIFSKN CNNSFAECSS QDVVTKPDCN CLYPKAIPSS DPASVSPHQP LAPSMAPVAG LTWEDSEGTE GSSLLPGEQP LHTVDPGSAK QRPPRSTCQS FEPPETPVVK DSTIGGSPQP RPSVGAFNPG MEDILDSAMG TNWVPEEASG EASEIPVPQG TELSPSRPGG GSMQTEPARP SNFLSASSPL PASAKGQQPA DVTGTALPRV GPVRPTGQDW NHTPQKTDHP SALLRDPPEP GSPRISSPRP QGLSNPSTLS AQPQLSRSHS SGSVLPLGEL EGRRSTRDRR SPAEPEGGPA SEGAARPLPR FNSVPLTDTH ERQSEGSSSP QLQESVFHLL VPSVILVLLA VGGLLFYRWR RRSHQEPQRA DSPLEQPEGS PLTQDDRQVE LPV 248： M-CSF小鼠序列：成熟序列从第33位氨基酸开始。登录号： NP_031804 MTARGAAGRC PSSTWLGSRL LLVCLLMSRS IAKEVSEHCS HMIGNGHLKV LQQLIDSQME TSCQIAFEFV DQEQLDDPVC YLKKAFFLVQ DIIDETMRFK DNTPNANATE RLQELSNNLN SCFTKDYEEQ NKACVRTFHE TPLQLLEKIK NFFNETKNLL EKDWNIFTKN CNNSFAKCSS RDVVTKPDCN CLYPKATPSS DPASASPHQP PAPSMAPLAG LAWDDSQRTE GSSLLPSELP LRIEDPGSAK QRPPRSTCQT LESTEQPNHG DRLTEDSQPH PSAGGPVPGV EDILESSLGT NWVLEEASGE ASEGFLTQEA KFSPSTPVGG SIQAETDRPR ALSASPFPKS TEDQKPVDIT DRPLTEVNPM RPIGQTQNNT PEKTDGTSTL REDHQEPGSP HIATPNPQRV SNSATPVAQL LLPKSHSWGI VLPLGELEGK RSTRDRRSPA ELEGGSASEG AARPVARFNS IPLTDTGHVE QHEGSSDPQI PESVFHLLVP GIILVLLTVG GLLFYKWKWR SHRDPQTLDS SVGRPEDSSL TQDEDRQVEL PV 249： 人抵抗素的序列：前体。 MKALCLLLLPVLGLLVSSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFRAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCG SACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQP 250： 小鼠抵抗素的序列：前体。 MKNLSFPLLFLFFLVPELLGSSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSC GSACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVAS 251： 淋巴毒素-β： Swissprot：TNFC_human：胞外域的序列： QD QGGLVTETAD PGAQAQQGLG FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ GLGWETTKEQ AFLTSGTQFS DAEGLALPQD GLYYLYCLVG YRGRAPPGGG DPQGRSVTLR SSLYRAGGAY GPGTPELLLE GAETVTPVLD PARRQGYGPL WYTSVGFGGL VQLRRGERVY VN 252： 淋巴毒素-β： Swissprot：TNFC_mouse：胞外域的序列： QD QGRRVEKIIG SGAQAQKRLD DSKPSCILPS PSSLSETPDP RLHPQRSNAS RNLASTSQGP VAQSSREASA WMTILSPAAD STPDPGVQQL PKGEPETDLN PELPAAHLIG AWMSGQGLSW EASQEEAFLR SGAQFSPTHG LALPQDGVYY LYCHVGYRGR TPPAGRSRAR SLTLRSALYR AGGAYGRGSP ELLLEGAETV TPVVDPIGYG SLWYTSVGFG GLAQLRSGER VYVNISHPDM VDYRRGKTFF GAVMVG 253： RNA-噬菌体PP7： msktivlsvg eatrtlteiq stadrqifee kvgplvgrlr ltaslrqnga ktayrvnlkl dqadvvdcst svcgelpkvr ytqvwshdvt ivansteasr kslydltksl vatsqvedlv vnlvplgr 254： RNA-噬菌体SPA1蛋白： aklnqvtls kigkngdqtl tltprgvnpt ngvaslseag avpalekrvt vsvaqpsrnr knfkvqiklq nptactrdac dpsvtrsafa dvtlsftsys tdeeralirt elaalladpl ivdaidnlnp aywaallvas sgggdnpsdp dvpvvpdvkp pdgtgrykcp facyrlgsiy evgkegspdi yergdevsvt fdyaledflg ntnwrnwdqr lsdydianrr rcrgngyidl datamqsddf vlsgrygvrk vkfpgafgsi kyllniqgda wldlsevtay rsygmvigfw tdskspqlpt dftqfnsanc pvqtviiips 1 255： “Qβ240”： AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 256： “Qβ243”： AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 257： “Qβ250”： ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 258： “Qβ259”： ARLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 259： “Qβ251”： AKLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 260： PH19(SEQ ID NO：260) TAAGTCCTCTGCCACGTACC 261： PH20(SEQ ID NO：261) TGGAAACCACGCTCACTTCC 262： PH21(SEQ ID NO：262) CGGGATCCGGGATGAAGAACCTTTCATTTC 263： PH22(SEQ ID NO：263) GCCTCTAGAGAGGAAGCGACCTGCAGCTTAC 264： PH29(SEQ ID NO：264) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGGACGACTACAAGGATGACGACA 265： PH30(SEQ ID NO：265) AGCTTGTCGTCATCCTTGTAGTCGTCCCCACATCCACCCCCTCCCG 266： PH31(SEQ ID NO：266) AGCTTACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGG 267： PH32(SEQ ID NO：267) CGGCTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTA 268： PH35(SEQ ID NO：268) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGATCGAAGGTCGCA 269： PH36(SEQ ID NO：269) AGCTTGCGACCTTCGATCCCACATCCACCCCCTCCCG 270： PH37(SEQ ID NO：270) CGGGATCCAGCAGCTGGGCTCGAGGTGCTAGCTTTGTTTAAAC 271： PH38(SEQ ID NO：271) GATCGTTTAAACAAACAAAGCTAGCACCTCGAGCCCAGCTGCTGGATCCCGGTAC 272： PH39(SEQ ID NO：272) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGGACGATGACGACA 273： PH40(SEQ ID NO：273) AGCTTGTCGTCATCGTCCCCACATCCACCCCCTCCCG 274： PH41(SEQ ID NO：274) CATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGT 275： PH42(SEQ ID NO：275) GCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTAC 276： PH43(SEQ ID NO：276) ACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCG 277： PH44(SEQ ID NO：277) GATCCGCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCA 278： SU7(SEQ ID NO：278) AGCTTGCGGATCCAGGATATCGGCTCGAGGTTCTAGAGTG 279： SU8(SEQ ID NO：279) GGCCCACTCTAGAACCTCGAGCCGATATCCTGGATCCGCA 280： 抵抗素-C-Xa： SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCGIEGR 281： 抵抗素-C-EK SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCGDDDD 282： 抵抗素-GCG： SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCG 283： pCep-Xa-Fc*：(全序列) 1 GCCCCGCCGC CGGACGAACT AAACCTGACT ACGGCATCTC TGCCCCTTCT TCGCTGGTAC GAGGAGCGCT 71 TTTGTTTTGT ATTCGGGGCA GTGCATGTAA TCCCTTCAGT TGGTTGGTAC AACTTGCCAA CTGGGCCCTG 141 TTCCACATGT GACACGGGGG GGGACCAAAC ACAAAGGGGT TCTCTGACTG TAGTTGACAT CCTTATAAAT 211 GGATGTGCAC ATTTGCCAAC ACTGAGTGGC TTTCATCCTG GAGCAGACTT TGCATGCTGT GGACTGCAAC 281 ACAACATTGC CTTTATGTGT AACTCTTGGC TGAAGCTCTT ACACCAATGC TGGGGGACAT GTACCTCCCA 351 GGGGCCCAGG AAGACTACGG GAGGCTACAC CAACGTCAAT CAGAGGGGCC TGTGTAGCTA CCGATAAGCG 421 GACCCTCAAG AGGGCATTAG CAATAGTGTT TATAAGGCCC CCTTGTTAAC CCTAAACGGG TAGCATATGC 491 TTCCCGGGTA GTAGTATATA CTATCCAGAC TAACCCTAAT TCAATAGCAT ATGTTACCCA ACGGGAAGCA 561 TATGCTATCG AATTAGGGTT AGTAAAAGGG TCCTAAGGAA CAGCGATATC TCCCACCCCA TGAGCTGTCA 631 CGGTTTTATT TACATGGGGT CAGGATTCCA CGAGGGTAGT GAACCATTTT AGTCACAAGG GCAGTGGCTG 701 AAGATCAAGG AGCGGGCAGT GAACTCTCCT GAATCTTCGC CTGCTTCTTC ATTCTCCTTC GTTTAGCTAA 771 TAGAATAACT GCTGAGTTGT GAACAGTAAG GTGTATGTGA GGTGCTCGAA AACAAGGTTT CAGGTGACGC 841 CCCCAGAATA AAATTTGGAC GGGGGGTTCA GTGGTGGCAT TGTGCTATGA CACCAATATA ACCCTCACAA 911 ACCCCTTGGG CAATAAATAC TAGTGTAGGA ATGAAACATT CTGAATATCT TTAACAATAG AAATCCATGG 981 GGTGGGGACA AGCCGTAAAG ACTGGATGTC CATCTCACAC GAATTTATGG CTATGGGCAA CACATAATCC 1051 TAGTGCAATA TGATACTGGG GTTATTAAGA TGTGTCCCAG GCAGGGACCA AGACAGGTGA ACCATGTTGT 1121 TACACTCTAT TTGTAACAAG GGGAAAGAGA GTGGACGCCG ACAGCAGCGG ACTCCACTGG TTGTCTCTAA 1191 CACCCCCGAA AATTAAACGG GGCTCCACGC CAATGGGGCC CATAAACAAA GACAAGTGGC CACTCTTTTT 1261 TTTGAAATTG TGGAGTGGGG GCACGCGTCA GCCCCCACAC GCCGCCCTGC GGTTTTGGAC TGTAAAATAA 1331 GGGTGTAATA ACTTGGCTGA TTGTAACCCC GCTAACCACT GCGGTCAAAC CACTTGCCCA CAAAACCACT 1401 AATGGCACCC CGGGGAATAC CTGCATAAGT AGGTGGGCGG GCCAAGATAG GGGCGCGATT GCTGCGATCT 1471 GGAGGACAAA TTACACACAC TTGCGCCTGA GCGCCAAGCA CAGGGTTGTT GGTCCTCATA TTCACGAGGT 1541 CGCTGAGAGC ACGGTGGGCT AATGTTGCCA TGGGTAGCAT ATACTACCCA AATATCTGGA TAGCATATGC 1611 TATCCTAATC TATATCTGGG TAGCATAGGC TATCCTAATC TATATCTGGG TAGCATATGC TATCCTAATC 1681 TATATCTGGG TAGTATATGC TATCCTAATT TATATCTGGG TAGCATAGGC TATCCTAATC TATATCTGGG 1751 TAGCATATGC TATCCTAATC TATATCTGGG TAGTATATGC TATCCTAATC TGTATCCGGG TAGCATATGC 1821 TATCCTAATA GAGATTAGGG TAGTATATGC TATCCTAATT TATATCTGGG TAGCATATAC TACCCAAATA 1891 TCTGGATAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC 1961 ATAGGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGT ATATGCTATC 2031 CTAATTTATA TCTGGGTAGC ATAGGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA 2101 TCTGGGTAGT ATATGCTATC CTAATCTGTA TCCGGGTAGC ATATGCTATC CTCATGCATA TACAGTCAGC 2171 ATATGATACC CAGTAGTAGA GTGGGAGTGC TATCCTTTGC ATATGCCGCC ACCTCCCAAG GGGGCGTGAA 2241 TTTTCGCTGC TTGTCCTTTT CCTGCATGCT GGTTGCTCCC ATTCTTAGGT GAATTTAAGG AGGCCAGGCT 2311 AAAGCCGTCG CATGTCTGAT TGCTCACCAG GTAAATGTCG CTAATGTTTT CCAACGCGAG AAGGTGTTGA 2381 GCGCGGAGCT GAGTGACGTG ACAACATGGG TATGCCCAAT TGCCCCATGT TGGGAGGACG AAAATGGTGA 2451 CAAGACAGAT GGCCAGAAAT ACACCAACAG CACGCATGAT GTCTACTGGG GATTTATTCT TTAGTGCGGG 2521 GGAATACACG GCTTTTAATA CGATTGAGGG CGTCTCCTAA CAAGTTACAT CACTCCTGCC CTTCCTCACC 2591 CTCATCTCCA TCACCTCCTT CATCTCCGTC ATCTCCGTCA TCACCCTCCG CGGCAGCCCC TTCCACCATA 2661 GGTGGAAACC AGGGAGGCAA ATCTACTCCA TCGTCAAAGC TGCACACAGT CACCCTGATA TTGCAGGTAG 2731 GAGCGGGCTT TGTCATAACA AGGTCCTTAA TCGCATCCTT CAAAACCTCA GCAAATATAT GAGTTTGTAA 2801 AAAGACCATG AAATAACAGA CAATGGACTC CCTTAGCGGG CCAGGTTGTG GGCCGGGTCC AGGGGCCATT 2871 CCAAAGGGGA GACGACTCAA TGGTGTAAGA CGACATTGTG GAATAGCAAG GGCAGTTCCT CGCCTTAGGT 2941 TGTAAAGGGA GGTCTTACTA CCTCCATATA CGAACACACC GGCGACCCAA GTTCCTTCGT CGGTAGTCCT 3011 TTCTACGTGA CTCCTAGCCA GGAGAGCTCT TAAACCTTCT GCAATGTTCT CAAATTTCGG GTTGGAACCT 3081 CCTTGACCAC GATGCTTTCC AAACCACCCT CCTTTTTTGC GCCTGCCTCC ATCACCCTGA CCCCGGGGTC 3151 CAGTGCTTGG GCCTTCTCCT GGGTCATCTG CGGGGCCCTG CTCTATCGCT CCCGGGGGCA CGTCAGGCTC 3221 ACCATCTGGG CCACCTTCTT GGTGGTATTC AAAATAATCG GCTTCCCCTA CAGGGTGGAA AAATGGCCTT 3291 CTACCTGGAG GGGGCCTGCG CGGTGGAGAC CCGGATGATG ATGACTGACT ACTGGGACTC CTGGGCCTCT 3361 TTTCTCCACG TCCACGACCT CTCCCCCTGG CTCTTTCACG ACTTCCCCCC CTGGCTCTTT CACGTCCTCT 3431 ACCCCGGCGG CCTCCACTAC CTCCTCGACC CCGGCCTCCA CTACCTCCTC GACCCCGGCC TCCACTGCCT 3501 CCTCGACCCC GGCCTCCACC TCCTGCTCCT GCCCCTCCTG CTCCTGCCCC TCCTCCTGCT CCTGCCCCTC 3571 CTGCCCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCCCCTCCTG CTCCTGCCCC 3641 TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG CCCCTCCTGC CCCTCCTGCT 3711 CCTGCCCCTC CTGCCCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCTCCTGCCC 3781 CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCTCCTGCCC CTCCTGCCCC TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC 3851 TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCCCC TCCTGCTCCT GCCCCTCCTC CTGCTCCTGC CCCTCCTGCC 3921 CCTCCTGCCC CTCCTCCTGC TCCTGCCCCT CCTGCCCCTC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG 3991 CCCCTCCTGC CCCTCCTGCC CCTCCTCCTG CTCCTGCCCC TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC 4061 TCCTGCTCCT GCCCCTCCTG CCCCTCCTGC CCCTCCTCCT GCTCCTGCCC CTCCTCCTGC TCCTGCCCCT 4131 CCTGCCCCTC CTGCCCCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG CCCCTCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCTC 4201 CTGCCCCTCC CGCTCCTGCT CCTGCTCCTG TTCCACCGTG GGTCCCTTTG CAGCCAATGC AACTTGGACG 4271 TTTTTGGGGT CTCCGCACAC CATCTCTATG TCTTGGCCCT GATCCTGAGC CGCCCGGGGC TCCTGGTCTT 4341 CCGCCTCCTC GTCCTCGTCC TCTTCCCCGT CCTCGTCCAT GGTTATCACC CCCTCTTCTT TGAGGTCCAC 4411 TGCCGCCGGA GCCTTCTGGT CCAGATGTGT CTCCCTTCTC TCCTAGGCCA TTTCCAGGTC CTGTACCTGG 4481 CCCCTCGTCA GACATGATTC ACACTAAAAG AGATCAATAG ACATCTTTAT TAGACGACGC TCAGTGAATA 4551 CAGGGAGTGC AGACTCCTGC CCCCTCCAAC AGCCCCCCCA CCCTCATCCC CTTCATGGTC GCTGTCAGAC 4621 AGATCCAGGT CTGAAAATTC CCCATCCTCC GAACCATCCT CGTCCTCATC ACCAATTACT CGCAGCCCGG 4691 AAAACTCCCG CTGAACATCC TCAAGATTTG CGTCCTGAGC CTCAAGCCAG GCCTCAAATT CCTCGTCCCC 4761 CTTTTTGCTG GACGGTAGGG ATGGGGATTC TCGGGACCCC TCCTCTTCCT CTTCAAGGTC ACCAGACAGA 4831 GATGCTACTG GGGCAACGGA AGAAAAGCTG GGTGCGGCCT GTGAGGATCA GCTTATCGAT GATAAGCTGT 4901 CAAACATGAG AATTCTTGAA GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TATAGGTTAA TGTCATGATA 4971 ATAATGGTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 5041 TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AATATTGAAA 5111 AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT 5181 GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT 5251 ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT 5321 GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT 5391 CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 5461 GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA ACTTACTTCT 5531 GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT 5601 GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA 5671 TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA 5741 CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT 5811 GATAAATCTG GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 5881 CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA 5951 GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT CATATATACT TTAGATTGAT 6021 TTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC 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AIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFTTKLLSYTKQLFRHGPFLEVLAIEGR 329： 小鼠C-IL-13-S：(SEQ ID NO：329) LACGGGGGGPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAI YRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF 330： 人C-IL13-F：(SEQ ID NO：330) ADPGCGGGGGLAGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCS AIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFLEVLAIEGR 331： 人C-IL-13-S：(SEQ ID NO：331) LACGGGGGGPVPPSTALRELIEELVNTTQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQR MLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN 332： 小鼠C-IL-5-E：(SEQ ID NO：332) ALVGCGGPKPSTPPGSSGGAPASMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQG LDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG 333： 小鼠C-IL-5-F：(SEQ ID NO：333) ADPGCGGGGGLAMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVR GGTVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEGLEVLAIEGR 334： 小鼠C-IL-5-S：(SEQ ID NO：334) LACGGGGGMEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGG TVEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG 335： 人C-IL-5-E：(SEQ ID NO：335) ALVGCGGPKPSTPPGSSGGAPASIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGI GTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES 336： 人C-IL-5-F：(SEQ ID NO：336) ADPGCGGGGGLAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIPQGIGTLESQTVQG GTVFRLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIESLEVLAIEGR 337： 人C-IL-5-S：(SEQ ID NO：337) LACGGGGGIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGT VERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES 338： 引物NheIL13-F：(SEQ ID NO：338) CTAGCTAGCCGGGCCGGTGCCAAGATC 339： 引物XhoIL13-R：(SEQ ID NO：339) TTTCTCGAGGAAGGGGCCGTGGCGAA 340： 引物Spelinker3-F1：(SEQ ID NO：340) CCCCGCCGGGTTCTTCTGGCGGTGCTCCGGCTAGCATGGAGATTCCCATGAGCAC 341： 引物SpeNlinker3-F2：(SEQ ID NO：341) TTTTACTAGTTGGTTGCGGCGGCCCGAAACCGAGCACCCCGCCGGGTTCTTC 342： 引物IL5StopXho-R：(SEQ ID NO：342) TTTTGCGGCCGCGTTTAAACTCGAGTTATTAGCCTTCCATTGCCCACTC 343： 引物BamH1-FLK1-F：(SEQ ID NO：343) CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC 344： 引物Nhe1-FLK1-B：(SEQ ID NO：344) CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC 345： mVEGFR-2(2-3)片段：(SEQ ID NO：345) PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK RFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSH HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCV ASSGRMIKRN RTFVRVHTKP 346 人C-LT·49-306：(SEQ ID NO：346) LACGGQDQGRRVEKIIGSGAQAQKRLDDSKPSCILSPSSLSETPDPRLHPQRSNASRNLASTSQGPVAQSSR EASAWMTILSPAADSTPDPGVQQLPKGEPETDLNPELPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSP THGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIG YGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVG 347 人C-LT·126-306：(SEQ ID NO：347) LACGGSPAADSTPDPGVQQLPKGEPETDLNPELPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGL ALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSL WYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVG 348 修饰过的人肮病毒蛋白片段：(SEQ ID NO：348) VGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDE YSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQ RGRLAGGGGCG 349 修饰过的人肮病毒蛋白片段：(SEQ ID NO：349) VGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQ YSNQNNFVHDCVNTTVKEHTVTTTTKGENFTETDIKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQ RGRLAGGGGCG 350 修饰过的人肮病毒蛋白片段：(SEQ ID NO：350) VGGLGGYMLGSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDR YSNQNNFVHDCVNITVKQHTVTTTTKGENFTETDIKIMERVVEQMCITQYQRESQAYYQ RGRLAGGGGCG
病毒样颗粒(VLP)由于其结构特征和非传染性，在疫苗生产领域 得到应用。VLP是由一种或多种类型的许多蛋白质分子以对称方式建立 的超分子结构。它们缺乏病毒基因组，因此没有传染性。VLP通常能通 过异源表达大量产生，且易于纯化。
VLP的例子包括：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182 (1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德 毕斯病毒、轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)、口蹄疫病毒 (Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺沃克病毒(Jiang X. 等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest. 87：1456-1461(1991))的衣壳蛋白、逆转录病毒GAG蛋白(WO 96/30523)、逆转录转座子Ty蛋白p1、乙型肝炎病毒(WO 92/11291) 和人乳头瘤病毒(WO 98/15631)的表面蛋白。
由于免疫耐受，通常难以诱发针对自体分子的免疫应答。特别是， 如果通过常规接种策略触发，具有自体分子特异性的淋巴细胞通常是低 反应性的，甚至无反应性。
淀粉样B肽(Aβ1-42)在阿耳茨海默病的神经病理学中起主要作用。 Aβ肽的区域特异性的胞外积累伴随着小神经胶质增生、细胞骨架改变、 营养不良性神经炎和突触丢失。一般认为这些病理学改变与定义该疾病 的认知缺陷有关。
在一种阿耳茨海默病小鼠模型中，产生Aβ1-42的工程转基因动物 (PDAPP-小鼠)在脑中形成斑和神经元损伤。最近的研究表明，用Aβ1-42 免疫幼年PDAPP-小鼠可使斑形成和相关的营养不良性神经炎受到抑制 (Schenk，D.等人，Nature 400：173-77(1999))。
此外，免疫已经发生AD样神经病理学的PDAPP小鼠也可降低神经 病理学的程度和进展。这些研究的免疫方案如下：肽溶解于水缓冲液中， 与完全弗氏佐剂1∶1混合(初次剂量)，得到100μg/剂的肽浓度。之后的 加强用不完全弗氏佐剂。小鼠在11个月内接受11次免疫。达到并保持 了大于1∶10000的抗体效价。因此，免疫可能是阿耳茨海默病的一种有 效的预防和治疗方法。
在另一项研究中，外周施用的抗Aβ1-42抗体能够穿过血脑屏障，结 合Aβ肽，诱导清除已经存在的淀粉样蛋白(Bard，F等人，Nature Medicine 6：916-19(2000))。该研究采用抗Aβ1-42的多克隆抗体，或抗来源于 Aβ不同区的合成片段的单克隆抗体。因此，抗体的诱导可以认为是阿耳 茨海默病的一种可能的治疗方法。
已经确定，单独施用纯化的蛋白质通常不足以引起强免疫应答；分 离的抗原一般必须与被称为佐剂的辅助物质结合。佐剂保护施用的抗原 免于快速降解，而且佐剂可以使得长时间内释放低水平的抗原。
如前所述，阿耳茨海默病(AD)的重要事件之一是淀粉样蛋白沉积 为不可溶的纤维块(淀粉样蛋白产生)，在大脑血管壁周围形成胞外神 经炎斑和沉积物(综述见Selkoe，D.J.(1999)Nature 399，A23-31)。神 经炎斑和亲刚果红(congophilic)血管病的主要成分是淀粉样蛋白β (Aβ)，尽管这些沉积物也含有其它蛋白质，如糖胺聚糖和载脂蛋白。 Aβ是从一种被称为淀粉样前体蛋白(APP)的大糖蛋白上蛋白水解切割 下来的，它包含695-770个氨基酸的同种型，具有一个疏水性跨膜区。 Aβ形成一组长度最高达43个氨基酸的肽，它们显示相当大的氨基端和 羧基端异质性(截短)以及修饰(Roher，A.E.，Palmer，K.C.，Chau，V.& Ball， M.J.(1998)J.Cell Biol.107，2703-2716；Roher，A.E.，Palmer，K.C.， Yurewicz，E.C.，Ball，M.J.& Greeberg，B.D.(1993)J.Neurochem.61， 1916-1926)。主要的同种型是Aβ1-40和1-42。它高度倾向于形成可聚 集为原纤维的β折叠，最终产生淀粉样蛋白。最近的研究证实，接种诱 发的脑淀粉样沉积物减少导致认知能力提高(Schenk，D.，Barbour，R.， Dunn，W.，Gordon，G.，Grajeda，H.，Guido，T.，Hu，K.，Huang，J.， Johnson-Wood，K.，Khan，K.等人(1999)Nature 400，173-177)。
我们惊奇地发现，存在于高度有序、重复阵列中的自体分子或自身 抗原能够有效地诱发自体特异性免疫应答，特别是抗体应答。而且，甚 至在没有非特异性激活抗原递呈细胞和其它免疫细胞的佐剂时，也能诱 发这种应答。
发明概述
本发明提供包含高度有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物， 及其生产方法和用途。因此，本发明的组合物可用于生产预防传染性疾 病、治疗变态反应和癌症、有效诱发自体特异性免疫应答、特别是抗体 应答的疫苗。
第一方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1) 非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；(ii)包含至少一 个第一附着位点的形成体(organizer)，其中该形成体与该核心颗粒通过 至少一个共价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种自身抗原或其片段， 具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非 天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。 通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发明提 供一种有序、重复的自身抗原阵列。因此，通过第一附着位点与第二附 着位点的结合，自身抗原或自身抗原决定簇与非天然分子支架结合在一 起，形成一种有序、重复的抗原阵列。
第二方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒和(ii)包含至少 一个第一附着位点的形成体，其中该核心颗粒是一种病毒样颗粒，包含 一种噬菌体的重组蛋白或其片段，其中该形成体与该核心颗粒通过至少 一个共价键连接。该抗原或抗原决定簇具有至少一个第二附着位点，该 位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；(ii)该抗 原或抗原决定簇天然存在的附着位点。通过第二附着位点与第一附着位 点经由至少一个非肽键结合，本发明提供一种有序、重复的抗原阵列。
第三方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，和(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天 然分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1) 非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和(ii)具有至少 一个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗粒通过至少一个 共价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种淀粉样β肽(Aβ1-42)或其片段， 具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非 天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点。 通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发明提 供一种有序、重复的抗原阵列。
第四方面，本发明提供一种新型组合物，它包含或由下列成分组成： (A)一种非天然分子支架，(B)一种抗原或抗原决定簇。这种非天然 分子支架包含或由下列成分组成：(i)一种核心颗粒，其选自：(1)非 天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和(ii)具有至少一 个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗粒通过至少一个共 价键连接。该抗原或抗原决定簇是一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片 段，具有至少一个第二附着位点，该位点选自：(i)该抗原或抗原决定 簇非天然存在的附着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位 点。通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发 明提供一种有序、重复的抗原阵列。
在下文中，特别是通过发明详述、实施例和权利要求书，本发明的 其它方面以及优选实施方案和优点将更加明显。
在本发明的一个优选实施方案中，核心颗粒是一种包含RNA-噬菌 体重组蛋白的病毒样颗粒，这种蛋白优选地选自：a)噬菌体Qβ；b)噬 菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2； g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1) 噬菌体PP7。最优选的是噬菌体Qβ和噬菌体fr。
在本发明的另一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的重组蛋白包括野 生型外壳蛋白。
在本发明的又一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的重组蛋白包括突 变的外壳蛋白。
在另一个实施方案中，核心颗粒包含或由一种或多种不同的肝炎核 心(衣壳)蛋白(HBcAg)组成。在一个相关实施方案中，这些HBcAg 的一个或多个半胱氨酸残基缺失，或被置换为另一种氨基酸残基(例如 丝氨酸残基)。在一个具体实施方案中，用来制备本发明的组合物的 HBcAg的半胱氨酸残基(对应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基48和 107)缺失，或被置换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
此外，用来制备本发明组合物的HBcAg变体通常是保持与其它 HBcAg结合的能力的变体，它们能形成二聚体或多聚体结构，呈现有序、 重复的抗原或抗原决定簇阵列。
在另一个实施方案中，非天然分子支架包含或由下列成分组成：由 菌毛蛋白产生的或从细菌中收获的菌毛或菌毛样结构。当利用菌毛或菌 毛样结构制备本发明的组合物时，它们可以由细菌细胞中天然存在的、 但是通过遗传工程(例如通过同源重组)修饰的菌毛蛋白基因或导入这 些细胞中的菌毛蛋白基因的产物组成。
在一个相关实施方案中，核心颗粒包含或由下列成分组成：由菌毛 蛋白制备的或从细菌中收获的菌毛或菌毛样结构。这些核心颗粒可以由 细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因的产物组成。
在一个特别实施方案中，形成体可包含至少一个第一附着位点。第 一和第二附着位点是本发明组合物的特别重要的元件。在本发明的不同 实施方案中，第一和/或第二附着位点可以是抗原和其抗体或抗体片段； 生物素和亲和素(avidin)；链霉亲和素和生物素；受体与其配体；配体结 合蛋白与其配体；相互作用的亮氨酸拉链多肽；氨基和对其有反应性的 化学基团；羧基和对其有反应性的化学基团；巯基和对其有反应性的化 学基团；或它们的组合。
在另一个优选的实施方案中，该组合物还包含一个氨基酸接头。该 氨基酸接头优选地包含或由第二附着位点组成。第二附着位点分别介导 抗原与核心颗粒的定向且有序的缔合和结合。氨基酸接头的一个重要功 能是进一步确保第二附着位点的适当展示和可接近性，从而促进抗原与 核心颗粒的结合，特别是通过化学交联结合。氨基酸接头的另一个重要 特性是进一步确保第二附着位点的最佳可接近性，特别是反应性。氨基 酸接头的这些特性对于蛋白质抗原来说更重要。
在另一个优选实施方案中，氨基酸接头选自：(a)CGG；(b)N端 γ1-接头；(c)N端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N端甘氨酸接头；(f) (G)kC(G)n，n＝0-12，k＝0-5；(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；(h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；(i)GGC；(k) GGC-NH2；(1)C端γ1-接头；(m)C端γ3-接头；(n)C端甘氨酸接头； (o)(G)nC(G)k，n＝0-12，k＝0-5；(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；(q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
甘氨酸接头和甘氨酸丝氨酸接头的一个重要特性是其柔性，特别是 其结构柔性，这允许形成多种构象，不倾向于折叠为可阻止第二附着位 点可接近性的结构。因为甘氨酸接头和甘氨酸丝氨酸接头不含或只含数 量有限的侧链残基，它们与抗原广泛相互作用的倾向小，从而进一步确 保第二附着位点的可接近性。甘氨酸丝氨酸接头内的丝氨酸残基使这些 接头的溶解度提高。因此，本发明的内容中也包括将一个或两个氨基酸， 特别是极性或带电氨基酸残基，串联或分开插入甘氨酸或甘氨酸丝氨酸 接头中。
在又一个优选的实施方案中，氨基酸接头是GGC-NH2、GGC-NMe、 GGC-N(Me)2、GGC-NHET或GGC-N(Et)2，其中GGC半胱氨酸残基的 C端被酰胺化。特别是对于肽抗原，尤其是具有第二附着位点的抗原或 抗原决定簇包含Aβ肽或其片段的实施方案中，优选这些氨基酸接头。 特别优选的是GGC-NH2。在另一个实施方案中，氨基酸接头是一种免 疫球蛋白(Ig)铰链区。Ig铰链区的片段以及用甘氨酸残基修饰的Ig铰 链区也属于本发明的范围内。优选地，Ig铰链区只含一个半胱氨酸残基。 应当理解，Ig铰链区氨基酸接头的该单一半胱氨酸残基可位于接头序列 内的几个位点处，本领域技术人员在本发明指导下将知道如何选择它 们。
在一个实施方案中，本发明提供将几乎所有选择的抗原与病毒、细 菌菌毛、细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒或病毒衣壳颗 粒表面偶联的方法。为了产生针对所展示的抗原的高效免疫应答，即接 种，本发明通过使一种抗原形成准晶体“病毒样”结构，利用宿主的强烈 抗病毒免疫反应。
在另一个实施方案中，抗原可以选自：(1)适于诱发抗癌细胞免疫 应答的蛋白质；(2)适于诱发抗传染病免疫应答的蛋白质；(3)适于诱 发抗变应原免疫应答的蛋白质；(4)适于诱发强抗自身抗原应答的蛋白 质；和(5)适于在家畜或宠物中诱发免疫应答的蛋白质。在另一个实 施方案中，第一附着位点和/或第二附着位点选自：(1)遗传工程赖氨酸 残基和(2)遗传工程半胱氨酸残基，这两种残基可以通过化学方法连 接在一起。
在又一个优选的实施方案中，第一附着位点包含或者是一个氨基， 第二附着位点包含或者是一个巯基。优选地，第一附着位点包含或者是 一个赖氨酸残基，而第二附着位点包含或者是一个半胱氨酸残基。
本发明也包括如下的实施方案：形成体颗粒只有一个第一附着位点， 抗原或抗原决定簇只有一个第二附着位点。因此，当用这种实施方案制 备有序、重复的抗原阵列时，每个形成体将与一个抗原或抗原决定簇结 合。
另一方面，本发明提供包含或由下列成分组成的组合物：(a)一种 非天然分子支架，其包含：(i)一种核心颗粒，其选自非天然来源的核 心颗粒和天然来源的核心颗粒；(ii)包含至少一个第一附着位点的形成 体，其中该核心颗粒包含或由下列成分组成：病毒样颗粒、细菌菌毛、 菌毛样结构或修饰的HBcAg或其片段，而该形成体与该核心颗粒通过 至少一个共价键连接；(b)具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决 定簇，该第二附着位点选自：(i)该抗原或抗原决定簇非天然存在的附 着位点；(ii)该抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中第二附着 位点能够通过至少一个非肽键与第一附着位点结合，而抗原或抗原决定 簇与支架通过结合相互作用，形成一种有序、重复的抗原阵列。
本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法和应用此处 所述疫苗组合物的医学治疗方法。
应当理解，以上的概述和下面的详述都只是代表性和说明性的，旨 在进一步说明如权利要求所限定的本发明。
另一方面，本发明提供一种组合物，它包含通过共价键与磷脂酶A2 蛋白或其片段连接的噬菌体Qβ外壳蛋白。在一个优选实施方案中，磷 脂酶A2蛋白或其片段与噬菌体Qβ外壳蛋白通过共价键相互作用，形成 一种有序、重复的抗原阵列。在另一个优选实施方案中，该共价键不是 肽键。在另一个优选实施方案中，磷脂酶A2蛋白包含选自下列的氨基酸： SEQ ID NO：168的氨基酸序列、SEQ ID NO：169的氨基酸序列、SEQ ID NO：170的氨基酸序列、SEQ ID NO：171的氨基酸序列、SEQ ID NO： 172的氨基酸序列、SEQ ID NO：173的氨基酸序列、SEQ ID NO：174 的氨基酸序列和SEQ ID NO：175的氨基酸序列。
本发明也提供一种生产该组合物的方法，包括将噬菌体Qβ外壳蛋白 与磷脂酶A2蛋白组合，其中噬菌体Qβ外壳蛋白与磷脂酶A2蛋白相互 作用，形成一种抗原阵列。
另一方面，本发明也提供一种组合物，其包含一种含有噬菌体Qβ 外壳蛋白的非天然分子支架，和一种含有至少一个第一附着位点的形成 体，其中该形成体与噬菌体Qβ外壳蛋白通过至少一个共价键连接；和 具有至少一个第二附着位点的磷脂酶A2蛋白或其片段或其变体，该第二 附着位点选自：磷脂酶A2蛋白或其片段非天然存在的附着位点；磷脂酶 A2蛋白或其片段天然存在的附着位点，其中该第二附着位点与第一附着 位点通过至少一个非肽键结合，而抗原或抗原决定簇与支架通过这种结 合相互作用，形成一种有序、重复的抗原阵列。在一个优选实施方案中， 磷脂酶A2蛋白包含选自下列的氨基酸：SEQ ID NO：168的氨基酸序列、 SEQ ID NO：169的氨基酸序列、SEQ ID NO：170的氨基酸序列、SEQ ID NO：171的氨基酸序列、SEQ ID NO：172的氨基酸序列、SEQ ID NO： 173的氨基酸序列、SEQ ID NO：174的氨基酸序列和SEQ ID NO：175 的氨基酸序列。
本发明也提供一种生产该组合物的方法，包括将噬菌体Qβ外壳蛋白 与磷脂酶A2蛋白组合，其中噬菌体Qβ外壳蛋白与磷脂酶A2蛋白相互 作用，形成一种抗原阵列。该抗原阵列优选地是有序和/或重复的。
本发明也提供一种药物组合物，其包含磷脂酶A2蛋白和一种药物可 接受的载体。本发明也提供一种包含磷脂酶A2蛋白的疫苗组合物。在一 个优选实施方案中，权利要求31的疫苗组合物还包含至少一种佐剂。
本发明也提供一种治疗蜂毒引起的变态反应的方法，包括对患者施 用所述药物组合物或疫苗组合物。这种施用的结果是，患者显示对蜂毒 的免疫应答降低。
本发明也涉及一种疫苗，它通过诱导抗淋巴毒素β、抗淋巴毒素α或 抗淋巴毒素β受体抗体，用来预防朊病毒介导的疾病。该疫苗含有对于 被免疫的人或动物而言外源的蛋白质载体，该载体与淋巴毒素β或其片 段、淋巴毒素α或其片段或淋巴毒素β受体或其片段偶联。给人或动物注 射该疫苗，以便诱导对内源淋巴毒素β、淋巴毒素α或淋巴毒素β受体特 异的抗体。诱导的抗淋巴毒素β、淋巴毒素α或抗淋巴毒素β受体抗体减 少或清除了淋巴器官中存在的滤泡状树突细胞库。由于在没有滤泡状树 突细胞的情况下，朊病毒在淋巴器官中的复制以及向中枢神经系统的转 运受到影响，这种治疗抑制了朊病毒介导的疾病的发展。另外，阻断淋 巴毒素β对自身免疫病(如I型糖尿病)患者有益。
附图简述
图1A-1C：用于表达本发明抗原的模块真核表达载体；
图2A-2C：抵抗素的克隆、表达以及与Qβ衣壳蛋白的偶联；
图3A-3B：为了与病毒样颗粒和菌毛偶联，淋巴毒素β构建体的克隆 和表达。
图4A-4B：MIF构建体的克隆、表达以及与Qβ衣壳蛋白的偶联。
图4C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF蛋白免疫的小鼠血清中， MIF特异的IgG抗体的ELISA分析。
图5：通过SDS-PAGE分析的，MIF构建体与fr衣壳蛋白以及与 HBcAg-lys-2Cys-Mut衣壳蛋白的偶联。
图6：人C-RANKL的克隆与表达。
图7：朊病毒蛋白的克隆与表达。
图8A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio I”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio II”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio III”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图8D：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的血管紧张肽免疫的小鼠血清中， “Angio IV”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图9A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der pI肽免疫的小鼠血清中， “Der pI p52”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图9B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der pI肽免疫的小鼠血清中， “Der pI p117”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图10A：在利用与I型菌毛蛋白偶联的人VEGFR II肽和人VEGFR II 胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II肽特异的IgG抗体的ELISA分 析。
图10B：在利用与I型菌毛蛋白偶联的人VEGFR II肽和人VEGFR II 胞外域免疫的小鼠血清中，人VEGFR II胞外域特异的IgG抗体的ELISA 分析。
图11：在对全长HBc-TNF免疫的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特异 的IgG抗体的ELISA分析。
图12：在利用与3’TNF II肽偶联的2cysLys-mut HBcAgl-149免疫 的小鼠血清中，抗-TNFα蛋白特异的IgG抗体的ELISA分析。
图13A：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13B：“Aβ33-42”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13C：“Aβ1-27”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图13D：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂Sulfo-GMBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图13E：“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白利用交联剂Sulfo-MBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图14A：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-15”免疫的小鼠血清中， “Aβ1-15”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图14B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”免疫的小鼠血清中， “Aβ1-27”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图14C：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ33-42”免疫的小鼠血清中， “Aβ33-42”特异的IgG抗体的ELISA分析。
图15A：pCC2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图15B：pCA2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图15C：pCB2与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图16：朊病毒肽与Qβ衣壳蛋白的偶联；SDS-PAGE分析。
图17A：IL-5在细菌中表达的SDS-PAGE分析。
图17B：IL-5和IL-13在真核细胞中表达的Western-Blot分析。
图18A：鼠VEGFR-2肽与菌毛偶联的SDS-PAGE分析。
图18B：鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图18C：鼠VEGFR-2肽与HBcAg-lys-2cys-Mut偶联的SDS-PAGE 分析。
图18D：在利用与菌毛偶联的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血清中，鼠 VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图18E：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽免疫的小鼠血 清中，鼠VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图18F：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut偶联的鼠VEGFR-2肽免疫 的小鼠血清中，鼠VEGFR-2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图19A：Aβ1-15肽与HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣壳蛋白偶联的 SDS-PAGE分析。
图19B：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut或fr衣壳蛋白偶联的Aβ1-15 肽免疫的小鼠血清中，Aβ1-15特异的IgG抗体的ELISA分析。
图20：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的人Aβ肽免疫的转基因APP23 小鼠血清中，人Aβ特异的IgG抗体的ELISA分析。
图21：Fab抗体片段与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图22A：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂sulfo GMBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图22B：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂sulfo MBS偶联的 SDS-PAGE分析。
图22C：flag肽与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联的 SDS-PAGE分析。
图22D：PLA2-cys蛋白与突变Qβ衣壳蛋白利用交联剂SMPH偶联 的SDS-PAGE分析。
图23：利用与突变Qβ衣壳蛋白和fr衣壳偶联的M2肽免疫的ELISA 分析。
图24：DER p1，2肽与突变Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析。
图25A：利用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2对过敏小鼠的脱敏：温 度测量。
图25B：利用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2-cys对过敏小鼠的脱敏： IgG 2A和IgE效价。
图26：PLA2-cys与Qβ衣壳蛋白偶联的SDS-PAGE分析和 Western-blot分析。
图27A：在利用与HBcAg-lys-2cys-Mut、Qβ衣壳蛋白、fr衣壳蛋白、 HBcAg-lys-1-183偶联的M2肽和与HBcAg 1-183融合的M2肽免疫的小 鼠血清中，M2肽特异的IgG抗体的ELISA分析。
图28A：抗独特型IgE mimobody VAE051与Qβ衣壳蛋白偶联的 SDS-PAGE分析。
图28B：在利用与Qβ衣壳蛋白偶联的VAE051免疫的小鼠血清中， 抗独特型抗体VAE051和人IgE特异的Ig抗体的ELISA分析。
发明详述
1.定义
甲病毒：如此处所用的，术语“甲病毒”是指甲病毒属所包括的所有 RNA病毒。Strauss和Strauss，Microbiol.Rev.，58：491-562(1994)中描 述了该属的成员。甲病毒的例子包括：奥拉病毒、比巴鲁病毒、犰狳病 毒、屈曲病毒、东方马脑炎病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、克泽拉格齐 病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎博病毒、恩杜姆病毒、皮克孙 纳病毒、托纳特病毒、特里尼蒂病毒、乌纳病毒、西方马脑炎病毒、沃 达罗河病毒、辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞 拉马脑炎病毒(VEE)和罗斯河病毒。
抗原：如此处所用的，术语“抗原”是能够被抗体结合的分子。抗原 还能诱发体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-淋巴细胞和/或T-淋 巴细胞的产生。抗原可能含有一种或多种表位(B-表位和T-表位)。上 述特异反应的含义是，抗原将以高度选择性的方式与其相应抗体反应， 而不与其它抗原诱导产生的多数其它抗体反应。
抗原决定簇：如此处所用的，术语“抗原决定簇”是指被B-淋巴细胞 或T-淋巴细胞特异识别的抗原部分。B-淋巴细胞通过产生抗体对外源抗 原决定簇起反应，而T-淋巴细胞是细胞免疫的介体。因此，抗原决定簇 或表位是被抗体识别的抗原部分，或者对于MHC而言，是被T细胞受 体识别的抗原部分。
结合：如此处所用的，当用于第一和第二附着位点时，术语“结合” 是指至少一个非肽键。结合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极 性的或它们的任何组合。
第一附着位点：如此处所用的，短语“第一附着位点”是指“形成体” 的一个元件，它本身以非随机方式与核心颗粒结合，位于抗原或抗原决 定簇上的第二附着位点可以与它结合。第一附着位点可以是蛋白质、多 肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化 合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰 氟)或其组合，或其化学反应性基团。在重复构型中，非天然分子支架 表面上存在多个第一附着位点。
第二附着位点：如此处所用的，短语“第二附着位点”是指与抗原或 抗原决定簇有关的一种元件，位于非天然分子支架表面上的“形成体”的 第一附着位点可以与之结合。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是 蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或 化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺 酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少 一个第二附着位点。因此，术语“含有至少一个第二附着位点的抗原或抗 原决定簇”是指至少包含抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗 原结构。然而，尤其是对于非天然存在于抗原或抗原决定簇内的第二附 着位点，这些抗原或抗原结构包含一种“氨基酸接头”。这种氨基酸接头， 或者在本说明书中也称为“接头”，可结合抗原或抗原决定簇和第二附着 位点，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，一般但不是必 须-是一个氨基酸残基，优选地是半胱氨酸残基。然而，如此处所用的 术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成， 尽管由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨 基酸接头中的氨基酸残基优选地由本领域公知的天然存在的氨基酸或 非天然氨基酸组成，均为L型或均为D型或是其混合物。然而，本发明 也包括含有带巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。这种分子优选 地包含C1-C6烷基-、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。抗原或抗 原决定簇或任选地第二附着位点优选地通过至少一个共价键与氨基酸 接头结合，更优选地通过至少一个肽键结合。
结合的：如此处所用的，术语“结合的”是指结合或附着，其可以是 共价的，例如化学偶联，或是非共价的，例如离子相互作用、疏水作用、 氢键等。共价键可以是，例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳 -硫键、碳-磷键等。术语“结合的”比例如“偶联的”、“融合的”和“附着的” 等术语更加广义，并且包括后者。
核心颗粒：如此处所用的，术语“核心颗粒”是指具有固有的重复组 织的刚性结构，它为“形成体”的附着提供基础。如此处所用的核心颗粒 可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
外壳蛋白：如此处所用的，术语“外壳蛋白”是指能参加噬菌体或 RNA-噬菌体衣壳装配的噬菌体或RNA-噬菌体的蛋白质。然而，当指 RNA-噬菌体外壳蛋白基因的特定基因产物时，使用术语“CP”。例如， RNA-噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物被称作“Qβ CP”，而噬 菌体Qβ的“外壳蛋白”包括“Qβ CP”以及A1蛋白。
顺式作用：如此处所用的，术语“顺式作用”序列是指复制酶与之结 合从而催化RNA分子的RNA依赖性复制的核酸序列。这些复制事件导 致全长和部分RNA分子复制，因此，甲病毒亚基因组启动子也是一种“顺 式作用”序列。顺式作用序列可以位于或靠近核酸分子的5’端、3’端或两 端，以及内部。
融合：如此处所用的，术语“融合”是指通过其编码核苷酸序列的阅 读框内组合不同来源的氨基酸序列组合在一条多肽链中。术语“融合”除 了与其末端之一融合之外，显然还包括内部融合，即不同来源的序列插 入多肽链内。
异源序列：如此处所用的，术语“异源序列”是指本发明载体中存在 的第二核苷酸序列。术语“异源序列”也指本发明的载体中包含的异源 DNA序列编码的任何氨基酸或RNA序列。异源核苷酸序列能编码通常 在含有该序列的细胞类型中表达的蛋白质或RNA分子，或在其中通常 不表达的分子(例如辛德毕斯结构蛋白)。
分离的：如此处所用的，当术语“分离的”用于分子时，该术语的含 义是，该分子已经从它的天然环境中移出。例如，活动物中自然存在的 多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与自然状态的共存物质分离的同一多 核苷酸或多肽是“分离的”。此外，对于本发明而言，载体中包含的重组 DNA分子被认为是分离的。分离的RNA分子包括DNA和RNA分子的 体内或体外RNA复制产物。分离的核酸分子还包括合成产生的分子。 另外，重组宿主细胞中包含的载体分子也是分离的。因此，不是所有“分 离的”分子都需要“纯化”。
免疫治疗剂：如此处所用的，术语“免疫治疗剂”是用于治疗疾病或 紊乱的组合物。更具体而言，该术语用来指变态反应的治疗方法或癌症 的治疗方法。
个体：如此处所用的，术语“个体”是指多细胞生物，包括植物和动 物。优选的多细胞生物是动物，更优选的是脊椎动物，更加优选的是哺 乳动物，最优选的是人。
低或不可检测的：如此处所用的，当用于基因表达水平时，短语“低 或不可检测的”是指表达水平显著低于该基因最大诱导时所见(例如，至 少低5倍)，或者通过下列实施例部分使用的方法不易检测到。
凝集素：如此处所用的，是指尤其从豆科植物的种子中，以及从其 它多种植物和动物来源获得的蛋白质，它们含有特定单糖或寡糖的结合 部位。例子包括伴刀豆球蛋白A和麦芽凝集素，它们在糖蛋白研究中广 泛用作分析和制备的试剂。
模拟位：如此处所用的，术语“模拟位”是指可诱发对抗原或抗原决 定簇的免疫应答的物质。术语模拟位一般用于特定抗原。例如，激发抗 磷脂酶A2(PLA2)抗体产生的肽是抗原决定簇的一种模拟位，该抗体 能与之结合。模拟位与其诱发的免疫应答所针对的抗原或抗原决定簇可 能有或者可能没有实质性结构相似性，或者共有或不共有结构特征。生 成和鉴定可诱发针对特定抗原或抗原决定簇之免疫应答的模拟位的方 法在本领域中公知，并在本文的其它部分描述。
天然来源：如此处所用的，术语“天然来源”的含义是其整体或部分 都不是合成的，而是天然存在或产生的。
非天然的：如此处所用的，该术语通常指不是来自自然的，更具体 而言，该术语是指来自人工的。
非天然来源：如此处所用的，术语“非天然来源”通常是指合成的或 者不是来自自然的，更具体而言，该术语是指来自人工的。
非天然分子支架：如此处所用的，短语“非天然分子支架”是指人工 制备的、可以用来产生第一附着位点的刚性、重复阵列的任何产物。理 想地但不是必须地，这些第一附着位点具有几何顺序。非天然分子支架 部分地或者整体上可以是有机或无机的，可以是化学合成的或通过生物 学方法合成的。非天然分子支架的组成为：(a)一种核心颗粒，是天然 或非天然来源的；和(b)一种形成体，其本身包含至少一个第一附着 位点，并与核心颗粒通过至少一个共价键连接。在一个特别实施方案中， 非天然分子支架可以是病毒、病毒样颗粒、细菌菌毛、病毒衣壳颗粒、 噬菌体、其重组形式，或合成颗粒。
