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图1.抗原激发的脾细胞的淋巴
细胞增殖。
图2.抗原激发的脾细胞的IFN-γ产量。
图3.抗原激发的脾细胞的IL-5产量。
图4.H5 HA ELISA抗体滴度。
图5.H3 HA ELISA抗体滴度。
发明详述
本发明提供了用合适的表达质粒转化的稳定昆虫细胞系中生产和 分泌出来的流感重组亚单位蛋白。将含或不含佐剂的重组蛋白单独使 用或一起结合使用以致于它们有效诱导能抑制体外测定中血凝反应的 强抗体应答。此抗体应答是体内抵御流感感染的表现。当结合使用时, 除了诱导相关抗体应答外,重组蛋白也诱导细胞免疫应答,其进一步 增强疫苗制剂的功效。合适抗原的使用,含或不含佐剂或佐剂组合物, 能被用于诱导特定的免疫应答,其导致能抵御流感的抗体。
本发明的优选实施方案中,在利用昆虫细胞的真核表达系统中生 产重组流感亚单位蛋白,其是本文所述疫苗制剂的组分。昆虫细胞是 可选的真核表达系统,其能在提供简单并相对价廉的培育条件的同时 提供表达适当折叠的及翻译后的改良蛋白。多数昆虫细胞表达系统基 于来自杆状病毒的载体的使用,以驱动重组蛋白的表达。使用来自杆 状病毒的载体的表达不是基于使用稳定的表达细胞系。而是这些系统 依赖于每次生产循环的宿主细胞的感染。结果,所需产物通过杆状病 毒载体的超表达也导致病毒产生,其导致宿主细胞的溶解。基于通过 整合表达盒进宿主细胞基因组中产生稳定细胞系的表达系统能用于多 代所需产物的表达。此提供了给定产物生产中更高水平的一致性。黑 腹果蝇(Drosophila melanogaster)表达系统(“果蝇表达系统”或 “果蝇系统”)(Johansen,H.等,Genes Dev.(1989)3:882-889; Ivey-Hoyle,M.,Curr.Opin.Biotechnol.(1991)2:704-707;Culp, J.S.,等,Biotechnology(NY)(1991)9:173-177)是基于用于重组 蛋白表达的稳定转化细胞系的生成。此昆虫细胞表达系统显示出从不 同来源成功生产出多种蛋白。最重要的是,此表达系统中生产的重组 蛋白显示保留相应天然蛋白的构建体和功能特征。在果蝇表达系统中 成功表达的蛋白实例包括HIV gp120(Culp,J.S.,等,Biotechnology (NY)(1991)9:173-177;Ivey-Hoyle,M.,Curr.Opin.Biotechnol. (1991)2:704-707,人多巴胺β-水解酶(Bin等,Biochem J.(1996) 313:57-64),人血管细胞粘附蛋白(Bernard等,Cytotechnology (1994)15:139-144),和登革热包膜糖蛋白(Modis等,PNAS USA(2003) 100:6986-6991;Modis等,Nature(2004)427(6972)313-319;和 Modis等,J.Virol.(2005)79(2):1223-1231;,和Zhang等, Structure(2005)12(9):1607-1618)。HBI也测定到果蝇表达系统 产生的亚单位蛋白产生较优的免疫原材料。例如,可比较的果蝇-表达 的登革热E蛋白和毕赤氏酵母-表达的登革热E蛋白的蚀斑减少中和滴 度(PRNT80)比较显示两个系统分别在1∶400-1∶1600和<1∶10-1∶80 的范围,对于免疫使用了等剂量。这些实施例中,果蝇表达蛋白的表 达水平均高于所用其它系统表达的等同蛋白,更重要的是,基于功能 和/或构建体研究表达的果蝇产物质量较高。
更优选的实施方案中,用作表达流感重组亚单位蛋白的宿主细胞 的昆虫细胞是
黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞系或来 源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞系(Schneider,J. Embryol.Exp.Morph.(1972)27:353-365)。
与其它用于表达在流感疫苗制剂中使用的亚单位的异源表达系统 相反,果蝇表达系统提供了稳定持续的昆虫细胞培养系统,其能生产 大量的保持相关免疫性质的天然样亚单位蛋白。
尽管果蝇表达系统能生产构建体和免疫相关的蛋白,但不是所有 表达异源蛋白或蛋白截断形式的尝试都是成功的。因此,需要系统评 价来测定在S2细胞表达系统中表达特定异源蛋白亚单位的能力。不能 在S2细胞系统中充分表达的蛋白及其亚单位的实例包括登革热蛋白 和
肝炎C NS3蛋白,全长登革热NS1蛋白的截断形式,全长登革热E 蛋白的特定截断形式,全长疟疾LSA-1蛋白的截断形式,和MSP-1蛋 白的疟疾p19亚单位。
另外,为了疫苗的最佳功效,将用于疫苗制剂的特定蛋白接受合 适佐剂和给药方式的选择。例如,alhydrogel在许多情况下激发不错 的Th2应答。但是,Th1应答需要使用如GPI-0100的佐剂。这两种佐 剂的结合也导致另一种依赖于所用疫苗抗原的免疫应答。经皮下途径 的接种能用于一些疫苗,同时肌内途径好于其它。
本发明的焦点集中在两种特定的甲型流感亚型上,H3N2和H5N1。 为了用于H3N2亚型,A/Fujian/411/02流感菌株用作HA基因的来源。 为了用于H5N1亚型,使用A/Hong Kong/156/97和A/Indonesia/5/05 两种菌株。A/Hong Kong/156/97菌株用作HA和M1的来源,同时 A/Indonesia/5/05仅用于HA序列。编码这些特定流感菌株及多数其 它菌株的不同蛋白的核苷酸序列在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 和ISD(www.flu.lanl.gov)
数据库中可用。用于装配和表达上述流 感亚单位的相同方法能延伸至所有甲型流感亚型和菌株。
本发明中,通过可操作地将这样蛋白的编码序列与分泌
信号序列 连接以致表达产物分泌至培养基中来评价从果蝇S2细胞表达和分泌 流感亚单位蛋白HA和M1。为了表达和分泌HA和M1,利用tPA(组织 血
纤维蛋白溶酶原催化剂)分泌信号。所有编码所述流感亚单位蛋白 的核苷酸序列合成制得(DNA2.0,Menlo Park,CA)并来源于GenBank 和ISD数据库中可用的序列。编码流感亚单位蛋白的特定合成DNA序 列也是昆虫细胞中表达的最佳化密码子。利用标准重组DNA方法将编 码本文所述序列的亚单位蛋白克隆至处于果蝇MtnA(金属硫蛋白) 启动子控制下的果蝇表达质粒中。然后将含有克隆流感序列的果蝇表 达质粒用于转化果蝇S2细胞。
优选实施方案中,在C-端截断HA蛋白以除去膜跨越区段,来允 许可溶亚蛋白的分泌。可溶膜少锚亚单位指的是HA胞外域(跨膜锚 定蛋白的表面暴露区段)。截断并分泌的HA亚单位被设计成保留病毒 表面呈现的膜锚定HA的暴露部分的天然样特征,并且能在加进疫苗制 剂时诱导强免疫应答。HA胞外域含所有的HA1区段和约三分之二的 HA2区段(截断在HA2区段)。特别地,在全长序列(包括分泌信号) 的氨基酸Gly520截断H3 HA蛋白,在全长序列(包括分泌信号)的氨 基酸Gly521截断H5 HA蛋白。H3 HA蛋白情况下,在氨基酸Gly520被截 断的C-端部分;H5 HA蛋白情况下,在氨基酸Gly521被截断的C-端部 分;本文被称为“标称(nominal)胞外域”。截断点可改变高达标称 胞外域长度的10%,只要这种变化不影响保留可溶HA亚单位蛋白的抗 原决定部位的构象(胞外域)。为了表达,除去天然分泌信号序列, 因为将表达质粒提供的异源分泌信号(tPA)用于指导流感亚单位的分 泌。表达的H3 HA胞外域蛋白序列是SEQ ID NO:1,表达的H5 HA Hong Kong胞外域蛋白序列和H5 HA Indonesia胞外域蛋白序列分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。HA胞外域亚单位通过其所来源的HA亚型 命名后缀HA-Ecto,例如H3 HA-Ecto。
可替换的实施方案中,如下描述了由HA分子进一步截断构建的 HA亚基的表达,即截断比HA序列N-端的胞外域和区段除去的除去了 更多的C-端。这些HA的进一步截断设计成表达HA亚单位,其导致在 免疫作用上对HA分子天然暴露表面更强的免疫应答。这种胞外域的进 一步截断通过除去全部HA2区段(代表约三分之一的全长HA蛋白的C -端区段)和HA N-端区段的小区段来产生。N-端和C-端截断的亚单 位包围HA区段被称为球形头部,并因而指代HA-头部。C-端截断对于 所有“头部”亚单位是在不变的点。特别地,“头部”亚单位对于H3 HA-头部在Arg329被截断,对于H5 HA-头部在Arg326被截断(为此目的 的氨基酸数目基于成熟的HA蛋白并不包括分泌信号)。H3 HA-头部和 H5 HA-头部的特定N-端截断和C-端截断本文被称为“标称HA-头部”。 N-端和C-端的截断点可以改变高达标称HA-头部长度的10%,只要这 种变化不影响残余可溶HA-头部上抗原决定部位的构象。“头部”亚 单位通过N-端截断
位置来辨别。例如,名为“H3 HA-A19-头部”的亚 单位来源于H3亚型并在Ala19(A19)N-端截断。此外,编号基于成熟 的HA蛋白。H3和H5表达的HA-头部序列分别显示在附录A的列1和 2,相对于相应的HA胞外域序列。附录A通过引用被结合到本文中。 H3 HA-A19-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO:4。H3 HA-G49-头部的氨 基酸序列是SEQ ID NO:5。H5HA-A9-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO:6。 H5 HA-G39-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO:7。
