下面的定义适用于本发明。这些定义取代在通过引用而并入本文中的各个单独的参考文献中所包含的任何矛盾的定义。未定义的字词具有本领域技术人员通常使用的含义。此外,除非上下文另有要求,单数术语应包括复数形式,并且复数术语应包括单数形式。
“约(About)”或”大约(approximately)”当与可测量的数字变量结合使用时,指该变量的指示值,并指该变量在指示值的实验误差内(例如,在平均值的95%置信区间内)或在指示值的10%内(取其较大者)的所有值。如果“约”用于以周计的时间间隔,则“约3周”为17至25天,而“约2至约4周”为10至40天。
如本文所用的“佐剂”指用作免疫应答的非特异性刺激剂的任何物质。参见下文对佐剂的进一步描述。
如本文所用的,“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及后来被修饰的那些氨基酸,例如羟基脯氨酸、羧基谷氨酸和O-
磷酸丝氨酸。20种常规氨基酸的立体异构体(例如,D-氨基酸)、非天然氨基酸如α和α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸以及其他非常规氨基酸也可以是用于本发明的多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括:4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-Ν,Ν,Ν-三甲基赖氨酸、ε-Ν-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、
5-羟基赖氨酸、σ-Ν-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸。这些氨基酸在本文中可用它们公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的它们的单字母符号表示。如本文所用的,“
抗体”是包含抗原结合位点的任何多肽,而不论其来源、生产方法或其他特征如何。抗体是指由于对抗原的免疫应答而导致与该抗原特异性结合的免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白是由具有“恒定”和“可变”区的“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白质,并基于恒定区的组成而被分成多个类别(例如,IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。在
哺乳动物和禽类中,免疫球蛋白M(IgM)、IgG和IgY同种型在全身应答中发挥主导作用,而IgA是粘膜表面的关键参与者。硬骨鱼是包含免疫球蛋白的最原始的有骨
脊椎动物,并且与哺乳动物和禽类相比,多数硬骨鱼中的血清IgM表达为四聚体,虽然也曾描述了IgM
单体。
另外,硬骨鱼缺乏IgA或IgA的功能等同物,尽管最近的研究已经增加了两种新的免疫球蛋白分子,IgD和IgT/IgZ,其中IgT被报道为专
门用于肠粘膜免疫的免疫球蛋白。对给定抗原具有“特异性”的抗体表示该抗体的可变区唯一地识别并结合特定抗原。该术语包括但不限于:多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多重特异性抗体、单链抗体、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单链抗体、
嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR嫁接抗体。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白,或者可以是完整免疫球蛋白的免疫
反应性部分。“抗体”可以转
化成抗原结合蛋白质,其包括但不限于抗体片段,该抗体片段包括但不限于:Fab、F(ab')2、Fab'片段、Fv片段、单链Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段、双抗体(diabody)、CDR3肽、约束的FR3-CDR3-FR4肽、纳米抗体、二价纳米抗体、小模
块化免疫药物(SMIP)和迷你抗体以及上述任何片段及其化学或遗传处理的对应物,以及保留抗原结合功能的其他抗体片段。通常,此类片段将包含抗原结合域。
本领域技术人员将会认识到,可将任何此类分子工程化(例如,“种系化(germlined)”),以降低其免疫原性,提高其亲和力,改变其特异性,或用于其他目的。
如本文所用的,“抗原”或“免疫原”是指包含一个或多个表位(线性、构象,或两者)的分子,该分子在暴露于受试者时将诱发对该抗原具有特异性的免疫应答。表位是与T细胞受体或特异性抗体结合的抗原的特异性位点,并且一般包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。术语抗原指亚单位抗原——抗原从在自然中与该抗原相关联的完整生物体中分离并离散——以及整个杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、
真菌、寄生虫或其他
微生物。术语抗原还指抗体,如抗独特型抗体或其片段,并指可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位。术语抗原还指在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸,例如在DNA免疫应用中。
如本文所用的,“抗原性”是指蛋白质或多肽可以被针对该蛋白质或多肽的抗体免疫特异性结合的能力。
“缓冲液”是指防止另一种化学物质的浓度发生变化的化学系统。质子供体和受体系统充当缓冲液,防止氢离子浓度(pH)的显著变化。缓冲液的进一步实例是含有弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。
如本文所用的,术语“细胞系”或“宿主细胞”意指病毒可以在其内复制或保持的原核或真核细胞。
如本文所用的,术语“培养物”意指在不存在其他物种或种类的情况下生长的细胞或微生物群体。
“剂量”是指给予受试者的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“引发剂量”是指在第0天给予的这样的组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“每年剂量”是指第一剂量后给予的这样的组合物的量,其可以是但并非必须是与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
“表位”是抗原的特异性位点,它与T细胞受体或特异性抗体结合,并且通常包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。
如本文所用的“赋形剂”是指不是抗原的疫苗或免疫原性组合物的非反应性载体组分。
优选的赋形剂是在浸泡疫苗领域中公知的赋形剂。