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列：如此处所用的，术语“有序、 重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的一种重复 模式，其特征在于抗原或抗原决定簇相对于非天然分子支架均匀地空间 排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。 合适的有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的例子是那些具有抗原或抗 原决定簇以5-15纳米间隔严格重复的次晶顺序的阵列。
形成体：如此处所用的，术语“形成体”是指以非随机方式与核心颗 粒结合的一种元件，它为产生有序、重复的抗原阵列提供成核位点。形 成体是包含至少一个第一附着位点的任何元件，它通过至少一个共价键 与核心颗粒结合。形成体可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸(即蛋白质、 多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或 化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺 酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。因此，形成体进一步确保形成 本发明的有序、重复的抗原阵列。在本发明的典型实施方案中，核心颗 粒例如通过遗传工程或化学反应修饰，产生包含核心颗粒和形成体的非 天然分子支架，其中形成体通过至少一个共价键与核心颗粒连接。然而 在本发明的某些实施方案中，选择的形成体为核心颗粒的一部分。因此， 对于这些实施方案，产生包含核心颗粒和形成体的非天然分子支架以及 确保形成有序、重复的抗原阵列不一定需要修饰核心颗粒。
许可温度：如此处所用的，短语“许可温度”是指一种酶具有相对高 水平的催化活性时的温度。
菌毛：如此处所用的，术语“菌毛”(单数为pilus)是指由蛋白质单 体(例如菌毛蛋白单体)组成的细菌细胞的胞外结构，它们是以有序、 重复的模式组织的。而且，菌毛是参与以下过程的结构：例如细菌细胞 与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的 例子包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。下文描述 了菌毛的其它例子。
菌毛样结构：如此处所用的，短语“菌毛样结构”是指具有类似于菌 毛的特征并且由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个例子是表 达修饰菌毛蛋白的细菌细胞形成的一种结构，该菌毛蛋白不形成与天然 菌毛基本相同的有序、重复的阵列。
多肽：如此处所用的，术语“多肽”是指由氨基酸残基，通常是天然 氨基酸残基，通过肽键连接在一起组成的聚合物。尽管多肽不必限制其 大小，但是术语多肽通常用于大小约为10-50个氨基酸的肽。
蛋白质：如此处所用的，术语蛋白质是指大小一般为20个以上、尤 其是50个以上氨基酸残基的多肽。蛋白质一般具有确定的三维结构， 尽管它们不一定必须如此，通常称为折叠的，相反，通常不具有确定的 三维结构、而是采取大量不同构象的肽和多肽，称为非折叠的。蛋白质 的确定的三维结构对于核心颗粒与抗原之间的结合特别重要，这种结合 由第二附着位点介导，特别是利用化学交联剂通过第一与第二附着位点 之间的化学交联。在本发明的某些方面，氨基酸接头也与蛋白质的结构 特征密切相关。
纯化的：如此处所用的，当术语“纯化的”用于一种分子时，它的含 义是被纯化的该分子相对于自然环境中与它结合的分子浓度提高。自然 结合的分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖，但一般不包括为了保持完整 性或有利于分子纯化而添加的水、缓冲液和试剂。例如，在oligo dT柱 层析中，即使mRNA用水溶剂稀释，如果自然结合的核酸和其它生物分 子不与该柱结合并与目的mRNA分子分离，则该mRNA分子通过这种 层析被纯化。
受体：如此处所用的，术语“受体”是指能与被称为配体的另一种分 子相互作用的蛋白质或糖蛋白或其片段。配体可属于任何类别的生物化 学或化学化合物。受体不一定必须是膜结合蛋白。可溶性蛋白，例如麦 芽糖结合蛋白或视黄醇结合蛋白，也是受体。
残基：如此处所用的，术语“残基”的含义是多肽骨架或侧链中的特 定氨基酸。
重组宿主细胞：如此处所用的，术语“重组宿主细胞”是指已经导入 一种或多种本发明的核酸分子的宿主细胞。
重组病毒：如此处所用的，短语“重组病毒”是指人工遗传修饰的病 毒。该短语包括本领域公知的所有病毒。更具体而言，该短语是指人工 遗传修饰的甲病毒，最具体而言，该短语是指人工遗传修饰的辛德毕斯 病毒。
限制性温度：如此处所用的，短语“限制性温度”是指一种酶具有水 平较低或不可检测的催化活性时的温度。“热”和“冷”敏感性突变体均周 知，因此，限制性温度可高于或低于许可温度。
RNA依赖性RNA复制事件：如此处所用的，短语“RNA依赖性RNA 复制事件”是指用一种RNA分子作为模板导致一种RNA分子形成的过 程。
RNA依赖性RNA聚合酶：如此处所用的，短语“RNA依赖性RNA 聚合酶”是指催化由一种RNA分子产生另一种RNA分子的聚合酶。该 术语在此与术语“复制酶”同义。
RNA-噬菌体：如此处所用的，术语“RNA-噬菌体”是指感染细菌的 RNA病毒，优选地是指感染细菌的单链正义RNA病毒。
自身抗原：如此处所用的，术语“自身抗原”是指由宿主的DNA编码 的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物定义为自身的。 另外，两种或几种自体分子组合产生的蛋白质或是自体分子的一部分的 蛋白质，以及与上述自体分子具有高同源性(＞95％)的蛋白质，也可以 被认为是自身的。
温度敏感的：如此处所用的，短语“温度敏感的”是指一种酶，它在 一种温度下容易催化一种反应，但在另一种温度下催化同一反应较慢或 者根本不能催化。温度敏感酶的一个例子是pCYTts载体编码的复制酶 蛋白，在低于34℃的温度下它具有容易检测到的复制酶活性，在37℃ 时活性较低或检测不到。
转录：如此处所用的，术语“转录”是指在RNA聚合酶催化下，由 DNA模板产生RNA分子。
非翻译RNA：如此处所用的，短语“非翻译RNA”是指一种RNA序 列或分子，它不编码一种开放阅读框，或者编码一种开放阅读框或其部 分但为一种无法产生氨基酸序列的形式(例如不含起始密码子)。这类 分子的例子有tRNA分子、rRNA分子和核酶。
载体：如此处所用的，术语“载体”是指用来将遗传物质转移到宿主 细胞中的试剂(例如质粒或病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。
病毒样颗粒：如此处所用的，术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病 毒颗粒的结构。而且，本发明的病毒样颗粒是非复制型和非传染性的， 因为它缺乏所有或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制和感染成 分。本发明的病毒样颗粒可含有不同于其基因组的核酸。
噬菌体的病毒样颗粒：如此处所用的，术语“噬菌体的病毒样颗粒” 是指一种类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，是非复制型和非传染性的， 至少缺乏编码噬菌体复制机器的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或 进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括这样的噬菌体的病毒样 颗粒，其中上述基因仍然存在但是失活，因此，也产生非复制型和非传 染性的噬菌体病毒样颗粒。
病毒颗粒：如此处所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。 在某些病毒类型中，病毒颗粒包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的 具有附加的结构(例如被膜、尾等)。
一个：当本公开内容中使用术语“一个”(“one”，“a”，“an”)时，除 非另外说明，其含义是“至少一个”或“一个或多个”。
2.有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物及其制备方法
本发明提供包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物。此 外，本发明能使技术人员方便地构建有序、重复的抗原或抗原决定簇阵 列，用于不同的治疗目的，包括传染病的预防、变态反应的治疗和癌症 的治疗。
本发明的组合物基本包含或者由下列两种元件组成：(1)一种非天 然分子支架；和(2)一种抗原或抗原决定簇，它含有至少一个第二附 着位点，该位点能通过至少一个非肽键与第一附着位点结合。
本发明的组合物也包含或者由下列成分组成：直接连接了抗原或抗 原决定簇的细菌菌毛蛋白。
这种非天然分子支架包含或者由下列元件组成：(a)一种核心颗粒， 其选自：(1)非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的核心颗粒；和 (b)至少包含一个第一附着位点的形成体，其中该形成体与该核心颗 粒通过至少一个共价键连接。
本发明的组合物也包含或者由下列成分组成：直接连接了抗原或抗 原决定簇的核心颗粒。
该抗原或抗原决定簇含有至少一个第二附着位点，该位点选自：(a) 该抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；(b)该抗原或抗原决定簇 天然存在的附着位点。
通过第二附着位点与第一附着位点经由至少一个非肽键结合，本发 明提供一种有序、重复的抗原阵列。因此，通过第一附着位点与第二附 着位点的这种结合，抗原或抗原决定簇与非天然分子支架结合在一起， 形成一种有序、重复的抗原阵列。
技术人员可以特别设计抗原或抗原决定簇和第二附着位点，使得与 非天然分子支架-或者在某些实施方案中与核心颗粒-结合的所有抗原或 抗原决定簇的排列是均一的。例如，可以将单一的第二附着位点置于抗 原或抗原决定簇的羧基端或氨基端，从而通过设计确保与非天然分子支 架附着的所有抗原或抗原决定簇分子都以统一的方式定位。因此，本发 明提供了一种以形成重复模式的方式将任何抗原或抗原决定簇以确定 的顺序置于非天然分子支架上的便利方法。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技 术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白在 原核和真核细胞中的表达，等等。这些方法是本领域技术人员周知的， 在出版的实验室方法手册中可以方便地查到(例如：Sambrook，J.等人编 写的《分子克隆：实验室手册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分 子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。采用组织培养细 胞系进行研究的基本实验室技术(Celis，J.编写的《细胞生物学》， Academic Press，第2版，(1998))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane， D.，《抗体：实验室手册》；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，《酶学方法》， 128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，“蛋白质纯化原理 与实践”，第3版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有充 分描述，这些文献均在此引用作为参考。
A.核心颗粒和非天然分子支架
本发明的某些组合物的一种元件是一种非天然分子支架，其包含或 者由一种核心颗粒和一种形成体组成。如此处所用的，短语“非天然分子 支架”是指可以用来提供第一附着位点的刚性、重复阵列的任何人工生产 的产物。更具体而言，非天然分子支架包含或由下列元件组成：(a)一 种核心颗粒，其选自：(1)非天然来源的核心颗粒和(2)天然来源的 核心颗粒；和(b)包含至少一个第一附着位点的形成体，其中该形成 体与该核心颗粒通过至少一个共价键连接。
本领域技术人员容易认识到，本发明非天然分子支架的核心颗粒不 限于任何特定形式。核心颗粒可以是有机或无机的，可以是化学合成或 通过生物学方法合成的。
在一个实施方案中，非天然核心颗粒可以是一种合成的聚合物、脂 微团或金属。这种核心颗粒是本领域周知的，为建立本发明的新型非天 然分子支架提供基础。例如，美国专利号5,770,380描述了合成聚合物 或金属核心颗粒，公开了与多个肽环连接的calixarene有机支架在生产 “拟抗体”中的用途，美国专利号5,334,394描述了用作病毒诱饵的纳米晶 体颗粒，它由多种无机材料组成，包括金属或陶瓷。合适的金属包括铬、 铷、铁、锌、硒、镍、金、银、铂。该实施方案中合适的陶瓷材料包括 二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化钌和氧化锡。该实施方案的核心颗 粒可以由包括碳(金刚石)在内的有机物制成。合适的聚合物包括聚苯 乙烯、尼龙和硝化纤维素。对于这种类型的纳米晶体颗粒，也可以使用 由氧化锡、二氧化钛或碳(金刚石)制成的颗粒。脂微团可以用本领域 周知的任何方法制备。例如，微团可以通过下列方法制备：Baiselle和 Millar(Biophys.Chem.4：355-361(1975))或Corti等人(Chem.Phys. Lipids 38：197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426：314-318(1998)) 或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.213：29-35(1999))或 Morein等人(Nature 308：457-460(1984))的方法，这些文献均在此 引用作为参考。
核心颗粒也可以通过生物学方法生产，可以是天然的或非天然的。 例如，这种实施方案可以包括一种包含或者由病毒、病毒样颗粒、细菌 菌毛、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式组成的核心颗粒。在一个更 具体的实施方案中，核心颗粒可以包含或者由下列成分组成：轮状病毒 的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、形成细菌菌 毛或菌毛样结构的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重 组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白(例如HBcAg)、烟草花叶病毒的重 组蛋白、禽兽棚病毒的重组蛋白和人乳头瘤病毒的重组蛋白。核心颗粒 还可包含或由下列成分组成：这些蛋白质的一个或多个片段，以及这些 蛋白质的变体，它们保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或抗原决定 簇阵列的能力。
如下文更详细地说明的，保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或 抗原决定簇阵列的能力的蛋白质变体与它们的野生型对应物在氨基酸 水平上可能有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。 以含有SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的HBcAg为例说明，本发明包 括含有HBcAg多肽的疫苗组合物，该HBcAg多肽包含或者由下列成分 组成：与SEQ ID NO：89所示氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列，和必要时加工除去N端前导序列的蛋白 质形式。这些变体通常能够结合形成二聚体或多聚体结构。能用来确定 蛋白质是否形成这种结构的方法包括凝胶过滤、琼脂糖凝胶电泳、蔗糖 梯度离心和电子显微镜术(例如：Koschel，M.等人，J.Virol 73：2153-2160 (1999))。
保留彼此结合、形成有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列能力的蛋 白质片段可以包含或由下列多肽组成：长度为15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190或200个氨基酸的多肽。这类蛋白质片 段的例子包括此处所述的适于制备核心颗粒和/或非天然分子支架的蛋 白质片段。
无论是天然的还是非天然的，本发明的核心颗粒通常具有一种形成 体，它通过至少一个共价键与天然或非天然核心颗粒连接。该形成体是 一种以非随机方式与核心颗粒结合的元件，为产生有序、重复的抗原阵 列提供核化位点。理想地，但不是必需的，该形成体与核心颗粒以几何 顺序结合。该形成体至少包含一个第一附着位点。
在本发明的一些实施方案中，有序、重复的阵列通过(1)核心颗粒 或非天然分子支架与(2)(a)一种抗原或抗原决定簇或(b)一种或多 种抗原或抗原决定簇之间的结合而形成。例如，细菌菌毛或菌毛样结构 由组织成有序、重复结构的蛋白质组成。因此，在许多情况下，通过将 这些成分与细菌菌毛或菌毛样结构直接连接或通过一种形成体连接，能 形成抗原或抗原决定簇的有序阵列。
如前所述，形成体可以是包含至少一个第一附着位点的任何元件， 它通过至少一个共价键与核心颗粒结合。形成体可以是蛋白质、多肽、 肽、氨基酸(即蛋白质、多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合 成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、毛地黄毒 苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或其化学反应性基团。在一 个更具体的实施方案中，形成体可包含第一附着位点，包括：抗原、抗 体或抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、 配体结合蛋白、相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、对氨基有反应性的 化学基团、羧基、对羧基有反应性的化学基团、巯基、对巯基有反应性 的化学基团，或它们的组合。
在一个实施方案中，非天然分子支架的核心颗粒包含一种病毒、细 菌菌毛、由细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳 颗粒或其重组形式。可以选择本领域周知的具有有序且重复的外壳和/ 或核心蛋白结构的任何病毒作为本发明的非天然分子支架。合适的病毒 的例子包括：辛德毕斯病毒和其它甲病毒、弹状病毒(例如水泡性口炎 病毒)、小核糖核酸病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)、披膜病毒(例 如风疹病毒)、正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、禽瘟病毒)、 多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、鸟多瘤病毒BFDV)、细 小病毒、轮状病毒、噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体M11、噬菌体MX1、 噬菌体NL95、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2、噬菌 体f2、噬菌体PP7、诺沃克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎 病毒、烟草花叶病毒、禽兽棚病毒和人乳头瘤病毒(例如，参见Bachman， M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17：553-558(1996)中的表1)。
在一个实施方案中，本发明利用病毒的基因工程产生有序、重复的 病毒被膜蛋白与包含所选择的异源蛋白质、肽、抗原决定簇或反应性氨 基酸残基的形成体的融合体。在非天然分子支架的构建中可以包括本领 域技术人员周知的其它遗传操作；例如，可希望通过遗传突变限制重组 病毒的复制能力。选择用于与形成体(即第一附着位点)蛋白融合的病 毒蛋白应当具有组织的、重复的结构。这种组织的、重复的结构包括在 病毒表面上间隔5-15nm的次晶组织。这种融合蛋白的产生将在病毒表 面产生多个有序、重复的形成体。因此，由此产生的第一附着位点的有 序、重复组织反映天然病毒蛋白的正常结构。
如将在本说明书中更详细地描述的，在本发明的另一个实施方案中， 非天然分子支架是一种重组甲病毒，更具体而言，是一种重组辛德毕斯 病毒。甲病毒是正链RNA病毒，在感染细胞的细胞质中完整地复制其 基因组RNA，而没有DNA中间产物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol. Rev.58：491-562(1994))。甲病毒家族的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong， C.等人，Science 243：1188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol. 11：18-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestr_m，P.& Garoff， H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))和其它病毒(Davis，N.L.等 人，Virology 171：189-204(1989))，作为多种不同蛋白质的基于病 毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8：578-582(1997)； Liljestr_m，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))以及作为研 制疫苗的候选物，已经受到极大的关注。最近，颁布了一些关于甲病毒 在异源蛋白质表达和疫苗研制中应用的专利(参见美国专利号 5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245和5,814,482)。本发明的 甲病毒支架的构建可以利用重组DNA技术领域周知的方法进行，如上 述文章所述，在此引用作为参考。
能够利用多种不同的重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒，用于 抗原或抗原决定簇附着。例如，已知甲病毒具有广泛的宿主范围；辛德 毕斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞、以及某些昆 虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51：645(1973)；Leake，C.，J.Gen. Virol.35：335(1977)；Stollar，V.，《披膜病毒》，R.W.Schlesinger编， Academic Press，(1980)，583-621页)。因此，在本发明的实施过程中可 使用大量重组宿主细胞。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO细胞特别适 于生产异源蛋白质，因为它们具有以类似于人类细胞的方式糖基化异源 蛋白质的能力(Watson，E.等人，Glycobiology 4：227，(1994))，并且能 够被选择(Zang，M.等人，Bio/Technology 13：389(1995))或遗传改造 (Renner W.等人，Biotech.Bioeng.4：476(1995)；Lee K.等人，Biotech. Bioeng.50：336(1996))以在无血清培养基及悬液中生长。
向宿主细胞中导入多核苷酸载体能够利用标准实验室手册所述的方 法完成(参见，例如：Sambrook，J.等人编写的《(分子克隆：实验室手册》， 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)，第9章；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如电穿孔、DEAE-葡聚糖 介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂介导的转染、转导、刮刀载入、 冲击导入、感染等方法。Felgner，P.等人的美国专利5,580,859描述了向 宿主细胞中导入外源DNA序列的方法。
也可以用包装的RNA序列感染宿主细胞。通过将这些包装的RNA 序列添加到培养基中，能将它们导入宿主细胞中。例如，多篇文献资料 中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括“辛德毕斯病毒表达系统”， C版(Invitrogen目录号K750-1)。
当采用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒 时，这些细胞通常在组织培养物中生长。在培养物中培养细胞的方法在 本领域众是周知的(参见，例如：Celis，J.编写的《细胞生物学》，Academic Press，第2版，(1998)；Sambrook，J.等人编写的《(分子克隆：实验室手 册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞的培养》，Alan R.Liss，Inc. (1983))。
本领域技术人员可以理解，第一附着位点可以是能使选择的抗原或 抗原决定簇与非天然分子支架特异结合的任何合适的蛋白质、多肽、糖、 多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合， 或是它们的一部分。在一个实施方案中，附着位点是可选自本领域周知 范围的蛋白质或肽。例如，第一附着位点可选自：配体、受体、凝集素、 亲和素、链霉亲和素、生物素、表位如HA或T7标签、Myc、Max、免 疫球蛋白域和本领域公知的能作为第一附着位点的其它任何氨基酸序 列。
本领域技术人员还应当理解，在本发明的另一个实施方案中，可以 在构建用于与衣壳蛋白框内融合的形成体(即蛋白质或多肽)时附带产 生第一附着位点。例如，一种蛋白质可以用于与被膜蛋白融合，该被膜 蛋白具有已知以特定方式糖基化的氨基酸序列，添加的糖部分于是可以 通过与作为抗原第二附着位点的凝集素结合，作为病毒支架的第一附着 位点。此外，形成体序列可以在体内生物素化，生物素部分可以作为本 发明的第一附着位点，或者可以对形成体序列进行不同氨基酸残基的体 外化学修饰，这种修饰作为第一附着位点。
在本发明的另一个实施方案中，选择与乙型肝炎衣壳(核心)蛋白 (HBcAg)框内融合的JUN-FOS亮氨酸拉链蛋白域作为第一附着位点。 然而，本领域所有人员都应当清楚，为了使第一附着位点位于本发明的 非天然分子支架内，可以在融合蛋白构建体中使用其它病毒衣壳蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，选择与HBcAg框内融合的赖氨酸或 半胱氨酸残基作为第一附着位点。然而，本领域所有人员都应当清楚， 为了使第一附着位点位于本发明的非天然分子支架内，可以在融合蛋白 构建体中使用其它病毒衣壳蛋白或病毒样颗粒。
用于第一附着位点的JUN氨基酸序列如下： CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(SEQ ID NO： 59)
在这种情况下，抗原上预期的第二附着位点是FOS亮氨酸拉链蛋白 域，其氨基酸序列如下： CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(SEQ ID NO： 60)
这些序列来源于转录因子JUN和FOS，侧翼均为一条在两端含有半 胱氨酸残基的短序列。已知这些序列能够彼此相互作用。最初假定的 JUN-FOS二聚体的结构是，一个单体的疏水侧链与另一个单体的相应侧 链以类似于拉链的方式交错(Landschulz等人，Science 240：1759-1764 (1988))。然而，已经证明这种假设是错误的，已知这些蛋白质形成一 种α-螺旋形卷曲螺旋(O’Shea等人，Science 243：538-542(1989)；O’Shea 等人，Cell 68：699-708(1992)；Cohen & Parry，Trends Biochem.Sci.11： 245-248(1986))。因此，更多的是由于历史的原因而不是结构上的原因， 术语“亮氨酸拉链”通常用来指这些蛋白质域。在本专利中，术语“亮氨酸 拉链”是指上述序列或者与上述之一基本上类似的序列。术语JUN和FOS 用于指各自的亮氨酸拉链域，而不是完整的JUN和FOS蛋白。
如前所述，本发明包括基于病毒的核心颗粒，其包含或由病毒、病 毒样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式组成。技术人员知道如 何生产这种核心颗粒并与形成体附着。WO 00/32227的实施例17-22公 开了作为核心颗粒的乙型肝炎病毒样颗粒和麻疹病毒衣壳颗粒的生产， 在此引用作为参考。在这些实施方案中，JUN亮氨酸拉链蛋白域或FOS 亮氨酸拉链蛋白域可以作为本发明的非天然分子支架的形成体，从而作 为第一附着位点。
实施例23-29详细描述了生产携带含反应性赖氨酸残基的框内融合 肽的乙型肝炎核心颗粒和携带遗传融合的半胱氨酸残基的抗原，分别作 为第一和第二附着位点。
在其它实施方案中，本发明的组合物采用的核心颗粒由乙型肝炎衣 壳(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或者能形成有序阵列的其它 蛋白质或肽组成，它们经修饰后去除了游离半胱氨酸残基或减少了它们 的数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，去除天然 存在的半胱氨酸残基的修饰的HBcAg保留了结合并形成多聚体结构的 能力。因此，适用于本发明的组合物的核心颗粒包括含有修饰HBcAg 或其片段的核心颗粒，其中一个或多个天然存在的半胱氨酸残基缺失或 者被置换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的一种蛋白质。 已经鉴定了HBcAg的多种同种型。例如，含有SEQ ID NO：132所示氨 基酸序列的HBcAg蛋白的长度为183个氨基酸，是通过加工212个氨 基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。这种加工导致从乙型肝炎核 心抗原前体蛋白的N端除去29个氨基酸。类似地，含有SEQ ID NO： 134所示氨基酸序列的HBcAg蛋白长度为185个氨基酸，是通过加工 214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。与SEQ ID NO：132 所示的氨基酸序列相比，SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列在SEQ ID NO：134的位点152和153处含有一个两氨基酸的插入。
在大多数情况中，本发明的疫苗组合物用HBcAg的加工后形式(即 已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列(例如SEQ ID NO： 134所示的前29个氨基酸残基)的HBcAg)制备。
此外，在不发生加工的条件下生产HBcAg时，HBcAg通常以“加工 后的”形式表达。例如，细菌系统，如大肠杆菌，一般不除去通常在真核 细胞中表达的蛋白质的前导序列，也被称为“信号肽”。因此，当利用大 肠杆菌表达系统产生本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含 乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的形式。
在本发明的一个实施方案中，利用含有SEQ ID NO：134所示氨基 酸序列的修饰HBcAg或其部分制备非天然分子支架。具体而言，适于 实施本发明的修饰HBcAg包括如下蛋白质：其中在对应于含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的蛋白质的位点48、61、107和185的位点处， 一个或多个半胱氨酸残基缺失或被置换为其它氨基酸残基(例如丝氨酸 残基)。本领域技术人员可以认识到，在氨基酸序列与SEQ ID NO：134 所示不同的HBcAg变体的相似位置处，半胱氨酸残基也可以缺失或被 置换为其它氨基酸残基。然后可利用这种修饰的HBcAg变体制备本发 明的疫苗组合物。
本发明也包括如下修饰的HBcAg变体，它们缺失或置换一个或多个 在含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的多肽中不存在的其它半胱氨 酸残基。这种HBcAg变体的例子含有SEQ ID NO：90和132所示的氨 基酸序列。这些变体在对应于SEQ ID NO：134氨基酸残基147的位点 处含有半胱氨酸残基。因此，本发明的疫苗组合物包括含有如下HBcAg 的组合物，其中SEQ ID NO：134所示氨基酸序列中不存在的半胱氨酸 残基已经删除。
在某些情况下(例如当使用异双功能交联剂使抗原或抗原决定簇附 着于非天然分子支架时)，据信HBcAg中存在游离半胱氨酸残基导致毒 性成分与核心颗粒共价偶联，以及单体交联形成不确定的形式。
另外，在许多情况下，对本发明的组合物进行测定可能无法检测出 这些毒性成分。这是因为毒性成分与非天然分子支架的共价偶联将导致 不同种产物的形成，其中毒性成分与HBcAg的不同半胱氨酸残基连接， 或者在某些情况下不含半胱氨酸残基。换句话说，每个HBcAg的每个 游离半胱氨酸残基不与毒性成分共价连接。此外，在许多情况下，特定 HBcAg的半胱氨酸残基都不与毒性成分连接。因此，可能难以检测这些 毒性成分的存在，因为它们存在于混合分子群体中。然而，对个体施用 含有毒性成分的HBcAg种可能导致可能十分严重的不利反应。
本领域公知，游离半胱氨酸残基能够参与多种化学副反应。这些副 反应包括：二硫化物交换，在与其它物质的联合治疗中与(例如)注射 或形成的化学物质或代谢物反应，或者直接氧化，以及在暴露于紫外线 后与核苷酸反应。这样可能产生毒性加合物，特别是由于HBcAg具有 结合核酸的强烈倾向。利用以含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和异双 功能交联剂制备的衣壳，难以检测抗原-衣壳偶联物中的这种毒性产物， 因为这将导致宽范围分子量的产物分布。因此毒性加合物将分布于多种 产物之间，它们可能分别以低浓度存在，但当在一起时达到毒性水平。
鉴于上述情况，在疫苗组合物中使用经修饰去除天然存在的半胱氨 酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着于非天然分 子支架时，毒性物能够结合的位点在数量上减少，或者全部去除。而且， 也可以用高浓度的交联剂生产高度修饰的颗粒，这没有产生HBcAg单 体的多种不确定交联产物(即，交联的单体HBcAg的多种混合物)的 缺点。
已经鉴定了大量适用于本发明的天然存在的HBcAg变体。例如， Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ ID NO：134中97位处的异亮氨酸残基被替换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残 基的变体。在下列GenBank报告中公开了多种HBcAg变体以及几种乙 型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列：AAF121240(SEQ ID NO：89)、 AF121239(SEQ ID NO：90)、X85297(SEQ ID NO：91)、X02496(SEQ ID NO：92)、X85305(SEQ ID NO：93)、X85303(SEQ ID NO：94)、 AF151735(SEQ ID NO：95)、X85259(SEQ ID NO：96)、X85286(SEQ ID NO：97)、X85260(SEQ ID NO：98)、X85317(SEQ ID NO：99)、 X85298(SEQ ID NO：100)、AF043593(SEQ ID NO：101)、M20706 (SEQ ID NO：102)、X85295(SEQ ID NO：103)、X80925(SEQ ID NO： 104)、X85284(SEQ ID NO：105)、X85275(SEQ ID NO：106)、X72702 (SEQ ID NO：107)、X85291(SEQ ID NO：108)、X65258(SEQ ID NO： 109)、X85302(SEQ ID NO：110)、M32138(SEQ ID NO：111)、X85293 (SEQ ID NO：112)、X85315(SEQ ID NO：113)、U95551(SEQ ID NO： 114)、X85256(SEQ ID NO：115)、X85316(SEQ ID NO：116)、X85296 (SEQ ID NO：117)、AB033559(SEQ ID NO：118)、X59795(SEQ ID NO：119)、X85299(SEQ ID NO：120)、X85307(SEQ ID NO：121)、 X65257(SEQ ID NO：122)、X85311(SEQ ID NO：123)、X85301(SEQ ID NO：124)、X85314(SEQ ID NO：125)、X85287(SEQ ID NO：126)、 X85272(SEQ ID NO：127)、X85319(SEQ ID NO：128)、AB010289 (SEQ ID NO：129)、X85285(SEQ ID NO：130)、AB010289(SEQ ID NO：131)、AF121242(SEQ ID NO：132)、M90520(SEQ ID NO：135)、 P03153(SEQ ID NO：136)、AF110999(SEQ ID NO：137)和M95589 (SEQ ID NO：138)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg 变体在氨基酸序列上有多个位点不同，包括对应于位于SEQ ID NO：134 中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、 49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、 97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、 135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基 酸残基。
适用于本发明的HBcAg可以来源于任何生物，只要它们能够结合形 成有序、重复的抗原阵列。
如上所述，在本发明的疫苗组合物中一般使用加工后的HBcAg(即 缺乏前导序列的HBcAg)。因此，当用含有SEQ ID NO：136、137或138 所示氨基酸序列的HBcAg制备本发明的疫苗组合物时，通常分别去掉 这些蛋白质的N端30、35-43或35-43个氨基酸残基。
本发明包括疫苗组合物，以及应用这些组合物的方法，其中使用上 述变异HBcAg制备非天然分子支架。
本发明的范围内还包括能够结合形成二聚体或多聚体结构的其它 HBcAg变体。因此，本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物， 该多肽包含或者由下列氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：89-132和 134-138所示任何氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％ 相同的氨基酸序列，和必要时除去N端前导序列的这些蛋白质的加工后 形式。
多肽的氨基酸序列是否含有与SEQ ID NO：89-132和134-138所示 氨基酸序列之一或其部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相 同的氨基酸序列，可用已知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利 用Bestfit或其它任何一种序列比对程序确定一种特定序列与本发明的参 照氨基酸序列是否(例如)95％相同时，设置参数，使得在全长参照氨 基酸序列上计算百分同一性，并允许最高达参照序列中氨基酸残基总数 5％的同源性缺口。
含有SEQ ID NO：89-132和134-136所示氨基酸序列的HBcAg变 体和前体彼此相对类似。因此，所谓位于对应于SEQ ID NO：134特定 位点处的HBcAg变体的氨基酸残基，是指在SEQ ID NO：134所示氨基 酸序列中该位点处存在的氨基酸残基。在可感染哺乳动物的乙型肝炎病 毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性大多足够高，因此本领域技术 人员查阅SEQ ID NO：134所示氨基酸序列和特定HbcAg变体的氨基酸 序列以及鉴定“相应”氨基酸残基没有什么困难。例如，SEQ ID NO：135 所示的HBcAg氨基酸序列，它显示来源于一种感染土拨鼠的病毒的 HBcAg氨基酸序列，与含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的HBcAg 有足够的同源性，很明显地在相应于SEQ ID NO：134的氨基酸残基155 与156之间在SEQ ID NO：135中存在3个氨基酸残基的插入。
感染雪雁和鸭的乙型肝炎病毒的HBcAg与感染哺乳动物的乙型肝 炎病毒的HBcAg的氨基酸序列相当不同，因此这些蛋白质形式与SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的比对比较困难。然而，本发明包括含有 感染鸟类的乙型肝炎病毒HBcAg变体的疫苗组合物，以及含有这些 HBcAg变体的片段的疫苗组合物。适用于制备本发明疫苗组合物的 HBcAg片段包括含有如下多肽片段的组合物，该多肽片段包含或由选自 下列的氨基酸残基组成：SEQ ID NO：137的36-240、36-269、44-240、 44-269、36-305和44-305，或SEQ ID NO：138的36-240、36-269、44-240、 44-269、36-305和44-305。本领域技术人员会认识到，在包含于本发明 的疫苗组合物之前，这些多肽中天然存在的一个、两个、三个或多个半 胱氨酸残基(例如，位于SEQ ID NO：137的153位或SEQ ID NO：138 的34、43和196位的半胱氨酸残基)可以被置换为另一种氨基酸残基， 或者缺失。
在一个实施方案中，含有SEQ ID NO：134所示氨基酸序列的蛋白 质的48和107位处的半胱氨酸残基缺失或被置换为另一种氨基酸残基， 但是61位处的半胱氨酸保留。然后用该修饰的多肽制备本发明的疫苗 组合物。
如以下实施例31所述，例如，可以通过定点诱变去除溶剂可达的 48和107位处的半胱氨酸残基。发明人还发现，如实施例31所述构建 的Cys-48-Ser，Cys-107-Ser HBcAg双突变体能够在大肠杆菌中表达。
如上所述，游离半胱氨酸残基的去除减少了毒性成分能够与HBcAg 结合的位点数量，也去除了相同或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨 酸残基能够发生交联的位点。61位处的半胱氨酸参与二聚体形成，并与 另一个HBcAg的61位半胱氨酸形成二硫键，它通常保持完整，以稳定 本发明的HBcAg二聚体和多聚体。
如实施例32所述，用(1)含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和(2) 利用碘代乙酰胺使游离半胱氨酸残基无反应性的HBcAg进行的交联实 验表明，HBcAg的游离半胱氨酸残基通过异双功能交联剂衍生的赖氨酸 侧链与游离半胱氨酸残基之间的反应，负责HBcAg之间的交联。实施 例32也表明，HBcAg亚单位的交联导致形成大小不确定的高分子量产 物，它们不能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析出来。
当抗原或抗原决定簇与非天然分子支架通过一个赖氨酸残基连接 时，置换或删除在对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天然存在的赖 氨酸残基之一或这两者、以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基可 能是有利的。这些赖氨酸残基的去除导致除去了可能破坏有序阵列的抗 原或抗原决定簇结合部位，应当能提高最终疫苗组合物的质量和均一 性。
在许多情况中，当去除了对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天 然存在的两个赖氨酸残基时，向HBcAg中导入另一个赖氨酸作为抗原 或抗原决定簇的附着位点。例如，下文实施例23描述了插入这种赖氨 酸残基的方法。当例如改变对应于SEQ ID NO：134中7和96位处天然 存在的两个赖氨酸残基，并且试图利用异双功能交联剂使抗原或抗原决 定簇附着于非天然分子支架时，向HBcAg内导入一个赖氨酸残基通常 是有利的。
已经显示，HBcAg的C端指导该蛋白质的核定位(Eckhardt等人， J.Virol.65：575-582(1991))。另外也认为该蛋白质的该区域使HBcAg 具有结合核酸的能力。
在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物含有具有核酸结合活性的 HBcAg(例如含有天然存在的HBcAg核酸结合域)。含有一个或多个核 酸结合域的HBcAg可用于制备T细胞刺激活性提高的疫苗组合物。因 此，本发明的疫苗组合物包括含有具有核酸结合活性的HBcAg的组合 物。还包括其中HBcAg与核酸结合的疫苗组合物以及这些组合物在接 种方法中的应用。这些HBcAg可以在对个体施用之前结合核酸，或者 可以在施用后结合核酸。
在其它实施方案中，本发明的疫苗组合物含有C端区(例如SEQ ID NO：134的氨基酸残基145-185或150-185)已经去除并且不能结合核 酸的HBcAg。因此，适用于本发明的另外的修饰HBcAg包括C端截短 的突变体。合适的截短突变体包括从C端除去1、5、10、15、20、25、 30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
适用于本发明的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变 体包括从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的 修饰HBcAg。
适用于本发明的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截 短突变体包括从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨 基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、 39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的 氨基酸序列组成。
如上所述，在本发明的某些实施方案中，向一种形成非天然分子支 架的多肽中导入一个赖氨酸残基作为第一附着位点。在优选实施方案 中，用包含或者由SEQ ID NO：134的氨基酸1-144或氨基酸1-149组 成的HBcAg制备本发明的疫苗组合物，该序列经过修饰，使得对应于 79和80位的氨基酸被置换为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQ ID NO：158)的肽，48和107位处的半胱氨酸残基缺失或置换为另一 种氨基酸残基，而61位处的半胱氨酸保留。本发明还包括含有如下多 肽的相应片段的疫苗组合物，该多肽含有SEQ ID NO：89-132和135-136 任一所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改变。
本发明还包括含有如下HBcAg片段的疫苗组合物，该片段包含或者 由不同于SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列组成，其中在SEQ ID NO： 134的相应位点处不存在的半胱氨酸残基已经被删除。这种片段的一个 例子是包含或者由SEQ ID NO：132的氨基酸1-149组成的多肽，其中 147位处的半胱氨酸残基被置换为另一种氨基酸残基或者缺失。
本发明还包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：134的氨基酸1-144或1-49， 和包含SEQ ID NO：89-132或134-136任一所示氨基酸序列的相应部分， 以及SEQ ID NO：158的氨基酸1-147或1-152至少80％、85％、90％、 95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
本发明也包括含有如下HBcAg多肽的疫苗组合物，该多肽包含或者 由下列氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：137的氨基酸36-240、36-269、 44-240、44-269、36-305和44-305或SEQ ID NO：138的氨基酸36-240、 36-269、44-240、44-269、36-305和44-305至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列。
本发明的疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗 组合物可以由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备含有“野 生型”HBcAg和其中一个或多个氨基酸残基改变(例如：缺失、插入或 置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。然而在大多数应用中，只使用一 种类型的HBcAg，或者至少含有基本相同的第一附着位点的多种 HBcAg，因为用这些HBcAg制备的疫苗呈现高度有序、重复的抗原或 抗原决定簇阵列。此外，本发明的优选疫苗组合物是呈现高度有序、重 复抗原阵列的组合物。
本发明还包括如下疫苗组合物，其中的非天然分子支架利用与另一 种蛋白质融合的HBcAg制备。如上所述，适用于本发明疫苗组合物的 HBcAg融合蛋白的其它例子包括添加了有助于HBcAg二聚体和多聚体 形成和/或稳定的氨基酸序列的融合蛋白。附加的氨基酸序列可以与 HBcAg的N端或C端融合。这种融合蛋白的一个例子是HBcAg与酿酒 酵母GCN4螺旋区(GenBank登录号P03069(SEQ ID NO：154))的融 合体。
GCN4蛋白的螺旋域通过非共价相互作用形成同型二聚体，它能用 来制备和稳定HBcAg二聚体和多聚体。
在一个实施方案中，本发明提供利用HBcAg融合蛋白制备的疫苗组 合物，该融合蛋白包含HBcAg或其片段，和与C端融合的含有SEQ ID NO：154氨基酸残基227-276序列的GCN4多肽。该GCN4多肽也可以 与HBcAg的N端融合。
也可以用HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白制备本发明的疫苗组 合物。SH3域是在多种蛋白质中发现的相对较小的域，它提供与蛋白质 结合配偶体中的特异富含脯氨酸序列相互作用的能力(参见McPherson， Cell Signal 11：229-238(1999))。可以以几种方式应用HBcAg/SH3融 合蛋白。第一，SH3域能形成第一附着位点，可与抗原或抗原决定簇的 第二附着位点相互作用。类似地，也可以向HBcAg中添加另一种富含 脯氨酸的氨基酸序列，并作为第一附着位点用于抗原或抗原决定簇的 SH3域第二附着位点。第二，SH3域能与导入HBcAg中的富含脯氨酸 区结合。因此，可以将SH3域和富含脯氨酸SH3相互作用位点插入相 同或不同的HBcAg中，用来形成和稳定本发明的二聚体和多聚体。
在其它实施方案中，利用细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白部分或含有 细菌菌毛蛋白或其部分的融合蛋白制备本发明的疫苗组合物。菌毛蛋白 的例子包括大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈 瑟菌(Neisseria meningitidis)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)产生的菌毛蛋白。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包 括GenBank报告AJ000636(SEQ ID NO：139)、AJ132364(SEQ ID NO： 140)、AF229646(SEQ ID NO：141)、AF051814(SEQ ID NO：142)、 AF051815(SEQ ID NO：143)和X00981(SEQ ID NO：155)所述的 那些，其完整公开内容在此引用作为参考。
在蛋白质输出到细菌周质中之前，细菌菌毛蛋白通常被加工，以去 除N端前导序列。本领域技术人员会认识到，用来制备本发明疫苗组合 物的细菌菌毛蛋白通常不含天然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体例子是大肠杆菌的P-菌毛蛋白 (GenBank报告AF237482(SEQ ID NO：144))。适用于本发明的1型 大肠杆菌菌毛蛋白的一个例子是含有GenBank报告P04128所述氨基酸 序列(SEQ ID NO：146)的一种菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603 所述核苷酸序列(SEQ ID NO：145)的核酸编码。这些GenBank报告 的完整公开内容在此引用作为参考。一般用上述蛋白质的成熟形式制备
本发明的疫苗组合物。
适用于本发明的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白部分通常能够结合，形成 非天然分子支架。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法在本领域是已知的。例如， Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12890-12895(1996)描述了 大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。另外，Eshdat等人，J.Bacteriol.148： 308-314(1981)描述了适于解离大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。 简言之，这些方法如下：通过在饱和盐酸胍中37℃孵育，解离菌毛。然 后通过层析纯化菌毛蛋白，之后对5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人也发现，在对含有5 mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋 白二聚体重新装配，形成菌毛。
此外，例如利用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋 白，使其含有第一附着位点，抗原或抗原决定簇通过第二附着位点与该 第一附着位点连接。或者，抗原或抗原决定簇也能通过第二附着位点与 这些蛋白质中天然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然 后可用于本发明的疫苗组合物中。
用来制备本发明疫苗组合物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处关于 HBcAg所述的方式修饰。例如，半胱氨酸和赖氨酸残基可以删除，或者 可以置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位 点。而且，菌毛蛋白可以以修饰的形式表达，或者可以在表达后化学修 饰。类似地，可以从细菌中收获完整菌毛，然后化学修饰。
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛 样结构，用来组成本发明的疫苗组合物。适于制备疫苗组合物的菌毛的 一个例子是大肠杆菌1型菌毛，它是由具有SEQ ID NO：146所示氨基 酸序列的菌毛蛋白单体构成的。
本领域已知多种收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski (Biophys.J.74：623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌 毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多毛大肠杆菌上 剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循环纯化。下文实施例 33描述了一种类似的纯化方法。
收获后，可用多种方法修饰菌毛或菌毛样结构。例如，可向菌毛中 添加第一附着位点，抗原或抗原决定簇可以通过第二附着位点与之结 合。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，形成非天然分 子支架。
也可以在不含非天然形成体的情况下，通过抗原或抗原决定簇的附 着修饰菌毛或菌毛样结构。例如，抗原或抗原决定簇可与天然存在的半 胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这种情况中，天然存在的氨基酸残基 的高度有序和重复性将指导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶 联。例如，利用异双功能交联剂，可将菌毛或菌毛样结构与抗原或抗原 决定簇的第二附着位点连接。
当利用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的疫苗组合物 时，遗传构建这些生物使它们产生具有所希望特征的结构通常是有利 的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，为了产生具有所希望特征的结 构，可以修饰将要从中收获菌毛的大肠杆菌。菌毛蛋白可能的修饰的例 子包括一个或多个赖氨酸残基的插入，一个或多个天然存在的赖氨酸残 基的缺失或置换，和一个或多个天然存在的半胱氨酸残基(例如SEQ ID NO：146中44和84位处的半胱氨酸残基)的缺失或置换。
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有不是赖氨酸残 基的第一附着位点(例如FOS或JUN域)的表达产物。当然，合适的 第一附着位点一般只限于那些不能阻止菌毛蛋白形成适于本发明疫苗 组合物的菌毛或菌毛样结构的第一附着位点。
细菌细胞中天然存在的菌毛蛋白基因可在体内修饰(例如通过同源 重组)，或者可将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入这些细胞中。例如， 可将菌毛蛋白基因作为可复制克隆载体或可插入细菌染色体内之载体 的一部分导入细菌细胞中。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调节控制 序列(例如1ac操纵子)连接。
在大多数情况中，本发明的疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构 由一种菌毛蛋白亚单位组成。一般使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛 样结构，因为预计它们能形成呈现高度有序、重复抗原阵列的结构。
然而，本发明的组合物也包括包含由不同种菌毛蛋白亚单位组成的 菌毛或菌毛样结构的疫苗。构成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单 位可由细菌细胞中天然存在的基因表达，或者可以将基因导入细胞中。 在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达天然存在的菌毛蛋白基因和导 入的基因时，产物通常是由这些菌毛蛋白的混合物组成的结构。另外， 当细菌细胞表达两种或多种菌毛蛋白基因时，各种菌毛蛋白基因的相对 表达一般是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比例的一种 因素。
当希望获得具有特定混合菌毛蛋白亚单位组成的菌毛或菌毛样结构 时，可用一种异源诱导型启动子调节至少一种菌毛蛋白基因的表达。可 用这种启动子以及其它遗传元件调节细菌细胞中不同菌毛蛋白亚单位 的相对含量，从而调节菌毛或菌毛样结构的组成。
另外，在大多数情况中，抗原或抗原决定簇通过肽键之外的键与细 菌菌毛或菌毛样结构连接，可以遗传改造产生本发明组合物中使用的菌 毛或菌毛样结构的细菌细胞，以产生与抗原或抗原决定簇融合的菌毛蛋 白。形成菌毛或菌毛样结构的这些融合蛋白适用于本发明的疫苗组合 物。
如上所述，病毒衣壳可以用于(1)抗原或抗原决定簇的递呈，和(2) 本发明的疫苗组合物的制备。在本发明的实施中有用的尤其是病毒衣壳 蛋白，在此也称为“外壳蛋白”，它们在表达后形成衣壳或衣壳样结构。 因此，这些衣壳蛋白可形成核心颗粒和非天然分子支架。这些衣壳或衣 壳样结构通常形成有序、重复的阵列，能用于抗原或抗原决定簇的递呈 和本发明的疫苗组合物的制备。
可以利用多种方法使一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)抗原 或抗原决定簇附着于一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)可形成衣 壳或衣壳样结构的蛋白质(例如噬菌体外壳蛋白)及其它蛋白质上。例 如，可以利用第一和第二附着位点使抗原或抗原决定簇附着于核心颗 粒。此外，也可以用一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)异双功能 交联剂使抗原或抗原决定簇附着于一种或多种可形成病毒衣壳或衣壳 样结构的蛋白质上。
例如，可以利用病毒衣壳蛋白或其片段制备本发明的核心颗粒和疫 苗组合物。噬菌体Qβ外壳蛋白例如可以在大肠杆菌中重组表达。而且， 这些蛋白质在表达后自动形成衣壳。而且，这些衣壳形成有序、重复的 抗原或抗原决定簇阵列，后者可用于抗原递呈和疫苗组合物的制备。如 下文实施例38所述，可用噬菌体Qβ外壳蛋白制备引发对抗原决定簇之 免疫应答的疫苗组合物。
可用来制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括下列噬 菌体的外壳蛋白：RNA噬菌体，如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：159，关于 Qβ CP的PIR数据库登录号为VCBPQβ，和SEQ ID NO：217，关于Qβ A1蛋白的登录号为AAA16663)、噬菌体R17(SEQ ID NO：160；PIR 登录号VCBPR7)、噬菌体fr(SEQ ID NO：161；PIR登录号VCBPFR)、 噬菌体GA(SEQ ID NO：162；GenBank登录号NP-040754)、噬菌体 SP(SEQ ID NO：163，关于SP CP的GenBank登录号CAA30374，和 SEQ ID NO：254，关于SP A1蛋白的登录号)、噬菌体MS2(SEQ ID NO： 164；PIR登录号VCBPM2)、噬菌体M11(SEQ ID NO：165；GenBank 登录号AAC06250)、噬菌体MX1(SEQ ID NO：166；GenBank登录号 AAC14699)、噬菌体NL95(SEQ ID NO：167；GenBank登录号 AAC14704)、噬菌体f2(SEQ ID NO：215；GenBank登录号P03611)、 噬菌体PP7(SEQ ID NO：253)。本领域技术人员会认识到，本发明疫 苗组合物的制备可以使用可形成衣壳或衣壳样结构的任何蛋白质。而 且，在Qβ外壳蛋白的衣壳装配中可以掺入噬菌体Qβ的A1蛋白或C 端缺少多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式。为了含有第二 附着位点的抗原的附着，A1蛋白也可以与一种形成体融合，因而与第一 附着位点融合。为了确保衣壳形成，衣壳组件中A1蛋白相对于Qβ CP 的百分比是有限的。A1蛋白的登录号为AAA16663(SEQ ID NO：217)。
也曾经发现，当Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时，自装配成衣壳 (Kozlovska TM.等人，GENE 137：133-137(1993))。获得的衣壳或病 毒样颗粒显示一种二十面体噬菌体样衣壳结构，直径为25nm，T＝3准 对称。而且已解析了噬菌体Qβ的晶体结构。衣壳含有180个拷贝的外 壳蛋白，它们通过二硫键以共价五聚体和六聚体的形式连接 (Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。其它RNA 噬菌体外壳蛋白也显示在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA.等人， Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)， Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol. Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白之外还含有 所谓的通读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1是通过UGA终止密码子处的抑 制产生的，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳 蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的 外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，能与复制酶基因的核糖体结合位点的 茎环相互作用，在病毒生命周期中作为一种翻译阻抑物。这种相互作用 的序列和结构成分已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 28：71-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。 已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-5554(1996))。
蛋白质或蛋白质域对颗粒结构和装配的影响要大于短肽的影响。一 个例子是，当Qβ颗粒表达时，含有二硫键的抗原在大肠杆菌的细胞质 中一般不可能正确折叠。同样，在原核表达系统中糖基化一般是不可能 的。因此，从已经装配的颗粒和分离的抗原开始将抗原附着于颗粒上， 是此处所述的本发明的一个优点。这允许颗粒和抗原在表达宿主中表 达，保证抗原的正确折叠和颗粒的正确折叠和装配。
本发明的一个发现是，一个或几个抗原分子可以附着于RNA噬菌 体外壳蛋白的衣壳的一个亚单位上。RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳，尤其 是Qβ衣壳的一个具体特征是每个亚单位可能偶联几个抗原。这可产生 密集的抗原阵列。通过化学交联共价结合抗原的其它病毒衣壳，如主要 免疫显性区(MIR；WO 00/32227)中一个赖氨酸残基修饰的HBcAg， 显示每个亚单位最多0.5个抗原的偶联密度。HBcAg的刺突之间的距离 (对应于MIR)为50A(Wynne，SA.等人，Mol.Cell 3：771-780(1999))， 因此不能产生间距小于50A的抗原阵列。
Qβ外壳蛋白的衣壳在其表面上展示数量确定的赖氨酸残基，具有确 定的拓扑学，3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它 4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。这些确定的特征有利于抗原附着于颗 粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的内部。其他RNA噬菌体 外壳蛋白的衣壳在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基 也具有确定的拓扑学。来源于RNA噬菌体的衣壳有另一个优点，即在 细菌中的高表达量，这允许以经济的成本生产大量物质。
Qβ外壳蛋白的衣壳的另一个特征是其稳定性。Qβ亚单位之间通过 二硫键彼此结合，共价连接亚单位。Qβ衣壳蛋白也显示对有机溶剂和 变性剂的非凡的抗性。我们惊奇地看到，能够采用高达30％的DMSO和 乙腈浓度和高达1M的胍盐浓度，而不影响衣壳的稳定性或形成抗原阵 列的能力。因此，可以用这些有机溶剂偶联疏水性肽。Qβ外壳蛋白衣 壳的高度稳定性是一个重要特征，特别适用于哺乳动物和人类的免疫和 接种。衣壳对有机溶剂的抗性使得能够偶联在水性缓冲液中不可溶的抗 原。
向RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端β发夹中插入半胱氨酸残基 已经在专利申请US/5,698,424中描述过。但是我们注意到，衣壳中存在 暴露的游离半胱氨酸残基可通过形成二硫键导致衣壳的寡聚化。专利申 请US/5,698,424中所述的其它附着包括抗原与Qβ颗粒之间二硫键的形 成。含巯基的分子易于发生这种附着。
Qβ上半胱氨酸残基形成的已有二硫键与含有游离巯基残基的抗原 之间的反应释放非抗原性的含巯基物质。这些新形成的含巯基物质能够 再次与颗粒上存在的其它二硫键反应，从而建立一种平衡。在与颗粒上 形成的二硫键反应时，抗原可以与来自颗粒的半胱氨酸残基或者与在颗 粒上形成原二硫键的离去基团分子的半胱氨酸残基形成二硫键。而且， 所述的其它附着方法，利用异双功能交联剂一端与Qβ颗粒上的半胱氨 酸反应、另一端与抗原上的赖氨酸残基反应，导致抗原在颗粒上的随机 定向。
我们还注意到，与Qβ和Fr外壳蛋白的衣壳不同，专利申请 US/5,698,424中描述的重组MS-2基本不含核酸，而上述两种衣壳内包 装有RNA。
我们描述了本发明的新型组合物，它们可形成抗原密度可变的强抗 原阵列。我们证明，能够达到比用其它VLP通常获得的高得多的表位密 度。我们也公开了以适当间隔同时展示几种抗原的组合物，和以合适和 希望的方式添加辅助分子、提高溶解度或修饰衣壳的组合物。
本申请中公开了具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳组 合物的制备。本领域技术人员会理解，有序、重复抗原阵列的装配条件 相当部分取决于抗原和抗原上第二附着位点的选择。在没有有用的第二 附着位点的情况下，必须为抗原构建这种第二附着位点。
设计第二附着位点的一个前提是选择融合、插入或者通常是改造的 位置。本领域技术人员知道如何获得选择第二附着位点位置的指南。抗 原的晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可接近性(例如取决于它 们对于溶剂的可接近性)或者关于适于作为第二附着位点的残基(如半 胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。暴露的二硫键，象Fab片段的情况一 样，也可以是第二附着位点的来源，因为它们通常能通过温和还原转化 为一个半胱氨酸残基。在自身抗原免疫旨在抑制这种自身抗原与其天然 配体相互作用的情况下，通常添加第二附着位点，以便产生针对与天然 配体的相互作用位点的抗体。因此，选择第二附着位点的位置，以避免 第二附着位点或含有第二附着位点的任何氨基酸接头的空间位阻。在其 它实施方案中，希望针对不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点 的位点发生抗体应答。在这些实施方案中，可以选择第二附着位点，使 其能阻止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚化状态、寡聚化 位点、辅因子的存在和抗原结构和序列中实验证据揭示性位点是否存 在，其中抗原的修饰与自身抗原的功能相一致，或者与可识别自身抗原 的抗体的产生相一致。
