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诊断和治疗癌症的化合物和方法

阅读：1020发布：2020-09-21

专利汇可以提供诊断和治疗癌症的化合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 治疗 和诊断癌症的化合物和方法。还提供了 离析 人 氨 基酸运载体或其亚单位和基本纯化运载体或亚单位的方法。特别是还公开了与 肿瘤 共存的谷氨酰胺运载体，但是它们通常没有活性或有很小活性，或者在大多数非肿瘤细胞中少量存在。还公开了有关氨基酸运载体的诊断产品和方法以及 生物 制品。还提供了用于人和动物治疗的方法和治疗用品，包括抗谷氨酰胺化合物、谷氨酰胺类似物、 抗体 组合物、药用组合物和 疫苗 。还公开了用于筛选抑制谷氨酰胺摄入肿瘤细胞的化合物的筛选方法和设备。，下面是诊断和治疗癌症的化合物和方法专利的具体信息内容。

1、基本纯化的人氨基酸运载体或其片段或亚单位。
2、基本纯化的哺乳动物谷氨酰胺或丙氨酸运载体或其片段或亚单位。
3、基本纯化的肿瘤谷氨酰胺运载体或其片段或亚单位。
4、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们存在在固体型肿瘤中。
5、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们存在于淋巴瘤或血癌中。
6、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们是Na+依赖性的。
7、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们能除去血液和周围的组织中的谷氨酰胺，还能够起氮陷阱的作用。
8、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们与对固体肿瘤中的谷氨酰胺运载体或其片段或亚单位有抗性的鼠、兔或其它抗血清反应。
9、根据权利要求8的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们与对HeLa细胞谷氨酰胺运载体，或其片段或亚单位有抗性的鼠、兔或其它抗血清反应。
10、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们与对淋巴瘤的谷氨酰胺运载体、或其片段或亚单位有抗性的鼠或兔抗血清产生阳性抗体-抗原反应。
11、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，在还原条件下用SDS-PAGE对它们测定时，其Mr值约为42，000。
12、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，用SDS-PAGE对它们测定时，其Mr值约为53，000。
13、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，它们存在于选自HEP-2，MM253Cl，KB，Detroit-562，HeLa和T24的细胞系。
14、根据权利要求3的基本纯化的运载体、片段或亚单位，其中运载体存在于选自NAMALWA、EB2、HEp-2、MM253Cl、KB、Detroit-562、HeLa和T24的细胞系。
15、根据权利要求3的基本纯化的运载体TGTI，其中当运载体是在HeLa细胞中时，它的Vm值约为6.8±0.35nmol/min/mg蛋白质，Km值约为0.03±0.0015mM，Hill系数约为1.0±0.05，所述各值是在细胞内谷氨酰胺含量至少约为10mM时测定的。
16、根据权利要求3的基本纯化的运载体TGTⅡ，其中当运载体在HeLa细胞中时，它的Vm值约为25±2nmol/min/mg蛋白质，Km值约为0.15±0.0075mM，Hill系数约为2.0±0.2，所述各值是在细胞内谷氨酰胺含量至少为10mM时测定的。
17、根据权利要求3的基本纯化的运载体TGTⅢ，其中当运载体在HeLa细胞中时，它的Vm值约为22.0±1.1nmol/min/mg蛋白质，Km约为1.8±0.10mM，Hill系数约为6.3±0.31，所述各值是在细胞内谷氨酰胺含量至少为10mM时测定的。
18、基本纯化的肿瘤谷氨酰胺运载体Ⅱ，该运载体Ⅱ：
a）用SDS-PAGE测定时，Mr值约为42，000;
b）是Na+依赖性的;
c）可从血液和周围的组织中除去谷氨酰胺，还可起氮陷阱的作用;
d）与对HeLa细胞谷氨酰胺运载体有抗性的鼠或兔抗血清产生阳性抗体-抗原反应;
e）有组氨酸作为它主要的氨基酸抑制剂;
f）具有下降的适应调节;
g）有碳水化合物残基;
h）可从HeLa细胞分离出。
19、根据权利要求18的基本纯化的运载体，其中当运载体在HeLa细胞中时，它的Vm值约为25±2nmol/min/mg蛋白质，Km值约为0.15±0.03mM和Hill系数约为2.0±0.2，所述各值是在细胞内谷氨酰胺浓度至少约为10mM时测定的。
20、基本纯化的人氨基酸运载体，或其片段或亚单位，它们是用下述方法制备：
A.将含氨基酸运载体的细胞与在运载体上的活性位点结合的标记化合物接触，使标记物与运载体的结合位点相结合;
B.分离出标记的运载体。
21、根据权利要求15的基本纯化的人氨基酸运载体、片段或亚单体，其中细胞是肿瘤细胞。
22、根据权利要求20的人氨基酸运载体、片段或亚单位，其中细胞是淋巴细胞。
23、根据权利要求20的人氨基酸运载体、片段或亚单位，它们是用电泳分离的。
24、根据权利要求20的人氨基酸运载体、片段或亚单位，它们是谷氨酰胺运载体。
25、根据权利要求24的人氨基酸运载体、片段或亚单位，它们存在于固体型肿瘤细胞或淋巴瘤细胞中。
26、根据权利要求1-25的任一项的基本纯化的运载体、片段或亚单位，其中纯化的运载体、片段或亚单位是以它的天然形式存在。
27、根据权利要求1-25的任一项的基本纯化的运载体、片段或亚单位，其中纯化的运载体、片段或亚单位是以分离形式存在。
28、根据权利要求26或27的基本纯化的运载体的亚单位，其中所述亚单位是用于主动运载所述氨基酸或谷氨酰胺。
29、根据权利要求26或27的基本纯化的运载体，其中纯化的运载体包括整个运载体蛋白，所述片段包括所述整个运载体蛋白的片段。
30、一种测定配位体与肿瘤谷氨酰胺运载体结合位点的结合能力的方法，该方法包括：
A.提供一种含有肿瘤谷氨酰胺运载体、或其片段或亚单位的生物样品;
B.所述样品与配位体接触;
C.测定该配位体是否与所述运载体相结合。
31、根据权利要求30的方法，其中步骤A是通过提供从含有肿瘤谷氨酰胺运载体的细胞系制备基本纯化的细胞膜来进行的。
32、根据权利要求30的方法，其中在步骤B完成之后，将所述样品洗涤，然后与标记配位体接触，该配位体不可逆地结合在所述运载体的结合位点上，而步骤C是通过测定所述标记物的存在来进行的。
33、根据权利要求32的方法，其中步骤C是通过凝胶电泳将生物样品的蛋白质分离成带状，并测定在相应于运载体、或其片段或亚单位的分子量的蛋白质带，上存在的标记物来进行的。
34、根据权利要求33的方法，其中所述的凝胶电泳是SDS-PAGE，所述相应于运载体、片段或亚单位的分子量的蛋白质带具有Mr值约为42000或53000。
35、一种测定第一配位体结合到肿瘤谷氨酰胺运载体上结合位点的结合能力的方法，该方法包括步骤：
A.提供至少一种含有肿瘤谷氨酰胺运载体或其片段或亚单位的生物样品;
B.将所说的至少一种生物样品与一定量的第一配位体接触;
C.将该至少一种生物样品与能不可逆地结合在非特异活性基团上的第二配位体接触;
D.洗涤生物样品，以除去过量的第二配位体，并将可用洗涤方法除去的任何所说的第一配位体释出;
E.将生物样品与不可逆地结合在所述位点上的标记配位体接触;
F.测定存在的该标记物。
36、根据权利要求35的方法，其中步骤A按如下进行：
1）在微载体珠上培养含有肿瘤谷氨酰胺运载体的细胞直到完全会合;
2）溶解该细胞;
3）搅拌除去细胞内杂质;
4）从微载体珠上除下纯化的膜;
5）收集释出的膜。
37、根据权利要求35的方法，其中步骤B是通过在各种预定浓度的第一配位体中培育多种生物样品。
38、根据权利要求35的方法，其中对照样品是通过用谷氨酰胺作为第一配位体来进行步骤A～F而实施的。
39、根据权利要求35的方法，其中第二配位体是N-乙基马来酰亚胺。
40、根据权利要求35的方法，其中标记配位体是标记N-乙基马来酰亚胺。
41、根据权利要求40的方法，其中标记配位体是3H-N-乙基马来酰亚胺或14C-N-乙基马来酰亚胺。
42、根据权利要求35的方法，其中步骤F按如下进行：
1.从生物样品中除去未结合的标记配位体;
2.溶解生物样品的蛋白质;
3.用凝胶电泳法将溶解蛋白分离成蛋白质带;
4.染色凝胶以便可观察蛋白质带;
5.从凝胶中分离出与谷氨酰运载体或其片段或其亚单位的分子量相应的蛋白质带;
6.测定标记物的量。
43、根据权利要求42的方法，其中标记物是放射性标记物;步骤2是将蛋白溶解在十二烷基磺酸钠中;步骤3是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行;步骤5是将凝胶切成适当的带，然后溶解该带，用辐射计数器测定标记物的存在。
44、根据权利要求35的方法，其中：
步骤B是将多种生物样品与各个预定浓度的第一配位体接触;
步骤F是通过测定各个预定浓度第一配位体的单位重量细胞蛋白测定标记物量的值;并用所述标记物量的值计算第一配位体的结合参数。
45、一种测定第一配位体抑制肿瘤谷氨酰胺运载体中运输谷氨酰胺的方法，该方法包括如下步骤：
A.提供一种含有肿瘤谷氨酰胺运载体的细胞样品;
B.在一定浓度的第一配位体存在下，将该细胞与标记谷氨酰胺接触;
C.测定细胞中标记物的存在。
46、根据权利要求45的方法，其中步骤B是在一段预定时间内，将细胞与标记谷氨酰胺接触，之后，停止或减少谷氨酰胺的运输，其中步骤C是测定细胞中标记物的量。
47、根据权利要求46的方法，其中在步骤B之前将该细胞在一定浓度的谷氨酰胺中预培育。
48、根据权利要求47的方法，其中在所述预培育之前，将该细胞在浓度足以引起所述谷氨酰胺运载体以约最高速度运输的谷氨酰胺中预负荷，然后在步骤B中与标记谷氨酰胺浓度大致相同的预定浓度的谷氨酰胺中预培育。
49、根据权利要求45的方法，其中步骤C是：
1.从细胞的细胞质中提取标记谷氨酰胺;
2.定量测定所提取的标记谷氨酰胺量;
3.定量测定细胞蛋白的重量。
50、根据权利要求45～49的任何一项方法，其中所述运载体包括TGTⅠ，TGTⅡ，TGTⅢ或它们的混合物。
51、一种生物产品，该产品包括分离的DNA片段，该片段限定为用于至少编码部分的氨基酸运载体或相应于所述DNA片段链的核苷酸顺序的结构基因。
52、根据权利要求51的生物产品，其中所述氨基酸运载体是固体型肿瘤谷氨酰胺运载体或淋巴瘤谷氨酰胺运载体或白血病谷氨酰胺运载体。
53、一种生物产品，该产品包括一种根据权利要求52的重组DNA载体，其中所述载体能够将所述DNA片段直接复制。
54、一种生物产品，该产品包括一种权利要求52的重组DNA载体，其中所述载体能够表达宿主细胞中所述的结构基因。
55、一种生物产品，该产品包括含有权利要求53或54的重组DNA载体的转化宿主。
56、一种生物产品，该产品包括由权利要求55的转化宿主产生的运载体蛋白。
57、一种生物产品，该产品包括氨基酸序列，该序列是相应于人氨基酸运载体或其片段或亚单位。
58、一种生物产品，该产品包括权利要求57的氨基酸序列，其中所述氨基酸运载体是固体型肿瘤谷氨酰胺运载体，淋巴瘤谷氨酰胺运载体或白血病谷氨酰胺运载体。
59、一种生物产品，该产品包括抗体组合物，该组合物基本上由抗体分子或片段或由它们与人氨基酸运载体发生免疫反应得到的产物组成。
60、一种生物产品，该产品包括权利要求59的抗体组合物，其中抗体分子与肿瘤细胞谷氨酰胺运载体进行免疫反应。
61、根据权利要求59或60的生物产品，其中抗体组合物包括多克隆抗体、片段或由它们得到的产物。
62、根据权利要求59或60的生物产品，其中抗体组合物包括单克隆抗体、片段或由它们得到的产物。
63、一种生物产品，该产品包括可产生对人氨基酸运载体的抗体的杂种瘤。
64、根据权利要求63的生物产品，其中杂种瘤可产生固体型肿瘤谷氨酰胺运载体或淋巴瘤谷氨酰胺运载体的抗体。
65、一种单克隆抗体组合物，该组合物包括由权利要求63或64的杂种瘤产生的抗体分子。
66、根据权利要求51～65的任一项的生物产品，其中运载体是可产生主动运输或结合所述氨基酸或谷氨酰胺的亚单位。
67、根据权利要求51～65的任一项的生物产品，其中运载体是不产生主动运输或结合所述氨基酸或谷氨酰胺的亚单位。
68、根据权利要求51～65的任一项的生物产品，其中所述运载体包括整个运载体蛋白。
69、根据权利要求51～68的任一项的生物产品，其中运载体包括TGTⅠ、TGTⅡ、TGTⅢ或其混合物。
70、一种形成单克隆抗体的方法，该抗体可与人氨基酸运载体、或其片段或其亚单位进行免疫反应，该方法包括：
A.用所述运载体、片段、肽或亚单位使哺乳动物获得免疫;
B.从所述获得免疫的哺乳动物中分离出产生抗体的细胞，并制成所述细胞的悬浮液;
C.用转化剂处理所述细胞制成转化的可产生抗体的细胞;
D.通过在不能供给未转化细胞的组织培养基中有限制地稀释克隆在步骤C处理的细胞，以产生克隆的转化体;
E.测定克隆转化株的组织培养基，以确定是否存在可与所述运载体或片段进行免疫反应的分泌的抗体分子;
F.在组织培养基中选择和培养克隆的转化株以产生所述分泌的抗体分子;
G.从所述经选择的克隆转化株的培养基中收获所述分泌的抗体分子。
71、一种形成单克隆抗体的方法，该抗体与人氨基酸运载体或其片段进行免疫反应，该方法包括：
A.用所述运载体、片段或亚单位使小鼠获得免疫;
B.从所述小鼠摘下脾脏，并制成脾细胞的悬浮液;
C.在融合启动子存在下，将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生分泌抗体的杂种瘤;
D.在不能供给未融合的骨髓和脾细胞的培养基中在分离的细胞中稀释和培养融合的细胞;
E.测定在含有杂种瘤的每一穴中的上清液，以确定是否存在与所述运载体或片段免疫反应的分泌的抗体分子;
F.选择和克隆杂种瘤分泌的所述抗体分子;
G.从上述克隆的上清液中收获抗体分子。
72、根据权利要求70或71的方法，其中所述运载体是肿瘤谷氨酰胺运载体。
73、根据权利要求70、71或72的方法，其中运载体是可产生主动运输或结合所述氨基酸或谷氨酰胺的亚单位。
74、根据权利要求70、71或72的方法，其中运载体是整个运载蛋白。
75、根据权利要求72～74的任一项的方法，其中运载体是以它的天然态存在。
76、根据权利要求72～74的任一项的方法，其中运载体是以离解态存在。
77、根据权利要求59或60的生物产品，其中抗体组合物包括通过遗传工程方法得到的抗体、片段或由其产生的产物。
78、一种具有通式（Ⅰ）的化合物或其生理上可接受的盐：

其中：X选自CR5R6、NH、NOH、或O;
W选自C＝O、O＝S＝O、O＝P-R7;
V是

R1选自H、OR13、NH2、NHNH2、苯甲基，其中R13选自H或C1-5取代或非取代、环化或非环化、饱和或非饱和的烃基;
R2选自R13定义的基团、NH2、O（C＝O）R13、（C＝O）OR13和（C＝O）NR13AR13B，
其中：R13A和R13B可分别选自R13定义的基团;
R3选自R13定义的基团;
R4选自R13、囟素和（C＝O）R1;
R5和R6可分别选自囟素和R13;
R7选自-OR14、NR15R16，其中R14、R15和R16分别选自H、C1-5取代或非取代、饱和或非饱和、环化或非环化羟基、或C5-6取代或非取代的芳族或杂芳族环;
R8选自R14、OR14、氨基、酰胺基、NO和NO2;
R9选自R14;
或者R8和R9与氮原子一起形成3元-8元、取代或非取代、饱和或非饱和杂环;
或者其中V-W-X-CH2代表下列基团：

其中，R17选自R14、SO2Cl和-O-（C＝O）-R14;以及
R18和R19可分别选自R14和囟素，R14在4元环的α碳原子上有离去基团取代;
或者其中V-W-X代表下列基团：

其中：R20选自R14、OR14、NHR14和-O-（C＝O）R14;
或ZR21是卤素;
Z选自O、S、NR14;
R21选自甲磺酰基、甲苯磺酰基、-O-（C＝O）-R14、C1-5取代或非取代、环化或非环化、饱和或非饱和烃基;
或其中R20和R21与下列基团

一起形成可进一步取代的或非饱和的5元或6元杂环，其中R1-R21可相同或不同。
79、根据权利要求78的化合物，其具有通式（Ⅱ）结构，或其生理上可用的盐：

其中，X选自CH2、NH、NOH或O，R1、R2、R8和R9的定义如上。
80、根据权利要求79的化合物，其具有通式（Ⅲ）结构，或其生理
其中：X是CH2、NH、NOH或O;
当R8选自OH、NHR14、-（C＝O）NHR14、或-（C＝O）N（R14）OH时，R23是H;
当R8选自（C＝O）NHR14和-（C＝O）N（R14）OH时，R23是OH;
或者R23和R8分别选自前述定义的R14;
或者R23和R8与氮原子一起形成取代或非取代、饱和或非饱和的5元或6元杂环。
81、根据权利要求80的化合物，其具有下列通式，或其生理上可用盐：

其中：R8和R9如前述定义。
82、根据权利要求80的化合物，其具有下列通式，或其生理上可用盐：

其中：R26是H、OH或NO;
R24和R25分别选自H、OR13、SR13、NR132、NO2、CHO、CO2H或卤素，其中R13的定义如前述。
83、根据权利要求80的化合物，具有下列通式，或其生理上可用的盐

