猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗
阅读：403发布：2020-05-14
专利汇可以提供猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用不同PCV2亚型控制PCV2感染的免疫接种方法。特别地，将PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物用于 治疗 或 预防 感染不同亚型的PCV2，减少、预防或治疗感染不同亚型的PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染不同亚型的PCV2所引起的 疾病 的方法。，下面是猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗专利的具体信息内容。
1.PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，用在治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病的方法中。
2.根据权利要求1的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白为重组PCV2b ORF2蛋白，优选重组杆状病毒表达的PCV2b ORF2蛋白。
3.根据权利要求1或2的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白包含与SEQ ID No:1的序列至少94％或优选至少
95％相同的序列，或者由与SEQ ID No:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列组成。
4.根据权利要求1-3中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是感染PCV2b亚型(PCV2b)和/或除2b亚型以外PCV2的亚型。
5.根据权利要求1-4中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是感染除2b亚型以外PCV2的亚型。
6.根据权利要求4的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是同时感染(i)PCV2b和(ii)除2b亚型以外PCV2的亚型。
7.根据权利要求4-6中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染除2b亚型以外PCV2的亚型是感染PCV2a亚型(PCV2a)和/或PCV2c亚型(PCV2c)。
8.根据权利要求4-7中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染除2b亚型以外PCV2的亚型是感染PCV2a。
9.根据权利要求1-8中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2是同时感染(i)PCV2b和(ii)PCV2a。
10.根据权利要求4-9中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2b是感染PCV2，所述PCV2包含与SEQ ID NO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽或者包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。
11.根据权利要求7-9中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2a是感染PCV2，所述PCV2包含与SEQ ID NO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽或者包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中
-所述治疗或预防感染PCV2是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述PCV2的免疫应答，
-所述临床表现选自：淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减少的平均日增重、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC、增加的死亡率，或者
-所述疾病为PMWS。
13.根据权利要求4-12中任一项的用于所述用途的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中
-所述治疗或预防感染除2b以外PCV2的亚型是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述除2b以外PCV2的亚型的免疫应答，或者同时诱导针对所述除2b以外PCV2的亚型和PCV2b的免疫应答。
14.PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白为重组PCV2b ORF2蛋白，优选重组杆状病毒表达的PCV2b ORF2蛋白。
15.权利要求14的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白包含与SEQ ID No:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列，或者由与SEQ ID No:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列组成。
16.一种治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病的方法，所述方法包括向动物给药PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述感染PCV2优选为感染权利要求3-12中任一项的PCV2和/或其中所述PCV2b ORF2蛋白或所述免疫原性组合物优选为权利要求14或15的PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物。
17.PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病，其中所述感染PCV2优选为感染权利要求3-12中任一项的PCV2和/或其中所述PCV2b ORF2蛋白或所述免疫原性组合物优选为权利要求14或15的PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物。
18.权利要求16的方法或权利要求17的用途，其中
-所述治疗或预防感染PCV2是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述PCV2的免疫应答，或者其中所述预防、减少或治疗感染除2a亚型以外PCV2的亚型是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述除2a亚型以外PCV2的亚型的免疫应答，或者共同诱导针对所述除a亚型以外PCV2的亚型和PCV2a的免疫应答，
-所述临床表现选自：淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减少的平均日增重、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC、增加的死亡率，或者
-所述疾病为PMWS。
19.根据前述权利要求中任一项的PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物或方法或用途，其中所述PCV2b ORF2蛋白或所述免疫原性组合物仅给药一次。
20.根据前述权利要求中任一项的PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物或方法或用途，其中将所述PCV2b ORF2蛋白或所述免疫原性组合物给药至动物，优选猪，更优选家猪，特别优选小猪或母猪。
猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗
[0002] 本申请包含按照37C.F.R.1.821–1.825的序列表。本申请所附序列表整体援引加入本文。
背景技术
[0003] 猪圆环病毒2型(PCV2)是小的(直径17-22nm)、二十面体的、无包膜的DNA病毒，其包含单链环状基因组。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV-1)共享约80％序列相同性。但是，与一般无毒力的PCV1相反，感染PCV2的猪表现出通常称作断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征是消瘦、皮肤苍白、瘦弱、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。在一些受感染的猪中，所有表现的组合会变得明显，而其他猪仅具有这些临床表现中的一种或两种。在尸检中，微观和宏观病变也出现在多个组织和器官上，其中淋巴器官是最常见的病变部位。已观察到PCV2核酸或抗原的量与微观淋巴病变的严重程度之间的高相关性。感染PCV2的猪的死亡率可以达到80％。除了PMWS，PCV2与几种其他感染有关，包括伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser’s disease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断奶后大肠杆菌病、营养性肝功能障碍和化脓性支气管肺炎。