在某些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要根据本发明公 开内容融合一种氨基酸接头，该接头含有适于作为第二附着位点的氨基 酸。在一个优选实施方案中，该氨基酸是半胱氨酸。氨基酸接头的选择 取决于自身抗原的性质，其生物化学性质，如pI、电荷分布、糖基化。 通常柔性氨基酸接头是有利的。氨基酸接头的例子有免疫球蛋白的铰链 区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n和甘氨酸接头(G)n，它们全都含有一个 半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地还含有甘氨酸残基。以下是所 述氨基酸接头的例子：
N端γ1：CGDKTHTSPP
C端γ1：DKTHTSPPCG
N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP
C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG
N端甘氨酸接头：GCGGGG
C端甘氨酸接头：GGGGCG
对于肽而言，已经表明肽C端的GGCG接头或N端的CGG是有用 的。通常在体积大的氨基酸与用作第二附着位点的半胱氨酸之间插入甘 氨酸残基。
抗原与VLP附着，特别是与RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳附着的一 种特别优选的方法是将RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳表面上的赖氨酸残 基与抗原上的半胱氨酸残基连接。为了有效地作为第二附着位点，巯基 必须是偶联可用的。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即必须有含 有游离巯基的半胱氨酸或半胱氨酸残基可以利用。在作为第二附着位点 的半胱氨酸残基为氧化形式的情况下，如果它例如要形成二硫键，需要 用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。
本申请的一项发现是，通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节 RNA噬菌体外壳蛋白衣壳上的表位密度。例如，在相同反应条件下，交 联剂Sulfo-GMBS和SMPH可比交联剂Sulfo-MBS获得更高的表位密度。 高浓度的反应物对衍生化有积极影响，并且可以通过操作反应条件控制 与RNA噬菌体外壳蛋白，特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的抗原数量。
根据理论计算，大小为17kDa的球形蛋白质抗原可以达到的最大数 量不超过0.5。因此，Qβ外壳蛋白衣壳的几个赖氨酸残基会被交联剂 分子衍生，但是不含连接抗原。这导致正电荷消失，这可能不利于偶联 物的溶解性和稳定性。如同公开的Qβ外壳蛋白突变体中那样，通过用 精氨酸置换某些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过度消失，因为精氨 酸残基不与交联剂反应。
在其它实施方案中，我们公开了一种含有其它赖氨酸残基的Qβ突 变外壳蛋白，它适于获得高密度抗原阵列。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人， Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，本领域技术人员能容易 地鉴定表面暴露的残基，并修饰噬菌体外壳蛋白，以便插入一个或多个 反应性氨基酸残基。因此，本领域技术人员能容易地生产和鉴定可用于 实施本发明的噬菌体外壳蛋白的修饰形式。因此，也可以用形成衣壳或 衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬 菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的疫苗组 合物。
尽管上述变异蛋白质的序列与它们的野生型对应物不同，但是这些 变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包 括含有可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的疫苗组合物，以及制备 这些疫苗组合物的方法，用来制备这些疫苗组合物的单个蛋白质亚单位 和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括如下 野生型蛋白质的变体形式，它们可形成有序、重复的抗原阵列(例如， 可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体)，并保留结合并形成衣壳或衣 壳样结构的能力。
因此，本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物，该蛋白质包含 或者由与可形成有序阵列的野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、 97％或99％相同的氨基酸序列组成。在许多情况中，需要加工这些蛋白 质，以去除信号肽(例如，异源信号肽)。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明的疫苗组合物的蛋白质 的核酸分子。
在特别实施方案中，本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物， 该蛋白质含有或者由与SEQ ID NO：159-167任一所示氨基酸序列至少 80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，或是必要 时去除N端前导序列的这些蛋白质的加工后形式。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构以及其它有 序阵列的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具 有SEQ ID NO：159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从C端除 去了1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。在本发明的实 施中使用的C端截短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的蛋白质也包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的 N端截短突变体。这类截短突变体的具体例子包括具有SEQ ID NO： 159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从N端除去了1、2、5、7、 9、10、12、14、15或17个氨基酸。在在本发明的实施中使用的N端截 短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质还包括可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白 质的N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括具有SEQ ID NO： 159-167任一所示氨基酸序列的蛋白质，其中从N端除去了1、2、5、7、 9、10、12、14、15或17个氨基酸，并且从C端除去了1、2、5、7、9、 10、12、14、15或17个氨基酸。在本发明的实施中使用的N端和C端 截短突变体通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括含有如下蛋白质的疫苗组合物，该蛋白质包含或者由 与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨 基酸序列组成。
本发明因此包括由可形成有序阵列的蛋白质制备的疫苗组合物，由 单个蛋白质亚单位制备疫苗组合物的方法，制备这些单个蛋白质亚单位 的方法，编码这些亚单位的核酸分子，以及应用本发明的疫苗组合物接 种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
B.具有第二附着位点的抗原或抗原决定簇的构建
本发明的组合物中的第二种成分是具有至少一个第二附着位点的抗 原或抗原决定簇，该位点能够通过至少一个非肽键与非天然分子支架的 第一附着位点结合。根据希望的治疗效果而选择的抗原或抗原决定簇， 本发明提供不同的组合物。通过改变为第二附着位点选择的分子，可提 供其它组合物。
然而，当用细菌菌毛或菌毛样结构、菌毛蛋白制备本发明的疫苗组 合物时，抗原或抗原决定簇可以通过菌毛蛋白/抗原融合蛋白的表达与菌 毛蛋白结合。类似地，当用菌毛蛋白之外的蛋白质(例如病毒衣壳蛋白) 制备本发明的疫苗组合物时，抗原或抗原决定簇可以通过非菌毛蛋白/ 抗原融合蛋白的表达与这些非菌毛蛋白结合。抗原或抗原决定簇也可以 通过非肽键与细菌菌毛、菌毛样结构、菌毛蛋白和可形成有序阵列的其 它蛋白质结合。
本发明的抗原可以选自：(a)适于诱发抗癌细胞免疫应答的蛋白质； (b)适于诱发抗传染病免疫应答的蛋白质；(c)适于诱发抗变应原的免 疫应答的蛋白质；(d)适于在家畜中诱发免疫应答的蛋白质；(e)(a)- (d)所述任一种蛋白质的片段(例如域)。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原或抗原决定簇可用于传染病 的预防。这种治疗方法可用于治疗影响多种宿主(例如人、牛、绵羊、 猪、狗、猫、其它哺乳动物种和非哺乳动物种)的多种传染病。本领域 技术人员周知可以治疗的传染病，例子包括：病毒病原的感染，如HIV、 流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘 等；或细菌病原的感染，如肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病原的感染， 如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。因此，在医学领域 众所周知那些为本发明的组合物而选择的抗原或抗原决定簇；抗原或抗 原决定簇的例子包括：HIV抗原gp140和gp160；流感抗原血凝素、M2 蛋白和神经氨酸酶、乙型肝炎表面抗原、疟疾的环子孢子蛋白。
在特定实施方案中，本发明提供适于在预防和/或减弱由“自身”基因 产物(例如肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病或症状的方法中使用的疫 苗组合物。因此，本发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或减弱由 “自身”基因产物引起或加重的疾病或症状的抗体的组合物。这类疾病或 症状的例子包括：移植物抗宿主病、IgE介导的变态反应、过敏症、成 人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、变应性哮喘、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、Graves病、系统性红斑狼疮(SLE)、 炎性自身免疫病、重症肌无力、免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)、血 管免疫增生性淋巴结病(AIL)、免疫母细胞淋巴结病(IBL)、类风湿 性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、阿耳茨海默病和骨质疏松症。
在有关实施方案中，本发明的组合物是免疫治疗剂，可用于治疗变 态反应或癌症。
治疗变态反应的医学领域的技术人员知道如何选择用于制备组合物 和在治疗变态反应的方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原 决定簇的代表性例子包括：蜂毒磷脂酶A2、BetvI(桦树花粉变应原)、 5DolmV(白面胡蜂毒变应原)、蜂毒肽和Der pI(屋尘螨变应原)以 及能引发免疫应答的它们的片段。
如上所述，一种优选的抗原或抗原决定簇是Der pI。Der pI是在屋 尘螨粪便颗粒中发现的一种25kD的蛋白酶。Der pI是屋尘螨的主要变 态反应分子。因此，80％的螨虫变态反应患者含有抗-Der pI IgE抗体。 尤其是，已知肽p52-72和p117-133等含有可被天然Der pI特异性抗体 识别的表位。在对完整抗原的多克隆应答中产生的IgE抗体可与肽区 59-94高亲和力结合(L.Pierson-Mullany等人，(2000)《分子免疫学》)。 其它区也可与IgE高亲和力结合。肽p117-133在N端含有一个游离半胱 氨酸，优选地作为本发明的第二附着位点。3D模型将肽p52-72和 p117-133分配在全蛋白质的表面。然而，Der pI蛋白的其它片段可含有
优选用于本发明的B细胞表位。
治疗癌症的医学领域的技术人员知道如何选择用于制备组合物和在 癌症治疗方法中使用的抗原或抗原决定簇。这类抗原或抗原决定簇的代 表性例子包括：Her2(乳腺癌)、GD2(神经母细胞瘤)、EGF-R(恶性 胶质母细胞瘤)、CEA(甲状腺髓样癌)和CD52(白血病)、人黑素瘤 蛋白gp100、人黑素瘤蛋白melan-A/MART-1、酪氨酸酶、NA17-Ant蛋 白、MAGE-3蛋白、p53蛋白、HPV16 E7蛋白以及能引发免疫应答的它 们的片段。可用来治疗癌症的组合物和方法的另外的优选抗原决定簇是 参与血管形成的分子和抗原决定簇。血管形成-新血管的形成-在生理 和病理生理过程(分别如创伤愈合和实体瘤生长)中起重要作用 (Folkman，J.(1995)Nat.Medicine 1，27-31；Folkman，J.和Klagsbrun，M. (1987)Science 235，442-446；Martiny-Baron，G.和Marmé，D.(1995) Curr.Opin.Biotechnol.6，675-680；Risau，W.(1997)Nature 386，671-674)。 快速生长的肿瘤始于并依靠血管的形成提供所需的血液供应。因此，抗 血管生成剂可以作为有效的抗癌治疗。
在迄今鉴定的几种推定的血管生成因子中，血管内皮生长因子 (VEGF)是一种强内皮细胞特异性有丝分裂原，是多种实体瘤的血管 生成的一种主要刺激物。尽管最近的发现表明，一组血管生成因子必须 完美配合才能形成功能性血管，但是甚至一种生长因子的阻断似乎也可 限制疾病诱导的血管生长。因此，VEGF的阻断可能是肿瘤诱导的血管 生成中的首要干预目标。最近已经把靶向内皮而不是肿瘤本身作为治疗 肿瘤的一种新策略(Millauer，B.，Shawver，L.K.，Plate，K.H.，Risau，W.和 Ullrich，A.(1994)Nature 367，576-579；Kim，J.，Li，B.，Winer，J.，Armanini， M.，Gillett，N.，Phillip，H.S.，Ferrara，N.(1993)Nature 362，841-844)。与 免疫系统识别的靶结构容易突变的肿瘤不同，内皮细胞通常不能逃脱免 疫系统或其它治疗方案。
已经公开了一种抗-VEGFR-II抗体(IMC-1C11)和一种抗VEGF抗 体(Lu，D.，Kussie，P.，Pytowski，B.，Persaud，K.，Bohlen，P.，Witte，L.，Zhu， Z.(2000)J.Biol.Chem.275，14321-14330；Presta，L.G.，Chen，H.，O’Connor， SJ.，Chisholm，V.，Meng，YG.，Krummen，L.，Winkler，M.，Ferrara N.(1997) Cancer Res.47，4593-4599)。前一种中和单克隆抗-VEGFR-2抗体识别一 种被确定为推定VEGF/VEGFR-II结合位点的表位(Piossek，C.， Schneider-Mergener，J.，Schirner，M.，Vakalopoulou，E.，Germeroth，L.， Thierauch，K.H.(1999)J Biol Chem.274，5612-5619)。
因此，在本发明的另一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是一 种来源于VEGFR-II接触位点的肽。这提供了一种根据本发明的组合物 和疫苗组合物，它可能具有抗血管生成的特性，可用于癌症治疗。用 VEGFR-2特异的血清抑制小鼠肿瘤生长已经得到证实(Wei，YQ.，Wang， QR.，Zhao，X.，Yang，L.，Tian.L.，Lu，Y.，Kang，B.，Lu，CJ.，Huang，MJ.，Lou， YY.，Xiao，F.，He，QM.，Shu，JM.，Xie，XJ.，Mao，YQ.，Lei，S.，Luo，F.，Zhou， LQ.，Liu，CE.，Zhou，H.，Jiang，Y.，Peng，F.，Yuan，L P.，Li，Q.，Wu，Y.，Liu，JY. (2000)Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，适用于本发明的组合物 和根据本发明的抗血管生成疫苗组合物的另外优选的抗原决定簇包括 具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人VEGFR-II衍生 肽，和/或具有序列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK的鼠 VEGFR-II衍生肽，和/或VEGFR-II的相关胞外球形域1-3。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，疫苗组合物包含一种选自 病毒样颗粒或细菌菌毛的核心颗粒和VEGFR-II衍生肽或其片段作为本 发明抗原或抗原决定簇。
治疗相关疾病的医学领域的技术人员知道如何选择用于治疗其它自 身抗原相关疾病或症状的组合物和方法的抗原或抗原决定簇。这类抗原 或抗原决定簇的代表性例子有，如：淋巴毒素(例如淋巴毒素α(LTα)、 淋巴毒素β(LTβ))和淋巴毒素受体、核因子KB配体的受体激活物 (RANKL)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体 (VEGF-R)、白介素-5、白介素-17、白介素-13、CCL21、CXCL12、SDF-1、 MCP-1、Endoglin、抵抗素、GHRH、LHRH、TRH、MIF、嗜酸细胞活 化趋化因子(Eotaxin)、缓激肽、BLC、肿瘤坏死因子α和淀粉样β肽 (Aβ1-42)(SEQ ID NO：220)，以及能引发免疫应答的它们的片段。在 一个优选实施方案中，抗原是淀粉样β肽(Aβ1-42) (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) (SEQ ID NO：220)或其片段。淀粉样β蛋白是SEQ ID NO：218。淀 粉样β前体蛋白是SEQ ID NO：219。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是一种血管 紧张肽或其片段。如此处所用的术语“血管紧张肽”包括含有血管紧张肽 原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其片段的任何肽。序列如下： 血管紧张肽原：DRVYIHPFHLVIHN；血管紧张肽I：DRVYIHPFHL； 血管紧张肽II：DRVYIHPF。通常在血管紧张肽序列的C端或N端添加 一个或多个其它氨基酸。血管紧张肽的序列对应于人序列，与鼠序列相 同。因此，分别用含有这种血管紧张肽作为本发明抗原决定簇的疫苗或 组合物免疫人或小鼠是针对自身抗原的接种。这些其它氨基酸对于与核 心颗粒的定向和有序结合特别有价值。
优选地，血管紧张肽具有选自下列的氨基酸序列：a)氨基酸序列 CGGDRVYIHPF；b)氨基酸序列CGGDRVYIHPFHL；c)氨基酸序列 DRVYIHPFHLGGC；和d)氨基酸序列CDRVYIHPFH。血管紧张肽I 是用肾源酶肾素从血管紧张肽原(14个氨基酸)上切下的。血管紧张肽 I是一种10个氨基酸的无生物活性肽。血管紧张肽转化酶(ACE)在N 端进一步切割，产生具有生物活性的8个氨基酸的血管紧张肽II。该肽 可与血管紧张肽受体AT1I和AT2结合，导致血管收缩和醛甾酮释放。
本发明的一种疫苗包含可用于治疗高血压的至少一种血管紧张肽。
在本发明的一个特别实施方案中，抗原或抗原决定簇选自：(a)HIV 的重组蛋白，(b)流感病毒的重组蛋白(例如流感病毒M2蛋白或其片 段)，(c)丙型肝炎病毒的重组蛋白，(d)弓形虫(Toxoplasma)的重组 蛋白，(e)恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的重组蛋白，(f)间 日疟原虫(Plasmodium vivax)的重组蛋白，(g)卵形疟原虫(Plasmodium ovale)的重组蛋白，(h)三日疟原虫(Plasmodium malariae)的重组蛋 白，(i)乳腺癌细胞的重组蛋白，(j)肾癌细胞的重组蛋白，(k)前列 腺癌细胞的重组蛋白，(l)皮肤癌细胞的重组蛋白，(m)脑癌细胞的重 组蛋白，(n)白血病细胞的重组蛋白，(o)重组抑制蛋白(profiling)， (p)蜂毒变态反应的重组蛋白，(q)坚果变态反应的重组蛋白，(r) 食物变态反应的重组蛋白，(s)哮喘的重组蛋白，(t)衣原体(Chlamydia) 的重组蛋白，和(u)(a)-(t)所示任何蛋白质的片段。
选择组合物的抗原或抗原决定簇后，即可在制备过程中向分子上添 加至少一个第二附着位点，构建与本发明的非天然分子支架结合的有组 织的、重复的阵列。本领域技术人员知道什么能构成合适的第二附着位 点。第二附着位点的代表性例子包括但不限于：抗原、抗体或抗体片段、 生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、配体结合蛋白、 相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、对氨基有反应性的化学基团、羧基、 对羧基有反应性的化学基团、巯基、对巯基有反应性的化学基团，或其 组合。
第一与第二附着位点的结合将取决于选择的各个分子的特性，但是 将包含至少一个非肽键。根据第一和第二附着位点的组合，这种结合的 性质可能是共价的、离子性的、疏水性的、极性的或其组合。
在本发明的一个实施方案中，第二附着位点可以是FOS亮氨酸拉链 蛋白域或JUN亮氨酸拉链蛋白域。
在本发明的一个更具体的实施方案中，选择的第二附着位点是FOS 亮氨酸拉链蛋白域，它与本发明的非天然分子支架上的JUN亮氨酸拉链 蛋白域特异结合。JUN与FOS亮氨酸拉链蛋白域的结合为在支架表面形 成有组织的、重复的抗原或抗原决定簇阵列提供了基础。FOS亮氨酸拉 链蛋白域可以与选择的抗原或抗原决定簇在氨基端、羧基端或(希望时) 在蛋白质内部框内融合。
为了举例说明，列出了几种FOS融合构建体。人生长激素(实施例 4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA2)(实施例9)、卵白蛋白(实施例10)和HIV gp140(实施例12)。
为了简化FOS融合构建体的生成，公开了几种载体，这为抗原或抗 原决定簇的设计和构建提供了选择(参见实施例6)。载体pAV1-4设计 用于在大肠杆菌中表达FOS融合体；载体pAV5和pAV6设计用于在真 核细胞中表达FOS融合蛋白。这些载体的特性简述如下：
1.pAV1：该载体设计用于向大肠杆菌周质间隙中分泌在C端含有 FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的StuI/NotI位点。
2.pAV2：该载体设计用于向大肠杆菌周质间隙中分泌在N端含有 FOS的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/EcoRV(或 NotI/HindIII)位点。
3.pAV3：该载体设计用于在大肠杆菌的细胞质中产生C端含有FOS 的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的EcoRV/NotI位点。
4.pAV4：该载体设计用于在大肠杆菌的细胞质中产生N端含有FOS 的融合蛋白。目的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/EcoRV(或 NotI/HindIII)位点。在蛋白质合成后蛋白水解除去N端甲硫氨酸残基 (Hirel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8247-8251(1989))。
5.pAV5：该载体设计用于真核产生C端含有FOS的融合蛋白。目 的基因(g.o.i)可以通过连接到该载体的Eco47III/NotI位点内插入在编 码hGH信号序列的序列与编码FOS域的序列之间。或者，含有自身信 号序列的基因也可通过连接到StuI/NotI位点内与FOS编码区融合。
6.pAV6：该载体设计用于真核产生N端含有FOS的融合蛋白。目 的基因(g.o.i)可以连接到该载体的NotI/StuI(或NotI/HindIII)位点。
本领域技术人员会理解，FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白的构 建可包括添加特定的遗传元件，以促进重组蛋白的产生。实施例4为添 加特定大肠杆菌翻译调节元件提供了指导，实施例7为添加真核信号序 列提供了指导。也可根据技术人员的特殊需要选择其它遗传元件。
本发明也包括在细菌(实施例5)或真核细胞(实施例8)中产生 FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白。本领域技术人员知道选择何种 细胞类型表达融合蛋白，这取决于多种因素，例如在组合物的设计中， 翻译后修饰是否是一个重要的考虑因素。
如前所述，本发明公开了利用pAV载体构建FOS-抗原或FOS-抗原 决定簇融合蛋白的多种方法。除了允许原核和真核表达外，这些载体还 能使技术人员选择向抗原的N端还是C端添加FOS亮氨酸拉链蛋白域。 提供了具体实例，其中与PLA2(实施例9)和卵白蛋白(实施例10) 形成N端和C端FOS融合体。实施例11证实了PLA2和卵白蛋白FOS 融合蛋白的纯化。
在一个更具体的实施方案中，本发明涉及HIV基因组编码的抗原或 抗原决定簇。更具体而言，这种HIV抗原或抗原决定簇是gp140。如实 施例11-15所述，HIV gp140可以制备成带有FOS亮氨酸拉链蛋白域的 形式，合成并纯化该融合蛋白，用来与本发明的非天然分子支架附着。 本领域技术人员会知道，在生产本发明的组合物时也可以使用其它HIV 抗原或抗原决定簇。
在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种流感病毒 核酸编码的抗原或抗原决定簇的疫苗组合物，和这种疫苗组合物在引发 免疫应答中的应用。在一个更具体的实施方案中，流感抗原或抗原决定 簇可以是一种M2蛋白(例如具有SEQ ID NO：213所示氨基酸序列的 M2蛋白，GenBank登录号P06821，或SEQ ID NO：212，PIR登录号 MFIV62)，或其片段(例如SEQ ID NO：213中约2-24个氨基酸，SEQ ID NO：212的氨基酸序列)。此外，流感抗原或抗原决定簇也可以通过 肽键或非肽键与非天然分子支架或核心颗粒偶联。当流感抗原或抗原决 定簇通过肽键与非天然分子支架或核心颗粒偶联时，通常将形成融合蛋 白表达产物形式的有序、重复阵列的分子。然而，更优选的实施方案是 一种如下组合物，其中M2肽通过化学交联与本发明公开的Qβ衣壳蛋 白、HBcAg衣壳蛋白或菌毛偶联。
适用于本发明的M2蛋白的(例如具有SEQ ID NO：213氨基酸序 列的M2蛋白)以及寻求免疫应答的其它蛋白质的不同部分，可以包含 或者由长度为任意氨基酸数量、但长度通常至少6个氨基酸的肽组成(例 如长度为6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95或97个氨基酸的肽)。
在本发明的另一个具体实施方案中，选择的第二附着位点是一个半 胱氨酸残基，它与本发明的非天然分子支架或核心颗粒的一个赖氨酸残 基特异性结合，或者选择的第二附着位点是一个赖氨酸残基，它与本发 明的非天然分子支架或核心颗粒的一个半胱氨酸残基特异性结合。赖氨 酸残基(Lys)与半胱氨酸残基(Cys)的化学连接为在支架或核心颗粒 表面上形成有组织的、重复抗原或抗原决定簇阵列提供了基础。半胱氨 酸或赖氨酸残基可以通过基因工程方法在选择的抗原或抗原决定簇在 氨基端、羧基端或(希望时)蛋白质内部框内构建。例如，为PLA2和 HIV gp140提供一个半胱氨酸残基，用来与赖氨酸残基第一附着位点连 接。在其它具体实施方案中，本发明提供适于在预防和/或减弱变态反应 (如导致过敏反应的变态反应)的方法中使用的疫苗组合物。因此，本 发明的疫苗组合物包括导致产生可预防和/或减弱变态反应的抗体的组 合物。因此，在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括引发针对一 种变应原的免疫应答的组合物。这类变应原的例子包括磷脂酶如Apis mellifera(SEQ ID NO：168，GenBank登录号443189；SEQ ID NO：169， GenBank登录号229378)、Apis dorsata(SEQ ID NO：170，GenBank登 录号B59055)、Apis cerana(SEQ ID NO：171，GenBank登录号A59055)、 Bombus pennsylvanicus(SEQ ID NO：172，GenBank登录号B56338) 和Heloderma suspectum(SEQ ID NO：173，GenBank登录号P80003； SEQ ID NO：174，GenBank登录号S14764；SEQ ID NO：175，GenBank 登录号226711)的磷脂酶A2(PLA2)蛋白。
以Apis mellifera的PLA2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：168)为 例，在预防和/或减弱变态反应的组合物中也可使用代表完整PLA2序列 任何部分的长度至少约为60个氨基酸的肽。这类肽的例子包括含有SEQ ID NO：168的氨基酸1-60、SEQ ID NO：168的氨基酸1-70、SEQ ID NO： 168的氨基酸10-70、SEQ ID NO：168的氨基酸20-80、SEQ ID NO：168 的氨基酸30-90、SEQ ID NO：168的氨基酸40-100、SEQ ID NO：168 的氨基酸47-99、SEQ ID NO：168的氨基酸50-110、SEQ ID NO：168 的氨基酸60-120、SEQ ID NO：168的氨基酸70-130或SEQ ID NO：168 的氨基酸90-134的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白)的 相应部分。这类肽的其它例子包括含有SEQ ID NO：168的氨基酸1-10、 SEQ ID NO：168的氨基酸5-15、SEQ ID NO：168的氨基酸10-20、SEQ ID NO：168的氨基酸20-30、SEQ ID NO：168的氨基酸30-40、SEQ ID NO：168的氨基酸40-50、SEQ ID NO：168的氨基酸50-60、SEQ ID NO： 168的氨基酸60-70、SEQ ID NO：168的氨基酸70-80、SEQ ID NO：168 的氨基酸80-90、SEQ ID NO：168的氨基酸90-100、SEQ ID NO：168 的氨基酸100-110、SEQ ID NO：168的氨基酸110-120或SEQ ID NO： 168的氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白(例如上述PLA2蛋白) 的相应部分。
适用于本发明的PLA2部分以及寻求其免疫应答的其它蛋白质的部 分可包含或者由长度一般为至少6个氨基酸的肽(例如长度为6、7、8、 9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95或100个氨基酸的肽)组成。
PLA2肽(例如上述全长PLA2蛋白及其部分)也可以与能形成有序、 重复的抗原阵列的任何物质(例如Qβ衣壳蛋白或其片段)偶联。
在本发明的另一方面，本发明提供特别适于治疗和/或预防“自身”基 因产物所致或加重的疾病的组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，抗原决定簇是RANKL(NFKB配 体的受体激活物)。RANKL也被称为TRANCE(TNF相关激活诱导的 细胞因子)、ODF(破骨细胞分化因子)或OPGL(Osteoprotegerin配体)。 人RANKL胞外部分的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：221 (RNAKL human：TrEMBL：O14788)，而一种人同种型的氨基酸序列 显示于SEQ ID NO：222。鼠RNAKL和一种同种型的胞外部分的序列 分别显示于SEQ ID NO：223(RANKL mouse：TrEMBL：O35235)、 SEQ ID NO：224(RANKL mouse剪接形式：TrEMBL：Q9JJK8和 TrEMBL：Q9JJK9)。
已经表明，RANKL是破骨细胞生成中的一个重要因子。抑制 RANKL与其受体RNAK的相互作用能抑制破骨细胞生成，从而提供了 一种防止可见于骨质疏松和其它疾病的过量骨吸收的方法。 RANKL/RANK相互作用受RANK-Fc融合蛋白或RANKL的可溶性诱饵 受体(称为osteoprotegerin OPG)抑制。
在免疫系统中，RANKL在T细胞上表达，而RANK发现于抗原递 呈细胞上。RANKL-RANK相互作用对于不依赖CD40L的T辅助细胞激 活非常重要(Bachmann等人，J.Exp.Med.7：1025(1999))，并且延长 树突细胞的寿命并增强其佐剂特性(Josien等人，J Exp Med.191：495 (2000))。
在骨骼中，RANKL在基质细胞或成骨细胞上表达，而RANK在破 骨细胞前体上表达。RANK与RANKL的相互作用对于破骨细胞前体发 育为成熟破骨细胞至关重要。osteoprotegerin能阻断这种相互作用。
OPG-缺陷小鼠会患骨质疏松，这可通过注射重组OPG拯救。这意 味着OPG能够逆转骨质疏松。因此，通过注射本发明的这一特别实施 方案的组合物抑制RANK-RANKL相互作用可以逆转骨质疏松。
另外，在OPG敲除小鼠中也观察到动脉钙化，注射OPG能够逆转 (Min等人，J.Exp.Med.4：463(2000))。在佐剂诱导的关节炎模型上， 注射OPG能够阻止骨损失和软骨破坏，但不能阻止炎症(爪肿胀)。假 定激活的T细胞导致RANKL介导的破骨细胞产生增多和骨损失。OPG 可抑制前列腺癌诱导的破骨细胞生成，并阻止前列腺癌在小鼠骨骼中的 生长。在小鼠中，OPG能够减轻晚期骨癌的疼痛。
RANKL是一种245个氨基酸的跨膜蛋白，属于TNF超家族。TACE 样蛋白酶能够释放其胞外区部分(178个氨基酸)(Lum等人，J Biol Chem.274：13613(1999))。另外，也曾描述了缺乏跨膜域的剪接变体 (Ikeda等人，Endocrinology 142：1419(2001))。释放的部分含有与可 溶性TNF-α高度同源的域。RANKL的这种胞外域形成可见于TNF-α的 同型三聚体。其C端似乎与三聚体接触位点有关。该序列区内含有一个 半胱氨酸。
我们建立了RANKL相应区的三维结构模型，发现在与本发明的载 体上的第一附着位点相互作用的折叠结构中，天然存在的半胱氨酸可能 不可接近。优选在N端附着含有一个氨基酸接头的第二附着位点，其中 含另一个半胱氨酸残基。一种人-RANKL构建体是本发明的一个非常优 选的实施方案，其中含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头与RANKL胞 外部分融合。然而，含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头作为第二附着 位点与RANKL序列或RANKL胞外部分的C端融合构成本发明另外的 优选实施方案。
人-RANKL构建体，如SEQ ID NO：320所确定的，根据实施例6 所公开的内容制备，本领域技术人员能够通过蛋白质序列比对比较鼠与 人RANKL序列，以鉴定将要克隆入实施例6所述载体中的人-RANKL 序列部分。含有氨基酸138-317并对应于人RANKL胞外域C端区的片 段是本发明特别优选的实施方案，可以被修饰用于如本发明要求的与 VLP和菌毛偶联。然而，为在以下所述适当宿主中表达也可采用其它适 当的载体。本发明的范围内还包括其它人-RANKL构建体，特别是包含 能被TACE样蛋白酶释放的胞外区部分(178个氨基酸)或其片段(Lum 等人，J Biol Chem.274：13613(1999))的那些，或者包含对应于缺乏 跨膜域的其他剪接变体之序列及其保守片段的那些。包含氨基酸165-317 的人C端片段也是本发明的实施方案。或者，本发明的范围内也包括包 含整个胞外区(氨基酸71-317)的片段，可将其修饰以便如本发明所要 求的与VLP和菌毛偶联。
RANKL已经在不同系统中表达(大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物 细胞)，并且显示具有活性，因此，生产组合物的抗原可以采用多种表 达系统。在蛋白质的表达定向于大肠杆菌周质的情况中，RANKL的或 由蛋白质胞外部分组成的RANKL构建体的信号肽被替换为细菌信号 肽，这两种蛋白都可能被修饰，以便包含一个根据本发明的第二附着位 点。为了在大肠杆菌细胞质中表达蛋白质，RANKL构建体应不含信号 肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是MIF或其片段。 MIF是一种细胞因子，最早在1966年对其作为巨噬细胞迁移抑制剂的 功能由过描述。它也被称为延迟早期反应蛋白6(DER6)、糖基化抑制 因子或苯丙酮酸互变异构酶。最后一个名称起因于MIF的酶活性，然而 其内源底物尚未确定。
已经表明MIF与多种疾病有关。在结核菌素诱导的迟发型超敏 (DTH)反应中MIF(mRNA和蛋白质)被正调节，抗-MIF抗体抑制 该DTH反应。在同种异体肾移植排斥中MIF也被正调节。在眼自身免 疫病—实验自身免疫眼色素层视网膜炎(EAU)-的一个模型中，抗 MIF治疗使EAU发展延迟。患者血清中MIF升高，在Behcet病患者和 虹膜睫状体炎患者中也是如此。MIF免疫可能是一种治疗类风湿性关节 炎的方法。
在特应性皮炎患者中发现有高血清MIF浓度。在皮肤损伤中，MIF 广泛表达，而不是象对照中一样在基细胞层中发现。MIF浓度在类固醇 治疗后降低，这与MIF在炎症中的作用一致。也发现MIF对肾小球肾 炎的发生有作用。用抗MIF抗体治疗的动物显示肾小球肾炎明显缓解。 MIF是垂体产生、分泌的，例如在LPS刺激后产生，并且加重内毒素血 症。因此，抗-MIF单克隆抗体抑制内毒素血症和脓毒性休克，而重组 MIF显著提高腹膜炎的致死性。MIF也是一种糖皮质激素诱导的细胞因 子产生调节剂，并且促发炎症。
MIF由T细胞(Th2)产生，支持T细胞的增殖，抗MIF治疗降低 T细胞增殖和IgG水平。在多发性硬化症和神经Behcet病患者的脑脊液 中MIF浓度升高。在长期银屑病患者的血清中也发现高MIF水平。在 溃疡性结肠炎患者的血清中也发现高MIF水平，但在节段性肠炎患者中 未发现。
在支气管哮喘患者的血清中发现高MIF水平。在类风湿性关节炎患 者的滑液中MIF也被正调节。在小鼠和大鼠模型中，抗-MIF治疗可有 效缓解类风湿性关节炎(Mikulowska等人，J.Immunol.158：5514-7 (1997)；Leech等人，Arthritis Rheum.41：910-7(1998)；Leech等 人，Arthritis Rheum.43：827-33(2000)；Santos等人，Clin.Exp.Immunol. 123：309-14(2001))。因此，旨在应用包含MIF作为抗原决定簇的 组合物抑制MIF活性的治疗可能有利于上述疾病。
来自小鼠、大鼠和人的MIF由114个氨基酸组成，含有三个保守半 胱氨酸，如SEQ ID NO：225(MIF rat：SwissProt)、SEQ ID NO：226 (MIF mouse：SwissProt)和SEQ ID NO：227(MIF human：SwissProt) 所示。三个亚单位构成一个同型三聚体，它不是被二硫键稳定的。已解 析了X-射线结构，显示有三个游离半胱氨酸(Sun等人，PNAS 93： 5191-96(1996))，而一些文献数据宣称存在二硫键。但是，没有半胱氨 酸暴露得足以与载体上可能的第一附着位点最佳相互作用。因此，因为 蛋白质的C端在三聚体结构中暴露，为了在本发明的优选实施方案中产 生第二附着位点，优选地在蛋白质的C端添加一个含有游离半胱氨酸残 基的氨基酸接头，如实施例4关于大鼠-MIF所述。
小鼠-MIF与大鼠-MIF之间只有一个氨基酸改变，类似地，人-MIF 与大鼠MIF或人-MIF与小鼠-MIF之间也有极高的序列同源性(约90％ 序列相同)。根据本发明的人-MIF和小鼠-MIF构建体在实施例4中描述， 并且能如所公开的产生。为了证实与本发明的核心颗粒结合的MIF蛋白 或其片段具有诱导自身特异性免疫应答的高效能，给小鼠注射与Qβ衣 壳蛋白偶联的大鼠-MIF构建体。用大鼠-MIF免疫小鼠获得高抗体效价， 这表明，用与病毒样颗粒、特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF构建体免 疫克服了对自身抗原免疫的耐受(实施例4)。因此，包含与核心颗粒结 合的，优选地与菌毛或病毒样颗粒结合的，更优选地与RNA-噬菌体的 病毒样颗粒结合的，再更优选地与RNA-噬菌体Qβ或fr结合的人-MIF 蛋白的本发明组合物，是本发明极其优选的实施方案。
然而，在MIF序列的N端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头产 生本发明另外的优选实施方案。MIF已经在大肠杆菌中表达、纯化，并 且显示具有全部功能(Bernhagen等人，Biochemistry 33：14144-155 (1994))。因此，对于产生本发明的优选实施方案，MIF优选地可以在 大肠杆菌中表达。
如果未从构建体上切下起始甲硫氨酸，MIF的互变异构酶活性受到 抑制。在大肠杆菌中表达的、实施例4描述的MIF构建体显示互变异构 酶活性。已切除起始甲硫氨酸并且序列中起始甲硫氨酸之后的脯氨酸残 基突变为丙氨酸的MIF突变体不显示互变异构酶活性，是本发明的其它 实施方案，包括于本发明的范围内。在某些特别实施方案中，用无互变 异构酶活性的MIF突变体免疫。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是白介素-17 (IL-17)。人IL-17是一种32kDa的、二硫键连接的、具有可变糖基化 的同型二聚体蛋白(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486(1995)； Fossiez，F.等人，J.Exp.Med.183：2593-2603(1996))。该蛋白质包含 155个氨基酸，包含19-23个残基的N端分泌信号序列。IL-17的氨基酸 序列仅类似于疱疹病毒蛋白(HSV13)，与其它细胞因子或已知蛋白质 没有相似性。人IL-17的氨基酸序列在SEQ ID NO：228(登录号 AAC50341)中显示，小鼠蛋白质序列在SEQ ID NO：229(登录号 AAA37490)中显示。在所评价的大量组织和细胞系中，只在激活的T 细胞和12-十四酸13-乙酸佛波酯/离子霉素刺激的外周血单核细胞中检 测到编码IL-17的mRNA转录物(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486 (1995)；Fossiez，F.等人，J.Exp.Med.183：2593-2603(1996))。人 和小鼠序列都含有6个半胱氨酸残基。
IL-17受体在许多组织和细胞型中广泛表达(Yao，Z.等人，Cytokine 9：794-800(1997))。尽管根据人IL-17受体的氨基酸序列(866个氨基 酸)可以预测一种含有一个跨膜域和一个525个氨基酸长胞内域的蛋白 质，但是该受体序列是独特的，与来自细胞因子/生长因子受体家族的任 何受体的序列没有相似性。IL-17本身与其它已知蛋白质缺乏相似性， 这些事实结合起来表明，IL-17及其受体可能是一种新的信号蛋白和受 体家族的一部分。临床研究表明，IL-17可能与多种炎症疾病有关。IL-17 由类风湿性关节炎患者的滑膜T细胞分泌，并刺激炎症介质的产生 (Chabaud，M.等人，J.Immunol.161：409-414(1998)；Chabaud，M.等 人，Arthritis Rheum.42：963-970(1999))。在类风湿性关节炎患者中报 告有高水平的IL-17(Ziolkowska等人，J.Immunol.164：2832-8(2000))。
已经显示，白介素17对鼠膝关节中的蛋白聚糖降解有影响(Dudler J.等人，Ann Rheum Dis.59：529-32(2000))，并且促使滑膜基质破坏 (Chabaud M.等人，Cytokine.12：1092-9(2000))。有相关动物关节炎 模型用来检测MIF免疫的效果(Chabaud M.等人，Cytokine.12：1092-9 (2000))。在多发性硬化症患者的单核细胞中发现IL-17mRNA水平升 高(Matusevicius，D.等人，Mult.Scler.5：101-104(1999))。在系统性 红斑狼疮患者中也发现血清IL-17水平升高(Wong C.K.等人，Lupus9： 589-93(2000))。另外，在从损伤性银屑病皮肤分离的T细胞中，IL-17 mRNA水平也升高(Teunissen，M.B.等人，J.Invest.Dermatol.111：645-649 (1998))。
IL-17与肾移植排斥的相关性也已经得到证实(Fossiez，F.等人，Int. Rev.Immunol.16：541-51(1998))。Antonysamy等人(J.Immunol.162： 577-84(1999))提出了IL-17在器官异体移植排斥中作用的证据，他们 证明IL-17促进树突细胞祖细胞的功能分化。他们的发现提示IL-17在 异体T细胞增殖中的作用，这可通过对DC的成熟诱导作用部分介导。 此外，同-小组报告(Tang J.L等人，Transplantation 72：348-50(2001)) 了IL-17在急性血管排斥的免疫发病机理中的作用，其中白介素-17的拮 抗作用抑制急性血管排斥但不抑制慢性血管排斥。IL-17似乎具有作为 同种异体移植中治疗干预新靶标的潜力。
上述发现提示IL-17在炎症反应的开始或持续中可能起关键性作用 (Jovanovic，D.V.等人，J.Immunol.160：3513-3521(1998))。
抗-IL-17单克隆抗体mAb5(Schering-Plough研究所)能够完全抑制 50ng/mlIL-17诱导后类风湿性关节炎(RA)滑膜上清液中IL-6的产生。 一种无关的mAb MX1在该试验中没有作用。mAb5是在用人rIL-17(r＝ 重组)免疫后获得的一种小鼠IgG1。在该试验系统中，浓度为1μg/ml 的mAb5能够完全抑制IL-6的产生(Chabaud M.等人，J.Immunol.161： 409-414(1998))。因此，IL-17免疫提供了一种治疗上述多种疾病的方 法。
因此，在本发明的另一个优选实施方案中，组合物包含一种接头， 该接头含有一个第二附着位点，并与重组IL-17的C端融合。然而在本 发明的其他优选的实施方案中，含有一个游离半胱氨酸的氨基酸接头与 对应于加工后蛋白序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式序列 的N端、信号肽的C端插入。对于真核表达系统，如此处所述的其它自 身抗原一样，必要时可以将IL-17基因的信号肽替换为另一种信号肽。 对于细菌中的表达，为了在周质中可溶性表达，将信号肽替换为细菌信 号肽，或者为了在细胞质中表达，将其删除。缺乏信号肽的人IL-17的 构建体优选地含有残基24-155、22-155、21-155或20-155。缺乏信号肽 的小鼠IL-17的构建体优选地含有残基26-158、25-158、24-158或27-155。 人IL-17可以在CV1/EBNA细胞中表达；重组hIL-17显示以糖基化及非 糖基化形式分泌(Yao，Z.等人，J.Immunol.155：5483-5486(1995))。 IL-17也能表达为hIL-17/Fc融合蛋白，然后从融合蛋白上切下IL-17蛋 白。IL-17也可以在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达(Murphy K.P. 等人，Protein Expr Purif.12：208-14(1998))。人IL-17也可以在大肠杆 菌中表达。当IL-17在大肠杆菌中的表达定向于周质时，将IL-17的信 号肽替换为细菌信号肽。为了在大肠杆菌细胞质中表达蛋白质，IL-17 构建体应当不含信号肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是白介素-13 (IL-13)。IL-13是由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，主要影响 单核细胞、巨噬细胞和B细胞。前体人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO： 230中显示，加工后的人IL-13的氨基酸序列在SEQ ID NO：231中显示。 前体蛋白的前20个氨基酸对应于信号肽，在加工后的蛋白质中不存在。 小鼠序列也已经报道，加工后的氨基酸序列在SEQ ID NO：232中显示 (Brown K.D.等人，J.Immunol.142：679-687(1989))。根据表达宿主， 例如为了在真核宿主中表达和分泌，IL-13构建体将包含前体蛋白的序 列，或者例如为了在大肠杆菌中细胞质表达，由成熟蛋白质组成。为了 在大肠杆菌周质中表达，IL-13的信号肽替换为细菌信号肽。
IL-13是一种T辅助细胞2产生的细胞因子(类似于IL-4、IL-5)， 最近表明它与变态反应气管反应(哮喘)有关。在多种肿瘤类型(例如 何杰金淋巴瘤)中发现了IL-13和IL-13受体的正调节。白介素13由何 杰金和里-施细胞分泌并刺激它们的生长(Kapp U等人，J Exp Med.189： 1939-46(1999))。因此，IL-13免疫提供了一种治疗上述疾病(如哮 喘或何杰金淋巴瘤)的方法。
优选地，该组合物包含一种氨基酸接头，该接头含有一个游离半胱 氨酸残基并与成熟IL-13序列的N端或C端融合，以在该蛋白质内引入 一个第二附着位点。在其他优选的实施方案中，向IL-13成熟形式的N 端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头，因为根据IL-13的NMR结 构，该N端可以自由接近(Eisenmesser，E.Z.等人，J.Mol.Biol.310：231 (2001)。在进一步优选的实施方案中，含游离半胱氨酸的氨基酸接头 与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式 的序列N端、信号肽的C端插入。在进一步优选的实施方案中，向该蛋 白质的C端添加一个含游离半胱氨酸的氨基酸接头。
IL-13可以在大肠杆菌(Eisenmesser，E.Z.等人，Proten Expr.Purif.20： 186-95(2000))或NS-0细胞(真核细胞系)(Cannon-Carlson S.等人， Protein Expr.Purif.12：238-48(1998))中表达。实施例9描述了与含半 胱氨酸残基的氨基酸接头融合的鼠IL-13的构建体和该构建体在细菌和 真核宿主中的表达。人IL-13构建体可以按照实施例9所述制备，融合 蛋白表达并分别用因子Xa和肠激酶切割后，产生蛋白质人C-IL-13-F (SEQ ID NO：330)和人C-IL-13-S(SEQ ID NO：331)。这样产生的 蛋白质能与VLP和菌毛偶联，产生本发明的优选实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，抗原决定簇是白介素-5(IL-5)。IL-5 是用于嗜酸性粒细胞生成(eosinophilopoiesis)的一种谱系特异性细胞因 子，在与嗜酸性粒细胞数量升高有关的疾病(如哮喘)中起重要作用。 前体和加工后人IL-5的序列分别在SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：234 中列出，加工后的小鼠氨基酸序列在SEQ ID NO：235中显示。
在几项研究中显示了IL-5的生物学功能(Coffman R.L.等人，Science 245：308-10(1989)；Kopf等人，Immunity 4：15-24(1996))，指出了 在嗜酸性粒细胞介导的疾病中抑制IL-5功能的有利作用。IL-5作用的抑 制提供了一种治疗哮喘和与嗜酸性粒细胞有关的其它疾病的方法。
IL-5通过一个二硫键共价连接形成一种二聚体。曾经报告了一种单 链(sc)构建体，其中两个IL-5单体通过一个肽接头连接。
在本发明的优选实施方案中，在IL-5加工后形式的序列N端添加一 个含游离半胱氨酸的肽接头。优选地也可以在scIL-5加工后形式的序列 N端添加一个含游离半胱氨酸的接头。在其他优选的实施方案中，含游 离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融合， 或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。
在另外优选的实施方案中，含游离半胱氨酸的接头与IL-5序列的C 端融合，或者与scIL-5序列的C端融合。
曾经描述了可用于IL-5的多种表达系统，它们可以用于制备本发明 的组合物。Proudfoot等人(Biochem J.270：357-61(1990))描述了一 种采用大肠杆菌的细菌表达系统。如果在大肠杆菌的细胞质中表达IL-5， IL-5构建体不含信号肽。为了制备本发明的组合物，也可以用昆虫细胞 生产IL-5构建体(Pierrot C.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.253： 756-60(1998))。同样，也可以采用杆状病毒表达系统(sf9细胞；Ingley E.等人，Eur.J.Biochem.196：623-9(1991)和Brown P.M.等人，Protein Expr.Purif.6：63-71(1995))。最后，也曾报告哺乳动物表达系统(CHO 细胞)，并可用于制备本发明的组合物(Kodama S等人，J.Biochem. (Tokyo)110：693-701(1991))。
也已报道了用于小鼠IL-5的杆状病毒表达系统(Mitchell等人， Biochem.Soc.Trans.21：332S(1993)；Kunimoto DY等人，Cytokine 3： 224-30(1991))和采用CHO细胞的哺乳动物细胞表达系统(Kodama S 等人，Glycobiology 2：419-27(1992))。
实施例10描述了鼠IL-5构建体的表达，其中为了与VLP和菌毛偶 联，IL-5序列在其N端与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合。人构建 体可按照实施例10所述制备，产生适于与VLP和菌毛偶联从而产生本 发明优选实施方案的蛋白质人C-IL-5-E(SEQ ID NO：335)、人C-IL-5-F (SEQ ID NO：336)和人C-IL-5-S(SEQ ID NO：337)。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是CCL-21。CCL-21 是CC亚家族的一种趋化因子，也被称为诱导型小细胞因子A21、 exodus-2、SLD(次级淋巴细胞细胞因子)、TCA4(胸腺来源的趋化剂4) 或6Ckine。
CCL21抑制血细胞生成并刺激胸腺细胞、激活的T细胞和树突细胞 的趋化性，但不刺激B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的趋化性。它显 示对幼稚T细胞具有优先活性。它也是一种肾小球系膜细胞的强化学引 诱剂。CCL21可结合趋化因子受体CCR7和CXCR3(取决于物种)。它 能在生理剪切下触发依赖整联蛋白的淋巴细胞翻滚的快速终止，并由高 内皮微静脉高度表达。
在人肺癌SCID小鼠模型(Arenberg等人，Cancer Immunol. Immunother.49：587-92(2001))和小鼠结肠癌肿瘤模型(Vicari等人， J.Immunol.165：1992-2000(2001))中，鼠CCL21抑制肿瘤生长和血 管生成。在大鼠角膜微袋试验中也检测到了鼠CCL21的血管抑制活性 (Soto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：8205-10(1998))。
已经表明，在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4被正调 节，其各自的配体CCL21和CXCL12在作为乳腺癌第一转移目标的器 官中高度表达(Müller等人，Nature 410：50-6(2001))。体外CCL21 介导的趋化作用能被中和性抗-CCL21抗体阻断，正如CXCR4-介导的趋 化作用能被对应的抗体阻断。因此，CCL21免疫提供了一种治疗癌症(更 具体而言是乳腺癌)转移扩散的方法。
分泌的CCL21在小鼠和人类中分别由110或111个氨基酸组成。其 各自的序列在SEQ ID NO：236(Swissprot：SY21 human)和SEQ ID NO： 237(Swissprot：SY21 mouse)中显示。与其它CC细胞因子不同，CCL21 在C端延伸区内含有两个额外的半胱氨酸。假定所有半胱氨酸都参与二 硫键。
下文描述了用来制备包含CCL21抗原决定簇的本发明组合物的构 建体和表达系统。在同源蛋白质嗜酸细胞活化趋化因子的NMR结构中， N端和C端都暴露于溶剂。在某些具体实施方案中，在蛋白质C端添加 一个含游离半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头。曾经表达了一种 含碱性磷酸酶(在CCL21的C端)的融合蛋白，显示具有功能性，表 明在CCL21的C端融合与受体结合相容。在其它具体实施方案中，含 游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列的序列N端融 合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。
曾经描述了用于生产CCL21的几种表达系统(例如，Hedrick等人， J Immunol.159：1589-93(1997))。例如，可以在杆状病毒系统中表达 (Nagira等人，J.Biol.Chem.272：19518-24(1997))。
在一个相关的优选实施方案中，抗原决定簇是基质衍生因子-1 (SDF-1)，现在称为CXCL12。CXCL12是骨髓基质细胞产生的一种趋 化因子，最初被确定为前B细胞的一种刺激因子。
如上所述，已经表明，在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4 被正调节，而其各自的配体CCL21和SDF-1在作为乳腺癌转移第一目 标的器官中高度表达(Müller等人，Nature 410：50-6(2001))。体外 SDF-1/CXCR4介导的趋化作用能被中和性抗-SDF-1抗体和抗-CXCR4- 抗体抑制。
在采用人MDA-MB-231乳腺癌细胞系的SCID小鼠乳腺癌转移模型 中，当用抗-CXCR4抗体处理小鼠时，观察到肺转移显著减少。在引流 的淋巴结中，观察到向腹股沟和腋窝淋巴结的转移减少(38％转移，而 在对照中为100％)。因此，CXCL12免疫提供了一种治疗癌症(特别 是乳腺癌)转移的方法。
已经表明，SDF-1/CXCR4趋化因子受体对能提高更多原始造血祖细 胞向骨髓归巢的效能。另外，还推断CXCR4和SDF-1能影响慢性淋巴 细胞白血病细胞的分布。这些细胞不停地浸润患者的骨髓，显示它们在 骨髓中的迁移是依赖于CXCR4的。慢性淋巴细胞白血病细胞经历凋亡， 除非它们与基质细胞共培养。SDF-1阻断抗体能抑制基质细胞的这种保 护作用(Burger等人，Blood 96：2655-63(2000))。因此CXCL12免疫 提供了一种治疗慢性淋巴细胞白血病的方法。
已经表明，CXCR4是HIV进入T细胞的一种共同受体。SDF-1抑 制CD4+细胞的X4(CXCR4依赖的)HIV株感染(Oberlin等人，Nature 382：833-5(1996)；Bleul等人，Nature 382：829-33(1996)；Rusconi 等人，Antivir.Ther.5：199-204(2000))。已证明SDF-1的合成肽类似 物可有效抑制HIV-1通过CXCR4受体进入并感染(WO059928A1)。因 此，CXCL12免疫提供了一种阻断HIV进入T细胞的方法，因而提供了 一种治疗AIDS的方法。
也曾报告SDF-1-CXCR4相互作用在类风湿性关节炎滑膜中的CD4+ T细胞积累中起关键作用(Nanki等人，2000)。因此SDF-1免疫提供了 一种治疗类风湿性关节炎的方法。
已知人和鼠SDF-1通过一种基因的不同剪接以两种形式存在 -SDF-1α和SDF-1β。它们的不同在于4个C端氨基酸，在SDF-1β中存 在(74个氨基酸)而在SDF-1α中不存在(70个氨基酸)。人SDF-1序 列在SEQ ID NO：238中显示(Swissprot：SDF1 human)，鼠SDF-1序 列在SEQ ID NO：239中显示(Swissprot：SDF1 mouse)。SDF-1含有4 个保守半胱氨酸，形成两个分子内二硫键。SDF的晶体结构显示为一种 非共价连接的二聚体(Dealwis等人，PNAS 95：6941-46(1998))。SDF-1 结构也显示长N端延伸。
利用丙氨酸扫描诱变鉴定了SDF-1上的(部分)受体结合位点 (Ohnishi等人，J.Interferon Cytokine Res.20：691-700(2000))，Elisseeva 等人(J.Biol.Chem.275：26799-805(2000))和Heveker等人(Curr.Biol. 8：369-76(1998))描述了抑制受体结合(和HIV进入)的SDF-1衍生 的肽。
下文描述了适于生产与SDF-1有关的本发明组合物的构建体和表达 系统。SDF-1的N端和C端暴露于溶剂。在具体实施方案中，含有一个 半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头与蛋白质序列的C端融合，而 在其它具体实施方案中，含有一个半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸 接头与蛋白质序列的N端融合。含有一个游离半胱氨酸的氨基酸接头与 对应于加工后蛋白质序列的序列的N端融合，或在蛋白质成熟形式的序 列的N端、信号肽的C端插入。编码这些特定构建体的基因可以克隆到 适当的表达载体中。
已报道了SDF-1在鸡胚成纤维细胞仙台病毒系统中的表达(Moriya 等人，FEBS Lett.425：105-11(1998))以及在大肠杆菌中的表达(Holmes 等人，Prot.Expr.Purif.21：367-77(2001))和SDF-1的化学合成(Dealwis 等人，PNAS 95：6941-46(2001))。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是BLC。B淋巴细 胞化学引诱剂(BLC，CXCL13)在脾脏、派尔结和淋巴结中表达(Gunn 等人，1998)。它在生发中心的表达最强烈，在这里B细胞经历体细胞 突变和亲和力成熟。它属于CXC趋化因子家族，其最接近的同源物是 GROα(Gunn等人，Nature 391：799-803(1998))。人BLC与鼠BLC 64％同源。其受体为CXCR5。BLC与IL-8也有同源性。BLC向次级淋 巴器官(如脾脏和派尔结)的滤泡中补充B细胞。向富含滤泡状树突细 胞(FDC)的淋巴结区室中补充B细胞也需要BLC(Ansel等人，Nature 406：309-314(2000))。BLC也诱导淋巴毒素α1β2(LT？α1β2)在补充 的B细胞上的增强表达。这提供了一种正反馈环，因为LT？α1β2促进 BLC表达(Ansel等人，Nature 406：309-314(2000))。BLC也显示能 诱导淋巴新生(Luther等人，Immunity 12：471-481(2000))。FDC似 乎也表达BLC。因此BLC免疫可提供一种治疗与淋巴新生有关的自身 免疫病(如类风湿性滑膜炎和类风湿性关节炎或I型糖尿病)的方法。 已经描述了携带C端his尾的一种BLC构建体，它具有功能性(Ansel， K.M.等人，J.Exp.Med.190：1123-1134(1999))。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含一种接头，该 接头含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点，并在BLC序列的C端 融合。
在与BLC同源的IL-8中，N端和C端都是游离的。因此在另一个 优选实施方案中，向BLC的N端添加一个含有半胱氨酸作为第二附着 位点的氨基酸接头，产生本发明的这种具体组合物。
在本发明的另一些优选的实施方案中，组合物包含一种含游离半胱 氨酸的氨基酸接头，该接头与对应于加工后蛋白质序列的序列的N端融 合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的C端插入。编码 这些具体构建体的基因可以克隆到适当的表达载体中，并相应地表达。 人BLC的序列在SEQ ID NO：240中显示(登录号：NP_006410)。该 序列的氨基酸1-22是信号肽。鼠序列在SEQ ID NO：241中显示(登录 号：NP_061354)。氨基酸1-21是信号肽。为了产生本发明的组合物， 含有BLC作为抗原决定簇的本发明组合物优选地采用蛋白质的成熟形 式。
在另一个具体实施方案中，抗原决定簇是嗜酸细胞活化趋化因子。 嗜酸细胞活化趋化因子是趋化因子受体3特异的一种趋化因子，存在于 嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞上。然而，嗜酸细胞活化趋化 因子似乎是嗜酸性粒细胞高度特异的(Zimmerman等人，J.Immunol. 165：5839-46(2000))。在嗜酸细胞活化趋化因子-1敲除小鼠中，嗜酸 性粒细胞的迁移减少70％，然而其仍能发展为嗜酸性细胞增多症 (Rothenberg等人，J.Exp.Med.185：785-90(1997))。IL-5似乎负责 嗜酸性粒细胞从骨髓向血液中的迁移，嗜酸细胞活化趋化因子负责在组 织中的局部迁移(Humbles等人，J.Exp.Med.186：601-12(1997))。
人类基因组含有3种嗜酸细胞活化趋化因子基因：嗜酸细胞活化趋 化因子1-3。它们彼此具有30％的同源性。迄今为止知道在小鼠中有两 种基因：嗜酸细胞活化趋化因子1和嗜酸细胞活化趋化因子2 (Zimmerman等人，J.Immunol.165：5839-46(2000))。它们具有38％ 的同源性。鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2与人嗜酸细胞活化趋化因子-2有 59％的同源性。在小鼠中，嗜酸细胞活化趋化因子-1似乎在胃肠道中普 遍表达，而嗜酸细胞活化趋化因子-2似乎主要在空肠中表达(Zimmerman 等人，J.Immunol.165：5839-46(2000))。在支气管-肺泡液中存在嗜酸 细胞活化趋化因子-1(Teixeira等人，J.Clin.Invest.100：1657-66(1997))。 人嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在SEQ ID NO：242中显示(氨基酸 1-23对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID NO： 243中显示(氨基酸1-26对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-3 的序列在SEQ ID NO：244中显示(氨基酸1-23对应于信号肽)，小鼠 嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列在SEQ ID NO：245中显示(氨基酸1-23 对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列在SEQ ID NO： 246中显示(氨基酸1-23对应于信号肽)。
嗜酸细胞活化趋化因子的分子量为8.3kDa。它在多种条件下在单体 与二聚体之间取得平衡，在37℃下估计的Kd为1.3mM(Crump等人， J.Biol.Chem.273：22471-9(1998))。然而单体形式是主要的。嗜酸细 胞活化趋化因子的结构已经通过NMR波谱法阐明。与其受体CCR3的 结合部位位于N端，第一个半胱氨酸之前的区域是非常重要的(Crump 等人，J.Biol.Chem.273：22471-9(1998))。与嗜酸细胞活化趋化因子 结合的趋化因子受体肽证实了这一发现。嗜酸细胞活化趋化因子含有4 个半胱氨酸，形成2个二硫键。因此，在一个优选实施方案中，本发明 的组合物包含一种含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点的氨基酸 接头，优选地与嗜酸细胞活化趋化因子序列的C端融合。在其它优选实 施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工后蛋白质序列 的序列的N端融合，或者在该蛋白质成熟形式的序列的N端、信号肽的 C端插入。将编码这些特定构建体的基因克隆到适当的表达载体中。
嗜酸细胞活化趋化因子能够化学合成(Clark-Lewis等人， Biochemistry 30：3128-3135(1991))。也描述了嗜酸细胞活化趋化因子 -1在大肠杆菌细胞质中的表达(Crump等人，J.Biol.Chem.273：22471-9 (1998))。曾经描述了嗜酸细胞活化趋化因子-2在大肠杆菌中表达为随 后重折叠的包涵体(Mayer等人，Biochemistry 39：8382-95(2000))， 和昆虫细胞表达(Forssmann等人，J.Exp.Med.185：2171-6(1997))， 而且可用来实现本发明的特定实施方案。
在本发明的另一个具体实施方案中，抗原决定簇是巨噬细胞集落刺 激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-1是巨噬细胞及其骨髓祖细 胞增殖、分化和存活的一种调节剂。M-CSF的受体是一种细胞表面酪氨 酸激酶受体，由原癌基因cfms编码。M-CSF及其受体表达增强与几种 上皮癌(如乳腺癌、子宫癌和卵巢癌)的预后不良有关。易患乳癌的转 基因小鼠(PyMT)与在csf-1基因中含有隐性无效突变的小鼠杂交，产生 一种小鼠品种，用该小鼠品种研究肿瘤的进展。与PyMT小鼠相比，这 些小鼠显示晚期侵袭性癌症和肺转移均减弱(Lin等人，J.Exp.Med.193： 727-739(2001))。原因似乎是没能向肿瘤组织中补充巨噬细胞。Lewis 肺癌的皮下生长在csf.1裸鼠中也减弱。推断巨噬细胞增强肿瘤生长的机 制是通过巨噬细胞产生的血管生成因子、生长因子和蛋白酶。
已经有M-CSF可溶性形式的结构数据(晶体结构：Pandit等人， Science 258：1358-62(1992))，表明蛋白质的N端和C端都可以接近。 然而，N端靠近与受体相互作用的部分。另外，M-CSF以可溶性和细胞 表面两种形式存在，跨膜区位于C端。因此，在本发明的一个优选实施 方案中，本发明的组合物包含一种含有一个半胱氨酸的氨基酸接头，优 选地在M-CSF或其片段的C端添加，或者优选地在M-CSF可溶性形式 或其片段的C端添加。在另外的优选实施方案中，含有游离半胱氨酸的 氨基酸接头与对应于加工后蛋白质或该蛋白质可溶性形式序列的序列N 端融合，或者在该蛋白质成熟形式或该蛋白质可溶性形式序列的N端、 信号肽的C端插入。M-CSF是一种二聚体，其中两个单体通过一个链间 二硫键连接。
曾经描述了用于M-CSF N端149个氨基酸片段(功能性)的一种大 肠杆菌表达系统(Koths等人，Mol.Reprod.Dev.46：31-37(1997))。 M-CSF的这种片段，优选如上所述修饰修饰过的，是本发明的一种优选 的抗原决定簇。
人序列在SEQ ID NO：247中显示(登录号：NP 000748)。本发明 另外优选的抗原决定簇包括由SEQ ID NO：247的残基33-181或33-185 组成的N端片段，这对应于该受体的可溶性形式。
小鼠序列(登录号：NP 031804)在SEQ ID NO：248中显示。成 熟序列从氨基酸33开始。因此，本发明的一种优选抗原决定簇包括氨 基酸33-181或33-185。
在另一个具体实施方案中，抗原决定簇是抵抗素(Res)。用细菌中 表达产生的、针对小鼠抵抗素(mRes)与GST融合蛋白的兔多克隆抗 体进行被动免疫研究。在动物肥胖症/II型糖尿病模型上，这种被动免疫 导致葡萄糖摄取增强(Steppan等人，Nature 409：307-12(2001))。
