一种戊型肝炎亚单位疫苗
阅读：775发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种戊型肝炎亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种戊型 肝炎 亚单位 疫苗 ，其中 抗原 蛋白时 氨 基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的戊型肝炎病毒ORF2蛋白。本发明的戊型肝炎ORF2蛋白制备的 亚单位疫苗 具有抗原 稳定性 高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关 抗体 ，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎疫苗和诊断 试剂 奠定了坚实的 基础 。，下面是一种戊型肝炎亚单位疫苗专利的具体信息内容。
1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，抗原是戊型肝炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
3.如权利要求2所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白是使用重组大肠杆菌发酵制备的。
5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白进行了灭活处理。
6.如权利要求5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白是使用甲醛溶液进行灭活。
7.权利要求1-6任一项所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：
1)油相制备：
取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；
2)水相制备：
将大肠杆菌表达的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配成制苗用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
3)乳化：
取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以
10000r/min，乳化5分钟完成制备。
一种戊型肝炎亚单位疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)引起的以肠道传播为 主的传染性疾病，具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,是一种经肠道传 播的严重危害人类健康的病毒性肝炎。目前戊型肝炎在我国以及许多发展中国 家中流行，在少数发达国家呈散发性流行。HEV是一种人畜共患病毒，已有报 道显示HEV在自然条件下能感染鸡、鹿和兔等多种动物。戊型肝炎在一些爆 发性发病鸡群中会使产蛋率下降20％以上。产蛋肉种鸡和30～72周龄产蛋母 鸡HS综合征死亡率比正常死亡率高，40～50周龄发病率最高。病鸡可能出现 鸡冠、肉垂苍白、沉郁、食欲不振、肛门口羽毛污染或有糊状粪便。
[0003] 现有的戊型肝炎疫苗为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。 传统的灭活疫苗具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价高，但也存在制 造疫苗使用的毒株培养困难，与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影 响了攻毒保护效果的缺点，从而制约了灭活疫苗的应用。而且，使用全病毒抗 原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免 疫产生，会导致干扰疫情的监测。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒 株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。
发明内容
[0004] 本发明目的是提供一种戊型肝炎亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明提供一种亚单位疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是戊型肝 炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
[0006] 更优选的，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，编码基因的 核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
[0008] 更进一步的，本发明的ORF2蛋白进行了灭活处理；具体是使用甲醛溶液 进行灭活；
[0009] 本发明所提供的亚单位疫苗的制备方法，包括如下的步骤：
[0010] 1)油相制备：
[0012] 2)水相制备：
[0013] 将大肠杆菌表达的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配成制苗 用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入抗原液95份， 搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
[0014] 3)乳化：
[0015] 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入 水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。
具体实施方式
[0017] 本发明从全国各地临床发生戊型肝炎的养殖场分离HEV，并对其临床流行 病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好的戊型肝炎病毒(QD07株)， 从中获得了一种新型的戊型肝炎病毒抗原蛋白(ORF2蛋白)，将其在大肠杆菌 中获得进行可溶性的表达，制备亚单位疫苗。
[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0019] 实施例1：ORF2基因的扩增及序列分析
[0020] 2018年自大连地区的部分肉种鸡发生疑似戊型肝炎，经临床调查和实验室 检测，初步诊断为戊型肝炎。经调查上述的发病鸡群之前已经注射过戊型肝炎 疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有戊型肝炎病毒在疫苗的选择压力下发生 了突变，从发病鸡病料样品中分离出戊型肝炎病毒QD07株，作为扩增的模板。
[0021] 1、扩增戊型肝炎病毒ORF2基因
[0022] 根据NCBI中发表的戊型肝炎病毒ORF2基因序列，设计并合成了引物,引 物的序列信息如下：
[0023] primer1：5′-ATGTCGGTGCGTGGATTGTTGCTC-3′；