其中，R27和R28各选自H和OH。
84、根据权利要求80的化合物，其具有下列通式，或其生理上可用盐：


其中：X是OH、OMs、OTs或囟素，R30和R31分别选自前述定义的R13。
85、根据权利要求78-84的任一化合物，该化合物可抑制谷氨酰运送到肿瘤细胞中的运载体至少约20%。
86、根据权利要求85的化合物，该化合物可抑制运载体至少约40%。
87、根据权利要求86的化合物，该化合物可抑制运载体至少约60%。
88、根据权利要求78-87的任一化合物，该化合物的Bm约大于1。
89、根据权利要求78-88的任一化合物，该化合物的K′s约小于1.5。
90、一种组合物，该组合物包括有选择地与谷氨酰胺运载体结合的分子，所述分子是与细胞毒素剂相连的。
91、根据权利要求90的组合物，其中所述分子包括单克隆抗体、片片或由其得到的产物。
92、根据权利要求90的组合物，其中所述分子包括多克隆抗体、片段或由此得到的产物。
93、根据权利要求90的组合物，其中所述分子包括谷氨酰胺。
94、根据权利要求90的组合物，其中所述分子包括谷氨酰胺类似物。
95、根据权利要求94的组合物，其中谷氨酰胺类似物的Bm约大于1.0nmole/mg蛋白。
96、根据权利要求94或95的组合物，其中类似物的K值小于约1.5mM。
97、根据权利要求90～94的任何一项的组合物，其中谷氨酰胺运载体包括TGTⅠ，TGTⅡ或TGTⅢ，或其混合物。
98、根据权利要求90～97的任何一项的组合物，其中细胞毒素剂是化学治疗剂。
99、根据权利要求90～97的任何一项的组合物，其中细胞毒素剂是放射性同位素。
100、根据权利要求91或92的组合物，其中抗体是与具有联接键断裂时基本上无害的结构式的谷氨酰胺类似物相联的。
101、一种疫苗，该疫苗包括至少一种抗原人氨基酸运载体或其片段或亚单位。
102、根据权利要求101的疫苗，其中运载体、片段或亚单位包括肿瘤谷氨酰胺运载体、片段或亚单位。
103、根据权利要求102的疫苗，其中肿瘤谷氨酰胺运载体包括TGTⅠ、TGTⅡ、TGTⅢ或其混合物。
104、根据权利要求101-103的疫苗，其中运载体、片段或亚单位是以其天然态存在。
105、根据权利要求101-103的疫苗，其中运载体、片段或亚单位是以离解态存在的。
106、根据权利要求101-103的疫苗，其中亚单位可进行主动运输所述氨基酸或谷氨酰胺。

说明书全文

本发明涉及治疗和诊断动物例如人癌症的化合物和方法，更具体地说，本发明涉及人类氨基酸运载体的鉴定和分离，包括诸如谷氨酰胺运载体一类的运载体，谷氨酰胺运载体为肿瘤细胞所共有，但一般不被发现，或者没有活性，或者以低含量存在于大多数非肿瘤细胞中。本发明还涉及用于制备这类运载体及其他生物制品（如抗体）的重组体产物和方法;涉及用于检测这类运载体在人和动物体内是否存在的诊断制品和测定方法;涉及含有例如运载体的抗体、抗谷氨酰胺化合物和能够有效抑制诸如谷氨酰胺一类氨基酸通过这种运载体或与细胞内谷氨酰胺代谢相互影响的谷氨酰胺类似物等物质的组合物;以及含有这类抑制剂的治疗用组合物。本发明还涉及通过施用这类组合物治疗癌症的方法、含有这类运载体及其片段或亚单位的疫苗，以及使用这类疫苗获得免疫的方法。

目前治疗的方法通常都是给患者施用一种或多种药物，这种药物分为三大类化合物，即：（1）烷基化剂，如苯丁酸氮芥、马利兰、梅尔法兰和环磷酰胺;（2）抗代谢物，如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代乌嘌呤、5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷和异噁唑乙酸;（3）抗菌素，如放线菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、博来霉素和正定霉素。可惜使用这些化合物都存在着问题，主要问题在于这些化合物通常对肿瘤细胞和非肿瘤细胞都有细胞毒性，因此对患者的健康组织和器官都会产生严重损害。除了少数例外，目前还没有能够将这类细胞毒素药物有选择地仅对肿瘤细胞的方法。

包括在上述化疗化合物中的有谷氨酰胺，例如6-二氮-5-氧-L-正 亮氨酸（DON）、O-二氮-乙酰基-L-丝氨酸（重氮丝氨酸）和α-氨基-3-氯-4，5-二氢-5-异噁唑基乙酸（异噁唑乙酸），它们与细胞内的生物合成相互影响。但是，这类化合物显然已被证实也具有毒性，因此目前并无销售这类药物用于治疗癌症。

缺乏有关恶性细胞性状的生物学基础知识妨碍了利用正常细胞和恶性细胞之间的共同性和显著区别进行药物的研究开发。其区别之一在于细胞代谢所需要的谷氨酰胺的量。谷氨酰胺是癌细胞的主要代谢产物，与供给能量的葡萄糖代谢产物具有同样的重要作用，并且还是DNA生物合成所需酸基的重要供给者。尽管正常细胞含有能够合成其所需谷氨酰胺的谷氨酰胺合成酶，但是谷酰胺合成酶在肿瘤细胞中基本没有活性（或者含量很低），然而，谷氨酰胺酶的活性却很高，这是一种破坏谷氨酰胺的水解酶。因此，肿瘤细胞取决于周围血液的供给和供其谷氨酰胺的组织。

谷氨酰胺通过谷氨酰胺运输蛋白运输到肿瘤细胞中，因此这种谷氨酰胺运载体使谷氨酰胺通过肿瘤细胞的细胞膜的能力即是其生长发育的活力。就此而言，已经证明：肿瘤细胞中谷氨酰胺运载体的活性远高于正常细胞的谷氨酰胺运载体。

研究人员试图通过降低癌症患者血清的谷氨酰胺浓度，利用肿瘤细胞对谷氨酰胺的需要。通过利用限制谷氨酰胺的饮食和/或施用谷氨酰胺酶或天门冬酰胺酶，以破坏血流中的谷氨酰胺，这项研究业已完成。谷氨酰胺的丧失可能使癌细胞减弱，从而使其对于常规的化学治疗或放射性治疗更敏感。但是，这种治疗能极端地导致对肿瘤细胞和正常细胞不加区分地进行破坏。

总之，在已知肿瘤细胞需要从周围血液和组织中增加对谷氨酰胺的摄入量的情况下，在利用这种高摄入量，从而设计出有选择地作用于肿瘤细胞的化合物或方法方面并未取得显著进展。与此相似的是在瘤症诊 断方面也未利用这种差别，而诊断癌存在的可靠测定方法也显然为人们所渴望。

利用本发明者所研究的动力学分析，业已发现肿瘤细胞中存在三种谷氨酰胺的运载体，还发现至少有一种运载体为其他固体型肿瘤和淋巴瘤所共有。利用所研究的鉴定和分离肿瘤谷氨酰胺运载体的技术，还证实了另一种人氨基酸运载体即丙氨酸运载体。

因此，鉴定、分离肿瘤谷氨酰胺运载体和其他人和哺乳动物的氨基酸运载体及其特征的确定，能够为诊断、治疗和其他有关的物质组合物以及测定和应用等种种方法开辟了新的广泛的领域，所述种种方法包括利用肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间摄入谷氨酰胺的差别，并且能够用于检查肿瘤，或有选择地作用于肿瘤细胞，而对正常细胞产生很小或没有影响。

因此，本发明的首个实施例提供了基本上纯化的人氨基酸运载体，包括在肿瘤细胞中发现的谷氨酰胺运载体和丙氨酸运载体。

本发明的另一些实施例提供了筛选化合物的方法，以测定其与肿瘤谷氨酰胺运载体上结合点的结合能力，或该类化合物抑制运送谷氨酰胺进入肿瘤细胞的能力。

本发明的另一个实施例提供了实施本发明的结合和运输抑制测定的实验室设备。

本发明的其他一些实施例提供了诊断用制品以及将其用于检查体内或离体肿瘤细胞的方法，还提供通过按照本发明重复和定期分析测定控制癌症发展的方法。

本发明的另一些实施例提供了通过重组DNA方法用于产生本发明运输蛋白和异地结合到单克隆抗体上的运载体的生物制品。

本发明的另一些实施例提供了抗谷酰胺化合物和谷氨酰胺类似物以及将它们用于治疗癌症的方法。

本发明的其他实施例还提供了治疗癌症的方法，包括使用抗谷氨酰胺化合物、谷氨酰胺类似物或抗体组合物，抑制谷氨酰胺输入肿瘤细胞的方法。这些方法可与诸如化学治疗或放射性治疗等其他常规抗癌治疗方法结合使用。

本发明还提供了含有至少一种抗原人氨基酸运载体或其片段或其亚单位的疫苗。

因此，本发明的目的之一是提供氨基酸运载体用于诊断和治疗癌症的肿瘤谷氨酰胺运载体。

本发明的目的之二是提供能鉴定用于治疗癌症的化合物的筛选方法。

本发明的目的之三是提供诊断用制品和诊断和监察癌症发展的方法。

本发明的目的之四是提供用于诊断和治疗癌症和用于制备大量纯化的运载体或结合到这些运载体上的抗体的生物制品。

本发明的目的之五是提供用于治疗癌症的化合物和组合物以及治疗癌症，包括施用这类化合物和组合物的方法。

本发明的目的之六是提供通过抑制谷氨酰胺输入肿瘤细胞或使用肿瘤细胞的运输机理，有选择地将细胞毒素化合物输入细胞的治疗癌症的方法。在这些方法中包括通过抑制谷氨酰胺摄入细胞使细胞减弱，然后通过诸如化学治疗和放射治疗等常规治疗方法或针对这种细胞的任何其他方法杀死该细胞。

本发明的目的之七是提供能用于防癌的疫苗。

本发明的目的之八是提供抑制淋巴细胞增殖的化合物和方法。

本发明的其他目的和优点一部分将在说明书的以下部分陈述和一部分从说明书中可明显地看出，或可通过实施本发明得到了解。本发明的目的和优点可通过组合物，和在权利要求书中具体指出的方法来认识到和得到。

附图简介：

图1说明聚丙烯酰胺凝胶显示的谷氨酰胺运载蛋白的纯化，第1行是分子量标准，第2行是洗脱蛋白，第3-8行是全部细胞膜样品;

图2说明谷氨酰胺摄入到HeLa细胞中;

图3说明用NEM滴定谷氨酰胺摄入到HeLa细胞中;

图4说明NEM的不同保温时间对谷氨酰胺摄入HeLa细胞的影响;

图5说明1mM  NEM对谷氨酰胺摄入HeLa细胞的影响;

图6说明抗血清对谷氨酰胺输入HeLa细胞的影响;

图7a-7j说明谷氨酰胺输入红血细胞（RBC）和各种细胞系;

图8说明3H-NEM与HeLa细胞的细胞膜的结合;

图9说明3H-NEM与由图8限定的HeLa细胞的细胞膜的峰A-E得到的材料的结合;

图10说明用3H-NEM和由图8限定的峰A-D得到的材料相结合来滴定谷氨酰胺运输;

图11说明3H-NEM与由图8限定的峰C得到的材料相结合的理论曲线;

图12说明用过量底物防止3H-NEM的结合;

图13说明NEM的不同保温时间对谷氨酰胺摄入HeLa细胞的影响;

图14说明用3H-NEM差示标记HeLa细胞膜;

图15说明3H-NEM标记的HeLa细胞膜蛋白的放射自显影，第1、2行表示用1mM3H-NEM标记的分离蛋白，第3、4行表示用1mM3H-NEM标记的分离蛋白，第3、4行表示用1mM3H-NEM标记的分离蛋白（均在100mM谷氨酰胺存在下）;

图16说明用过量底物防止14C-NEM的结合;

图17说明HeLa细胞膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶提取成4个部分，第1、2行包括第1部分，第3、4行包括第2部分，第5、6行包括第3部分、第7、8行包括第4部分;

图18说明用Schiff-Periodate染色剂使HeLa细胞膜蛋白的聚丙烯酰 胺凝胶的碳水化合物染色;

图19说明在还原条件和非还原条件下HeLa细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶，第1行是分子量标准，第2行是在非还原条件下的膜蛋白，第3和4行是在还原条件下的膜蛋白;

图20说明钠对3H-NEM与HeLa细胞膜结合的影响;

图21说明3H-NEM与细胞膜外部位点的结合（UPM）;

图22说明3H-NEM与细胞膜内部位点的结合（LPM）;

图23说明血清对3H-NEM与HeLa细胞膜结合的影响;

图24说明代表性化合物的结合的Lineweaver-Burk图;

图25说明银染色的4～40%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶显示谷氨酰胺运载蛋白的位置;

图26说明有代表性的免疫斑迹显示了各种细胞系对抗血清的响应，第1行是分子量标准，第2行是HeLa细胞，第3行是Detroit  562细胞，第4行是Molt-3细胞，第5行是Molt-4细胞;

图27说明用过量丙氨酸，或不用丙氨酸，当暴露在3H-NEM之期间或之前保护3H-NEM与蛋白带结合;

图28说明用3H-NEM与峰A-E的结合有关的NEM来抑制丙氨酸摄入HeLa细胞;

图29说明对于用3H-NEM与峰A-E结合有关的NEM来抑制丙氨酸摄入HeLa细胞的校正值;

图30说明在零点移动条件下，HaLa细胞和牛淋巴细胞与谷氨酰胺摄入曲线相关的浓度比较;

图31说明用正常淋巴细胞然后用刀豆球蛋白A激发，C-谷氨酰胺摄入与时间关系;

图32说明在有刀豆球蛋白A和没有刀豆球蛋白A存在下，谷氨酰胺摄入牛淋巴细胞的初始速度;

图33～38说明用染料排除法测定的淋巴细胞存活率和用谷氨酰胺类似物的浓度范围与MTT测定作图来测定的相对有丝分裂;

图39说明一种一次体系中的标记物摄入速度的倒数与底物浓度绘图;

图40a说明用二种一次体系将标记物摄入速度的倒数绘图;

图40b说明三种一次体系的标记物摄入速度的倒数绘图;

图41说明三种一次体系的标记物摄入速度的倒数绘图;

图42说明高次体系，然后一次体系的标记物摄入速度的倒数绘图;

图43说明先一次体系，然后高次体系绘图;

图44说明二种高次体系绘图;

图45说明三种体系、其中二种是高次体系的摄入速度倒数绘图;

图46说明HeLa细胞中谷氨酰胺的摄入速度绘图;

图47说明1/Vt＊与浓度绘图;

图48说明用最后等式计算的最终曲线;

图49说明在Na+缺乏条件下，谷氨酰胺摄入HeLa细胞的情况绘图;

图50说明标记物的摄入速度倒数与浓度绘图;

图51～59是反应方案1-9的分别绘图，该方案是用于制备本发明的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物的合成反应;

图60说明HeLa细胞在1mM组氨酸中的生长情况，生长速度是以多重试样（n为6）中每24小时的细胞蛋白总量来测定的;

图61说明丙氨酸摄入HeLa细胞的情况;

图62说明丙氨酸摄入HeLa细胞的Lineweaver-Burk分析，HeLa细胞已经用1mM  NEM预培养，或没有用NEM预培养;

图63说明用各种浓度NEM滴定丙氨酸摄入HeLa细胞中;

图64说明1mM  NEM对丙氨酸摄入HeLa细胞中的影响，该HeLa细胞在放射性培养之前用NEM预培养或不用NEM预培养;

图65说明本发明的上层细胞膜（UPM）和下层细胞膜（LPM）的制备方 法流程图;

图66是本发明6穴试片的示意图，它是倒放在倒置的试片盖上;

图67是图66倒置的示意总图，这样在盖上的物品可进入试片的穴中;

图68是倒置的本发明6穴试片盖;

图69说明6穴圆底试片倒置，并放在倒置的装有溶液的盖片上;

图70说明用于溶液转移的装配好的6穴试片和盖片;

图71说明本发明的96穴盖片;

图72带有可装溶液的通道的96穴盖片;

图73说明将96穴试片倒置并放在装有溶液的倒置盖片上;

图74说明用于转移溶液的装配好的96穴试片和盖片;

下面所给出的是应用于整个说明书中的某些基本术语的定义和缩写。

抗谷氨酰胺化合物-是指任何可通过谷氨酰胺运载体或其它途径进入细胞的化合物，和/或对谷氨酰胺摄入和/或代谢、生物合成、细胞内降解（即酶促的）等等有作用的化合物，和/或防止谷氨酰胺与任何其它与谷氨酰胺可结合的物质的运载体相结合的化合物。

抗-受体-是指可对配体-受体对的受体选择性结合的试剂。例如，配体是一种抗原，而受体是一种抗体如小鼠IgG抗体，抗受体就是IgG的抗体。抗受体也可以是可选择性地与结合在受体上的部分相结合的物质。例如：结合上的部分可以是半抗原，抗受体是一种抗半抗原的抗体。也包括片段和衍生产物。

谷氨酰胺类似物-是指具有类似于谷氨酰胺结构的任何化合物。

人氨基酸运载体-是指在细胞膜内的分子，该细胞是从可使氨基酸进出细胞的人组织得到的。

配体-是指被测定的靶分析物。这个术语包括免疫结合对如抗体或抗原的任何成员。另外，配体还可以是例如氨基酸或它的运载体，酶或 核酸顺序如RNA或DNA探查物。

受体-是指直接与靶配体结合的分子。例如，如果配体是一种抗原，受体就可以是一种抗体，较好的是单克隆抗体。如果靶配体是一种抗体，受体可以就是抗原或抗-抗体。如果配体是一种酶，受体是一种酶的底物。如果抗原是核酸顺序，受体可以是互补顺序。片段和衍生物也包括在内。