[0004] 目前，已知有3种亚型的PCV2(PCV2a、PCV2b和PCV2c)，它们根据PCV2基因型的统一命名进行分类(Segales,J.et al.,2008,PCV-2genotype definition and nomenclature,Vet Rec 162:867-8)。已提出另外两种亚型(PCV2d和PCV2e)(Wang et al.Virus Res.2009145(1):151-6)，但是，后来证实它们属于PCV2a和PCV2b组(Cortey et al.Vet Microbiol.2011149(3-4):522-32011)。根据PCV2基因型的这种统一命名，orf2基因用来进行pcv-2的基因型分型，其中所述基因型分型是基于所比较的两个序列不同的核苷酸位点的比例(p距离)。这个值通过核苷酸差异的数量除以所比较的核苷酸的总数获得(Kumar et al.2001Bioinformatics 17,1244-1245)，随后，p距离/频率直方图的构建使得能够确定可能截断值以区分不同的基因型(Rogers and Harpending 1992Molecular Biology and Evolution 9,552-569；Biagini et al.1999Journal of General Virology 80,419-424)。利用这种方法，当orf2pcv-2序列之间的遗传距离为0·035时将它们分配至不同基因型。
[0005] US 2011/0305725A1描述了在猪中测试新疫苗制剂以评价其对猪圆环病毒和猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)的效力的研究。在这个研究的过程中，观察到对照和疫苗接种组中的一些猪表现出PMWS的临床表现。随后证实这些猪在攻击之前暴露于环境PCV2。来自这些猪的血液和组织样品的分子分析显示它们包含不同于用来攻击的毒株的2B型毒株(US 2011/0305725 A1的[0152]段)。
[0006] 因此，需要新的和增强的疫苗接种方法以控制不同PCV2亚型的PCV2感染。发明内容
[0008] 因此，本发明在其不同方面是根据权利要求书实施的。
[0009] 本发明是基于令人惊讶的发现，给药仅一个剂量的PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白，特别是如果其包含在免疫原性组合物中，足以减少和预防感染PCV2a或PCV2b所引起的临床表现。附图说明
[0010] 图1证实攻击之后28天的淋巴耗竭(lymphoid depletion)结果。表现出扁桃体、髂、气管支气管和肠系膜淋巴结淋巴耗竭的猪阳性的百分比。示出用PCV2a免疫接种和攻击的猪以及用PCV2b免疫接种和攻击的猪。
[0011] 图2证实攻击之后28天的淋巴炎症结果。表现出扁桃体、髂、气管支气管和肠系膜淋巴结淋巴炎症的猪阳性的百分比。示出用PCV2a免疫接种和攻击的猪以及用PCV2b免疫接种和攻击的猪。
[0012] 图3证实攻击之后28天的IHC组织结果。来自以下组织的猪阳性IHC阳性的百分比；扁桃体、髂、气管支气管和肠系膜淋巴结。示出用PCV2a免疫接种和攻击的猪以及用PCV2b免疫接种和攻击的猪。
[0013] 图4证实攻击之后28天的平均肺炎症评分。攻击之后28天猪的平均组肺炎症评分。示出用PCV2a免疫接种和攻击的猪以及用PCV2b免疫接种和攻击的猪。
[0014] 图5证实攻击之后28天治疗组的PCV2病毒血症。通过利用PCV2a/2b引物和PCV2b特异性引物的PCR的猪阳性的百分比。示出用PCV2a免疫接种和攻击的猪以及用PCV2b免疫接种和攻击的猪。
[0015] 图6证实总严重程度评分，所有淋巴样组织，其用于确定每组缺失、炎症和定殖的缓解分数。
[0016] 图7证实攻击之后的PCV2b病毒血症，其中在第28天之后观察病毒血症的减少。
具体实施方式
[0017] 本发明因此特别地分别基于PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白或所述包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物可以用于特定目的。
[0018] 在一方面，本发明因此涉及PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物,其用在治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病的方法中。
[0019] 本发明还提供一种治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病的方法，所述方法包括向动物，特别是有需要的动物给药PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物。
[0020] 而且，本发明提供PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防感染PCV2，减少、预防或治疗感染PCV2所引起的临床表现，或者预防或治疗感染PCV2所引起的疾病。
[0021] 特别地，在本发明的上下文中，优选PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白为重组PCV2b ORF2蛋白，更优选重组杆状病毒表达的PCV2b ORF2蛋白。
[0022] 特别地，为了本发明目的，优选PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF2蛋白包含或由以下序列组成：与SEQ ID No:1的序列至少94％、优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、并且最优选至少
99％相同的序列。
99％相同的序列。
[0023] 术语“重组蛋白”指通过重组DNA技术制备的多肽。这类技术的实例包括将编码所表达的蛋白的DNA插入合适的表达载体，优选杆状病毒表达载体，所述表达载体转而用来转化宿主细胞以产生所述DNA编码的蛋白或多肽。
[0024] 如本文所用，术语“重组蛋白”因此特别地指表达自重组DNA分子的蛋白分子。
[0025] 应当进一步理解术语“由序列组成的重组蛋白”特别地还涉及任何共翻译和/或翻译后修饰或者受到其中表达多肽的细胞影响的序列修饰。因此，如本文所用，术语“由序列组成的重组蛋白”还涉及具有受到其中表达多肽的细胞影响的一个或多个修饰的序列，特别是蛋白生物合成和/或蛋白加工中影响的氨基酸残基修饰，优选选自糖基化、磷酸化和乙酰化。
[0026] 在一优选方面，如本文所述，感染PCV2是感染PCV2b亚型(PCV2b)和/或感染除2b亚型以外PCV2的亚型。
[0027] 如本文所用，术语“感染PCV2”等于术语“PCV2感染”。
[0028] 特别地，如本文提到的，感染除2b亚型以外PCV2的亚型是感染PCV2a亚型(PCV2a)和/或PCV2c亚型(PCV2c)，并且优选感染PCV2a。
[0029] 如本文所述，术语“PCV2b亚型(PCV2b)ORF2蛋白”涉及如PCV2基因型定义的标准化命名所定义的PCV-2b的ORF2基因编码的蛋白(Segales,J.et al.,2008,PCV-2genotype definition and nomenclature,Vet Rec162:867-8)其援引加入本文)。
[0030] 根据另一优选方面，如本文所述，感染除2b亚型以外PCV2的亚型是同时感染(i)除2b亚型以外PCV2的亚型和(ii)PCV2b，特别是同时感染PCV2a和PCV2b。
[0031] 如本文所述，根据PCV2基因型定义的标准化命名，术语“PCV2a”、“PCV2b”和“PCV2c”分别涉及PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c(Segales,J.et al.,2008,PCV-2genotype definition and nomenclature,Vet Rec 162:867-8，其援引加入本文)。
[0032] 特别地，如本文提到的，感染PCV2b是感染(i)包含与SEQ ID NO:1的序列至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、并且最优选至少99％相同的多肽的PCV2，或者(ii)包含多核苷酸的PCV2，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:1的序列至少94％、优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少
98％、并且最优选至少99％的多肽的序列。
98％、并且最优选至少99％的多肽的序列。
[0033] 如本文所用，特别应当理解术语“与SEQ ID NO:X的序列相同”分别等于术语“在SEQ ID NO:X的长度与SEQ ID NO:X的序列相同”或术语“在SEQ ID NO:X的整个长度与SEQ ID NO:X的序列相同”。在这个上下文中，“X”是选自1-2的任何整数，从而“SEQ ID NO:X”代表本文中提到的任何SEQ ID NO。
[0034] 优选地，如本文所述，感染PCV2a是感染(i)包含与SEQ ID NO:2的序列至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、并且最优选至少99％相同的多肽的PCV2，或者(ii)包含多核苷酸的PCV2，所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:2的序列至少94％、优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、并且最优选至少99％的多肽的序列。