更优选的实施方案中,多聚体形式的HA被表达。类似上述HA胞 外域的HA序列通过36个残基的氨基酸序列与HA胞外域序列的C-端 融合来进一步改变。该分泌的融合HA亚单位形成三聚分子,显示保留 HA蛋白的天然样特征如位于病毒表面并能在加进疫苗制剂时诱导强 免疫应答。36个残基氨基酸序列的29个氨基酸来源于抗菌素T4 fibritin蛋白序列其被称为“foldon”序列(另外的7个氨基酸作为 HA序列和foldon序列之间的间隔)。foldon序列,其位于fibritin 蛋白的C-端,必然通过非共价结合集合fibritin的三个单体形成三 聚体分子。“HA foldons”通过胞外域的C-端(H3为Gly520,H5为 Gly521)与含36个氨基酸foldon的序列融合来构建。此HA胞外域与 foldon序列的融合的表达导致产生可溶共价连接的三聚体HA亚单位。 HA foldons通过所来源的HA亚型命名后缀“HA-foldon”,例如“H5 HA-foldon”。H3 HA-foldon和H5 HA-foldon共同被称为“HA-foldons”, 单独被称为“HA-foldon”。表达H3-foldon亚单位和H5-foldon亚 单位的蛋白序列分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
优选实施方案中,表达了表示全长天然M1蛋白的H5N1 M1亚单位。 氨基酸1至252编码M1蛋白。表达的M1蛋白序列为SEQ ID NO:10 所示。SEQ ID NO:1至10的氨基酸序列可以具有高达10%的残基取代, 只要这种取代不影响抗原决定部位构象。
稳定转化的S2细胞系表达分泌的流感重组亚单位蛋白,如下所述 并用于优选的疫苗制剂,通过如下所述的多种方法首先纯化。优选的 纯化方法生产保留天然构象的蛋白。
优选的实施方案中,加入本文所述果蝇-表达的流感重组亚单位蛋 白的疫苗制剂,含或不含一种或多种佐剂,提高强免疫应答。这种疫 苗制剂的使用诱导强血凝素抗体滴度,例如,≥1∶40。这种疫苗制剂 特别能诱导高血凝素抗体滴定得到其它重组表达流感蛋白不诱导有效 免疫应答的事实的支持。此外,疫苗制剂能抵御鼠模型上流感激发。 更多的描述单独组分特征及此疫苗制剂显著功效的细节如下。
另一个实施方案,疫苗制剂特征在于使用低剂量能诱导特定有效 免疫应答的重组亚单位蛋白。低剂量定义为15μg或更少的重组蛋白。 此与其它需要更高剂量达到适度免疫应答的流感重组亚单位蛋白形成 对照。
因而,本发明涉及并提供作为防止或削弱流感病毒感染手段的疫 苗制剂。如本文所用的,疫苗据说是防止或削弱疾病如果它对个体的 给药导致个体对疾病的完全或部分免疫,即对疾病症状的完全或部分 抑制。
为了使受试者对流感免疫,含一种或多种亚单位的疫苗制剂通过 常规免疫方案,通常不局限于疫苗的多样给药,来给受试者给药。发 明免疫原组合物在多样给药中的使用可能导致抗体水平的提高和免疫 受试者表达的免疫球蛋白所有组分的多样性。
免疫原组合物的给药典型的是通过注射,如肌肉或皮下;然而其 它给药的全身方式也可使用。
根据本发明,免疫原组合物的“有效剂量”是足够达到所需生物 效应。通常,所需提供组合物有效量的剂量根据这样的因素如受试者 年龄、基因背景、环境和性别而变化。发明的免疫原制备能通过有效 量的单一剂量或复合剂量来执行。发明组合物的有效量可在每剂 1-100μg之间变化,更优选在每剂1-15μg之间。
尽管上面的描述和下面的实施例主要涉及来自A型亚型H3N2和 H5N1的流感亚单位HA和M1的表达,但是方法和疫苗制剂能延伸至其 它A型亚型和B型流感和C型流感。
实施例
下面的实施例说明了利用稳定转化的昆虫细胞系的流感亚单位蛋 白HA蛋白和M1蛋白的有效表达。为了这些实施例的目的,利用果蝇 表达系统。也说明了表达重组亚单位蛋白的纯化。
实施例进一步说明了果蝇表达重组蛋白用作免疫原时导致加强的 生物相关的免疫应答。显示的结果表明来自天然流感蛋白HA和M1的 单独流感亚单位蛋白或这些相同亚单位蛋白的各种组合能增强抵御鼠 模型上的激发。因而,来自稳定转化昆虫细胞的重组表达HA蛋白和 M1蛋白的利用导致较好的免疫原组合物和满足上述技术问题的需要 和解决。
实施例1
来自H5N1和H3N2亚型的流感HA胞外域的表达和纯化
一系列为培养的果蝇细胞中异源重组目标蛋白的表达和选择设计 的表达质粒用于所述工作。关于表达质粒制备的细节,参见美国专利 US5,550,043、US5,681,713、US5,705,359、和US6,046,025,其内容 通过引用结合到本文中。特别地,用于此工作的两个质粒是pMttbns 和pCoHygro。pMttbns表达载体含有以下因子:果蝇金属硫蛋白启动 子(Mtn)、人组织血纤维蛋白溶酶原催化剂(tPA)单序列、和SV40 早期聚腺苷
酸化信号(Culp等,Biotechnology(1991)9:173-177)。 pCoHygro质粒提供了潮霉素的可选标记(Van der Straten,Methods in Mol.and Cell Biol.(1989)1:1-8)。潮霉素基因在果蝇COPIA 转座因子长端重复序列的转录控制下。通过去除含外部Xho I位点的 15个
碱基对BamHI区段来改变pMttbns载体。此改进的载体,称为pMtt ΔXho,允许利用Bgl II和Xho I特别位点的插入区段的直接克隆。 关于表达质粒制备和在果蝇表达系统中使用的细节,参见普通转让的 美国专利US6,165,477、US6,416,763、US6,432,411、和US6,749,857, 其内容通过引用结合到本文中。除非本文另外定义的,这种普通转让 专利中所用的和关于果蝇表达系统的术语定义适用本文。这种普通转 让专利中克隆进质粒的DNA序列当然区别于本文公开的克隆流感序 列,并被其取代。
果蝇表达系统被报道表达高水平适当折叠的蛋白(Culp等 Biotechnology(1991)9:173-177,Bernard等Cytotechnology (1994)15:139-144,Bin等Biochem J.(1996)313:57-64, Incardona和Rosenberry,Mol.Biol.of the Cell(1996) 7:595-611)。基于果蝇金属硫蛋白(Mtn)启动子的表达载体提供了 异源蛋白的调节表达(Van der Straten,Methods in Mol.and Cell Biol.(1989)1:1-8),Johansen,H.等,Genes Dev.(1989) 3:882-889;,和Culp等Biotechnology(1991)9:173-177)。利 用Mtn表达质粒的果蝇表达系统的使用允许能有效保留并且能表达高 产高质蛋白的稳定转化体的生成。通过加入
硫酸铜诱导表达。
编码流感亚单位蛋白的果蝇表达质粒通过在果蝇表达载体pMtt ΔXho中插入合适基因的确定区段来构建。流感基因的合适区段通过 基因合成生成(DNA2.0,Menlo Park,CA)。除了所关心合适基因的 合成,基因也是昆虫细胞中最佳表达的密码子。合成基因也包括为了 与必需控制因子一起克隆的合适限制性内切核酸酶切割位点,例如终 止密码子。合成的流感基因克隆进用Bgl II和Xho I消化的pMttΔ Xho载体。克隆进pMttΔXho的Bgl II位点导致4个氨基酸 Gly-Ala-Arg-Ser因与tPA分泌信号序列的融合而加入表达蛋白的氨 基端。对所有构建体进行测序以证实被引入的多种组分是正确的并且 合适读框被保留。
从ATCC获得的果蝇S2细胞(Schneider,J.Embryol.Exp. Morph.(1972)27:353-365)用于S2系统。使细胞适应于在Excell 420 培养基(JRH Biosciences,Lenexa,KS)中生长并且本文所述的所 有步骤和培养均在Excell 420培养基中。细胞培养的第5天和第7 天之间传代并且典型地以1x106个细胞/ml的
密度接种表达质粒并在 26℃下培育。含编码流感亚单位蛋白序列的表达质粒通过磷酸
钙方法 转化进S2细胞中。为了用潮霉素B选择,细胞与pCoHygro质粒以20 μg表达质粒比1μg pCoHygro的比率共同转化。转化后,耐潮霉素的 细胞,0.3mg/ml,被选择。一旦稳定的细胞系被选择,就将它们用来 评价合适产物的表达。培养基的5毫升等份试样被以2x106个选择的 细胞/ml接种,用0.2mM CuSO4诱导,在26℃下培育7天。培养物用 来评价细胞相关的区段和培养基中亚单位蛋白的表达。蛋白通过 SDS-PAGE分离并用考马斯蓝着色或着色到硝化纤维上。被表达的给定 目标蛋白的特定抗体用于探测蛋白质印迹。通过SDS-PAGE凝胶的考马 斯着色在果蝇培养物中易检测到1mg/L或更高的表达水平。为了生产 更大量的产物,转化的果蝇S2细胞作为悬浮培养物在旋转烧瓶或生物 反应器中培育。