抵抗素(Res)是约12 KD的一种114个氨基酸的肽类激素。它含 有11个半胱氨酸，其中最N端的一个显示负责蛋白质的二聚化，其它 10个被认为参与分子内二硫键(Banerjee和Lazar，J.Biol.Chem.276： 25970-3(2001))。第一个半胱氨酸突变为丙氨酸破坏了mRes的二聚化。
已经显示，在一动物模型中，在C端含有FLAG尾的mRes仍保留 活性(Steppan等人，Nature 409：307-12(2001))，类似地，C端具有 HA尾(血凝素尾)的抵抗素形式在组织培养测定中有活性(Kim等人， J.Biol.Chem.276：11252-6(2001))，这提示C端对引入修饰不是特别 敏感。因此，在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含一种含有半 胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头，其融合在抵抗素序列的C端。 在另外的优选实施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加 工后蛋白质序列的序列N端融合，或者在该蛋白质成熟形式序列的N端、 信号肽的C端插入。
作为本发明的一个优选实施方案，MRes或huRes也可以在真核表 达系统中表达为Fc融合分子，其在抵抗素与构建体Fc部分之间，优选 地在融合蛋白Fc部分铰链区的一个或多个半胱氨酸残基的C端，含有 一个蛋白酶切割位点，或者更优选地按照实施例2的描述和公开内容表 达。切割融合蛋白释放出抵抗素，它还包含一个如实施例2所述的含有 半胱氨酸残基的氨基酸接头，或含有融合蛋白Fc部分的部分或全部铰 链区，后者在C端含有半胱氨酸残基，适于与VLP或菌毛偶联。人抵 抗素序列在SEQ ID NO：249中显示(登录号：AF323081)。小鼠序列 在SEQ ID NO：250中显示(登录号：AF323080)。本发明的一个优选 实施方案是在C端与一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头融合的人抵抗素 蛋白。人抵抗素构建体可以按照实施例2的公开内容制备，并通过蛋白 质序列比对比较鼠与人抵抗素序列，确定将要按照实施例2所述克隆到 实施例1和实施例2所述载体或其它适当表达载体中的人抵抗素序列的 部分。适用于生产本发明组合物的人抵抗素构建体的例子有人抵抗素 -C-Xa(SEQ ID NO：325)、人抵抗素-C-EK(SEQ ID NO：326)和人抵 抗素-C(SEQ ID NO：327)。
这样产生的人抵抗素构建体是本发明的一个优选实施方案。因此应 用上述本发明的组合物进行抵抗素接种可以提供一种治疗II型糖尿病和 肥胖症的方法。
在另一个实施方案中，抗原决定簇是淋巴毒素-β。淋巴毒素-β免疫 可用于治疗朊病毒介导的疾病。羊瘙痒病(一种朊病毒介导的疾病)病 原体复制被认为主要在淋巴组织中发生，并且依赖于表达朊病毒-蛋白质 的滤泡状树突细胞(FDC)(Brown等人，Nature Med.11：1308-1312 (1999))。随后表明，缺乏功能性滤泡状树突细胞的小鼠显示脾脏中 的朊病毒复制减弱，神经侵袭(略微)延迟(Montrasio等人，Science 288： 1257-1259(2000))。给小鼠注射可溶性淋巴毒素-β受体-Fc-融合蛋白 (LTβR-Fc)可实现这一点。这种可溶性受体构建体通过干扰T、B或 NK细胞上淋巴毒素-β与FDC前体细胞上淋巴毒素-β受体的相互作用， 抑制FDC的发育。因此，淋巴毒素-β(也称为TNFγ)接种可以提供一 种治疗或预防克-雅氏病(变型)或其它朊病毒介导的疾病的疫苗，从而 防止朊病毒复制和神经侵袭。
淋巴毒素-β免疫也可以提供一种治疗糖尿病的方法。在不肥胖的糖 尿病NOD小鼠中转基因表达可溶性LTβR-Fc融合蛋白阻止了糖尿病发 展，但不能阻止胰岛炎的发展(Ettinger等人，J.Exp.Med.193：1333-40 K(2001))。Wu等人(J.Exp.Med.193：1327-32(2001))也采用NOD 小鼠研究淋巴毒素-β的作用，但他们不采用转基因动物，而是注射 LTβR-Fc融合蛋白。他们观察到糖尿病发展的强烈抑制和胰岛炎的抑制。 最令人感兴趣的是，通过融合蛋白治疗甚至能逆转业已存在的胰岛炎。 胰脏中淋巴滤泡结构的形成于是能被逆转。因此，淋巴毒素-β接种提供 了一种治疗I型糖尿病的方法。
人淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO：250中显示 (TNFC_human)，鼠淋巴毒素-β胞外域的序列在SEQ ID NO：251中显 示(TNFC_mouse)。
在又一个优选的实施方案中，本发明组合物包含一种含有一个游离 半胱氨酸的氨基酸接头，其添加于对应于淋巴毒素-β加工后形式序列的 N端，或者插入对应于该蛋白质成熟形式的序列N端与信号肽之间，或 在信号肽的C端侧。在本发明另外的优选实施方案中，淋巴毒素-β的胞 外部分表达为一种融合蛋白，它含有在N端与淋巴毒素-β融合的谷胱甘 肽-S-转移酶，或者含有在N端与淋巴毒素-β胞外部分融合的6组氨酸 尾，其后为myc-尾。含有蛋白酶切割位点的氨基酸间隔区以及在蛋白酶 切割位点的C端含有一个游离半胱氨酸作为第二附着位点的接头序列与 淋巴毒素-β胞外部分序列的N端融合。优选地，淋巴毒素-β的胞外部 分由对应于淋巴毒素-β氨基酸49-306或126-306的片段组成。本发明的 这些具体组合物可以在pCEP-Pu真核载体中克隆并表达。在另外的优选 实施方案中，本发明组合物包含一种氨基酸接头，该接头含有一个适于 作为第二附着位点的游离半胱氨酸残基，该接头与淋巴毒素-β或淋巴毒 素-β片段的C端融合。在一个特别优选的实施方案中，氨基酸序列 LACGG与淋巴毒素-β胞外部分或淋巴毒素-β胞外部分之片段的N端融 合，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接头ACGG，该接头本身含有一个 可与VLPS和菌毛偶联的半胱氨酸残基，在用肠激酶切割如实施例3所 述在载体pCEP-SP-GST-EK或载体pCP-SP-his-myc-EK中表达的相应融 合蛋白后，产生蛋白质人C-LT·49-306(SEQ ID NO：346)和人C-LT·126-306 (SEQ ID NO：347)。
在一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇是朊病毒蛋白、其片段， 特别是朊病毒蛋白的肽。在一个实施方案中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋 白。在整个说明书特别是在实施例7中提供了关于如何修饰人朊病毒蛋 白以便与核心颗粒结合的指南。小鼠朊病毒蛋白构建体已经公开，也可 以建立人朊病毒蛋白构建体，并且含有例如SEQ ID NO：348的序列。 其它构建体包含人朊病毒蛋白完整序列或人朊病毒蛋白的其它片段，它 们是本发明的其它组合物。朊病毒蛋白免疫可以提供一种治疗或预防克 -雅氏症(变型)或其它朊病毒蛋白引起的疾病的方法。用包含朊病毒蛋 白的本发明组合物免疫可以提供一种治疗其它动物中朊病毒介导的疾 病的方法，牛和绵羊的朊病毒蛋白构建体的相应序列分别在SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：350中列出。对应于实施例8所述鼠肽的人朊 病毒蛋白的肽，和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(“人 cprplong”)和CGSDYEDRYYRENMHR(“人cprpshort”)的肽，是本发明 的优选实施方案。这些肽包含用于与VLP和菌毛偶联而添加的一个N 端半胱氨酸残基。相应的牛和绵羊的肽是 CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(“牛cprplong”)和 CGNDYEDRYYRENMHR(“牛cprpshort”)、 CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(“绵羊cprplong”)和 CGNDYEDRYYRENMYR(“绵羊cprpshort”)，均为本发明的实施方案。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是肿瘤坏死因子α (TNF-α)、其片段或TNF-α的肽。特别是，通过分别用包含本发明的这 些肽或片段的疫苗和组合物免疫人或动物，能用TNF-α的肽或片段诱导 针对整个蛋白质的自身特异性免疫应答。优选地，用VLP、噬菌体或细 菌菌毛作为核心颗粒，TNF-α、其肽或片段根据本发明与之附着。
下列鼠肽是人肽的鼠同源物，它们显示能被中和TNF-α活性的抗体 结合(Yone等人，J.Biol.Chem.270：19509-19515)，在本发明的另一 个优选的实施方案中，为了与VLP、噬菌体或细菌菌毛偶联，将其用半 胱氨酸残基修饰。
MuTNF-α肽：在由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基22-32组成的表位 N端添加序列CGG：CGGVEEQLEWLSQR。
3’TNF II肽：序列CGG在由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基4-22组成 的表位C端融合，21位谷氨酰胺突变为甘氨酸。产生的肽的序列为： SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC。
5’TNF II肽：一个半胱氨酸残基与由成熟鼠TNF-α的氨基酸残基 4-22组成的表位N端融合，21位谷氨酰胺突变为甘氨酸。产生的肽的 序列为：CSSQNSSDKPVAHVVANHGV。
4-22表位相应的人序列是SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ。如鼠 序列一样，为了根据本发明与VLP、噬菌体或细菌菌毛共价偶联，一个 半胱氨酸优选地在该表位的N端融合，或者序列GGC在该表位的C端 融合。然而，本发明的范围内也包括其他含有半胱氨酸的序列在表位N 端或C端融合。通常，优选地在添加的半胱氨酸残基与表位序列之间插 入一个或两个甘氨酸残基。然而，也可以插入其它氨基酸代替甘氨酸残 基，这些氨基酸残基优选地是小氨基酸，如丝氨酸。
对应于氨基酸残基22-32的人序列是QLQWLNRRANA。优选地， 为了根据本发明与VLP或细菌菌毛共价偶联，序列CGG在表位的N端 融合。适用于本发明的其它TNF-α表位也已经被描述并公开，例如Yone 等人(J.Biol.Chem.270：19509-19515)所述。
本发明还包括含有此处所述抗原或抗原决定簇的模拟位的组合物。
本发明的该具体组合物包含在病毒样颗粒或菌毛上呈现的抗体或 (优选地)抗体片段，以诱导针对该抗体的免疫应答。为了诱发针对淋 巴瘤的保护性免疫应答，可以选择淋巴瘤细胞产生的抗体或抗体片段， 与病毒样颗粒附着并免疫。
在其它实施方案中，模拟一种抗原的抗体或抗体片段与颗粒附着。 这种模拟的抗体或抗体片段可以按如下产生：用本领域公知的任何已知 方法免疫、随后分离模拟抗体或抗体片段，这类方法包括，例如：杂交 瘤技术(Gherardi，E.等人，J.Immunol.Methods 126：61-68(1990))、 噬菌体展示(Harrison等人，Methods Enzymol.267：83-109(1996))、 核糖体展示(Hanes，J.等人，Nat.Biotechnol.18：1287-1292(2000))、 酵母双杂交(Visintin，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11723-11728 (1999))、酵母表面展示(Boder，ET.& Wittrup，KD.Methods.Enzym. 328：430-444(2000))、细菌表面展示(Daugherty，PS.等人，Protein Eng. 12：613-621(1999))。模拟抗体也可以用本领域公知的方法(如上述方 法)从抗体库或原初抗体库中分离。
在另一个实施方案中，可以使用一种可识别另一种抗体的结合部位 的抗体，即抗独特型抗体，也称为免疫性抗体。可被抗独特型抗体识别 的抗体也称为中和抗体。因此，通过抗独特型抗体免疫，具有中和抗体 特异性的分子在原处产生；我们将产生的这些抗体称为诱导抗体。在另 一个优选实施方案中，选择免疫抗体，与免疫靶分子的配体分子相互作 用。配体分子可以是与靶分子相互作用的任何分子，但优先与需要产生 抗体以抑制其功能的靶分子的位点相互作用。配体分子可以是靶分子的 天然配体，或者可以是任何改构、设计或分离的具有适当结合特性的配 体。
免疫性抗体可以是来源于人的，如从原初或免疫人抗体库中分离， 或者可以从另一种动物来源(例如鼠源)的文库中分离。
抗体或抗体片段与VLP或菌毛的偶联如下实现：有限还原暴露的二 硫键(例如Fab片段中CH1与Cκ或Cλ之间的链间二硫键)，或者含有 一个游离半胱氨酸的接头在抗体或抗体片段C端融合。在另一个实施方 案中，为了与VLP或菌毛蛋白附着，含有一个游离半胱氨酸残基的接头 与抗体或抗体片段的N端融合。
本领域公知一些采用模拟位的疫苗组合物，以及生产并鉴定特定表 位的模拟位的方法。例如，Arnon等人，Immunology 101：555-562(2000) 描述了针对曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的基于模拟位肽的疫苗， 其完整公开内容在此引用作为参考。这些疫苗采用的模拟位如下获得： 筛查固相8mer随机肽库，鉴定可被针对曼氏血吸虫的保护性单克隆抗 体识别的表位的模拟位。类似地，Olazewska等人，Virology 272：98-105 (2000)描述了模拟麻疹病毒融合蛋白表位的合成肽的鉴定，以及这些 肽在免疫小鼠中的应用，其完整公开内容在此引用作为参考。另外， Zuercher等人，Eur.J.Immunol.30：128-135(2000)描述了利用表位展 示性噬菌体进行口服抗-IgE免疫的组合物和方法，其完整公开内容在此 引用作为参考。特别是，表位展示性M13噬菌体被用作一种口服抗-IgE 疫苗的载体。试验的疫苗组合物含有单克隆抗-IgE抗体BSW17的模拟 位和表位。
本发明因此包括含有可引发针对特定抗原的免疫应答的模拟位的疫 苗组合物，以及组成这些疫苗组合物的具体模拟位/核心颗粒偶联物和具 体模拟位/非天然分子支架偶联物，本发明还包括这些疫苗组合物引发针 对特定抗原或抗原决定簇的免疫应答的用途。模拟位也可以是多肽，如 抗独特型抗体。因此，在本发明的又一个优选的实施方案中，抗原或抗 原决定簇是一种抗独特型抗体或抗独特型抗体片段。
本发明还包括含有此处所述抗原或抗原决定簇的模拟位的组合物。
特定抗原的模拟位可以用多种方法产生或鉴定，包括筛查随机肽噬 菌体展示文库(参见，例如：PCT公布号WO97/31948，其完整内容在 此引用作为参考)。为了鉴定可结合一种或多种具有特定抗原特异性的 抗体的肽，通常进行这些文库的筛查。
适用于本发明疫苗组合物的模拟位可以是线性或环状的肽。作为线 性或环状肽的模拟位可以通过一个肽键以外的键与非天然分子支架或 核心颗粒连接。
如上所述，已经鉴定了一些可引发针对人IgE分子的免疫应答的人 IgE模拟位和表位(参见，例如：PCT公开号WO97/31948)。因此，在 某些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括可引发针对免疫球蛋白分子 (例如IgE分子)的免疫应答的组合物。
可用来引发这种免疫应答的肽包括蛋白质、蛋白质亚单位、IgE分 子的结构域和能诱导产生具有IgE分子特异性的抗体的模拟位。用来制 备疫苗组合物的IgE分子部分通常来源于将要施用该组合物的物种的 IgE分子。例如，准备对人类施用的疫苗组合物通常含有人IgE分子的 一个或多个部分，和/或一个或多个能引发针对人IgE分子的免疫应答的 模拟位。
在具体实施方案中，用于人的本发明疫苗组合物含有SEQ ID NO： 176；登录号AAB59424(SEQ ID NO：176)所示IgE重链恒定区的至 少一部分。在更特别的实施方案中，用来制备本发明疫苗组合物的IgE 肽包含或者由具有下列氨基酸序列的肽组成：CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO：178)。
在其它具体实施方案中，本发明疫苗组合物含有至少一种模拟位， 该模拟位能引发可产生具有特定抗原特异性的抗体的免疫应答。
适于制备本发明疫苗组合物的IgE模拟位的例子包括具有下列氨基 酸序列的肽： 模拟位 SEQ ID NO 模拟位 SEQ ID NO INHRGYWV RNHRGYWV RSRSGGYWLW VNLTWSRASG C.H3表位 VNLPWSRASG VNLTW SFGLE VNLPWSFGLE C.H3模拟位 VNRPWSFGLE 179 180 181 182 183 184 185 186 VKLPWRFYQV VWTACGYGRM GTVSTLS LLDSRYW QPAHSLG LWGMQGR LTLSHPHWVLNHFVS SMGPDQTLR VNLTWS GEFCINHRGYWVCGDPA 187 188 189 190 191 192 193 194 195 216
C.α疫苗颗粒的制备
本发明提供用于构建有序、重复抗原阵列的新型组合物和方法。本 领域技术人员会知道，有序、重复抗原阵列的装配条件很大程度上取决 于具体非天然分子支架的第一附着位点的选择和具体抗原或抗原决定 簇的第二附着位点的选择。因此，技术人员在组合物设计中的选择(即 第一和第二附着位点、抗原和非天然分子支架的选择)将决定α疫苗颗 粒(结合后的有序、重复的抗原阵列与非天然分子支架)装配的具体条 件。技术人员知道关于α疫苗颗粒装配的信息，并且有大量参考文献可 以帮助技术人员(例如，Sambrook，J.等人编写的《分子克隆：实验室手 册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)；Ausubel，F.等人编写的《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Celis，J.编写的《细胞生物学》，Academic Press， 第2版，(1998)；Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)，均在此引用作 为参考)。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的第一和第二附着位点分 别采用JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白域。在α疫苗颗粒的制备中，必须 在促进有序、重复抗原阵列在非天然分子支架上装配的条件下产生和纯 化抗原。在JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白域实施方案中，应当用还原剂(例 如二硫苏糖醇，DTT)处理FOS-抗原或FOS-抗原决定簇，以减少或消 除形成二硫键的机会(实施例15)。
为了制备JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白域实施方案的非天然分子支架 (即重组辛德毕斯病毒)，重组E2-JUN病毒颗粒应当浓缩、中和，并用 还原剂处理(见实施例16)。
JUN/FOS实施方案中有序、重复抗原阵列的装配在氧化还原复性液 (shuffle)存在下进行。E2-JUN病毒颗粒与240倍摩尔过量的FOS-抗原或 FOS-抗原决定簇在4℃下结合10小时。随后通过层析浓缩并纯化α疫 苗颗粒(实施例16)。
在本发明的另一个实施方案中，非天然分子支架与抗原或抗原决定 簇的偶联可以通过化学交联实现。在一个特定实施方案中，化学剂是一 种异双功能交联剂，如ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Tanimori 等人，J.Pharm.Dyn.4：812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45： 195(1981))，其含有(1)一个与氨基具有反应性的琥珀酰亚胺基，和 (2)一个与SH基具有反应性的马来酰亚胺基。可以构建第一附着位点 的异源蛋白质或多肽，使之含有一个或多个赖氨酸残基，作为异双功能 交联剂琥珀酸亚胺部分的反应部位。一旦与异源蛋白质的赖氨酸残基化 学偶联，异双功能交联剂的马来酰亚胺基团将可以用于与抗原或抗原决 定簇上的半胱氨酸残基的SH基团反应。在这种情况下，抗原或抗原决 定簇的制备可能需要将半胱氨酸残基构建到选作第二附着位点的蛋白 质或多肽中，使它可以与已与非天然分子支架的第一附着位点结合的交 联剂上的游离马来酰亚胺功能基团反应。因此，在这种情况下，异双功 能交联剂与非天然分子支架的第一附着位点结合，并将该支架与抗原或 抗原决定簇的第二附着位点相连接。
3.组合物、疫苗及其给药，以及治疗方法
本发明提供可用于预防和/或缓解疾病或症状的疫苗组合物。本发明 还提供用于预防和/或缓解个体的疾病或症状的接种方法。
在一个实施方案中，本发明提供用于在广泛物种(特别是哺乳动物 种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)中防治传染病的疫苗。疫苗可 以设计为用来治疗病毒病原的感染，如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、 EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌病原的感染，如 肺炎、结核、梅毒等；或寄生虫病原的感染，如疟疾、锥虫病、利什曼 病、滴虫病、阿米巴病等。
在另一个实施方案中，本发明提供用于在广泛物种(特别是哺乳动 物种，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等)中防治癌症的疫苗。疫苗可 以设计为用于治疗所有癌症类型：淋巴瘤、癌、肉瘤、黑素瘤等。
在本发明的另一个实施方案中，可以在治疗变态反应的疫苗的设计 中使用本发明的组合物。IgE同种型抗体是变态反应中的重要成分。肥 大细胞在其表面结合IgE抗体，并在特异性抗原与结合于肥大细胞表面 的IgE分子结合后释放组胺和其它变态反应介质。因此，抑制IgE抗体 的产生是保护免于变态反应的一个有前途的目标。获得希望的T辅助细 胞应答后这将成为可能。T辅助细胞应答可分为1型(TH1)和2型(TH2) T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today 18：263-266(1997))。TH1 细胞分泌干扰素-γ和能触发B细胞产生IgG1-3抗体的其它细胞因子。相 反，TH2细胞产生的一种重要细胞因子是IL-4，它使B细胞产生IgG4 和IgE。在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展互相排斥，因为TH1 细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，触发强TH1应答的抗原同 时抑制TH2应答的发展，从而抑制IgE抗体的产生。有趣的是，实际上 所有病毒都在宿主中诱发TH1应答，而不能触发IgE抗体的产生 (Coutelier等人，J.Exp.Med.165：64-69(1987))。这种同种型模式不 限于活病毒，在灭活的或重组的病毒颗粒上也能观察到(Lo-Man等人， Eur.J.Immunol.28：1401-1407(1998))。因此，利用本发明的方法(例 如α疫苗技术)，可以为病毒颗粒加装多种变应原，并用于免疫。由于 获得的变应原的“病毒结构”，将引发TH1应答，产生“保护性”IgG1-3抗 体，而阻止可引起变态反应的IgE抗体的产生。由于变应原由可被一组 不同辅助T细胞识别的病毒颗粒递呈而不是变应原本身递呈，甚至在携 带已存在的变应原特异性TH2细胞的过敏个体中也可能诱导产生变应原 特异的IgG1-3抗体。高浓度IgG抗体的存在可阻止变应原与结合IgE的 肥大细胞结合，从而抑制组胺的释放。因此，IgG抗体的存在可以保护 免于IgE介导的变态反应。引起变态反应的典型物质包括：草、豚草、 桦树或杉树花粉、屋尘、螨、动物皮屑、霉菌、昆虫毒液或药物(如青 霉素)。因此，不仅在变态反应发生之前而且在发生之后，用含有变应 原的病毒颗粒免疫个体都是有利的。
在具体实施方案中，本发明提供预防和/或缓解由“自身”基因产物 (例如肿瘤坏死因子)(即，如此处所用的“自身抗原”)所致或加重的疾 病或症状的方法。在有关实施方案中，本发明提供诱发个体的如下免疫 应答的方法，其导致可预防和/或缓解由“自身”基因产物所致或加重的疾 病或症状的抗体产生。这类疾病或症状的例子包括：移植物抗宿主病、 IgE介导的变态反应、过敏性反应、成人呼吸窘迫综合征、节段性肠炎、 变应性哮喘、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非何杰金淋巴瘤(NHL)、 Graves病、炎性自身免疫病、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、 免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)、血管免疫增生性淋巴结病(AIL)、 免疫母细胞性淋巴结病(IBL)、类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬 化症、骨质疏松症和阿耳茨海默病。
本领域技术人员会理解，当对个体施用本发明的组合物时，组合物 中可含有盐、缓冲液、佐剂或能提高组合物效能的其它物质。大量资料 中提出了适于在制备药物组合物中使用的物质的例子， 包括 《REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES》(Osol，A.编著， Mack Publishing Co.，(1990))。
如果接受个体能耐受本发明的组合物的给药，则本发明的组合物可 以说是“药理学可接受的”。此外，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即 产生希望的生理效应的量)给药。
本发明的组合物可以用本领域公知的多种方法给药，但通常通过注 射、输液、吸入、口服或其它合适的物理方法给药。此外，组合物也可 以肌内、静脉内或皮下给药。用于给药的组合物成分包括无菌水溶液(例 如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二 醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。可用载体或封闭 包衣/敷料提高皮肤通透性并增强抗原吸收。
朊病毒介导的疾病对社会的威胁日益增大。具体而言，朊病毒诱导 的牛BSE是长期被忽视但是可以影响整个欧洲的大量动物的一种疾病。 而且，CJD的一种变形是由于人类食用朊病毒感染的牛肉后感染引起的。 尽管迄今为止感染的人数相对较低，但这种疾病似乎可能成为流行病。 然而，vCJD发展的长期预后可能特别困难，因为感染与明显发病之间 的潜伏期极长(估计为10年)。
朊病毒是在大多数哺乳动物种类中存在的细胞蛋白质。朊病毒蛋白 以两种形式存在-通常存在于健康人体中的一种正常折叠的形式 (PrPc)，和引起疾病的一种错误折叠的形式(PrpSc)。当前的朊病毒假 说认为，错误折叠的朊病毒形式PrpSc能催化健康朊病毒Prpc重新折叠 为致病PrpSc(A.Aguzzi，Haematologica 85，3-10(2000))。在一些罕见的 情况下，这种转变也可能自发发生，在人体中引起经典CJD。prpSc中的 一些突变与这种自发转变的增多有关，引起不同形式的家族性CJD。然 而，PrpSc也可能是传染性的，可通过输血或通过食物链传播。后一种类 型的朊病毒介导的疾病被称为库鲁病，常常在食人者中发生。然而，由 于食用自己个体的物种不多，这种经口传播的疾病类型非常罕见，对其 它物种没有记载。
在整个欧洲，大量用牛肉制品饲养母牛改变了感染传播性致BSE PrpSc的母牛的状况和数量，这在最近几年显著增多，影响到数十万母牛。 大量患BSE的母牛的突然出现在人群中引起了极大恐慌，担心在人类中 可能诱发一种类似的疾病。的确，在1996年报告了第一例变型CJD， 可能是由于食用感染PrpSc的牛肉引起的。直到今天，这种恐惧仍进一步 增长，因为在随后几年感染的人数不断增加，而且未见治愈。而且，因 为绵羊可患有一种被称为羊瘙痒病的朊病毒介导的疾病，其它哺乳动物 种类也能感染PrpSc。
从实验来看，BSE样疾病也可能在其它物种中发生。已经极其详细 地研究了朊病毒的传播机制。现在清楚，朊病毒首先在感染小鼠的淋巴 器官中复制，然后转移到中枢神经系统中。对于朊病毒蛋白在淋巴器官 中的复制和向中枢神经系统内的转运，滤泡状树突细胞(FDC)-淋巴 器官中的一种极少的细胞群-似乎是必需的(S.Brandner，M.A.Klein，A. Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23(1999)；F.Montrasio等人，Science 288， 1257-9(2000))。FDC是研究较少的一种细胞类型，但是现在清楚它们 的发育依赖于B细胞产生淋巴毒素和/或TNF(F.Mackay，J.L.Browning， Nature 395，26-27(1998))。确实，缺乏淋巴毒素的小鼠不显示FDC(M.S. Matsumoto等人，Science 264，703-707(1996))。而且，它们不能有效 地感染朊病毒，并且不会患病。除了FDC之外，抗体也可能在疾病进展 中起作用(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23 (1999))。
最近表明，利用Ltb受体Fc融合分子阻断LTb途径不仅清除了小鼠 中的FDC，而且也阻断了PrpSc的感染(F.Montrasio等人，Science 288， 1257-9(2000))。因此，可诱导LTb或其受体之特异性抗体的疫苗可能 阻断PrpSc从一个个体传播给另一个个体，或者从周围向中枢神经系统传 播。
然而，通常难以(甚至不可能)通过常规接种诱发对自体分子的抗 体应答。提高接种效率的一种方法是提高所用抗原的重复程度：与分离 的蛋白质不同，在有及没有T细胞辅助时，病毒能在不含任何佐剂的情 况下诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann & Zinkermagel，Ann.Rev. Immunol.15：235-270(1991))。尽管病毒经常很少含蛋白质，但是它 们能比其分离的成分触发更强的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒 免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒显示一 种准晶体表面，该表面上展示规则排列的表位，这些表位可有效交联B 细胞上表位特异的免疫球蛋白(Bachmann & Zinkermagel，Immunol. Today 17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是直 接诱导细胞周期进行和产生IgM抗体的一种强激活信号。此外，这些触 发的B细胞能够激活T辅助细胞，随后诱导B细胞从生产IgM转换为 生产IgG，以及长期B细胞记忆的产生-这是所有接种的目标(Bachmann & Zinkermagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至 与自身免疫病中抗-抗体的产生有关，并且作为对病原体的自然应答的一 部分(见Fehr，T.等人，J Exp.Med.185：1785-1792(1997))。因此，高 度组织的病毒表面呈现的抗体能够诱发强烈的抗-抗体应答。
免疫系统通常不能产生抗自身结构的抗体。对于低浓度存在的可溶 性抗原，这是由于在Th细胞水平上的耐受性。在这些条件下，自身抗 原与能输送T辅助细胞的载体的偶联可以破坏耐受。对于高浓度存在的 可溶性蛋白质或低浓度的膜蛋白，B细胞和Th细胞可以是耐受的。然 而，B细胞的耐受可能是可逆的(无反应性的)，并且能通过施用以高度 组织方式与外源载体偶联的抗原而被破坏(Bachmann & Zinkermagel， Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。因此，象病毒、病毒样颗粒 或细菌菌毛一样高度组织的LTb、LTa或LTb受体可能破坏B细胞耐受， 并诱导产生这些分子特异的抗体。
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供 一种促进诱导产生内源淋巴毒素(LT)b、LTa或LTb受体的特异性抗 体的方法。本发明也提供一种生产如下抗原或抗原决定簇的方法，该抗 原或抗原决定簇能够诱导产生LTb、LTa或LTb受体特异的抗体，可用 于预防和治疗朊病毒介导的疾病，如变型克-雅氏症(vCJD)或牛海绵 状脑病(BSE)，并清除自身免疫病组织中的淋巴器官样结构。
本发明的目的在于提供一种能够诱导LTb、LTa或LTb受体特异的 抗体、从而从淋巴器官中清除FDC的疫苗。这种治疗可以防止感染PrpSc 或PrpSc从周围神经系统向中枢神经系统扩散。另外，这种治疗也能阻止 在自身免疫病累及的器官中产生淋巴器官样结构，并且可以溶解已经存 在的这种结构，改善疾病症状。
LTb、LTa或LTb受体或其片段与对于宿主而言外源的蛋白质载体偶 联。在本发明的一个优选实施方案中，为了使LTb、LTa或LTb受体或 其片段高度重复且有组织，将这些分子与高度组织化的结构偶联。高度 组织化的结构可以是细菌菌毛、下列重组蛋白产生的病毒样颗粒(VLP)： 噬菌体Qβ的重组蛋白、轮状病毒的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、 甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重组蛋白、 乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花叶病毒的重组蛋白、禽兽棚病毒的重 组蛋白和人乳头瘤病毒的重组蛋白。为了优化LTb、LTa或LTb受体或 其片段在高度组织的结构上的三维排列，向该高度组织的结构中引入附 着位点，如化学反应性氨基酸(除非天然存在)，并且在LTb、LTa或LTb 受体或其片段上引入结合位点，如化学反应性氨基酸(除非天然存在)。 高度组织的结构上存在附着位点而LTb、LTa或LTb受体或其片段上存 在结合位点将使这些分子以定向、有序的方式与重复结构偶联，这是诱 发有效B细胞应答所必需的。
在一个同样优选的实施方案中，向重复结构中引入的附着位点是可 特异结合链霉亲和素的生物素。生物素可以通过化学修饰引入。LTb、 LTa或LTb受体或其片段可以与链霉亲和素融合或连接，并与生物素化 的重复结构结合。
本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法和应用这些 组合物的医学治疗方法。应当理解，以上的一般性描述和下面的详述只 是代表性和说明性的，旨在进一步说明本发明。
除了疫苗技术之外，本发明的其它实施方案还涉及癌症和变态反应 的医学治疗方法。
此处提到的所有专利和出版物都在此完整引用作为参考。
实施例
下列实验中使用的酶和试剂包括：T4 DNA连接酶，获自New England Biolabs；Taq DNA聚合酶，QIAprep Spin质粒试剂盒，QIAGEN 质粒Midi试剂盒，QiaExII凝胶提取试剂盒，QIAquick PCR纯化试剂 盒，均获自QIAGEN；QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒，获自 Pharmacia；SuperScript一步法RT PCR试剂盒、胎牛血清(FCS)、细菌 用胰蛋白胨和酵母提取物，获自Gibco BRL；寡核苷酸，获自Microsynth (瑞士)；限制性核酸内切酶，获自Boehringer Mannheim，NewEngland Biolabs或MBI Fermentas；Pwo聚合酶和dNTPs，获自Boehringer Mannheim。HP-1培养基获自Cell Culture Technologies(Glattbrugg，瑞 士)。所有标准化学试剂都从Fluka-Sigma-Aldrich获得，所有细胞培养 材料都从TPP获得。
DNA操作按照标准技术进行。按照使用说明书，利用QIAprep Spin 质粒试剂盒由2ml细菌培养物制备DNA，或利用QIAGEN质粒Midi 试剂盒由50ml培养物制备DNA。对于限制性内切酶消化，DNA与浓 度为5-10单位(U)酶/mg DNA的适当的限制性内切酶在厂商推荐条件 下(缓冲液和温度)至少孵育2小时。如果反应条件适于所有酶，则用 一种以上的酶同时进行消化，或者连续进行消化。为了进一步操作，消 化下来的DNA片段通过0.7-1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下， 按照厂商提供的说明书用QiaExII凝胶提取试剂盒纯化。对于DNA片段 的连接，100-200pg纯化载体DNA与3倍摩尔过量的插入片段在16℃ 和存在1 U T4 DNA连接酶的条件下在厂商提供的缓冲液中孵育过夜(总 体积：10-20μl)。用一等份(0.1-0.5μl)连接反应液转化大肠杆菌 XL1-Blue(Stratagene)。利用Gene Pulser(BioRAD)和0.1cm Gene Pulser 池(BioRAD)，在200 Ohm、25μF、1.7kV下，通过电穿孔进行转化。 电穿孔后，细胞在1ml S.O.B.培养基(Miller，1972)中振摇孵育1小时， 之后平板接种于选择性S.O.B.琼脂上。
实施例1
用于抗原与VLP偶联的模块真核表达系统
该系统是为了与VLP化学偶联，在抗原上添加含有半胱氨酸残基的 不同氨基酸接头序列而产生的。
A.编码含半胱氨酸氨基酸接头和可切割Fc-尾的EBNA衍生表达系统 的构建
用Kpn I和Bam HI消化pCep-Pu(Wuttke等人，J.Biol.Chem.276： 36839-48(2001))，用退火的寡核苷酸PH37(SEQ ID NO：270)和PH38 (SEQ ID NO：271)引入一个新的多克隆位点，产生pCep-MCS。
如下产生一种模块系统，其含有一个侧翼为几个甘氨酸的游离半胱 氨酸、一个蛋白酶切割位点和人IgG1恒定区。用Bsp120I和Hind III消 化pSec2/Hygro B(Invitrogen目录号V910-20)，与退火的寡核苷酸SU7 (SEQ ID NO：278)和SU8(SEQ ID NO：279)连接，产生构建体 pSec-B-MCS。然后用NheI和HindIII消化pSec-B-MCS，并与退火的寡 核苷酸PH29(SEQ ID NO：264)和PH30(SEQ ID NO：265)连接， 产生构建体pSec 29/30。构建体pSec-FL-EK-Fc*通过下列三个片段的连 接产生：用Eco RI和Hind III消化的第一pSec 29/30，退火的寡核苷酸 PH31(SEQ ID NO：266)和PH32(SEQ ID NO：267)，以及含有人 IgG1恒定区修饰形式的质粒(pSP-Fc*-C1)的Bgl I/EcoRI片段(关于 hu IgG1序列的细节见最终构建体pCep-Xa-Fc*的序列，图1A-1C)。 pCep-Xa-Fc*的完整序列在SEQ ID NO：283中列出。产生的构建体命名 为pSec-FL-EK-Fc*。通过Nhe I/Pme I消化该质粒，从该质粒上切下接 头区和人IgG1 Fc部分，克隆入用Nhe I和Pme I消化的pCep-MCS，产 生构建体pCep-FL-EK-Fc*。这样产生一种模块载体，其中接头序列和蛋 白酶切割位点位于Nhe I与Hind III位点之间，容易与退火的寡核苷酸 交换。为了产生可切割的融合蛋白，用Nhe I和Hind III消化载体 pCep-FL-EK-Fc*，用退火的寡核苷酸PH35(SEQ ID NO：268)和PH36 (SEQ ID NO：269)导入N端一侧为氨基酸GGGGCG的因子Xa切割 位点，用退火的寡核苷酸PH39(SEQ ID NO：272)和PH40(SEQ ID NO： 273)导入N端一侧为GGGGCG的肠激酶位点，分别产生构建体 pCep-Xa-Fc*(见图1A)和pCep-EK-Fc*(见图1B)。另外还含有真核 信号肽的构建体pCep-SP-EK-Fc*(见图1C)通过下列三个片段的连接 严生：Kpn I/Bam HI消化的pCep-EK-Fc*，退火的寡核苷酸PH41(SEQ ID NO：274)和PH42(SEQ ID NO：275)，以及退火的寡核苷酸PH43 (SEQ ID NO：276)和PH44(SEQ ID NO：277)。
B.融合蛋白的大规模制备
为了大规模地制备不同融合蛋白，利用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies)，根据厂商推荐，用不同pCep表达质粒转染293-EBNA 细胞(Invitrogen)。转染24-36小时后，细胞在嘌呤霉素(1μg/ml)选 择下以1∶3的比例分到补充有10％FCS的DMEM中。然后在选择培养 基中扩增耐药性细胞。为了收获融合蛋白，将耐药性细胞群传代到聚L- 赖氨酸覆盖的平皿上。细胞一旦长满，即用PBS洗涤2次，并向平板中 添加无血清培养基(DMEM)。在最长达1个月的时期内，每2-4天收集 一次组织培养上清液，更换为新鲜的DMEM培养基。收获的上清液保 存于4℃。
C.融合蛋白的纯化
重组Fc-融合蛋白用蛋白A Sepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech AG)通过亲和层析纯化。简言之，向层析柱上填充1-3ml蛋白 A树脂，用蠕动泵以0.5-1.5ml/min的流速使含有重组蛋白的组织培养上 清液上柱。然后用20-50ml PBS洗柱。根据融合蛋白的不同，在柱上进 行蛋白酶切割，或如下所述洗脱蛋白质。用含有150mM NaCl的柠檬酸 /磷酸缓冲液(pH3.8)洗脱重组融合蛋白，合并含蛋白质的级分，用 ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩。
D.重组融合蛋白的蛋白酶切割(因子Xa，肠激酶)
洗脱的含肠激酶(EK)切割位点的重组融合蛋白用EKmax系统 (Invitrogen)根据厂商推荐切割。通过与蛋白A孵育，除去切割的融合 蛋白的Fc部分。然后用EK-Away系统(Invitrogen)根据厂商推荐除去 肠激酶。类似地，根据厂商推荐，含因子Xa(Xa)切割位点的融合蛋 白通过限制性蛋白酶因子Xa切割和去除试剂盒(Roche)切割。通过与 蛋白A孵育，除去切割的Fc部分，用试剂盒附带的链霉亲和素树脂除 去蛋白酶。
不同融合蛋白用ultrafree离心滤器(Millipore)浓缩，用紫外分光 光度法定量，用于随后的偶联反应。
图1A-1C显示所用的不同真核表达载体的部分序列。只显示修饰的 序列。
图1A：pCep-Xa-Fc*：序列从BamHI位点向前显示，在翻译序列之 上显示不同特征。箭头所指为因子Xa蛋白酶切割位点。
图1B：pCep-EK-Fc*：序列从BamHI位点向前显示，在翻译序列之 上显示不同特征。箭头所指为肠激酶切割位点。Hind III位点下游序列 与图1A所示相同。
图1C：pCep-SP-EK-Fc*：序列从信号肽的开始处向前显示，在翻译 序列之上显示不同特征。用信号肽酶切下的信号肽序列以粗体显示。箭 头所指为肠激酶切割位点。Hind III位点下游序列与图1A所示相同。
实施例2
小鼠抵抗素的真核表达以及与VLP和菌毛的偶联
A.小鼠抵抗素的克隆
用Qiagen RNeasy试剂盒根据厂商推荐从60mg小鼠脂肪组织中分 离总RNA。用40μl H2O洗脱RNA。然后用该总RNA进行反转录，该 反应使用oligo dT引物和ThermoScroptTM RT-PCR系统(Life Technologies)，根据厂商推荐进行。样品在50℃下孵育14时，加热到 85℃5分钟，在37℃下用RNAseH处理20分钟。
用2μl RT反应液进行小鼠抵抗素的PCR扩增。PCR用Platinium TAQ (Life Technologies)根据厂商推荐进行，使用引物PH19(SEQ ID NO： 260)和PH20(SEQ ID NO：261)。引物PH19(SEQ ID NO：260)对 应于小鼠抵抗素序列的58-77位，引物PH20(SEQ ID NO：261)对应 于454-435位。PCR混合物首先在94℃下变性2分钟，然后如下进行35 个循环：94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟，最后样品在72℃下放 置10分钟。纯化PCR片段，通过TA克隆亚克隆入pGEMTeasy载体 (Invitrogen)，产生pGEMT-mRes。为了添加合适的限制性酶切位点， 利用如上所述的相同循环程序，用引物PH21(SEQ ID NO：262)和PH22 (SEQ ID NO：263)对pGEMT-mRes进行第二次PCR。正向引物(PH21 (SEQ ID NO：262))含有一个BamHI位点和小鼠抵抗素序列的核苷酸 81-102。反向引物(PH22(SEQ ID NO：263))含有一个Xba I位点和 小鼠抵抗素序列的核苷酸426-406。所述位点参照小鼠抵抗素序列基因 登录号AF323080。纯化PCR产物，用Bam HI和Xba I消化，亚克隆入 经Bam HI和Xba I消化的pcmv-Fc*-C1，产生构建体pcmv-mRes-Fc*。
通过Bam HI/Xba I消化从pcmv-mRes-Fc*上切下抵抗素开放阅读 框，克隆入Bam HI和Nhe I消化的pCep-Xa-Fc*和pCep-EK-Fc*(见实 施例1，B部分)，分别产生构建体pCep-mRes-Xa-Fc*和 pCep-mRes-EK-Fc*。
B.抵抗素的制备、纯化和切割
然后用pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*构建体转染 293-EBNA细胞，以制备如实施例1部分B所述的重组蛋白。组织培养 上清液如实施例1部分C所述纯化。然后如实施例1部分D所述切割纯 化的蛋白质。根据所用的载体，产生的重组蛋白命名为“抵抗素-C-Xa”， 或“Res-C-Xa”和“抵抗素-C-EK”或“Res-C-EK”(见图2A和图2B)。
图2A和图2B显示用于表达和进一步偶联的重组小鼠抵抗素蛋白的 序列。Res-C-Xa(图2A)和Res-C-EK(图2B)显示翻译的DNA序列。 在蛋白质分泌后被信号肽酶切割的抵抗素信号序列以斜体显示。信号肽 酶和特异性蛋白酶(因子Xa或肠激酶)切割后产生的氨基酸序列以粗 体显示。粗体序列对应于实际用于偶联的氨基酸蛋白质序列，即SEQ ID NO：280和SEQ ID NO：281。SEQ ID NO：282对应于另一种抵抗素蛋 白构建体，根据本发明它也能用来与病毒样颗粒和菌毛偶联。
C.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液0.2ml与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下对用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。8μl透析的Qβ反应混合物与32μl抵抗 素-C-Xa溶液(产生终浓度为0.39mg/ml的抵抗素)、13μl Qβ反应混合 液与27μl抵抗素-C-EK溶液(产生终浓度为0.67mg/ml的抵抗素)在 25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析(见图2C)。偶 联反应液中有另一条24kDa的带，但在衍生的Qβ和抵抗素中没有。24 kDa的大小对应于偶联产物24kDa的预期大小(14kDa的Qβ分别加 10kDa抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK)。
图2C显示抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与Qβ的偶联结果。偶联产 物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。第1道：分子量标准。 第2道：偶联前的抵抗素-C-EK。第3道：偶联后的抵抗素-C-EK-Qβ。 第4道：衍生的Qβ。第5道：偶联前的抵抗素-C-Xa。第6道：偶联后 的抵抗素-C-Xa-Qβ。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。偶联带用箭 头指示。
D.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与fr衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液0.2ml中与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶液在25 ℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。8μl透析的fr衣壳蛋白反应混合物 与32μl抵抗素-C-Xa溶液(产生终浓度为0.39mg/ml的抵抗素)、13μl fr衣壳蛋白反应混合液与27μl抵抗素-C-EK溶液(产生终浓度为0.67 mg/ml的抵抗素)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
E.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
将2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液0.2ml与5.6μl 100mM SMPH(Pierce)在DMSO中的溶 液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。8μl透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut 反应混合物与32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl HBcAg-Lys-2cys-Mut反应 混合液与27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃摇床上反应4小时。偶联产物 通过SDS-PAGE分析。
F.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与菌毛的偶联
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液 400μl与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce) 在摇床上室温反应60分钟。将反应混合物过PD-10柱 (Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质 级分，8μl脱盐的衍生菌毛蛋白与32μl抵抗素-C-Xa溶液、13μl脱盐 的衍生菌毛蛋白与27μl抵抗素-C-EK溶液在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物通过SDS-PAGE分析。
实施例3
A.含半胱氨酸接头的引入，小鼠淋巴毒素-β的表达与纯化
重组表达小鼠淋巴毒素-·(LT-·)的胞外部分，其在N端含有一个 CGG氨基酸接头。该接头含有一个用来与VLP偶联的半胱氨酸。为了 便于纯化，该蛋白质的长(氨基酸49-306)和短(氨基酸126-306)形 式在N端与谷胱甘肽S-转移酶(GST)或组氨酸-myc尾融合。为了切 割该尾，插入一个肠激酶(EK)切割位点。
C-LT·49-306和C-LT·126-306的构建
利用PCR方法，以寡核苷酸5’LT·和3’LT·为引物从插入到 pFB-LIB中的小鼠脾脏cDNA文库中扩增小鼠LT·49-306。对于PCR 反应，在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs 和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板DNA。温度循环 如下：94℃ 2分钟，然后94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分钟) 25个循环，之后68℃ 10分钟。PCR产物用T4激酶磷酸化，连接到EcoRV 酶切并去磷酸化的pEntry1A(Life Technologies)中。产生的质粒命名为 pEntry1A-LT·49-306。
以pEntry1A-LT·49-306作为模板，分别用寡核苷酸5’LT·long-NheI 和3’LT·stop-NotI以及5’LT·short-NheI和3’LT·stop-NotI进行第二次 PCR反应。寡核苷酸5’LT·long-NheI和5’LT·short-NheI含有一个 内部的NheI位点，并含有Cys-Gly-Gly接头的密码子，3’LT·stop-NotI 含有一个内部NotI位点，并含有终止密码子。对于第二次PCR反应， 在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和150ng模板DNA。温度循环如下：94℃ 2分钟，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分钟)5个循环， 然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分钟)20个循环，之后68℃ 10分钟。
PCR产物用NheI和NotI消化，插入pCEP-SP-GST-EK或 pCEP-SP-his-myc-EK(Wuttke等人，J.Biol.Chem.276：36839-48(2001)) 中。产生的质粒分别命名为pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、 pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306、 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·126-306。GST为谷胱甘肽一S-转移酶，EK 为肠激酶，his为六组氨酸尾，myc为抗c-myc表位。C表示另含有半胱 氨酸的CGG接头。
其它所有步骤都按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸序列： 5’LT·： 5’-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3’(SEQ ID NO：284) 3’LT·： 5’-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3’(SEQ ID NO：285) 5’LT·long-NheI： 5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3’(SEQ ID NO：286) 5’LT·shorr-NheI： 5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGG ATT C-3’(SEQ ID NO：287) 3’LT·stop-NotI： 5’-CAA TGA CTG CGG CCG CTT ACC CCA CCA TCA CCG-3’(SEQ ID NO： 288)。
GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306
和his-myc-EK-C-LT·126-306的表达和制备
为了如实施例1所述制备蛋白质，用质粒 pCEP-SP-GST-EK-C-LT·49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT·126-306、 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·49-306和 pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT·126-306转染293-EBNA细胞(Invitrogen)。 制备的蛋白质命名为GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、 his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306。
LT·融合蛋白的蛋白质序列由下列cDNA序列翻译而来：
GST-EK-C-LT·49-306：SEQ ID NO：289
GST-EK-C-LT·126-306：SEQ ID NO：290
his-myc-EK-C-LT·49-306：SEQ ID NO：291
his-myc-EK-C-LT·126-306：SEQ ID NO：292
融合蛋白在还原条件下在12％SDS-PAGE上分析。将凝胶印迹到硝 酸纤维素膜上。将膜封闭，与单克隆小鼠抗-myc抗体或与抗-GST抗体 孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG或辣根过氧 化物酶偶联的兔抗山羊IgG孵育。结果显示在图3中。GST-EK-C-LT·49-306 和GST-EK-C-LT·126-306可用抗-GST抗体检测，分子量分别为62kDa和 48kDa。his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306可用抗-myc 抗体检测，分别为40-56kDa和33-39kDa。
图3A和图3B显示LT·融合蛋白的表达结果，LT·融合蛋白在还 原条件下在12％SDS-PAGE上分析。将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。将 膜封闭，与单克隆小鼠抗-myc抗体(1∶2000稀释)(图3A)或与抗-GST 抗体(1∶2000稀释)(图3B)孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联 的山羊抗小鼠IgG(1∶4000稀释)(图3A)或辣根过氧化物酶偶联的兔 抗山羊IgG(1∶4000稀释)(图3B)孵育。A：第1、2道： his-myc-EK-C-LT·126-306。第3、4道：his-myc-EK-C-LT·49-306。B：第 1、2道：GST-EK-C-LT·126-306。第3、4道：GST-EK-C-LT·49-306。标 准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
B.GST-EK-C-LT·49-306、GST-EK-C-LT·126-306、his-myc-EK-C-LT·49-306 和his-myc-EK-C-LT·126-306的纯化
GST-EK-C-LT·49-306和GST-EK-C-LT·126-306用谷胱甘肽-Sepharose 柱纯化，his-myc-EK-C-LT·49-306和his-myc-EK-C-LT·126-306用Ni-NTA sepharose柱纯化，均使用标准纯化方法。纯化的蛋白质用肠激酶切割， 并在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。
C.C-LT·49-306和C-LT·126-306与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃摇床 上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各24时。透析的Qβ反应混合物与C-LT·49-306和 C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM Qβ，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306) 在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
D.C-LT·49-306和C-LT·126-306与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃摇床 上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合物与 C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM fr，60μM C-LT·49-306 和C-LT·126-306)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
E.C-LT·49-306和C-LT·126-306与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与DMSO贮存液稀释的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut 反应混合物与C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-LT·49-306和C-LT·126-306)在25℃摇床 上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
F.C-LT·49-306和C-LT·126-306与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与DMSO 贮存液稀释的50倍摩尔过量的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室温反 应60分钟。反应混合物用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱 盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与 C-LT·49-306和C-LT·126-306溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM C-LT·49-306 和C-LT·126-306)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物在还原条件下通 过SDS-PAGE分析。
实施例4
A.含半胱氨酸接头的引入，大鼠巨噬细胞迁移抑制因子MIF的表达、
纯化以及与Qβ的偶联
重组表达大鼠巨噬细胞迁移抑制因子(rMIF)，其在C端融合三种 不同的氨基酸接头C1、C2和C3。每个接头含有一个半胱氨酸用于与 VLP偶联。
rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3的构建
通过将NdeI位点与XhoI位点之间的原始序列替换为退火的寡核苷 酸引物MCS-1F和MCS-1R(在15mM TrisHCl pH8缓冲液中退火)，使 pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改变为GTTTAACTTT AAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACG GCGGCCGCATGCACC。产生的质粒命名为pMod00，它在MCS中含有 NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制性酶切位点。退火的 Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R寡核苷酸对和退火的 oligo1F-C-甘氨酸-接头和oligo1R-C-甘氨酸-接头对一起连接到 BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC1，它含有一个N端 六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和含有一个半胱氨酸残基的C端氨基 酸甘氨酸接头。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe R寡核苷 酸对与退火的oligo1F-C-γ1-接头和oligo1R-C-γ1-接头对一起连接到 BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC2，它含有一个N端 六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和来源于人免疫球蛋白γ1铰链区并含 有一个半胱氨酸残基的C端·1接头。退火的Bamhis6-EK-Nhe-F和 Bamhis6-EK-Nhe R寡核苷酸对、退火的oligo1FA-C-γ3-接头和 oligo1RA-C-γ3-接头对以及退火的oligo1FB-C-γ3-接头和oligo1RB-C-γ3- 接头对一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC3， 它含有一个N端六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和来源于小鼠免疫球 蛋白·3铰链区并含有一个半胱氨酸残基的C端·3接头。
用寡核苷酸rMIF-F和rMIF-Xho-R通过PCR扩增了含有大鼠MIF cDNA的pBS-rMIF。rMIF-F含有一个内部NdeI位点，rMIF-Xho-R含有 一个内部XhoI位点。PCR产物用NdeI和XhoI消化，连接到用相同酶 消化的pModEC1、pModEC2和pModEC3中。产生的质粒分别命名为 pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3。
对于PCR反应，在50·1反应混合液(2单位PFX聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各15pmol引物和1ng模板DNA。温度 循环如下：94℃2分钟，然后94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30 秒)30个循环，之后68℃ 2分钟。
其它所有步骤都按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸序列：
引物MCS-1F： 5’-TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCA T-3’(SEQ ID NO：293)
引物MCS-1R： 5’-TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GAT CCA-3’(SEQ ID NO：294)
Bamhis6-EK-Nhe-F： 5’-GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GAT GAC AAA GCG CTA GCC C-3’(SEQ ID NO：295)
Bamhis6-EK-Nhe-R： 5’-TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGG TGG TGG TGG TGG TGT G-3’(SEQ ID NO：296)
oligo 1F-C-甘氨酸-接头： 5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO：297)
oligo 1R-C-甘氨酸-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3’(SEQ ID NO：298)
oligo 1F-C-γ1-接头： 5’-TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO：299)
oligo 1R-C-γ1-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGG GTT TTA TCC-3’(SEQ ID NO：300)
oligo 1FA-C-γ3-接头： 5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ ID NO：301)
oligo 1RA-C-γ3-接头： 5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’ (SEQ ID NO：302)
oligo 2FB-C-γ3-接头： 5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’ (SEQ ID NO：303)
oligo 2RB-C-γ3-接头： 5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQ ID NO：304)
rMIF-F： 5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3’(SEQ ID NO：305)
rMIF-Xho-R： 5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO：306)
rMIF-C的表达与纯化
用质粒pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3转化感受 态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。含氨苄青霉素(Amp)琼脂平板上的单 个菌落在液体培养基中扩增(含150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp， 0.5％葡萄糖的SB)，并在220rpm振摇和30℃下孵育过夜。然后用过夜 培养液1∶50v/v接种于1 L SB(150mM MOPS，pH7.0，200μg/ml Amp)， 在30℃下培养至OD600＝2.5。用2mM IPTG诱导表达。过夜培养并以 6000rpm离心后收集细胞。将细胞沉淀悬浮于含0.8mg/ml溶菌酶的裂 解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％ Tween-20)中，超声处理并用benzonase处理。然后将2ml裂解液过20 ml Q XL-柱和20ml SP XL-柱。蛋白质rMIF-C1、rMIF-C2和rMIF-C3 流出。
rMIF-C的蛋白质序列由cDNA序列翻译而来。
rMIF-C1：SEQ ID NO：307
rMIF-C2：SEQ ID NO：308
rMIF-C3：SEQ ID NO：309
rMIF-C1与Q·衣壳蛋白的偶联
将6mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.48ml与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM 贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0透析2次各3小时。将3.6mg/ml rMIF-C1 蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液1.3ml与9.6μl TCEP(Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下反应1小时。 130μl衍生并透析的Q与129μl还原的rMIF-C1在241μl 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.0中25℃反应过夜。
rMIF-C2与Q·衣壳蛋白的偶联
将5.5mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中 的溶液0.9ml与9μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM贮 存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.80mg/ml rMIF-C2蛋白在 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液850μl与8.5μl TCEP (Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在室温下反应1小时。80μl 衍生并透析的Q·与85μl还原的rMIF-C2在335μl 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2中25℃反应过夜。
rMIF-C3与Q·衣壳蛋白的偶联
将6mg/ml Q·衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.48ml与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的100mM 贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.0透析2次3小时。将5.98mg/ml rMIF-C3蛋 白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液720μl与9.5μl TCEP (Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下反应1小时。130 μl衍生并透析的Q与80μl还原的rMIF-C3在290μl 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.0中25℃反应过夜。