[0035] 优选地，在本发明的上下文中，治疗或预防感染PCV2是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述PCV2的免疫应答，临床表现和/或疾病，如本文提到的，所述临床表现选自：淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减少的平均日增重、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC、增加的死亡率，如本文提到的，所述疾病为PMWS。
[0036] 特别地，在本发明的上下文中，治疗或预防感染除2b以外PCV2的亚型是基于或包括或由以下组成：诱导针对所述除2b以外PCV2的亚型的免疫应答或者同时诱导针对所述除2b以外PCV2的亚型和PCV2b的免疫应答。
[0037] 如本文所用，术语“预防(prevention)”或“减少(reduction)”或“预防(preventing)”或“减少(reducing)”表示但不限于这样的方法，所述方法包括向动物给药PCV2抗原，即本发明的PCV2b ORF2蛋白，其包括在本发明的组合物中，其中当给药至所述动物时，所述PCV2抗原引发或能够引发所述动物中针对PCV2的免疫应答。总之，这样的治疗分别导致PCV2引起的疾病的临床表现或与PCV2感染相关的临床表现减少。更特别地，如本文所用，术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”一般表示一种预防方法，其中在诱导或发生PCV2引起的疾病过程之前将动物暴露于本发明的免疫原性组合物。
[0038] 在本文中“与PCV2感染相关的临床表现减少”表示但不限于与野生型感染相比，减少组中感染个体的数量，减少或消除表现出感染的临床表现的个体数量，或者减少个体中存在的任何临床表现的严重程度。例如，其应当指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或PCV2感染的任何临床表现症状的减少。优选地，与未接受所述组合物并可能感染的个体相比，在接受本发明的组合物的个体中这些临床表现减少至少10％。更优选地，在接受本发明的组合物的个体中临床表现减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、并且甚至更优选至少50％。
[0039] 术语“病毒血症减少”表示但不限于进入动物的血流的PCV2病毒的减少，其中病毒血症水平，即PCV2RNA拷贝数/mL血清或空斑形成集落数/分升血清在接受本发明的组合物的个体的血清中与未接受所述组合物并可能感染的个体相比减少至少50％。更优选地，在接受本发明的组合物的个体中病毒血症水平减少至少90％、优选至少99.9％、更优选至少99.99％、并且甚至更优选至少99.999％。
[0040] 如本文所用，术语“病毒血症”特别理解为其中PCV2颗粒在动物的血流中复制和循环的疾病状况。
[0042] 根据本发明的一特别优选的方面，PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物仅给药一次。
[0043] 优选地，在本发明的上下文中，PCV2b ORF2蛋白或免疫原性组合物特别地分别待给药或给药仅一次至动物，优选猪，更优选家猪，特别优选小猪。
[0044] 本发明克服现有技术中固有的问题，并且提供明显进步。根据另一方面，本发明还提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物。
[0045] 如本文所用，术语“疫苗”或“免疫原性组合物”(两个术语同义使用)指包含PCV2b ORF2蛋白的任何药物组合物，所述组合物可以用来预防或治疗个体中的PCV2感染相关疾病或疾病状况。优选的免疫原性组合物可以诱导、刺激或增强针对PCV2的免疫应答。因此该术语涵盖如下文所述的亚单位免疫原性组合物以及包含全杀灭的(whole killed)或减毒的(attenuated)和/或灭活的(inactivated)PCV2b的组合物。
[0046] 根据另一方面，本发明还提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，特别是母源性抗PCV2抗体，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物为亚单位免疫原性组合物，一种包含全杀灭的或减毒的和/或灭活的PCV2b的组合物。
[0047] 如本文所用，术语“亚单位免疫原性组合物”指包含源自PCV2b抗原或与PCV2b抗原同源的至少一种免疫原性多肽或抗原(但不是所有抗原)的组合物。这样的组合物基本上不含完整的PCV2b。因此，“亚单位免疫原性组合物”制备自至少部分纯化或分级分离(优选基本上纯化)的来自PCV2b的免疫原性多肽或其重组类似物。亚单位免疫原性组合物可以包含亚单位抗原或基本上不含其他抗原的所关注的抗原或来自PCV2b的多肽，或者分级分离的形式。优选的免疫原性亚单位组合物包含如本文所述的PCV2b ORF-2蛋白。
[0048] “免疫应答”表示但不限于在宿主中发展对所关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效应：产生或激活抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞，特异性地针对所关注的组合物或疫苗中包括的抗原或多种抗原。优选地，宿主会表现出治疗性或保护性免疫(记忆)应答，从而对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护会这样证实，与PCV2感染相关的表现的数量或严重程度减少，或者缺少与PCV2感染相关的一种或多种表现，特别是感染PCV2b亚型(PCV2b)和/或感染除2b亚型以外PCV2的亚型，病毒血症的发作延迟，病毒持久性减少，总病毒负荷减少和/或病毒分泌减少。
[0049] 如本文所用，术语“抗原”指引发如上所述的免疫应答的氨基酸序列。
[0050] 根据另一方面，如本文所用的免疫原性组合物最优选包含PCV2b的ORF-2表达的蛋白或其片段。本文中用于制备所述组合物和本文提供的方法中使用的PCV2b ORF-2DNA和蛋白PCV2b分离株内高度保守的结构域，因此任何PCV2b ORF-2作为如本文所用的PCV2b ORF-2DNA和/或蛋白的来源会是有效的。优选的PCV2b ORF-2蛋白是SEQ ID NO:1的蛋白。但是，本领域技术人员应当理解这个序列的序列同源性可以变化多达1-5％，并且仍然保留使得其可用于本发明的免疫原性组合物的抗原特征。
[0051] 如本领域已知的，“序列相同性”指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，即参考序列以及与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。序列相同性是这样确定的，在序列已最佳比对以产生最高程度的序列相似性(如通过这类序列的字符串之间的匹配确定的)之后比较给定序列与参考序列。在这样的比对时，序列相同性在位置对位置的基础上确定，例如，如果在特定位置，核苷酸或氨基酸残基是相同的，则序列在该位置是“相同的”。然后将这类位置相同性的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数以给出％序列相同性。序列相同性可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,ed.,Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)；和Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些方法，它们的教导援引加入本文。确定序列相同性的优选方法设计为给出受试序列之间的最大匹配。将确定序列相同性的方法编入可公开获得的确定给定序列之间序列相同性的计算机程序中。这类程序的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可公开获得自NCBI和其他来源(BLAST Manual,Altschul,S.et al.,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教导援引加入本文)。这些程序利用缺省空位权重最佳比对序列以产生给定和参考序列之间最高水平的序列相同性。作为示例，就具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％“序列相同性”的核苷酸序列的多核苷酸而言，意味着除了给定多核苷酸序列可以包括多达15个、优选多达10个、甚至更优选多达5个点突变/参考核苷酸序列的每100个核苷酸，给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中多达15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以缺失或用另一核苷酸取代，或者可以将参考序列中总核苷酸的多达15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸插入参考序列。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或者那些末端位置之间的任何地方，其各自散布于参考序列中的核苷酸中或者散布于参考序列内的一个或多个相邻基团中。类似地，就具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％序列相同性的给定氨基酸序列的多肽而言，意味着除了给定多肽序列可以包括多达15个、优选多达10个、甚至更优选多达5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的每100个氨基酸，所述多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％序列相同性的给定多肽序列，可以将参考序列中多达15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％的氨基酸残基缺失或用另一氨基酸取代，或者可以将参考序列中氨基酸残基总数的多达