肿瘤谷氨酰胺运载体（TGT）-是指在肿瘤细胞膜内的分子，该肿瘤细胞可以跨过膜，从胞外介质中运载氨基酸谷氨酰胺到细胞的细胞质中，反之亦然。

Ac-乙酰基

ACS-液体计数闪烁体

ATV-抗生胰蛋白酶维尔烯

Bm-最大结合常数

Bn-苯甲基

BSA-牛血清白蛋白

Bu-丁基

Ci-居里

DCC-二环己基碳化二亚胺

DCHA-二环己胺

DCM-二氯甲烷

DMF-二甲基甲酰胺

DMSO-二甲基亚砜

dpm-每分钟衰变数

EDTA-乙二胺四乙酸

ELISA-酶联免疫吸附分析法

Et-乙基

FBS-牛胎血清

h-Hill系数

HBSS-汉克氏平衡盐溶液

HEPES-N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸

IgG-免疫球蛋白G

Km-米氏常数

Ks′-表观离解常数

LPM-下层细胞膜

M199-介质199

Me-甲基

Mr-相关分子量

NEM-N-乙基马来酰亚胺

PBS  A-不含钙或镁的磷酸平衡盐水

PEG-聚乙二醇

PMSF-苯甲基磺酰氯

rpm-每分钟转数

RPMI1640-罗斯韦尔·帕克纪念研究所细胞培养介质1640

SDS-十二烷基硫酸钠

SDS-PAGE-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

t-叔级

TBST-用非离子活性剂Tris-缓冲的盐水

TEN-Tris-EDTA-NaCl

TFA-三氟乙酸

THF-四氢呋喃

Tosyl-对甲基苯磺酰基

Tris-三（羟乙基）氨基乙烷

UPM-上层细胞膜

V/v-体积比体积

Vm-最大速度

W/v-重量与体积比

Z-苄酯基

Ⅱ.氨基酸运输蛋白的鉴定

本发明的第1个实施例包括人氨基酸运输蛋白，如果这种蛋白存在于肿瘤细胞则具有特殊的意义，但是在肿瘤细胞中并不存在，或者存在但无活性，或以较低的量存在于非肿瘤细胞中。已经发现三种这样的蛋白，即TGTⅠ，TGTⅡ和TGTⅢ，它们存在于肿瘤细胞中，但在非肿瘤细胞中似乎不存在或无活性。此外，TGTⅠ-Ⅲ可以存在于正常细胞中，但含量很低。分离TGTⅠ、TGTⅡ和TGTⅢ的方法可用其他运输蛋白的分离方法予以说明，尤其是对肿瘤细胞具有专一性的那些运输蛋白都能被鉴定和分离。该方法是以用于由肝细胞中分离出丙氨酸载体的方法（Hayes  et  al.，Biochem  J.，214，1983，489～495）为基础，但有一些重要区别。本发明的肿瘤谷氨酰胺运载体是由HeLa细胞中分离得到的，这种细胞是由已经建立的人肿瘤细胞系衍生的。该细胞系由Henrietta  Lacks于1951年由子宫颈瘤的活检组织得到。

A.HeLa细胞蛋白的分离方法

开始制备HeLa细胞和其他粘连细胞系单层培养以及制备微载体培养细胞的方法如下：

1.HeLa细胞和其他粘连细胞系的单层培养

将细胞置于塑料瓶或玻璃瓶表面上进行单层培养（Flow实验室），至达到生长汇合时用抗菌素胰蛋白酶维尔烯（ATV）收集细胞。活性的生长 培养基每2天更换一次含有5%（V/V）胎牛血清（FBS）的新鲜培养基（M199或RPMI1640）。

2.微载体培养

将粘连细胞按Pharmacia（1981）所述方法培养在玻璃珠（Sigma化学公司）的表面上。用含有10%（V/V）FBS的新鲜培养基冲洗玻璃珠（0.5g）3次，再与用ATV从单层培养物中收集到的约10b细胞混合，用含有10%（V/V）FBS的新鲜培养基稀释到200ml。将接种物转移到微载体容器（500ml容量，Techne，Cambridge，U.K.）中，放在37℃的磁搅拌器上，培养物在开始的24小时内，每隔半小时在25rpm的转速下搅拌2分钟，以后在整个培养期间都以35rpm转速连续搅拌。培养基每2天换1次，可以将带细胞的玻璃珠固定，潷去原来的培养基，加进新鲜的含有5%（V/V）FBS培养基。5天后玻璃珠上生长汇合，即可用于细胞膜的制备。

然后用下述步骤进行HeLa细胞的谷氨酰胺运载体的鉴定和纯化。

3.由HeLa细胞进行细胞膜的制备

将细胞作为微载体培养物培养至玻璃珠上的生长完全汇合。然后按以下方法制备细胞膜。

（ⅰ）将带细胞的玻璃珠固定后，移去上清液，用新鲜培养基洗涤玻璃珠3次，再在4℃下将玻璃珠悬浮在20ml低渗缓冲液（10mM  Tris-HCl，pH7.4）10分钟，使细胞膨胀溶解。

（ⅱ）将细胞悬浮液强烈涡动8秒钟，然后在最大调速的MSE超声粉碎机中用微针尖超声处理8秒钟。

（ⅲ）将细胞悬浮液用低渗缓冲液洗涤3次后，再悬浮在10ml含有1mM  EDTA的低渗缓冲液中，超声处理30秒钟。

（ⅳ）收集通过差示沉降法收集释放出的细胞膜，并通过在Damon/IEC  model  B-20A离心机（10000g）中离心成小片。

（ⅴ）将上述小片再悬浮在1ml含有0.25M蔗糖的低渗缓冲液（pH 7.4）中，在-20℃下贮藏。用新鲜制备的细胞膜片段进行酶的测定和结合试验。参见Gotlib  et  al.，Biochem，et  Biophys.Acta，602，（1980）201-212。

4.十二烷硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳

a.选择性提取膜蛋白

采用以去污剂Triton  X-114独特的性质为基础的方法（Thomspon  et  al.，Biochemistry，26，1987，743-750）将膜蛋白选择性提取成4个组。用10ml磷酸盐缓冲盐水（PBSA）冲洗单层培养物3次。第一组膜蛋白是从用2ml  1mM  EDTA、0.15mM  NaCl和10mM4-（2-羟乙基）-1-哌嗪-乙烷磺酸（HEPES）（pH7.4）培养的完整HeLa细胞的表面提取的（部分1）。细胞是用橡胶淀帚从烧瓶表面刮下来的，在聚丙烯锥形管中用500g的离心机离心5分钟收集细胞。细胞碎片用100μl的2%（V/V）Triton  X-114于10mM  HEPES的溶液（pH7.4）处理，再离心（11600g）10分钟除去未溶物。不含去污剂的上相含疏水蛋白（部分2），而下相含亲水蛋白（部分3）。未溶碎片在SDS加溶缓冲液中溶解（部分4）。第1-3部分的蛋白经加入丙酮至最终浓度为90%（V/V）后沉淀，并在Eppendorf超速离心机（model  5414）（11600g）离心10分钟粉碎成碎片。丙酮沉淀物经真空干燥，然后在100μl  SDS加溶缓冲液中溶解，通过SDS-PAGE进行分离。

b.蛋白质的分离

将膜制剂（约1mg蛋白）以1分钟3次的剧烈涡动，溶解在1ml  SDS加溶缓冲液中（25mM  tris-HCl，2%（w/v）SDS，2%（W/V）聚蔗糖，1%（V/V）2-巯基乙醇，2mM  EDTA，5mM  PMSF，pH6.8），然后置于-20℃下过夜。用Bio-Rad  Mini-ProteanⅡ装置在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白（参阅Laemmli，Nature，227，1970，680-685）。加溶膜（1mg蛋白/ml）与试样缓冲液（62.5mM  tris-HCl，pH6.8，2%（W/V）SDS，2%（W/V）聚蔗糖，5%（V/V）巯基乙醇，0.00125%溴酚兰，25mM  EDTA）以1∶2混合，并在 70℃下加热10分钟。将30μl样品置于0.75mm凝胶槽中，通入50毫安稳定电流1.5小时。凝胶按下述一种方法进行染色（参阅Ohsawa  et  al.，Anal.Biochem.，135，1983，409-415）。

（ⅰ）考马斯兰染色

凝胶从电泳装置上移去后置于70%（V/V）聚乙二醇（PEG）2000的溶液中过夜。待凝胶转变为不透明时置于1%（W/V）考马斯兰溶液中染色15分钟，然后在10%乙酸中更换若干次进行脱色。

（ⅱ）银染色

凝胶在70%（W/V）聚乙二醇2000中收缩过夜，然后转移到硝酸银溶液（20%（W/V）AgNO3，35%（V/V）氨，4%（W/V）NaOH，在5分钟内使用）中，缓慢搅拌20分钟。凝胶在蒸馏水中冲洗三次1分钟，然后转移到显色液（0.002%（V/V）甲醛，0.005%（W/V）柠檬酸）中显色至可以看到蛋白带。用10%（V/V）乙酸可以终止显色，凝胶可以贮存在PEG溶液中。

C.放射性计数

将染过色的凝胶置于透明的塑料切面上，该切面放在透射器（可见光波长）上，这样可以很容易看到蛋白带。用曲解剖刀从凝胶上切下染色蛋白带，放在4ml容量的闪烁管中。将凝胶片溶于100μl H2O2和100μl 1.8mM CuSO4中，室温下过夜，加入4ml液体计数闪烁体（ACS），用闪烁管对放射性进行计数（参阅Donato et al.，J.Biochem.Biophys.methods，15，1988，331-336）。

d.放射自显影

在室温下，含有溶解膜蛋白的放射性标记聚丙烯酰胺凝胶在Amplify（Amersham）中保温30分钟，然后在Pharmacia凝胶干燥器（model  GSD-4）中，60℃下干燥2小时。将一片塑料置于凝胶和干燥器盖之间，防止粘连。将干凝胶在-65℃下与富士X光片接触6天，曝光结束时可将凝胶重新恢复到室温，放在科达显影液中显影2分钟，其间 每隔15秒钟细心搅拌一次，继之用自来水洗2分钟，然后置于科达定影液中，至底片半透明。

e.还原和非还原电泳

将细胞膜制剂溶于含5%（V/V）巯基乙醇或不含巯基乙醇的缓冲液中（参阅Allore  et  al.，Mol，Immunol.，20，1983，383-395），再将溶解膜与含或不含巯基乙醇的样品缓冲液混合，通过SDS-PAGE分离蛋白，并按上述方法染色。

f.糖蛋白染色

如上所述，通过SDS-PAGE分离膜蛋白，然后对糖部分染色（参阅Zacharius et al.，Anal.Biochem.，30，1969，148-152）。在4℃下，将凝胶固定在7.5%（V/V）乙酸中1小时，再在室温下置于0.2%（W/V）过碘酸溶液中45分钟。之后立即将凝胶置于4℃的席夫试剂（0.5g品红，9.0g Na2SO3于500ml水中，加10ml HCl，使溶液避光）中45分钟，凝胶在更换2-3次的10%（V/V）乙酸中脱色过夜。

5.电洗脱

电洗脱是在Bio-Rad电洗脱仪（model 422）中进行的。将膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶在0.1%（W/V）考马斯兰中进行轻度染色（5分钟），再用10%（V/V）乙酸洗几次脱色。将相当于谷氨酰胺运载蛋白的着色带用曲解剖刀从凝胶上切离，置于与渗析膜连接的玻璃管中。容器中装满挥发性洗脱缓冲液（0.05M NH4HCO3，1%（W/V）SDS），每一玻璃管通6安培稳压电流24小时。从渗析膜表面收集洗脱蛋白，并在-20℃下贮藏在含有50μl 0.1M PMSF的洗脱缓冲液中。用分子量极限值为10000的Centricom微浓缩器浓缩洗脱蛋白样品，微浓缩器在5000g的45°固定角转子（IEC/Damon model B-20A离心机）中离心30分钟（5000g），得到最终体积为50-100μl。银染色聚丙烯酰胺凝胶用Mr 42000表示洗脱蛋白的纯化，示于图1。

微浓缩器也可用于蛋白溶液对若干次洗涤的PBS  A的渗析，以除去盐和SDS。洗脱蛋白纯度的检测可通过用200μl  SDS样品缓冲液平衡50μl浓缩蛋白，再用SDS-PAGE和银染色来检测。在每个样品中蛋白质含量可采用MicroLowry方法，用200μl蛋白溶液和吸光率为660nm进行测定（Markwell  et  al.，Anal.Bioshem.，87，1978，206）。

6.3H-NEM标记试验

a.采用不同浓度的NEM进行标记

用各含0.1ml3H-NEM的贮存溶液制备0.25-10mM的HBSS（10ml）的NEM溶液。将细胞膜制剂（0.2mg蛋白/ml）与200μl NEM溶液在37℃下保温1小时，然后在冰冷的0.9%NaCl中洗涤，终止标记。细胞膜在11600g离心成碎片，按上所述，溶于200μl加溶缓冲液，在-20℃下贮存。

b.防止与过量底物结合

将细胞膜制剂（0.2mg蛋白/ml）与100mM谷氨酰胺的D或L异构体的HBSS溶液在37℃下预保温20分钟后，再用1mM含100mM谷氨酰胺的3H-NEM标记20分钟。在冰冷的0.9%NaCl中洗涤，终止标记，然后将这些细胞膜溶于加溶缓冲液中。

c.谷氨酰胺结合位点的差示标记

细胞膜制剂（0.2mg蛋白/ml）与100μl不同浓度的谷氨酰胺（0.5-10mM）在37℃下保温5分钟。然后加入试验浓度的谷氨酰胺配成的100μl NEM（2mM），得到1mM NEM的浓度，将细胞膜悬浮液在37℃下保温5分钟。然后加入以试验浓度的谷氨酰胺配成的100μl NEM（2mM），得到1mM NEM的浓度，将细胞膜悬浮液在37℃下保温10分钟。保温结束时，细胞膜悬浮液在11600g rpm下离心1分钟，将碎片用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤。该细胞膜与1mM3H-NEM在37℃下保温1小时后，用冰冷的0.9%NaCl洗涤，终止标记。将细胞膜溶于加溶缓冲液， 在-20℃下贮存。

d.上层和下层细胞膜的标记

图65的流程介绍了制备上层细胞膜（UPM）和下层细胞膜（LPM）和用3H-NEM标记的方法。该方法在需要对同个细胞膜内外两面进行的各种测定时，可用于任何粘连细胞系（HeLa除外）。1mM NEM放射性溶液的制备方法是将100μl3H-NEM贮存溶液（0.5mCi/ml）加到10ml 1mM NEM的HBSS溶液（pH7.4）中。

e.Na+的依赖性

将含有大约100μg/ml蛋白质的等份HeLa细胞溶液用作实验材料。所有溶液均在不含钠的HBSS中制备，放射性NEM的制备则是将100μl3H-NEM贮存溶液（0.5mCi/ml）加到1ml 1mM NEM的HBSS溶液中。细胞膜与10mM谷氨酰胺在100mM NaCl或100mM胆碱盐酸盐存在下于37℃预保温5分钟。NEM溶液（含有适当浓度的谷氨酰胺和钠或胆碱）加到保温细胞膜中，NEM最终的浓度为1mM，在37℃下再保温10分钟。细胞膜在Eppendorf超速离心机（11600g）中离心5分钟，粉碎成碎片，在37℃下再悬浮在1mM3H-NEM（含100mM钠或胆碱）中1小时。标记期结束时，将细胞膜用HBSS洗涤，然后溶于100μl SDS加溶缓冲液中。将溶解的细胞膜样品涂在12%聚丙烯酰胺凝胶上，在50毫安稳定电流下处理1小时。将分离蛋白用考马斯兰染色后，将该凝胶切下进行放射性计数。

f.血清对谷氨酰胺运载体的作用

在对细胞膜部分进行分离前，先用多种方法处理HeLa细胞，使谷氨酰胺运载体移入到细胞膜中。在制备膜前，先将HeLa细胞在含20%（V/V）FBS或不含FBS的新鲜培养基199中保温2小时，然后按常规方法分离再用3H-NEM标记细胞膜。所有溶液均在HBSS中制备，放射性NEM的制备则是将100μl的3H-NEM贮存溶液（0.5mCi/ml）加到1ml 1mM NEM的HBSS 溶液中。将细胞膜在37℃下于10mM谷氨酰胺中预保温5分钟，然后在10分钟内将NEM加到最终浓度为1mM。细胞膜在Eppendorf超速离心机（11600g）中粉碎5分钟后，在37℃下悬浮在3H-NEM中1小时。细胞膜在0.9%NaCl中洗涤后，溶于100μl SDS加溶缓冲液中进行SDS-PAGE分析，从凝胶上切下分离蛋白，进行放射性计数。

B.分离的谷氨酰胺运载体的鉴定和特性

1.载体蛋白的鉴定

a.3H-NEM标记试验

将HeLa细胞膜与溶于SDS去污剂中的3H-NEM一起保温，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。已经发现大量蛋白与3H-NEM结合，如图8所示，它们标记为A-E。这类结合在一些细胞膜制剂中始终均可持续地观察到。表1给出峰A-E的近似分子量和3H-NEM与每个峰的结合，每个峰值根据计算已知，对3H-NEM溶液的专一活性为2.22×105dpm/nmol。分子量的测定相当于标准标记物，其值为至少3个测定的平均±S.E.