所有三种偶联产物都在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。 凝胶用考马斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆 兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀释)或纯化的兔抗-MIF抗体(Torrey Pines Biolabs，Inc.)(1∶2000稀释)孵育。随后将印迹与辣根过氧化物酶偶联 的山羊抗兔IgG(1∶2000稀释)孵育。结果显示在图4A和图4B中。偶 联产物能在考马斯染色凝胶中检测到(图4A)，用·抗-Qβ·抗血清和 抗-MIF抗体(图4B)能清楚地证实所有三种rMIF变体与Qβ·衣壳蛋 白的共价偶联。
图4A显示MIF构建体与Qβ的偶联。偶联产物在还原条件下在16％ SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分子量 示于左侧空白处。
图4B显示MIF-C1与Qβ的偶联。偶联产物在还原条件下在16％ SDS-PAGE凝胶上分析。第1道：偶联前的MIF-C1。第2道：偶联前的 衍生Qβ。第3-5道：Qβ-MIF-C1。第1-3道用考马斯亮蓝染色。第4、5 道是分别用抗-MIF抗血清和抗Qβ抗血清显色的偶联反应的Western印 迹。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
B.用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1免疫小鼠
给雌性Balb/c小鼠接种未添加佐剂的与Qβ衣壳蛋白偶联的 MIF-C1。每种样品25μg总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0天和第14 天皮下注射(100ml，于腹部两侧)。小鼠在第31天眼眶后放血，其血 清用MIF特异的ELISA分析。
C.ELISA
ELISA板用浓度为5μg/ml的MIF-C1包被。封闭ELISA板，然后 与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检 测。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。结果显示在图4C中。与 Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1的小鼠抗血清具有明显的反应性，而免疫前 血清不与MIF反应(图4C，数据未显示)。在与Qβ衣壳蛋白偶联的 MIF-C1的抗血清的稀释系列中，在1∶84000时达到最大半数效价 (half-maximal titer)。
图4C显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的MIF-C1接种的小鼠血清获得的 ELISA信号。第0天和第14天给雌性Balb/c小鼠皮下接种PBS中的25 μg疫苗。第31天测定抗MIF-C1血清IgG。分析其中一只小鼠的免疫前 血清作为对照。所述血清稀释的结果显示为450nm下的光密度。所有 接种的小鼠都形成高抗体效价。在对照中未检测到MIF特异性抗体。
实施例5 rMIF-C1与fr衣壳蛋白和HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联 rMIF-C1与fr衣壳蛋白的偶联
将3.1mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与3μl 100mM溶解于DMSO的SMPH贮存液(Pierce)在 25℃下反应30分钟。在平行反应中，fr衣壳蛋白首先用碘乙酰胺烷基化， 然后在上述相同反应条件下与SMPH反应。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.7mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液80μl与1μl 36mM溶于H2O的TCEP(Pierce)贮存液在25℃下反应1小时。50μl 衍生并透析的fr衣壳蛋白和50μl衍生、烷基化并透析的fr衣壳蛋白分 别与17μl还原的rMIF-C1在25℃下反应2小时。
偶联产物在16％SDS-PAGE凝胶上分析(图5)。在偶联反应中能检 测到预期大小为27kDa(rMIF-C1：表观分子量13kDa，fr衣壳蛋白的 表观分子量14kDa)和29kDa(rMIF-C1的表观分子量13kDa， HBcAg-Lys-2cys-Mut的表观分子量15kDa)的带，但在fr衣壳蛋白和 rMIF-C1溶液中未检测到，这明确证实了偶联。
rMIF-C1与肝炎HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联
将1.2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白在20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2中的溶液100μl与1.4μl SMPH(Pierce)(来自溶解于 DMSO的100mM贮存液)在25℃下反应30分钟。反应溶液随后在4℃ 下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。将5.7 mg/ml rMIF-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液80 μl与1μl TCEP(Pierce)(来自溶于H2O的36mM贮存液)在25℃下 反应1小时。然后60μl衍生并透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳蛋白与 20μl还原的rMIF-C1在25℃下反应2小时。
偶联产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析(图5)。在偶 联反应中能检测到预期大小约为28kDa(rMIF-C1：表观分子量13kDa， HBcAg-Lys-2cys-Mut：表观分子量15kDa)的一条额外的带，但在衍生 的HBcAg-Lys-2cys-Mut或rMIF-C1溶液中未检测到，明确证实了偶联。
加至图5的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：偶联前的rMIF-C1。第3道：偶联 后的rMIF-C1-fr衣壳蛋白。第4道：衍生的fr衣壳蛋白。第5道：与烷 基化fr衣壳蛋白偶联后的rMIF-C1-fr。第6道：烷基化并衍生的fr衣壳 蛋白。第7道：偶联后的rMIF-HBcAg-Lys-2cys-Mut。第8、9道：衍生 的HBcAg-Lys-2cys-Mut。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分子量 示于左侧空白处。
实施例6
A.含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，小鼠RANKL的表达与 纯化
重组表达核因子κb配体受体激活物(RANKL，也被称为破骨细胞 分化因子、osteoprotegerin配体和肿瘤坏死因子相关激活诱导的细胞因 子)的一个片段，其具有含有一个半胱氨酸的N端接头，用于与VLP 偶联。
表达质粒的构建
用寡核苷酸RANKL-UP和RANKL-DOWN PCR扩增RANKL基因 的C端编码区。RANKL-UP含有一个内部ApaI位点，RANKL-DOWN 含有一个内部XhoI位点。PCR产物用ApaI和XhoI消化，连接到 pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。产生的质粒命名为pGEX-RANKL。 所有步骤均按标准分子生物学方法进行，并证实序列。质粒 pGEX-RANKL编码谷胱甘肽S-转移酶-Prescission切割位点-含半胱氨酸 的氨基酸接头-RANKL(GST-PS-C-RANKL)融合蛋白。含半胱氨酸的 氨基酸接头具有序列GCGGG。该构建体在含半胱氨酸的氨基酸接头与 RANKL序列之间还含有一个六组氨酸尾。
寡核苷酸：
RANKL-UP： 5’-CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACC AGCGCTTCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO：316)
RANKL-DOWN： 5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’(SEQ ID NO： 317)
GST-PS-C-RANKL的蛋白质序列(SEQ ID NO：318)和 GST-PS-C-RANKL的cDNA序列(SEQ ID NO：319)
1 M S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E
1 atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaa
26 E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L
76 gaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttg
51 E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I R Y I
151 gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatata
76 A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L
226 gctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttg
101 D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K
301 gatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaag
126 L P E M L K M F E D R L C H K T Y L N G D H V T H
376 ctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccat
151 P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A F P K
451 cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaa
176 L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A
526 ttagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagca
201 W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S D L E V L F
601 tggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttc
226 Q G P G C G G G H H H H H H Q R F S G A P A M M E
676 cagGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAGCTCCAGCTATGATGGAA
251 G S W L D V A Q R G K P E A Q P F A H L T I N A A
751 GGCTCATGGTTGGATGTGGCCCAGCGAGGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTTGCACACCTCACCATCAATGCTGCC
276 S I P S G S H K V T L S S W Y H D R G W A K T S N
826 AGCATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACTCTGTCCTCTTGGTACCACGATCGAGGCTGGGCCAAGATCTCTAAC
301 M T L S N G K L R V N Q D G F Y Y L Y A N I C F R
901 ATGACGTTAAGCAACGGAAAACTAAGGGTTAACCAAGATGGCTTCTATTACCTGTACGCCAACATTTGCTTTCGG
326 H H E T S G S V P T D Y L Q L M V Y V V K T S I K
976 CATCATGAAACATCGGGAAGCGTACCTACAGACTATCTTCAGCTGATGGTGTATGTCGTTAAAACCAGCATCAAA
351 I P S S H N L M K G G S T K N W S G N S E F H F Y
1051 ATCCCAAGTTCTCATAACCTGATGAAAGGAGGGAGCACGAAAAACTGGTCGGGCAATTCTGAATTCCACTTTTAT
376 S I N V G G F F K L R A G E E I S I Q V S H P S L
1126 TCCATAAATGTTGGGGGATTTTTCAAGCTCCGAGCTGGTGAAGAAATTAGCATTCAGGTGTCCAACCCTTCCCTG
401 L D P D Q D A T Y F G A F K V Q D I D
1201 CTGGATCCGGATCAAGATGCGACGTACTTTGGGGCTTTCAAAGTTCAGGACATAGACTAACTCGAGCGG
C-RANKL的表达与纯化
用质粒pGEX-RANKL转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)Gold pLys 细胞。含卡那霉素和氯霉素琼脂平板上的单个菌落在液体培养基中扩增 (LB培养基，30μg/ml卡那霉素，50μg/ml氯霉素)，并在220rpm振 摇和30℃下孵育过夜。然后用过夜培养液1∶100v/v接种于1L LB(含 30μg/ml卡那霉素)，在24℃下培养至OD600＝1。用0.4mM IPTG诱导 表达。16小时后以5000rpm离心收集细胞。将细胞沉淀悬浮于裂解缓 冲液(50mM Tris-HCl，pH8；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mM DTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4U/ml DNAse)中30分钟。加 入2.5倍体积的缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0；1％ Triton X100；100 mM NaCl；0.1％NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，在37℃下孵育15 分钟。超声处理细胞，以9000rpm沉淀15分钟。将上清液立即进行GST- 亲和层析。
5ml GST-TrapFF柱(Amersham Pharmacia)用PBS pH7.3(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)平衡。上清液上样 到5ml GST-Trap FF柱上，随后用5倍柱体积的PBS洗柱。用含有10mM GSH的50mM Tris-HCl，pH＝8.0洗脱蛋白质GST-PS-C-RANKL。
纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白用蛋白酶PreScission(Amersham Pharmacia)消化。消化在37℃下进行1小时，GST-PS-C-RANKL与 PreScission的摩尔比为500/1。
此外，用HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia)对蛋白酶消 化反应进行缓冲液交换，合并含有蛋白质的级分，立即用以前报告的相 同条件进行GST亲和层析的另一步骤。在还原条件下用SDS-PAGE凝 胶分析C-RANKL的纯化，如图6所示。标准蛋白质的分子量示于图中 凝胶左侧空白处。凝胶用考马斯亮蓝染色。切割的C-RANKL在流出液 (未结合的级分)中存在，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的 GST-PS和PreScission与柱结合。获得高纯度的预期大小为22kDa的 C-RANKL蛋白。
加样至图6的凝胶上的样品如下：
第1道：低分子量标准。第2、3道：0.4mM IPTG诱导16小时后， 空载体pGEX6p1和pGEX-RANKL分别转化的BL21/DE3细胞的裂解液 的上清液。第4道：过GST-Trap FF柱后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。 第5道：GST-Trap FF柱未结合的级分。第6道：PreScission蛋白酶切 割后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白。第7道：上样GST-RANKL消化 液的GST-Trap FF柱的未结合级分，含有纯化的C-RANKL。第8道： 上样GST-PS-C-RANKL消化液并用GSH洗脱的GST-Trap FF柱的结合 级分。
B.C-RANKL与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与C-RANKL溶 液(终浓度：60μM Qβ，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
C.C-RANKL与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl(pH7.2)中的 溶液与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25 ℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合液与 C-RANKL溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM C-RANKL)在25 ℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
D.C-RANKL与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与C-RANKL溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
E.C-RANKL与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH在摇床上室温反应60 分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合 并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与C-RANKL溶 液(终浓度：60μM菌毛，60μM C-RANKL)在25℃摇床上反应4小 时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
实施例7
A.含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，小鼠朊病毒蛋白截短形式的
表达与纯化
重组表达小鼠朊病毒蛋白(称为mPrPt)的截短形式(氨基酸 121-230)，其在C端融合一个GGGGCG氨基酸接头，用于与VLP和菌 毛偶联。为便于纯化，该蛋白质与人Fc-片段的N端融合。为了在纯化 后切割融合蛋白的Fc部分，向肠激酶(EK)切割位点之后引入一个EK 切割位点。
mPrPt-EK-Fc*的构建
以质粒pBPCMVPrP-Fc为模板，用引物5’PrP-BamHI和3’PrP-NheI PCR扩增小鼠PrPt。pBPCMVPrP-Fc含有小鼠朊病毒蛋白的野生型序列。 5’PrP-BamHI含有一个内部BamHI位点，并且含有一个ATG，3’PrP-NheI 含有一个内部NheI位点。
对于PCR反应，在50μl反应混合液(1单位PFX Platinum聚合酶， 0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用各0.5μg引物和200ng模板 DNA。温度循环如下：94℃2分钟，然后94℃(15秒)、50℃(30秒)、 68℃(45秒)5个循环，然后94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45 秒)20个循环，之后68℃10分钟。
PCR产物用BamHI和NheI消化，插入在EK切割序列5’端含有 GGGGCG接头序列的pCEP-SP-EK-Fc*中。得到的质粒命名为 pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*。
其它所有步骤均按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸：
引物5’PrP-BamHI
5’-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3’(SEQ ID NO： 321)
引物3’PrP-NheI
5’-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3’(SEQ ID NO：322)
mPrPt-EK-Fc*的表达与纯化
用质粒pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*转染293-EBNA细胞(Invitrogen)， 如实施例1所述用蛋白A-sepharose柱纯化。
mPrPt-EK-Fc*的蛋白质序列在SEQ ID NO：323中列出。
切割后的mPrPt含有SEQ ID NO：324所示的序列，在其C端含有 GGGGCG接头。
纯化的融合蛋白mPrPt-EK-Fc*用肠激酶切割，并在肠激酶切割之前 及之后在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马斯亮蓝 染色。结果显示在图7中。标准蛋白质的分子量示于图中凝胶左侧空白 处。mPrPt-EK-Fc*融合蛋白可被检测到，为一条50kDa的带。含有与其 C端融合的GGGGCG氨基酸接头的切割的mPrPt蛋白可被检测到，为 一条18-25kDa的宽带。mPrPt的身份通过Western印迹证实(数据未显 示)。因此，能够表达并纯化具有一个含半胱氨酸残基的C端氨基酸接 头的mPrPt，用来与VLP和菌毛偶联。
加载到图7的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：切割前的mPrPt-EK-Fc*。第3道： 切割后的mPrPt。
B.mPrPt与Qβ衣壳的偶联
120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与25 倍摩尔过量的用DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反 应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与mPrPt溶液(终浓度： 60μM Qβ，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
C.mPrPt与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与mPrPt溶液(终 浓度：60μM fr，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
D.mPrPt与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与mPrPt溶液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。偶联 产物经SDS-PAGE分析。
E.mPrPt与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与mPrPt 溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM mPrPt)在25℃摇床上反应4小时。 偶联产物经SDS-PAGE分析。
实施例8
A.朊病毒肽与Qβ衣壳蛋白的偶联：朊病毒肽疫苗
化学合成下列朊病毒肽：CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR (“cprplong”)和CGNDWEDRYYRENMYR(“cprpshort”)，为了与VLP 和菌毛偶联，它们包含一个添加的N端半胱氨酸残基，用于如以下所述 与Qβ进行化学偶联。
将140μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液5ml与108μl 65mM SMPH水溶液(Pierce)在25℃摇床上反应30 分钟。反应溶液随后在4℃下用5L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液与1.35μl 2mM肽cprpshort 贮存液(溶解于DMSO)(1∶2肽/Q·衣壳蛋白比)或者与2.7μl相同贮 存溶液(1∶1肽/Q·比)反应。1μl 10mM肽cprplong贮存溶液(溶解 于DMSO)与100μl透析的反应混合液反应。偶联反应在15℃水浴中 进行过夜。反应混合液随后在4℃下用2×5 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析24小时。
离心偶联产物，上清液和沉淀在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶 上分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。结果显示在图16中。标准蛋白质的 分子量示于图中凝胶左侧空白处。分子量为16.5-25kDa之间的带清楚 地证实了肽cprpshort和cprplong与Q·衣壳蛋白的共价偶联。
加载到图16A的凝胶上的样品如下：
第1道：纯化的Q·衣壳蛋白。第2道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋 白。第3-6道：以1∶2肽/Q·比(第3、4道)和1∶1肽/Q·比(第5、6 道)进行的Qβ衣壳蛋白-cprpshorr偶联。显示可溶性级分(第3、5道) 和不可溶性级分(第4、6道)。
加载到图16B的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋白。第3、 4道：Qβ衣壳蛋白-cprplong偶联反应物。显示可溶性级分(第3道)和 不可溶性级分(第4道)。
B.朊病毒肽与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与等摩尔浓度的 肽cprpshort或以1∶2cprplong/fr的比例在16℃摇床上反应过夜。偶联 产物经SDS-PAGE分析。
C.朊病毒肽与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液与10倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应 混合液与等摩尔浓度的肽cprpshort或以1∶2 cprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mut的比例在16℃摇床上反应过夜。偶联产物 经SDS-PAGE分析。
D.朊病毒肽与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与朊病 毒肽等摩尔或以1∶2的肽/菌毛比在16℃摇床上反应过夜。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
实施例9
与VLP和菌毛偶联的IL-13的克隆、表达和纯化
A.白介素13(IL-13)的克隆与表达，为与VLP和菌毛偶联，其在N 端氨基酸接头处含有一个半胱氨酸残基
a)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳动物细胞中作为Fc 融合蛋白表达
通过RT-PCR从体外激活的脾细胞中分离用于克隆IL-13的DNA， 这些脾细胞用如下方法获得：从小鼠脾脏细胞中分离CD4+T细胞，在 预先用抗CD3和抗CD28抗体包被的6孔板中在IMDM(+5％FCS+10 ng/mlIL4)中孵育3天。用这些细胞的RNA通过一步法RT-PCR(Qiagen 一步法PCR试剂盒)扩增IL13。RNA的反转录使用引物XhoIL13-R， IL13 cDNA的PCR扩增使用引物NheIL13-F(SEQ ID NO：338)和 XhoIL 13-R(SEQ ID NO：339)。扩增的IL13 cDNA利用NheI/XhoI限 制性酶切位点连接到pMOD载体中(产生载体pMODB1-IL13)。用 BamHI/XhoI消化pMODB1-IL13，将含IL-13的片段连接到预先用 BamHI/XhoI消化的pCEP-SP-XA-Fc*(Δxho)载体中，该载体与 pCEP-SP-XA-Fc*的结构类似，但除去了Fc序列末端的一个XhoI位点。 对连接后产生的质粒(pCEP-SP-IL13-Fc)测序，用来转染HEK-293T细 胞。该质粒编码的IL 13构建体在IL-13成熟序列N端融合有氨基酸序 列ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，它的 侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。IL13-Fc可用蛋白A树脂从 pCEP-SP-IL13-Fc转染细胞的上清液中纯化。表达结果显示在图17B中 (样品的描述见实施例10)。用因子Xa切割融合蛋白释放N端与上述 氨基酸序列融合的成熟IL-13，获得以下称为“小鼠C-IL-13-F”的一种蛋 白质，其具有SEQ ID NO：328的序列。图17B的结果清楚地证实了IL-13 构建体的表达。
b)小鼠IL-13的克隆(HEK-293T)，用于在哺乳动物细胞中表达， 其在N端融合有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)
用于克隆N端含有GST的IL-13的cDNA如上(a)所述由TH2激 活的T细胞的cDNA获得。使用引物Nhelink1IL13-F和 IL13StopXhoNot-R从该cDNA中扩增IL-13。PCR产物用NheI和XhoI 消化，连接到预先用NheI/XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK载体中。用可 从所述连接反应分离的质粒(pCEP-SP-GST-IL13)转染HEK-293T细胞。 获得的由该质粒编码的IL13构建体在IL-13成熟序列N端融合了氨基酸 序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序列ACGGGGG，其侧翼为 克隆过程中引入的其它氨基酸。用pCEP-SP-GST-IL13转染的细胞的培 养上清液含有融合蛋白GST-IL13，该融合蛋白能按照标准方法通过谷胱 甘肽亲和层析纯化。用肠激酶切割该融合蛋白释放在N端与上述氨基酸 序列融合的成熟IL-13，获得以下称为“小鼠C-IL-13-S”的一种蛋白质， 其具有SEQ ID NO：329的序列。
B.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与25 倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反 应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与小鼠C-IL-13-F或小鼠 C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F 或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE 分析。
C.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合液与小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM 小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物 经SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶 联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶 液(终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-13-F或小 鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM小鼠 C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经 SDS-PAGE分析。
实施例10
为了与VLP和菌毛偶联而含有一个含半胱氨酸残基的N端氨基酸接头
的白介素5(IL-5)的克隆与表达
A.IL-5的克隆，用于在大肠杆菌中作为包涵体表达
使用下列两种引物从ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC号：37562) 中PCR扩增IL-5：Spelinker3-F1(SEQ ID NO：340)和IL5StopXho-R (SEQ ID NO：342)。用该PCR产物作为模板进行第二次PCR，使用引 物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO：341)和IL5StopXho-R。插入片段用 SpeI和NotI消化。将该插入片段连接入预先用NheI和NotI消化(未磷 酸化)的pET载体衍生物(pMODEC3-8载体)中，转化大肠杆菌TG1 细胞。克隆到pMODEC3-8载体中产生的IL5构建体在其N端含有一个 六组氨酸尾，随后是一个肠激酶位点，一个含有半胱氨酸残基的N端γ3 氨基酸接头(其C端一侧为序列AS，N端一侧为序列ALV)，和IL5基 因的成熟形式。肠激酶切割释放的蛋白质被称为“小鼠C-IL-5-E”(SEQ ID NO：332)。产生的克隆pMODC6-IL5.2(也称为pMODC6-IL5)的质粒 DNA通过DNA测序证实其序列，用它转化大肠杆菌BL21株。
克隆pMODC6-IL5/BL21在含1mg/L氨苄青霉素的5ml LB中生长 过夜。2ml培养液用含有1mg/L氨苄青霉素的100ml培养液(TB)稀 释。当培养液达到光密度OD600＝0.7时，加入0.1ml 1M异丙基β-D-硫 代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)溶液诱导培养。每2小时采集10ml样品。 样品以4000xg离心10分钟。沉淀重悬浮于0.5ml含50mM Tris-HCl、 2mM EDTA、0.1％triton X-100的裂解缓冲液(pH8)中。加入20μl 溶菌酶(40mg/ml)并在4℃下孵育试管30分钟后，超声处理细胞2分 钟。加入100μl 50mM MgCl2溶液和1ml benzonase。然后在室温下孵 育细胞30分钟，以13000×g离心15分钟。
弃上清液，沉淀在100μl SDS加样缓冲液中98℃煮沸5分钟。溶于 加样缓冲液的10μl样品在还原条件下通过SDS-PAGE分析(图17A)。 图17A的凝胶清楚地证实了IL-5构建体的表达。加载到图17A的凝胶 上的样品如下：
M道：标准分子量蛋白质(NEB，宽范围预染色标准蛋白)。第1 道：诱导前1ml培养液的细胞提取物。第2道：诱导4小时后1ml培 养液的细胞提取物。
B.IL-5的克隆，用于在哺乳动物细胞(HEK-293T)中表达
a)在N端与一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头融合且在C端与Fc 片段融合的IL-5
用(A)所述的模板(ATCC克隆37562)克隆下列构建体。质粒 pMODB1-IL5(一种pET衍生物)用BamHI/XhoI消化，产生一个小片 段，其编码与含有半胱氨酸的N端氨基酸接头融合的IL5。将该片段连 接到预先用BamHI和XhoI消化的载体pCEP-SP-XA-Fc*(ΔXho)中。 连接物通过电穿孔进入大肠杆菌TG1株，产生的克隆pCEP-SP-IL5-Fc.2 的质粒DNA通过DNA测序证实其序列，用它来转染HEK-293T细胞。 该质粒编码的IL5构建体包含在IL-5成熟序列N端融合的氨基酸序列 ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，其含有 一个半胱氨酸，侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。用因子-Xa切割 该融合蛋白释放的IL-5蛋白在下文中称为“小鼠C-IL-5-F”(SEQ ID NO： 333)。
转染并在嘌呤霉素上筛选后，利用与辣根过氧化物酶偶联的抗-His (小鼠)和抗-小鼠IgG抗体，通过Western印迹分析培养上清液(图17B)。 与辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgG抗体也能检测Fc-融合蛋白。用蛋 白A树脂通过亲和层析进行蛋白质纯化。图17B的结果清楚地证实了 IL-5构建体的表达。
加载到图17B的Western印迹上的样品如下：
第1道：表达IL5-Fc的HEK培养上清液(20μl)。SDS-PAGE在还 原条件下进行。第2道：表达IL13-Fc的HEK培养上清液(20μl)。 SDS-PAGE在非还原条件下进行。第3道：表达IL5-Fc的HEK培养上 清液(20μl)。SDS-PAGE在非还原条件下进行。
b)克隆的IL-5，其含有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)和在N端融合 的一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头
用引物Nhe-link1-IL13-F和IL5StopXho-R扩增IL-5(ATCC 37562)。 用NheI和XhoI消化后，将插入片段连接到预先用NheI和XhoI消化的 pCEP-SP-GST-EK中。对产生的质粒pCEP-SP-GST-IL5测序，并用于转 染HEK-293T细胞。得到的该质粒编码的IL-5构建体含有在IL-5成熟 序列的N端融合的氨基酸序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序 列ACGGGGG，其含有一个半胱氨酸残基，侧翼为克隆过程中引入的其 它氨基酸。肠激酶切割释放的蛋白质在下文中称为“小鼠C-IL-5-S”(SEQ ID NO：334)。产生的蛋白质用谷胱甘肽亲和树脂通过亲和层析进行纯 化。
C.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与Qβ衣壳蛋白的偶联
120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的Qβ反应混合液与小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
D.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与fr衣壳蛋白的偶联
120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液 与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的fr反应混合液与小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM fr衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
E.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联
120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH (Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1 L 20 mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。透析的 HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液 (终浓度：60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠 C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分析。
F.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与菌毛的偶联
125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与50倍 摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在摇床上室 温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech) 脱盐。合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与小鼠 C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度：60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-5-F 或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物经SDS-PAGE分 析。
实施例11
含半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，鼠血管内皮生长因子-2
(mVEGFR-2，FLK1)片段的表达、纯化和偶联
将包含第二和第三胞外域的鼠血管内皮生长因子-2(mVEGFR-2， FLK1)的构建体重组表达为一种Fc-融合蛋白，为与VLP和菌毛偶联， 它在C端包含一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头。mVEGFR-2(2-3)的蛋 白质序列由小鼠FLK-1的cDNA序列翻译而来(Matthews等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88：9026-9030(1991)：登录号X59397；Ig样C2型域2： 氨基酸143-209；Ig样C2型域3：氨基酸241-306)。mVEGFR-2(2-3)构 建体包含mVEGFR-2从脯氨酸126到赖氨酸329之间的序列(前体蛋白 的编号)。该构建体除了免疫球蛋白样C2型域2和3之外，为了添加氨 基酸间隔区，还包含mVEGFR-2序列中域2之前和域3之后的侧翼区。 含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头通过克隆入pCEP-SP-EK-Fc*载体 (实施例1)内与mVEGFR-2序列的C端融合。克隆入pCEP-SP-EK-Fc* 载体内的mVEGFR-2的片段编码下列氨基酸序列(SEQ ID NO：345)： PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK RFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSH HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCV ASSGRMIKRN RTFVRVHTKP
重组mVEGFR-2(2-3)在真核细胞中的表达
利用pCEP-SP-EK-Fc*载体在EBNA 293细胞中表达重组 mVEGFR-2(2-3)。pCEP-SP-EK-Fc*载体含有一个BamHI和一个NheI位 点，编码含有一个半胱氨酸残基的氨基酸接头、一个肠激酶切割位点和 C端的一个人Fc区。用引物对BamHI-FLK1-F和NheI-FLK1-B从小鼠7 天胚胎cDNA(Marathon-Ready cDNA，Clontech)中PCR扩增 mVEGFR-2(2-3)。对于PCR反应，在50·1反应混合液(1·1 Advantage 2聚合酶混合物(50×)，0.2mM dNTPs和5·110×cDNA PCR反应缓冲 液)中使用各10pmol引物和0.5ng cDNA(小鼠7天胚胎cDNA， Marathon-Ready cDNA，Clontech)。温度循环如下：94℃ 1分钟，94℃ 30 秒、54℃30秒、72℃1分钟5个循环，之后94℃(30秒)、54℃(30 秒)、70℃(1分钟)5个循环，之后94℃(20秒)、54℃(30秒)、68℃ (1分钟)30个循环。PCR产物用BamHI和NheI消化，插入用相同酶 消化的pCEP-SP-EK-Fc*载体中。产生的质粒命名为 mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc。其它所有步骤都按标准分子生物学方法进 行。
寡核苷酸：
1.引物BamHI-FLK1-F
5’-CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC-3’(SEQ ID NO：343)
2.引物NheI-FLK1-B
5’-CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC-3’(SEQ ID NO：344)
重组mVEGFR-2(2-3)的转染和表达
用上述mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc构建体转染EBNA 293细胞， 收集细胞无血清上清液，用于如实施例1所述纯化。
重组mVEGFR-2(2-3)的纯化
表达的Fc-EK-mVEGFR-2(2-3)蛋白的蛋白A纯化如实施例1所述进 行。随后，在融合蛋白与蛋白A结合后，利用肠激酶(肠激酶Max， Invitrogen)从与蛋白A结合的Fc部分上切下mVEGFR-2(2-3)。在37℃ 下消化过夜(2.5单位肠激酶/100μl结合融合蛋白的蛋白A珠)。通过层 析柱(Micro Bio Spin，Biorad)的短暂离心将释放的VEGFR-2(2-3)与 仍与蛋白A结合的Fc部分分离。为了除去肠激酶，流出液用肠激酶away (Invitrogen)按照使用说明书处理。
实施例12
鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白、HbcAg-lys-2cys-Mut与菌毛的偶联，用
VLP-肽和菌毛-肽疫苗免疫小鼠
A.鼠VEGFR-2肽与VLP和菌毛的偶联
化学合成下列肽(由比利时Eurogenetic合成)：鼠VEGFR-2肽 CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK，用于如下所述与菌毛化学偶 联。
鼠VEGFR-2肽与菌毛的偶联：将1mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液1400μl与85μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在 摇床上室温反应60分钟。反应混合液经PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐，合并从该柱上洗脱的含蛋白质级分(约含1.4mg蛋白质)， 并与2.5倍摩尔过量(终体积)的鼠VEGFR-2肽反应。例如，向200μl 约含0.2mg衍生菌毛的洗脱液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶解于 DMSO)。混合液在25℃摇床上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析过夜。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析， 显示于图18A中。将每种样品的上清液(S)和沉淀(P)以及菌毛和 Sulfo-MBS交联剂(Pierce)衍生的菌毛加样到凝胶上。加载到图18A 的凝胶上的样品如下：
第1道：标准蛋白质；第2-5道：偶联的样品(菌毛鼠：与鼠肽偶 联的菌毛；菌毛人：与人肽偶联的菌毛)；第6道：用Sulfo-MBS交联 剂衍生的菌毛；第7-9道：PD-10柱洗脱液的三种级分。级分2是峰级 分，级分1和3是在峰缘采集的级分。偶联带在凝胶上清晰可见，证实 鼠VEGFR-2与菌毛成功偶联。
鼠VEGFR-2肽与Qβ衣壳蛋白的偶联：将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液1ml与20μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。反应溶液随后 在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析两次各2小时。1000μl透析的 反应混合液与12μl 10mM肽溶液(溶解于DMSO)在25℃摇床上反应 4小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析2×2小 时。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析，显示于图18B中。将 每种样品的上清液(S)以及Qβ衣壳蛋白和Sulfo-MBS交联剂(Pierce) 衍生的Qβ衣壳蛋白加样到凝胶上。偶联一式两份进行。下列样品被加 载到凝胶上：
第1道：标准蛋白质；第2、5道：Qβ衣壳蛋白；第3、6道：用 Sulfo-MBS交联剂衍生的Qβ衣壳蛋白；第4、7道：与鼠VEGFR-2肽 偶联的Qβ衣壳蛋白。偶联带在凝胶上清晰可见，证实鼠VEGFR-2与 Qβ衣壳蛋白成功偶联。
鼠VEGFR-2肽与HbcAg-lys-2cys-Mut的偶联：将0.9mg/ml无半 胱氨酸的HbcAg衣壳蛋白(实施例31)在PBS pH7.4中的溶液3ml与 37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。 反应溶液随后用2 L 20mM Hepes pH7.4透析过夜。更换缓冲液后，反 应溶液用相同缓冲液再透析2小时。透析的反应混合液与3μl 10mM肽 溶液(溶解于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃ 下用2 L 20mM Hepes pH7.4透析过夜，然后更换缓冲液，用相同缓冲 液再透析2小时。偶联结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析，显示于 图18C中。将每种样品的上清液(S)以及HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白和 Sulfo-MBS交联剂衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白加样到凝胶上。偶联 一式两份进行。偶联反应在2.5倍和10倍摩尔过量的肽中进行。下列样 品被加载到凝胶上：
第1道：标准蛋白质；第2、4、6、8道：与10倍摩尔过量的肽进 行偶联反应的上清液(S)和沉淀(P)；第3、5、7、9道：与2.5倍摩 尔过量的肽进行偶联反应的上清液(S)和沉淀(P)；第10道：Sulfo-MBS 衍生的HbcAg-lys-2cys-Mut；第11道：HbcAg-lys-2cys-Mut。
偶联带在凝胶上清晰可见，证实鼠VEGFR-2与HbcAg-lys-2cys-Mut 蛋白成功偶联。
B.小鼠的免疫：
菌毛-肽疫苗：
给雌性C3H-HeJ(缺乏Toll样受体4)和C3H-HeN(野生型)小鼠 接种不含佐剂的与菌毛蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg 总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、 28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分 析。
Qβ衣壳蛋白-肽疫苗：
给雌性Black 6小鼠接种含及不含佐剂(氢氧化铝)的与Qβ衣壳蛋 白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg总蛋白用PBS稀释为200 μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、28、42天眼眶后放血， 第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分析。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗：
给雌性Black 6小鼠接种含及不含佐剂(氢氧化铝)的与 HbcAg-lys-2cys-Mut蛋白偶联的鼠VEGFR-2肽。每种样品约100μg总 蛋白用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮下注射。小鼠在第14、 28、42天眼眶后放血，第42天的血清用人VEGFR-2特异的ELISA分 析。
C.ELISA
通过ELISA用固定化的鼠VEGFR-2肽检测免疫小鼠的血清。利用 化学交联剂Sulfo-SPDP使鼠VEGFR-2肽与牛RNAseA偶联。ELISA板 用浓度为10μg/ml的偶联RNAse A包被。封闭ELISA板，然后与连续 稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也 检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。用未偶联载体免疫的小鼠的血清 进行对照ELISA实验，结果显示，检测的抗体是各自肽特异的。结果显 示在图4-6中。
菌毛-肽疫苗：
ELISA的结果如图18D所示。所述血清稀释液的结果显示为450nm 下的光密度。三只小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有 小鼠都产生抗鼠VEGFR-2肽的IgG抗体效价。缺乏Toll样受体4的小 鼠与野生型小鼠之间未见差异，证实了当与菌毛偶联时，自身抗原鼠 VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相应血清 命名。
Qβ衣壳蛋白-肽疫苗：
所述血清稀释液的结果在图18E中显示为450nm下的光密度。两只 小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生抗鼠 VEGFR-2肽的IgG抗体效价，证实了当与Qβ衣壳蛋白偶联时，自身抗 原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相 应血清命名。
HbcAg-lys-2cys-Mut疫苗：
所述血清稀释液的结果在图18F中显示为450nm下的光密度。三只 小鼠的平均值(包括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生抗鼠 VEGFR-2肽的IgG抗体效价，证实了当与Qβ衣壳蛋白偶联时，自身抗 原鼠VEGFR-2肽在小鼠中的免疫原性。给小鼠注射的疫苗按分析的相 应血清命名。
实施例13
Aβ1-15肽与HBcAg-lys-2cys-Mut和fr衣壳蛋白的偶联
化学合成下列Aβ肽(DAEFRHDSGYEVHHQGGC)，该肽包含人 Aβ残基1-15的氨基酸序列，为了与VLP和菌毛偶联，在其C端与序列 GGC融合。
A.a)Aβ1-15肽利用交联剂SMPH与HBcAg-lys-2cys-Mut的偶联
将1.2mg/ml HBcAg-lys-2cys-Mut蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液833.3μl与17μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为 10000 Da的透析管中用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析两次 各2小时。833.3μl透析的反应混合液与7.1μl 50mM肽贮存液(溶解 于DMSO中的肽贮存液)在15℃摇床上反应2小时。反应混合液随后 在4℃下用1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜。样品等量 分装后液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
b)Aβ1-15肽利用交联剂SMPH与fr衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶 液500μl与23μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30 分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为10000 Da的透析管中用 1 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析两次各2小时。500μl透析 的反应混合液与5.7μl 50mM肽贮存液(溶解于DMSO中的肽贮存液) 在15℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析过夜。样品等量分装后液氮冻结，贮存于-80℃， 直到用于免疫小鼠。偶联反应的样品在还原条件下通过SDS-PAGE分析。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示于图19A中。对应于 Aβ1-15与fr衣壳蛋白或与HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶联的偶联带在凝胶上 清晰可见，在图中以箭头指出，证实Aβ1-15与fr衣壳蛋白及与 HBc-Ag-lys-2cys-Mut衣壳蛋白成功偶联。Aβ1-15与fr衣壳蛋白偶联可 见多条偶联带，而与HBc-Ag-lys-2cys-Mut偶联主要可见一条偶联带。
下列样品加载到图19A的凝胶上。
1：蛋白质标准(kDa标准7708S BioLabs。凝胶上的分子量标准带 从上往下为：175，83，62，47.5，32.5，25，16.5，6.5kDa)。2：衍生 的HBc-Ag-lys-2cys-Mut。3：与Aβ1-15偶联的HBc-Ag-lys-2cys-Mut， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的上清液。4：与Aβ1-15偶联的 HBc-Ag-lys-2cys-Mut，在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。5： 衍生的fr衣壳蛋白。6：与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白，在偶联反应结 束时采集并离心的样品的上清液。7：与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。
B.Balb/c小鼠的免疫
雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天两次皮下接种用无菌PBS稀释 的10μg与Aβ1-15偶联的fr衣壳蛋白(Fr-Aβ1-15)或10μg与Aβ1-15 偶联的HBc-Ag-lys-2cys-Mut(HBc-Aβ1-15)。对小鼠在第22天眼眶后 放血，用Aβ-1-15特异性ELISA分析血清。
C.ELISA
利用化学交联剂Sulfo-SPDP使Aβ1-15与牛RNAse A偶联。ELISA 板用浓度为10μg/ml的Aβ1-15-RNAse偶联物包被。封闭ELISA板， 然后与连续稀释的血清样品孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗 体检测。也检测来自未免疫小鼠的血清作为对照。
图19B显示在第22天获得的ELISA信号，应用分别以疫苗Fr-Aβ 1-15和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括来自未免疫小鼠的对照 血清(免疫前血清)。不同血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。 三只接种小鼠的平均值均被显示。接种的所有小鼠在血清中都含有Aβ 1-15特异的IgG抗体。
实施例14
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽与1型菌毛的偶联
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽利用交联剂SMPH与菌毛的偶联。
化学合成下列Aβ肽： DAEFRHDSGYEVHHQGGC(“Aβ1-15”)，该肽包含人Aβ氨基酸残基 1-15的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其C端与序列GGC融 合； DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC(“Aβ1-27”)，该肽包含 人Aβ氨基酸残基1-27的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其C 端与序列GGC融合；以及 CGHGNKSGLMVGGVVIA(“Aβ 33-42”)，该肽包含人Aβ氨基酸残基 33-42的氨基酸序列，为了与菌毛和VLP偶联，在其N端与序列 CGHGNKS融合。所有这三种肽都如下所述与菌毛化学偶联。
将2mg/ml菌毛在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液2ml 与468μl 33.3mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应45分钟。 将反应溶液上样到PD10柱(Pharmacia)上，用6×500μl 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4洗脱。洗脱级分通过在硝酸纤维素(Schleicher & Schuell)上斑点杂交分析，并用Amidoblack染色。合并级分3-6。然后 将样品等量分装冻存于液氮中，贮存于-80℃，直到用于偶联。
200μl融化的脱盐反应混合液与200μl DMSO和各2.5μl相应的50 mM肽DMSO贮存液在摇床上室温反应3.5小时。400μl反应混合液随 后在4℃下在分子量排阻值为10000 Da的透析管中用1 L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析三次各1小时。然后将样品等量分装冻存于液 氮中，贮存于-80℃。
用于SDS-PAGE的样品制备如下进行：100μl透析的偶联反应液在 10％TCA中冰上孵育10分钟，然后离心。沉淀重悬浮于50μl 8.5M盐 酸胍溶液中，在70℃下孵育15分钟。然后用乙醇沉淀样品，在第二次 离心步骤后，沉淀重悬浮于样品缓冲液中。
偶联实验的结果在还原条件下通过SDS-PAGE分析。所有三种肽的 偶联带均清晰可见，证实Aβ肽与菌毛成功偶联。
实施例15
用与Qβ衣壳蛋白偶联的Aβ肽接种APP23小鼠
A.APP23小鼠的免疫
三种不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2； H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) 与Qβ衣壳蛋白偶联。产生的疫苗命名为“Qb-Ab 1-15”、“Qb-Ab 1-27”和 “Qb-Ab 33-42”。接种使用8个月大的携带人APP转基因的雌性APP23 小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292 (1997))。给小鼠皮下注射无菌PBS稀释的25μg疫苗，14天后用相同 量的疫苗加强。在开始免疫前和加强注射7天后，从小鼠尾静脉取血。 通过ELISA分析血清。
B.ELISA
Aβ1-40和Aβ1-42肽贮存液用DMSO配制，使用前用包被缓冲液 稀释。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封闭ELISA 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也包括接种前获得的血清作为对照。显示平均值高于基线3 个标准差的血清稀释度被计算并定义为“ELISA滴度”。测试的所有3种 疫苗在APP23小鼠中都有免疫原性，并且诱导出针对Aβ1-40和/或Aβ 1-42的高抗体效价。结果显示在图20中。在同一小鼠的免疫前血清中 未检测到特异性抗体(数据未显示)。
图20显示在第22天获得的ELISA信号，应用分别以疫苗Fr-Aβ1-15 和HBc-Aβ1-15免疫的小鼠的血清。也包括来自未免疫小鼠的对照血清 (免疫前血清)。不同血清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。三 只接种小鼠的平均值均被显示。
小鼠A21-A30接受疫苗Qb-Ab 1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab 1-27， 小鼠A41-49接受Qb-Ab 33-42。每只小鼠在第21天通过ELISA测定Aβ 1-40和Aβ1-42肽特异的血清抗体滴度。每只小鼠显示的ELISA滴度定 义为平均值高于基线3个标准差的血清稀释度。接种Qb-Ab 1-15或 Qb-Ab 1-27的小鼠产生抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗体滴度，而接种 Qb-Ab 33-42的小鼠只产生抗Aβ1-42肽的高抗体滴度。
实施例16
Fab抗体片段与Qβ衣壳蛋白的偶联
4.0mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶 液与2.8mM SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO的贮存液)在25℃摇 床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
用木瓜蛋白酶消化人IgG产生的人IgG的Fab片段购自Jackson Immunolab。该溶液(11.1mg/ml)用20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 稀释为2.5mg/ml的浓度，使之与不同浓度(0-1000μM)的二硫苏糖醇 (DTT)或三羧乙基磷化氢(TCEP)在25℃下反应30分钟。
混合衍生并透析的Qβ衣壳蛋白溶液与未还原或还原的Fab溶液(终 浓度：1.14mg/ml Qβ和1.78mg/ml Fab)诱导偶联，在25℃摇床上反应 过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色。结果显示在图21中。
在偶联之前用25-1000μM TCEP和25-100μM DTT还原Fab的样品 中能检测到约40kDa的偶联产物(图21，箭头)，而用10μM TCEP、 10μM DTT或1000μM DTT还原则检测不到。偶联带也与抗-Qβ抗血清 反应(数据未显示)，清楚地证实了Fab片段与Qβ衣壳蛋白的共价偶联。
加载到图21的凝胶上的样品如下：
第1道：分子量标准。第2、3道：偶联前衍生的Qβ衣壳蛋白。第 4-13道：Fab还原后的Qβ-Fab偶联反应，其中4：用10μM TCEP还原 Fab后的Qβ-Fab偶联反应；5：用25μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应；6：用50μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；7：用100 μM TCEP还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；8：用1000μM TCEP还原 Fab后的Qβ-Fab偶联反应；9：用10μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应；10：用25μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；11：用50 μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶联反应；12：用100μM DTT还原Fab 后的Qβ-Fab偶联反应；13：用1000μM DTT还原Fab后的Qβ-Fab偶 联反应。14：偶联前的Fab。凝胶用考马斯亮蓝染色。标准蛋白质的分 子量示于左侧空白处。箭头所指为偶联带。
实施例17
用与Qβ衣壳蛋白偶联的Aβ肽接种APP23小鼠
A.APP23小鼠的免疫
三种不同的Aβ肽(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2； H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ 33-42；Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) 与Qβ衣壳蛋白偶联。产生的疫苗命名为“Qb-Ab 1-15”、“Qb-Ab 1-27”和 “Qb-Ab 33-42”。接种使用8个月大的携带人APP转基因的雌性APP23 小鼠(Sturchler-Pierrat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13287-13292 (1997))。给小鼠皮下注射无菌PBS稀释的25μg疫苗，14天后用相同 量的疫苗加强。在开始免疫前和加强注射7天后，从小鼠尾静脉取血。 通过ELISA分析血清。
B.ELISA
Aβ1-40和Aβ1-42肽贮存液用DMSO配制，在使用前用包被缓冲 液稀释。ELISA板用0.1μg/孔的Aβ1-40或Aβ1-42肽包被。封闭ELISA 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也包括接种前获得的血清作为对照。平均值高于基线3个标 准差的血清稀释度被计算并定义为“ELISA滴度”。测试的所有3种疫苗 在APP23小鼠中都是免疫原性的，并且诱导产生抗Aβ1-40和/或Aβ1-42 的高抗体效价。结果显示在图20中。在同一小鼠的免疫前血清中未检 测到特异性抗体(数据未显示)。
图20显示在第22天获得的ELISA信号，其应用分别以疫苗Qb-Ab 1-15、Qb-Ab 1-27和Qb-Ab 33-42免疫的小鼠的血清。小鼠A21-A30接 受疫苗Qb-Ab 1-15，小鼠A31-A40接受Qb-Ab 1-27，小鼠A41-49接受 Qb-Ab 33-42。每只小鼠在第21天通过ELISA测定Aβ1-40和Aβ1-42 肽特异的血清抗体滴度。每只小鼠显示的ELISA滴度定义为平均值高于 基线3个标准差的血清稀释度。接种Qb-Ab 1-15或Qb-Ab 1-27的小鼠 形成抗Aβ1-40和Aβ1-42的高抗体滴度，而接种Qb-Ab 33-42的小鼠 只有抗Aβ1-42肽的高抗体滴度。在表达人Aβ转基因的转基因小鼠中 用人Aβ肽获得极强的免疫应答，证明通过Aβ肽与Qβ衣壳蛋白偶联， 能够克服对自身抗原的耐受。
实施例18
Qβ外壳蛋白突变型的构建、表达与纯化
pQβ-240的构建
用质粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene 137：133-137)作为构 建pQβ-240的初始质粒。突变Lys13→Arg通过反向PCR产生。反向引 物设计为反向尾-尾方向：
5’-GGTAACATCGG AGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3’和