15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％的氨基酸插入参考序列。参考序列的这些突变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者那些末端位置之间的任何地方，其各自散布于参考序列中的残基中或者散布于参考序列内的一个或多个相邻基团中。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守氨基酸取代。但是，在确定序列相同性时保守取代并不作为匹配包括在内。
15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％的氨基酸插入参考序列。参考序列的这些突变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者那些末端位置之间的任何地方，其各自散布于参考序列中的残基中或者散布于参考序列内的一个或多个相邻基团中。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守氨基酸取代。但是，在确定序列相同性时保守取代并不作为匹配包括在内。
[0052] 如本文所用，“序列同源性”指一种确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，将两个或更多个序列进行最佳比对，并且如果需要，则引入空位。但是，与“序列相同性”相比，在确定序列同源性时保守氨基酸取代作为匹配计数。换句话说，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或者包含用另一氨基酸或核苷酸的保守取代，或者可以将参考序列中总氨基酸残基或核苷酸的多达15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％的氨基酸或核苷酸(不包括保守取代)插入参考序列。优选地，同源序列包含至少一段50个、甚至更优选至少100个、甚至更优选至少250个、并且甚至更优选至少500个核苷酸。
[0053] “保守取代”指用具有相似特征或特性(包括大小、疏水性等)的另一氨基酸残基或核苷酸取代氨基酸残基或核苷酸，从而整体功能未显著改变。
[0054] “分离的”表示“人工”使其自天然状态改变，即，如果其天然存在，则将其自原始环境改变或移除，或者二者。例如，在本文中采用该术语时，天然存在于活生物体内的多核苷酸或多肽是未“分离的”，但是分离自其天然状态的共存物质的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
[0055] 因此，根据另一方面，本发明还提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，特别是母源性抗PCV2抗体，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b)ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF-2蛋白是本文所述那些蛋白中的任一种。优选地，所述PCV2ORF-2蛋白为：
[0056] i)包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成的多肽；或者[0057] ii)与i)的多肽至少95％同源的任何多肽。
[0058] 根据另一方面，在免疫原性组合物中以有效诱导期望的免疫应答的蛋白包含水平提供PCV2b ORF-2，所述期望的免疫应答即减少由PCV2感染所致或与PCV2感染相关的一种或多种临床表现的发生，减轻所述临床表现的严重程度，或者预防或减少所述临床表现。优选地，PCV2b ORF-2蛋白包含水平为至少0.2μg蛋白/ml最终免疫原性组合物(μg/ml)、更优选约0.2-约400μg/ml、仍更优选约0.3-约200μg/ml、甚至更优选约0.35-约100μg/ml、仍更优选约0.4-约50μg/ml、仍更优选约0.45-约30μg/ml、仍更优选约0.5-约18μg/ml、甚至更优选约0.6-约15μg/ml、甚至更优选约0.75-约8μg/ml、甚至更优选约1.0-约6μg/ml、仍更优选约1.3-约3.0μg/ml、甚至更优选约1.4-约2.5μg/ml、甚至更优选约1.5-约2.0μg/ml、并且最优选约1.6μg/ml。
[0059] 根据另一方面，蛋白包含水平为至少0.2μg/如上文所述的PCV2b ORF-2蛋白/剂量的最终免疫原性组合物(μg/剂量)、更优选约0.2-约400μg/剂量、仍更优选约0.3-约200μg/剂量、甚至更优选约0.35-约100μg/剂量、仍更优选约0.4-约50μg/剂量、仍更优选约0.45-约30μg/剂量、仍更优选约0.5-约18μg/剂量、甚至更优选约0.6-约15μg/ml、甚至更优选约0.75-约8μg/剂量、甚至更优选约1.0-约6μg/剂量、仍更优选约1.3-约3.0μg/剂量、甚至更优选约1.4-约2.5μg/剂量、甚至更优选约1.5-约2.0μg/剂量、并且最优选约1.6μg/剂量。而且，少于20μg/剂量，优选约0.5-18μg/剂量的PCV2b ORF-2蛋白包含水平(抗原含量)适合在幼小动物和/或PCV2抗体阳性(特别是抗PCV2母源性抗体阳性)的动物中赋予免疫性。因此，根据另一方面，本发明还提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，特别是母源性抗PCV2抗体，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药少于20μg/剂量，优选约0.5-
18μg/剂量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物。所述PCV2b ORF2蛋白是本专利申请中描述的任一种。
18μg/剂量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物。所述PCV2b ORF2蛋白是本专利申请中描述的任一种。
[0060] 用于本发明的免疫原性组合物的PCV2b ORF-2蛋白可以以任何方式获得，包括PCV2b ORF2的分离和纯化、标准蛋白合成以及重组方法。获得PCV2b ORF-2蛋白的优选方法在WO06/072065中提供，其教导和内容整体援引加入本文，因为令人惊讶地，已发现其中描述的获得PCV2a ORF-2多肽的方法可以相应地用于获得PCV2b ORF-2蛋白。简单地说，用包含PCV2b ORF-2DNA编码序列的重组病毒载体感染易感细胞，通过重组病毒表达PCV2b ORF-2蛋白，并且通过任何常规方法藉由过滤和灭活从上清液回收表达的PCV2ORF-2蛋白，优选利用二乙烯亚胺(binary ethylenimine)，然后将其中和以终止灭活过程。
[0061] 如本文所用，免疫原性组合物还指包含以下的组合物：i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，以及ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，优选重组杆状病毒。此外，免疫原性组合物可以包含i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，优选重组杆状病毒，以及iii)一部分细胞培养上清液。
[0062] 因此，根据另一方面，本发明还提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，特别是母源性抗PCV2抗体，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b ORF-2蛋白是重组PCV2b ORF-2，优选杆状病毒表达的PCV2b ORF-2蛋白。优选具有如上文所述序列的那些重组或杆状病毒表达的PCV2b ORF-2蛋白。
[0063] 如本文所用，免疫原性组合物还指包含以下的组合物：i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，优选重组杆状病毒，以及iii)一部分细胞培养物，其中约90％的组分大小小于1μm。
[0064] 如本文所用，免疫原性组合物还指包含以下的组合物：i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)以及灭活剂以灭活重组病毒载体，优选BEI，其中约90％的组分i)-iii)大小小于1μm。优选地，BEI以有效灭活杆状病毒的浓度存在，优选以2-约8mM BEI的量，优选约5mM BEI。
[0065] 如本文所用，免疫原性组合物还指包含以下的组合物：i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活剂以灭活重组病毒载体，优选BEI，以及v)中和剂以终止灭活剂介导的灭活，其中约90％的组分i)-iii)大小小于1μm。优选地，如果灭活剂为BEI，则所述组合物包含与BEI等量的硫代硫酸钠。