术语“鱼”是指可以用本发明的疫苗组合物治疗的冷水和温水鱼。可通过本发明的方法治疗的鱼包括易患由特定生物体或病原体引起的感染和疾病的任何鱼。这类鱼可以是海洋鱼或咸水鱼。用于本发明方法的合适的鱼的实例包括:鲑科鱼(大
马哈鱼属的种(Oncorhynchus sp.)和斑鳟属的种(Salmo sp.)),美国、欧洲和日本鳗鱼(鳗鲡属的种(Anguilla sp.)),罗非鱼(Oreochromis sp.),条纹鲈鱼和杂交条纹鲈鱼(金眼狼鲈(Morone chrysops)和条纹狼鲈(M.saxatilis)),比目鱼(鰤属的种(Seriola sp.)),海鲷(Sparus sp.),海鲈(尖吻鲈(Lates calcarifer)),河口石斑鱼(Epinephelus tawine),白斑鱼(Stitzostedion vitreum),斑点叉尾鮰(Ictalurus punctutus),centrachid(如大口鲈鱼,大口黑鲈(Micropterus salmoides)),
云斑鮰(Nebulosus sp.),肥头鲦鱼(黑头软口鲦(Pimephales promelas)),金体美鳊鱼(Netemigonus crysoleucas),鲤鱼(Cyprinus carpio),金枪鱼的所有种,观赏鱼种,如黑玛丽鱼(黑花鳉(Poecilia sphenops)),新月鱼(斑点剑尾鱼(Xiphosphorus maculatus)),海七鳃鳗(Petromyzon marinus),丁鲷(Tinea tinea),鲫鱼(欧鲫(Carassius carassius)),金鱼(Carassius auratus),香鱼(Plecoglossus altivelis),
淡水鲦鱼(宽鳍鱲(Zacco platypus))以及河鲈(Perca fluviatilis),斜齿鳊(Rutilus rutilus)和海鲈鱼(鮨科的种(Serranidae sp.))。在一个优选的实施方案中,鱼用于水产养殖。
“片段”是指蛋白质或基因的截短部分。“功能性片段”和“生物活性片段”是指保留了全长蛋白质或基因的生物学性质的片段。
“同源性”或“百分同源性”是指在比对序列并且如果需要的话引入缺口以获得最大百分序列同源性之后,并且也将任何保守置换考虑为序列同源性的一部分,在候选序列中与比对序列中的残基相同或相似的核苷酸或氨基酸残基的百分比。在一个优选的方面,本文提供的多核苷酸或氨基酸序列具有大于约60%的序列同源性,大于约70%的序列同源性,大于约80%的序列同源性,大于约90%的序列同源性,大于约95%的序列同源性,大于约
96%的序列同源性,大于约97%的序列同源性,大于约98%的序列同源性,或大于约99%的序列同源性。
“同一性”或“百分同一性”是指在比对两个序列并且如果需要的话引入缺口以获得最大百分序列同一性之后,并且不将任何保守置换考虑为序列同一性的一部分,在候选序列中与比对序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸的百分比。在一个优选的方面,本文提供的多核苷酸或氨基酸序列与参考序列(例如,SEQ ID NO:2、4或6)具有大于约60%的序列同一性,大于约70%的序列同一性,大于约80%的序列同一性,大于约90%的序列同一性,大于约95%的序列同一性,大于约96%的序列同一性,大于约97%的序列同一性,大于约
98%的序列同一性,或大于约99%的序列同一性。
“浸泡疫苗”涉及包围、环绕或包覆鱼表面并导致针对特定病原体的接种的溶液或溶液的预混合物。浸泡疫苗包括浸式疫苗以及浴式疫苗,在浸式疫苗中,将鱼短暂地浸没在溶液中,在浴式疫苗中,将鱼浸泡在溶液中一段时间,例如数小时甚至数天。
如本文所用的,受试者中的“免疫应答”是指发展出对抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答。“体液免疫应答”是指至少部分地由抗体介导的免疫应答。“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞或其他白细胞或此两者介导的免疫应答,并且包括产生细胞因子、趋化因子和由活化的T细胞、白细胞或此两者产生的类似分子。免疫应答可以使用本领域中已知的标准免疫试验和中和试验来确定。
如本文所用的,“免疫原性”是指蛋白质或多肽引发针对引起所述疾病的细菌或病毒的免疫应答的能力。
“免疫原性组合物”是这样一种制剂:其含有免疫原,包括,例如蛋白质,肽,完整细胞,灭活的、亚单位或减毒的病毒,或多糖,或它们的组合,经施用以针对存在于免疫原性组合物中的一种或多种抗原来刺激受体的体液和细胞免疫系统。“免疫”是在宿主中施用免疫原性组合物并刺激对抗原的免疫或免疫原性应答的过程。优选的宿主是鱼,诸如在水产养殖中使用的鱼。优选地,免疫原性组合物是疫苗。
如本文所用的,“免疫学保护量”是在受体中有效地诱导免疫原性应答的抗原的量,该抗原量足以预防或改善疾病的体征或症状,包括不良健康影响或其并发症。可诱发体液免疫或细胞介导的免疫或此两者。动物对组合物的免疫原性应答例如可在用野生型菌株攻击后通过测量抗体滴度、淋巴
细胞增殖试验间接地评估,或者通过监测体征和症状直接地评估。由组合物或疫苗所赋予的保护性免疫可通过测量以下指标来评估,例如,攻击生物体的排出的减少,临床体征如死亡率、发病率的降低、体温和受试者的总体身体状况、健康和表现。免疫应答可以包括但不限于:细胞和/或体液免疫的诱导。治疗有效的组合物或疫苗的量可以根据所使用的具有生物体或正在接受治疗或接种疫苗的动物的状况而变化,并且可由兽医来确定。
术语“分离的”是指这样的物质:其或者为基本上纯的形式,例如大于约95%的纯度,或者以某种方式从其天然环境中纯化、富集或移取。提及“分离的”表示一种物剂,如蛋白质,其移取自其天然环境,例如宿主动物/鱼,在生长培养基中,重组产生,或者从全细胞细菌制剂中纯化,并且随后可加回到含有其他活性物或抗原的组合物中。术语“分离的”涵盖在含有其他物剂/稀释剂/赋形剂/佐剂/蛋白质的溶液中的免疫原。优选地,本文所述的疫苗组合物是分离的。
“药剂”是指可用于预防、治愈或改善医学状况或预防某些生理状况或发生的任何物剂。
如本文所用的,“单克隆抗体”是指由杂交瘤细胞的单个系产生的抗体,它们均针对特定抗原上的一个表位。用于制备单克隆抗体的抗原可作为病原体的分离蛋白质或整个病原体而提供。“杂交瘤”是由通过融合骨髓瘤细胞和特异性抗体生产细胞而形成的杂合细胞组成的克隆细胞系。通常,单克隆抗体是小鼠来源的。然而,单克隆抗体也指通过
噬菌体展示技术或与噬菌体展示等同的方法或非小鼠来源的杂合细胞产生的,针对抗原的特定表位而形成的抗体的克隆群。
如本文所用的,“肠胃外施用”是指通过或经由不包括消化道的途径,向受试者体内引入物质,例如组合物或疫苗。肠胃外施用包括皮下、肌肉内、动脉内和静脉内施用。就本发明而言,肠胃外施用排除了主要涉及物质穿过口、鼻、气管和
肺中的粘膜组织而转运的施用途径。
如本文所用的,术语”病原体”或“病原微生物”意指微生物—例如柱状黄杆菌(F.columnare)、嗜冷黄杆菌(F.psycrophilum)、海洋粘着杆菌(T.maritimum)和传染性胰坏死病毒(IPNV)—其能够在其宿主动物、优选受疾病影响的鱼中诱发或引起疾病、病患或异常状态。