表1

峰 Mr3H-NEM（nmol/mg蛋白）

A  95000  0.416±0.05

B  53000  0.259±0.04

C  42000  0.155±0.03

D  31000  0.469±0.04

E  22000  0.397±0.05

为了确定某个具体蛋白与对NEM敏感的谷氨酰胺的运输有关，必须证明NEM与该蛋白结合的滴定与由NEM抑制运输平行进行。A-E的每个峰的NEM结合曲线示于图9。峰C的极限是发生在2mM NEM左右，3H-NEM结合的半极限值是在1mM NEM，在NEM这个值时，其与谷氨酰胺运输被50%抑制相一致（见图5）。在1mM时，3H-NEM与峰B结合的量略高于峰C，而峰A，D和E比3H-NEM结合的量大得多。用不同NEM浓度时，NEM与峰A-E的结合对在相同NEM浓度时谷氨酰胺运输的作用示于图10。得到峰C的1对1相互关系的线性曲线，表明运输的抑制作用是与抑制剂结合到该蛋白上是相平行进行的。3H-NEM与峰B-E的结合并有体现出用NEM抑制谷氨酰胺运输的1对1的相互关系。图11给出了仅有峰C的类似图形，其中在3H-NEM的100%饱和下，谷氨酰胺的摄入量假定是等于谷氨酰胺总摄入的非饱和组分，并且减去由测定每种NEM浓度下摄入率。所绘制的图形是与将运载蛋白用3H-NEM饱和的百分量和对谷氨酰胺摄入的控制百分量的理论图形相符合的。所观察的值与理论图形较好的统一，这正符合在谷氨酰胺运输至HeLa细胞中的峰C的推论。运输底物可保护运输蛋白免于与NEM结合所表明的事实为峰C与NEM敏感的谷氨酰胺运输有关提供了进一步的证据。在将膜用非标记NEM保温之前，可用大量过量的L-谷氨酰胺或D-谷氨酰胺预保温。将过量的谷氨酰胺和NEM除去，并用凝胶电泳分离出蛋白。图12表明，用L-谷氨酰胺可完全保护峰C，而D-谷氨酰胺不能保护3H-NEM的结合。峰B也表明可基本上保护3H-NEM的结合，这说明该蛋白也包含在谷氨酰胺运输中。

b.高亲和性和低亲和性运输间的区别

采用新的方法来研究在谷氨酰胺运输入HeLa细胞中，峰B和峰C的作用的区别，特别是鉴别高亲和性载体和低亲和性载体。图13说明了用NEM以不同的预保温时间对谷氨酰胺运输的作用。可从中看出，6分钟的预保温时间使低亲和性运输有些抑制作用，但是对高亲和性运输没有作 用。但是，12分钟的预保温时间对两种体系都有抑制作用。新的试验是基于这些观察，并包括使用了非标记NEM6分钟，这样它可结合细胞膜中的所有巯基。可是，谷氨酰胺含量的增加也加强了谷氨酰胺结合位点的保护。将谷氨酰胺和过量NEM洗去，暴露出谷氨酰胺结合位点。然后将3H-NEM于12分钟内加入以特异地标记谷氨酰胺结合位点。据推论，随着用于保护结合位点的谷氨酰胺含量增加，随后结合在谷氨酰胺结合位点上的3H-NEM量也成比例地增加。用1mM谷氨酰胺可保护高亲和性结合部位，因为在此浓度下高亲和性运输可有作用，低亲和性结合位点在用3H-NEM标记前要求对谷氨酰胺有高水平的保护，因为低亲和谷氨酰胺运输在谷氨酰胺量大于1mM下才运作。这类不同标记的试验结果示于图14，Mr为42000的峰C所示情况正是高亲和性运输蛋白的推理，该蛋白用3H-NEM在1mM谷氨酰胺或更高含量下标记。另一方面，峰B在5mM谷氨酰胺或更高含量下才能用3H-NEM标记，建议将这种Mr为53000的蛋白划入到低亲和性谷氨酰胺的运输。图1中表示了峰B和峰C在聚丙烯酰胺凝胶中的位置。

C.放射自显影

在存在或不存在过量运输底物下，将HeLa细胞膜用14C-NEM保温。将膜蛋白用SDS-凝胶电泳分解，然后将该凝胶曝光到X光片下。图15的放射自显影表明，在Mr为42000的带是在不存在保护底物谷氨酰胺下用NEM放射性标记（第1条和第2条），但是当在保温介质中有谷氨酰胺时，该带免于受放射性标记（第4条和第5条）。这些结果表明，NEM作用的方式是在运输蛋白上与谷氨酰胺直接争夺结合位点，并能区别出对谷氨酰胺运输有作用的特定蛋白。已经用14C-NEM标记的膜蛋白的复制凝胶也是切成薄片的并可用放射性计数的。所得结果示于图16，并与图12所示的滴定膜蛋白的结果相符合。许多峰是用14C-NEM标记的，但是只是峰C（Mr为42000）是可得到明显保护以防在过量谷氨酰胺存在下 用14C-NEM标记。与3H-NEM标记相比，放射性信号的强度增大许多，因为14C的能量越高，同样会给出很高的特定活性值。

2.膜蛋白的分离

根据膜蛋白的疏水性能和在细胞膜内的位置，可选择性地提取成四个部分。在图17中的染色的凝胶表明含有表面或外源性膜蛋白的部分1的各基团间有少量的蛋白重叠。部分2含有亲水性膜蛋白，部分3含有疏水性膜蛋白。最后部分4含有整合膜蛋白，该种蛋白仅在离子去污剂SDS存在下是可溶解的。染色凝胶表明，Mr为42000的高亲和性谷氨酰胺运输蛋白主要在第4部分，并且与疏水蛋白部分有少量的重叠。Mr为53000的低亲和性运输蛋白首先在第3部分出现，这表明它是疏水膜蛋白。

3.由SDS-PAGE表示的谷氨酰胺运载体的特性

用Schiff方法将已经用电泳方法分离的HeLa细胞膜蛋白对其碳水化合物染色。在图18中凝胶表明，包括Mr为42000的谷氨酰胺运输蛋白在内的许多蛋白是糖基化的。在还原和非还原的条件下，用SDS-PAGE法分离膜蛋白，从而检测分子内或分子外二硫键的存在。图19所示的凝胶表明，Mr为42000的谷氨酰胺运输蛋白没有在非还原试样中（第2条）出现，但是存在于还原试样中（第4条），这说明这种蛋白代表的是蛋白复合物的亚单位。中间条（第3条）是受到还原剂在最靠近还原试样的一侧扩散的影响而使带成为部分可见。

4.NEM结合的Na+依赖性

为了确定NEM与谷氨酰胺运输蛋白的结合是否有钠依赖性的，在钠离子存在或不存在下研究了3H-NEM与HeLa细胞膜的结合。图20表明，NEM与高亲和性谷氨酰胺运输蛋白（Mr为42000）的特定结合，然后在没有钠离子存在下，用过量底物对谷氨酰胺结合位点的保护下降30%。在没有钠离子下，NEM结合的抑制作用说明结合情况取决于在谷氨酰胺运输 蛋白上的活性位点上或它的附近钠离子的存在情况。钠离子存在或不存在对NEM与低亲和性谷氨酰胺运输蛋白（Mr为53000）的结合性没有影响。这些结果是与动力学研究结果相一致的，这个结果显示在没有Na+存在下，Na+依赖性的运载体Ⅱ的Km由0.17mM增加至1.5mM，然而运载体Ⅲ则不受影响。

5.标记细胞膜的内和外表面

研究出一种方法可在细胞膜的内表面和外表面上的谷氨酰胺运输位点上选择地标记（在上述部分ⅡA6所述）。图21表示3H-NEM与细胞膜外表面的结合，并表明了Mr为42000和53000的峰用同位素特定标记，然后用过量谷氨酰胺保护谷氨酰胺结合位点。正如所推测，对这些峰的结合是与用来保护结合位点的谷氨酰胺用量成比例的。

内细胞膜也是用3H-NEM特定标记的，图22所示结合的模式与外细胞膜的结合模式明显不同。虽然与Mr为42000和53000的峰结合的量值可与外细胞膜的相比较，但是结合的量和用于保护的谷氨酰胺的浓度间没有明显的关系。最明显的差别是出现了另外一条带（记为峰F），这条带在前面的试验中没有表示3H-NEM结合，但是在此该带表示当仅仅标记细胞膜的内表面时，结合与谷氨酰胺浓度之间有较好的相应关系。还有峰E在以前是给出了与谷氨酰胺反比例关系，现在表示了3H-NEM结合与谷氨酰胺浓度间正比例关系。对于细胞膜内表面和外表面的结合情况这种明显的区别的原因还不清楚，可能与用含有反应性巯基的输位点控制谷氨酰胺运输有关。

6.谷氨酰胺运载体的移位作用

FBS含有生长因子和增强培养基中细胞活性增殖的激素。在制备细胞膜之前，在FBS存在或不存在下将细胞保温，然后在用过量底物保护运输蛋白的谷氨酰胺活性位点之后，再用3H-NEM标记。图23表明由正常细胞和血清缺乏细胞制备的HeLa细胞膜蛋白的结合活性。在没有血清 下，NEM与高亲和性谷氨酰胺运载体的结合下降了50%。在通常与NEM有显著结合，即峰A、B、D、E的许多其它蛋白，在没有血清下NEM的结合也显示下降了。再向介质中加入血清，然后用无血清介质保温，结果3H-NEM与谷氨酰胺运输蛋白的结合只稍微增加了10%。

7.动力学分析

a.动力学方程的推导

在早期，人们认识到谷氨酰胺摄入肿瘤细胞的代谢重要性使以定量关系研究这种运输的性质成为必要。因而，在此仔细研究了HeLa细胞中谷氨酰胺运载体的动力学。以便得到尽可能接近体内条件的参数，所有运载试验都是在最适当的转移-激发条件下进行，用这种方法，可以得到在体外条件下的数据，这些数据应适用于在血液中通常发现的谷氨酰胺整个浓度范围。此外，在HeLa细胞中发现的谷氨酰胺摄入曲线错综复杂，使考虑或发展新的分析方法以尽可能澄清主要组分的运输机理成为必要。在膜运输动力学研究中，通常仍应用未修改的双重交互图形（Lineweaver  &  Burk，J.Am.Chem.Soc.56，（1934）658-666），尽管将它们应用在由酶试验得来的未称重数据时缺乏可靠性已成为人们经常讨论的话题（Dowd  &  Riggs，J.Biol，Chem.240，（1965）863～869;Wong，Kinetics  of  Enzyme  Mechanisms，（1975）P29  Academic  Press，London;Robersts，Enzyme  Kinetics，（1977）P287，Cambridge  University  Press），此外，当研究的体系看来不能与Michaelis-Menten方程式（Blangy等人，J.Mol.Biol，31（1968）13～35）所示的简单一次双曲线相一致时，则这些图形看来就更不可靠了。在细胞运输中还有更复杂的情况，因此很少有单独的、简单的运载体存在。因而，由于实际上1/S变量（S为底物浓度）与图中两点间的相对距离成反比关系，则在多种运载体存在下，随着浓度的提高，Lineweaver-Burk图形就更加难以处理。结果是，在S范围最末端的恒定增长使1/S值的变化减少，这样的浓度范 围的最末端的主要各点之间，很难有一个单独的适当分离的图形，因而必须要强化在1/S值范围的最末端的图形点（Roberts、1977），这些点也就是最小速度值，也好象是在整个图形中最不精确的值。这种主要作用可从谷氨酰胺摄入HeLa细胞的双重交互图形中看出，在此1.5至5mM间的主要拐点被压缩成1/S范围的1/400。对HeLa细胞中谷氨酰胺运输的情况，需要将速度与谷氨酰胺浓度为0.005～5mM按顺序作图（包括所有运输机理的组分）。当把这些结果转化成Lineweaver-Burk图形时，不可能用单一图形来表示主要图形点的明确分离。另外，在0.01mM处的误差幅度是1mM处的32倍，这样就使在比较有意义的图形上只能做推测工作。

为了克服这些缺点，特别开发了包括标记运输动力学试验的新制图方法。下面是在标记物恒定浓度条件下，标记物的单向通量方程式，该式是由Michaelis-Menten方程式得来的：

V＊＝L＊/（Km+S1）（1）

在此 V＊＝V.S＊1/S1

＝从面1摄入标记物

S＊1＝在面1上标记物恒定浓度

以及L＊＝VmS＊1

＝标记速度-底物浓度系数

方程式1的倒数为：

1/V＊＝（Km+S1）/L＊（2）

因而，1/V＊与S作图，得到斜率1/L＊，因为标记物浓度是已知的，则可以计算出Vm。（为了方便起见，在这些试验中标记物浓度采用给定一系列试验中底物的最小浓度）。在S轴上的截距等于-Km，在1/V＊轴上的截距等于Km/L＊。在多个一次运输体系中，其参数关系如下：

在1/V＊轴上的截距（S＝0）

＝1/∑（L＊/Km（1）） （3）

其中：最低Km＝Km（1）

其它运载体按照每个Km增加值的顺序连续记数，以后所有使用表示级数的和的∑都用于表示由i＝1开始的n项。

在S轴上的截距（1/V＊＝0）

-S＝∑（L＊/Km）/∑（L＊/Km2） （4）

最终斜率，S→∞

＝1/∑L＊（5）

在S轴上，上述斜率的截距：

＝-∑（KmL＊）/∑L＊（6）

在1/V＊轴上，上述斜率的截距：

＝∑（KmL＊）/∑L＊2（7）

下述方程式是由Hill方程式得到，并适用于与Hill关系一致的多次体系：

hV＊＝hL＊/（Kmh+Sh） （8）

倒数：

1/hV＊＝1/L＊（Kmh+Sh） （9）

其中hV＊＝V＊·（S＊/S）h（10）

以及hL＊＝Vm·S＊h（11）

因而，如果Hill系数可以近似估计，则可得到线型关系，并因而可能估计Vm和Km。从上述表明，在多个运载体系中，方程式3和9是特别有用的，首先是在多个一次运载体系，第二是在多个高次运载体系中。可容易地看出，方程式2是与Hanes方程式（Hanes，Biochem.J.26（1932）/406）有关的，因为它有下列式子。

（1/S＊）（S/V）＝（1/S＊）（Km/Vm+S/Vm） （12）

它是乘以1/S＊的Hanes方程式。对于HeLa细胞中谷氨酰胺摄入，将 Lineweaver-Burk图形与方程式2得到的图形相比较，它表明用方程式2在浓度为0.01～1mM间，1/V＊误差幅度下降1.6倍，而与Lineweaver-Burk图形比较，1/V的误差为32倍。另外，因为在新的图形中点的分布与所用底物浓度是直接相关的，所以在较大的底物浓度范围内有效点可较容易地适当分开。

在高次关系的情况下，其中摄入速度可用Hill方程式表示：

V＝（Vm·Sh）/（Khm+Sh） （13）

将该方程式转化为标记物摄入速度得到：

V＊＝（VmSh-1·S＊）/（Kmh+Sh） （14）

方程式14的倒数变为：

1/V＊＝（Kmh/L＊）·1/Sh-1+S/L＊（15）

将上述方程式用dS微分：

d（1/V＊）/ds＝（1-h）Kmh/L＊·1/Sh+1/L＊（16）

当上述斜率为极小值时（d（1/V）/ds→0），

则d（1/V＊）/ds＝0＝（1-h）Kmh/L＊·1/Sh+1/L＊

和（1-h）Kmh/Sh＝-1

得出结果：Km/S＝（1/（h-1））1/h（17）

这样，最小值（d（1/V＊）/ds＝0）和Km间的关系简单地取决于Hill系数，可用[1/（h-1）]1/h表示。应该注意，这样的表达是有些有利和有用的特性。首先，当h接近于1时，表达式趋向无穷大;第二，当h等于2时，表达式等于1;第三，当h变得越大时，表达式下降至约0.7，在无限大时又回到1。

可被证明的是，h值在2～10间，其变化值在1～0.7间。在最小图形点的浓度和h＝2及大于2时Km值之间的比例的这种微小变化的含意是可直接由图形的最小浓度大致估算出Km值。然后，将此值用于表2，表2是在与Km有关的不同浓度下，一系列与速度比有关的h值。在与Km值 等距的浓度下的成对速度比可用来从表中获得相同的h值。从成对的读数得到的h值差别不应大于1。如果成对的读数值间有明显的差别，较高浓度得到较低h值则Km值应向下调整，如果事实相反则应向上调整。要继续调节Km值，直到h值彼此间在1个单位内，然后得出新的Km（2）计算值。用两个h值平均来计算出h2值，然后可将该h值的计算用于表3（Km/S的比例，其中S是不同h值在图形最小值时的浓度），以进一步确定Km值。较好地估算出h值后，可以将1/hV＊与Sh（方程式9）作图，该图提供了Vm和Km值的进一步说明。可以看出（图5，参见附图1），当h等于或大于2时，在多组元体系中上述最小值是正斜率对间的转折点。

最后，在多变量体系中，分离运载体的Vm值大约估算可由图形斜率直接得到。因而，用1/V＊与底物浓度作图，可提供存在的运载体数量、载体运作所需的浓度范围、和摄入类型是否可用一次或多次Michaelis-Menten（Hill）方程式表示的最初指标。然后提供包括了存在的运载体的基本特性的“结构假设”，并可用作用于更精确测定在结构的假设中出现的所有运载体参数的起始点，当然，结构假设的研究要依赖于Km值的适当分离和Vm值没有极端的差别。这些要求包含于附录1的一组方案中，在其中处理了计算方法的细节。将上述计算方法应用于谷氨酰胺摄入HeLa细胞的计算中，以确定HeLa细胞中三种主要运载体的参数。Km值最低的两种运载体是Na依赖的（运载体Ⅰ和Ⅱ），Km值最高的一种运载体（运载体Ⅲ）是不依赖Na的。下面部分说明用于论证运载体Ⅰ和Ⅱ的Na离子依赖性的分析方法，以及由于Na+离子缺乏造成的数据变化。运载体Ⅱ是它的浓度速度曲线包括了血液中谷氨酰胺浓度范围的运载体。因而推论，这种运载体是有生理意义的，并且在此通常用来代表主要Na依赖运载体。

结构假设：所用模型的一般说明。

表11所示为选用于检验该种作图程序的模型的各个参数。在此解析中，假设每一个Km代表一种单一的运载体。

模型1

图39示出对模型1（一种一次运载体）的作图。各坐标轴截距为：

在1/V＊轴上的截距＝Km/L＊

在S轴上的截距＝-Km

斜率＝1/L＊。

模型2

图40示出对模型2（两种一次运载体）所绘的图。所作的图是非线性的，是由两段线性关系复合起来，两段之间由一个转折点分开，第一段线性关系具有初始斜率，该值接近于1/L1＊，第二段具有最后斜率，该值等于1/L2＊。

图40表明，随着靠近Km（2）处开始的向下转折而与线性有显著偏离（相对于当S→∞的最后斜率），并且与1/V＊轴的相交点位置比按最后斜率（当S→∞）外延的相交点要低30%，这是在大多数输送实验中应十分明显的相差。

另方面，在模型2的Lineweaver-Burk图中，与线性的偏差是可以忽略的，只是在1/Km（2）和0之间才可以看到，并且在1/3Km（2）位置的偏离只与外延线相差9%，这在多数实验中是难于与实验误差相区别的，因为对该条线的斜率有很小调整就足以将小于1/Km（2）的点包括进去。在Eadie为同一模型所作的图中（Eadie，1942;Hofstee，1952），与线性的偏离甚致比图40更明显，并且有可能从V和V/S轴上的外延截距分别得出Vm（1）和Vm（1）/Km（1）+Vm（2）/Km（2）数值。