[0066] 将所述蛋白加入组合物，所述组合物可以向对PCV2感染易感的动物给药。在优选形式中，所述组合物还可以包括本领域技术人员已知的额外组分(还参见Remington's Pharmaceutical Sciences.(1990).18th ed.Mack Publ.,Easton)。此外，所述组合物可以包括一种或多种兽医学可接受的载体。如本文所用，“兽医学可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。在一优选实施方案中，所述免疫原性组合物包含如本文提供的PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，将其与佐剂(优选卡波普(Carbopol))和生理盐水混合。
[0067] 本领域技术人员会理解本文所用的组合物可以加入已知的可注射的生理学上可接受的无菌溶液。为了制备即用溶液用于肠胃外注射或输注，水性等渗溶液如盐水或相应的血浆蛋白溶液可容易地获得。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。
[0068] 如本文所用，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝，皂草苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。所述乳液可以特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油如由烯烃(特别是异丁烯或癸烯)的寡聚化产生的角鲨烷或角鲨烯油；包含直链烷基的酸或醇的酯，更具体而言为植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支化脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，特别是山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选地乙氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter et al.,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.).JohnWiley and Sons,NY,pp51-94(1995)和Todd et al.,Vaccine 15:564-570(1997)。
[0069] 例如，可以使用描述于M.Powell and M.Newman,Plenum Press,1995编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳液以及该书第183页上描述的乳液MF59。
[0070] 佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。已知这些化合物为术语卡波姆(Pharmeuropa Vol.8,No.2,June 1996)。本领域技术人员还可以参考美国专利第2,909,462号，其描述了与聚羟基化化合物交联的这类丙烯酸聚合物，所述聚羟基化化合物具有至少3个(优选不超过8个)羟基，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选基团是包含2-4个碳原子的那些基团，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯类不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其他取代基如甲基。以名称Carbopol；(BF Goodrich,Ohio,USA)出售的产品特别适合。它们可以与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可以提到Carbopol 974P、934P和971P。
最优选是使用Carbopol，特别是使用Carbopol 971P，优选以约500μg-约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量。
最优选是使用Carbopol，特别是使用Carbopol 971P，优选以约500μg-约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量。
[0071] 其他合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)(重组或其他方式)的不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽等。
[0072] 优选地，以约100μg-约10mg/剂量的量添加佐剂。甚至更优选地，以约100μg-约10mg/剂量的量添加佐剂。甚至更优选地，以约500μg-约5mg/剂量的量添加佐剂。甚至更优选地，以约750μg-约2.5mg/剂量的量添加佐剂。最优选地，以约1mg/剂量的量添加佐剂。
[0073] 此外，所述组合物可以包括一种或多种药学可接受的载体。如本文所用，“药学可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。最优选地，由此提供的组合物包含回收自体外培养细胞的上清液的PCV2b ORF-2蛋白，其中用包含PCV2b ORF-2DNA且表达PCV2b ORF-2蛋白的重组病毒载体感染所述细胞，并且其中用约2-约8mM BEI，优选用约5mM BEI处理所述细胞培养物以灭活病毒载体，以及用等浓度的中和剂，优选硫代硫酸钠溶液至约2-约8mM，优选约5mM的终浓度。
[0074] 本发明还涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活剂以灭活重组病毒载体，优选BEI，以及v)中和剂以终止灭活剂介导的灭活，优选与BEI等量的硫代硫酸钠；以及vi)合适的佐剂，优选上述量的卡波普971；其中约90％的组分i)-iii)大小小于1μm。根据另一方面，这种免疫原性组合物还包含药学可接受的盐，优选生理学上可接受的浓度的磷酸盐。优选地，将所述免疫原性组合物的pH调节至生理学pH，意指约6.5-7.5。
[0075] 如本文所用，免疫原性组合物还指每1ml包含以下的组合物：i)至少1.6μg的上述PCV2b ORF-2蛋白，优选少于20μg；ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的杆状病毒；iii)一部分细胞培养物；iv)约2-8mM BEI；v)与BEI等量的硫代硫酸钠；以及vi)约1mg卡波普971；以及vii)生理学上可接受的浓度的磷酸盐；其中约90％的组分i)-iii)大小小于1μm，并且将所述免疫原性组合物的pH调节至约6.5-7.5。
[0076] 所述免疫原性组合物还可以包括一种或多种其他免疫调节剂，例如，白介素、干扰素或其他细胞因子。所述免疫原性组合物还可以包括庆大霉素和硫柳汞(Merthiolate)。虽然本领域技术人员可以容易地确定可用于本发明的上下文的佐剂和添加剂的量和浓度，但是本发明涵盖包含约50μg-约2000μg的佐剂和优选约250μg/ml剂量的疫苗组合物的组合物。因此，如本文所用，免疫原性组合物还指包含约1ug/ml-约60μg/ml抗生素，并且更优选少于约30μg/ml抗生素的组合物。
[0077] 如本文所用，免疫原性组合物还指包含以下的组合物：i)上述任何PCV2b ORF-2蛋白，优选以上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2b ORF-2蛋白的病毒载体，iii)一部分细胞培养物，iv)灭活剂以灭活重组病毒载体，优选BEI，以及v)中和剂以终止灭活剂介导的灭活，优选与BEI等量的硫代硫酸钠；vi)合适的佐剂，优选上述量的卡波普971；vii)药学可接受的浓度的盐水缓冲液，优选磷酸盐；以及viii)抗微生物活性剂；其中约90％的组分i)-iii)大小小于1μm。
[0078] 为了研究PCV2b ORF2蛋白可能对母体抗体的干扰，可以进行一项研究，其中在疫苗接种时确定研究动物的抗体滴度，然后将其分组为低、中和高抗体类别：<1:100的几何平均滴度视为低抗体滴度，1:100-1:1000的滴度视为中抗体滴度，而>1:1000的滴度视为高抗体滴度。这种分组模式与加拿大实地研究中进行的分组模式可比，所述加拿大实地研究中1:80的抗体滴度视为低，1:640的抗体滴度视为中，而>1:1280的抗体滴度视为高(Larochelle et al.,2003,Can.J.Vet.Res.；67:114-120)。为了分析在疫苗接种时低、中和高抗体滴度对病毒血症的影响，比较疫苗接种和安慰剂治疗的动物的病毒血症的发生、终止、持续时间，阳性采样天数以及病毒负荷。抗PCV2抗体，特别是母源性抗体的存在优选对任何那些参数没有显著影响。换句话说，PCV2b ORF2蛋白在动物中预防和治疗PCV2感染或者减少PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现中的效力优选在疫苗接种当天不受抗PCV2抗体存在的影响，优选高达1:100的抗PCV2抗体滴度，优选超过1:100，甚至更优选超过1:250，甚至更优选超过1:500，甚至更优选超过1:640；甚至更优选超过1:750，最优选超过1:1000。这种效果可以在一次注射疫苗接种实验中得到证实，一次注射疫苗接种实验表示PCV2b ORF2蛋白仅给药一次，而没有任何随后的PCV2b ORF2蛋白给药。
[0079] 检测和定量抗PCV2抗体的方法是本领域公知的。例如，PCV2抗体的检测和定量可以通过如Magar et al.,2000,Can.J.Vet Res.；64:184-186或Magar et al.,2000,J.Comp.Pathol.；123:258-269所述的间接免疫荧光进行。用于抗PCV2抗体定量的其他测定th描述于Opriessnig et al.,2006,37 Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians。此外，本领域技术人员可以使用的间接免疫荧光测定包括以下步骤：(i)将约20.000-60.000个PK15或VIDO R1细胞/孔接种在96孔板上，(ii)当单层约65-