“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内,适合与受试者的组织
接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应等,与合理的利益/风险比相称,并且对于其预期用途有效的物质。
如本文所用的,“多克隆抗体”是指对特定病原体或抗原产生的抗体的混合群体。通常,该群体包含多种抗体组,各个组对应于病原体或抗原的特定表位。为了制备多克隆抗体,通过接种或感染向宿主中引入完整病原体或分离的抗原,这诱导宿主产生针对该病原体或抗原的抗体。
如本文所用的,术语“多核苷酸”意指由在链中共价键合的核苷酸单体组成的有机
聚合物分子。DNA(脱
氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有独特生物功能的多核苷酸的实例。
如本文所用的,术语“多肽”意指由在链中键合的两个或更多个氨基酸组成的有机聚合物分子。
如本文所用的,“预防感染”意指防止或抑制引起所述疾病的细菌或病毒的复制,用以抑制细菌或病毒的传播,用以防止细菌或病毒在其宿主内建立其本身,或用以减轻由感染引起的疾病的症状。如果存在细菌或病毒载量的减少,则认为该治疗是治疗性的。
如本文对于疫苗或其他组合物所使用的,“防护”、“保护”、“保护性免疫”等意指该疫苗或组合物防止或减少由在该疫苗或组合物中使用的抗原所源自的生物体引起的疾病的症状。术语“防护”、“保护”等还意指该疫苗或组合物可以用于“治疗”疾病或者已经存在于受试者中的疾病的一种或多种症状。
“相对百分生存率”(RPS)可以如下定义或计算:RPS={1-(%接种死亡率/%对照死亡率)}×100。
如本文所用的,“呼吸系统施用”是指通过或经由喷雾的(雾化的)物质的吸入,向受试者体内引入物质,如疫苗或其他组合物。在呼吸系统施用中,主要
输送机制涉及雾化物质穿过气管、支气管和肺中的粘膜的吸收,并因此不同于鼻内或经口施用。
术语“特异性结合”、“特异性地结合”及类似术语被定义为形成复合物的两个或更多个分子,该复合物在生理或试验条件下是可测量的并且是选择性的。如果在适当选择的条件下,这样的结合基本上不受抑制,而同时非特异性结合受到抑制,则抗体或其他
抑制剂被称为与蛋白质“特异性地结合”。特异性结合的特征在于高亲和力并且对化合物或蛋白质是选择性的。非特异性结合通常具有低亲和力。在IgG抗体中的结合,例如,通常其特征在于-7 -8 -9 -10
至少约10 M或更高,例如至少约10 M或更高,或至少约10 M或更高,或至少约10 或更-11 -12
高,或至少约10 M或更高,或至少约10 M或更高的亲和力。该术语也适用于以下情况,例如,抗原结合域对并非被许多抗原所携带的特定表位是特异性的,在这样的情况下,携带抗原结合域的抗体通常将不结合其他抗原。
如本文所使用的,“特异性免疫原性片段”是指序列的一部分,其可被对该序列具有特异性的抗体或T细胞识别。
如本文所使用的,“受试者”是指任何具有免疫系统的动物,优选鱼。
如本文所使用的,“基本上相同”是指至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约
97%、至少约98%或至少约99%的序列同一性的程度。
如本文所使用的,“亚单位疫苗”和“亚单位组合物”是指一种类型的疫苗或组合物,其包含一种或多种抗原,但并非全部抗原,这些抗原来源于来自感兴趣的病原体(如病毒、细菌、寄生虫、真菌或真菌样生物体)的抗原或与该抗原同源。这样的组合物或疫苗基本上不含完整的病原
体细胞或病原性颗粒,或者这类细胞或颗粒的裂解物。因此,亚单位疫苗或亚单位组合物可由来自病原体的至少部分纯化的或基本上纯化的免疫原性多肽或其类似物来制备。获得亚单位疫苗或亚单位组合物中的一种或多种抗原的方法包括标准的纯化技术、重组生产或化学合成。因此,“亚单位疫苗”或“亚单位组合物”是指由病毒、细菌或其他免疫原的一种或多种限定的抗原性组分所组成的疫苗或组合物。本发明的亚单位组分可通过重组产生,并且可包含IPNVVP2抗原和/或嗜冷黄杆菌抗原。
如本文所使用的“T细胞表位”是指能够增强在目标生物体中的T细胞应答的抗原或抗原片段。如本文所使用的特异性T细胞表位在美国专利号8,168,201(在其中称为“混杂的T细胞表位”或“PTCE”)中描述,该专利的内容通过引用并入于此,犹如在本文中充分阐述。
特别地,美国专利号8,168,201中被
指定为SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6和7的T细胞表位序列在此并入本文。这些序列可与本申请中列出的任何氨基酸序列偶联或融合,以形成本发明的免疫原性组合物或抗原。
“TCID50”是指“组织培养感染剂量”,并被定义为感染给定批次的接种细胞培养物的50%所需要的病毒的稀释度。有多种方法可用于计算TCID50,包括斯皮尔曼-卡伯(Spearman-Karber)法,其应用于整个
说明书中。关于斯皮尔曼-卡伯法的描述,请参见B.W.Mahy和H.O.Kangro,Virology Methods Manual 25-46(1996)。
如本文所使用的,“治疗剂”是指任何分子、化合物、病毒或治疗,优选减毒的或杀死的病毒,或亚单位或化合物,其有助于治疗病毒、细菌、寄生虫或真菌感染、由此引起的疾病或病况。
如本文所使用的,“
治疗有效量”是指抗原或疫苗或组合物会在受试者(例如,鱼)中诱发免疫应答的量,该受试者接受足以预防或减轻由诸如病毒、细菌、寄生虫、真菌或真菌样生物体的病原体感染而引起的疾病(包括其不良健康影响或并发症)的体征或症状的抗原或疫苗或组合物。可诱发体液免疫或细胞介导的免疫,或者体液免疫和细胞介导的免疫两者。动物对抗原、疫苗或组合物的免疫原性应答可在用野生型菌株攻击后通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖试验间接地评估,或者通过监测体征和症状直接地评估。疫苗或组合物所赋予的保护性免疫可通过测量排出的攻击生物体的减少,和/或临床体征如死亡率、发病率的降低、体温以及受试者的总体身体状况、健康及表现来评估。疫苗或组合物在治疗上有效的量可根据所用的具体免疫原或受试者的状况而变化,并且可由本领域技术人员确定。
如本文所使用的,“治疗”(“Treat”或“treating”)是指逆转、缓解、预防该术语所适用的病症、病况或疾病,抑制其进展,或者指预防该病症、病况或疾病的一种或多种症状。
如本文所使用的,“疫苗”或“疫苗组合物”是指选自病毒或细菌的免疫原性组合物,优选为分离的亚单位的形式。向受试者施用疫苗导致免疫应答。疫苗可通过任何已知的给药途径,优选通过浸泡而直接引入受试者中。该术语意指预防或减轻感染或者预防或减轻感染的一种或多种体征或症状的组合物。疫苗组合物对抗病原体的保护作用通常通过在受试者中诱发免疫应答来实现。一般而言,被感染的受试者的感染发生率的取消或降低、体征或症状的减轻或者微生物的
加速消除指示了疫苗组合物的保护作用。
抗原、免疫原性组合物和疫苗