模型3

图41示出一种多运载体机制的标记物摄取的反比图形，其中包括三 种一次运载体。所得曲线与图40相似，不同之处是由两个转折点连成的三段线性关系。第一段线性关系的斜线（当S接近于0）与1/V＊轴相交，得到方程式3所示的关系。通常这是一个精确的截距，一经将Km（1）/Vm（1）估定之后，即可用于确定Km（2）/Vm（2）。首先由从一个较低的点至下一个点所得的斜率△（1/V＊）/△S来解析该曲线。在多组分一次体系中，这将反映所作图形之中从一点至下一点的斜率变化是最小的那些部分。图中这些接近线性的各段与从每一接近线性的线段延伸到下一个Km值的再延伸线段相交替。该等接近线性的线段是从恰在或刚刚高于后继的Km值之处开始（见计算部分）。在浓度坐标上最低值的是Km（1）。第一个斜率是1/L＊的一个低估值（Vm（1）的高估值），当1/V＊→0时在S轴的截距是-Km（1）的高估值。在第二个最小斜率变化之前的最后斜率（见模型3数据）得到1/（L1＊+L2＊）的估算值，依此类推。最后斜率得到对1/L1＊最近似值。因此，从最低浓度开始沿所绘曲线走上去，通过减去前一个估算值而得到每一个Vm值。

模型4

图42示出当有两种运载体时所得曲线的特性，其中运载体1是高次关系的（此处所论及的所有高次关系均为Hill型），运载体2是一次关系的。此图显示出浓度为0开始是负斜率，近Km（1）处有一个突变的最小值，正如前面正文中讨论方程式2和17应用时所指出。在曲线符合Monod、Wyman和Changeaux（1956）模型的情况下，为1/V＊所作图中再次显示出一个明显的最小值，转折点在0.5Vm（Km）。两种类型曲线的主要差别在于从浓度为0开始时负斜率的特性。当考虑Monod型关系时，令TO形态的离解常数＝KT，RO形态的离解常数＝KR，于是c＝KR/KT，L＝TO/RO。若取n＝4，c＝0.01，L＝10000，然后应用Monod方程式计算V＊，即可以1/V＊为纵坐标，以S为横坐标作图。这样绘出的曲线将显示如下的诊断指示：

1.从浓度为0开始，出现的是负斜率，开始这个值增加，在KR附近得到最大负斜率。这些斜率比简单Hill型关系所见的斜率要平缓得多，而Hill型的斜率极陡，迅速下降到最小值转折点。当采用Hill方程式并且h＝4，Km＝0.15，Vm＝20，在浓度0.05得到的斜率为-540，而按Monod方程式绘图所得为-38。

2.在按Monod方程式作图时，该负斜率曲线最终会到底，而在靠近Km（0.5Vm）处达到转折点，对于所有L值大于100的情况都是这种现象。

3.使L值减小时，结果是该转折点在浓度坐标上位置减小，并且转折区加宽，使其负斜率只有小的变化。随着L趋近于1，则按Monod方程式和按Hill方程式当h＜1.5时两者所绘曲线的形状只有很小差别。

模型5

图43所示是先用一次运载体随后用高次运载体所得曲线的类型。在此情况下，先是正的斜率，随后是突然的转折，再趋向于最后的斜率。第一段斜率的估算值为1/L1＊，第二段斜率估算值为1/L2＊。曲线最小值出现在1.4mM（转折点），其近似估算值为Km（2），外延至S→O的S轴上截距估值为-Km（1）。

模型6及7

在图44示出形状更不同的曲线。曲线1代表模型6，在此曲线的第一段重复了模型4的基本特征：亦即先是负的斜率，随后在刚刚大于Km（1）值位置是一个突变的最小值。然后曲线的走向与模型4不同，亦即先是斜率突然增大，斜率估值为1/L1＊，随后是一个转折，象以前一样达到最后斜率，其估值为1/L2＊。曲线2是一种极难解析和定量的曲线类型。其负斜率再一次表示了运载体1的高次方程式特征。然而，它向最小值的趋近是更为平缓，所以不能清楚地显示出转折点。这就暗示了h值是接近于或小于1.5，或者是Monod型关系并且L接近于1;并且 以缓慢的变化达到最后斜率表明随后的运载体体系是高次的，并具有更大得多的Vm值，或者Km（2）实值是大于1。

模型8

图45所示是一种三组分混合体系所作1/V＊图形。对前面几个图形的诊断解析应足以指明由此图形所指示的输送机制的特性。图中所示三种斜率代表该三种运载体。运载体1是一次关系的，并且所作图形显示在运载体1和2之间有一个最小值，表明运载体2是高次关系的。最后，从运载体2到运载体3的转变表明运载体3也是高次关系的。其转变是很平缓的，所以用肉眼估定该最小值是很近似的结果。

1.在多组分体系中规定参数极限的规则

一般说明：

运载体编号是从1至n，并从最小的Km开始编号。所有的作图均作为H-P 15C所作回归线来检验。在开始解析之前准备以下数据：速度与浓度关系，1/V＊与浓度关系以及△（1/V＊）/△S。在以下研究的实例中，所存在的运载体最大数目永不超过3。一般而言，中间的运载体提供所有夹在当中的各运载体（不论其数目多少）的处理模型。所有浓度均为mM（毫摩尔浓度），所有速度均为nmol·min-1·mg-1蛋白质（毫微摩尔·分钟-1·毫克-1蛋白质）。

规则：

1.（ⅰ）一般而言，相继Km值之间的相差应大于4倍（对于高次体系而言，此相差可以接近2倍）。

（ⅱ）各个Vm值的彼此相差不得大于5倍，并且一般规律是：

其中VmL＝两个Vm值中的较小值，

VmH＝其中的较大Vm值，

Km（x+1）＝较大的Km值，

Km（x）＝较小的Km值，

（ⅲ）所绘的点中必须有浓度至少低于1/5Km（1）浓度的点，以保证得到该运载体的参数的合理近似值，同时在Km（1）之下至少要有三个点。

（ⅳ）所绘的点必须延伸到2Km（n）（最大的Km）的位置，并且在Km（n）之上至少要有三个点。

（ⅴ）在每一对相继的Km值之间至少要绘出四个点。

2.作出结构假设的规则

（ⅰ）（a）初始斜率是正值：运载体Ⅰ是一次关系的。由最后斜率得到当S→O的Vm（1）值，并由按此斜率与S轴的交点为-Km（1）得到Km（1）值，或由第一个斜率最小变化位置得到Km（1）。

（b）初始斜率是负值：运载体Ⅰ是高次关系的。由该初始斜率到达其最小值时的浓度得到第一个Km（1）值，并且由第一段正值斜率曲线的顶部斜率得到1/L1＊值，从而得到Vm（1）值。

（ⅱ）对于多组分一次关系的情况，通过由最小斜率变化位置（接近直线）所得相继Km值，以及从紧靠该最小斜率变化位置之下的斜率所得相继1/∑L＊值来估定其余的各运载体。由最后的斜率得到1/L1＊。

（ⅲ）对于多组分高次关系的情况，从各对正斜率之间的各转折点估算各相继的Km值。指示转折点的特征是斜率变化率为负值转变为斜率变化率为正值的那个位置。从每一段斜率增值为正值的线段的顶部的斜率得到累计的1/L＊斜率。如（ⅱ）段，由最后斜率得到1/L1＊。

3.在多组分一次关系中各参数详细解析规则（假定三组分）：

（ⅰ）应用方程式3（见正文）和对Km（1）及L1＊的最初估值来估算Km（2）/L2＊，从而估算出在1/V＊轴上1/V2＊截距净值。应用最初运载体Ⅰ参数计算V1值并从V测定值减去得到估算的净V2值。这些点是取自估算的Km（1）至2Km（1）范围或0.01Km（3）至0，02Km（3）范围。在此范围内，假定在相继的Km值中有超过4倍间隔，运载体Ⅲ速度的影响可忽略不计。然后以 1/V2＊为纵坐标，以S为横坐标绘图，并由回归线估定在1/V轴上的截距。然后将此截距值与按上述方程式3所估算的数值相比较。很可能图解法所得的截距远大于由方程式3所估算的值，亦即图解结果与方程3结果之比，（R）＞1。重复同此程序，并且每次将L1＊减小约10%，直至所得R为常数为止。在此点，一次将Km（1）值减小10%，然后再重复减小L1＊的程序，至R再次为常数为止。将此程序继续下去，直至R＝1为止。于是由此而提供了同时解出运载体Ⅰ和Ⅱ的参数的方法。可以从最后所得1/V＊净值为纵坐标，S为横坐标作图的回归线来进一步肯定运载体Ⅱ的参数。

（ⅱ）现在用V2，3净值重复上述程序。将前面估算的运载体Ⅱ的参数代入方程式3，估算出截距1/V3＊净值。然后按上述运载体Ⅰ的参数的方式调整运载体Ⅱ的参数，得到运载体Ⅱ和Ⅲ的参数的最后数值。

（ⅲ）为了肯定这种解析的结果，先得出各个V1净值，再以1/V1＊为纵坐标，以0至约3Km（1）范围的S为横坐标作图，同时得到其相关系数，此值约为0.98。

4.在多组分高次关系中的详细解析规则

（ⅰ）若运载体Ⅰ是一次关系的，应用按部分该结构假设所估算的运载体Ⅰ参数即从V测定减去估算的V1，从而估算出V2净值。以1/V2＊为纵坐标，0.5Km（2）至2Km（2）范围的S为横坐标作图。有负的斜率表示运载体Ⅱ是高次的体系。由1/V＊达到最小值所对应的浓度表示近似的Km（2）（方程式17）。估算Km（2）和h2是计算在0.75Km（2）至Km（2）和Km（2）至1.25Km（2），或是0.5Km（2）至Km（2）和Km（2）至1.5Km（2）的V2比值并应用表12，得到h2的估算值。从各成对读数所得的h值的相差不得大于1。若各个成对读数之间的差别相当大，若是较大浓度值得到较小h值，应将Km值调整至更小值，反之，将Km调整至更大值。继续调整Km值，直至各h值彼此相差小于1为止，于是得到新的Km（2）估算值。然后取两个h值的平均值作为h2 估算值。表13（应用方程式17）所示是应用曲线最小值所作第一次估算所需的校正值。两个经调整的Km值彼此相差应小于20%（应指出，表13的校正值是基于单一绘图点估算）。这时以1/KV＊为纵坐标，以Sk为横坐标作图。然后将运载体Ⅱ的数值用于得到V1净值，并以1/V1＊为纵坐标，以小于Km（1）范围的S为横坐标作图。所得的曲线可用于对运载体Ⅰ参数的再估算，然后重复上述程序，直至得到该等运载体的一组恒定值为止。最后，以1/kV2＊为纵坐标，以小于Km（2）至0.2Km（3）范围的S为横坐标作图，得到运载体Ⅱ参数的估算值。

（ⅱ）若运载体Ⅰ是高次关系的，其程序与上述（ⅰ）为运载体Ⅱ所用的程序相同。然后将h值用于以1/kV＊为纵坐标以Sk为横坐标作图，得到Vm（1）并进一步肯定Km（1）。然后这些参数用于得到V2净值，并在假设运载体Ⅱ是高次关系的情况下，继续按上述（ⅰ）为运载体Ⅱ所用的程序。然后将这些参数用于得到V2净值，然后重复测定运载体Ⅰ和Ⅱ净值的程序，直至其中之一或另一个的参数恒定不变为止。最后以1/kV＊为纵坐标，以Sk为横坐标作图，得到运载体Ⅱ的参数的估算值。

（ⅲ）应用前面估算的运载体Ⅰ和Ⅱ的参数来估算V3参数净值，以1/V3＊净值为纵坐标，以0.5Km（3）至2Km（3）范围的S为横坐标作图，按上述为其他高次体系估算h3和Km（3），并经过多次重复该程序而使其值达到恒定。以1/kV3＊为纵坐标，S为横坐标作图，估算出Km（3）和Vm（3）。

（ⅳ）将估算净值舍去小数，办法是从V测定减去计算的V2+V3数值，并以1/V＊或1/kV＊为纵坐标，以具较大Km值的运载体所起作用为最小的浓度范围为横坐标作图，从而估算出运载体Ⅰ（亦即具最小Km的运载体）的速度净值。

（ⅴ）进行精细修整，办法是在最小浓度、最高浓度、在各Km值以及各Km值之间中点位置来校验V测定与计算的V值相差。

模型3

运载体 KmVm

1  0.03  10

2  0.30  20

3  3.0  25

数据：浓度为mM，速度为毫微摩尔·分钟-1·毫克-1蛋白质

注：

1.在各Km值之间出现各点间斜率以恒定变化率减小。曲线上这些段下面划有加重线。

2.在Km值附近，曲线几乎成为直线（斜率变化最小）。这些段在刚刚大于各Km值之处出现，并用黑体字表示。

3.S＊＝0.005mM。

结构假设：

规则2（ⅰ）a回归线通过0.005-0.02mM

1/V＊截距＝0.49，斜率＝12.57

Km（1）＝0.04mM，Vm（1）＝15.9。

规则2（ⅱ）

Km（1）＜0.04，Km（2）＝0.4，Vm（2）＝16.4，Km（3）＝2.5，Vm（3）＝20.6.

得自该结构假设的参数：

运载体 KmVmh

1  ＜0.04  15.9  1

2  0.4  16.4  1

3  2.5  20.6  1

规则3（ⅰ），取方程式3的倒数：

L1＊/Km（1）+L2＊/Km（2）＝1/截距＝2.04

0.08/0.04+x＝2.04，于是X＝0.04，

1/X＝25（初始截距太大）。

应用1/V2＊净值作图检验各L1＊/Km（1）比例

L1＊/Km（1）1/x 1/v2＊截距 R 0.03 0.04 0.04 0.075mM

0.07/0.04  3.45  5.57  1.61  5.6  5.7  5.74  5.73

0.06/0.04  1.85  2.69  1.45  3.11  3.33  3.50  3.82

0.05/0.04  1.27  1.70  1.35  2.15  2.35  2.52  2.87

0.045/0.04  1.09  1.46  1.34  1.89  2.05  2.21  2.55

0.05/0.035  1.63  2.07  1.27  2.44  2.61  2.75  3.04

0.045/0.035  1.325  1.67  1.26  2.05  2.22  2.37  2.67

0.05/0.032  2.09  2.39  1.14  2.69  2.81  2.92  3.16

0.045/0.032  1.58  1.86  1.18  2.21  2.35  2.48  2.76

0.05/0.03  2.68  2.66  0.99  2.89  2.98  3.06  3.25

在1/V＊轴的截距相符。

L1＊＝0.05，Vm（1）＝20，Km（1）＝0.03。

在1/V＊轴截距1/V2＊净值为2.66，斜率＝7.93

于是，Km（2）＝0.33，Vm（2）＝25.2。

规则3（ⅱ）

应用上述运载体Ⅰ和Ⅱ的参数并用方程式3估算V3净值。

方程式3：L2＊/Km（2）+x＝0.376，得0.126/0.33+x＝0.376，所得x值太大。

应用1/V3＊净值作图检验L2＊/Km（2）比例：

L2＊＝0.10，得Vm（2）＝20，Km（2）＝0.30mM。

1/V3＊作图，1/V3＊截距＝23.95，斜率＝7.97

Km（3）＝3.00，Vm（3）＝25.1。

规则3（ⅲ）：

确定各运载体参数：

0.005  0.01  0.02  0.03  0.04  0.05mM

1/v＊10.7 0.8 1.00 1.2 1.4 1.6

1/V1＊轴截距＝0.60，斜率＝20.0。

Km（1）＝0.03，Vm（1）＝10.0，r＝1.0000。

最后所得参数（括号内数字为实际值）：

运载体 KmVmh

1  0.03（0.03）  10（10）  1

2  0.30（0.30）  20（20）  1

3  3.0（3.0）  25.1（25）  1

模型8

运载体 KmVmh

1  0.03  10  1

2  0.15  20  2

3  1.50  25  4

结构假设：

规则2（ⅰ）a.，正值斜率：运载体Ⅰ是一次关系的。

回归线通过三个最低点：

1/V＊轴截距＝0.615，斜率＝15.29

Km（1）＝0.04，Vm（1）＝13。

规则2（ⅲ）

随着斜率减小而指示出一系列参数，在0.1mM处达到最小斜率，在0.15mM＝Km（2）斜率再开始增大，最后在0.5mM得到最后斜率0.59，因此 Vm（1）+Vm（2）＝33.9，得Vm（2）＝20.9。

下一个最小斜率是在1.5mM，在1.75mM＝Km（3）斜率再开始增大，最后斜率是3.61，得Vm（1）＝55.4，由此得Vm（3）＝21.5。

结构假设参数

运载体 KmVmh

1  0.04  13  1

2  0.15  20.9  ＞1

3  1.75  21.5  ＞1

规则4（ⅰ）

应用上述对运载体1估算的参数来估算V净值：

Km（1）＝0.04，Vm（1）＝13。

S（mM）  0.05  0.075  0.10  0.15  0.20  0.25

v21.03 2.66 4.56 8.07 10.7 12.44

1/v＊29.73 5.63 4.38 3.72 3.75 4.02

Km（2）＝0.15。

在0.15＝Km（1），V2＝8.07

在0.11＝0.75Km（1），V2＝5.20＊

在0.19＝1.25Km（1），V2＝10.04＊

＊由内插法估算。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝65%，Km/1.25Km＝80%

将这些比值应用于表12，得h2＝2.5

应用表13，Km/0.15＝0.85，得Km（2）＝0.13

由V2净值进行1/kV＊作图

第一次V2净值作图：

S250.0032 0.0087 0.018 0.031 0.049

1/V＊（lst.Est）392 610 956 1421 2035

1/hV＊轴截距＝296，斜率＝35，785。

Km（2）＝0.15，Vm（2）＝15.9，h2＝2.5，校正系数（r）＝1.0。

应用以上参数对运载体Ⅰ再估算：

第一次V1净值作图：

S（mM）  0.005  0.01  0.02

v11.44 2.55 4.17

1/v＊0.69 0.78 0.96

1/V＊轴截轴＝0.6，斜率＝18

Km（1）＝0.033，Vm（1）＝11.1，r＝1.0。

应用新的运载体Ⅰ参数为V2作图。

第二次1/V2＊净值作图：

S（mM）  0.05  0.075  0.10  0.15  0.20  0.25

v21.56 3.43 5.5 9.23 11.97 13.84

1/v＊6.4 4.37 3.63 3.25 3.34 3.61

Km（2）＝0.15，由图上最小值求得，

在0.15＝Km（2），V2＝9.23

在0.11＝0.75Km（2），V2＝6.25＊

在0.19＝1.25Km（2），V2＝11.29＊

＊由内插法估算。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝68%（比率1），Km/1.25Km＝81%（比率2）。