[0024] primer2：5′-CTAGGGTGGTGAGGGAAACGT-3′。
[0025] 提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩 增目的片段，经序列测定核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列 为SEQ ID NO:2。与NCBI中已公布的戊型肝炎病毒ORF2基因进行核苷酸序 列比对分析，结果核苷酸同源性约为83.4％～91.7％；推导的氨基酸第39位(Q 变H)、198位(Y变F)、240位(G变P)、294位(T变A)、306位(D变E)、 317位(L变I)、398位(S变T)、442位(A变D)、468位(T变N)、506 位(F变I)发生变异，氨基酸序列同源性分析约为78.6％～97.1％。结果表明， 分离的病毒为新的戊型肝炎病毒，含有新的ORF2基因。
[0026] 2、优化并合成戊型肝炎病毒ORF2基因
[0027] 分析所获得的戊型肝炎病毒ORF2基因的抗原特性，将ORF2基因的结构 域进行剪切，将N端330aa剪切掉，把C端5aa剪切掉，并将N端加入3个脯 氨酸3个精氨酸，帮助蛋白进行空间折叠和进行可溶性表达，同时将C(剪切 修饰后的第61位、255位、256位)突变为R来帮助蛋白进行可溶性表达，表 达出具有正确空间结构的蛋白，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的 氨基酸的序列为SEQ ID NO:4，能很好地表达出抗原位点。通过以上的优化突 变达到蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达。
[0028] 设计合成用于ORF2蛋白表达的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，送上海生物 工程有限公司公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增， 目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-ORF2。
[0029] 引物primer3和primer4的序列信息如下：
[0030] primer3：5′-TTGAATTCCCCCCGCCGAGAAGAAGGA-3′；
[0031] primer4:5′-AAGCGGCCGCCTACGTCCTACTAAGCCG-3′。
[0032] 实施例2：戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组表达
[0033] 1.ORF2蛋白的制备方法
[0034] 包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组ORF2蛋白的诱 导和提取纯化。
[0035] a.构建表达载体：
[0036] 将阳性克隆质粒pMD18-T-ORF2和表达载体pET28a载体分别用EcoRI和 NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别 获得约5400bp和850bp片段,在16℃定向连接构建pET28a表达载体；测序验 证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，转化入BL21感受态细胞。
[0037] b.构建表达菌株、蛋白提取纯化：
[0038] 转化后，37℃培养18h。挑取单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素)中， 37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴 煮5min，12000r/min离心2min离心取上清作为模板，进行PCR鉴定,PCR反 应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃
1min，72℃1min，共进行32个 循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约850bp 条带。检测结果表明，含ORF2基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。 将PCR检测阳性的菌株分别接种30mL LB培养基中，37℃摇床培养至 OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h,培养物离心后用1/20体积 的PBS重悬，破碎后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。同时，将没有改造前 的基因(即含SEQ ID NO:1基因)转入pET28a表达载体，作为未改造对照菌 株进行了表达，破碎后取沉淀进行SDS-PAGE检测。结果，改造后的菌株(含 核苷酸序列为SEQ ID NO:3)表达了可溶性的蛋白，蛋白存在于上清中，纯度 为43％；
未改造对照菌表达的蛋白以不可溶的包涵体形式存在。
1min，72℃1min，共进行32个 循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约850bp 条带。检测结果表明，含ORF2基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。 将PCR检测阳性的菌株分别接种30mL LB培养基中，37℃摇床培养至 OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h,培养物离心后用1/20体积 的PBS重悬，破碎后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。同时，将没有改造前 的基因(即含SEQ ID NO:1基因)转入pET28a表达载体，作为未改造对照菌 株进行了表达，破碎后取沉淀进行SDS-PAGE检测。结果，改造后的菌株(含 核苷酸序列为SEQ ID NO:3)表达了可溶性的蛋白，蛋白存在于上清中，纯度 为43％；
未改造对照菌表达的蛋白以不可溶的包涵体形式存在。
[0040] 实施例3：亚单位疫苗的制备
[0041] 一、亚单位疫苗制备
[0042] 1.制苗用ORF2蛋白的制备
[0043] 将BL21-ORF2菌株接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养 18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于LB液 体培养基中，37℃振荡培养18小时，经镜检后，置2～8℃保存。按发酵罐容 积60％(V/V)加入LB液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂， 通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至37℃，接种ORF2蛋白生产用 二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度37℃，维持DO 值(溶氧量)在20％。培养4小时后的菌液补加乳糖,诱导表达培养6h；发酵 培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌体沉淀破碎后，取 上清经Ni-NTA纯化蛋白。