本发明基于以下意外的发现:在浸泡疫苗中包含分离的抗原导致基本上改善的功效、效率和安全性。即,当组合物在病原性攻击之前施用于鱼时,其防止疾病的发作,而且不会导致不良
副作用。
本发明所包括的病毒可在细胞、细胞系和宿主细胞中繁殖。所述细胞、细胞系或宿主细胞可以是,例如但不限于,哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞,包括昆虫和
植物细胞。本发明所包括的病毒可在其中繁殖的细胞、细胞系和宿主细胞是容易为本领域技术人员所知并且可获得的。
本发明所包括的细菌可使用本领域普通技术人员已知的各种培养基来培养和繁殖,该培养基包括肉汤(液体)和琼脂(固体;半固体)培养基。一些细菌还可在哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中培养和繁殖。
本发明所包括的病毒和细菌可在用于免疫原性组合物或疫苗之前进行减毒或灭活。减毒和灭活的方法是本领域技术人员所熟知的。用于减毒的方法包括但不限于,在合适的细胞系上在细胞培养物中连续传代(病毒和一些细菌)、在肉汤培养物中连续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)以及化学诱变(病毒和细菌)。用于病毒或细菌灭活的方法包括但不限于,用福尔马林、β丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)处理,或本领域技术人员已知的其他方法。
用福尔马林灭活可通过将含有微生物的悬浮液与37%甲
醛混合成0.5%的最终甲醛浓度来进行。微生物-甲醛混合物通过在室温下连续搅拌约24小时来混合。随后通过测定在合适的细胞系或肉汤培养基上的生长来检测灭活的微生物混合物中残余的活生物体。
对于一些抗原,BEI灭活可通过将含有本发明的微生物的悬浮液与0.1M BEI(在
0.175N NaOH中的2-溴-乙胺)混合成1mM的最终BEI浓度来进行。对于其他抗原,最终的BEI浓度为2mM。本领域技术人员将知晓合适的使用浓度。病毒-BEI混合物通过以下步骤混合:在室温下持续搅拌约48小时,随后加入1.0M
硫代硫酸钠至0.1mM的最终浓度。
继续混合另外两小时。通过测定在合适的细胞系或肉汤培养基上的生长来检测含有灭活微生物的混合物中残余的活病毒。
本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可包含一种或多种药学上可接受的载体,该载体包括任何及所有的
溶剂、分散介质、包衣剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、
防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、
吸附延迟剂等。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、
乙醇、甘油等。等渗剂可包括
氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖,以及本领域技术人员已知的其他稀释剂。稳定剂包括
白蛋白以及本领域技术人员已知的其他稳定剂。防腐剂包括硫柳汞以及本领域技术人员已知的其他防腐剂。
可添加至本文所述的浸泡疫苗中的具体物剂包括:嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌、鳗弧菌、杀鲑弧菌、鲑鱼肾杆菌、传染性造血组织坏死病毒(IHNV)、传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、特别是胰腺疾病病毒(PDV)、鲑鱼甲病毒(SAV)、鲑鱼痘病毒和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
可包含在本文所述的疫苗中的佐剂可以是可代谢的,即指由能够被
目标物种所代谢的组分组成的佐剂,如基于
植物油的佐剂。可代谢的佐剂可以是可代谢的油。可代谢的油为通常存在于植物和动物中的脂肪和油,并且通常主要由三酰甘油(也称为甘油三酯)或中性脂肪的混合物组成。这些非极性的水不溶性物质是甘油的
脂肪酸三酯。三酰甘油根据其三个脂肪酸残基或
侧链的性质和布置的不同而不同。
佐剂也可以是不可代谢的,即指由不能被施用乳液的动物的身体所代谢的组分组成的佐剂。适用于本发明组合物的不可代谢油包括烷
烃、烯烃、炔烃以及它们相应的酸和醇、其醚和酯,及其混合物。优选地,油的各个化合物是轻质烃化合物,即,这些组分具有6至30个
碳原子。该油可以合成地制备或从石油产物中纯化。用于本文所述组合物的优选的不可代谢油包括,例如矿物油、石
蜡油和环烷烃。术语“矿物油”指不可代谢的佐剂油,其为通过蒸馏技术从矿脂中得到的液体烃的混合物。该术语与“
液化石蜡”、“液体矿脂”和“白矿物油”同义。该术语还意在包括“轻质矿物油”,即类似地通过蒸馏矿脂得到的,但比重略低于白矿物油的油。矿物油可获自各个商业来源,例如,J.T.Baker(Phillipsburg,PA)、USB Corporation(Cleveland,OH)。轻质矿物油能以商品名 商购获得。
佐剂包括但不限于Emulsigen佐剂系统(MVP Laboratories;Ralston,NE)、RIBI佐剂系统(Ribi Inc;Hamilton,MT)、明矾、氢氧化
铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液(例如,弗氏完全和不完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx;Atlanta,GA)、SAF-M(Chiron;Emeryville,CA)、佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.;Cambridge,MA)、
GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.;Birmingham,AL)或其他皂苷级分、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的(重组或其他形式的)热不稳定肠毒素、霍乱毒素、胞壁酰二肽、
角鲨烯/普朗尼克(pluronic)嵌段共聚物/
表面活性剂(SP-油)、磺基脂β(sulpholipobeta)-环糊精(SL-CD)、含有免疫调节剂(例如,CpG或poly I:C)的脂质体、胞壁酰二肽(MDP)、iscomatrix(Quil A/磷脂酰胆碱)、CpG/DEAE-葡聚糖/矿物油(TXO)、CpG、三萜类化合物(例如,Quil A或另一种纯化的或部分纯化的皂苷制剂)、甾醇(例如,胆固醇)、免疫调节剂(例如,溴化二甲基双十八烷基铵-DDA)、聚合物(例如,聚
丙烯酸如 )和Th2刺激剂(例如,糖脂,如Bay ),以及它们的
组合,以及本领域技术人员已知的许多其他佐剂。
可使用的各种组合的非限制性实例包括三萜加甾醇(例如,Quil A/胆固醇,也称为QAC),三萜加甾醇、免疫调节剂和聚合物(例如,Quil A/胆固醇/DDA/ ,