由表12示出：h＝2.25（对比率1），h＝2.13（对比率2）。

上述的两个h值接近，所以不需要再进行调整。

h的平均值为2.19。

从图上最小值得Km（2）＝0.15mM，根据表13按h值校正，得0.15×0.96＝0.144mM。

第二次1/kV＊净值作图

S（mM）  0.1  0.15  0.20  0.25  0.30

S220.0063 0.015 0.029 0.047 0.071

1/hV＊132 192 279 395 539

1/kV＊截距＝95.97，斜率＝6281。

得Km（2）＝0.15，Vm（2）＝18.4

应用上述参数重新为1/V＊1作图：

第二次1/V＊1净值作图

S（mM）  0.005  0.01  0.02  0.03

v11.44 2.54 4.13 5.24

1/v1＊0.70 0.79 0.97 1.14

1/V1＊截距＝0.61，斜率＝17.9，

Km（1）＝0.034，Vm（1）＝11.1

调整完成。

规则4（ⅲ）

应用运载体Ⅰ和Ⅱ的参数估算V3

运载体 KmVmh

1  0.034  11.1  1

2  0.15  18.4  2.2

为1/V＊3作图

S（mM）  1.0  1.25  1.5  1.75  2.0  3.0  4.0  5.0

v34.53 8.57 12.96 16.71 19.5 24.03 25.0 25.3

1/v＊344.15 29.17 23.14 20.94 20.51 25.0 32.0 39.5

从图中最小值估算得Km（3）＝2.0，

在2.0＝Km（3），V3＝19.50

在1.5＝0.75Km（3），V3＝12.96

在2.5＝1.25Km（3），V3＝21.76

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝66%（比率1），Km/1.25Km＝90%（比率2）。

由表12得：对于比率1，h＝2.5;对于比率2，h＝1.0。

h的低值在Km值之上，表示初始估算的Km值太高。

精细调整Km（3），直至所得h值相等为止。

最终Km（3）调整为1.6mM。

然后得比率1＝53.6%，比率2＝74%，

由表12得知，对比率1，h＝3.5;对比率2，h＝3.5，

最后，Km（3）＝1.6，h＝3.5。

为1/hV＊3作图：

S  1.0  1.25  1.5  1.75  2.0  3.0  4.0  5.0

S351.0 2.18 4.13 7.1 11.3 46.8 128 280

1/hv＊3x10-624 28.8 36.1 48.0 65.6 220 579 1250

1/hV＊截距＝17.26×106，斜率＝4.4×106，

结果，Km（3）＝1.48，Vm（3）＝25.7，h＝3.5

应用表13确定Km（3）：

Km（3）＝2.0×0.775＝1.55mM。

到此阶段，所得参数估算值为

运载体 KmVmh

1  0.034  11.1  1

2  0.15  18.4  2.2

3  1.48  25.7  3.5

规则4（ⅳ）

最后估算V1净值 S（mM） 0.005 0.01 0.02

v  1.44  2.54  4.13

1/v＊10.69 0.79 0.97

1/V＊1截距＝0.60，斜率＝18.57，

得Km（1）＝0.032，Vm（1）＝10.8。

在完成详细解析之后，所得参数估算值为：

运载体 KmVmh

1  0.032  10.8  1

2  0.15  18.4  2.2

3  1.48  25.7  3.5

规则4（ⅴ）

精细调整：对在Km值和在选定的最小值之下和在选定的最大值之上以及在它们之间的值所测定的和计算的速度进行校验。

S（mM）  0.01  0.03  0.15  0.75  1.5  6.0

v 2.59 5.77 18.33 30.3 42.1 54.8

v 2.62 5.74 18.11 30.4 42.0 54.6

不需要进一步调整。

最后参数（括号内为实际值）：

运载体 KmVmh

1  0.032（0.03）  10.8（10.0）  1（1）

2  0.15（0.15）  18.4（20）  2.2（2.0）

3  1.48（1.50）  25.7（25）  3.5（4.0）

在Hela细胞中谷氨酰胺摄取曲线的解析

图46和47分别是摄取曲线和标记物反比图。

数据：

结构假设：

规则2（ⅰ）a，正值斜率：运载体Ⅰ是一次关系的。

通过三个最低点的回归线：

1/V＊轴截距＝0.74，斜率＝20。

Km（1）＝0.04，Vm（1）＝10

规则2（ⅲ），在0.025和0.1mM之间有一处为0斜率，并在0.2处开始斜率增加，指示出近似的Km（2）值。斜率增大，最后在0.5mM处达到斜率5.4，于是Vm（1）+Vm（2）＝37，得Vm（2）＝27。下一个斜率增大最小值是在2.0mM，并于2.5mM＝Km（3）再次开始斜率增大，最后斜率为3.9，故Vm（1）＝51.3，得Vm（3）＝14.3。

结构假设参数：

运载体 KmVmh

1  0.04  10  1

2  0.2  27  ＞1

3  2.5  14  ＞1

规则4（ⅰ）

应用上述对运载体Ⅰ估算的参数为V2净值参数进行估算：

Km（1）＝0.04，Vm（1）＝10。

S（mM）  0.05  0.1  0.20  0.25  0.50

v20.95 6.4 13.7 15.4 19.8

1/v＊210.5 3.12 2.92 3.25 5.05

Km（2）＝0.20，

在0.15＝Km（2），V2＝13.7，

在0.11＝0.75Km（2），V2＝10.5＊，

在0.19＝1.25Km（2），V2＝15.4＊，

＊由内插法估算。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）;

0.75Km/Km＝73.3，作为比率1;Km/1.25Km＝89%，作为比率2。

在表12中应用这些比率，得在比率1，h＝2.0;在比率2，h＝1.1。表示对Km的估算值太高。

在Km为0.15进行最后调整，得到：

在0.15＝Km（2），V2＝10.05，

在0.075＝0.5Km（2），V2＝3.675，

在0.225＝1.5Km（2），V2＝14.55，

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.5Km/Km＝37%，作为比率1;Km/1.5Km＝69%，作为比率2。

由表12得到，对于比率1，h＝2.25;对于比率2，h＝2.25。

于是确定了Km（2）是在0.15mM。

应用表13，由上述h2值校正初始从作图的最小值所得Km（2）估算值：

Km（2）＝0.2×0.92＝0.18mM。

由V2净值为1/kV＊作图。

第一次V2净值作图

S2250.0056 0.027 0.044 0.021

1/hv＊132 294 432 1597

1/V＊轴截距＝103，斜率＝7127。

Km（2）＝0.15，Vm（2）＝21.1，h2＝2.2，相关系数（r）＝0.9999。

由此确定了运载体Ⅱ的参数。

应用上述参数对运载体Ⅰ再估算：

第一次V1净值作图

S（mM）  0.005  0.01  0.015  0.025  0.03  0.05

v11.18 2.10 2.76 3.2 3.74 5.05

1/v＊0.85 0.95 1.09 1.56 1.6 1.98

1/V＊轴截距＝0.74，斜率＝26.48，

Km（1）＝0.028，Vm（1）＝7.55，r＝0.9783。

应用新求得的运载体参数，再进行V2作图。

第二次1/V2＊净值作图

S（mM）  0.05  0.10  0.20  0.25  0.50

v21.86 7.8 15.5 17.3 21.95

1/v＊5.37 2.56 2.58 2.89 4.55

Km（2）＝0.15

在0.15＝Km（2），V2＝11.65，

在0.11＝0.5Km（2），V2＝4.83＊，

在0.19＝1.5Km（2），V2＝16.4＊，

＊由内插法估算。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.5Km/Km＝41%（比率1）;Km/1.5Km＝71%（比率2）。

由表12得到：对比率1，h＝2.0;对比率2，h＝2.0。

上述的各h数值相等，因此不需要进一步调整。

h平均值，h＝2.0。

应用表13，由上述h2数值校正最初从图形最小值估算的Km（2）：

Km（2）＝0.15×1.0＝0.15mM。

第二次 净值作图

S（mM）  0.1  0.2  0.25  0.5

S200.01 0.04 0.0625 0.25

1/hv＊51.3 103 144 455

1/kV＊截距＝36.36，斜率＝1677，r＝0.9999。

于是，Km（2）＝0.15，Vm（2）＝23.9，h2＝2.0。

运截体Ⅲ的估算

规则4（ⅲ）

从运载体Ⅰ和Ⅱ的参数估算V3。

运载体 KmVmh

1  0.028  7.55  1

2  0.15  23.9  2.0

以1/V3＊作图：

S（mM）  1.25  1.5  1.75  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0

v34.28 6.22 8.346 16.51 19.5 21.18 21.95 22.0

1/v＊358.55 48.23 42.04 24.2 25.6 28.3 31.9 36.36

估算值，Km（3）＝2.0

在2.0＝Km（3），V＝16.50，

在1.5＝0.75Km（3），V3＝6.22，

在2.5＝1.25Km（3），V3＝19.5。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝38%（比率1）;Km/1.25Km＝85%（比率2）。

由表12得：对比率1，h3＝5.0;对比率2，h3＝1.6。

精细调整Km（3），直至各h值相等为止。

再估算h3：最后调整值Km（3）＝1.85mM。

在1.85＝Km（3），V3＝11.60，

在1.40＝0.75Km（3），V3＝5.44，

在2.31＝1.25Km（3），V3＝18.40。

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝47%（比率1）;Km/1.25Km＝63%（比率2）。

由表12得到：对比率1，h3＝4.0，对比率2，h3＝6.0。

令h3＝5.0，

应用上述h3值，按表13所示校正最初由图形最小值估算的Km（3）：Km（3）＝2.0×0.71＝1.4mM。

S  1.5  1.75  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0

S507.6 16.4 32.0 97.7 243 525 1024

1/ v＊1x10-120.39 0.63 0.62 1.60 3.67 7.65 14.9

1/kV＊截距＝0.245×1012，斜率＝4.4×1012。

于是，Km（3）＝1.77;Vm（3）＝20.3;h＝5.0。

规则4（ⅳ）

应用上述运载体Ⅱ和Ⅲ的参数估算运载体Ⅰ的净值。数据

S（mM）  0.005  0.01  0.015  0.025  0.03  0.05

v  1.16  2.04  2.64  2.92  3.37  4.31

1/v＊0.86 0.98 1.13 1.71 1.78 2.32

1/V＊截距＝0.70，斜率＝34.13。

Km（1）＝0.02，Vm（1）＝5.9。

运载体参数：

运载体 KmVmh

1  0.02  5.9  1

2  0.15  23.9  2

3  1.8  21  5

精细调整：

注：

1.黑体字表示需要调整的数值。

2.V（1）是由计算的参数所得结果。

3.V（2）调整为：Km（1）调至0.03mM，Vm（1）调至6.8，Vm（2）调至25，Vm（3）调至22。

4.V（3）调整为h3调至6。

最后的参数：

运载体 KmVmh

1  0.03  6.8  1

2  0.15  25  2

3  1.8  22  6

图48表示计算的曲线与作图各点平均值的关系。

注：实验时，是用两组不同参数在不同时间进行，用以确定速度。从数字上讲，由这两组参数所得结果几乎全同，即1毫微微摩尔/分钟·每个细胞＝1.12毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。

数列图：a＝结构假设，b＝详细解析，c＝精细调整。

运载体 Progression KmVmh

1  a  0.04  10  1

″  b  0.02  5.9  1

″  c  0.03  6.8  1

2  a  0.2  27  ＞1

″  b  0.15  23.9  2

″  c  0.15  25  2

3  a  2.5  14  ＞1

″  b  1.8  21  5

″  c  1.8  22  6

在HeLa细胞中缺Na+谷氨酰胺摄取曲线解析

图49和50所示分别是正常摄取和缺Na+摄取的摄取曲线和标记物反比作图。

数据：

结构假设：

规则2（ⅰ及ⅲ）b

初始斜率是负值，因此一次运载体Ⅰ已被消除。在靠近0.5mM＝Km（2） 处出现斜率最小值，在其后斜率上升段最后的斜率是在0.75mM处，斜率＝12.0＝1/L2＊＝1/Vm（2）×0.005，因此Vm（2）＝17毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。下一个斜率最小变化出现在2.5mM＝Km（3），在此最小值之后的最大斜率（在5mM）所得数值为Vm（2）+Vm（3）＝69毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。因此Vm（3）＝52毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。曲线的形状是典型的两个高次的体系的曲线形状（图44）。

结构假设参数

运载体 KmVmh

1  -  -  -

2  0.5  17  ＞1

3  2.5  52  ＞1

规则4（ⅰ）

估算Km（2）和h2：最后调整的Km（2）＝0.5mM。

在0.5mM＝Km（2），V2＝9.0，

在0.375mM＝0.75Km（2），V2＝5.44，

在0.625mM＝1.25Km（2），V2＝18.40，

速度比（在由Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝72%（比率1）;Km/1.25Km＝80%（比率2）。

由表12得到：对比率1，h2＝2.0;对比率2，h2＝2.3。

令h2＝2.15

应用上述h2值，按图13所示校正最初由图中最小值所估算的Km（2）：Km（2）＝0.5×0.95＝0.48mM。

为 作图：

S  0.15  0.25  0.30  0.35  0.40  0.50  0.60

S2150.017 0.051 0.075 0.105 0.14 0.225 0.333

1/＊v＊20.39 0.63 0.62 1.60 3.67 7.65 14.9

截距＝730，斜率＝6578。

于是，Km（2）＝0.36，Vm（2）＝13.5，h＝2.15，r＝0.9861。

规则4（ⅲ）

估算V3净值：

S（mM）  1.0  1.25  1.50  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0

Net v31.85 11.2 16.1 28.8 41.7 49.64 51.6 52.6

1/v＊3108 22.38 18.6 13.9 12.0 12.1 13.6 15.2

估算Km（3）及h3∶Km（3）初始值2.5mM，Km（3）最后调整值2.0mM。

在2.0mM＝Km（3），V2＝28.8，

在1.5mM＝0.75Km（3），V2＝16.1，

在2.5mM＝1.25Km（3），V2＝41.7。

速度比（在以Km比率所表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝56（比率1），Km/1.25Km＝69%（比率2）。

由表12得到：对比率1，h3＝3.25;对比率2，h3＝4.25，令h3＝3.75。

应用上述h3值，按表13所示校正最初由图中最小值所估算的Km（3）：Km（3）＝2.5×0.79＝2.0mM。

第一次 净值作图：

S（mM）  1.25  1.5  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0  5.0

S1752.31 4.57 13.45 31.1 61.5 110 181 418

1/＊v＊3x10-78.77 12.1 19.9 31.7 52.75 90.5 149 338

截距＝6.74×107，斜率＝0.789×107，r＝0.9999。

于是，Km（3）＝1.77mM，Vm（3）＝53.9毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，h3＝3.75。

规则4（ⅳ）

第一次V2净值作图

S（mM）  0.15  0.25  0.30  0.35  0.40  0.50  0.60  0.75  1.0

Netv22.4 4.2 5.1 5.9 6.8 8.9 9.5 9.0 8.5

在0.6和1.0mM之间V2净值减小，表示h3或Km（3）是太小，将h3从3.75增至5.0，重新以1/V2＊为纵坐标，以S为横坐标作图，校验在0.6和1.0mM之间V2净值是否已增大或接近一个最大值。

第一次1/V2＊净值作图：

由图中最小值示出，Km（2）＝0.5

在0.5mM＝Km（2），V2＝8.9，

在0.375mM＝0.75Km（2），V2＝6.35，

在0.625mM＝1.25Km（2），V2＝10.4，

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝71%（比率1），Km/1.25Km＝86%，（比率2）

由表12得：对比率1，h2＝2.0;对比率2，h2＝1.5，令h2＝1.75。

应用表13，得Km的校正后值为Km（2）＝0.42，已很相符。

第一次 净值作图

截距＝135，斜率＝752，r＝0.9658。

于是，Km（2）＝0.375mM，Vm（2）＝14.1毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，h2＝1.75。

规则4（ⅱ）

第二次估算V3净值：

S（mM）  1.25  1.50  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0

Net v311.2 16.0 28.6 41.4 49.26 51.2 52.1

1/v＊322.3 18.7 14.0 12.1 12.2 13.7 15.3

估算Km（3）及h3：Km（3）的初始值为2.5mM。

Km（3）最后调整值为2.0mM，

在2.0mM＝Km（3），V＝28.6

在1.5mM＝0.75Km（3），V2＝16.0

在2.5mM＝1.25km（3），V2＝41.4

速度比（在以Km比率表示的相关浓度，%）：

0.75Km/Km＝56%（比率1），Km/1.25Km＝69%（比率2），

由表12得到：对比率1，h3＝3.25;对比率2，h3＝4.25。令h3＝3.75。

应用上述h3值按表13所示校正最初由图形最小值所估算的Km（3）：Km（3）＝2.5×0.79＝2.0mM。

第二次 净值作图

S（mM）  1.25  1.5  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0

S103.05 7.59 32.0 97.7 243 525 1024

Net v312.35 17.3 30.1 43.0 51.0 53.0 54.0

1/＊v＊3x10-108.7 15.2 35.8 75.5 158 328 629

截距＝12.3×1010，斜率＝0.602×1010，r＝0.9999。

于是，Km（3）＝1.83mM，Vm（3）＝53.1毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，h3＝5。

最后 净值作图

截距＝143，斜率＝756，r＝0.9957。

于是，Km（2）＝0.39mM，Vm（2）＝14.1毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，h2＝1.75。

详细解析完毕后的参数：

运载体 KmVmh

1  -  -  -

2  0.39  14.1  1.75

3  1.83  53.1  5.0

规则4（ⅴ）

精细调整：

S（mM）  0.15  0.35  0.75  1.0  1.25  2.0  2.5  5.0

v 2.4 6.0 11.5 14.0 23.8 42.0 55.0 66.5

v 2.2 6.4 11.3 14.2 19.4 46.0 57.4 66.7

这些结果表明，在1.25、2.0、5.0所得数值需要约10%的调整才能配合测定值。减小h3数值可达到此目的。但由于此调整必须在3.75和5之间，认为已不需要进一步精细调整。最后参数就是上面详细解析所得的那些数据。