85％汇合时，用PCV2分离株感染细胞，(iii)将感染的细胞温育48小时，(iv)去除培养基并将细胞用PBS洗涤2次，(v)丢弃洗涤缓冲液并用冷50/50甲醇/丙酮固定剂在约-20℃下处理细胞约15min，(vi)丢弃固定剂并将平板空气干燥，(vii)制备猪血清样品在PBS中的系列稀释液以及抗PCV2阳性和阴性对照样品(阳性对照和阴性对照样品)的系列稀释液，(viii)将系列稀释液添加至板并温育以允许抗体(如果血清样品中存在)在36.5±1℃下结合约1hr，(ix)将板用PBS洗涤3次并丢弃PBS，(x)将板用PBS中1:100稀释的商业山羊抗猪FITC缀合物染色并在36.5±1℃下温育约1hr，(xi)将微孔板从恒温箱中取出，丢弃缀合物并将板用PBS洗涤2次，(xii)利用UV显微术读取板并报告单独的孔为阳性或阴性，其中阳性对照和阴性对照样品用来监测测试系统，(xiii)利用表现出特异性IFA反应性的最高稀释液和阳性孔的数量/稀释液计算血清抗体滴度，或者利用适当的Reed-Muench公式计算50％终点。
85％汇合时，用PCV2分离株感染细胞，(iii)将感染的细胞温育48小时，(iv)去除培养基并将细胞用PBS洗涤2次，(v)丢弃洗涤缓冲液并用冷50/50甲醇/丙酮固定剂在约-20℃下处理细胞约15min，(vi)丢弃固定剂并将平板空气干燥，(vii)制备猪血清样品在PBS中的系列稀释液以及抗PCV2阳性和阴性对照样品(阳性对照和阴性对照样品)的系列稀释液，(viii)将系列稀释液添加至板并温育以允许抗体(如果血清样品中存在)在36.5±1℃下结合约1hr，(ix)将板用PBS洗涤3次并丢弃PBS，(x)将板用PBS中1:100稀释的商业山羊抗猪FITC缀合物染色并在36.5±1℃下温育约1hr，(xi)将微孔板从恒温箱中取出，丢弃缀合物并将板用PBS洗涤2次，(xii)利用UV显微术读取板并报告单独的孔为阳性或阴性，其中阳性对照和阴性对照样品用来监测测试系统，(xiii)利用表现出特异性IFA反应性的最高稀释液和阳性孔的数量/稀释液计算血清抗体滴度，或者利用适当的Reed-Muench公式计算50％终点。
[0080] 这样的测定描述于WO 2008/076915 A2的实施例2中。
[0081] 在结果有争议的情况下以及在有疑问的任何问题中，本文提到的抗PCV2滴度指是/可以通过这个测定估计的抗PCV2滴度。
[0082] 因此，根据另一方面，本发明提供一种在动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，特别是母体抗体，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，优选少于20μg/剂量，其中所述动物具有可检测的抗PCV2抗体滴度，所述抗PCV2抗体滴度高达1:100，优选超过1:100，甚至更优选超过1:250，甚至更优选超过1:500，甚至更优选超过1:640，甚至更优选超过1:750，最优选超过1:1000。优选地，如WO 2008/076915 A2的实施例2中示例性描述的，上述抗PCV2抗体滴度在特异性抗PCV2免疫测定中，优选在如上文所述的测定中可检测且可定量。更优选地，抗PCV-2抗体是母源性抗体。最优选地，PCV2b ORF2蛋白仅给药一次，优选以少于20μg/剂量的剂量。
[0083] 仅具有低滴度(<1:100)或中滴度(<1:1000)的母源性抗PCV2抗体的小猪不足以抵抗在3周龄之前发生的PCV2感染。因此，在生命的非常早期疫苗接种是可取的。在本发明的上下文中，优选在3周龄或3周龄之前疫苗接种/治疗动物。此外，无论现有初始抗体滴度如何，超过1:1000的抗PCV2抗体滴度优选对PCV2疫苗的效力没有影响。例如，与未疫苗接种的动物相比，高滴度动物(抗PCV2抗体滴度>1:1000)的疫苗接种优选导致病毒血症持续时间较短，病毒血症的终止较早，病毒血症采样天数较少，并且基因组等同物的总和/ml减少。当比较疫苗接种的“高”、“中”和“低滴度动物”时，关于PCV2病毒血症的不同参数，优选未观察到显著差异。而且在高抗PCV2抗体滴度的存在下，用于疫苗接种的PCV2b ORF2蛋白优选仍显著减少血液中的病毒血症(病毒血症的终止、病毒血症的持续时间、病毒负荷)。优选地，当比较疫苗接种组的低和高滴度动物时，关于活体体重未发现差异。此外，与具有初始高抗体滴度的安慰剂处理的动物相比，在疫苗接种/治疗时具有高抗PCV2抗体滴度(>1:1000)的疫苗接种的动物还优选在病毒血症发生之后表现出显著较高的体重。因此，根据一优选方面，用PCV2b ORF2蛋白疫苗接种/治疗1日龄或更大的动物是可行的。但是，疫苗接种应当在最初8周龄，优选在最初7周龄内进行。因此，根据另一方面，本发明提供一种在动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，在1日龄或更晚，但是优选不晚于8周龄，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白。根据一优选实施方案，需要少于20μg/剂量PCV2b ORF2蛋白以在这样的动物中赋予免疫性。根据一更优选的实施方案，将PCV2b ORF2蛋白，优选少于20μg/剂量向需要这样的治疗的动物仅给药一次。
[0084] 根据另一更一般的方面，本发明提供一种在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白。
[0085] 如本文所用，术语“幼小动物”指1-22日龄的动物。优选地，术语幼小动物表示1-20日龄的动物。更优选地，术语幼小动物指1-15日龄的动物，甚至更优选1日龄-14日龄的动物，甚至更优选1-12日龄的动物，甚至更优选1-10日龄的动物，甚至更优选1-8日龄的动物，甚至更优选1-7日龄的动物，甚至更优选1-6日龄的动物，甚至更优选1-5日龄的动物，甚至更优选1-4日龄的动物，甚至更优选1-3日龄的动物，甚至更优选1或2日龄的动物，最优选1日龄的动物。因此，根据另一方面，本发明提供一种在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，所述动物为1-22日龄，优选1-20日龄，更优选1-15日龄，甚至更优选1-14日龄，甚至更优选1-12日龄，甚至更优选1-10日龄，甚至更优选1-8日龄，甚至更优选1-7日龄，甚至更优选1-6日龄，甚至更优选1-5日龄，甚至更优选1-4日龄，甚至更优选1-3日龄，甚至更优选1或2日龄，最优选1日龄。例如，在19-22日龄免疫接种/治疗优选表现出高效力的免疫接种。此外，在12-18日龄，优选12-14日龄免疫接种/治疗优选非常有效地减少与PCV2感染相关的临床表现，减少总病毒负荷，减少病毒血症的持续时间，延迟病毒血症的发作，体重增加。此外，在1周龄免疫接种优选非常有效地减少与PCV2感染相关的临床表现，减少总病毒负荷，减少病毒血症的持续时间，延迟病毒血症的发作，体重增加。优选地，需要少于20μg/剂量PCV2b ORF2蛋白以在那些幼小动物中赋予免疫性。根据一更优选的实施方案，将PCV2b ORF2蛋白，优选少于20μg向需要这样的治疗的幼小动物仅给药一次。
[0086] 由于PCV2在该领域普遍存在，因此大部分幼小小猪就PCV2而言是血清阳性的。因此，根据另一方面，本发明提供一种在幼小动物中，优选在免疫接种当天具有抗PCV2抗体的动物，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，所述动物为1-22日龄，优选1-20日龄，更优选1-15日龄，甚至更优选1-14日龄，甚至更优选1-12日龄，甚至更优选1-10日龄，甚至更优选1-8日龄，甚至更优选1-7日龄，甚至更优选1-6日龄，甚至更优选1-5日龄，甚至更优选1-4日龄，甚至更优选1-3日龄，甚至更优选1或2日龄，最优选1日龄。优选地，在免疫接种/治疗当天，所述幼小动物具有可检测的抗PCV2抗体滴度，所述抗PCV2抗体滴度在免疫接种/治疗当天高达1:100，优选超过1:100，甚至更优选超过1:250，甚至更优选超过1:500，甚至更优选1:640，甚至更优选超过1:750，最优选超过1:1000。优选地，需要少于20μg/剂量PCV2b ORF2蛋白以在那些幼小动物中赋予足够的免疫性。根据更优选的实施方案，将PCV2b ORF2蛋白，优选少于20μg向需要这样的治疗的幼小动物仅给药一次。
[0087] 如上文所述，与未免疫接种的对照动物相比，用PCV2b ORF2蛋白免疫接种/治疗幼小动物优选导致病毒血症期缩短。与相同物种的未免疫接种的对照动物相比，平均缩短时间可以优选为例如9.5天。因此，根据另一方面，本发明还提供一种在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，其中所述治疗或预防导致与相同物种的未治疗的对照组的动物相比，病毒血症期缩短5天或更多天，优选6天或更多天，甚至更优选7天或更多天，甚至更优选8天或更多天，甚至更优选9天，甚至更优选10天，甚至更优选12天，甚至更优选14天，最优选超过16天。在某些情况下，病毒血症期优选缩短超过20天。一般来说，幼小小猪的免疫接种优选导致体重增加的损失减少、病毒血症的持续时间较短、病毒血症终止较早和病毒负荷较低。因此，根据另一方面，本发明提供一种在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，其中所述PCV2感染的治疗或预防导致与相同物种的未治疗的对照组的动物相比，疫苗效力参数改进，所述疫苗效力参数选自体重增加的损失减少、病毒血症的持续时间较短、病毒血症终止较早、病毒负荷较低或它们的组合。优选地，需要少于20μg/剂量PCV2b ORF2蛋白来引起上述任何改进的疫苗效力参数。此外，这类改进的疫苗效力参数是通过仅一个剂量的单次给药达到的。