也称为QCDC),和三萜加甾醇、免疫调节剂、聚合物和Th2刺激剂(例如,Quil A/胆固醇/DDA/ 和BayR ,也称为QCDCR)。
在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度可容易地由本领域技术人员来确定。在一个实施方案中,本发明考虑包含约20μg至约2000μg的佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中,所包含的佐剂的量为约100μg至约1500μg,或约250μg至约1000μg,或约350μg至约750μg。在另一个实施方案中,以约500μg/2ml免疫原性组合物或疫苗剂量的量包含佐剂。
免疫原性组合物和疫苗还可包含抗生素。此类抗生素包括但不限于选自氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、多肽类、喹诺
酮类、磺胺类和
四环素类的那些抗生素。在一个实施方案中,本发明考虑包含约1μg/ml至约60μg/ml的抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中,该免疫原性组合物和疫苗包含约5μg/ml至约55μg/ml的抗生素,或约10μg/ml至约50μg/ml的抗生素,或约15μg/ml至约
45μg/ml的抗生素,或约20μg/ml至约40μg/ml的抗生素,或约25μg/ml至约35μg/ml的抗生素。在又一个实施方案中,该免疫原性组合物和疫苗包含少于约30μg/ml的抗生素。
本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗可包含一种或多种编码病毒或细菌或者病毒或细菌蛋白质的多核苷酸分子。DNA或RNA分子可以在该免疫原性组合物或疫苗中使用。
DNA或RNA分子可以在不存在其他物剂的情况下施用,或者它可以与促进细胞摄取的物剂(例如,脂质体或阳离子脂质)一起施用。该免疫原性组合物或疫苗中的多核苷酸总量通常为约0.1μg/ml至约5.0mg/ml。在另一个实施方案中,该免疫原性组合物或疫苗中的多核苷酸总量为约1μg/ml至约4.0mg/ml,或约10μg/ml至约3.0mg/ml,或约100μg/ml至约
2.0mg/ml。使用核酸(DNA或mRNA)的疫苗和疫苗接种程序已在本领域中进行了很好的描述,例如,美国专利号5,703,055、美国专利号5,580,859、美国专利号5,589,466,所有这些专利均通过引用并入本文。
除了上文描述的病毒或细菌,本发明所包括的免疫原性组合物和疫苗还可包含其他另外的抗原。抗原可为灭活的完整或部分微生物制剂的形式,或者为通过遗传工程技术或化学合成获得的抗原分子的形式。适合根据本发明使用的其他抗原包括但不限于来源于病原性病毒如IPNV的那些抗原。
施用
在本发明的一个优选实施方案中,对鱼接种一定量的重组抗原,其有效地针对由与该抗原所源自的病原体相同的物种所引起的疾病提供保护,其中将鱼浸泡于含有抗原的水中在鱼中产生免疫应答,优选提供对抗该病原体的保护。鱼的皮肤上皮和鳃具有以宽泛的以及特定的方式保护鱼的机制,从而有效地使它们识别它们已接触到的病原体。当将鱼浸泡于含有稀释的疫苗的水中时,来自该疫苗的悬浮的抗原可被皮肤和鳃吸收。随后存在于皮肤和鳃上皮中的特化细胞,如抗体分泌细胞,将被激活,并在后期暴露于活病原体时对鱼提供保护。位于皮肤和鳃的上皮中的其他细胞,如抗原呈递细胞(巨噬细胞),也吸收疫苗抗原,并将它们运送到专门的组织,在那里建立起全身性免疫应答。
在浸泡接种中,存在几种施加方法,包括浸式和浴式。在浸式接种中,将鱼浸没于高度浓缩的疫苗溶液(通常为1份疫苗产品对9份水)中非常短的持续时间,通常为30秒。对于浴式接种,将鱼在较低的疫苗浓度下暴露较长的一段时间,通常为一至几个小时。本发明对于浸泡疫苗既考虑浸式方法也考虑浴式方法。另外,可通过本领域技术人员已知的喷雾技术使鱼暴露于疫苗组合物。
使用和施用浸泡疫苗的技术在以下专利中公开,这些专利的内容通过引用而并入,犹如在本文中充分阐述。美国专利号6,518,252涉及用于减少
水生动物的感染负荷的浸浴法。美国专利号6,893,667涉及使用无针注射技术将粉末状核酸分子的制剂递送至脊椎动物组织中以供组织中的细胞转化的方法。美国专利号6,872,386涉及一种口服疫苗,其包含用作待接种的水生动物的食物的多细胞生物体,以及供应给该多细胞生物体并因此被该多细胞生物体生物包封的单细胞生物体。美国专利号6,855,372涉及用于涂覆皮肤穿刺显微投影体的方法和设备。美国专利号6,673,374涉及一种抗微生物组合物,其用于治疗受不同病因的皮炎影响的人体皮肤,由过氧化氢、一种或多种
保湿剂和抗炎剂制成;且任选地包含
去角质剂;该专利中的组合物可掺入本文所述的浸泡疫苗中。美国专利号6,699,907涉及由极性亲脂性溶剂和具有8至14个碳的脂肪酸制成的抗微生物作用组合物。美国专利号4,009,259涉及用于治疗鱼并提高疫苗或消毒剂的效率的方法,其中将鱼浸没于高渗溶液中2至3分钟,随后浸没于浸泡疫苗或化疗溶液的另一溶液中。这些溶液由
硫酸盐、氯化物或
磷酸盐形式的钠、
钾、
钙和镁盐制成。美国专利号4,282,828涉及通过在喷雾中直接洒布疫苗而施加浸泡疫苗的设备。将鱼限制在矩形接受器中,在那里使鱼暴露于这样的浸浴程序。美国专利号4,287,179涉及通过以非加压浸泡的形式简单地施加浸泡疫苗来将该疫苗应用于红口病(耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病(yersiniosis))的程序。美国专利号
4,363,290涉及用于施加一种或多种浸泡疫苗的自动设备,该设备由将鱼引导至含有疫苗溶液的隔室内,并且随后一旦所需的浸泡接触时间结束,就使鱼朝向它们的外部栖息地转移的装置组成。
在其中浸泡鱼的水可以是淡水、咸水或半咸水,这取决于待治疗的鱼的品种和鱼的自然栖息地。递送至鱼的抗原的量是有效地针对由病原体引起的疾病提供保护的量。例如,在其中浸泡鱼的水中的抗原的量有效提供保护。将鱼浸泡于水中,或用含有抗原的
流体喷射一段时间,该时间足以发展出对抗由野生型病原体引起的疾病的保护。通常,15秒至数小时的浸泡时间适合于本发明的方法。优选地,浸泡时间为1分钟至2小时。更优选地,浸泡时间为15分钟至2小时。最优选的浸泡时间为30分钟至1小时。
就本发明而言,当已经获得对抗疾病的完全或部分免疫时,认为由本发明的方法引起的对抗该疾病的保护已经引发。当根据受感染的鱼的数目或疾病的严重程度的降低所证实的,对于所治疗的鱼的群体的保护水平在已根据本发明治疗的鱼中高于在未接种疫苗的对照组中时,认为已在该群体中获得了免疫。优选地,与未接种疫苗的对照相比,根据本发明的方法的疫苗接种将导致由疾病引起的死亡率或表现出该疾病的临床体征的个体的数目下降20%。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含治疗有效量的一种或多种上述微生物。纯化的病毒和/或细菌可直接用于免疫原性组合物或疫苗中,或者可进一步减毒或灭活。通常,免疫