图50中示出该计算出的曲线与作图各点平均值的关系。

注：Km值为mM，速度为毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。

数列图：a＝结构假设，b＝详细解析，c＝精细调整。

运载体 Progression KmVmh

1  a  -  -  -

″  b  -  -  -

″  c  -  -  -

2  a  0.5  17  ＞1

″  b  0.39  14.1  1.75

″  c  ″  ″  ″

3  a  2.5  52  ＞1

″  b  1.8  53  5

″  c  ″  ″  ″

缺Na+参数（括号内）与存在有Na+离子所得参数的比较：

运载体 KmVmh

1  0.03（-）  6.8（-）  1.0

2  0.15（0.39）  25.0（14.1）  2.0（1.75）

3  1.8（1.8）  22.0（55.0）  6（5）

这些结果显示了一般的受Na+影响效应的关系，缺少Na+的结果使运载体Ⅰ完全消除，并且运载体Ⅱ被抑制到这样的程度：Km加大一倍以上，Vm几乎减半。这就启示了，残余的输送作用可能由于一种被促进的体系，因为残余运载体的摄取已被亮氨酸所抑制，而受Na+影响的输送作用就不是这样。几乎可以肯定，所见到的摄取输送作用是由于当内部和外部谷氨酰胺浓度相等时的标记物交换作用。

应着重指出的是，对于缺Na+离子摄取所得的参数是很粗略的，并可由一系列曲线来表示，这些曲线是决定于对图中各具体段所给的加权份量。此外，也没有证据能说明这种机制的本性是会带来残余活性。前述数据的意义在于，这些数字表明一般由运载体Ⅱ所包括的活性浓度范围，在缺乏Na+离子的条件下被高度抑制。

8.细胞与谷氨酰接触

a.程序

这种程序包括一项双标记物实验，先将细胞与2mM的3H-谷氨酰胺 （50μCi/ml）接触10分钟，测定标记物摄入蛋白质中的摄取量（其后用于测定细胞数目），然后与14C-谷氨酰胺（50μCi/ml）接触1分钟，用以测定摄取速率。对于全部重复试样使用相同的标记物溶液，因此在每次培育后取出50μl的试样，然后计数以校正标记物的稀释程度。并未发生浓度稀释，因为每次带标记物的培育都是用未标记的谷氨酰胺并应用与有标记的谷氨酰胺试样相同的试验浓度进行3分钟培育。培育都是在37℃进行，在每次实验前将细胞培养物用含10%（体积/体积）FBS的新鲜培养基199培育2小时。然后将此培养基换成于培养基199中的2mM未标记谷氨酰胺，并培育10分钟。然后再将此培养基换成于培养基199中的3H-谷氨酰胺并准确地培育30分钟。用HBSS洗涤此培养物三次，随后用谷氨酰胺在HBSS中试验溶液（0.25-4.0mM）培育3分钟。随后立即与14C-谷氨酰胺准确地接触1分钟，用冰冷的0.9%（重量/体积）NaCl洗涤细胞三次，再用冰冷的丙酮洗涤三次，使之停止摄取。然后将培养物放在真空干燥器中过夜。

b.蛋白质和可溶性氨基酸的分离

用刮刀和丙酮从培养瓶表面取出这些细胞，然后于100℃使蛋白质凝固而沉淀（McEvoy-Bowe等，J.Chromatog.，347（1985）199-208）。用巴氏移液管取出上部水层并保存。这一组分中含有细胞质氨基酸，取其0.2ml试样并向其中加入0.3ml H2O和4ml ACS（Amersham），供放射性计数之用。

将下层用另外0.5ml乙酸铵再提取，这次将上层弃去。蒸发除掉氯仿，并将蛋白质沉淀物用2ml5%（重量/体积）磺基水杨酸盐洗涤，然后用2ml水洗涤二次。在每次洗涤后，将试管用600g离心分离10分钟。将蛋白质小粒在56℃干燥过夜，然后向已干燥的蛋白质中加入1ml  0.1M  NaOH，密封试管，然后置于100℃环境中过夜，使蛋白质消化。应用BSA为标准物以测定蛋白质含量，于500nm得到光吸收率读数（Lowry等， J.Biol  Chem.，193（1951）265-275）。应用LKB  Wallac  1215  Rackbeta液体闪烁计数仪为放射性试样计数，该仪器是应用ACS淬止的试样的双标记物计数程序。

c.谷氨酰胺摄取量计算

细胞存在数目测定是在10分钟培育期内向细胞蛋白质中掺入3H-谷氨酰胺。应用下述关系式将每分钟向细胞蛋白质中掺入谷氨酰胺的量换算为细胞数目：细胞数目＝（2.2+24.6×Gln毫微摩尔数/分钟）×10·。一分钟内向细胞质内加入谷氨酰胺的量，是由该培养基中谷氨酰胺的比放射性来计算，所得结果是由细胞数目或蛋白质含量来表达，两种方法得到几乎全同的摄取量曲线。在抑制实验中，凡是预培育时间超过3分钟的情况，其摄取速率只是用蛋白质含量表达。

d.用于输送实验的实验室仪器

本发明的另一实施方案是用于检定本发明效果的输送检定板组合件。另一个方案是使用这种组合件的程序。

在临床化学的组织培养或细胞生长培养中，常用的方法是使用检定板，板上有许多小的凹穴或槽来接受试样。常规式多穴槽板的形式是由一个塑料模制件组成，从而可以在长方形盘中放置6-96个凹穴。板上放一个平的盖，可以把全部凹穴同时封盖住。也可使用能单个拆开的盖，可以单独打开每一个穴。USP4599314披露了这类多穴板和盖的结构。

在组织或细胞培养物的输送实验中，为得到可靠的结果，常需要大量的试样，并且要用多种准确计时条件。在培养板表面生长成单层的组织培养细胞提供均匀的细胞群体，它们可能接触到瞬时和同时的培养条件变化，从而使生理条件只是近似的。多凹穴检定板可以在同一时间为大量试样提供输送实验，但需要有一种方法能在同一时间将预培育物和放射性溶液转移到每一个凹穴中。

本发明提供一种用于多凹穴输送检定板的上盖板，这种盖板带有排 成阵列的向下伸出的开口的封头，其排列方式与各凹穴在板上的排列相重合，当把盖板放在上面并与检定板密合接触时，各个封头的开口伸入检定板的各个穴中。

本发明还提供一种输送检定板组合件，其中包括一个检定板，上面有多个间隔开的凹穴，还有一个可移开的盖板，这个板倒置时可以独立停放在一个平的支持面上，盖板上有许多个开口向下伸出的封头，其排列与检定板上的穴相重合，当把盖板放上去并与检定板密合接触时，各个封头的开口伸入到检定板的各个凹穴中。

本发明还提供一种输送作用检定方法，包括在一块检定板的多个穴的底部生长的细胞，将如前段所述的盖板倒置，向盖板上每个封头中加入培育用培养基，将检定板倒置并将之放在盖板之上，然后把整个组件再倒置回来，并保证每个封头中的培养基转移到检定板上的相应凹穴中。下面通过实施例并结合图66、67说明本发明的实施方案。

上述的输送检定板盖可配用于多种尺寸的多凹穴检定板。在下述两个实施例中（实例80及81），将盖板配用于一个6穴板或一个96穴板。但不讲自明的是，本发明还包括其他能适用于各种多凹穴试样板的板盖。此外，虽然这些实例所述是从实验室易得设备所制，但不讲自明的是，这些板盖可以由适当的可灭菌的塑料模制而成。

图66、67示出的组合件包括板盖10和输送检定板20，后者包括有长方形基板21，上面有6个平底凹空22，成两排排列，每排3个。板盖10包括基本上成长方形的盖片11，它的剖面与底板相同，具有向下伸出的包边12。在上面制成6个圆筒形封头13，并从盖片上向下伸出，其排列与板20的穴22相对应。每一个封头13都是倒置圆筒形，一端封死14，在由盖11的平面向下伸的一端有口15。当板盖10置于带6个穴的底板20之上时，盖片11与板20的上部平面表面25密贴，每个封头13的口15伸入到对应的凹穴内。

在使用时，在培养板的底部生长的细胞，以2-3天时间达到75%-90%汇合度。在输送实验开始时，从检定板中倾斜倒出培养基，并应用上述的板盖向各穴中加入新的温育培养基。在实验开始之前，可向倒置的板盖的各封头中放入任意多少种溶液。将该倒置的板盖放在恒温水浴中，即可将这些溶液保持在规定温度。在达到规定时间之前数秒钟，将在穴底上已附有细胞的培养板倒置并扣在已倒置的板盖上，使每个穴对准对应的封头。（见图69，73）。到了规定时间，把整个组合件倒置回来，使溶液转移到相应的凹穴中，并且不会从一个穴洒到其他穴中（见图70、74）。这种转移法对于所有的穴都是瞬时并且同时的，达到既缩短实验操作时间，又提高实验精确度的要求。

从图49、50可以看到，板盖10上的封头13的横截面比检定板20中各平底穴22的横截面小得多。虽然该封头的横截面并不是必须小得多，但小得多是有益的，因为在进行液体转移时减少其内所含液体洒出或溅出的可能性。另外，封头的横切面实际上与凹穴的横切面是相同的。

图中未示出的另一实施方案是板盖上有96个封头，用于有96个凹穴的检定板。在此实施方案中，各封头的横截面可以比各穴的横截面小一些或基本相同，并且板盖与检定板的排布是一种密闭的紧贴配合，这样也能减少洒出的可能性。可使用适当的夹紧装置例如使用卡夹来保证板盖和底板之间的密贴配合。

为6穴底板设计的板盖的封头中能容纳1-3ml溶液，但这种设计还可修改以容纳更多溶液。重要之点是封头的口要从盖片的底面至少伸出5mm，使之能伸入凹穴之内。为96个穴设计的板盖，其封头中可容纳100-300μl或更多溶液。6穴和96穴的板盖都设计成平底的封头，以保证板盖倒置在平面上时能独立站立。

9.检定结果

谷氨酰胺向HeLa细胞的输送是视浓度而定的，并可达到饱和。其摄 取速率是由每毫克蛋白质表示，所反映的是在收获的试样中活细胞存在数目，而不是细胞总数。图2示出谷氨酰胺被HeLa细胞摄入是分为两种高亲合性输送体系（运载体Ⅰ和Ⅱ）和一种低亲合性体系（运载体Ⅲ）。低于0.2mM（运载体Ⅰ）的谷氨酰胺摄取显示很低程度的协同性，而通过运载体Ⅱ的摄取在浓度0.2mM-1mM范围是符合Michaelis-Menten动力学。运载体Ⅲ在1.5-3.0mM范围显示协同性动力学，并且不可饱和组分是3.3毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，这是由全部速度测定演绎所得。对谷氨酰胺摄入到HeLa细胞的全面动力学解析得知（见表2），运载体Ⅰ的Km很小，为0.03±0.0015mM，V最大也是很小，为6.8±0.035毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，因此这种运载体对于谷氨酰胺摄取所起的作用是很不显著的。运载体Ⅱ的Km是0.15±0.075mM，在0.2-1.0mM底物浓度范围的V最大是25±2毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。在谷氨酰胺浓度范围1.0-3.0mM，运载体Ⅲ的Km是1.8±0.10mM，V最大为22±1.1毫摩尔/分钟/毫克蛋白质。计算了每种运载体对于其底物的专一性。运载体Ⅱ的专一性很高，为167毫升/分钟/毫克蛋白质，而运载体Ⅲ的专一性很低，为12.2毫升/分钟/毫克蛋白质。正如预料，运载体Ⅰ的专一性极高，为227毫升/分钟/毫克蛋白质，表明此种运载体对于底物谷氨酰胺是具很高专一性的。

表2

谷氨酰胺向HeLa细胞摄入的动力学参数

V最大

运载体  Km（mM）  （毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质）  Hill系数

Ⅰ  0.03±0.0015  6.8±0.35  1.0±0.05

Ⅱ  0.15±0.075  25.0±2.0  2.0±0.2

Ⅲ  1.8±0.10  22.0±1.1  6.3±0.31

除它们的动力学数值是已知外，关于TGTⅠ-Ⅲ的以下资料也是已 知：

TGT-Ⅰ

-当谷氨酰胺浓度低于0.2mM，起主要输送作用

-符合Michaelis-Menton动力学

-受钠的影响

-对锂离子的轻度接受性

-高度的立体有择

-接受N-甲基氨基酸

-不受2-氨基-2-降冰片烷羧酸的抑制

-不发生适应性调节

-受激发的反式效应

-可能的氨基酸运载体系A。

TGT-Ⅱ

-当谷氨酰胺浓度在0.2-1.0mM之间，起主要输送作用

-协同性载体

-受钠的影响

-不接受锂离子

-高度的立体有择

-不接受N-甲基氨基酸

-受到2-氨基-2-降冰片烷羧酸的抑制

-不发生适应性调节

-受激发的反式效应

-受汞撒利的抑制

-是一种整体膜状糖蛋白，其中含有二硫化物桥联

-解离蛋白质的相对分子量为42000

-可能的氨基酸输送体系ASC。

TGT-Ⅲ

-当谷氨酰胺浓度在1.0mM以上，起主要输送作用

-协同性载体

-不受钠的影响

-不接受锂离子

-高度的立体有择

-不接受N-甲基氨基酸

-受到2-氨基-2-降冰片烷羧酸的抑制

-不发生适应性调节

-受激发的反式效应

-受汞撒利的抑制

-疏水性膜状蛋白质

-可能的氨基酸输送体系L

-解离蛋白质的相对分子量为53000。

表4 按照受Na+影响情况、在0.75mM谷氨酰胺浓度的摄取速度、主要已知抑制剂的特性、以及在缺乏谷氨酰胺的培养基中能力的降低等方面对谷氨酰胺运载体进行分类。

在图3中示出在NEM为0.25-10.0mM范围内，用1mM谷氨酰胺的谷氨酰胺输送的测定结果。所用的预培育时间为20分钟，并如图4所示，为使1mM  NEM对于在1mM的谷氨酰胺输送产生最大效果，这是最适宜培育时间。

在图5中示出Sulphydryl试剂N-乙基马来酰亚胺对于在0.25-4.0mM谷氨酰胺浓度范围谷氨酰胺向HeLa细胞内输送的影响。经过用NEM进行20分钟预培育之后，将该单分子层暴露于放射性谷氨酰胺并测定1分钟摄取量。由1mM  NEM抑制了经由全部运载体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的摄取作用。业已发现，NEM的抑制作用是借助于在预培养混合物中含有大量过量的该 种底物从而保护该载体不与NEM结合，这样使NEM与谷氨酰胺直接争夺载体上的位点。表3示出，过量的L-谷氨酰胺部分地保护了在1mM的谷氨酰胺输送作用而不被1mM  NEM抑制。但D-谷氨酰胺未显示出保护作用。

表3

由底物保护NEM对谷氨酰胺摄取的抑制作用

培育条件  谷氨酰胺摄取（占对照组的%）

对照组  100

由NEM抑制（1mM）  53

用L-谷氨酰胺保护（100mM）  75

用D-谷氨酰胺保护（100mM）  53

可以认识到，离析得到的受体（例如，Mr42000）可能是亚单位。用于离析该等运载体的条件，特别是使用SDS（它能破坏非共价键）并结合使用2-巯基乙醇（它能破坏二硫化物键）时，具有将大的官能团分子减小到其最低分子量的能力。由此，有可能运载体的存在形式是许多大小为Mr42000并由二硫化物键或非共价力键合到一起。它还可以键合到在此体系中未检测到的其他较小或较大分子。这些亚单位的结合，以及构成谷氨酰胺运载体的功能，也包括在本发明范围内。

C.其他人类氨基酸运载体的鉴别及离析

其他人类氨基酸运载体可以由前述用于肿瘤谷氨酰胺运载体的相似方式进行离析。值得特别注意的是那些负责将氨基酸摄入到肿瘤细胞的运载体，特别是这些运载体是否在非肿瘤细胞中不存在或无活性。例如，应用以下程序也离析出在HeLa细胞中发现的一种丙氨酸运载体。

1.在HeLa细胞中丙氨酸运载体的鉴别和离析

测定了在1.0-10.0mM丙氨酸浓度范围丙氨酸向HeLa细胞中的摄入，并表明符合Michaelis-Menten型动力学，如图61所示。在图61中，HeLa细胞暴露于14C-丙氨酸，历时1分钟，并定量测定出现在细胞质中标记 物的量并以总细胞蛋白质表示。图62示出对丙氨酸摄取的Lineweaver-Burk解析，表明丙氨酸摄取的Km为1.33mM，V最大为19.6毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。在图62中，HeLa细胞先在1mM NEM或无NEM条件下预培育，然后进行放射性培育。丙氨酸向这些细胞中扩散速度为0.625毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，并从可饱和组分减去，供动力学解析。

图63示出在NEM浓度为0.25-10.0mM范围，1mM丙氨酸的丙氨酸输送测定结果。在图63中，HeLa细胞先用不同浓度NEM预培育，然后暴露于14C-丙氨酸，用以测定在1mM的丙氨酸摄取速率。当NEM浓度大于2mM之后，对丙氨酸输送的抑制作用达到最大，这时的丙氨酸输送速率是对照组数值的40%。在图64示出，经过用1mM NEM预培育15分钟，1mM NEM对丙氨酸向HeLa细胞内输送的效果。表明该Sulphydryl试剂的作用方式是通过在预培育混合物中加入大量过量的底物，使之直接与丙氨酸争夺载体上的位点。表14（图85）示出，100mM的丙氨酸部分保护了1mM NEM对丙氨酸摄取的抑制作用，而非专一性立体异构物D-丙氨酸完全不能保护载体不受NEM抑制。

图62所示的NEM抑制丙氨酸摄入的Lineweaver-Burk解析表明，虽然NEM是一种不可逆的抑制剂，而它的作用方式显示使Km值降低，这就暗示它是一种竞争性的抑制剂。