[0088] 如本文所用，术语“有效量”表示但不限于在给药所述有效剂量的PCV2b ORF2蛋白的动物中引发或能够引发免疫应答的PCV2b ORF2蛋白的量。优选地，有效量定义为赋予至少10周持续时间的免疫性(DOI)、优选至少12周(DOI)、更优选至少15周(DOI)、最优选至少20周(DOI)的PCV2b ORF2蛋白的量。
[0089] 有效的量取决于疫苗的成分和给药的时间表。通常，当灭活病毒或修饰的活病毒制品用于联合疫苗时，疫苗的量包含约102.0-约109.0TCID50/剂量，优选约103.0-约108.0TCID50/剂量，更优选约104.0-约108.0TCID50/剂量。特别地，当修饰的活PCV2b用于疫苗时，向易感动物给药的推荐剂量优选为103.0TCID50(组织培养感染剂量50％终点)/剂量-约
6.0 4.0 5.0
10 TCID50/剂量，并且更优选约10 TCID50/剂量-约10 TCID50/剂量。一般来说，当使用纯化的抗原时，抗原的量为0.2-5000微克，以及102.0-109.0TCID50，优选103.0-106.0TCID50，更优选104.0-105.0TCID50。
6.0 4.0 5.0
10 TCID50/剂量，并且更优选约10 TCID50/剂量-约10 TCID50/剂量。一般来说，当使用纯化的抗原时，抗原的量为0.2-5000微克，以及102.0-109.0TCID50，优选103.0-106.0TCID50，更优选104.0-105.0TCID50。
[0090] 亚单位疫苗通常以至少0.2μg蛋白/剂量的蛋白包含水平给药，优选以约0.2-约400μg/剂量，仍更优选以约0.3-约200μg/剂量，甚至更优选以约0.35-约100μg/剂量，仍更优选以约0.4-约50μg/剂量，仍更优选以约0.45-约30μg/剂量，仍更优选以约0.5-约18μg/剂量，仍更优选以约0.6-约16μg/剂量，甚至更优选以约0.75-约8μg/剂量，甚至更优选以约
1.0-约6μg/剂量，仍更优选以约1.3-约3.0μg/剂量。
1.0-约6μg/剂量，仍更优选以约1.3-约3.0μg/剂量。
[0091] 优选地，上述免疫原性组合物的预防使用有效减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现，优选在幼小动物中和/或在治疗当天具有对PCV2的被动免疫的动物中。特别地，如本文所述的免疫原性组合物的预防使用，特别是包含PCV2b ORF-2蛋白的组合物的预防使用优选有效减少在治疗/疫苗接种当天感染PCV2且具有母体抗PCV-2抗体的动物中的淋巴结病、淋巴耗竭和/或多核/巨大组织细胞。例如，据发现如本文所述的免疫原性组合物的预防使用有效减少淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、减少的平均日增重、肺部炎症、肺组织的PCV2抗原的阳性IHC、增加的死亡率。此外，如本文所述的免疫原性组合物的预防使用优选有效减少(1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，(2)皮肤苍白或黄疸，(3)具有斑点的萎缩性肝，(4)胃溃疡，(5)肾炎,以及(6)生殖障碍，例如流产、死产、干尸化等，(7)软膜(Pia)样损伤，通常已知与胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)感染(回肠炎)有关，(8)淋巴结病，(9)淋巴耗竭,和/或(10)多核/巨大组织细胞，(11)猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，(12)PCVAD相关的死亡，(13)PCVAD相关的体重减轻，(14)减少的生长变异性，(15)降低的“侏儒”频率，(16)减少的与猪繁殖与呼吸疾病综合征(PRRSV)的共感染。这样的免疫原性组合物还有效提高经济上重要的生长参数如屠宰时间、酮体重、瘦肉率。因此如本文所用，术语“临床表现”表示但不限于(1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，(2)皮肤苍白或黄疸，(3)具有斑点的萎缩性肝，(4)胃溃疡，(5)肾炎,以及(6)生殖障碍，例如流产、死产、干尸化等，(7)软膜样损伤，通常已知与胞内劳森菌感染(回肠炎)有关，(8)淋巴结病，(9)淋巴耗竭,和/或(10)多核/巨大组织细胞，(11)猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，(12)PCVAD相关的死亡，(13)PCVAD相关的体重减轻，(14)减少的生长变异性，(15)降低的“侏儒”频率，(16)减少的与猪繁殖与呼吸疾病综合征(PRRSV)的共感染，(17)淋巴炎症，(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC，(19)病毒血症，(20)鼻脱落，(21)发热，(22)减少的平均日增重，(23)肺部炎症，(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC，(25)增加的死亡率。此外，本文所述的免疫原性组合物减少总圆环病毒负荷，包括发作较迟、持续时间较短、病毒血症终止较早和减少的病毒负荷及其在幼小动物(特别是在疫苗接种当天具有抗PCV2抗体的那些幼小动物)中的免疫抑制影响，从而导致较高水平的总体疾病抵抗性以及减少的PCV2相关疾病和临床表现的发生率。
[0092] 因此，根据另一方面，本发明提供一种在幼小动物和/或动物中，优选具有抗PCV2抗体的动物，治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物，其中那些临床表现选自：(1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，(2)皮肤苍白或黄疸，(3)具有斑点的萎缩性肝，(4)胃溃疡，(5)肾炎,以及(6)生殖障碍，例如流产、死产、干尸化等，(7)软膜样损伤，通常已知与胞内劳森菌感染(回肠炎)有关，(8)淋巴结病，(9)淋巴耗竭,和/或(10)多核/巨大组织细胞，(11)猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，(12)PCVAD相关的死亡，(13)PCVAD相关的体重减轻，(14)减少的生长变异性，(15)降低的“侏儒”频率，(16)减少的与猪繁殖与呼吸疾病综合征(PRRSV)的共感染，(17)淋巴炎症，(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC，(19)病毒血症，(20)鼻脱落，(21)发热，(22)减少的平均日增重，(23)肺部炎症，(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC，(25)增加的死亡率。根据另一方面，本发明提供一种在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现的方法，所述方法包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白，其中那些临床表现选自：(1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，(2)皮肤苍白或黄疸，(3)具有斑点的萎缩性肝，(4)胃溃疡，(5)肾炎,以及(6)生殖障碍，例如流产、死产、干尸化等，(7)软膜样损伤，通常已知与胞内劳森菌感染(回肠炎)有关，(8)淋巴结病，(9)淋巴耗竭,和/或(10)多核/巨大组织细胞，(11)猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，(12)PCVAD相关的死亡，(13)PCVAD相关的体重减轻，(14)减少的生长变异性，(15)降低的“侏儒”频率，(16)减少的与猪繁殖与呼吸疾病综合征(PRRSV)的共感染，(17)淋巴炎症，(18)淋巴组织的PCV2抗原的阳性IHC，(19)病毒血症，(20)鼻脱落，(21)发热，(22)减少的平均日增重，(23)肺部炎症，(24)肺组织的PCV2抗原的阳性IHC，(25)增加的死亡率。
[0093] 本发明的组合物可以口服、真皮内、气管内或阴道内施用。所述组合物优选可以肌肉内或鼻内施用，最优选肌肉内施用。在动物体内，可以证实通过静脉内或通过直接注射入靶组织来施用如上文所述的药物组合物是有利的。对于全身施用，优选静脉内、血管内、肌肉内、鼻内、动脉内、腹腔内、口服或鞘内途径。更局部的施用可以皮下、真皮内、皮内、心内、叶内(intralobally)、髓内、肺内或者直接在待治疗的组织或靠近待治疗的组织(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)实现。根据治疗所期望的持续时间和有效性，本发明组合物可以给药一次或数次，还可以间歇给药，例如以每日计给药数天、数周或数月且以不同剂量。
[0094] 优选地，向有需要的个体肌肉内给药一剂量的如上文所述的免疫原性组合物。根据另一方面，将如本文所述的PCV2b ORF2蛋白或包含任何这样的PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物装入瓶中并以一(1)mL/剂量给药。因此，根据另一方面，本发明还提供1ml免疫原性组合物，其包含如本文所述的PCV2b ORF2蛋白，用于在幼小动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现，包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白。根据另一方面，本发明还提供1ml免疫原性组合物，其包含如本文所述的PCV2b ORF2蛋白，在动物中，优选在具有抗PCV2抗体的动物中治疗或预防PCV2感染或者减少由PCV2感染引起或与PCV2感染相关的临床表现，包括以下步骤，向需要这样的治疗的动物给药有效量的PCV2b ORF2蛋白或包含PCV2b ORF2蛋白的免疫原性组合物。