2 12 3 11
原性组合物或疫苗含有约1×10至约1×10 个病毒或细菌颗粒,或约1×10 至约1×10
4 10 5 9 6
个颗粒,或约1×10至约1×10 个颗粒,或约1×10 至约1×10 个颗粒,或约1×10 至约
8
1×10个颗粒。免疫原性组合物或疫苗中有效提供保护作用的微生物的精确量可由本领域技术人员来确定。
根据本发明的方法,可向动物施用单次剂量,或可替代地,可以以约两周至约十周的间隔进行两次或更多次接种。可能需要加强方案,且可调整剂量方案以提供最佳的免疫。本领域技术人员可以容易地确定最佳施用方案。
可通过使用本领域技术人员已知的合适的配制技术,诸如掺入包括缓冲液、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精等
溶解度增强剂,来提高在制备肠胃外溶液中使用的材料的溶解度。
可通过使用多种技术来评估在动物中诱发的免疫应答的程度和性质。例如,可从接种的动物中采集血清,并检测血清中是否存在免疫原特异性抗体。可通过诸如T细胞增殖的试验来实现对淋巴组织中有响应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测,该CTL指示细胞免疫应答的诱发。相关技术已在本领域中充分描述。
试剂盒
由于免疫原性组合物或疫苗与另外的组合物或化合物联合施用—例如,为达到治疗特定疾病或病况的目的—可能是理想的,因此免疫原性组合物或疫苗可方便地包含于或组合于适合施用或共同施用该组合物的试剂盒的形式中在本发明的范围内。
因此,本发明所包括的试剂盒可包含一种或多种单独的药物组合物,其中至少一种是根据本发明的免疫原性组合物或疫苗;以及用于分别保持所述组合物的装置,诸如容器、分
装瓶或分装箔包。这样的试剂盒的实例是
注射器和针,等等。本发明的试剂盒特别适用于施用不同的剂型,例如,口服或肠胃外剂型,用于以不同的剂量间隔施用单独的组合物,或用于滴定可以被相互测定的单独的组合物。为帮助人们施用本发明所包括的组合物,该试剂盒通常包含施用指导说明。
本发明所包括的另一种试剂盒可包含一种或多种可用于检测受感染的动物的试剂。该试剂盒可包含用于分析样品中是否存在完整微生物、多肽、表位或多核苷酸序列的试剂。可使用抗体、PCR、杂交以及本领域技术人员已知的其他检测方法来确定病毒、细菌、多肽或多核苷酸序列的存在。
本发明所包括的另一种试剂盒可提供用于检测抗特定表位的抗体的试剂。此类试剂可用于分析样品中抗体的存在,并且容易被本领域普通技术人员知晓并获得。可使用本领域技术人员已知的标准检测方法来确定抗体的存在。
在某些实施方案中,该试剂盒可包括一组打印的说明书,或指示该试剂盒可用于检测受感染的动物的标签。
总的克隆策略和疫苗/抗原构建
嗜冷黄杆菌抗原CM8(SEQ ID NO:7)
供体基因为276bp基因序列(Fp91),其编码来自嗜冷黄杆菌的91aa组蛋白样DNA结合TM
蛋白质的86aa截短形式(称为8)(GenBank 登录号AAR29587)。
所述组蛋白样蛋白质基因的上游为前导序列,称为C。序列C编码食纤维梭菌
(Clostridium cellulovoran)的
纤维素结合蛋白前体的90个氨基酸的片段;C所源自的纤TM
维素结合蛋白前体由1848个氨基酸组成(GenBank 登录号P38038)。序列C之后为来源于含有BamHI和Nde I限制位点(它们之间存在短间隔区)的DNA序列的另外6个氨基酸。
90个氨基酸的肽片段C用于促进高水平表达,并确保作为包涵体的靶蛋白质在大肠杆菌中的不溶性。
紧随前导序列C的是片段M,片段M编码来自麻疹病毒融合肽(MVF)的15个氨基酸的TM
免疫刺激肽(GenBank M81903)(L S E I K G V I V H R L E G V)。MDNA区段(代表T细胞表位)进行优化,用于在大肠杆菌中进行高水平表达。(Kuzyk,Burian等人.2001)。
没有DNA片段携带任何调节元件。大肠杆菌特异性的转录和翻译
信号由一个(多个)表达质粒提供。
表达盒由核糖体结合位点序列、肽C前导序列、T细胞表位“M”和编码蛋白质抗原“8”的嗜冷黄杆菌基因(Fp91)组成,并如下构建:
为了努力促进在大肠杆菌中的高表达水平,将N-末端融合肽与供体基因融合。将编码前导肽C和核糖体结合位点(RBS)的片段“C”克隆至pET21a(+)(Novagen)的XbaI和Bam HI位点之间,从而产生质粒pETC。使用四个重叠的寡核苷酸和PCR技术合成相关的片段“C”。PCR反应的结果是DNA片段5'-Xba I-RBS-C-Hind III-3'。
来自嗜冷黄杆菌的靶抗原基因被鉴定为组蛋白样蛋白质。使用PCR技术形成具有侧翼限制酶切位点的感兴趣的嗜冷黄杆菌基因。将PCR扩增的DNA克隆至质粒pBCKS-V内作为Bam HI-Hind III片段,从而产生pBCKS-V-8。随后将片段8作为BamΗΙ-Ase I片段从pBCKS-V-8克隆至用Bam HI和Nde I消化的质粒pETC中,从而产生pETC8。
如下所述将麻疹病毒表位(M)克隆至pETC8中的肽C与嗜冷黄杆菌基因“8”之间:通过用Bam HI和Ase I消化从pBCKS-V-M上切下M编码区,并将其亚克隆至pETC8的BamHI和Nde I位点内,从而产生pETCM8(Ase I和Nde I产生可通过DNA连接酶连接的相容粘性DNA末端)。质粒pETCM8是基于pET21a(+)的T7表达载体。
在诱导T7启动子后验证重组蛋白盒CM8的表达。
将所得蛋白质称为“嗜冷黄杆菌rHLP”或“rHLP”抗原,其在下述实施例中使用并描述于SEQ ID NO:7中。
IPNV构建体
IPNV的基因组区段A含有以顺序5'-VP2-NS-VP3-3'布置的三个基因。VP2编码IPNV表面糖蛋白。选择由VP2的1-257个氨基酸组成的被称为VP2'的区段用于疫苗开发。
包括所选的T细胞表位序列的VP2c DNA序列使用重叠寡核苷酸方法合成并通过DNA测序方法进行验证。
抗原盒VP2c:
编码被称为“VP2c”的rIPNV抗原盒的DNA序列如下设计:含有BamHI和Nde I限制位点的DNA序列,之后为编码病毒VP2蛋白质的1-257个氨基酸加氨基酸序列“KKKAKKKQL”的VP2c片段;且最后为含有Vsp I和Hind III限制位点的DNA序列。
生产质粒pKLPR-CTMVP2c中的表达盒CTMVP2c:
编码目标重组蛋白CTMVP2c的DNA序列如下设计:前导序列C编码来源于食纤维
梭菌的纤维素结合蛋白A前体(GenBankTM登录号P38038)的90个氨基酸;其后为来源于含有BamHI和Nde I限制位点的DNA序列的另外6个氨基酸;这之后是编码来自被称为“T”(Q Y I K A N S K F I G I T E L)的破伤风梭菌破伤风毒素(Clostridium TM
tetani tetanus toxin)(tt)P2表位的混杂T细胞表位(830-844)(GenBank AAO37454)TM