5’-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCT CCGATGTTACC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-240 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：255) AKLETVTLGNIG DGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-243的构建
用质粒pQβ10作为构建pQβ-243的初始质粒。突变Asn10→Lys通 过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向：
5’-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3’和
5’-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-243 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：256) AKLETVTLG IGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250的构建
用质粒pQβ-240作为构建pQβ-250的初始质粒。突变Lys2→Arg通 过定点诱变产生。突变PCR片段的合成使用上游引物 5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物 5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，导入pQβ-185表达载体的仅有的限 制性酶切位点NcoI和HindIII中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂 商推荐方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-250 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：257) A LETVTLGNIG DGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251的构建
用质粒pQβ10作为构建pQβ-251的初始质粒。突变Lys16→Arg通 过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向：
5’-GATGGA CAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3’和
5’-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTG TCCATC-3’。
用第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游 引物5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’和下游引物 5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’。第二 次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆入用相同限制性内切酶 酶切的pQβ10表达载体。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商推荐方 案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-251 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。获得的由该构建 体编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：259中显示。
pQβ-259的构建
用质粒pQβ-251作为构建pQβ-259的初始质粒。突变Lys2→Arg通 过定点诱变产生。突变PCR片段的合成使用上游引物 5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’和下游引物 5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’，导入pQβ-185表达载体的仅有的限 制性酶切位点NcoI和HindIII中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂 商推荐方案进行(MBI Fermentas，Vilnius，立陶宛)。
利用定向标记物掺入法测序证实了希望得到的突变。携带pQβ-259 的大肠杆菌细胞支持14kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在PAGE上与 从Qβ噬菌体颗粒中分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列为：(SEQ ID NO：258) AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
Qβ和Qβ突变体的表达和纯化的一般方法
表达
用Qβ表达质粒转化大肠杆菌JM109。用Qβ表达质粒转化的克隆 接种于5ml含20·g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。不加振摇在37℃ 下孵育16-24小时。
用制备的细菌培养液以1∶100接种于100-300ml含20·g/ml氨苄青 霉素的LB培养基。不加振摇在37℃下孵育过夜。用制备的细菌培养液 以1∶50接种于烧瓶中的M9+1％酪蛋白氨基酸+0.2％葡萄糖培养基， 37℃振摇孵育过夜。
纯化
用于纯化过程的溶液和缓冲液
1.裂解缓冲液LB
50mM Tris-HCl pH8.0，含5mM EDTA，0.1％tritonX100和新鲜制 备的PMSF，至5μg/ml。不含溶菌酶和DNAse。
2.SAS
饱和硫酸铵水溶液
3.缓冲液NET
20mM Tris-HCl pH7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEG
溶解于NET中的40％(w/v)聚乙二醇6000
破碎与裂解
冷冻的细胞以2ml/g细胞重悬浮于LB中。混合物以22kH超声处 理5次各15秒，间隔1分钟，溶液在冰上冷却。然后用Janecki K60转 子以14000rpm离心裂解液1小时。除非另外指出，以下所述的离心步 骤均用相同转子进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤两次。 离心后，合并裂解液的上清和洗涤液。
分级分离
在搅拌下向上述合并的裂解液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。将SAS 的体积调节为总体积的1/5，获得20％饱和。溶液静置过夜，次日以14000 rpm离心20分钟。沉淀用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的 上清液，逐滴加入SAS，获得40％饱和。溶液静置过夜，次日以14000mm 离心20分钟。获得的沉淀用NET缓冲液溶解。
层析
将重新溶解于NET缓冲液中的衣壳蛋白上样到Sepharose CL-4B柱 上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个主要含有膜和膜片段，不收集。 衣壳包含在第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。 合并峰级分，将NaCl浓度调节为0.65M的终浓度。在搅拌下逐滴 加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。溶液不加搅拌静置过夜。 以14000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后溶解于最小体积的NET 中，再次上样到Sepharose CL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和(w/v) 的硫酸铵沉淀。离心并重新溶解于NET缓冲液后，衣壳蛋白上样到 Sepharose CL-6B柱上重新进行层析。
透析与干燥
合并如上获得的峰级分，对无菌水充分透析，冻干保存。
Qβ-240的表达与纯化
将细胞(质粒pQβ-240转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中， 超声处理5次各15秒(水冰夹套)，以13000rpm离心1小时。上清液 保存于4℃，直到进一步处理，而碎片用9ml LB洗涤2次，最后用溶 于LB的9ml 0.7M尿素洗涤。合并所有上清液，上样到Sepharose CL-4B 柱上。合并的峰级分用硫酸铵沉淀并离心。然后用Sepharose 2B柱进一 步纯化再次溶解的蛋白质，最后用Sepharose 6B柱纯化。衣壳峰最后用 水充分透析，如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显微镜检查 证实。
Qβ-243的表达与纯化
将细胞(大肠杆菌RR1)重悬浮于LB中，并如一般方法所述处理。 蛋白质用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱通过连续凝胶 过滤步骤纯化。合并峰级分，如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过 电子显微镜检查证实。
Qβ-250的表达与纯化
将细胞(pQβ-250转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，并如 上所述处理。蛋白质用Sepharose CL-4B柱，最后用Sepharose CL-2B柱 通过凝胶过滤纯化，并如上所述冻干。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显 微镜检查证实。
Qβ-259的表达与纯化
将细胞(pQβ-259转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，并超 声处理。碎片用10ml LB洗涤一次，第二次用溶于LB的10ml 0.7M尿 素洗涤。蛋白质用Sepharose CL-4B柱通过两次凝胶过滤层析步骤纯化。 如上所述透析并冻干蛋白质。外壳蛋白装配为衣壳通过电子显微镜检查 证实。
实施例19
用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2使变应性小鼠脱敏
A.通过接种使变应性小鼠脱敏
雌性CBA/J小鼠(8周龄)用PLA2致敏：每只小鼠，通过振荡30 分钟使0.1μg PLA2(Latoxan，法国)吸附到1mg明矾(Imject，Pierce) 上，总体积为66μl，然后皮下注射。该步骤每14天重复一次，总共4 次。这种处理导致PLA2-特异的血清IgE的产生，但不产生IgG2a抗体。 最后一次致敏1个月后，小鼠皮下注射10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联 的重组PLA2的疫苗。1周及2周后，再次用相同量的疫苗处理。最后 一次处理1周后，从小鼠采血，然后用25μg PLA2(Latoxan)腹膜内 攻击，用校准的数字温度计测量直肠温度。未用Qβ衣壳蛋白-PLA2处 理的致敏小鼠作为对照。虽然所有对照小鼠都经历了过敏反应，表现为 PLA2攻击后直肠温度显著降低，而接种的小鼠完全或至少部分受到保 护。结果显示在图25A中。
B.ELISA
ELISA板(Maxisorp，Nunc)用5μg/ml PLA2(Latoxan)包被。封 闭平板，然后与连续稀释的血清孵育。为了检测IgE抗体，血清在室温 下在摇床上用蛋白G珠(Pharmacia)预处理60分钟。离心除去珠，用 上清液进行ELISA。与PLA2结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG2a或IgE 抗体检测。ELISA滴度在半数最大光密度(OD50％)时测定，对于IgG2a 表示为100倍预稀释的血清的-log5，对于IgE表示为10倍预稀释的血 清的-log5。对于所有小鼠，在疫苗处理之前及结束时测定血清中PLA2 特异的IgG2a和IgE。接种导致PLA2特异性IgG2a显著增多，而注意 到IgE滴度没有与之一致的改变。这些结果表明，接种导致诱导Th1样 免疫应答(反映为IgG2a产生)。结果显示在图25B中。
接种和未接种小鼠的过敏反应显示在图25A中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2 的疫苗皮下处理3次。对照小鼠致敏但不接种。最后一次接种1周后， 所有小鼠都用25μg PLA2腹膜内攻击，通过测量直肠温度60分钟监测 过敏反应。虽然所有对照小鼠都显示体温显著降低，但接种的小鼠完全 或至少部分受到免于过敏反应的保护。
接种对PLA2特异性IgG2a的诱导显示在图25B中。
小鼠用PLA2致敏，然后用10μg包含与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2 的疫苗处理3次。对照小鼠致敏但不接种。处理开始前和处理结束后、 攻击前采集致敏小鼠的血清。在接种的小鼠中(图左边)，观察到PLA2 特异性IgG2a显著增多。
实施例20
PLA2-Cys(也称为PLA2融合蛋白)的表达、
重折叠、纯化和偶联
A.包涵体的表达和制备
用含有实施例xxx的PLA2-Cys基因的pET11a质粒转化大肠杆菌 BL21DE3Rill(Stratagene)。过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素和 15μg/ml氯霉素的dYT培养基中生长。培养液用含氨苄青霉素和氯霉素 的新鲜dYT培养基稀释，在37℃下生长，直到OD600nm＝1。培养液用1mM IPTG诱导，再培养4小时。离心收集细胞，重悬浮于含有0.5mg/ml溶 菌酶的PBS缓冲液中。在冰上孵育后，细胞在冰上超声处理，加入MgCl2至10mM的浓度。向细胞裂解液中添加6μl Benzonase(Merck)，裂解 液在室温下孵育30分钟。添加Triton至终浓度为1％，裂解液在冰上再 孵育30分钟。13000g离心10分钟收集包涵体(IB)沉淀。包涵体沉淀 用含有20mM Tris，23％蔗糖，1mM EDTA，pH8.0的洗涤缓冲液洗涤。 将包涵体溶解于含200mM DTT的6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0中。 溶解的包涵体以50000g离心，上清液用6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0 透析，随后用含有0.1mM DTT的相同缓冲液透析。添加氧化的谷胱甘 肽至终浓度为50mM，溶解的包涵体在室温下孵育1小时。溶解的包涵 体用6M盐酸胍，20mM Tris，pH8.0透析。通过Bradford分析和 SDS-PAGE估计包涵体溶液的浓度。
B.重折叠和纯化
将包涵体溶液每24小时分三部分缓慢加入含有2mM EDTA，0.2 mM苯甲脒，0.2mM 6氨基己酸，0.2mM盐酸胍，0.4M L-精氨酸，pH6.8 的重折叠缓冲液中，至终浓度为3μM，在重折叠开始前，在4℃下向其 中添加5mM还原谷胱甘肽和0.5mM氧化谷胱甘肽。利用YM10膜 (Millipore)超滤将重折叠溶液浓缩为其体积的一半，并用含有0.1mM DTT的PBS，pH7.2透析。通过超滤进一步浓缩蛋白质，在4℃下上样到 用20mM Hepes，150mM NaCl，0.1mM DTT平衡的Superdex G-75柱 (Pharmacia)上进行纯化。在室温下将平衡缓冲液的pH调节为7.2。合 并单成分的级分(monomeric fractions)。
C.偶联
将1.5mg Qβ在0.75mL 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中的溶 液与0.06mL Sulfo-SMPB(Pierce；31mM水贮存液)在室温下反应45 分钟。反应混合液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析过夜，0.75 mL该溶液与1.5mL PLA2-Cys在0.1mM DTT中的溶液(62μM)和0.43 mL在室温下调节为pH7.4的20mM Hepes，150mM NaCl，137μM DTT 混合。偶联反应在室温下继续4小时，利用分子量截断值为300 000Da 的Spectra Por透析管(Spectrum)，反应混合液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4透析过夜。偶联反应通过SDS-PAGE考马斯蓝染色和 Western印迹分析，使用兔抗蜂毒抗血清(1∶10000稀释)，用山羊抗兔 碱性磷酸酶偶联物(1∶10000稀释)显色；或者使用兔抗Qβ抗血清 (1∶5000)，用山羊抗兔碱性磷酸酶偶联物(1∶10000稀释)显色。在这 两种情况下，样品都在还原条件下进行反应。
偶联反应的结果显示在图26中。对应于Qβ衣壳蛋白与PLA2-Cys 偶联产物的带在Qβ衣壳蛋白与PLA2-Cys间偶联反应的考马斯蓝染色 SDS-PAGE(左图)、抗-Qβ Western印迹(中图)和抗-PLA2 Western印 迹(右图)中清晰可见，在图中用箭头指出。15μl偶联反应液和50μl 透析的偶联反应液加样到凝胶上。
第1道：蛋白质标准。2：透析的偶联反应液1。3：偶联反应1。4： 偶联反应2。5：偶联反应2。6：偶联反应1。7：透析的偶联反应液1。 8：蛋白质标准。9：偶联反应2。10：偶联反应1。11：透析的偶联反应 液1。12：蛋白质标准。
实施例21
抗独特型IgE mimobody VAE051与Qβ的偶联、
小鼠的免疫和抗血清的检测
4.0mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶 液与10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)(来自溶解于DMSO中的100mM 贮存液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。VAE051溶液(2.4mg/ml) 在25℃下用等摩尔浓度的TCEP还原60分钟。
46μl透析的Qβ反应混合液与340μl TCEP处理的VAE05l溶液(2.4 mg/ml)在总体积为680μl的50mM乙酸钠缓冲液中在16℃摇床上反应 2小时。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色。偶联反应中的另外两条带(在VAE或Qβ溶液中没有)代 表与Qβ偶联的VAE051的重链和轻链(图28A)。分别用重链和轻链特 异的抗体通过Western印迹证实这两条带的身分。
小鼠的免疫
利用截断值为300000Da的膜，Qβ-VAE051偶联溶液用20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析。在第0天和第14天给两只雌性Balb/c 小鼠腹膜内注射50μg Qβ-VAE051。将小鼠在第28天眼眶后放血，其血 清用IgE-和VAE051-特异的ELISA分析。
ELISA
ELISA板用浓度为0.8μg/ml的人IgE或10μg/ml的VAE051包被。 封闭ELISA板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记 的抗小鼠IgG抗体检测(图28B)。
两只小鼠都显示对VAE051以及人IgE的强反应性。同一小鼠的免 疫前血清不显示对VAE051和IgE的任何反应性(图28B)。这证实产生 了针对抗独特型IgE mimobody VAE051的抗体，该抗体也识别“亲本”分 子IgE。
实施例22
利用交联剂SMPH的DerpI肽与野生型Qβ衣壳蛋白
的高占用率偶联
化学合成Derp 1，2肽，为便于偶联，该肽在N端添加一个半胱氨酸， 其具有下列序列：H2N-CQIYPPNANKIREALAQTHSA-COOH。该肽用 来与野生型Qβ衣壳蛋白化学偶联，如下所述。
D.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
浓度为2mg/ml的Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中 的溶液与5倍或20倍过量的交联剂SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液随后在4℃下用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析2次各2小时。透析的反应混合液与5倍过量的Derp 1，2肽在25℃ 摇床上反应2小时。
偶联反应的结果如图24所示。分别对应于每个亚单位1、2、3条肽 的偶联带在凝胶上清晰可见，如箭头所指。平均每个亚单位两条肽在衣 壳上展示。
加载到图24的凝胶上的样品如下：
第1道：蛋白质标准。2：用5倍过量的SMPH衍生的Qβ衣壳蛋白。 3：用20倍过量的SMPH衍生的Qβ衣壳蛋白。4： 5倍衍生的Qβ衣壳 蛋白的偶联反应。5： 20倍衍生的Qβ衣壳蛋白的偶联反应。
实施例23
含赖氨酸残基的肽向HBcAg(1-149)c/e1表位中的插入
HBcAg的c/e1表位(残基72-88)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg) 表面的顶端区中。该区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)被遗传工程 置换为肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys构建体)。引入的赖氨酸残 基在其侧链上含有一个反应性氨基，能用于HBcAg颗粒与含有游离半 胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
具有SEQ ID NO：158所示氨基酸序列的HBcAg-LysDNA通过PCR 产生：编码HBcAg片段(氨基酸残基1-78和81-149)的两个片段分别 通过PCR扩增。这些PCR中使用的引物也引入编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly 肽的DNA序列。HBcAg(1-78)片段利用引物EcoRIHBcAg(s)和 Lys-HBcAg(as)从pEco63中扩增。HBcAg(81-149)片段利用引物 Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63中扩增。引物 Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两种PCR产物的末端引入互补DNA 序列，使两种PCR产物在随后的装配PCR中融合。装配的片段利用引 物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)通过PCR扩增。
对于PCR反应，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng模板 DNA。两种反应的温度循环如下进行：94℃ 2分钟；94℃(1分钟)、50℃ (1分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
引物序列：
EcoRIHBcAg(s)： (5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)(SEQ ID NO：79)；
Lys-HBcAg(as)： (5’- CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAG GTAGC-3’)(SEQ ID NO：80)；
Lys-HBcAg(s)： (5’- GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT GTC-3’)(SEQ ID NO：81)；
HBcAg(1-149)Hind(as)： (5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQ ID NO：82).
为了通过PCR融合两种PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1 mM dNTPs和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol引物 EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，含100ng两种纯化的PCR片 段。PCR循环条件为：94℃ 2分钟；94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、 72℃(2分钟)30个循环。装配的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析， 纯化，并在含EcoRI和HindIII限制性内切酶的适当缓冲液中消化19小 时。消化的DNA片段连接到EcoRI-HindIII消化的pKK载体中，产生 pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制性酶切和插入片段 的DNA测序分析PCR产物向载体中的插入。
实施例24
HBcAg-Lys的表达与部分纯化
用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌XL-1blue株。将1ml细菌过夜培 养液接种于含100μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基。该培养物在 37℃下培养4小时，直到600nm下的OD值达到约0.8。添加IPTG至1 mM终浓度诱导HBcAg-Lys的合成。诱导后，细菌在37℃下继续振摇 16小时。以5000×g离心15分钟收集细菌。沉淀冻存于-20℃。融解沉 淀，重悬浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细 菌裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，pH7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20， 10mM EDTA，10mM DTT)中。细胞在室温下孵育30分钟，用弗氏压 碎器破碎。向裂解液中添加Triton X-100至终浓度为0.2％，裂解液在偶 尔振荡的条件下在冰上孵育30分钟。IPTG诱导携带pKK-HBcAg-Lys 表达质粒或一种对照质粒的大肠杆菌细胞表达HBcAg-Lys。在添加IPTG 前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒和携带对照质粒的细菌培养液中采样。 添加IPTG后16小时，再从含有pKK-HBcAg-Lys的培养液和对照培养 液中采样。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色监测蛋白质的表达。
然后为了除去不可溶的细胞碎片，以12000×g离心裂解液30分钟。 应用抗HBcAg的单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical and Scientifc Corp.，Westbury，NY，USA)通过Western印迹分析上清液和沉 淀，显示有相当量的HBcAg-Lys蛋白是可溶的。简言之，以14000×g 离心表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和对照细胞的裂解液30分钟。分 离上清液(＝可溶性部分)和沉淀(＝不可溶部分)，并用SDS样品缓冲 液等体积稀释。通过SDS-PAGE及之后利用抗-HBcAg单克隆抗体YVS 1841的Western印迹分析样品。
使用由覆盖3ml 15％蔗糖溶液的4ml 65％蔗糖溶液组成的蔗糖分级 梯度液，随后加入4ml细菌裂解液，对澄清的细胞裂解液进行分步梯度 离心。样品在4℃下以100000×g离心3小时。离心后，从梯度液顶部采 集1ml级分，通过SDS-PAGE考马斯蓝染色分析。HBcAg-Lys蛋白通 过考马斯蓝染色检测。
HBcAg-Lys蛋白在15％与65％蔗糖间的界面处富集，表明已经形成 衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质保留在不含蔗糖的梯度上层，因此分级梯 度离心HBcAg-Lys颗粒导致颗粒的富集和部分纯化。
实施例25
利用异双功能交联剂SPDP，FLAG肽与HBcAg-Lys的化学偶联
为了引发针对FLAG肽的免疫应答，将氨基端含有一个半胱氨酸残 基的合成FLAG肽(氨基酸序列CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO：147)) 与纯化的HBcAg-Lys颗粒进行化学偶联。600ml 95％纯度的HBcAg-Lys 颗粒溶液(2mg/ml)在室温下与异双功能交联剂3-(2-吡啶二硫)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(0.5mM)孵育30分钟。反应完成后，混合 液用1升含有150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析过夜， 以除去游离的SPDP。为了防止金属催化的巯基氧化，在10mM EDTA 存在下，500ml衍生的HBcAg-Lys衣壳(2mg/ml)与0.1mM FLAG肽 (含有一个氨基端半胱氨酸)混合。由于SPDP与肽的游离半胱氨酸反 应后释放吡啶-2-硫酮，故根据溶液在343nm下光密度的提高监测反应。 衍生的Lys残基与肽的反应约30分钟后完成。
给小鼠注射FLAG修饰的颗粒。
实施例26
pMPSV-gp140cys的构建
利用寡核苷酸gp140CysEcoRI和SalIgp140由pCytTSgp140FOS通 过PCR扩增gp140基因。对于PCR，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸 和50ng模板DNA。两种反应的温度循环如下进行：94℃2分钟；94℃ (0.5分钟)、55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
PCR产物用QiaEXII试剂盒纯化，用SalI/EcoRI消化，连接到用相 同酶酶切的载体pMPSVHE中。
寡核苷酸序列：
gp140CysEcoRI： 5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ ID NO： 83)
SalIgp 140： 5’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO：84)。
实施例27
pMPSVgp140cys的表达
通过限制性内切酶消化使pMPSVgp140cys(20μg)线性化。通过 苯酚/氯仿抽提终止反应，随后异丙醇沉淀线性化的DNA。限制性内切 酶消化通过琼脂糖凝胶电泳评价。对于转染，5.4μg线性化 pMPSVgp140cys与0.6μg线性化pSV2Neo在30μl H2O中混合，然后添 加30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)后，振荡溶液5秒钟，随后在室温下 孵育25秒。立即将溶液加到2ml含2％FCS的HP-1培养基(2％FCS 培养基)中。然后将生长至80％汇合度的BHK21细胞的培养基(6孔板) 更换为含DNA的培养基。在CO2孵箱中37℃孵育5小时后，除去含 DNA的培养基，更换为2ml含15％甘油的2％FCS培养基。孵育30秒 后除去含甘油培养基，用5ml含10％FCS的HP-1培养基漂洗细胞。最 后加入2ml含10％FCS的新鲜HP-1培养基。
筛选稳定转染的细胞，在37℃ CO2孵箱中在选择培养基(加入G418 的HP-1培养基)中生长。当混合群体生长至汇合时，将培养液分到两 个平皿上，然后在37℃下生长12小时。将一个细胞平皿转移到30℃下， 诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一个平皿保持于37℃。
可溶性GP140-Cys的表达通过Western印迹分析确定。用甲醇/氯仿 沉淀培养基(0.5ml)，将沉淀重悬浮于SDS-PAGE加样缓冲液中。将样 品在95℃下加热5分钟，之后加样到15％丙烯酰胺凝胶上。如Bass和 Yang在Creighton，T.E.编著的《蛋白质功能：实用方法》第二版，IRL Press， Oxford(1997)，29-55页中所述，在SDS-PAGE后，将蛋白质转移到Protan 硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，德国)。膜用溶解于TBS(每升 10×TBS：87.7g NaCl，66.1g盐酸Trizma(Sigma)和9.7g Trizma碱 (Sigma)，pH7.4)的1％牛白蛋白(Sigma)在室温下封闭1小时，然 后与抗-GP140或GP-160抗体孵育1小时。印迹用TBS-T(含0.05％ Tween20的TBS)洗涤3次各10分钟，与碱性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人 IgG偶联物孵育1小时。用TBS-T洗涤2次各10分钟并用TBS洗涤2 次各10分钟后，用碱性磷酸酶检测试剂(10ml AP缓冲液(100mM Tris/HCl，100mM NaCl，pH9.5))与50μl NBT溶液(溶于70％二甲基甲 酰胺的7.7％硝基蓝四唑(Sigma))和37μl X-磷酸溶液(溶于二甲基甲 酰胺的5％5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)进行显色反应。
实施例28
gp140Cys的纯化
将抗-gp120抗体与NHS/EDC激活的葡聚糖共价偶联，并填充层析 柱。将含GP140Cys的上清液加载上柱，充分洗涤后，用0.1M HCl洗 脱GP140Cys。收集过程中在收集管内用1M Tris pH7.2直接中和洗脱液。
在纯化过程中可能形成二硫键，因此用溶于10mM Tris pH7.5的10 mM DTT在25℃下处理收集的样品2小时。
随后用10mM Mes；80mM NaCl pH6.0透析除去DTT。最后如实施 例16所述，GP140Cys与在E2中含有JUN残基的甲病毒颗粒混合。
实施例29
PLA2-Cys的构建
利用寡核苷酸EcoRIPLA和PLA-Cys-hind由pAV3PLAfos通过PCR 扩增PLA2基因。对于PCR，在含2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs 和2mM MgSO4的50μl反应混合液中使用各100pmol寡核苷酸和50ng 模板DNA。反应的温度循环如下进行：94℃ 2分钟；94℃(0.5分钟)、 55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)30个循环。
PCR产物用QiaEXII试剂盒纯化，用EcoRI/HindIII消化，连接到相 同酶酶切的载体pAV3中。
寡核苷酸
EcoRIPLA： 5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO：85)
PLA-Cys-hind： 5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG’3’(SEQ ID NO： 86)。
实施例30
PLA2-Cys的表达与纯化
为了在细胞质中产生含Cys尾的蛋白质，用载体pAV3∷PLA和 pPLA-Cys转化大肠杆菌XL-1 Blue株。培养液在37℃振摇下在含氨苄 青霉素的富集培养基中孵育。在光密度(550nm)＝时，添加1mM IPTG， 继续孵育5小时。离心收集细胞，重悬浮于含DNAse、RNAse和溶菌酶 的适当缓冲液(例如，Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl)中，通过弗氏压 碎器破碎。离心(Sorvall RC-5C，SS34转子，1500rpm，10min，4℃)后， 沉淀在4℃下重悬浮于25ml包涵体洗涤缓冲液(20mM tris-HCl，23％蔗 糖，0.5％Triton X-100，1mM EDTA，pH8)中，如上所述再次离心。重复 这-步骤直到离心后上清液基本澄清。包涵体在室温下重悬浮于20ml 溶解缓冲液(5.5M盐酸胍，25mM tris-HCl，pH7.5)中，离心除去不可 溶物质，然后使上清液通过无菌滤器(0.45μm)。该蛋白质溶液在10mM EDTA和100mM DTT存在下在4℃下至少保持静置10小时，然后用10 倍体积的5.5M盐酸胍，25mM tris-HCl，10mM EDTA，pH6透析3次。 该溶液用含有适当氧化还原复性剂(shuffle)(氧化的谷胱甘肽/还原的 谷胱甘肽；胱氨酸/半胱氨酸)的5L 2M尿素，4mM EDTA，0.1M NH4Cl， 20mM硼酸钠(pH8.3)透析2次。对重折叠的蛋白质进行离子交换层 析。蛋白质在含2-10mM DTT、pH高于7的适当缓冲液中保存，使半 胱氨酸残基保持还原状态。在蛋白质与甲病毒颗粒偶联之前，使蛋白质 溶液通过Sephadex G-25凝胶过滤柱除去DTT。
实施例31
不含游离半胱氨酸残基而含有一个插入的赖氨酸残
基的HBcAg的构建
在对应于SEQ ID NO：134的48和107位点处不含半胱氨酸残基， 而含有一个插入的赖氨酸残基的肝炎核心抗原(HBcAg)，在此称为 HBcAg-lys-2cys-Mut，用下列方法构建。
首先用下列PCR引物组合分别扩增如实施例23所述制备的 HBcAg-Lys基因的三个片段，引入两个突变。PCR方法基本如实施例1 所述，用常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
简言之，用下列引物制备片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s) CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO：148)
引物2：48as GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(SEQ ID NO： 149)
用下列引物制备片段2：
引物3：48s GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(SEQ ID NO：150)
引物4：107as CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC(SEQ ID NO：151)
用下列引物制备片段3：
引物5：HBcAg149hind-as CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG (SEQ ID NO：152)
引物6：107s GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(SEQ ID NO：153)。
然后将片段1和2利用引物EcoRIHBcAg(s)和107as通过PCR结合， 产生片段4。片段4和片段3利用引物EcoRIHBcAg(s)和 EcoRIHBcAghind-as通过PCR结合，产生全长基因。然后用EcoRI (GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化全长基因，克隆到在相同限 制性酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例32
封闭HBcAg的游离半胱氨酸残基然后交联
如上实施例23所述制备的HBcAg-Lys的游离半胱氨酸残基用碘乙 酰胺封闭。然后用异双功能交联剂m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰 亚胺酯(Sulfo-MBS)将封闭的HBcAg-Lys与FLAG肽交联。
封闭游离半胱氨酸残基及交联HBcAg-Lys的方法如下。在1ml的总 体积中，HBcAg-Lys(550μg/ml)与在磷酸缓冲液(PBS)(50mM磷酸 钠，150mM氯化钠，pH7.2)中浓度为50mM的碘乙酰胺(Fluka Chemie， Brugg，瑞士)在室温下反应15分钟。这样修饰的HBcAg-Lys立即与浓 度为330μM的Sulfo-MBS(Pierce)直接在步骤1的反应混合液中在室 温下反应1小时。然后在冰上冷却反应混合液，用1000倍体积的PBS pH 7.2透析。透析的反应混合液最后与300μM FLAG肽(CGGDYKDDDDK (SEQ ID NO：147)，为了与活化的HBcAg-Lys偶联，该FLAG肽含有 一个N端游离半胱氨酸)反应，并且加样到SDS-PAGE上进行分析。
在SDS-PAGE凝胶上获得的条带模式显示有另一条清晰的条带，它 的迁移慢于交联剂衍生化、但是没有与FLAG肽反应的对照HBcAg-Lys。 不用碘乙酰胺预先封闭半胱氨酸，在相同条件下反应，HBcAg-Lys单体 完全交联形成较高分子量的分子。
实施例33
大肠杆菌1型菌毛的分离以及利用异双功能交联剂
与FLAGE肽的化学偶联
A.前言
细菌菌毛或伞毛是多种细菌产生的丝状表面细胞器。这些细胞器介 导细菌与宿主细胞表面受体的附着，是发生多种细菌感染(如膀胱炎、 肾盂肾炎、新生儿脑膜炎和腹泻)所需的。
根据受体特异性(来自不同种的血细胞的凝集)、装配途径(胞外核 化、一般分泌、伴侣蛋白/导引蛋白(usher)、备选伴侣蛋白)和形态学特 征(刚性粗菌毛；柔性细菌毛；非典型结构，包括囊；卷曲毛；等等)， 菌毛可分为不同类别。通过所谓的伴侣蛋白/导引蛋白途径装配并介导与 宿主糖蛋白的粘附、形成右手螺旋的刚性粗菌毛的例子包括1型菌毛、 P-菌毛、S-菌毛、F1C-菌毛和987P-菌毛。这类菌毛中最突出并且最具特 征的成员是P-菌毛和1型菌毛(关于粘附结构、装配和相关疾病的综述 见Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999)；Bullitt & Makowski，Biophys.J.74：623-632(1998)；Hung，D.L. & Hultgren，S.J.， J.Struct.Biol.124：201-220(1998))。
1型菌毛是大肠杆菌表面上的长丝状多聚蛋白结构。它们具有粘附 特性，能与特定宿主组织表面上存在的含甘露糖受体结合。全部大肠杆 菌分离株中的70-80％能表达1型菌毛，一个大肠杆菌细胞能携带最高达 500根菌毛。1型菌毛的长度一般达到0.2-2μM，平均数量为1000个蛋 白质亚单位，这些亚单位结合为右手螺旋，每圈3.125个亚单位，直径 6-7nm，中心孔为2.0-2.5nm。
1型菌毛的主要成分FimA占总菌毛蛋白质的98％，是一种15.8kDa 的蛋白质。次要的菌毛成分FimF、FimG和FimH在顶端以固定距离沿 菌毛轴掺入(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”，《菌毛》， Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。FimH是一种29.1kDa 的蛋白质，显示是1型菌毛的甘露糖结合粘附素(Krogfelt，K.A.等人， Infect.Immun.58：1995-1998(1990)；Klemm，P.等人，Mol.Microbiol.4： 553-560(1990)；Hanson，M.S.& Brinton，C.C.J.，Nature 17：265-268 (1988))，FimG和FimH可能有利于它的掺入(Klemm，P.& Christiansen， G.，Mol.Gen.Genetics 208：439-445(1987)；Russell，P.W.& Orndorff，P.E.， J.Bacteriol.174：5923-5935(1992))。最近表明，FimH可能也在菌毛末 端形成一种尖细的纤毛(Jones，C.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92： 2081-2085(1995))。不同成熟菌毛的主要和次要成分的顺序极其相似， 表明高度有序的装配过程(Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181： 1059-1071(1999))。
大肠杆菌的P-菌毛具有极其相似的结构，直径为6.8nm，轴孔为1.5 nm，每圈3.28个亚单位(Bullitt & Makowski，Biophys.J.74：623-632 (1998))。16.6kDa的PapA是这种菌毛的主要成分，显示与FimA有 36％的序列同一性和59％的相似性(见表1)。如1型菌毛中那样，36.0kDa P-菌毛粘附素PapG和特化的衔接蛋白只占总菌毛蛋白的极小部分。与1 型菌毛最明显的不同是粘附素不作为菌毛杆的组成部分，以及它只位于 端部菌毛中，后者通过1型菌毛没有的特化衔接蛋白与菌毛杆连接 (Hultgren，S.J.等人，Cell 73：887-901(1993))。
表1：1型菌毛和P-菌毛的几种结构菌毛蛋白之间的相似性和同一性 (百分数)。忽略粘附素。
相似性
FimA PapA FimI FimF FimG PapE PapK PapH PapF
FimA 59 57 56 44 50 44 46 46
PapA 36 49 48 41 45 49 49 47
FimI 35 31 56 46 40 47 48 48
同 FimF 34 26 30 40 47 43 49 48
一 FimG 28 28 28 26 39 39 41 45
性 PapE 25 23 18 28 22 43 47 54
PapK 24 29 25 28 22 18 49 53
PapH 22 26 22 22 23 24 23 41
PapF 18 22 22 24 28 27 26 21
1型菌毛是非常稳定的异型寡聚复合物。SDS处理和蛋白酶消化、 煮沸或添加变性剂都不能使1型菌毛分离成单个的蛋白质成分。最初发 现不同方法的组合，如在100℃和pH1.8下孵育，可以解聚并分离成分 (Eshdat，Y.等人，J.Bacteriol.148：308-314(1981)；Brinton，C.C.J.，Trans， N.Y.Acad.Sci.27：1003-1054(1965)；Hanson，A.S.等人，J.Bacteriol.，170： 3350-3358(1988)；Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛” 《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。有趣的是， 1型菌毛在机械搅拌后显示在FimH掺入位点处断裂的倾向，产生在其 顶端呈现FimH粘附素的片段。这可以解释为细菌在机械应力下将菌毛 剪短为有效长度的一种机制(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1 型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。尽 管它们特别稳定，但在50％甘油存在下，1型菌毛还是部分解开；它们 丧失螺旋结构，形成一种延长的、柔性的、2nm宽的蛋白质链(Abraham， S.N.等人，J.Bacteriol.174：5145-5148(1992))。
P-菌毛和1型菌毛由大约10kb的大肠杆菌染色体上的单基因簇编码 (Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P. 编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26；Omdorff，P.E.& Falkow，S.，J. Bacteriol.160：61-66(1984))。在1型菌毛基因簇中总共发现了9个基 因，在P-菌毛簇中发现了11个基因(Hultgren，S.J.等人，Adv.Prot.Chem. 44：99-123(1993))。这两种簇的构成非常相似。
前两个fim基因-fimB和fimE，编码参与调节菌毛表达的重组酶 (McClain，M.S.等人，J.Bacteriol.173：5308-5314(1991))。主要结构 菌毛蛋白由该簇的下一个基因fimA编码(Klemm，P.，Euro.J.Biochem. 143：395-400(1984)；Orndorff，P.E.& Falkow，S.，J.Bacteriol.160：61-66 (1984)；Orndorff，P.E.& Falkow，S.，J.Bacteriol.162：454-457(1985))。 fimI的确切作用还不清楚。曾经报告它也掺入菌毛中(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。相邻的fimC不编码成熟菌毛的结构成分，而是 编码菌毛装配必需的所谓的菌毛伴侣蛋白(Klemm，P.，Res.Microbiol. 143：831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90： 8397-8401(1993))。
成熟菌毛锚定的细菌外膜中的装配平台由fimD编码(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990))。1型菌毛的 三种次要成分——FimF、FimG和FimH，由该簇的最后三种基因编码 (Klemm，P.& Christiansen，G，Mol.Gen.Genetics 208：439-445(1987))。 除了fimB和fimE之外，所有基因都编码通过分泌途径分泌到周质中的 前体蛋白。
在伴侣蛋白/导引蛋白途径后不同菌毛之间的相似性不限于它们的 形态学特征。它们的基因也以极其相似的方式排列。编码主要结构亚单 位的基因通常位于基因簇的开始处调节元件的直接下游，其后为编码另 一种结构亚单位的基因(对于1型菌毛为fimI，对于P-菌毛为papH)。 PapH显示能够终止菌毛装配，而推断FimI也能够如此(Hultgren，S.J. 等人，Cell 73：887-901(1993))。指导菌毛形成过程的两种蛋白质，即 特化的菌毛伴侣蛋白和外膜装配平台，相邻地位于下游。在基因簇的末 端编码数量不定的次要菌毛成分，包括粘附素。形态学结构、序列(见 表1)、基因组织和调节的相似性表明这些细胞器有一种紧密的进化关系 和相似的装配过程。
产生1型菌毛的细菌显示所谓的相变异。细菌完全有菌毛或者无菌 毛。这通过含有fimA启动子的314bp基因组DNA片段的颠倒实现， 从而诱导菌毛基因的“全开”或“全关”表达(McClain，M.S.等人，J. Bacteriol.173：5308-5314(1991))。其它结构菌毛基因的表达与fimA 表达的偶联通过一种仍然未知的机制实现。然而，大量研究阐明了影响 这两种表型转换的机制。
1型菌毛基因簇的前两种基因fimB和fimE编码可识别二重对称的9 bp DNA片段的重组酶，其侧翼为可颠倒的fimA启动子。FimB切换菌 毛形成“开”，而FimE以“关”的方向打开启动子。因此fimB或fimE表 达的正调节或负调节控制所谓的“fim-开关”位置(McClain，M.S.等人，J. Bacteriol.173：5308-5314(1991)；Blomfield，I.C.等人，J.Bacteriol.173： 5298-5307(1991))。
两种调节蛋白fimB和fimE由不同的启动子转录，它们的转录受多 种不同因子的影响，包括整合宿主因子(IHF)(Blomfield，I.C.等人， Mol.Microbiol.23：705-717(1997))和亮氨酸反应性调节蛋白(LRP) (Blomfield，I.C.等人，J.Bacteriol.175：27-36(1993)；Gally，D.L.等人， J.Bacteriol.175：6186-6193(1993)；Gally，D.L.等人，Microbiol.21： 725-738(1996)；Roesch，R.L.& Blomfield，I.C.，Mol.Microbiol.27： 751-761(1998))。前者的突变使细菌锁定为“开”或“关”状态，而LRP 突变体转换的频率降低。另外也显示了leuX对菌毛生物发生的影响。该 基因位于染色体上的fim基因附近，编码UUG密码子的次要亮氨酸 tRNA(minor leucine tRNA)。fimB含有5个UUG密码子，而fimE只 含两个，leuX转录增强将更有利于FimB表达而不是FimE表达(Burghoff， R.L.等人，Infect.Immun.61：1293-1300(1993)；Newman，J.V.等人，FEMS Microbiol.Lett.122：281-287(1994)；Ritter，A.等人，Mol.Microbiol.25： 871-882(1997))。
此外，温度、培养基组成和其它环境因素也能影响FimB和FimE的 活性。最后，曾经报告了fimA启动子的自发、统计学上的转换。这种 自发转换的频率约为每一代10-3(Eisenstein，B.I.，Science 214：337-339 (1981)；Abraham，S.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 82：5724-5727 (1985))，但受上述因素的强烈影响。
基因fimI和fimC也从fimA启动子开始转录，但在fimA直接下游 鉴定了一个DNA片段，它具有形成二级结构的强烈倾向，可能是一种 部分转录终止子(Klemm，P.，Euro.J.Biochem.143：395-400(1984))； 因此推测它严重减少fimI和fimC的转录。在fimC的3’端，有另一种启 动子控制fimD转录；在fimD的3’端有一种最新知道的fim启动子，它 调节FimF、FimG和FimH的水平。因此，所有次要1型菌毛蛋白都转 录为一种mRNA(Klemm，P.& Krogfelt，K.A.，“大肠杆菌的1型菌毛”《菌 毛》，Klemm，P.编著，CRC Press Inc.，(1994)pp.9-26)。这确保mRNA 水平上的1∶1∶1化学计量，这很可能在蛋白质水平上保持。
对于P-菌毛，当测定不同P-菌毛基因的mRNA的半衰期时，我们发 现了另外的调节机制。papA的mRNA非常长寿，而papB(一种调节菌 毛蛋白)的mRNA由短寿的mRNA编码(Naurec kiene，S.& Uhlin，B.E.， Mol.Microbiol.21：55-68(1996)；Nilsson，P.等人，J.Bacteriol.178： 683-690(1996))。
对于1型菌毛，1型菌毛伴侣蛋白FimC的基因开始于GTG而不是 ATG密码子，导致翻译效率下降。最后，对fimH基因的分析显示fimH mRNA具有形成茎-环的倾向，这可能严重阻碍翻译。总之，细菌菌毛的 生物发生由作用于蛋白质生物合成所有水平的多种不同机制调节。
周质菌毛蛋白通常合成为前体，含有一个N端信号序列，它允许利 用分泌装置通过内膜转运。转运后，前体通常被信号肽酶I切割。1型 菌毛结构亚单位通常含有二硫键，它们的形成由DsbA催化并且可能由 DsbC和DsbG基因产物催化。
1型菌毛伴侣蛋白FimC缺乏半胱氨酸残基。相反，P-菌毛的伴侣蛋 白PapD是菌毛伴侣蛋白家族的唯一含有二硫键的成员，P-菌毛对DsbA 的依赖性已经确定(Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：11552-11556(1994))。PapD在ΔdsbA株的周质中不积累，表明缺 乏伴侣蛋白导致P-菌毛装配机制受阻碍(Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc. Nat.Acad.Sci.USA 91：11552-11556(1994))。这与以下发现一致：1 型菌毛在ΔdsbA株中仍然装配，但水平降低(Hultgren，S.J.等人，“细菌 粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press， (1996)pp.2730-2756)。
1型菌毛以及P-菌毛98％由分别被称为FimA和PapA的单一或主要 的结构亚单位组成。这两种蛋白质的大小均为～15.5kDa。两种菌毛基因 簇编码的其它次要成分非常相似(见表1)。除粘附素外其它亚单位的序 列和大小的相似性提示它们全都共有相同的折叠基序，只是彼此间的亲 和力不同。特别是这些蛋白质的N端和C端区非常保守，推测在菌毛内 的伴侣蛋白/亚单位相互作用以及亚单位/亚单位相互作用中起重要作用 (Soto，G.E.& Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999))。有趣 的是，在菌毛粘附素的中间能发现保守N端片段，表明粘附素有两个结 构功能域，其中由保守基序开始的C端功能域相当于结构菌毛亚单位， 而N端域负责宿主细胞受体的识别(Hultgren，S.J.等人，Proc.Nat.Acad. Sci.USA 86：4357-4361(1989)；Haslam，D.B.等人，Mol.Microbiol.14： 399-409(1994)；Soto，G.E.等人，EMBO J.17：6155-6167(1998))。不 同亚单位也显示影响菌毛的形态学特征。据报告，去除几种基因可减少 1型或P-菌毛的数量或增加它们的长度(fimH，papG，papK，fimF，fimG) (Russell，P.W.& Orndorff，P.E.，J.Bacteriol.174：5923-5935(1992)； Jacob-Dubuisson，R.等人，EMBO J.12：837-847(1993)；Soto，G.E. & Hultgren，S.J.，J.Bacteriol.181：1059-1071(1999))；基因缺失组合扩大 了这种影响，或者导致完全不能形成菌毛(Jacob-Dubuisson，R.等人， EMBO J.12：837-847(1993))。
在也是通过伴侣蛋白/导引蛋白系统装配的非菌毛粘附细胞细胞器 如Myf菌毛和CS3菌毛中，保守的C端区不同。这间接证明了这些C 端亚单位片段对于四级结构相互作用的重要性(Hultgren，S.J.等人，“细 菌粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)。
基因缺失研究证实，除去菌毛伴侣蛋白导致P-菌毛和1型菌毛完全 不能形成(Lindberg，F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058(1989)；Klemm， P.，Res.Microbiol.143：831-838(1992)；Jones，C.H.等人，Proc.Nat.Acad Sci.USA 90：8397-8401(1993))。ΔfimC株的周质提取物显示主要亚单 位FimA聚集，但无法检测到菌毛(Klemm，P.，Res.Microbiol.143： 831-838(1992))。过量表达单一P-菌毛亚单位的尝试失败，在不含PapD 时只能检测到蛋白水解的形式；另外，在不含伴侣蛋白的情况下从内膜 级分纯化了P-菌毛粘附素(Lindberg，F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058 (1989))。然而，对于FimC/FimH复合物以及不同Pap-蛋白-包括粘附 素PapG和主要亚单位PapA，结构菌毛蛋白及其伴侣蛋白的共表达使周 质中能检测到伴侣蛋白/亚单位复合物(Tewari，R.等人，J.Biol.Chem. 268：3009-3015(1993)；Lindberg.F.等人，J.Bacteriol.171：6052-6058 (1989))。也在体外研究了伴侣蛋白/亚单位复合物对其装配平台的亲和 力，发现非常不同(Dodson等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：3670-3674 (1993))。根据这些结果，提示菌毛伴侣蛋白具有下列功能。
假定它们能识别未折叠的菌毛亚单位，阻止它们凝集，提供指导形 成天然结构的“折叠模板”。
折叠亚单位在折叠后展示可允许亚单位/亚单位相互作用的表面，预 计它们受到保护而不会与其它亚单位相互作用，并保持单体、可装配的 状态。
最后，推测菌毛伴侣蛋白在外膜装配部位触发亚单位的释放，通过 以不同效率触发，影响成熟菌毛的组成和顺序(参见以下单独的部分)。
在外膜上释放亚单位后，伴侣蛋白是游离状态，以便参与另一轮底 物结合、帮助折叠、亚单位通过周质转运以及向装配部位特异输送。由 于周质缺乏能量来源，如ATP，整个菌毛装配过程必须要热力学驱动 (Jacob-Dubuisson，F.等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 91：11552-11556 (1994))。菌毛伴侣蛋白的多种不同功能涉及极精细调节的级联步骤。
然而，有几项发现不易用上述菌毛伴侣蛋白功能模型解释。一个例 子是多聚伴侣蛋白/亚单位复合物的存在(Striker，R.T.等人，J.Biol.Chem. 269：12233-12239(1994))，其中一个伴侣蛋白与亚单位二聚体或三聚 体结合。难以想象一种折叠模板能被“双重利用”。关于伴侣蛋白/亚单位 相互作用的分子细节的研究(见下文)部分支持上述功能，但也出现了 新的问题。
迄今为止，通过遗传研究或序列分析鉴定的所有31种周质伴侣蛋白 都是约25kDa的蛋白质，具有10左右的极高pI值。这些伴侣蛋白中的 10种帮助杆状菌毛的装配，4种参与细菌毛的形成，10种对于非典型细 结构(包括荚膜样结构)的生物发生非常重要，2种粘附结构迄今为止 尚未确定(Holmgren，A.等人，EMBO J.11：1617-1622(1992)；Bonci，A. 等人，J.Mol.Evolution 44：299-309(1997)；Smyth，C.J.等人，FEMS Immun.Med.Microbiol.16：127-139(1996)；Hung，D.L.& Hultgren，S.J.， J.Struct.Biol.124：201-220(1998))。这些伴侣蛋白和PapD之间的逐 对序列同一性为25-56％，表明总体折叠相同(Hung，D.L.等人，EMBO J. 15：3792-3805(1996))。
关于伴侣蛋白/底物识别的第一项研究是基于所有已知菌毛伴侣蛋 白的C端都极其相似这一发现。ELISA测定显示，对应于P-菌毛蛋白C 端的合成肽结合PapD(Kuehn，M.J.等人，Science 262：1234-1241(1993))。 最重要的是，解析了两种复合物的X-射线结构，其中PapD与对应于粘 附素PapG或次要菌毛成分PapK的C端的19个残基的肽共结晶(Kuehn， M.J.等人，Science 262：1234-1241(1993)；Soto，G.E.等人，EMBO J.17： 6155-6167(1998))。这两种肽在伸展构象中都与伴侣蛋白N端功能域 中朝向域间隙的β链结合，从而用另外一条链使β折叠延长。肽的C端羧 酸基团通过氢键锚定于Arg8和Lys112上，这两个残基在菌毛伴侣蛋白 家族中恒定。诱变研究证实了它们的重要性，因为它们与丙氨酸的交换 导致无功能菌毛伴侣蛋白在周质中的聚积(Slonim，L.N.等人，EMBO J. 11：4747-4756(1992))。PapD的晶体结构表明，Arg8或Lys112都与伴 侣蛋白的稳定无关，但是完全暴露于溶剂(Holmgren，A.& Branden，C.I.， Nature 342：248-251(1989))。据报告，在底物上的C端PapA残基的 交换阻止P-菌毛形成，对P-菌毛粘附素PapG的保守C端片段的类似实 验阻止它掺入P-菌毛中(Hultgren，S.J.等人，“细菌粘附及其装配”，《大 肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996) pp.2730-2756)。因此，所有证据都表明菌毛亚单位的识别是通过亚单位 的C端片段。
最近关于P-菌毛粘附素PapG的C端氨基酸交换的一项研究给出了 更详细的信息。在相对于C端的位点-2、-3、-6、-8处的氨基酸置换均 是耐受的，但改变了菌毛稳定性(Soto，G.E.等人，EMBO J.17：6155-6167 (1998))。
但是，当更仔细地研究这一模型时，出现了一些问题。不装配为刚 性、杆状菌毛的粘附细菌结构缺乏保守的C端片段(Hultgren，S.J.等人， “细菌粘附及其装配”，《大肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996)pp.2730-2756)，尽管它们也依赖于相关菌毛伴侣蛋白的存 在。这表明菌毛亚单位的C端片段具有不同的作用，即成熟菌毛中四级 结构相互作用的介导。而且，由于伴侣蛋白复合物中C端肽与伴侣蛋白 的结合很弱，通过NMR解析其结构的尝试严重受阻(Walse，B.等人， FEBS Lett.412：115-120(1997))；而C端片段对于伴侣蛋白识别的一 个主要贡献是相对较高的亲和作用。
如果考虑不同亚单位之间的变异性，又出现了另一个问题。虽然C 端片段保守，但是发现了多种保守置换。例如，在与PapD共结晶的两 种肽之间，19个氨基酸残基中的15个不同(Soto，G.E.等人，EMBO J.17： 6155-6167(1998))。这曾经用伴侣蛋白与底物之间的相互作用类型来解 释，主要通过主链相互作用发生，而不是通过侧链相互作用特异性发生。 而且，伴侣蛋白对某些底物的特异性不易解释。与前述相反，保守残基 已经被视为特异性的证据(Hultgren，S.J.等人，“细菌粘附及其装配”，《大 肠杆菌与沙门氏菌》，Neidhardt，F.C.编著，ASM Press，(1996) pp.2730-2756)。
外膜装配平台，在文献中也被称为“导引蛋白(usher)”，在1型和 P-菌毛中分别是由FimD或PapC的同型寡聚体形成的(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990)；Thanassi，D.G. 等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151(1998))。通过电子显微 镜术对1型菌毛延长的研究证实菌毛从底部延长(Lowe，M.A.等人，J. Bacteriol.169：157-163(1987))。与未折叠亚单位向周质间隙中的分泌 不同，完全折叠的蛋白质必须通过外膜转移，可能是以寡聚形式转移 (Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151(1998))。 这首先需要一个允许通过的足够宽的膜孔，其次需要一种热力学驱动的 转运机制(Jacob-Dubuisson，F.等人，J.Biol.Chem.269：12447-12455 (1994))。
已显示，单独的FimD表达不利于细菌生长，菌毛亚单位的共表达 能恢复细菌正常生长(Klemm，P.& Christiansen，G.，Mol.Gen.Genetics 220：334-338(1990))。据此推断，导引蛋白可能形成完全被菌毛填满 的孔。电子显微镜观察结合PapC的膜泡，证实存在一种内径为2nm的 成孔结构(Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151 (1998))。由于孔的内径太小，菌毛杆不能通过，提出在细菌表面外形 成成熟菌毛的螺旋排列。发现甘油使菌毛解散，然后形成一条约2nm 的蛋白质链，这一发现很好地符合该假说，因为在孔中可形成一条延长 的亚单位链作为第一步(Abraham，S.N.等人，J.Bacteriol.174：5145-5148 (1992)；Thanassi，D.G.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：3146-3151 (1998))。在细菌膜外形成的螺旋菌毛杆可能是使生长的菌毛通过膜转 移的驱动力。
也已经证实，1型和P-菌毛的导引蛋白形成以不同亲和力与伴侣蛋 白/亚单位复合物结合的三元复合物(Dodson，K.W.等人，Proc.Nat.Acad. Sci.USA 90：3670-3674(1993)；Saulino，E.T.等人，EMBO J.17：2177-2185 (1998))。这可解释为使菌毛蛋白在菌毛中具有确定顺序的“动力学分 配”。而且也提出，结构蛋白可能呈现一个只与另外一种菌毛蛋白相容的 结合表面；这将是在成熟菌毛中获得高度固定顺序亚单位的另一种机制 (Saulino，E.T.等人，EMBO J.17：2177-2185(1998))。
B.大肠杆菌1型菌毛的制备
将大肠杆菌W3110株涂布于LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，pH7.5，1％琼脂(w/v))平板上，在37℃下孵育过夜。 然后用单菌落接种5ml LB起始培养液(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提 取物，5g/L NaCl，pH7.5)。在有利于细菌产生1型菌毛的条件下(37℃， 不搅拌)孵育24小时后，5只含有1升LB的摇瓶各接种1ml初始培养 液。然后细菌培养液不加搅拌地在37℃下再孵育48-72小时。离心收集 细菌(5000rpm，4℃，10分钟)，得到的沉淀重悬浮于250ml 10mM Tris/HCl，pH7.5中。在普通混合器中以17000rpm搅拌5分钟从细菌上 分离菌毛。在4℃下以10000rpm离心10分钟后，收集含菌毛上清液， 添加1M MgCl2至终浓度为100mM。溶液在4℃下静置1小时，然后离 心沉淀(10000rpm，20分钟，4℃)菌毛。将沉淀重悬浮于10mM HEPES， pH7.5中，然后通过最后的离心步骤除去残余细胞碎片，澄清菌毛溶液。
C.利用m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯 (sulfo-MBS)FLAG与纯化的大肠杆菌1型菌毛的偶联
600μl 95％纯度的细菌1型菌毛溶液(2mg/ml)在室温下与异双功 能交联剂sulfo-MBS(0.5mM)孵育30分钟。随后，混合液用1升含 150mM NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析过夜，除去游离的 sulfo-MBS。然后为了防止金属催化的巯基氧化，在10mM EDTA存在 下，将500μl衍生的菌毛(2mg/ml)与0.5mM FLAG肽(含有一个氨 基端半胱氨酸)混合。未偶联的肽通过排阻层析除去。
实施例34
用于表达大肠杆菌1型菌毛的表达质粒的构建
GenBank登录号U14003(其全部公开内容在此引用作为参考)中公 开的DNA序列含有产生1型菌毛所需的所有大肠杆菌基因，从核苷酸 233947到核苷酸240543(fim基因簇)。该部分序列含有基因fimA、fimI、 fimC、fimD、fimF、fimG和fimH的序列。为了扩增这部分大肠杆菌基 因组，如下所述进行三次不同的PCR，随后克隆入pUC19(GenBank登 录号L09137和X02514)。
PCR模板如下制备：将10ml大肠杆菌W3110株的甘油贮存液与90 ml水混合，95℃煮沸混合液10分钟，然后用台式离心机以14000rpm 离心10分钟，收集上清液。
10ml上清液与如下所述的50pmol PCR引物一和50pmol PCR引物 二混合。加入5ml 10×PCR缓冲液，0.5ml Taq-DNA-聚合酶和水，加 至总共50ml。所有PCR都按照下列方案进行：94℃ 2分钟，然后94℃ 20秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟30个循环。然后通过1％琼脂糖凝胶电 泳纯化PCR产物。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸233947到核苷酸235863 的序列，其中包括fimA、fimI和fimC基因： TAGATGATTACGCCAAGCTTATAATAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGC AGCATG(SEQ ID NO：196)和 GTCAAAGGCCTTGTCGACGTTATTCCATTACGCCCGTCATTTTGG(SEQ ID NO：197)
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和SalI将扩 增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMAIC(SEQ ID NO：198)。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸235654到核苷酸238666 的序列，其中包括fimD基因： AAGATCTTAAGCTAAGCTTGAATTCTCTGACGCTGATTAACC(SEQ ID NO：199)和 ACGTAAAGCATTTCTAGACCGCGGATAGTAATCGTGCTATC(SEQ ID NO：200)。