[0044] 2.灭活
[0045] 将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混 合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶 口附近粘附的蛋白液未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保 存。
[0046] 3.半成品检验
[0047] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0048] (2)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。
[0049] (3)灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种LB固体培养基，置于37℃ 继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。
[0050] 5.亚单位疫苗成品制备
[0051] 经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分 按体积比计)。
[0052] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加 热至80℃后，再加司本-80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备 用。
[0053] (2)水相制备将灭活的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配 成制苗用抗原液。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用抗 原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
[0054] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时 徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。
[0055] 乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。
[0056] 二、亚单位疫苗成品检验
[0057] (1)性状
[0058] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。检验均合格。
[0059] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴 外，均应不扩散。检验结果合格。
[0060] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底 析出的水相应不超过0.5ml。检验结果合格。
[0061] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果合格。
[0062] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果 合格。
[0063] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。检验结果 合格。
[0064] (4)安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗 2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡 采食、饮水及临床情况。结果均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0065] (5)效力检验
[0066] 5.1最小免疫剂量和使用剂量的测定用本发明制备的戊型肝炎亚单位疫 苗以不同剂量分别颈部皮下接种50周龄的SPF鸡，免疫剂量分别为0.3ml/只、 0.1ml/只、0.03ml/只，同时设未免疫疫苗的对照组。免疫后28日攻毒戊型肝炎 病毒临床分离株(YB07株)，点眼滴鼻0.2ml/只(病毒含量为107.0LD50/0.1ml)， 连续观察14日，记录产蛋和发病死亡情况。结果表明，对照组6/10发病死亡， 产蛋率下降40％；0.03ml/只～0.3ml/只免疫组鸡均10/
10健活，产蛋率无变化 (表1)。
10健活，产蛋率无变化 (表1)。
[0067] 因此将戊型肝炎亚单位疫苗最小免疫剂量确定为0.03ml/只。为保证疫苗质 量，将疫苗的使用剂量确定为3.3倍最小免疫剂量即0.1ml/只。
[0068] 表1：最小免疫剂量的攻毒保护结果
[0069]
[0070]
[0071] 注：“-”表示未进行相关试验。
[0072] 5.2对地方流行毒株的攻毒保护：
[0073] 50周龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射本发明的戊型肝炎亚单位疫苗， 0.1ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫 组和对照组均点眼攻毒10株各地方分离株，点眼滴鼻0.2ml/只(病毒含量为 107.0LD50/0.1ml)，攻毒后观察14日，记录发病死亡情况，产蛋率变化。
[0074] 结果表明，ORF2蛋白制备的戊型肝炎亚单位疫苗能抵御各地方病毒分离 株的攻击(参见表2)；结果表明本发明制备的ORF2蛋白亚单位疫苗具有良好 的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗戊型肝炎的攻击。
[0075] 而且，使用实施例1筛选的YB07病毒株进行攻毒实验，结果表明本发明 ORF2蛋白制备的亚单位疫苗的免疫效果最好。
[0076] 表2对地方流行毒株的攻毒保护
[0077]
[0078]
[0079] 5.3与市售疫苗的比较试验用目前市售戊型肝炎疫苗和本发明制备的亚 单位疫苗分别免疫50周龄SPF鸡，每只颈部皮下注射本发明的戊型肝炎亚单 位疫苗，0.1ml/只，另取同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免 疫组和对照组均点眼攻毒0.2ml/只(戊型肝炎病毒含量为107.0LD50/0.1ml)，攻 毒后观察14日，记录发病死亡情况，产蛋率变化。
[0080] 结果，本发明制备的ORF2蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以完 全保护(10/10)免疫鸡抵抗戊型肝炎的攻击，产蛋率无变化；市售戊型肝炎疫 苗免疫鸡的攻毒保护率为5/10，产蛋率下降22％；不免疫对照组发病死亡率为 6/10，产蛋率下降40％。结果表明本发明亚单位疫苗的免疫效果更好。
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