[0095] 根据另一方面，向有需要的个体至少另外给药一次至少一剂量的如上文所述的免疫原性组合物，其中第二次或任何另外的给药在初始或任何以前的给药之后至少14天给予。优选地，所述免疫原性组合物与免疫刺激剂一起给药。优选地，所述免疫刺激剂给予至少2次。优选地，在免疫刺激剂的第一次与第二次或任何另外的给药之间有至少3天，更优选至少5天，甚至更优选至少7天。优选地，在本文提供的免疫原性组合物的初始给药之后至少10天，优选15天，甚至更优选20天，甚至更优选至少22天给予免疫刺激剂。优选的免疫刺激剂为例如匙孔血蓝蛋白(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂乳化(KLH/ICFA)。但是，应当理解，还可以使用本领域技术人员已知的任何其他免疫刺激剂。如本文所用，术语“免疫刺激剂”表示可以触发免疫应答的任何物质或组合物，优选不引发或增加特异性免疫应答，例如，针对特异性病原体的免疫应答。进一步指示以合适的剂量给药免疫刺激剂。以下实例示出按照本发明的优选材料和方法。尽管与本文所述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料可以用于本发明的实施或测试，但是现在描述优选的方法、装置和材料。但是，应当理解，这些实例仅通过示例的方式提供，并且其中任何均不应视为对本发明总范围的限制。
[0096] 实施例1
[0097] PCV2b ORF-2蛋白的制备
[0098] 使来自液氮储存器的初始SF+细胞在无菌转瓶中的Sf-900III不含血清的昆虫培养基(Invitrogen Cat#12658-027)中悬浮生长，持续搅拌。使培养物在具有25-150mL Sf-900III不含血清的昆虫培养基的100mL-250mL转瓶中生长。当细胞增殖至4.0-8.0x 106个细胞/mL的细胞密度时，将它们以2.0x 106个细胞/mL的种植密度分至新容器中。随后使扩大培养物在大小多达36升的转瓶或多达300升的不锈钢生物反应器中于25-29℃下生长2-7天的时间。
[0099] 接种之后，将烧瓶在28℃下温育>1小时。随后，将每个烧瓶用包含PCV2b ORF-2基因(SEQ ID NO:3)的重组杆状病毒接种。包含PCV2b ORF-2基因的重组杆状病毒按照WO06/072065的说明产生。用杆状病毒接种之后，然后将烧瓶在27±2℃下温育4天，并且期间还以
100rpm搅拌。所述烧瓶使用通风盖以允许空气流动。温育之后，收获所得的上清液，将其过滤以去除细胞碎片并灭活。通过使上清液的温度升至37±2℃来将其灭活，并且向上清液添加二乙烯亚胺(BEI)至5mM的终浓度。然后将样品连续搅拌72-96hr。添加给出5mM的最终最小浓度的1.0M硫代硫酸钠溶液以中和任何残余的BEI。灭活之后，添加用磷酸盐缓冲液和卡波普缓冲的PCV2b ORF-2至约0.5-2.5mg/剂量。最终剂量包含约16μg PCV2ORF-2b蛋白。
100rpm搅拌。所述烧瓶使用通风盖以允许空气流动。温育之后，收获所得的上清液，将其过滤以去除细胞碎片并灭活。通过使上清液的温度升至37±2℃来将其灭活，并且向上清液添加二乙烯亚胺(BEI)至5mM的终浓度。然后将样品连续搅拌72-96hr。添加给出5mM的最终最小浓度的1.0M硫代硫酸钠溶液以中和任何残余的BEI。灭活之后，添加用磷酸盐缓冲液和卡波普缓冲的PCV2b ORF-2至约0.5-2.5mg/剂量。最终剂量包含约16μg PCV2ORF-2b蛋白。
[0100] 实施例2
[0101] 这个研究是实验猪圆环病毒2型ORF2b疫苗抗PCV2ORF2a和PCV2ORF2b攻击的效力评价。将60只7周龄的剖腹产的剥夺初乳的(CDCD)小猪用于这个研究并分为4组；1)15只用毒性PCV2a攻击的用实验猪圆环病毒疫苗(2b型，杀死的杆状病毒载体)免疫接种的猪，2)15只用毒性PCV2a攻击的未免疫接种的攻击的对照猪，3)15只用毒性PCV2b攻击的用实验猪圆环病毒疫苗(2b型，杀死的杆状病毒载体)免疫接种的猪，以及，4)15只用毒性PCV2b攻击的未免疫接种的攻击的对照猪。在第0天，向组1和3的猪肌肉内(IM)给药1mL疫苗，而组2和4，未免疫接种的攻击对照猪未接受任何治疗。在第28天，将组1和2中的所有猪用毒性PCV2-ORF2a以5.0Log10TCID50/mL活病毒的大约剂量1mL鼻内(IN)和1mL IM攻击。在第28天，将组3和4中的所有猪用毒性PCV2-ORF2b以3.0Log10TCID50/mL活病毒的大约剂量1mL鼻内(IN)和1mL IM攻击。在第25天和第31天，所有猪IM接受2.0mL不完全弗氏佐剂中乳化的匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)。每天监测猪的临床表现，并且定期抽血用于血清学测试。在第56天，将所有猪尸检，收集所选组织并进行大体病理学观察。
[0102] 在所有测试的参数中，当与它们各自的攻击对照组进行比较时，PCV-PCV2b免疫接种的动物均表现出减少。对于测试的参数，肠系膜和气管支气管淋巴结表现出最大的减少。在测试的参数中，用髂淋巴结观察到较少减少。当比较用PCV2a攻击的PCV2b免疫接种的动物与未免疫接种的对照时，扁桃体样品也表现出减少，除了淋巴炎症增加。当比较PCV2b免疫接种的动物与它们各自的PCV2b和PCV2a未免疫接种的对照时，肺炎症评分也表现出减少。当在第56天(攻击后4周)进行比较时，PCV2b免疫接种的动物在用PCV2a攻击时具有少
20％的病毒血症动物，并且在用PCV2b攻击时具有平均少30％的病毒血症动物。还在图1-5中示出的获得自这个研究的数据表明对暴露于毒性PCV2b和PCV2a毒株的小猪，PCV2-ORF2b疫苗减少感染。
20％的病毒血症动物，并且在用PCV2b攻击时具有平均少30％的病毒血症动物。还在图1-5中示出的获得自这个研究的数据表明对暴露于毒性PCV2b和PCV2a毒株的小猪，PCV2-ORF2b疫苗减少感染。
[0103] 实施例3
[0104] 这个研究评价在3周龄给予时猪圆环病毒2型ORF2b原型疫苗(包括重组杆状病毒表达的PCV2b ORF2蛋白)抗PCV2 ORF2b(PCV2b)攻击的效力。
[0105] 将42只健康的CDCD猪(11只猪来自2窝中的1窝，而10只猪来自2窝中的1窝)限制并安置在6个围栏中。将一个围栏内的猪平等地随机分配至3个治疗组中的1个：组1(严格的阴性对照)由6只猪组成且不接受治疗，组2(攻击对照，n＝18)不接受治疗，以及组3(实验PCV2b疫苗，n＝18)。治疗组的概况在表1中提供。
[0106] 表1:
[0107]
[0108] 在D0，猪为24周龄，并且向组3的猪肌肉内(IM)给药1mL剂量的疫苗。在D11和D17，所有猪均肌肉内(IM)接受2.0mL剂量的KLH/ICFA。在攻击之前从组2取出1只猪(条件差)，并且攻击之前从组3取出2只猪(组B沙门氏菌(Salmonella物种)，阿贡纳沙门菌(S.agona))。在D14将所有猪用5.25log10TCID50/mL的活毒性PCV2b在右颈1.0mL IM和1.0mL鼻内攻击。每天检测猪的总体健康。在D-4、D14、D21、D28、D33和D42采集血液样品，并且在所有天数(除了Day-4)通过定量实时聚合酶链反应测试血清的PCV2病毒血症。对照组的18％(3/17)的猪在研究结束之前死亡，相比之下，免疫接种的组中0％的猪(0/16只猪)死亡。在对照组中，在D39两只猪和在D40一只猪濒死或发现死亡，相比之下，在免疫接种的组中直至研究结束仍没有猪濒死或发现死亡。在D42将所有存活的猪安乐死，将扁桃体样品、气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结和髂淋巴结收集入福尔马林。病理学家将各组织评分为淋巴耗竭、炎症和定殖(免疫组织化学)阴性或阳性(1-3的严重程度评分)。
[0109] 基于组织学结果，缓解分数(和较低的置信区间)对于淋巴耗竭为0.511(0.4043)，对于淋巴炎症为0.392(0)，而对于淋巴定殖为0.617(0.4)，图6。因此，观察到与攻击对照相比，在免疫接种的猪中淋巴耗竭、淋巴炎症和淋巴定殖的缓解是显著的。而且，通过利用PCV2b orf2特异性引物(Opriessnig et al.Vet Res.201041(3):31，其援引加入本文)的定量RT-PCR病毒血症的分析显示与攻击对照相比，免疫接种的猪中的病毒负荷随时间减少(图7)。
[0110] 在本发明的上下文和随此提供的实验数据内，特别考虑以下：
[0111] -关于淋巴耗竭：为了支持“辅助预防淋巴耗竭”的证据，如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)的一个或多个对于淋巴耗竭是组织学阳性的，则认为猪是阳性的；
[0112] -关于淋巴炎症：为了支持“辅助预防淋巴炎症”的证据，如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)的一个或多个对于淋巴炎症是组织学阳性的，则认为猪是阳性的；
[0113] -关于淋巴定殖：为了证实在病毒暴露后4周猪清除感染，如果4个淋巴组织样品(扁桃体、TBLN、MLN或ILN)的一个或多个通过IHC是PCV2淋巴定殖阳性的，则认为猪是阳性的；
[0114] -关于病毒血症：为了支持“辅助预防病毒血症”的证据，如果血清RT-PCR测试≥1.0x 104PCV2基因组等同物(线性较低水平)，则认为猪在采样当天是阳性的；以及[0115] -关于死亡率：为了支持“辅助预防死亡率”的证据，如果猪死于攻击(死亡或为了人道原因需要安乐死，具有可归因的临床表现、肉眼病变和/或与PCV2一致的组织学病变)，则认为猪是阳性的。
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