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和XbaI将 扩增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMD(SEQ ID NO：201)。
用具有下列序列的寡核苷酸扩增从核苷酸238575到核苷酸240543 的序列，其中包括fimF、fimG和fimH基因： AATTACGTGAGCAAGCTTATGAGAAACAAACCTTTTTATC(SEQ ID NO： 202)和 GACTAAGGCCTTTCTAGATTATTGATAAACAAAAGTCACGC(SEQ ID NO：203)。
这两种寡核苷酸也含有允许通过限制性酶切位点HindIII和XbaI将 扩增产物克隆入pUC19中的侧翼序列。产生的质粒命名为pFIMFGH (SEQ ID NO：204)。
然后进行以下克隆程序，产生含有上述所有fim基因的质粒。
pFIMAIC用EcoRI和HindIII消化(2237-3982)，pFIMD用EcoRI 和SstII消化(2267-5276)，pFIMFGH用SstII和HindIII消化(2327-2231)。 然后将片段连接，产生的含有菌毛形成所需全部fim基因的质粒命名为 pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)。
实施例35
用于表达缺少粘附FimH的大肠杆菌
1型菌毛的表达质粒的构建
将质粒pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)用KpnI消化，之后经 0.7％琼脂糖凝胶电泳分离由核苷酸8895-8509组成的片段，并通过自身 连接环化。产生的质粒命名为pFIMAICDFG(SEQ ID NO：206)，它缺 少fimH基因，可用来产生不含FIMH的1型菌毛。
实施例36
利用质粒pFIMAICDFGH表达1型菌毛
大肠杆菌W3110株用pFIMAICDFGH(SEQ ID NO：205)转化， 涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，pH7.5，1％琼脂(w/v))平板上，在37℃下孵育过夜。 然后用单菌落接种50ml LB-葡萄糖起始培养液(10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，1％(w/v)葡萄糖，5g/L NaCl，pH7.5，100mg/ml氨苄 青霉素)。在37℃下以150rpm孵育12-16小时后，含有2升LB-葡萄糖 的5升摇瓶接种20ml起始培养液。细菌培养液然后在37℃搅拌下(150 rpm)再孵育24小时。离心收集细菌(5000rpm，4℃，10分钟)，得到的 沉淀重悬浮于250ml 10mM Tris/HCl，pH8中。在普通混合器中以17000 rpm搅拌5分钟从细菌上分离菌毛。在4℃下以10000 rpm离心10分钟 后，收集含菌毛上清液，添加1M MgCl2至终浓度为100mM。溶液在4℃ 下静置1小时，然后离心沉淀(10000rpm，20分钟，4℃)沉淀出的菌 毛。将沉淀重悬浮于10mM HEPES，30mM EDTA，pH7.5中，室温下30 分钟，然后通过最后的离心步骤除去残余细胞碎片，澄清菌毛溶液。所 得制品然后用20mM HEPES，pH7.4透析。
实施例37
IgE表位和模拟位与大肠杆菌1型菌毛的偶联
将66μl等份100μM异双功能交联剂sulfa-MBS溶液加到400μl 95％纯度的细菌1型菌毛溶液(2.5mg/ml，20mM HEPES，ph7.4)中， 随后在搅拌下室温孵育45分钟。之后，利用PD-10柱通过大小排阻层 析除去过量的sulfa-MBS。此外，也可以通过透析除去交联剂。向1ml 等份衍生菌毛(1-1.25mg/ml，20mM HEPES pH7.4)中加入1.3μl含1.1 mg/ml肽Ce3epi(CGGVNLTWSRA SG(SEQ ID NO：207))或肽Ce3Mim (CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO：208))的溶液。样品在室温下孵 育4小时，用2L含20mM HEPES的缓冲液(pH7.4)透析2次除去未 偶联的肽。此外也可以通过大小排阻层析除去未偶联的肽。
实施例38
用与Qβ衣壳蛋白偶联的蜂毒磷酯酶A2
(PLA2)融合蛋白免疫小鼠
A.制备用于细胞质表达PLA2基因催化失活变体的替代载体，该变 体与氨基酸序列AAASGGCGG(SEQ ID NO：209)融合
利用寡核苷酸ecori_Ndel_pla(序列见下)和PLA-Cys-hind(实施例 29)由pAV3PLAfos通过PCR扩增实施例9的PLA2基因构建体。对于 PCR反应，在50μl含1.2单位Pfx DNA聚合酶(Gibco)、1mM MgSO4和200μM dNTPs和10倍稀释的Pfx增强溶液(Gibco)的反应混合液 中使用各100pmol引物和约1μg PAV3PLAfos DNA。反应的温度循环如 下进行：94℃ 2分钟，92℃(0.5分钟)、58℃(0.5分钟)、68℃(1分 钟)5个循环；92℃(0.5分钟)、63℃(0.5分钟)、68℃(1分钟)25 个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，随后用Qiagen Qiaquick 试剂盒分离该片段，用酶NdeI和HindIII消化，克隆入用相同酶消化的 PET11a载体(Novagen)。
寡核苷酸：ecori_Ndel_pla TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAACATATGGCTATCATCTACC(SEQ ID NO：214)
该载体编码具有下列氨基酸序列的融合蛋白： MAIIYPGTLWCGHGNKSSGPNELGRFKHTDACCRTQDMCPDVMSAG ESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTK CYKLEHPVTGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKYAAASGGCG G(SEQ ID NO：210)
PLA2融合蛋白与Qβ衣壳蛋白的偶联
600μl Qβ衣壳蛋白溶液(2mg/ml溶于20mM Hepes，pH7.4)与 176μl Sulfo-MBS(13mg/ml水溶液)在室温下反应60分钟，在4℃下 用1L 20mM Hepes pH7.4 O/N透析。次日，将500μl含0.1mM DTT 的PLA2溶液(2.5mg/ml)过5ml Hi-Trap柱(Pharmacia)脱盐。还原 并脱盐的PLA2(60μl约0.5mg/ml溶液)与活化并透析的Qβ衣壳(25 μl 1.5mg/ml溶液)混合，在室温下反应4小时。
在与PLA2偶联之前和之后采集的Qβ衣壳蛋白的电子显微镜图像 上，直径25-30nm的衣壳清晰可见。
C.用与Qβ衣壳蛋白偶联的PLA2免疫小鼠
雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg与PLA2偶联的Qβ衣壳蛋白静脉 内免疫，在第14天用相同量的抗原加强。在第20天从小鼠取血，用ELISA 分析血清。获得1∶5000的抗PLA2滴度。
实施例39
IgE模拟位和表位与Qβ衣壳蛋白的偶联
利用N端半胱氨酸残基将具有下列氨基酸序列的人IgE表位与Qβ 衣壳蛋白偶联：
Ce3表位：CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO：207)
Ce3模拟位：CGGVNLPWSFGLE(SEQ ID NO：208)
用Sulfo-MBS活化的Qβ衣壳蛋白进行偶联反应，随后透析除去过 量的交联剂。将表位或模拟位分别稀释到含活化Qβ衣壳的反应混合液 中，在室温下反应4小时。最后反应混合液用PBS透析4小时，注射给 小鼠。
下列环状模拟位也与Qβ衣壳蛋白偶联：
Ce4模拟位：GEFCINHRGYWVCGDPA(SEQ ID NO：211)。
为了向模拟位中引入一个受保护的巯基，模拟位首先与化学基团N- 琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸(SATA)反应。然后用羟胺处理以除去保 护基团，立即与活化的Qβ衣壳蛋白在室温下反应4小时。最后将反应 混合液透析4小时，注射给小鼠。
实施例40
用与M2肽偶联的HBcAg-Lys免疫小鼠
A.M2肽与HBcAg-Lys衣壳蛋白的偶联
为了引发抗M2肽的免疫应答，在C端含有一个半胱氨酸残基、对 应于流感M2蛋白N端片段的合成M2肽 (SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC(SEQ ID NO：212))与纯化 的HBcAg-Lys颗粒化学偶联。Sulfo-MBS(232μl，3mM)与1.4ml HBcAg-Lys在PBS中的溶液(1.6mg/ml)反应。混合液用磷酸缓冲液 (PBS)透析过夜。M2肽用DMSO稀释为24mg/ml的浓度；5μl该溶 液用300μl PBS稀释，取188μl加入312μl透析并活化的HBcAg-Lys 溶液中。向反应混合液中加入EDTA(10μl 1M溶液)，反应在室温下继 续4小时。
用与M2肽偶联的HBcAg-Lys免疫小鼠
雌性Balb/c小鼠在第0天用50μg HBcAg-Lys-M2或单独的M2肽静 脉内免疫，10天后用相同量的抗原加强。再过10天，给小鼠鼻内感染 流感病毒(50pfu，PR/8)，监测感染小鼠的存活。另外，也测定肺中的 病毒滴度。用M2-HBcAg-Lys肽预处理的小鼠完全受到保护，至第7天 病毒被清除。
实施例41 M2肽与菌毛、Qβ和无半胱氨酸的HBcAg衣壳蛋白的偶联，用这些偶 联的菌毛和衣壳免疫小鼠获得的抗体效价与用M2肽与HBcAg1-183的
N端融合蛋白免疫小鼠获得的效价进行比较
A.M2肽与菌毛、Qβ和无半胱氨酸的HBcAg-衣壳蛋白的偶联
Qβ：将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液1ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室 温反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析过夜。然后透析的反应混合物与25mM M2肽(SEQ ID NO：212) 在DMSO中的贮存液58.8μl在摇床上室温反应4小时。反应混合液随 后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过夜。
无半胱氨酸的HBcAg：将0.8mg/ml无半胱氨酸的HBcAg衣壳蛋 白(实施例31)在PBS pH7.2中的溶液1.25ml与93μl 13nmg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应30分钟。反应溶液随后 用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过夜。透析的反应混合物 与25mM M2肽(SEQ ID NO：212)在DMSO中的贮存液58.8μl在摇 床上室温反应4小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析过夜。
菌毛：将2.5mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液400μl 与60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应45分钟。 反应溶液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐，从柱上洗脱 的500μl蛋白质的第二级分(约含1g蛋白质)与25mM M2肽(SEQ ID NO：212)在DMSO中的贮存液58.8μl在摇床上室温反应4小时。反 应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析过 夜。
M2肽与HBcAg1-183的基因融合
M2与Hbc基因融合：如Neirynck等人，Nature Medicine 5：1157 (1999)所述，在Hbc的N端克隆M2。MD-HBc在大肠杆菌中表达， 通过凝胶层析纯化。通过Edman测序证实在M2-HBc的N端含有M2 肽。
小鼠的免疫：
对雌性Balb/c小鼠接种不加佐剂的与菌毛、Qβ和无半胱氨酸HbcAg 蛋白偶联的M2肽和与Hbc免疫原基因融合的M2肽。在第0天和第14 天腹膜内注射35μg每种样品蛋白质。将小鼠在第27天放血，用M2肽 特异的ELISA分析血清。
ELISA
ELISA板用10μg/ml与RNAse偶联的M2肽包被。封闭平板，然 后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体 检测。也检测免疫前的血清作为对照。用与Hbc或其它载体交联的无关 肽免疫小鼠，对其血清进行的对照ELISA实验显示，检测到的抗体是 M2肽特异的。结果显示在图27A和B中。
实施例42
血管紧张肽I和血管紧张肽II与Qβ的偶联，
以及用Qβ-血管紧张肽疫苗免疫小鼠
A.血管紧张肽I和血管紧张肽II与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，如下所述与Qβ化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液5ml与507μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 透析两次各2小时。665ml透析的反应混合物与2.8ml各种相应的100 mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液 随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小 时。
小鼠的免疫：
雌性Balb/c小鼠不加佐剂接种与Qβ衣壳蛋白偶联的4种血管紧张 肽之一。每种样品50μg总蛋白质用PBS稀释为200ml，在第0天和第 14天皮下注射(腹部两侧100ml)。对小鼠在第21天放血，其血清用血 管紧张肽特异的ELISA分析。
ELISA
利用化学交联剂sulfo-SPDP将所有4种血管紧张肽分别与牛RNAse A偶联。ELISA板用浓度为10mg/ml的偶联RNAse制剂包被。封闭平 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。也检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。用与Qβ或其它载 体交联的无关肽免疫小鼠，对其血清进行的对照ELISA实验显示，检测 到的抗体是各自肽特异的。结果显示在图8A-8D中。
图8A、8B、8C、8D分别显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio I-IV 免疫的小鼠血清中“Angio I”、“Angio II”、“Angio III”和“Angio IV”特异 性IgG抗体的ELISA分析。图中所用的Qβ-Angio I、Q β3-Angio II、Q β-Angio III和Qβ-Angio IV代表给小鼠注射的疫苗，根据上述血管紧 张肽的定义从这些小鼠获得血清。
在第0天、第14天，用溶于PBS的50mg疫苗皮下免疫雌性Balb/c 小鼠。第21天测定接种Qβ-Angio I、Qβ-Angio II、Qβ-Angio III和 Qβ-Angio IV的小鼠血清中抗所有4种肽(与RNAse A偶联的)，即 “Angio I”(图8A)、“Angio II”(图8B)、“Angio III”(图8C)和“Angio IV”(图8D)的IgG抗体。也分析同一小鼠的免疫前血清作为对照。指 定的血清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。3只小鼠的平均值(包 括标准差)均被显示。接种的所有小鼠都产生针对检测的所有4种肽的 高IgG抗体效价。在对照(免疫前小鼠)中未检测到血管紧张肽特异的 抗体。
实施例43 血管紧张肽I和血管紧张肽II与HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即无半胱氨
酸的HBcAg)的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Angio III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut(即无 半胱氨酸的HBcAg)化学偶联。
将0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白(参见实施例31) 在PBS pH7.4中的溶液1.25ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce) 水溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析过夜。更换缓冲液后，对反应溶液再透析2小 时。透析的反应混合物与1.8μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)在25 ℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析过夜，更换缓冲液，再透析2小时。
实施例44
血管紧张肽I和血管紧张肽II与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成下列血管紧张肽：CGGDRVYIHPF(“Angio I”)、 CGGDRVYIHPFHL(“Angio II”)、DRVYIHPFHLGGC(“Anguo III”)、 CDRVYIHPFHL(“Angio IV”)，用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶联。
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液与 60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液400μl在摇床上室温反应60 分钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合 并从柱上洗脱下来的含蛋白质的级分(约含1mg蛋白质，即衍生的菌 毛)，与3倍摩尔过量的肽反应。例如，向约含1mg衍生菌毛的500μl 洗脱液中添加2.34μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)。混合液在25℃ 摇床上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析过夜。
实施例45
Der p I肽与Qβ的偶联以及用Qβ-Der p I疫苗免疫小鼠
Der p I肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成下列来自居室尘埃的螨变应原Der p I的肽： CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(“Der p I p52”；氨基酸55-72，在N 端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头)、CQIYPPNANKIREALAQTHSA (“Der p I p 117”；氨基酸117-137)。这些肽如下所述与Qβ化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析两次各2小时。440μl透析的反应混合物与1.9μl 100mM肽 贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4 ℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
小鼠的免疫：
对雌性Balb/c小鼠接种不加佐剂的与Qβ衣壳蛋白偶联的2种Der p I肽之一。每种疫苗用两只小鼠。每种样品30μg总蛋白质用PBS稀释 为200μl，在第0天和第14天皮下注射。对小鼠在第21天眼眶后放血， 其血清用Der p I肽特异的ELISA分析。
ELISA
利用化学交联剂sulfo-SPDP将Der p I肽“Der p I p52”和“Der p I p117”分别与牛RNAse A偶联。ELISA板用浓度为10mg/ml的偶联 RNAse制剂包被。封闭平板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的 抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也检测同一小鼠的免疫前血清作 为对照。用与Qβ或其它载体交联的无关肽免疫小鼠，对其血清进行的 对照ELISA实验显示，检测到的抗体是各自肽特异的。结果显示在图 9A和9B中。
图9A和图9B显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的Der p I肽免疫的小鼠血 清中“Der p I p52”特异性(图9A)和“Der p I p117”(图9B)特异性IgG 抗体的ELISA分析。图9A和图9B中使用的“p52”和“p117”代表给分离 血清的小鼠注射的疫苗。
分析同一小鼠的免疫前血清(第0天)作为对照。指定血清稀释度 的结果显示为450nm下的光密度。第21天，接种的所有小鼠都产生所 接种的Der p I肽特异性的IgG抗体，但是没有另一个Der p I肽特异性 的抗体。在接种前(第0天)未检测到Der p I肽特异的抗体。
这两种Der p I肽疫苗在不含佐剂时都具有高度免疫原性。接种的所 有小鼠都对疫苗制剂中的肽产生良好的特异性抗体应答。
实施例46
Der p I肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut
(即无半胱氨酸的HBcAg)的偶联
化学合成下列来自居室灰尘的螨变应原Der p I的肽：Der p I p52(氨 基酸55-72，在N端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(氨基酸117-137)： CQIYPPNANKIREALAQTHSA。这些肽用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut (即无半胱氨酸的HBcAG)化学偶联。
将0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白(实施例31)在PBS pH7.4中的溶液1.25ml与93μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在 25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜。更换缓冲液后反应溶液再透析2小时。透析的反 应混合物与1.8μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应 2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4透析过夜，更换缓冲液，再透析2小时。
实施例47
Der p I肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成下列来自居室尘埃螨变应原Der p I的肽：Der p I p52(氨 基酸55-72，在N端另外含有一个半胱氨酸-甘氨酸接头) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(氨基酸117-137)： CQIYPPNANKIREALAQTHSA。这些肽用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶 联。
将2.5mg/ml大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes pH7.4中的溶液400 μl与60μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应60分 钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并 从柱上洗脱下来的含蛋白质的级分(约含1mg蛋白质，即衍生的菌毛)， 与3倍摩尔过量的肽反应。例如，向500μl约含1mg衍生菌毛的洗脱 液中添加2.34μl 100mM肽贮存液(溶于DMSO)。混合液在25℃摇床 上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 透析过夜。
实施例48 人VEGFR-II肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联以及用包含大肠杆菌1型菌
毛-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与大肠杆菌1型菌毛的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR II肽，用来与大肠杆菌1型菌毛化学偶联。
将1mg/ml菌毛蛋白在20mM Hepes pH7.4中的溶液1400μl与85 μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应60分钟。反应 混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗 脱下来的含蛋白质的级分(约含1.4mg蛋白质)，与2.5倍摩尔过量(终 体积)的人VEGFR-II肽反应。例如，向200μl约含0.2mg衍生菌毛的 洗脱液中添加2.4μl 10mM肽溶液(溶于DMSO)。混合液在25℃摇床 上孵育4小时，随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析过夜。
小鼠的免疫：
对雌性C3H-HeJ(缺乏Toll样受体4，LPS非应答小鼠)和C3H-HeN (野生型)小鼠接种不加佐剂的与1型菌毛蛋白偶联的人VEGFR-II肽。 每种样品约100μg总蛋白质用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮 下注射。将小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特异的 ELISA分析。
ELISA
用固定化的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II胞外域(R&D Systems GmbH，Wiesbaden)以ELISA检测免疫小鼠的血清。
利用化学交联剂sulfo-SPDP将人VEGFR-II肽与牛RNAse A偶联。 ELISA板用浓度为10μg/ml的偶联RNAse A包被。人VEGFR-II胞外域 以2μg/ml的浓度吸附到平板上。封闭平板，然后与连续稀释的小鼠血 清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测。也检测同一小鼠 的免疫前血清作为对照。用未偶联的载体免疫小鼠，对其血清进行对照 ELISA实验显示，检测到的抗体是各自肽特异的。与1型菌毛偶联的人 VEGFR-II肽的结果显示在图10中。具体而言，图10A和图10B分别显 示用与1型菌毛蛋白偶联的人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域免 疫的小鼠血清中人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域特异的IgG抗 体的ELISA分析。
对雌性C3H-HeJ(Toll样受体4缺乏，LPS非应答)和C3H-HeN(野 生型)小鼠在第0、14、28天皮下接种溶于PBS的100μg疫苗。在第 42天测定抗人VEGFR-II肽(与RNAse A偶联的)和人VEGFR-II肽胞 外域的血清IgG抗体。也分析同一小鼠的免疫前血清作为对照。指定血 清稀释度的结果显示为450nm下的光密度。3只小鼠的平均值均被显示 (包括标准差)。接种的所有小鼠都产生抗人VEGFR-II肽和人VEGFR-II 肽胞外域(KDR)的高IgG抗体效价，在缺乏Toll样受体4的小鼠与野 生型小鼠之间未观察到差异。这一点是值得注意的，因为已经证实，抗 人VEGFR-II肽和人VEGFR-II肽胞外域的高IgG抗体效价的形成与内 毒素污染无关。
实施例49
人VEGFR-II肽与Qβ衣壳蛋白的偶联以及用
包含Qβ衣壳蛋白-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR-II肽，用来与Qβ衣壳蛋白化学偶联。
将1mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与20μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上室温反应 45分钟。反应溶液随后在4℃下对2L 20mM Hepes pH7.4透析两次各2 小时。1000μl透析的反应混合物与12μl 10mM人VEGFR-II肽溶液(溶 于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃下对2L 20 mM Hepes pH7.4透析2次各2小时。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1ml与102μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上 反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.4透析两次各2小时。440μl透析的反应混合物与1.9μl 100mM肽 贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4 ℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
小鼠的免疫：
对C57BL/6小鼠接种不加佐剂的与Qβ蛋白偶联的人VEGFR-II肽。 每种样品约50μg总蛋白质用PBS稀释为200μl，在第0、14、28天皮 下注射。将小鼠在第14、28、42天眼眶后放血，用人VEGFR-II特异的 ELISA分析。
实施例50
人VEGFR-II肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白 (即无半胱氨酸的HBcAg)的偶联，以及用包含HBcAg-149-lys-2cys-Mut
衣壳蛋白-人VEGFR-II肽阵列的疫苗免疫小鼠
人VEGFR-II肽与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白的偶联
化学合成具有序列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK的人 VEGFR-II肽，用来与HBcAg-149-lys-2cys-Mut衣壳蛋白化学偶联。
将0.9mg/ml无半胱氨酸的HbcAg衣壳蛋白(参见实施例31)在PBS pH7.4中的溶液3ml与37.5μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇 床上室温反应45分钟。反应溶液随后用2L 20mM Hepes pH7.4透析过 夜。更换缓冲液后反应溶液再透析2小时。透析的反应混合物与3μl 10 mM人VEGFR-II肽溶液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反 应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.4透析过夜，更换缓冲 液，再透析2小时。
实施例51
HBcAg1-183Lys的构建
对肝炎核心抗原(HBcAg)1-183如实施例23所述修饰。将c/e1表 位(氨基酸残基72-88)区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)基因工程 置换为肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAgl-183Lys构建体)。引入的赖氨 酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，能用于HBcAg颗粒与含有游 离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。PCR方法基本如实施例 1所述，用常规克隆技术制备HBcAgl-183Lys基因。
如实施例23所述，通过由pEco63扩增HBcAg基因的两个不同片 段，插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列，然后通过PCR融合这两个片段， 装配为全长基因。使用下列PCR引物组合：
片段1：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(见实施例23)
引物2：Lys-HBcAg(as)(见实施例23)
片段2：
引物3：Lys-HBcAg(s)(见实施例23)
引物4：HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
装配：
引物1：EcoRIHBcAg(s)(见实施例23)
引物2：HBcAgwtHindIII
装配的全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消 化，克隆入在相同限制性酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)。
实施例52
muTNFα肽与HBcAg1-183Lys的偶联，以及用包含
HBcAg1-183Lys-muTNFα肽阵列的疫苗免疫小鼠
A.muTNFα肽与HBcAg1-183Lys的偶联
浓度为0.6mg/ml(29μM)的HBcAg1-183Lys如实施例32所述用 碘乙酰胺处理。HBcAg1-183Lys然后如实施例32所述与5倍过量的交 联剂Sulfo-MBS反应，并在4℃下用20mM Hepes pH7.2透析过夜。活 化(衍生)的HBcAg1-183Lys与5倍摩尔过量的肽muTNFα(序列 CGGVEEQLEWLSQR，直接稀释到DMSO中的100mM HBcAg1-183Lys贮存液溶液中)室温下反应4小时。偶联反应液(约1 ml溶液)在4℃下用2L 20mM Hepes pH7.2透析2次各4小时。透析 的偶联反应液等量分装液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
免疫：
对两只小鼠(雌性Balb/c)在第0天和第14天不加佐剂静脉内免疫， 每只动物100μg与muTNFα肽偶联的HBcAg1-183Lys。在第21天通过 ELISA测定血清中muTNFα肽(作为核糖核酸酶A配合物包被)和天 然TNFα蛋白(Sigma)特异的抗体。
ELISA
鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的浓度包被。检测同一小鼠的免 疫前血清作为对照。图14显示ELISA实验的结果，证实用与muTNFα 肽偶联的HBcAg1-183Lys(全长HBc-TNF)免疫产生鼠TNFα蛋白特异 的免疫应答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3种不 同稀释度检测。每个条图是两只小鼠血清信号的平均值。因为muTNFα 肽的氨基酸序列来源于小鼠TNFα蛋白的序列，因此，接种与muTNFα 肽偶联的HBcAg1-183Lys诱导了针对自身抗原的免疫应答。
实施例53
3’TNFII肽与2cysLys-mut HBcAg1-149的偶联，以及
用包含2cysLys-mut HBcAg1-149-3’TNF II肽阵列的疫苗免疫小鼠
3’TNF II肽与2cysLys-mut HBcAg1-149的偶联
浓度为2mg/ml的2cysLys-mut HBcAg1-149与50倍过量的交联剂 在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中在室温下反应30分钟。通过透 析过夜除去过量的交联剂，活化(衍生)的2cysLys-mut HBcAg1-149衣 壳蛋白与10倍过量的3’TNF II肽(SEQ： SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC，由溶于DMSO的100mM贮存液稀 释)在室温下反应4小时。反应混合液然后在分子量排阻值为50000Da 的透析管中透析过夜，液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
小鼠的免疫：
对3只8周龄雌性C3H/HeN小鼠接种不加佐剂的与2cysLys-mut HBcAg1-149偶联的3’TNF II肽。50μg总蛋白质用PBS稀释为200μl， 在第0天和第14天皮下注射(腹部两侧100μl)。将小鼠在第0天和 第21天眼眶后放血，其血清用鼠TNFα蛋白特异的ELISA分析。
ELISA
鼠TNFα蛋白(Sigma)以2μg/ml的浓度包被。检测同一小鼠的免 疫前血清作为对照。图15显示ELISA实验的结果，证实用与3’TNF II 肽偶联的2cysLys-mut HBcAg1-149免疫产生鼠TNFα蛋白特异的免疫应 答。在第0天(免疫前)和第21天采集的小鼠血清以3种不同稀释度 检测。每个条图是3只小鼠血清信号的平均值。因为3’TNF II肽的氨基 酸序列来源于鼠TNFα蛋白的序列，因此，接种与3’TNF II肽偶联的 2cysLys-mut HBcAg1-149诱导了自身抗原特异的免疫应答。
实施例54
Aβ1-15、Aβ1-27和Aβ33-42肽与Qβ的偶联，以及用包含
Qβ-Aβ肽阵列的疫苗免疫小鼠
A.利用交联剂SMPH偶联Aβ1-15和Aβ33-42肽与Qβ衣壳蛋白
化学合成下列Aβ肽：DAEFRHDSGYEVHHQGGC(简称为“Aβ 1-15”)，该肽包含人Aβ1-15残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣壳蛋白偶 联，在其C端与序列GGC融合；和CGHGNKSGLMVGGVVIA(简称 为“Aβ33-42”)，该肽包含人Aβ33-42残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣 壳蛋白偶联，在其N端与序列CGHGNKS融合。这两种肽都如下所述 与Qβ衣壳蛋白化学偶联。
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.5ml与16.6μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。450μl含有活 化(衍生)的Qβ的透析反应混合液与6.5μl 50mM每种相应的肽贮存 液(溶于DMSO)在15℃摇床上反应2小时。200μl反应混合液随后用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜，次日清晨更换缓冲液 继续2小时。反应混合液然后等量分装液氮冻结，贮存于-80℃，直到用 于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13A和图13B中。 箭头所指为对应于一个Qβ亚单位偶联两个肽的带(图13A)或一个Qβ 亚单位偶联一个肽的带(图13B)。标准蛋白质的分子量示于图13A和 图13B的左侧空白处。
加载到图13A的凝胶上的样品如下：
1：衍生的Qβ；2：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集 并离心的样品的上清液；3：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时 采集并离心的样品的沉淀；4：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在4℃下静置24 小时、未透析但是离心的样品的上清液；5：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在 4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀；6：与“Aβ1-15”偶 联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清液。
加载到图13B的凝胶上的样品如下：
1：衍生的Qβ；2：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集 并离心的样品的上清液；3：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在偶联反应结束 时采集并离心的样品的沉淀；4：与“Aβ33-42”偶联的Qβ，在4℃下静置 24小时、未透析但是离心的样品的上清液；5：与“Aβ33-42”偶联的Qβ， 在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀；6：与“Aβ33-42” 偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清液。
B.利用交联剂SMPH偶联“Aβ1-27”肽与Qβ衣壳蛋白
化学合成下列Aβ肽(“Aβ1-27”)： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC。该肽包含人Aβ1-27 残基的氨基酸序列，为了与Qβ衣壳蛋白偶联，在其C端与序列GGC 融合。
第一批与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”，在下文简称为“Qβ-Aβ1-27 第1批”，如下制备：
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.5ml与16.6μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中 用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。450μl透 析的反应混合液然后与6.5μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15℃摇 床上反应2小时。200μl样品等量分装，液氮冻结，贮存于-80℃，直到 用于免疫小鼠。
第二批与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-27”，在下文简称为“Qβ-Aβ1-27 第2批”，如下制备：
将Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液500 μl与11.3μl 32.5mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30分钟。 反应溶液随后在4℃下在分子量排阻值为3500Da的透析管(SnakeSkin， Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。 透析的反应混合液然后与3.6μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15 ℃摇床上反应2小时。反应混合液用1L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4透析1小时，在最后一次更换缓冲液后，用50000Da排阻值的透析 膜(Spectrpor，Spectrum)透析过夜。然后反应混合液等量分装液氮冻结， 贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。“Qβ-Aβ1-27第1批”用于第一次免疫， 而“Qβ-Aβ1-27第2批”用于加强。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13C中。箭头所指 为对应于一个Qβ亚单位偶联一个肽的带。
加载到图13C的凝胶上的样品如下：
M：蛋白质标准。1：Qβ衣壳蛋白。2：衍生的Qβ，在衍生反应结 束时采集并离心的样品的上清液。3：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采 集并离心的样品的沉淀。4：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应结束时 采集并离心的样品的上清液。5：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应结 束时采集并离心的样品的沉淀。6：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶联反应 液透析后采集并离心的样品的上清液。7：与“Aβ1-27”偶联的Qβ，在偶 联反应液透析后采集并离心的样品的沉淀。
C.利用交联剂Sulfo-GMBS偶联“Aβ1-15”肽与Qβ衣壳蛋白
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液500μl与5.5μl 65mM SMPH(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应 30分钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为10000Da的透析管中用2 L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。然后500μl透 析的反应混合液与6.5μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15℃摇床上 反应2小时。200μl反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析过夜，次日清晨更换缓冲液继续透析2小时。然后反应 混合液等量分装并液氮冻结，贮存于-80℃，直到用于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13D中。箭头所指 为分别对应于与一个Qβ亚单位偶联一个、两个和三个肽的带。
加载到图13D的凝胶上的样品如下：
M：蛋白质标准。1：衍生的Qβ。2：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶 联反应结束时采集并离心的样品的上清液。3：与“Aβ1-15”偶联的Qβ， 在偶联反应结束时采集并离心的样品的沉淀。4：与“Aβ1-15”偶联的Qβ， 在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的上清液。5：与“Aβ1-15” 偶联的Qβ，在4℃下静置24小时、未透析但是离心的样品的沉淀。6： 与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心的样品的上清 液。
D.利用交联剂Sulfo-MBS偶联“Aβ1-15”与Qβ衣壳蛋白
500μl Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的溶液 与14.7μl 100mM Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在25℃摇床上反应30分 钟。反应溶液在4℃下在分子量排阻值为3500Da的透析管(SnakeSkin， Pierce)中用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。 透析的反应混合液然后与7.2μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在15 ℃摇床上反应2小时。然后反应混合液用50000Da排阻值的透析膜 (Spectrpor，spectrum)用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析3 次4小时。反应混合液然后等量分装并液氮冻结，贮存于-80℃，直到用 于免疫小鼠。
偶联实验的结果通过SDS-PAGE分析，显示在图13E中。箭头所指 为对应于与一个Qβ亚单位偶联一个肽的带。
加载到图13E的凝胶上的样品如下：
1：Qβ衣壳蛋白。2：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采集并离心的 样品的上清液。3：衍生的Qβ，在衍生反应结束时采集并离心的样品的 沉淀。4：衍生的Qβ，在衍生反应液透析结束时采集并离心的样品的上 清液。5：衍生的Qβ，在衍生反应液透析结束时采集并离心的样品的沉 淀。6：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集并离心的样品的 上清液。7：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应结束时采集并离心的样 品的沉淀。8：与“Aβ1-15”偶联的Qβ，在偶联反应液透析后采集并离心 的样品的上清液。
E.小鼠的免疫
对5组8周龄雌性C57BL/6小鼠，每组3只，接种不加佐剂的5种 Aβ肽-Qβ衣壳蛋白偶联物之一。每种样品25μg总蛋白质用PBS稀释 为200μl，在第0天和第14天皮下注射。将小鼠在第0天(免疫前)和 第21天眼眶后放血，其血清用ELISA分析。利用3种不同的交联剂使 “Aβ1-15”肽与Qβ偶联，产生3种不同的疫苗制剂(“Qβ-Aβ1-15 SMPH”、 “Qβ-Aβ1-15 SMBS”、“Qβ-Aβ1-15 SGMBS”，结果参见ELISA部分)。
F.ELISA
如下所述，利用化学交联剂SPDP将所有3种Aβ肽分别与牛RNAse A偶联：10mg RNAse在2mL PBS(50mM磷酸缓冲液，150mM NaCl， pH7.2)中的溶液与100μl 20mM SPDP在DMSO中的溶液在25℃摇床 上反应60分钟。利用PD10柱(Pharmacia)通过凝胶过滤将活化(衍 生)的RNAse与过量的交联剂分离。合并含蛋白质的级分，用离心滤器 (5000MWCO)浓缩为2ml体积。333μl衍生的RNAse A溶液与2μl 肽贮存液(50mM溶于DMSO)反应。用分光光度法检测偶联反应。
ELISA板用浓度为10μg/ml的与肽偶联的RNAse A包被。封闭平 板，然后与连续稀释的小鼠血清孵育。结合的抗体用酶标记的抗小鼠IgG 抗体检测。免疫前血清或使用与Qβ偶联的无关肽免疫的小鼠的对照血 清显示，检测到的抗体是各自肽特异的。图14A、图14B和图14C分别 显示用与Qβ衣壳蛋白偶联的“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”分别免 疫的小鼠血清中，“Aβ1-15”、“Aβ1-27”和“Aβ33-42”特异的IgG抗体的 ELISA分析。横坐标的单位代表给采集血清的小鼠注射的疫苗，描述用 来制备各疫苗的肽和交联剂。所有血清都用与RNAse A偶联的三种肽测 定，结果表明，抗肽1-15与抗1-27抗体之间有交叉反应性，而抗33-42 抗体没有观察到这种交叉反应性，证明了免疫应答的特异性。同样，获 得的ELISA滴度(表示为产生高于背景3个标准差的ELISA信号的血 清稀释度)极高，为60000-600000。在对照(免疫前小鼠)中未检测到 Aβ肽特异的抗体。
实施例55
含半胱氨酸接头的引入，抗独特型IgE mimobody的
表达与纯化，以及与Qβ衣壳蛋白的偶联
A.mimobody表达质粒的构建，用于与Qβ衣壳蛋白偶联
所述质粒基于表达质粒VAE051-pASK116。该质粒含有mimobody 的重链和轻链的编码区。为了在重链C端引入含半胱氨酸的接头，使用 下列引物：
引物CA2F： CGGCTCGAGCATCACCATCACCATCACGGTGAAGTTAAACTGCAGCTGG AGTCG
引物CA1R： CATGCCATGGTTAACCACAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTC AAC
引物CB1R： CATGCCATGGTTAACCACACGGCGGAGAGGTGTGGGTTTTATCACAAGA TTTGGGCTCAAC
引物CC1R： CCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGGCTAGCACAAGATTTG GGCTCAACTC
引物CC1F： CGCCGGGTTCTTCTGGTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAACCATGGAG AAAATAAAGTG
引物CCR2： CTCCCGGGTAGAAGTCAC
A.1.pCA2的构建
用引物CA2F和CA1R扩增编码重链部分的741bp片段，该片段含 有编码含半胱氨酸接头序列的延伸序列。VAE-pASK116作为Pfx聚合酶 (Roche)的模板，使用PCR仪(Robo)，开始在92℃下变性，循环： 92℃30s，48℃30s，68℃60s，5个循环，然后92℃30s，58℃30s， 68℃1min，30个循环。适当大小的PCR产物用Qiagen PCR纯化试剂 盒纯化，按照厂商推荐(Gibco)用XhoI和NcoI消化。用Qiagen凝胶 提取试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化产物。平行地，质粒VAE-pASK116用 XhoI和NcoI酶切，从琼脂糖凝胶中纯化3.7kb带。利用T4 DNA连接 酶，按照厂商说明(Gibco)，在16℃下将适量等份的XhoI-NcoI消化的 PCR产物与质粒连接过夜。用连接产物转化感受态大肠杆菌XL-1细胞， 后者接种于含氯霉素的琼脂糖平板上。单菌落在LB/氯霉素培养基中扩 增，制备质粒(Qiagen mini质粒试剂盒)，用适当的酶消化后检测 XhoI-NcoI插入片段的存在。相应的阳性质粒命名为pCA2，对两条链测 序，证实含半胱氨酸接头的质粒的身份。
A.2.pCB2的构建
在与A.1.部分所述相同的条件下，用引物CA2F和CB1R在重链编 码序列的5’端引入接头2。产生的PCR产物为750bp，克隆入如A.1. 部分所述的VAE051-pASK116中。
A.3.pCC2的构建
质粒pCC2分两步构建：用引物CA2F和CC1R扩增754bp的第一 次PCR产物。用引物CC1F和CC2R产生560bp的第二次PCR产物。 两次PCR都用VAE051-pASK116作为模板，条件如A.1部分所述。这 两种PCR产物都从琼脂糖凝胶中分离，与引物CA2F和CC2R混合，进 行第三次PCR，产生1298bp的片段。分离该片段，用XhoI和NcoI消 化。产生的780bp片段如A.1部分所述克隆入VAE-pASK100中。
B.mimobody的表达
用质粒pCA2、pCB2和pCC2转化感受态大肠杆菌W3110细胞。来 自氯霉素琼脂糖平板的单菌落在液体培养基(LB+15μg/ml氯霉素)中 37℃扩增过夜。然后1L TB培养基以1∶50v/v接种过夜培养物，在28℃ 下生长至OD600＝3。用1mg/l无水四环素诱导表达。过夜培养并以6000 rpm离心后收集细胞。细胞沉淀在添加硫酸多粘菌素B的裂解缓冲液中 4℃孵育2小时，从中分离周质。以6000rpm离心分离球芽。获得的上 清液含有mimobody，用20mM Tris，pH8.0透析。
C.mimobody的纯化
按照厂商推荐，引入的his6-尾使mimobody pCA2和pCB2可以通过 Ni-NTA fast flow(Qiagen)层析纯化。如必要，在蛋白G fast flow柱 (Amersham Pharmacia Biotech)上进行再纯化步骤。Mimobody用0.1M 甘氨酸pH2.7洗脱，立即加入NaOH中和，用20mM Hepes，150mM NaCl， pH7.2透析。
pCC2仅通过蛋白G亲和层析纯化。纯度通过SDS-PAGE分析。
Mimobody的蛋白质序列由cDNA序列翻译而来。通过对pCA2和 pCB2进行Edman测序证实其N端序列。
pCA2、pCB2和pCC2的轻链序列相同，如下：
DIELVVTQPASVSGSPGQSITISCTGTRSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKL
MIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTL
GVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQ
VTHEGSTVEKTVAPTECS
pCA2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHC
G
pCB2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTS
PPCG
pCC2重链序列：
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYTYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCASPKPS
TPPGSSGGAPGGC
D.mimobody与Qβ衣壳蛋白的偶联
D.1.mimobody pCC2与Qβ衣壳蛋白的偶联
将4.5mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液1.25ml与40μl SMPH溶液(Pierce)(溶于DMSO的100mM贮存 液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。然后6μl透析的反应混 合液与30μl pCC2溶液(2.88mg/ml)在25℃摇床上反应过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qb抗 血清(1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-Fab-mAb抗体(Jackson ImmunoResearch)(1∶2000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根过氧化物 酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶7000 稀释)孵育。
结果显示在图13A中。偶联产物和离析物在还原条件下在 16％SDS-PAGE凝胶上分析。在图13A中，“pCC2”对应于偶联前的 mimobody。“Qβ衍生”代表偶联前衍生的Qβ，“Qβ-pCC2”代表偶联反 应的产物。凝胶用考马斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭， 与多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-Fab-mAb (Jackson ImmunoResearch)(1∶2000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根 过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG(1∶7000稀释)孵育。用增强化学发光试剂(Amersham Pharmacia ELC 试剂盒)显示免疫反应条带。标准蛋白质的分子量示于左侧空白处。
能够检测到约40kDa的偶联产物(图13A，箭头)。它与抗-Qβ抗 血清和可识别mimobody的抗-Fab的反应性清楚地证实了mimobody与 Qβ的共价偶联。
D.2.mimobody pCA2和pCB2与Qβ衣壳蛋白的偶联
将4.5mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的 溶液1.25ml与40μl SMPH溶液(Pierce)(来自溶于DMSO的100mM 贮存液)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。pCA2(1.2mg/ml)在 25℃下用20mM TCFP还原30分钟，pCB2(4.2mg/ml)在37℃下用 50mM巯基乙胺还原。然后这两种mimobody都在4℃下用20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.2透析2次。向30μl mimobody中添加6μl衍生的 Qβ，在25℃摇床上进行偶联过夜。
反应产物在还原条件下在16％SDS-PAGE凝胶上分析。凝胶用考马 斯亮蓝染色或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qβ抗 血清(Cytos，1∶2000稀释)或小鼠单克隆抗-his6-mAb抗体(Qiagen) (1∶5000稀释)孵育。随后印迹分别与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔 IgG或辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释)孵育。
结果显示在图13B和图13C中。偶联产物和离析物在还原条件下在 16％SDS-PAGE凝胶上分析。在图15A和图15B中，“pCA2”和“pCB2” 对应于偶联前的mimobody。“Qβ衍生”代表偶联前衍生的Qβ， “Qβ-pCA2”和“Qβ-pCB2”代表偶联反应的产物。凝胶用考马斯亮蓝染色 或印迹于硝酸纤维素膜上。将膜封闭，与多克隆兔抗-Qb抗血清(1∶2000 稀释)或小鼠单克隆抗-his6-mAb抗体(Qiagen)(1∶5000稀释)孵育。 随后印迹分别与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶 偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释)孵育。用增强化学发光试剂 (Amersham Pharmacia ELC试剂盒)显示免疫反应条带。标准蛋白质的 分子量示于左侧空白处。
pCA2和pCB2偶联都能够检测到约40kDa的偶联产物(图15A和 图15B，箭头所指)。它与抗-Qβ抗血清和可识别mimobody重链的抗-his6 抗体的反应性清楚地证实了mimobody与Qβ的共价偶联。
实施例56
利用交联剂Sulfo-GMBS，Flag肽与野生型和
突变Qβ衣壳蛋白偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与野生型Qβ衣壳蛋 白和突变型Qβ衣壳蛋白进行化学偶联。
A.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上 反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaClpH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100 mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随 后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
C.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
D.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-GMBS水溶液(Pierce)在25℃摇 床上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2 小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图22A中。加样模式如下：
1，衍生的Qβ-240；2，与Flag肽偶联的Qβ-240；3，衍生的Qβ-250； 4，与Flag肽偶联的Qβ-250；5，衍生的Qβ-259；6，与Flag肽偶联的 Qβ-259；7，衍生的野生型Qβ；8，与Flag肽偶联的野生型Qβ；9，蛋 白质标准。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变体和野生型，对应 于每个亚单位1条和2条肽的偶联带都是可见的。对应于未偶联的Qβ 亚单位的带极弱，表明几乎所有亚单位都与至少一条Flag肽反应。对于 Qβ-250突变和野生型Qβ，可见对应于每个亚单位3条肽的带。对应于 每个亚单位2条肽的带与对应于每个亚单位1条肽的带的强度比，野生 型最高，比例为1∶1。Qβ-250突变体的这一比例也较高，但是Qβ-240 突变体明显较弱，Qβ-259突变体最弱。
实施例57
利用交联剂Sulfo-MBS，Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与野生型Qβ衣壳蛋 白和突变型Qβ衣壳蛋白化学偶联。
A.Flag肽与Qβ衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上反 应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在 4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的 溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床上反 应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在 4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。
C.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床 上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
D.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2 中的溶液100μl与7μl 65mM Sulfo-MBS水溶液(Pierce)在25℃摇床 上反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2透析2次各2小时。100μl透析的反应混合液然后与0.58μl 100mM Flag肽贮存液(溶于水)在25℃摇床上反应2小时。反应混合 液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.2透析2次各2 小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图1中。加样模式如下：
1.蛋白质标准；2.衍生的Qβ-240；3与Flag肽偶联的Qβ-240；4. 衍生的Qβ-250；5.与Flag肽偶联的Qβ-250；6.衍生的Qβ-259；7.与Flag 肽偶联的Qβ-259；8.衍生的野生型Qβ；9与Flag肽偶联的野生型Qβ。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变型和野生型，可见 对应于每个亚单位1条肽的偶联带。对于突变型Qβ-250和野生型Qβ， 对应于每个亚单位2条肽的带也可见。对应于每个亚单位1条肽的带与 对应于未偶联的亚单位的带的强度比，Qβ-250突变体和野生型Qβ较高。 对于Qβ-240突变体，可见一条对应于每个亚单位2条肽的弱带。
实施例58
利用交联剂SMPH，Flag肽与Qβ突变体偶联
化学合成Flag肽，为了偶联该肽N端添加有一个CGG序列，它具 有下列序列：CGGDYKDDDDK。如下所述，该肽与Qβ突变体化学偶 联。
A.Flag肽与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl 50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
B.Flag肽与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 然后反应混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
C.Flag肽与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与 1.3μl 50mM Flag肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。 然后反应混合液在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2 次各2小时。
通过SDS-PAGE分析Qβ突变体240、250和259与Flag肽的偶联 反应的结果，显示在图1中。加样模式如下：1.蛋白质标准；2与Flag 偶联的Qβ-240，偶联反应的沉淀；3与Flag偶联的Qβ-240，偶联反应 的上清液；4.SMPH衍生的Qβ-240；5与Flag偶联的Qβ-250，偶联反应 的沉淀；6.与Flag偶联的Qβ-250，偶联反应的上清液；7.SMPH衍生的 Qβ-250；8与Flag偶联的Qβ-259，偶联反应的沉淀；9与Flag偶联的 Qβ-259，偶联反应的上清液；10.SMPH衍生的Qβ-259。
衍生反应与偶联反应的比较显示，对于所有突变体，对应于每个亚 单位1条和2条肽的偶联带都是可见的。对于Qβ-250突变体，对应于 每个亚单位3条和4条肽的带也是可见的。
实施例59
PLA2-Cys蛋白与突变型Qβ衣壳蛋白的偶联
冻干的突变型Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中 溶解过夜。
A.PLA2-Cys蛋白与Qβ-240衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-240衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液在4℃下用2L 20mM Hepes，150 mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液然后与146 μl20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
B.PLA2-Cys蛋白与Qβ-250衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-250衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液与146 μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
C.PLA2-Cys蛋白与Qβ-259衣壳蛋白的偶联
将2mg/ml Qβ-259衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4 中的溶液100μl与2.94μl 100mM SMPH在DMSO中的溶液(Pierce) 在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes， 150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。90μl透析的反应混合液与146 μl 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4混合，与85.7μl 2.1mg/ml PLA2-Cys贮存液在25℃摇床上反应4小时。然后反应混合液在4℃下用 2L 20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4透析2次各2小时。
通过SDS-PAGE分析的偶联实验结果显示在图1中。加样模式如下： 1.蛋白质标准。2.衍生的Qβ-240；3与PLA2-Cys偶联的Qβ-240，偶联 反应的上清液；4与PLA2-Cys偶联的Qβ-240，偶联反应的沉淀；5.衍生 的Qβ-250；6与PLA2-Cys偶联的Qβ-250，偶联反应的上清液；7与 PLA2-Cys偶联的Qβ-250，偶联反应的沉淀；8.衍生的Qβ-259；9与 PLA2-Cys偶联的Qβ-259，偶联反应的上清液；10与PLA2-Cys偶联的 Qβ-259，偶联反应的沉淀；11.PLA2-Cys。
所有突变体的偶联带(图中箭头所指)均可见，表明PLA2-Cys蛋 白能与所有突变型Qβ衣壳蛋白偶联。
此处提到的所有专利和出版物均引入本文作为参考。
1999年11月30日提交的美国申请号09/449,631和WO 00/3227的 全部公开内容均在此完整地引用作为参考。上文提及的所有出版物和专 利均在此完整引用作为参考。
序列表 <110>赛托斯生物技术公司
Renner，Wolfgang A.