H3N2菌株A/Fujian/411/02的全长HA基因(HAO)编码566个氨 基酸残基的蛋白。特别地,所用序列来自登录号ISDN38157(ISD, www.flu.lanl.gov)的核苷酸序列。非截断蛋白序列在N-端和C-端膜 锚处含有16个氨基酸分泌信号序列。为了表达可溶H3 HA胞外域(H3 HA-Ecto),N-和C-截断的分子被表达其在全长蛋白的Gln17至Gly526 序列(HA2的残基175,似X31晶体构建体的C-端,Wilson等Nature (1981)289:366-373)中。
含(“装载”)H3 HA-Ecto亚单位蛋白合成基因的pMttΔXho表 达质粒用于转化S2细胞。在选择稳定细胞系上,细胞被筛选用来表达 分泌形式的H3 HA-Ecto蛋白。所述H3 HA-Ecto亚单位的表达导致预 料分子重量的均一产物。分泌的H3 HA-Ecto的糖基化模式是均一的因 为用PNGase处理导致与7个糖基化位点存在符合的改变。分泌到S2 细胞培养基中的H3 HA-Ecto目标蛋白的表达水平估计在30μg/ml至 40μg/ml之间。
A/Hong Kong/156/97(H5N1)菌株的全长HA基因(HA0)编码568 个氨基酸残基的蛋白。特别地,所用序列来自登录号AF046088 (Genbank,www.ncbi.nlm.nih.gov)的核苷酸序列。HA0蛋白序列在 N-端和C-端膜锚处含有16个氨基酸分泌信号序列。为了表达可溶H5 HA分子(胞外域),N-和C-截断的分子被表达其在全长蛋白的Asp17 至Gly521序列(HA2的残基175,似X31晶体构建体的C-端,Wilson 等.Nature(1981)289:366-367)中。A/Hong Kong/156/97(H5N1) 菌株的HA在HA1/HA2接点含有一段6个碱性氨基酸残基其编码弗林蛋 白酶切割位点。在S2细胞表达时分裂该位点。
含(“装载”)H5 HA-Ecto亚单位蛋白合成基因的pMttΔXho表 达质粒用于转化S2细胞。在选择稳定细胞系上,细胞被筛选用来表达 分泌形式的H5HA-Ecto蛋白。所述H5 HA-Ecto亚单位的表达在非还 原条件下导致由许多条带(+或-10kD)组成的产物,这些条带预 料的分子重量范围内。因为分泌的H5 HA-Ecto的糖基化模式似乎基于 用PNGase在还原条件下处理导致与5个糖基化位点存在符合的改变而 均一。因此,表达的多带模式似乎是分子折叠变化的结果。分泌到S2 细胞培养基中的H5 HA-Ecto目标蛋白的表达水平估计为约5μg/ml。
两个H5N1菌株的HA蛋白在编码弗林蛋白酶切割位点的HA1/HA2 接点含有碱性氨基酸残基链。在S2细胞中表达时分裂该位点。H5 HA-Ecto的可选形式也被表达。这些可选形式通过在弗林蛋白酶切割 位点形成突变其阻止表达上H5 HA-Ecto亚单位的蛋白酶切割来制得。 含有弗林蛋白酶切割位点(Arg-Lys-Lys-Arg)的八个氨基酸序列,Hong Kong菌株的Arg339-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg和Indonesia菌株 的Arg339-Glu-Arg-Ser-Arg-Lys-Lys-Arg,除去并由4个氨基酸序列 Lys-Gln-Thr-Arg替换。这些H5 HA胞外域的变化形式分别称为 H5-HK-HA-Ecto-mut和H5-Indo-HA-Ecto-mut。
含H5 HA-Ecto-mut亚单位合成基因的pMttΔXho表达质粒用于转 化S2细胞。在选择稳定细胞系上,筛选细胞用来表达分泌形式的H5 HA-Ecto-mut蛋白。H5 HA-Ecto-mut亚单位的表达导致比H5 HA-Ecto 亚单位更均一的保护。分泌到S2培养物培养基中的H5-HK-HA Ecto 和H5-Indo-HA Ecto蛋白的表达水平估计分别为5μg/ml至10μg/ml 和10μg/ml至15μg/ml。H5 HA-Ecto、H3 HA-Ecto和其衍生物(不 受限地包括H5-HK-HA-Ecto-mut和H5-Indo-HA-Ecto-mut)共同被称 为“血凝素胞外域蛋白亚单位群”和单独被称为“血凝素胞外域蛋白 亚单位”。
标准层析方法用于分离来自S2培养物上清液的分泌的重组流感 HA亚单位蛋白。为了生产用于治疗人的材料,创造能被可行测量和用 作当前良好生产规范(“cGMP”)生产工艺的方法的需要影响了方法 发展成果。基于发明者以前免疫亲和层析(“IAC”)的成功,此方法 是发明者发展成果的主要焦点。如本领域所知,选择用于纯化的抗体 的重要标准是相关杂交瘤或其抗体的有效性,大批有效,其限制了能 用来评价IAC中使用的试剂。
非免疫亲和纯化方法如Vanlandschoot等的方法(Arch.Virol. (1996)141:1715-1726),其最初用于纯化作为草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)-9(Sf9)细胞分泌产物表达的 A/Victoria/3/75(H3N2)HA,也用来评价来自S2培养物上清液的分 泌的流感HA-Ecto亚单位的纯化。关于H3 HA-Ecto亚单位,两步纯化 方法被发展。大批收获被用缓冲液A(20mM磷酸钠,pH 7.0)稀释三 分之一,再装入SP-凝胶(GE Healthcare,Piscataway,NJ)柱中, 其随后用冲洗缓冲液B(50mM磷酸钠,pH 7.0)冲洗直至达到基线吸 光度。被结合的H3 HA-Ecto被用含0.5M NaCl的缓冲液B洗脱。从 SP-凝胶洗脱的产物再用缓冲液C(0.1M磷酸钠,pH 7.0)稀释二分之 一,再装入陶瓷羟
磷灰石层析柱(CHT;Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA),其再用缓冲液C冲洗直至达到基线吸光度。被结合 的H3 HA胞外域被用pH 7.0的0.5M磷酸钠洗脱。产物为鉴定而被浓 缩及通过
超滤来缓冲交换。
H5 HA-Ecto和H5 HA-Ecto-mut亚单位通过三步层析法来纯化。 用缓冲液A(25mM Tris-HCl,pH 8.8,+0.05%tween-20)将稀释大 批收获物稀释四分之一,再装载至CHT柱上,其随后用缓冲液A冲洗 直至达到基线吸光度。被结合的H5 HA-Ecto被用pH 7.45,+0.05% tween-20的50mM磷酸钠洗脱。洗脱产物装入用缓冲液A平衡的Q-凝 胶(GE Healthcare,Piscataway,NJ)柱中。柱用缓冲液A冲洗, 再用含50mM NaCl的缓冲液A冲洗。被结合的H5 HA-Ecto被用含1M NaCl的缓冲液A冲洗。Q-凝胶产物通过大小排阻层析在Sephacryl S-100柱(1.5x 95.5cm)上进一步
分馏,使用pH 7.2的11mM磷酸 缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液。含H5 HA-Ecto的级分为鉴定而 汇集和浓缩。
实施例2
来自H3N2和H5N1亚型的流感HA“头部”的表达和纯化
为了表达能引起更强免疫应答的可溶形式HA,实施例1所述的胞 外域亚单位在N-端和C-端进一步被截断。N-端和C-端被截断的亚单 位包围HA区段被称为球形头部,并因此被称为HA-头部。对于所有“头 部”亚单位,C-端截断是恒定点。特别地,对于H3 HA-头部,“头部” 亚单位在Arg329被截断;对于H5 HA-头部,“头部”亚单位在Arg326 被截断(为此目的的氨基酸数目基于不包括分泌信号的成熟HA蛋白, 与实施例1中编号基于含分泌信号的全长序列相反)。两个N-端截断 为H3-头部和H5-头部制得。当两个亚型间截断的编号不相配时,截断 是基于蛋白序列排列的等份量。第一个N-端截断在Ala残基,H5在 Ala9和H3在Ala19获得。第二个N-端截断在Gly残基,H5在Gly39和 H3在Gly49获得。“头部”亚单位通过N-端截断的位置指明,特别关 于上述截断,亚单位被称为H5 HA-A9-头部、H5 HA-G39、H3 HA-A19- 头部、和H3-HA-G49-头部。
用于克隆、转化、表达和鉴定HA-头部亚单位的方法与实施例1 所述方法相同。在选择稳定细胞系上,细胞被筛选用来表达分泌形式 的HA-头部。所述HA-头部亚单位的表达对于H5来源的头部导致预期 分子重量的均一产物而H3来源的头部的表达导致预期分子重量(+或 -10kD)范围内的多
电泳带。分泌到S2培养物培养基中的H3 HA-头 部和H5 HA-头部的表达水平分别为约5μg/ml和约20μg/ml。
H5 HA-头部的纯化通过非免疫亲和纯化方法来完成。大批收获被 用缓冲液A(20mM磷酸钠,pH 6.2)稀释三分之一,再装入CHT柱中, 其用缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。流经中未结合的材料,其含 H5 HA-头部,被直接装入SP-凝胶柱中,其用缓冲液A冲洗直至达到 基线吸光度。结合的H5 HA-头部被用含0.1M NaCl的缓冲液A洗脱。 洗脱产物再通过大小排阻层析在Sephacryl S-100(GE Healthcare, Piscataway,NJ)柱(1.5x 95.5cm)上磨光,使用pH 7.2的11mM 磷酸缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液。含H5 HA-头部的级分为鉴 定而汇集和浓缩。
实施例3
来自H3N2和H5N1亚型的流感HA“foldons”的表达和纯化