的DNA序列;随后为来自麻疹病毒的混杂T细胞表位(288-302)(GenBank M81903),称为“M”(LSEIKGVIVHRLEGV);这之后为编码VP2c的DNA序列;且最后为含有Vsp I和Hind III限制位点的DNA序列。
大肠杆菌BL21受体生物体含有单一质粒,即pKLPR-CTMVP2c,其包含表达IPNV疫苗重组蛋白的表达盒CTMVP2c。该表达盒由核糖体结合位点序列、蛋白C前导序列、前面有来自麻疹病毒融合蛋白的免疫刺激序列的IPNV抗原VP2c序列和破伤风毒素组成。构建的细节描述如下。
由TOP Gene Technologies(Quebec,加 拿 大 )基 于 由 Microtek Research and Development Ltd.设计的DNA序列来合成抗原盒VP2c。相关序列为来自智利和挪威的若干最新IPNV SP血清型分离株的基因VP2的片段的共有序列。将递送的合成DNA序列作为Bam HI-Hind III片段克隆至用于接下来的构建步骤的质粒pBCKS-V(用于携带克隆/表达盒的质粒)内,从而产生质粒pBCKS-VP2c。
为形成表达盒,将VP2c作为Bam HI-Hind III片段从pBCKS-VP2c转移至pETC,从而产生质粒pETC-VP2c。随后将作为Bam HI-Vsp I片段从pBCKS-V-M和pBCKS-V-T上切下的携带M和T混杂T细胞表位的盒顺次插入用Bam HI和Nde I消化的pET-VP2c中,从而产生质粒pETC-MVP2c以及最终的质粒pETC-TMVP2c。
在最后的构建步骤中,将具有适当核糖体结合位点的编码CTMVP2c融合蛋白的DNA表达盒作为Xba I-Xho I限制性片段从pETC-TMVP2c上切下,并克隆至生产表达质粒pKLPR-8(Microtek R&D Ltd.的专利质粒表达载体)的Xba I和Sal I位点内,从而产生最终的生产质粒pKLPR-CTMVP2c。
如在SEQ ID NO:8中,CTMVP2c表达盒表达由如上所述的N-末端蛋白C、免疫刺激性麻疹病毒融合蛋白表位、破伤风毒素蛋白质表位、VP2序列组成的氨基酸序列。
将所得到的蛋白质称为“IPNV rVP2”抗原,其在下述实施例中使用并描述于SEQ ID NO:8中。
在rVP2与rHLP免疫原性组合物之间的融合蛋白使用与在个体浸泡疫苗构建体中使用的材料和方法相似的材料和方法进行构建及表达,并作为包涵体从大肠杆菌中回收。在本发明的实施例中使用的融合蛋白序列示于SEQ ID NO:9中。
通过(但绝不限于)以下实施例进一步阐述本发明。
实施例
实施例1.采用单价IPNV(IPNV rVP2)和二价嗜冷黄杆菌(rHLP疫苗抗原)-IPNV VP2疫苗抗原疫苗对大西洋鲑鱼(Salmo salar)鱼苗的浸泡接种。
本研究的主要目的是确定单价IPNV疫苗和二价嗜冷黄杆菌组蛋白样蛋白质(HLP):
IPNVVP2疫苗在通过浸泡施用于大西洋鲑鱼苗时,是否可诱发显著的对抗IPNV的致死性攻击的保护。在本研究中,测试了2个剂量的单价IPNV浸泡疫苗。此外,还评估了两种类型的二价制剂,以研究包含嗜冷黄杆菌疫苗组分是否会干扰对抗IPNV的保护。鱼购自Australis S.A.Farmed(Penaflor,Chile),在使用之前检测为无病原体,并在攻击时具有约0.5g的平均体重。将鱼安置在21L罐中,直到随机选择进行接种疫苗。1周适应后,将所有的鱼转移到1升烧瓶中,并接种如表1中所述的疫苗2分钟。然后将接种后的鱼返送至
21L罐中直到进行攻击。攻击在400度日(“度日”=℃x保持的天数;400度日=12℃x约34天)时发生,并通过浸泡于9L罐中2小时来进行。攻击菌株为最近从智利分离的IPNV
5
菌株Sp;使用10pfu/ml的IPNV。对照组经受与接种组相同的条件(即,在1L烧瓶中接种疫苗2min;在9L罐中攻击2hr)。在攻击后,将鱼返送至21L罐中,在该罐中水温保持在
12±2℃。每日手动向鱼提供高达1%体重的合适的鱼饲料。
疫苗(表1)如下制备:
1)重组嗜冷黄杆菌组蛋白样蛋白质(rHLP)在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体,然后使其通过微流化器(microfluidiser),并将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化。
将蛋白质悬浮液在4-6℃下储存于0.5mM EDTA中。包涵体悬浮液中的HLP的浓度经计算(通过SDSPAGE、扫描显象测密术以及与BSA标准进行比较)为1.76μg/μl。
2)酸处理的重组嗜冷黄杆菌rHLP在3次独立的
发酵罐运行中表达为不溶性包涵体。
将最终的经洗涤的包涵体悬浮液用浓HCl、随后用10N NaOH进行pH处理,以使pH回到7。
将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。为了浓缩不溶性包涵体制剂并除去百里香酚,对蛋白质悬浮液进行过滤,并使10倍体积的无菌水通过过滤单元。包涵体悬浮液中HLP的浓度经计算为0.72μg/μl。
3)由与IPNV VP2融合的嗜冷黄杆菌HLP组成的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体。将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化,并重悬浮于百里香酚/EDTA溶液中。随后通过离心将包涵体制剂洗涤六次以除去百里香酚,重悬浮于无菌的0.05mMEDTA中,并在4-6℃下储存。该融合蛋白的浓度经计算为10.02μg/μl。
4)重组IPNVVP2在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体。将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化,并重悬浮于百里香酚/EDTA溶液中。随后通过离心将包涵体制剂洗涤六次以除去百里香酚,重悬浮于无菌的
0.05mMEDTA中,并在4-6℃下储存。IPNV VP2蛋白质的浓度经计算为10.90μg/μl。
表1.疫苗配方。
对于上述包涵体疫苗组合物的构建,本领域技术人员将容易理解,在不脱离本发明的精神的情况下可以替换某些特征。例如,可插入替代的前导序列,且可提供具有rHLP和/或rVP2抗原的另外或不同的T细胞表位。
实施例1中的疫苗制剂以与如下对实施例2所述相同方式的浓度施用。攻击后,对所有组均监测28天,此时在所有的攻击组中必须连续3天没有死亡。从外部检查每条死亡鱼的疾病迹象。外部观察后,对鱼进行尸检,并进行内部检查。在研究结束时对来自每个罐的
5条鱼的合并物进行IPNV感染的组织培养确认。
在攻击的同一天,从每组20条鱼中采集并合并血液,以便分离血清。对所收集的血清进行血清中和试验,以评估抗体应答。
如果发生以下任何一种情况,则该实验将被视为无效:(1)如果测试设施有任何故障,导致疫苗组或对照组的显著死亡率。(2)如果已确定已发生与方案的显著偏离。
没有此类故障发生。
如下,从确定已作为攻击生物体的结果而发生的那些死亡率来计算百分死亡率:
%死亡率={1-(因攻击导致的死亡数)/(攻击的鱼总数)}×100
在试验结束时计算相对百分存活率(RPS),此时使用上述公式计算,受感染的鱼中的对照死亡率达到>70%。
RPS={1-(%接种死亡率/%对照死亡率)}×100
结果
每组八十五条鱼一式两份接种四种不同的疫苗:2种单价IPNVVP2疫苗,以及2种二价嗜冷黄杆菌HLP:IPNV VP2疫苗。在疫苗接种期间没有观察到死亡。所有组的鱼在攻击的时间点时都是健康的。观察到对照组比接种组更活跃且进食更好。
在攻击的同一天,从每组20条鱼中采集并合并血液,并分离血清。通过血清中和试验评估的抗体应答表明,浸泡疫苗并没有在大西洋鲑鱼苗中引发可检测的抗体应答。
除阴性对照组外,用IPNV攻击每个疫苗组65条鱼的重复组。对每条鱼进行尸检。将每个罐的所有死亡鱼合并(最多5条的合并物)并检测其IPNV。所有浸泡攻击组经检测均为IPNV阳性。各组鱼的累计死亡率和相对百分存活率(RPS)示于表2中。
表2.用IPNV攻击的65条大西洋鲑鱼苗(0.5克)的组的死亡率和RPS。
*受感染的(-)对照组中的死亡鱼经检测其IPNV存在为阴性
试验结束时从每罐5条鱼的合并物中分离IPNV的结果证实这些鱼感染了病毒。通过尸检观察到了同样的结果。
(-)对照鱼(未接种疫苗且未受攻击的)到试验结束时达到15%和21%的死亡率水平(平均=18%)。在对较大的鱼的研究中,正常的背景死亡率达到约5%。对所有的死亡鱼进行尸检,并且确认在(-)对照死亡鱼中没有细菌或病毒感染。因此,认为该背景死亡率水平是由于在处理过程中的应激的汇总(compilation),以及鱼的大小较小(0.5克)。因此,为了RPS计算的目的,从所有组中减去该背景死亡率,即使所有其他组经检测均为IPNV阳性。
结论
浸泡疫苗接种导致所有组的大西洋鲑鱼苗的死亡率下降。在重复组中,疫苗A(IPNV rVP2)对大西洋鲑鱼苗提供了最高水平的保护,平均RPS为70%。疫苗C(IPNV rVP2+嗜冷黄杆菌rHLP)总体上提供了第二好的结果,平均RPS为59%。单价疫苗(IPNV rVP2)的两种不同剂量水平提供了不同的保护水平,较低的剂量水平(疫苗A)比较高的剂量水平(疫苗B)提供了更好的保护。以相同的相对剂量水平施用的两种不同的二价剂型(疫苗C;疫苗D)提供了不同的保护水平,疫苗C比疫苗D提供了更高的保护水平。
实施例2.对抗嗜冷黄杆菌的虹鳟鱼苗浸泡接种
该研究的目的是测试各个不同剂量的重组嗜冷黄杆菌组蛋白样蛋白质(HLP)疫苗(rHLP)以及重组嗜冷黄杆菌HLP(rHLP)和IPNV rVP2疫苗的不同二价制剂的功效,所有这些疫苗均作为虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的浸泡疫苗。
鱼购自Spring Valley Trout Farm(Langley,B.C.),并在接种疫苗时具有0.4g、0.6g和1.0g的平均体重。将鱼安置在一个室外390L的罐中1个月,直到随机选择进行预攻击和疫苗接种。疫苗(表1)如下制备:
1)重组嗜冷黄杆菌组蛋白样蛋白质(rHLP)在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体,然后使其通过微流化器,并将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化。将蛋白质悬浮液在
4-6℃下储存于0.5mM EDTA中。包涵体悬浮液中的HLP的浓度经计算(通过SDS PAGE、扫描显象测密术以及与BSA标准进行比较)为1.76μg/μl。
2)酸处理的重组嗜冷黄杆菌rHLP在3次独立的
发酵罐运行中表达为不溶性包涵体。
将最终的经洗涤的包涵体悬浮液用浓HCl、随后用10N NaOH进行pH处理,以使pH回到7。
将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。为了浓缩不溶性包涵体制剂并除去百里香酚,对蛋白质悬浮液进行过滤,并使10倍体积的无菌水通过过滤单元。包涵体悬浮液中HLP的浓度经计算为0.72μg/μl。
3)由与IPNV VP2融合的嗜冷黄杆菌HLP组成的重组融合蛋白在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体。将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化,并重悬浮于百里香酚/EDTA溶液中。随后通过离心将包涵体制剂洗涤六次以除去百里香酚,重悬浮于无菌的0.05mMEDTA中,并在4-6℃下储存。该融合蛋白的浓度经计算为10.02μg/μl。
4)重组IPNV VP2在大肠杆菌BL21细胞中表达为不溶性包涵体。将细胞用百里香酚/EDTA裂解,并通过微流化器。将不溶性蛋白质通过离心进行部分纯化,并重悬浮于百里香酚/EDTA溶液中。随后通过离心将包涵体制剂洗涤六次以除去百里香酚,重悬浮于无菌的
0.05mM EDTA中,并在4-6℃下储存。IPNV VP2蛋白质的浓度经计算为10.90μg/μl。
表3
随后将鱼(120条/组)转移到32.5L罐中。将鱼(每次30条)通过在含有包涵体重
组疫苗制剂的1L去氯水中浸泡2min来接种疫苗。在疫苗接种期间存在气石。包涵体制剂的浓度通过扫描SDS-PAGE凝胶并将其与BSA标准进行比较来测定。将鱼返送至32.5L罐中,并在其中保持,直到对其进行攻击。水温保持恒定在12±1℃,并且水流以1.0lpm持续。
在约408度日(“dd”;度日=℃乘以保持的天数)后通过浸泡对鱼进行攻击;在约
588dd时进行重复攻击。在15℃下于琼脂上从冷冻储备液培养嗜冷黄杆菌(菌株C594)的攻击菌株。在15℃下温育6天后,将细胞从平板上刮下,并重悬浮于15℃的无菌盐水中。将细胞重悬浮至最终OD600 8.4,并保持在15℃下。在攻击之前,将鱼麻醉,并转移到桌子上,使其取右侧卧位,头向左,左侧向上。使用以45°握持的干净的解剖刀片从脂鳍下方到尾根部从左到右擦拭3次而从茎(peduncle)区域擦去粘液。在该处理后,将鱼转移到1L浸泡罐中。一旦每组所有的鱼均处于浸泡罐中,即加入嗜冷黄杆菌至最终OD600 0.1。向罐中供应空气,并使鱼保持在含有嗜冷黄杆菌的悬浮液中1小时,此后,将鱼转移至14.3L的攻击罐中。
对鱼监测14天,直到所有组中连续3天没有观察到死亡。每日向鱼提供1%体重(除了移动之前及之后24小时,以及攻击时)的BioClark鱼苗饲料(Longview,WA)。对发生的死亡的约70%进行尸检。将来自死亡鱼的肾组织涂布在琼脂上以培养攻击生物体。如下计算相对百分存活率(RPS):
RPS={1-(%接种死亡率/%对照死亡率)}×100
结果
小鱼苗(0.4g)的接种导致阴性RPS,而中等(0.6g)和大(1.0g)鱼苗的接种导致保护作用(表3)。与低剂量组的35%(23%和47%)的死亡率相比,高剂量的单价疫苗在中等大小的鱼苗中产生平均12%(10%和13%)的死亡率。大鱼苗(在接种疫苗时为1g)似乎在采用低剂量疫苗时表现得非常好。然而,需要大鱼苗对照来排除大小对攻击的影响。使用中等大小的鱼来计算RPS,因为这是仅有的对照组的大小。