Bachmann，Martin
Tissot，Alain
Maurer，Patrick
Lechner，Franziska
Sebbel，Peter
Piossek，Christine
Ortmann，Rainer
Luond，Rainer
Staufenbiel，Matthias
Frey，Peter <120>分子抗原阵列 <130>1700.019PC07 <140>PCT/IB02/00168 <141>2002-01-21 <150>US 60/262,379 <151>2001-01-19 <150>US 60/288,549 <151>2001-05-04 <150>US 60/326,998 <151>2001-10-05 <150>US 60/331,045 <151>2001-11-07 <160>350 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>1 ggggacgcgt gcagcaggta accaccgtta aagaaggcacc 41 <210>2 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>2 ggtggttac ctgctgcacg cgttgcttaa gcgacatgta gcgg 44 <210>3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>3 ccatgaggcc tacgataccc 20 <210>4 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>4 ggcactcacg gcgcgcttta caggc 25 <210>5 <211>47 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>5 ccttctttaa cggtggttac ctgctggcaa ccaacgtggt tcatgac 47 <210>6 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>6 aagcatgctg cacgcgtgtg cggtggtcgg atcgcccggc 40 <210>7 <211>90 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>olginucleotide primer <400>7 gggtctagat tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc 60 catcgtctgc accagctggc ctttgacacc 90 <210>8 <211>108 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>8 gggtctagaa ggaggtaaaa aacgatgaaa aagacagcta tcgcgattgc agtggcactg 60 gctggtttcg ctaccgtagc gcaggccttc ccaaccattc ccttatcc 108 <210>9 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>9 cccgaattcc tagaagccac agctgccctc c 31 <210>10 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>10 cctgcggtgg tctgaccgac accc 24 <210>11 <211>41 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>11 ccgcggaaga gccaccgcaa ccaccgtgtg ccgccaggat g 41 <210>12 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引物 <400>12 ctatcatcta gaatgaatag aggattcttt aac 33 <210>13 <211>15 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>修饰过的核糖体结合位点 <400>13 aggaggtaaa aaacg 15 <210>14 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>信号肽 <400>14 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala
20 <210>15 <211>46 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>修饰的Fos构建体 <400>15 Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu 1 5 10 15 Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu
20 25 30 Leu Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys
35 40 45 <210>16 <211>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>肽接头 <400>16 Ala Ala Ala Ser Gly Gly 1 5 <210>17 <211>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>肽接头 <400>17 Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 <210>18 <211>256 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>18 gaattcagga ggtaaaaaac gatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggct 60 ggtttcgcta ccgtagcgca ggcctgggtg ggggcggccg cttctggtgg ttgcggtggt 120 ctgaccgaca ccctgcaggc ggaaaccgac caggtggaag acgaaaaatc cgcgctgcaa 180 accgaaatcg cgaacctgct gaaagaaaaa gaaaagctgg agttcatcct ggcggcacac 240 ggtggttgct aagctt 256 <210>19 <211>52 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>19 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lyg Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>20 <211>261 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(22)..(240) <400>20 gaattcagga ggtaaaaaac g atg aaa aag aca gct atc gcg att gca gtg 51
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val
1 5 10 gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc tgc ggt ggt ctg acc 99 Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr
15 20 25 gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc gcg 147 Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala
30 35 40 ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg gag 195 Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu
45 50 55 ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct 240 Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
60 65 70 gggtgtgggg atatcaagct t 261 <210>21 <211>73 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>21 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu
20 25 30 Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala
35 40 45 Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
50 55 60 Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala 65 70 <210>22 <211>196 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(34)..(189) <400>22 gaattcagga ggtaaaaaga tatcgggtgt ggg gcg gcc gct tct ggt ggt tgc 54
Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys
1 5 ggt ggt ctg acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac 102 Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp
10 15 20 gaa aaa tcc gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa 150 Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys
25 30 35 gaa aag ctg gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc taagctt 196 Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys 40 45 50 <210>23 <211>52 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>23 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>24 <211>204 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>24 gaattcagga ggtaaaaaac gatggcttgc ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa 60 accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa 120 gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg gcacacggtg gttgcggtgg ttctgcggcc 180 gctgggtgtg gggatatcaa gctt 204 <210>25 <211>56 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>25 Lys Thr Met Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr 1 5 10 15 Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn
20 25 30 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly
35 40 45 Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
50 55 <210>26 <211>26 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>26 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20 25 <210>27 <211>262 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>27 gaattcaggc ctatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 60 tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct gggtgtgggg cggccgcttc tggtggttgc 120 ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg 180 ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg 240 gcacacggtg gttgctaagc tt 262 <210>28 <211>52 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>28 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30 Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45 His Gly Gly Cys
50 <210>29 <211>261 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <220> <221>CDS <222>(7)..(240) <400>29 gaattc atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc 48
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly
1 5 10 ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa gag ggc agc gct tgc ggt ggt ctg 96 Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu 15 20 25 30 acc gac acc ctg cag gcg gaa acc gac cag gtg gaa gac gaa aaa tcc 144 Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser
35 40 45 gcg ctg caa acc gaa atc gcg aac ctg ctg aaa gaa aaa gaa aag ctg 192 Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu
50 55 60 gag ttc atc ctg gcg gca cac ggt ggt tgc ggt ggt tct gcg gcc gct 240 Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala
65 70 75 gggtgtggga ggcctaagct t 261 <210>30 <211>78 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>Fos融合构建体 <400>30 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Cys Gly Gly Leu Thr Asp
20 25 30 Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Val Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu
35 40 45 Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lyg Glu Lys Leu Glu Phe
50 55 60 Ile Leu Ala Ala His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Ala Ala Ala 65 70 75 <210>31 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>31 cctgggtggg ggcggccgct tctggtggtt gcggtggtct gacc 44 <210>32 <211>44 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>32 ggtgggaatt caggaggtaa aaagatatcg ggtgtggggc ggcc 44 <210>33 <211>47 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>33 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatgg cttgcggtgg tctgacc 47 <210>34 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>34 gcttgcggtg gtctgacc 18 <210>35 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>35 ccaccaagct tagcaaccac cgtgtgc 27 <210>36 <211>54 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>36 ccaccaagct tgatatcccc acacccagcg gccgcagaac caccgcaacc accg 54 <210>37 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>37 ccaccaagct taggcctccc acacccagcg gc 32 <210>38 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>38 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatg 29 <210>39 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>39 ggtgggaatt caggcctatg gctacaggct cc 32 <210>40 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>40 ggtgggaatt catggctaca ggctccc 27 <210>41 <211>59 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>41 gggtctagaa tggctacagg ctcccggacg tccctgctcc tggcttttgg cctgctctg 59 <210>42 <211>58 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400>42 cgcaggcctc ggcactgccc tcttgaagcc agggcaggca gagcaggcca aaagccag 58 <210>43 <211>402 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>修饰的蜂毒磷脂酶A2 <220> <221>CDS <222>(1)..(402) <400>43 atc atc tac cca ggt act ctg tgg tgt ggt cac ggc aac aaa tct tct 48 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 ggt ccg aac gaa ctc ggc cgc ttt aaa cac acc gac gca tgc tgt cgc 96 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg
20 25 30 acc cag gac atg tgt ccg gac gtc atg tct gct ggt gaa tct aaa cac 144 Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His
35 40 45 ggg tta act aac acc gct tct cac acg cgt ctc agc tgc gac tgc gac 192 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp
50 55 60 gac aaa ttc tac gac tgc ctt aag aac tcc gcc gat acc atc tct tct 240 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 tac ttc gtt ggt aaa atg tat ttc aac ctg atc gat acc aaa tgt tac 288 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr
85 90 95 aaa ctg gaa cac ccg gta acc ggc tgc ggc gaa cgt acc gaa ggt cgc 336 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg
100 105 110 tgc ctg cac tac acc gtt gac aaa tct aaa ccg aaa gtt tac cag tgg 384 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp
115 120 125 ttc gac ctg cgc aaa tac 402 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr
130 <210>44 <211>134 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>修饰的蜂毒磷脂酶A2 <400>44 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg
20 25 30 Thr Gln Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His
35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp
50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr
85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg
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115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr
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Met Asp Ile Asp Pro
1 5 tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg cct tct 1963 Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser
10 15 20 gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac acc gcc tca gct ctg 2011 Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu
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105 110 115 tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gcc tat aga 2299 Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
120 125 130 cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg gaa act act gtt gtt 2347 Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
135 140 145 aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct 2395 Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 150 155 160 165 cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga aga tct caa tct cgg 2443 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
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185 tattcctcta cagtacctat ctttaatcct gaatggcaaa ctccttcctt tcctaagatt 2558 catttacaag aggacattat tgataggtgt caacaatttg tgggccctct cactgtaaat 2618 gaaaagagaa gattgaaatt aattatgcct gctagattct atcctaccca cactaaatat 2678 ttgcccttag acaaaggaat taaaccttat tatccagatc aggtagttaa tcattacttc 2738 caaaccagac attatttaca tactctttgg aaggctggta ttctatataa gagggaaacc 2798 acacgtagcg catcattttg cgggtcacca tattcttggg aacaagagct acagcatggg 2858 aggttggtca ttaaaacctc gcaaaggcat ggggacgaat ctttctgttc ccaaccctct 2918 gggattcttt cccgatcatc agttggaccc tgcattcgga gccaactcaa acaatccaga 2978 ttgggacttc aaccccatca aggaccactg gccagcagcc aaccaggtag gagtgggagc 3038 attcgggcca gggctcaccc ctccacacgg cggtattttg gggtggagcc ctcaggctca 3098 gggcatattg accacagtgt caacaattcc tcctcctgcc tccaccaatc ggcagtcagg 3158 aaggcagcct actcccatct ctccacctct aagagacagt catcctcagg ccatgcagtg 3218 gaa 3221 <210>134 <211>185 <212>PRT <213>乙型肝炎病毒 <400>134 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
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180 185 <210>136 <211>217 <212>PRT <213>地松树乙型肝炎病毒 <400>136 Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
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210 215 <210>137 <211>262 <212>PRT <213>雪雁乙型肝炎病毒 <400>137 Met Asp Val Asn Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile Glu Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp
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ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 120 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 180 taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 240 tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 300 gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 360 atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 420 ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 480 cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 540 ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 600 aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 660 ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 720 gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 780 ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 840 gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 900 ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 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gggaatgtag cacggtggtg agtgaacgtg taggtgtggc gtttcacggt 3180 gtcgcggatg gtaaaaatcc ggatgtgctt tccgtgggag aggggccagg gatagccacc 3240 aatattggcg tagcgttgtt tgatgatgaa ggaaacctcg taccgattaa tcgtcctcca 3300 gcaaactgga aacggcttta ttcaggctct acttcgctac atttcatcgc caaatatcgt 3360 gctaccgggc gtcgggttac tggcggcatc gccaatgccc aggcctggtt ctctttaacc 3420 tatcagtaat tgttcagcag ataatgtgat aacaggaaca ggacagtgag taataaaaac 3480 gtcaatgtaa ggaaatcgca ggaaataaca ttctgcttgc tggcaggtat cctgatgttc 3540 atggcaatga tggttgccgg acgcgctgaa gcgggagtgg ccttaggtgc gactcgcgta 3600 atttatccgg cagggcaaaa acaagagcaa cttgccgtga caaataatga tgaaaatagt 3660 acctatttaa ttcaatcatg ggtggaaaat gccgatggtg taaaggatgg tcgttttatc 3720 gtgacgcctc ctctgtttgc gatgaaggga aaaaaagaga ataccttacg tattcttgat 3780 gcaacaaata accaattgcc acaggaccgg gaaagtttat tctggatgaa cgttaaagcg 3840 attccgtcaa tggataaatc aaaattgact gagaatacgc tacagctcgc aattatcagc 3900 cgcattaaac tgtactatcg cccggctaaa ttagcgttgc cacccgatca ggccgcagaa 3960 aaattaagat ttcgtcgtag cgcgaattct ctgacgctga ttaacccgac accctattac 4020 ctgacggtaa cagagttgaa tgccggaacc cgggttcttg aaaatgcatt ggtgcctcca 4080 atgggcgaaa gcacggttaa attgccttct gatgcaggaa gcaatattac ttaccgaaca 4140 ataaatgatt atggcgcact tacccccaaa atgacgggcg taatggaata acgcaggggg 4200 aatttttcgc ctgaataaaa agaattgact gccggggtga ttttaagccg gaggaataat 4260 gtcatatctg aatttaagac tttaccagcg aaacacacaa tgcttgcata ttcgtaagca 4320 tcgtttggct ggtttttttg tccgactcgt tgtcgcctgt gcttttgccg cacaggcacc 4380 tttgtcatct gccgacctct attttaatcc gcgcttttta gcggatgatc cccaggctgt 4440 ggccgattta tcgcgttttg aaaatgggca agaattaccg ccagggacgt atcgcgtcga 4500 tatctatttg aataatggtt atatggcaac gcgtgatgtc acatttaata cgggcgacag 4560 tgaacaaggg attgttccct gcctgacacg cgcgcaactc gccagtatgg ggctgaatac 4620 ggcttctgtc gccggtatga atctgctggc ggatgatgcc tgtgtgccat taaccacaat 4680 ggtccaggac gctactgcgc atctggatgt tggtcagcag cgactgaacc tgacgatccc 4740 tcaggcattt atgagtaatc gcgcgcgtgg ttatattcct cctgagttat gggatcccgg 4800 tattaatgcc 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20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40 221： RANKL_human：TrEMBL：O14788：胞外域 YFRAQMDPNRIS EDGTHCIYRI LRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK QAFQGAVQKE LQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI NATDIPSGSH KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD LATEYLQLMV YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGF FKLRSGEEIS IEVSNPSLLD PDQDATYFGA FKVRDID 222： RANKL_human：剪接同种型TrEMBL：O14788 MDPNRISEDG THCIYRILRL HENADFQDTT LESQDTKLIP DSCRRIKQAF QGAVQKELQH IVGSQHIRAE KAMVDGSWLD LAKRSKLEAQ PFAHLTINAT DIPSGSHKVS LSSWYHDRGW AKISNMTFSN GKLIVNQDGF YYLYANICFR HHETSGDLAT EYLQLMVYVT KTSIKIPSSH TLMKGGSTKY WSGNSEFHFY SINVGGFFKL RSGEEISIEV SNPSLLDPDQ DATYFGAFKV RDID 223： RANKL_mouse：TrEMBL：O35235：胞外域 YFRAQMDPNRI SEDSTHCFYR ILRLHENAGL QDSTLESEDT LPDSCRRMKQ AFQGAVQKEL QHIVGPQRFS GAPAMMEGSW LDVAQRGKPE AQPFAHLTIN AASIPSGSHK VTLSSWYHDR GWAKISNMTL SNGKLRVNQD GFYYLYANIC FRHHETSGSV PTDYLQLMVY VVKTSIKIPS SHNLMKGGST KNWSGNSEFH FYSINVGGFF KLRAGEEISI QVSNPSLLDP DQDATYFGAF KVQDID 224： RANKL_mouse剪接同种型：TrEMBL：Q9JJK8 MKQAFQGAVQ KELQHIVGPQ RFSGAPAMME GSWLDVAQRG KPEAQPFAHL TINAASIPSG SHKVTLSSWY HDRGWAKISN MTLSNGKLRV NQDGFYYLYA NICFRHHETS GSVPTDYLQL MVYVVKTSIK IPSSHNLMKG GSTKNWSGNS EFHFYSINVG GFFKLRAGEE ISIQVSNPSL LDPDQDATYF GAFKVQDID 225： MIF_at：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTSDPCALCS LHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYD MNAANVGWNG STFA 226： MIF_mouse：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPEGFLS ELTQQLAQAT GKPAQYIAVH VVPDQLMTFS GTNDPCALCS LHSIGKIGGA QNRNYSKLLC GLLSDRLHIS PDRVYINYYDMNAANVGWNG STFA 227： MIF_human：SwissProt PMFIVNTNVP RASVPDGFLS ELTQQLAQAT GKPPQYIAVH VVPDQLMAFG GSSEPCALCS LHSIGKIGGA QNRSYSKLLC GLLAERLRIS PDRVYINYYD MNAANVGWNN STFA 228： 人IL-17 登录号：AAC50341 1 mtpgktslvs lllllsleai vkagitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihnrntntnp 61 krssdyynrs tspwnlhrne dperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil 121 vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpi vhhva 229： 小鼠IL-17
登录号：AAA37490 1 mspgrassvs lmlllllsla atvkaaaiip qssacpntea kdflqnvkvn lkvfnslgak 61 vssrrpsdyl nrstspwtlh rnedpdryps viweaqcrhq rcvnaegkld hhmnsvliqq 121 eilvlkrepe scpftfrvek mlvgvgctcv asivrqaa 230： 人IL-13(前体) MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSG CSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN 231： 人IL-13(加工后) GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLL HLKKLFREGR FN 232： 小鼠IL-13(加工后) GPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISNCNAIYRTQRILHGLCNR KAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF 233： 人IL-5(前体) MRMLLHLSLL ALGAAYVYAI PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNH QLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQEFLGVMNTEW IIES 234： 人IL-5(加工后) I PTEIPTSALV KETLALLSTH RTLLIANETL RIPVPVHKNH QLCTEEIFQG IGTLESQTVQ GGTVERLFKN LSLIKKYIDG QKKKCGEERR RVNQFLDYLQ EFLGVMNTEW IIES 235： 小鼠IL-5(加工后) MEIPMSTVVKETLTQLSAHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEIFQGLDILKNQTVRGGTVEMLFQNLSLIKK YIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWAMEG 236： CCL21 Swissprot：SY21_human：切割信号肽后的序列： SDGGAQD CCLKYSQRKI PAKVVRSYRK QEPSLGCSIP AILFLPRKRS QAELCADPKE LWVQQLMQHL DKTPSPQKPA QGCRKDRGAS KTGKKGKGSK GCKRTERSQT PKGP 237： CCL21 Swissprot：SY21_mouse：切割信号肽后的序列： SDGGGQD CCLKYSQKKI PYSIVRGYRK QEPSLGCPIP AILFSPRKHS KPELCANPEE GWVQNLMRRL DQPPAPGKQS PGCRKNRGTS KSGKKGKGSK GCKRTEQTQP SRG 238： Swissprot：SDF1_human：切割信号肽后的序列： DGKPVSLSYRC PCRFFESHVA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQ EYLEKALNKR FKM 239： Swissprot：SDF1_mouse：切割信号肽后的序列： DGKPVSLSYRC PCRFFESHIA RANVKHLKIL NTPNCALQIV ARLKNNNRQV CIDPKLKWIQ EYLEKALNK 240： BLC序列：人：登录号：NP_006410 氨基酸1-22为信号肽。 MKFISTSLLL MLLVSSLSPV QGVLEVYYTS LRCRCVQESS VFIPRRFIDR IQILPRGNGC PRKEIIVWKK NKSIVCVDPQ AEWIQRMMEV LRKRSSSTLP VPVFKRKIP 241： BLC序列：小鼠：登录号：NP_061354 氨基酸1-21为信号肽。 MRLSTATLLL LLASCLSPGH GILEAHYTNL KCRCSGVIST VVGLNIIDRI QVTPPGNGCP KTEVVIWTKM KKVICVNPRA KWLQRLLRHV QSKSLSSTPQ APVSKRRAA 242： 人嗜酸细胞活化趋化因子-1 1-23为信号肽 1 mkvsaallwl lliaaafspq glagpasvpt tccfnlanrk iplqrlesyr ritsgkcpqk 61 avifktklak dicadpkkkw vqdsmkyldq ksptpkp 243： 人嗜酸细胞活化趋化因子-2 1-26为信号肽 1 maglmtivts llflgvcahh iiptgsvvip spccmffvsk ripenrvvsy qlssrstclk 61 agvifttkkg qqfcgdpkqe wvqrymknld akqkkaspra ravavkgpvq rypgnqttc 244： 人嗜酸细胞活化趋化因子-3 1-23为信号肽 1 mmglslasav llasllslhl gtatrgsdis ktccfqyshk plpwtwvrsy eftsnscsqr 61 avifttkrgk kvcthprkkw vqkyisllkt pkql 245： 小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-1 1-23为信号肽 1 mqsstallfl lltvtsftsq vlahpgsipt sccfimtskk ipntllksyk ritnnrctlk 61 aivfktrlgk eicadpkkkw vqdatkhldq klqtpkp 246： 小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2 1-25为信号肽 1 magsativag llllvacacc ifpidsvtip sscctsfisk kipenrvvsy qlangsicpk 61 agvifitkkg hkictdpkll wvqrhiqkld akknqpskga kavrtkfavq rrrgnstev 247： M-CSF序列：人：该构建体将为由33-181或33-185残基组成的N-端片段， 相应于受体的可溶形式。 登录号：NP_000748 MTAPGAAGRC PPTTWLGSLL LLVCLLASRS ITEEVSEYCS HMIGSGHLQS LQRLIDSQME TSCQITFEFV DQEQLKDPVC YLKKAFLLVQ DIMEDTMRFR DNTPNAIAIV QLQELSLRLK SCFTKDYEEH DKACVRTFYE TPLQLLEKVK NVFNETKNLL DKDWNIFSKN CNNSFAECSS QDVVTKPDCN CLYPKAIPSS DPASVSPHQP LAPSMAPVAG LTWEDSEGTE GSSLLPGEQP LHTVDPGSAK QRPPRSTCQS FEPPETPVVK DSTIGGSPQP RPSVGAFNPG MEDILDSAMG TNWVPEEASG EASEIPVPQG TELSPSRPGG GSMQTEPARP SNFLSASSPL PASAKGQQPA DVTGTALPRV GPVRPTGQDW NHTPQKTDHP SALLRDPPEP GSPRISSPRP QGLSNPSTLS AQPQLSRSHS SGSVLPLGEL EGRRSTRDRR SPAEPEGGPA SEGAARPLPR FNSVPLTDTH ERQSEGSSSP QLQESVFHLL VPSVILVLLA VGGLLFYRWR RRSHQEPQRA DSPLEQPEGS PLTQDDRQVE LPV 248： M-CSF小鼠序列：成熟序列从第33位氨基酸开始。登录号： NP_031804 MTARGAAGRC PSSTWLGSRL LLVCLLMSRS IAKEVSEHCS HMIGNGHLKV LQQLIDSQME TSCQIAFEFV DQEQLDDPVC YLKKAFFLVQ DIIDETMRFK DNTPNANATE RLQELSNNLN SCFTKDYEEQ NKACVRTFHE TPLQLLEKIK NFFNETKNLL EKDWNIFTKN CNNSFAKCSS RDVVTKPDCN CLYPKATPSS DPASASPHQP PAPSMAPLAG LAWDDSQRTE GSSLLPSELP LRIEDPGSAK QRPPRSTCQT LESTEQPNHG DRLTEDSQPH PSAGGPVPGV EDILESSLGT NWVLEEASGE ASEGFLTQEA KFSPSTPVGG SIQAETDRPR ALSASPFPKS TEDQKPVDIT DRPLTEVNPM RPIGQTQNNT PEKTDGTSTL REDHQEPGSP HIATPNPQRV SNSATPVAQL LLPKSHSWGI VLPLGELEGK RSTRDRRSPA ELEGGSASEG AARPVARFNS IPLTDTGHVE QHEGSSDPQI PESVFHLLVP GIILVLLTVG GLLFYKWKWR SHRDPQTLDS SVGRPEDSSL TQDEDRQVEL PV 249： 人抵抗素的序列：前体。 MKALCLLLLPVLGLLVSSKTLCSMEEAINERIQEVAGSLIFRAISSIGLECQSVTSRGDLATCPRGFAVTGCTCG SACGSWDVRAETTCHCQCAGMDWTGARCCRVQP 250： 小鼠抵抗素的序列：前体。 MKNLSFPLLFLFFLVPELLGSSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSC GSACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVAS 251： 淋巴毒素-β： Swissprot：TNFC_human：胞外域的序列： QD QGGLVTETAD PGAQAQQGLG FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ GLGWETTKEQ AFLTSGTQFS DAEGLALPQD GLYYLYCLVG YRGRAPPGGG DPQGRSVTLR SSLYRAGGAY GPGTPELLLE GAETVTPVLD PARRQGYGPL WYTSVGFGGL VQLRRGERVY VN 252： 淋巴毒素-β： Swissprot：TNFC_mouse：胞外域的序列： QD QGRRVEKIIG SGAQAQKRLD DSKPSCILPS PSSLSETPDP RLHPQRSNAS RNLASTSQGP VAQSSREASA WMTILSPAAD STPDPGVQQL PKGEPETDLN PELPAAHLIG AWMSGQGLSW EASQEEAFLR SGAQFSPTHG LALPQDGVYY LYCHVGYRGR TPPAGRSRAR SLTLRSALYR AGGAYGRGSP ELLLEGAETV TPVVDPIGYG SLWYTSVGFG GLAQLRSGER VYVNISHPDM VDYRRGKTFF GAVMVG 253： RNA-噬菌体PP7： msktivlsvg eatrtlteiq stadrqifee kvgplvgrlr ltaslrqnga ktayrvnlkl dqadvvdcst svcgelpkvr ytqvwshdvt ivansteasr kslydltksl vatsqvedlv vnlvplgr 254： RNA-噬菌体SPA1蛋白： aklnqvtls kigkngdqtl tltprgvnpt ngvaslseag avpalekrvt vsvaqpsrnr knfkvqiklq nptactrdac dpsvtrsafa dvtlsftsys tdeeralirt elaalladpl ivdaidnlnp aywaallvas sgggdnpsdp dvpvvpdvkp pdgtgrykcp facyrlgsiy evgkegspdi yergdevsvt fdyaledflg ntnwrnwdqr lsdydianrr rcrgngyidl datamqsddf vlsgrygvrk vkfpgafgsi kyllniqgda wldlsevtay rsygmvigfw tdskspqlpt dftqfnsanc pvqtviiips 1 255： “Qβ240”： AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 256： “Qβ243”： AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 257： “Qβ250”： ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 258： “Qβ259”： ARLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 259： “Qβ251”： AKLETVTLGNIGKDGRQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY 260： PH19(SEQ ID NO：260) TAAGTCCTCTGCCACGTACC 261： PH20(SEQ ID NO：261) TGGAAACCACGCTCACTTCC 262： PH21(SEQ ID NO：262) CGGGATCCGGGATGAAGAACCTTTCATTTC 263： PH22(SEQ ID NO：263) GCCTCTAGAGAGGAAGCGACCTGCAGCTTAC 264： PH29(SEQ ID NO：264) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGGACGACTACAAGGATGACGACA 265： PH30(SEQ ID NO：265) AGCTTGTCGTCATCCTTGTAGTCGTCCCCACATCCACCCCCTCCCG 266： PH31(SEQ ID NO：266) AGCTTACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGG 267： PH32(SEQ ID NO：267) CGGCTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTA 268： PH35(SEQ ID NO：268) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGATCGAAGGTCGCA 269： PH36(SEQ ID NO：269) AGCTTGCGACCTTCGATCCCACATCCACCCCCTCCCG 270： PH37(SEQ ID NO：270) CGGGATCCAGCAGCTGGGCTCGAGGTGCTAGCTTTGTTTAAAC 271： PH38(SEQ ID NO：271) GATCGTTTAAACAAACAAAGCTAGCACCTCGAGCCCAGCTGCTGGATCCCGGTAC 272： PH39(SEQ ID NO：272) CTAGCGGGAGGGGGTGGATGTGGGGACGATGACGACA 273： PH40(SEQ ID NO：273) AGCTTGTCGTCATCGTCCCCACATCCACCCCCTCCCG 274： PH41(SEQ ID NO：274) CATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGT 275： PH42(SEQ ID NO：275) GCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTAC 276： PH43(SEQ ID NO：276) ACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCG 277： PH44(SEQ ID NO：277) GATCCGCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCA 278： SU7(SEQ ID NO：278) AGCTTGCGGATCCAGGATATCGGCTCGAGGTTCTAGAGTG 279： SU8(SEQ ID NO：279) GGCCCACTCTAGAACCTCGAGCCGATATCCTGGATCCGCA 280： 抵抗素-C-Xa： SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCGIEGR 281： 抵抗素-C-EK SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCGDDDD 282： 抵抗素-GCG： SSMPLCPIDEAIDKKIKQDFNSLFPNAIKNIGLNCWTVSSRGKLASCPEGTAVLSCSCG SACGSWDIREEKVCHCQCARIDWTAARCCKLQVASSLAGGGGCG 283： pCep-Xa-Fc*：(全序列) 1 GCCCCGCCGC CGGACGAACT AAACCTGACT ACGGCATCTC TGCCCCTTCT TCGCTGGTAC GAGGAGCGCT 71 TTTGTTTTGT ATTCGGGGCA GTGCATGTAA TCCCTTCAGT TGGTTGGTAC AACTTGCCAA CTGGGCCCTG 141 TTCCACATGT GACACGGGGG GGGACCAAAC ACAAAGGGGT TCTCTGACTG TAGTTGACAT CCTTATAAAT 211 GGATGTGCAC ATTTGCCAAC ACTGAGTGGC TTTCATCCTG GAGCAGACTT TGCATGCTGT GGACTGCAAC 281 ACAACATTGC CTTTATGTGT AACTCTTGGC TGAAGCTCTT ACACCAATGC TGGGGGACAT GTACCTCCCA 351 GGGGCCCAGG AAGACTACGG GAGGCTACAC CAACGTCAAT CAGAGGGGCC TGTGTAGCTA CCGATAAGCG 421 GACCCTCAAG AGGGCATTAG CAATAGTGTT TATAAGGCCC CCTTGTTAAC CCTAAACGGG TAGCATATGC 491 TTCCCGGGTA GTAGTATATA CTATCCAGAC TAACCCTAAT TCAATAGCAT ATGTTACCCA ACGGGAAGCA 561 TATGCTATCG AATTAGGGTT AGTAAAAGGG TCCTAAGGAA CAGCGATATC TCCCACCCCA TGAGCTGTCA 631 CGGTTTTATT TACATGGGGT CAGGATTCCA CGAGGGTAGT GAACCATTTT AGTCACAAGG GCAGTGGCTG 701 AAGATCAAGG AGCGGGCAGT GAACTCTCCT GAATCTTCGC CTGCTTCTTC ATTCTCCTTC GTTTAGCTAA 771 TAGAATAACT GCTGAGTTGT GAACAGTAAG GTGTATGTGA GGTGCTCGAA AACAAGGTTT CAGGTGACGC 841 CCCCAGAATA AAATTTGGAC GGGGGGTTCA GTGGTGGCAT TGTGCTATGA CACCAATATA ACCCTCACAA 911 ACCCCTTGGG CAATAAATAC TAGTGTAGGA ATGAAACATT CTGAATATCT TTAACAATAG AAATCCATGG 981 GGTGGGGACA AGCCGTAAAG ACTGGATGTC CATCTCACAC GAATTTATGG CTATGGGCAA CACATAATCC 1051 TAGTGCAATA TGATACTGGG GTTATTAAGA TGTGTCCCAG GCAGGGACCA AGACAGGTGA ACCATGTTGT 1121 TACACTCTAT TTGTAACAAG GGGAAAGAGA GTGGACGCCG ACAGCAGCGG ACTCCACTGG TTGTCTCTAA 1191 CACCCCCGAA AATTAAACGG GGCTCCACGC CAATGGGGCC CATAAACAAA GACAAGTGGC CACTCTTTTT 1261 TTTGAAATTG TGGAGTGGGG GCACGCGTCA GCCCCCACAC GCCGCCCTGC GGTTTTGGAC TGTAAAATAA 1331 GGGTGTAATA ACTTGGCTGA TTGTAACCCC GCTAACCACT GCGGTCAAAC CACTTGCCCA CAAAACCACT 1401 AATGGCACCC CGGGGAATAC CTGCATAAGT AGGTGGGCGG GCCAAGATAG GGGCGCGATT GCTGCGATCT 1471 GGAGGACAAA TTACACACAC TTGCGCCTGA GCGCCAAGCA CAGGGTTGTT GGTCCTCATA TTCACGAGGT 1541 CGCTGAGAGC ACGGTGGGCT AATGTTGCCA TGGGTAGCAT ATACTACCCA AATATCTGGA TAGCATATGC 1611 TATCCTAATC TATATCTGGG TAGCATAGGC TATCCTAATC TATATCTGGG TAGCATATGC TATCCTAATC 1681 TATATCTGGG TAGTATATGC TATCCTAATT TATATCTGGG TAGCATAGGC TATCCTAATC TATATCTGGG 1751 TAGCATATGC TATCCTAATC TATATCTGGG TAGTATATGC TATCCTAATC TGTATCCGGG TAGCATATGC 1821 TATCCTAATA GAGATTAGGG TAGTATATGC TATCCTAATT TATATCTGGG TAGCATATAC TACCCAAATA 1891 TCTGGATAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC 1961 ATAGGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGT ATATGCTATC 2031 CTAATTTATA TCTGGGTAGC ATAGGCTATC CTAATCTATA TCTGGGTAGC ATATGCTATC CTAATCTATA 2101 TCTGGGTAGT ATATGCTATC CTAATCTGTA TCCGGGTAGC ATATGCTATC CTCATGCATA TACAGTCAGC 2171 ATATGATACC CAGTAGTAGA GTGGGAGTGC TATCCTTTGC ATATGCCGCC ACCTCCCAAG GGGGCGTGAA 2241 TTTTCGCTGC TTGTCCTTTT CCTGCATGCT GGTTGCTCCC ATTCTTAGGT GAATTTAAGG AGGCCAGGCT 2311 AAAGCCGTCG CATGTCTGAT TGCTCACCAG GTAAATGTCG CTAATGTTTT CCAACGCGAG AAGGTGTTGA 2381 GCGCGGAGCT GAGTGACGTG ACAACATGGG TATGCCCAAT TGCCCCATGT TGGGAGGACG AAAATGGTGA 2451 CAAGACAGAT GGCCAGAAAT ACACCAACAG CACGCATGAT GTCTACTGGG GATTTATTCT TTAGTGCGGG 2521 GGAATACACG GCTTTTAATA CGATTGAGGG CGTCTCCTAA CAAGTTACAT CACTCCTGCC CTTCCTCACC 2591 CTCATCTCCA TCACCTCCTT CATCTCCGTC ATCTCCGTCA TCACCCTCCG CGGCAGCCCC TTCCACCATA 2661 GGTGGAAACC AGGGAGGCAA ATCTACTCCA TCGTCAAAGC TGCACACAGT CACCCTGATA TTGCAGGTAG 2731 GAGCGGGCTT TGTCATAACA AGGTCCTTAA TCGCATCCTT CAAAACCTCA GCAAATATAT GAGTTTGTAA 2801 AAAGACCATG AAATAACAGA CAATGGACTC CCTTAGCGGG CCAGGTTGTG GGCCGGGTCC AGGGGCCATT 2871 CCAAAGGGGA GACGACTCAA TGGTGTAAGA CGACATTGTG GAATAGCAAG GGCAGTTCCT CGCCTTAGGT 2941 TGTAAAGGGA GGTCTTACTA CCTCCATATA CGAACACACC GGCGACCCAA GTTCCTTCGT CGGTAGTCCT 3011 TTCTACGTGA CTCCTAGCCA GGAGAGCTCT TAAACCTTCT GCAATGTTCT CAAATTTCGG GTTGGAACCT 3081 CCTTGACCAC GATGCTTTCC AAACCACCCT CCTTTTTTGC GCCTGCCTCC ATCACCCTGA CCCCGGGGTC 3151 CAGTGCTTGG GCCTTCTCCT GGGTCATCTG CGGGGCCCTG CTCTATCGCT CCCGGGGGCA CGTCAGGCTC 3221 ACCATCTGGG CCACCTTCTT GGTGGTATTC AAAATAATCG GCTTCCCCTA CAGGGTGGAA AAATGGCCTT 3291 CTACCTGGAG GGGGCCTGCG CGGTGGAGAC CCGGATGATG ATGACTGACT ACTGGGACTC CTGGGCCTCT 3361 TTTCTCCACG TCCACGACCT CTCCCCCTGG CTCTTTCACG ACTTCCCCCC CTGGCTCTTT CACGTCCTCT 3431 ACCCCGGCGG CCTCCACTAC CTCCTCGACC CCGGCCTCCA CTACCTCCTC GACCCCGGCC TCCACTGCCT 3501 CCTCGACCCC GGCCTCCACC TCCTGCTCCT GCCCCTCCTG CTCCTGCCCC TCCTCCTGCT CCTGCCCCTC 3571 CTGCCCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCCCCTCCTG CTCCTGCCCC 3641 TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG CCCCTCCTGC CCCTCCTGCT 3711 CCTGCCCCTC CTGCCCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCTCCTGCCC 3781 CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT GCTCCTGCCC CTCCTGCCCC TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC 3851 TGCTCCTGCC CCTCCTGCCC CTCCTGCCCC TCCTGCTCCT GCCCCTCCTC CTGCTCCTGC CCCTCCTGCC 3921 CCTCCTGCCC CTCCTCCTGC TCCTGCCCCT CCTGCCCCTC CTCCTGCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG 3991 CCCCTCCTGC CCCTCCTGCC CCTCCTCCTG CTCCTGCCCC TCCTGCCCCT CCTCCTGCTC CTGCCCCTCC 4061 TCCTGCTCCT GCCCCTCCTG CCCCTCCTGC CCCTCCTCCT GCTCCTGCCC CTCCTCCTGC TCCTGCCCCT 4131 CCTGCCCCTC CTGCCCCTCC TGCCCCTCCT CCTGCTCCTG CCCCTCCTCC TGCTCCTGCC CCTCCTGCTC 4201 CTGCCCCTCC CGCTCCTGCT CCTGCTCCTG TTCCACCGTG GGTCCCTTTG CAGCCAATGC AACTTGGACG 4271 TTTTTGGGGT CTCCGCACAC CATCTCTATG TCTTGGCCCT GATCCTGAGC CGCCCGGGGC TCCTGGTCTT 4341 CCGCCTCCTC 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| 一种番鸭细小病毒亚单位疫苗 | 2020-05-15 | 510 |
| 鱼用亚单位浸泡疫苗 | 2020-05-11 | 709 |
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