为了表达天然样三聚体形式组成的可溶多聚体形式的HA,36个氨 基酸序列融合于实施例1所述HA-Ecto亚单位的C-端。融合于HA-Ecto 亚单位的36个氨基酸序列中29个氨基酸来自抗菌素T4 fibritin蛋 白序列其称为“foldon”序列(另外的7个氨基酸作为HA序列和foldon 序列之间的间隔)。foldon序列,其位于fibritin蛋白的C-端,必 然通过非共价结合集合fibritin的三个单体形成三聚体分子。HA foldons通过胞外域的C-端(H3为Gly520,H5为Gly521)与含36个氨 基酸foldon的序列融合来构建。此HA胞外域与foldon序列的融合 的表达导致产生可溶非共价连接的三聚体HA亚单位。HA foldon通过 所来源的HA亚型命名后缀HA-foldon,例如“H5 HA-foldon”。
用于克隆、转化、表达和鉴定HA-foldon亚单位的方法与实施例 1所述方法相同。在选择稳定细胞系上,细胞被筛选用来表达分泌形 式的HA-foldons。所述HA-foldon亚单位的表达导致预期分子重量的 均一产物。分泌到S2培养物培养基中的H3 HA-foldon和H5 HA-foldon 的表达水平分别估计为10μg/ml和15μg/ml。
H3 HA-foldon使用两步层析法来纯化。大批收获被用缓冲液A (20mM Tris-HCl,pH 8.0)稀释四分之一,再装入用缓冲液A平衡的 Q-凝胶柱中。柱再用缓冲液B(20mM Tris-HCl,pH 5.0)冲洗直至达 到基线吸光度。被结合的材料通过用含0.125M NaCl和1M NaCl的缓 冲液B冲洗柱来洗脱。含H3 HA-foldon的0.125M NaCl级分用缓冲液 B稀释二分之一再装入用缓冲液B平衡的SP-凝胶柱中。柱用含0.35M NaCl的缓冲液B冲洗直至达到基线吸光度。被结合的材料通过用含 0.6M NaCl和1M NaCl的缓冲液B冲洗柱来洗脱。H3 HA-foldon在0.6M NaCl级分中被洗脱并随后为鉴定而被缓冲交换和超滤浓缩。
至于其它蛋白,IAC是H5 HA foldon的优选纯化方法。因为目前 没有合适的抗体可用,目前用于纯化H5 HA foldon的方法是基于为纯 化H5 HA胞外域和H3 HA foldon而发展的方法其利用Q-凝胶、SP- 凝胶、和CHT层析基质。
实施例4
来自H5N1亚型的流感M1的表达和纯化
来自H5N1菌株A/Hong Kong/156/97的全长M1基因编码252个氨 基酸蛋白。M1来源于也编码M2蛋白核苷酸序列的流感M序列。来自M 序列编码Met1至Lys252的序列用于在S2细胞中表达M1蛋白。此序列 来自登录号AF046090(GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov)所含H5N1 M序列的核苷酸序列。尽管M1蛋白不是从细胞正常分泌的,但是为了 此工作M1蛋白,如前定义的,连接于果蝇表达质粒的tPA分泌信号以 生产分泌形式的截断M蛋白。
用于克隆、转化、表达和鉴定M1亚单位的方法是实施例1所述方 法。在选择稳定细胞系上,细胞被筛选用来表达分泌形式的H5N1 M1 目标蛋白。所述M1亚单位的表达导致预期分子重量的均一产物。分泌 到S2培养物培养基中的H5N1 M1蛋白的表达水平分别估计为15μg/ml 至20μg/ml。
不像HA,M1蛋白的层析纯化方法未在文献中报道,除了纯化 His-tagged的重组M1蛋白的镍螯合柱(Hara等,Microbiol.Immunol. (2003)47:521-526;Watanabe等,J.Virol.(1996)70:241-247)。 为了保留M1的天然构象,不优选添加His标记。其它纯化M1的方法 是酸-氯仿-甲醇提取(Gregoriades,Virology(1973)54:369-383) 和酸依赖的清洁剂提取(Zhirnov,Virology(1992)186:327-330), 两者均不适用生产目的。至于HA蛋白,使用单克隆抗体的IAC是纯化 M1蛋白的优选方法。
可选的纯化方法也被评价从而导致非免疫亲和纯化方法的发展。 大批收获用2M硫酸钠稀释二分之一再装入用1M硫酸钠平衡的苯基凝 胶(GE Healthcare,Piscataway,NJ)柱中。柱用1M硫酸钠冲洗直 至达到基线吸光度。被结合的材料再用去离子水洗脱。水洗脱液直接 装入用含150mM NaCl的缓冲液A(10mM磷酸钠,pH 5.5)平衡的SP -凝胶柱中。柱用含150mM NaCl的缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。 被结合的材料通过含0.5M NaCl和1M NaCl的缓冲液A组成的分阶梯 度来洗脱。M1蛋白在0.5M NaCl步骤中被洗脱并随后通过大小排阻层 析在使用pH 7.2的11mM磷酸缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液的 Sephacryl S-100柱(1.5x 94cm)上进一步纯化。含M1蛋白的级分 为鉴定而汇集和浓缩。
实施例5
鼠免疫原性研究#1
含和不含H5N1 M1的S2表达的H5 HA-头部在Balb/c鼠上的免疫 原性
根据发明表达和纯化的H5抗原的免疫原性在Balb/c鼠上被评 价。含和不含H5N1 M1蛋白的H5 HA-A9-头部用来检验免疫原能力。 5-9只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过皮下途径使用如下表1所述的重 组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时GPI-0100 (250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受两剂之间间隔4 周的疫苗。最后一剂疫苗后7天,4只鼠/组被施与安乐死并脾被收集 用来分析如下所述的细胞免疫应答。最后一剂疫苗后两周,余下的动 物被施与安乐死并血清样本被收集。体液应答基于对免疫原特定的抗 体的个体滴度来评定,如通过ELISA抗原结合来测定。另外,汇集等 体积来自组内每个动物的血清并用来检验血凝抑制(HI)滴度。
表1:使用在果蝇S2表达系统中表达的H5 HA-头部的鼠免疫原性研究 设计
组 佐剂 (250μg) 疫苗抗原 抗原剂量(μg) #鼠 1 GPI-0100 H5 HA头部 3 5 2 GPI-0100 H5 HA头部+H5 M1 3(每个抗原) 9 3 GPI-0100 无 0 9
ELISA分析:流感蛋白(H5 HA头部蛋白和H5 M1蛋白)的抗体 通过ELISA技术使用具有
覆盖特定抗原的孔的小平板格式来滴定。涂 层之后,孔用含缓冲液的血清或清蛋白来中断,然后用碱性磷酸酶或 过氧化物酶共轭的次级抗体进行标准ELISA步骤。
HI分析:在南部研究学会(Frederick,MD)通过标准方法(Kendal 等,CDC(1982)pB-17-B35)进行所述HI分析。
补体结合分析:使用定量微补体结合分析检验鼠血清与流感抗原 的补体结合活性。商业上简单获得的补体(几内亚猪血清)、溶血素 (兔抗
绵羊红血球stromata血清)、和绵羊红血球(Cedarlane Laboratories,Hornby,Ontario,Canada)用作实验指示剂系统并 且使用的最佳浓度通过预备滴定来测定(Lieberman,等,Infect. Immunol.(1979)23:509-521)。纯化抗原和鼠抗血清的稀释液混合 并用稀释的补体缓冲在
冰上培育16小时。无抗原或抗血清的对照被包 括。使用溶血素预先培育增敏的绵羊红血球再加入抗原+抗血清+补 体的混合物中并在37℃培育60分钟。离心反应混合物,在413nm处 测定上清液的吸光度。所得溶血程度与通过抗原/抗血清结合的补体结 合程度成反比,50%补体结合的抗血清稀释液能被测定。因而,不同 流感抗原的抗血清的补体结合活性被直接比较。
脾细胞制备:第2剂后7天在组2和组3的4只鼠上都进行脾切 除术。用每只鼠的脾制备脾细胞悬浮液,用NH4Cl溶解红血球,最后 在细胞培养基中冲洗和再次悬浮细胞颗粒。使用Coulter计数器对每 个悬浮液进行细胞计数,用培养基稀释悬浮液至2x 106个细胞/ml。 来自个体鼠的脾细胞分别培养。
淋巴细胞增殖分析:每个脾细胞悬浮液的等分(0.1ml)分配到 96孔细胞培养皿的孔中。各自的抗原再以终浓度5μg/ml(终体积0.2 ml/孔)加到含每个细胞悬浮液的孔中(一式四份)。含未受激(无抗 原的)细胞悬浮液的孔也被包括。培养物在37℃/5%CO2/湿润地培育7 天,再在每孔中(以0.01ml体积)加入1微居里滴定的(甲基-3H) 胸腺嘧啶(6.7Ci/mmol;ICN Biomedicals,公司,Irvine,CA),继 续培育18小时。过后,细胞培养物被用
真空驱动收割机系统 (Filtermate,Perkin Elmer Life Sciences Co.,Boston MA)收 集在玻璃纤维过滤板上并大冲洗。过滤板再被在顶级计算微板块闪烁 和
荧光计算器(Perkin Elmer Life Sciences Co.,Boston MA)中 分析
放射性。
细胞因子产量分析:每个脾细胞悬浮液的等分(0.5ml)分配到 24孔细胞培养皿的孔中。5μg与用于淋巴细胞增殖相同的抗原再分配 到含每个细胞悬浮液的孔中(终体积1.0ml/孔)。未受激的细胞悬 浮液与对照被检验。培养物在在37℃/5%CO2/湿润地培育4天。培养 物上清液再被收集并冷冻用来分析特定的细胞因子。使用流式细胞计 数珠子排列分析法(BD Biosciences Pharmingen公司,San Diego CA) 分析脾细胞培养物上清液中的细胞因子。
表2.Balb/c鼠上H5 HA-头部诱导的HI抗体滴度
组 佐剂 疫苗抗原 抗原剂量(μg) HI滴度 1 GPI-0100 H5 HA-头部 3 20 2 GPI-0100 H5 HA-头部+H5N1 M1 3(每个抗原) 254a 3 GPI-0100 无 0 <10
a使用滴度为320、320和160的一式三份分析的GMT。
表3.Balb/c鼠上H5 HA-头部诱导的ELISA抗体滴度
抗体滴定的结果显示所有抗原均诱导不错的ELISA抗体滴度。当 鼠使用HA蛋白免疫时HI抗体滴度上升;当鼠同时使用HA和M1蛋白 免疫时特别高的滴度(大于10倍更高)被诱导。
淋巴细胞增殖(图1)和细胞因子产量分析(图2和3)的结果表 明流感抗原能引发不错的细胞免疫应答。当同时使用抗原和GPI-0100 佐剂免疫时,鼠能通过IFN-γ和IL-5(还有TNF-α,IL-2,和IL-4; 数据未示)的增殖和产出应答体外任何抗原的激发。此细胞媒介的免 疫应答能对给特定群体的受试者如老年个体提供抵御流感的保护性免 疫是至关重要的(McElhaney JE,等,J.Immunol.176:6333-6339, 2006)。
实施例6
鼠免疫原性研究#2
S2表达的H5 HA-Ecto和H5 HA-头部亚单位在Balb/c鼠上的免疫原性
S2表达的H5 HA亚单位蛋白的免疫原性,特别是H5 HA-Ecto-mut 和H5 HA-A9-头部,在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周雌性Balb/c 鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗 原的一种制剂同时含或不含alhydrogel(0.5mg/剂)或GPI-0100 (250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。如下表4所示,动物接受 两剂之间间隔4周的疫苗或者3剂前两剂之间间隔4周及第2剂和第 3剂之间间隔6周的疫苗。最后一剂疫苗后两周,动物被施与安乐死 并通过前面实施例4所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反 应性。结果如图4所示。
表4.H5 HA分子在Balb/c鼠上免疫原性研究评价的设计
组 佐剂 疫苗抗原和剂量(μg) #鼠 1 Alhydrogel 无 5# 2 Alhydrogel 15μg H5胞外域S2 5# 3 GPI-0100 无 5# 4 GPI-0100 15μg H5胞外域S2 10* 5 GPI-0100 15μg H5 HA头部S2 5#
*每组中5只鼠接受两次免疫,其它5只接受三次免疫。
#每组中5只鼠接受三次免疫
使用HA胞外域或HA“头部”的ELISA抗体滴定结果表明重组 蛋白是产生免疫性的。当使用佐剂时使用任何抗原都能达到特别高的 抗体滴度,特别在佐剂是GPI-0100时。在佐剂对照组中没有可测的抗 体滴度上升(数据未示)。
实施例7
鼠免疫原性研究#3
含和不含H5N1 M1的S2表达的H3 HA-Ecto在Balb/c鼠上的免疫 原性
含或不含H5 M1亚单位的S2表达的H3 HA-Ecto亚单位的免疫原 性在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌 肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂 同时含或不含矾(0.5mg/剂)或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml 总体积中的佐剂。如下表5所示,动物接受两剂之间间隔4周的疫苗 或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周,动物被施与安 乐死并通过前面实施例4所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白 的
反应性。结果如图5所示。
表5.H3 HA分子在Balb/c鼠上免疫原性研究评价的设计
组 佐剂 疫苗抗原和剂量(μg) 鼠 6 Alhydrogel 无 5 7 Alhydrogel 5μg H3 HA胞外域 5 8 Alhydrogel 5μg H3 HA胞外域+1μg H5 M1 5 9 GPI-0100 无 5 10 GPI-0100 5μg H3 HA胞外域 5
结果表明H3 HA抗原产生免疫性。当佐剂使用矾或GPI-0100时, 免疫原性提高。将M1加入免疫疫苗中没有显著影响HA抗原的滴度。 在佐剂对照组中没有可测的抗体滴度上升(数据未显示)。
实施例8
鼠免疫原性研究#4
+/-M1蛋白的S2表达的H3 HA分子在Balb/c鼠上的免疫原性
含和不含M1蛋白(1-5μg)的S2表达的H3 HA头部和H3 HA胞外 域分子(1-15μg)的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周 雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免 疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含矾(0.5mg/剂)作为0.2 ml总体积中的佐剂或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的 佐剂。动物接受3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周,动 物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本用来检验 与重组蛋白的反应性。
结果表明重组蛋白的免疫原性,甚至抗原低剂量时。使用佐剂的 疫苗接种引发更高水平的抗体。
实施例9
鼠免疫原性研究#5
+/-M1蛋白的S2表达的H5 HA分子在Balb/c鼠上另外的免疫原 性
一剂量内含或不含H5 M1蛋白的S2表达的H5 HA分子的全胞外域 头部或foldons的免疫原性在Balb/c鼠上被进一步评价。5-10只6-8 周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免 疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含矾(0.5mg/剂)或 GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受2剂 之间间隔4周的疫苗或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后 两周,动物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本 用来检验与重组蛋白的反应性。
实施例10
鼠免疫原性研究#6
一剂量内含或不含M1蛋白的S2表达的H3HA-Ecto或H3HA-foldon 亚单位在Balb/c鼠上的免疫原性
一剂量内含或不含M1蛋白的S2表达的H3 HA-Ecto或H3 HA-foldon亚单位的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。6-8周雌性 Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗 作为抗原的一种制剂同时含或不含alhydrogel(0.5mg/剂)或 GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受两剂 之间间隔4周的疫苗或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后 两周,动物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本 用来检验与重组蛋白的反应性。
实施例11
鼠激发研究
进行流感激发研究以评价不同的最佳疫苗制剂。Mock抗原用作对 照。鼠被最低量地免疫两次,最大量地免疫三次,间隔28天使用1-50μg H5抗原(胞外域,胞外域+M1或foldon)。下面实施例中,最后一次 免疫后两周,鼠被用致命剂量的A/Vietnam/1203/04激发。感染后14 天,观察鼠的发病率和死亡率。从鼠中取出
肺以使用标准方法测定病 毒滴度(Lu,等,J.of Virol.(1999)7:5903-5911)。
鼠激发研究的结果显示本文所述H5疫苗抗原保护鼠抵御野生型 H5病毒的致命激发。另外,肺中病毒滴度大大降低。
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序列表
<210>SEQ ID NO:1来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-Ecto
<211>508
<212>PRT
<213>甲型流感病毒-A/Fujian/411/02菌株
<400>1
Gly Ala Arg Ser Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr
20 25 30
Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln
35 40 45
Ser Ser Ser Thr Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp
50 55 60
Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys
65 70 75 80
Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys
85 90 95
Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
100 105 110
Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser
115 120 125
Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys
130 135 140
Arg Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His
145 150 155 160
Leu Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu
165 170 175
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp
180 185 190
Ser Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val
195 200 205
Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg
210 215 220
Pro Arg Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile
245 250 255
Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met
260 265 270
Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro
275 280 285
Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile
290 295 300
Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu
305 310 315 320
Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe
325 330 335
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp
340 345 350
Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala
355 360 365
Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys
370 375 380
Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu
385 390 395 400
Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr
405 410 415
Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
420 425 430
Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
435 440 445
Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu
450 455 460
Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala
465 470 475 480
Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg
485 490 495
Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly
500 505
<210>SEQ ID NO:2来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-Ecto
<211>509
<212>PRT
<213>甲型流感病毒-A/Hong Kong/156/97菌株
<400>2
Gly Ala Arg Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser
1 5 10 15
Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His
20 25 30
Ala Gln Asp Ile Leu Glu Arg Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu
35 40 45
Asn Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp
50 55 60
Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp
65 70 75 80
Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro
85 90 95
Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile
100 105 110
Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn
115 120 125
His Asp Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg
130 135 140
Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala
145 150 155 160
Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu
165 170 175
Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr
180 185 190
Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr
195 200 205
Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn
210 215 220
Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr
245 250 255
Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu
260 265 270
Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala
275 280 285
Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly
290 295 300
Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly
30 5310 315 320
Leu Arg Asn Thr Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu
325 330 335
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val
340 345 350
Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr
355 360 365
Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn
370 375 380
Lys Val Asn Ser Ile Ile Asn Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val
385 390 395 400
Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys
405 410 415
Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu
420 425 430
Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn
435 440 445
Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala
450 455 460
Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn
465 470 475 480
Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr
485 490 495
Ser Glu Glu Ala Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly
500 505
<210>SEQ ID NO:3来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Indonesia/5/05的H5 HA-Ecto
<211>509
<212>PRT
<213>甲型流感病毒-A/Indonesia/5/05
<400>3
Gly Ala Arg Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser
1 5 10 15
Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His
20 25 30
Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu
35 40 45
Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp
50 55 60
Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp
65 70 75 80
Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro
85 90 95
Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile
100 105 110
Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp
115 120 125
His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser
130 135 140
Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu
165 170 175
Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr
180 185 190
Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile GlyThr Ser Thr
195 200 205
Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn
210 215 220
Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr
245 250 255
Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu
260 265 270
Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala
275 280 285
Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly
290 295 300
Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly
305 310 315 320
Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Ser Arg Lys Lys Arg Gly Leu
325 330 335
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val
340 345 350
Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr
355 360 365
Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn
370 375 380
Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val
385 390 395 400
Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys
405 410 415
Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu
420 425 430
Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn
435 440 445
Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala
450 455 460
Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn
465 470 475 480
Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr
485 490 495
Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly
500 505
<210>SEQ ID NO:4来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-A19-头
部
<211>315
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>3
Gly Ala Arg Ser Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser
20 25 30
Ser Thr Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu
35 40 45
Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly
50 55 60
Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr
65 70 75 80
Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn
100 105 110
Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg
115 120 125
Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys
130 135 140
Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe
145 150 155 160
Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Ser Asp
165 170 175
Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr
180 185 190
Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg
195 200 205
Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys
210 215 220
Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro
225 230 235 240
Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser
245 250 255
Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly
260 265 270
Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr
275 280 285
Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
290 295 300
Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg
305 310 315
<210>SEQ ID NO:5来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-A49-头
部
<211>285
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>4
Gly Ala Arg Ser Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp
1 5 10 15
Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys
20 25 30
Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys
35 40 45
Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser
65 70 75 80
Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys
85 90 95
Arg Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His
100 105 110
Leu Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu
115 120 125
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp
130 135 140
Ser Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val
145 150 155 160
Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg
165 170 175
Pro Arg Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile
180 185 190
Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile
195 200 205
Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile
245 250 255
Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu
260 265 270
Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg
275 280 285
<210>SEQ ID NO:6来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-A9-头
部
<211>322
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>5
Gly Ala Arg Ser Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met
1 5 10 15
Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Arg Thr
20 25 30
His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu
35 40 45
Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp
50 55 60
Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Ser
65 70 75 80
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Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser Ser Gly Val Ser
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Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val
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Arg Arg
<210>SEQ ID NO:7来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-G39-
头部
<211>292
<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>6
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65 70 75 80
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Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn
100 105 110
Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg
115 120 125
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130 135 140
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<212>PRT
<213>甲型流感病毒
<400>8
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<213>甲型流感病毒
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115 120 125
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165 170 175
Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr
180 185 190
Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr
195 200 205
Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn
210 215 220
Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn
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Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr
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Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu
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Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly
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Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Ser Arg Lys Lys Arg Gly Leu
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Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr
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Leu
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<210>SEQ ID NO:10来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 N1基质1
<211>256
<212>PRT
<213>甲型流感病毒-A/Hong Kong/156/97菌株
<400>7
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1 5 10 15
Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu
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Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu
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165 170 175
Ile Arg His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala
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Val Ala Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly
210 215 220
Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Ile Glu Asn
225 230 235 240
Leu Gln Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250 255