HeLa细胞的丙氨酸输送蛋白质的鉴别，是根据鉴别谷氨酰胺输送蛋白质所用的同一原理。应用NEM作为丙氨酸载体的标记物是很有可能的，因为已经有报道丙氨酸输送作用对于NEM抑制是非常敏感的。HeLa细胞质膜在有或没有过量输送底物丙氨酸存在下用3H-NEM培育，并用SDS凝胶电泳法来解析其膜蛋白质。已发现有多种蛋白质能结合3H-NEM，如图27所示，但发现只有C、D峰受到所存在L-丙氨酸的保护。在图27中，在用3H-NEM培育之前和培育过程中，将HeLa细胞质膜用100mM丙氨酸预培育。非输送的立体异构物D-丙氨酸不能保护这些峰使之不与标记物结 合。

细胞质膜在用过量丙氨酸预培育、然后用14C-NEM培育之后，将之溶解于SDS之中，并应用SDS-凝胶电泳法将之解析。然后用此凝胶使X-射线胶片曝光，所得的放射自显影图显示，用输送底物L-丙氨酸预培育的结果在Mr31000谱带（条3和4）有专一性放射标记作用，而用D-丙氨酸预培育的无此作用。

3H-NEM浓度增加与这些峰的结合是应用在相同NEM含量时对丙氨酸输送的抑制进行测定。由图28所示，发现在不同NEM浓度的丙氨酸输送与3H-NEM对D峰的结合有一对一对应关系。假定在载体用3H-NEM 100%饱和时的摄取速率是等于丙氨酸摄入的扩散部分，并且是从在每一NEM浓度测定的摄入速率演绎得来，从而得到单独对D峰的测定曲线。在NEM和Mr31000蛋白质的结合与丙氨酸摄取的抑制之间的1∶1关系理论线有很好的一致性，表示这种蛋白质是担负将丙氨酸输送到HeLa细胞的载体。

2.结果

丙氨酸向HeLa细胞中的输送具有独特的动力学特性，它与谷氨酰胺向这些细胞的输送有明显区别。其摄入曲线与简单的Michaelis-Menten动力学相一致，达到的最大速度为15毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，Km为5.0mM。在预培育培养基中存在1mM  NEM，使在1mM丙氨酸中的对丙氨酸摄取被抑制50%。将输送抑制同NEM与膜蛋白质的结合以及对底物结合的保护的相关性表明，在丙氨酸向HeLa细胞输送中涉及到Mr31000蛋白质带。按上述用于TGTⅡ的相同方式，有可能离析出Mr31000的蛋白质。类此，在本说明书中关于抗体制备、重组体DNA无性繁殖方法、诊断和治疗产品、化合物及方法等等的讨论，也适用于这种丙氨酸运载体或按本发明的任何其他运载体。此外，本技术领域技术人员在阅读本说明书后将能明了离析人类氨基酸运载体的其他方法，特别是离析肿瘤氨 基酸运载体的方法。

虽然已讨论的是应用NEM来鉴别和离析氨基酸运载体，本领域技术人员将了解到还可以应用其他的试剂。例如，对于对NEM敏感的运载体，即表示在活性位点存在有巯基，也可能使用其他巯基化合物，如汞撒利、重氮丝氨酸、DTNB、以及有机汞制剂。对于对NEM不敏感的输送体系而言，被输送的特定氨基酸有可能加上标记，并用于鉴别该运载体。

D.鉴别其他细胞系中的运载体

在离析出一种人类氨基酸运载体之后，可能需要确定在其他类型细胞中是否存在相同或相关的运载体。例如，对于从HeLa细胞所离析的肿瘤谷氨酰胺运载体而言，就需要知道在其他肿瘤细胞中是否能找到同一种运载体。正如后文将更全面讨论，业已发现在其他固体型肿瘤细胞系和淋巴瘤细胞系中也存在TGTⅡ。这一知识的明显益处在于现已有可能应用相同的诊断和治疗组合物来诊断和选择性治疗多种不同类型的癌症。

1.用抗血清筛选细胞系

以下的实验程序是用于确定是否针对TGTⅡ所培育的抗体将与存在于其他固体型肿瘤细胞系、淋巴瘤细胞系、白血病细胞系以及正常人类细胞系中的蛋白质发生反应。

a.鼠抗血清的制备

用雄性Bal  b/c小鼠产生抗血清，是通过在肌内注射500μl抗原，250μl纯化谷氨酰胺输送蛋白质（250μg/ml）和250μl完全弗罗因德氏佐剂。每月为小鼠增补在不完全弗罗因德氏佐剂中培育的抗原，共经历3个月，然后通过尾部放血，收集血清。将血液于室温放置过夜使之凝块，将血清转移到微型离心管并以1200g离心分离（Eppendorf超速离心机）历时10秒，除去血红细胞。将此抗血清于-20℃贮存。同样由未注射小鼠得取对照组血清。

b.兔抗血清的制备

用雄性家兔产生抗血清，是通过在肌内注射2ml抗原（250μg/ml，与完全弗罗因德氏佐剂以1∶1混合），然后每两星期皮下注射增补不完全弗罗因德氏佐剂，共经历3个月。通过家兔耳部的末梢血管放血，并于4℃放置过夜使血液凝固。用400g离心分离10分钟，除掉血红细胞，得血清。将此血清以500μl为一份于-20℃贮存。在第一次注射之前从家兔取血，得到对照组血清。

C.对抗血清的ELISA筛选进行标定

在96穴的微量检测板（Flow Laboratories）的前5行（每行12穴）涂覆50μl试液，该试液是在涂覆缓冲液（35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH9.6）中的抗原溶液（50μg/ml）的双重稀释系列。向后三行穴中加入PBSA（50μl）。将检测板于室温（20℃）培育2小时。将抗原/PBS溶液从各穴中弹出，并将板用洗涤缓冲液（0.05%（体积/体积）Tween20在PBS A中溶液）洗涤3次。将板面向下放在纸巾垫上拍打干燥。通过用在TEN缓冲液（0.5M TRIS-HCl，0.01M EDTA，1.5M NaCl，pH9.0）中的0.2%（重量/体积）酪蛋白溶液于室温培育2小时，然后按上述用洗涤缓冲液洗三次，从而将各穴封闭。制备一系列从1∶10开始的在含0.2%（重量/体积）酪蛋白的TEN缓冲液中的该抗血清双重稀释液，并将这些稀释液向11列（每列8个穴）穴中加入100μl。向第12列的穴中加入对照组抗血清，并将检测板于室温培育1小时。将抗血清溶液弹出各穴，并将检测板按前述用缓冲液洗涤三次。制取抗-鼠/兔辣根过氧化物酶IgG结合物（Bio-Rad）在含0.2%（重量/体积）酪蛋白的TEN缓冲液中的1/1000稀释液，并向该板的每个穴中加入100μl，然后于室温培育1小时。按前述用洗涤缓冲液将检测板洗涤三次，然后向每个穴中加100μl底物。该底物是1mM ABTS溶于0.05M柠檬酸钠、含有2%H2O2的0.15M磷酸钠溶液。对此显色反应进行定量，即用一台Flow产检测板读数器读取在414nm和492nm测各穴的吸收率的差。

d.筛选抗血清

一经由标定得到ELISA检定的最佳条件，即进行筛选检定，以便进一步筛选这些抗血清。一般而言，将检测板涂以抗原（50g/ml）的1/50稀释液，并用抗血清的1/100稀释液作为探查物。所用的联合稀释倍数为1/1000，并按上述方式将检测板读出数据。

e.Western斑点显色

因为在抗血清中的低抗体滴定度，故使用更灵敏的Western斑点测定来确定免疫反应。应用Bio-Rad电泳转移池将蛋白质转移到硝化纤维素上。（见Towbin等，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，76，（1979）4350）。在电泳之后，将凝胶浸于转移缓冲液中（0.025M TRIS-HCl，0.192M甘氨酸，20%（体积/体积）甲醇）于室温历时30分钟。将硝化纤维素切成所需尺寸，在转移缓冲液中慢慢润湿，使该凝胶在阴极，使硝化纤维素在阳极，形成三夹层形式。用60伏恒电压进行转移，历时3小时。将硝化纤维素除下，放在一片用TRIS-HCl缓冲盐水浸润的滤纸上（10mM TRIS-HCl，150mM NaCl，pH8.0，其中含0.05%（体积/体积）Tween20（TBST）和4%（体积/体积）FBS）并于4℃保温过夜。然后将硝化纤维素转移到抗血清溶液中（在TBST中稀释1/100），并于室温培育1小时，随后于TBST中洗涤三次。制备在TBST中的抗-鼠/兔碱性磷酸酶IgG结合物（Promega）的1/10000稀释液，并于室温用该硝化纤维素培育30分钟。将硝化纤维素斑点在TBST中洗涤三次，然后加入溶于碱性磷酸酶缓冲液（100mM TRIS-HCl，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH9.5）的底物（0.37mM BCIP，0.5mM NBT）。当色带显示到足够深度时，用止停液（20mM TRIS-HCl，5mM EDTA，pH9.5）洗涤斑点，停止显色。

f.细胞系的筛选

（ⅰ）细胞膜制备

按上述方式从粘附细胞系制备HeLa细胞膜。使悬浮培养物生长到汇 合度约108细胞/ml，然后利用蔗糖梯度离心法（见Segal等，J.Cell.Physiol，100，（1979）109-118）制备细胞膜组分。所有操作都在4℃进行，首先将细胞用200g离心5分钟分离出片状沉淀物（Clements 2000台面式离心机），然后用0.9%（重量/体积）NaCl洗涤二次。将细胞碎片于10ml溶胞溶液中再悬浮（1mM NaHCO3，0.5Mm CaCl2，pH7.4），然后用紧密配合的Dounce均化器（最大调定值）以30行程进行均化。用Beckman离心机的摇摆臂转子（SW25.1）以500g将所得细胞均化物离心处理，收集上清液并保存。所得细胞碎片在另外10ml溶胞溶液中再均化并按上述方法分离出片状沉淀物。将上清液汇集并用12800g沉降处理20分钟。将膜碎片再悬浮于5ml溶胞缓冲液并与15ml 40%（重量/体积）蔗糖（溶于溶胞溶液）混合，得到30%的溶液。在离心管中，用配有长管的20ml注射器小心将15ml 40%（重量/体积）蔗糖溶液注于30%蔗糖膜溶液之下。然后将此管用54450g离心4小时，其后在浓度相差的界面位置可看到一层白膜。用移液管收集这个膜，然后用45000g沉降1小时。将细胞碎片再悬浮于10mM TRIS-HCl，pH7.4溶液中，并于-20℃贮存。

（ⅱ）筛选程序

将来自多种细胞系（表9）的经纯化细胞膜加溶于SDS-加溶缓冲液中并涂于分开的含有12%（重量/体积）聚丙烯酰胺凝胶的检测穴中。将分开的各蛋白质于硝化纤维素上显斑并按上述方法用谷氨酰胺运载体抗血清探测其反应。

2.测定谷氨酰胺在其他细胞系中的摄取。

应用以下程序测定谷氨酰胺在其他细胞系的摄取速率

a.谷氨酰胺在其他组织中摄取程序及相类的抑制实验

制订了一套测定粘附细胞摄入的新程序，用以研究谷氨酰胺类似物对谷氨酰胺被HeLa细胞摄入速率的影响，以及测定谷氨酰胺被其他类粘附细胞的摄入速率。这里描述的是测定谷氨酰胺被悬浮培养物摄入 的另一程序。

（ⅰ）粘附细胞

粘附细胞在6穴培养板（Flow产品）中生长，直至达到汇合为止。所有培育都在37℃进行，并应用改进的培养板盖（按上述）将每一新溶液转移到各穴中，该板盖有6×4ml闪烁小瓶正在每一穴之上插入到盖中。正常程序是将旧溶液从培养穴中倒出，将测板倒置并将之夹在盖上，同时将新溶液放在各闪烁小瓶中。然后将夹好的组合件倒置回来，于是在培养穴中同时倒入新溶液。在每次实验前两小时，将细胞培养物用含10%（体积/体积）FBS的新鲜培养基199进行培养。然后把培养基更换成在培养基199中的未标记2mM谷氨酰胺并培育20分钟。将该培养基除掉并由谷氨酰胺在HBSS中的试验浓度（0.25-5.0mM）溶液置换，历时3分钟，随后用14C-谷氨酰胺（62.5μCi/ml）在HBSS中的试验浓度溶液置换，历时准确1分钟。用冰冷的0.9%NaCl洗涤各穴三次以停止摄入。借助于用0.5ml 5%（重量/体积）三氯乙酸培育，以除掉可溶性氨基酸，然后用闪烁计数器对放射性计数。余下的蛋白质加溶于1M NaOH中历时120小时，然后测定蛋白质的存在量。测定结果表示为每毫克蛋白质每分钟的毫微摩尔谷氨酰胺掺入量。

（ⅱ）悬浮液培养物

在悬浮液培养物中的摄取实验是应用Bradford和McGivan所述的方法（Biochimica  et  Biophisica  Acta  698，1981，55-56）。在这些细胞上预先负荷2mM谷氨酰胺，历时20分钟，随后用试验浓度的谷氨酰胺预培育3分钟。然后向该细胞悬浮液中加入放射性谷氨酰胺（0.5μCi/ml）历时准确1分钟，然后使这些细胞通过在硅油中旋转而停止摄取。

在一种测定谷氨酰胺在悬浮液培养物中摄取的较好程序中，是将细胞再悬浮于含有氚化水（最后浓度5μCi/ml）和含2mM谷氨酰胺的HBS中，历时约20分钟。当开始时将200μl等分试样的该细胞悬浮液加入 到含有适当浓度谷氨酰胺溶液（在HBSS中）的多个1.5ml微型离心管中，使该2mM浓度达到该试验浓度。当时间＝3分钟，向该微型离心管中加入200μl14C-谷氨酰胺，在到达下一分钟的过程中，将其中100μl等分试样加入到经在37℃预热并含有20μl 12%（体积/体积）高氯酸并且在高氯酸之上还有50μl一层硅油的多个300μl微型离心管中。当时间到达4分钟，将这些300μl微型离心管离心旋转1分钟，然后放在冰箱中过夜。

将微型离心管中的底层物截取到含有200μl  PBS  A的闪烁小瓶中并猛烈振荡。加入闪烁液体，再将小瓶振荡，然后用液体闪烁计数仪作放射性计数。在20分钟培育过程中，向HBSS/2mM谷氨酰胺中加入抑制剂/类似物，进行输送抑制实验。

3.结果

研究0.25-4.0mM谷氨酰胺浓度范围内谷氨酰胺在各类细胞系中的摄取速率。在图7a-g中给出不同细胞系的摄取曲线。表6  汇总了在0.75mM谷氨酰胺浓度（生理浓度）所得摄取速率，其中包括从文献中所得多种组织的结果。所研究的全部固型肿瘤细胞系都具有很高摄取速率。大多数正常和淋巴瘤衍生的细胞系（包括正常和癌细胞）都显示低的摄取速率，例外情况是正常细胞系MRC5和成淋巴血瘤细胞系MOLT3。

表9  列出一些细胞系的免疫斑点分析结果，其中包括用由抗HeLa细胞的谷氨酰胺输送蛋白得到的鼠或兔抗血清。在斑点上类似于分子量42000的位置显示的色带表示对抗体的阳性应答。在图26中给出一种代表性的免疫斑点，它显示阳性和阴性的结果。多种其他的色带与抗血清的非专一性反应，暗示发生了某种程度的交叉反应。表10  所列出的细胞系包括它们对使用鼠或兔抗血清的免疫斑点分析的响应以及在0.75mM浓度的谷氨酰胺摄取速率。只列出了得到完整数据的细胞系。

将表9  所示的对各种类型细胞所作谷氨酰胺输送蛋白质的专一性结果与表6  对各种细胞系所作谷氨酰胺摄取速率结果相比较，反映出在抗体专一性和该细胞系的谷氨酰胺摄取之间的相关性，见表10  所示。那些对于抗血清有阴性应答的细胞系，也具有低的谷氨酰胺摄取速率。在对表10  结果的二方向列联检验中，以0.005概率水平否定了肿瘤细胞独立性或或无抗体专一性的假设。

这些研究的目的之一是确定是否在谷氨酰胺高速摄取与恶性病征之间存在明确相关性。表6  表明，所有这6种固型肿瘤组织的谷氨酰胺摄取速率均高于20毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质。全部在悬浮培养液中生长的Burkitt淋巴瘤似乎都居于固型肿瘤和白血病/正常细胞组之间的位置，并且三者之中有两个产生对HeLa细胞谷氨酰胺运载体抗体的阳性抗原-抗体反应（见表9  和表10  ），并且它们的谷氨酰胺摄取速率都很低。有一种正常的培养物产生高的谷氨酰胺摄取速率（MRC5，表9  ）。这是起因于这类型工作的自然危害性之一，就是正常细胞在活体中的生长速率要比在活体外预期的生长速率慢得多，并由于明显的理由，从培养物慢速生长和短限期生命转化到快速生长和更长的生命很可能是涉及谷氨酰胺运载体活性的转强。

作为以上发现的结果，暗示了具有被抑制的谷氨酰胺摄取速率的固型肿瘤是因为它们的供血常常不足，因此它们需要摄取全部它们能得到的谷氨酰胺。另方面，在血液或淋巴中正常存在的细胞易得到谷氨酰胺的大量供应，因此上述去阻遏机制未必能起作用。在资料完全的三例成淋巴细胞白血病和三例淋巴瘤中（表10  ），三例白血病全显示对该运载体抗体的阴性反应，但其中之一的谷氨酰胺摄取速率很高（迄今为止具此关系的唯一实例）;而在这些淋巴瘤中，其中两个对于运载体抗体有阳性反应，而另一个无此反应。三例淋巴瘤都具有低的谷氨酰胺摄取速率。把Bordin  Epstein-Barr转化的淋巴细胞同淋巴瘤放在一起， 因为它们是最接近的培养相当物。因此，这些淋巴瘤中之一显示了与白血病中之一相反的状况。

这些结果暗示了细胞转化为完全固型肿瘤状态可能有两个或更多步骤，这可能由于上面讨论过的两种中间状态，一种是由于谷氨酰胺摄取机制部分转为加快，而另一种是部分转为减慢。对表6  中6种固型肿瘤细胞（表面粘附细胞，而不是在悬浮液中生长的细胞）和15种其他组织的数据平均偏差的显著性进行史蒂顿特氏测验的结果，给出肿瘤的平均值为39.4毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，S＝±14.8;而其他组织给出平均值为8.0毫微摩尔/分钟/毫克蛋白质，S＝±8.0。由此得t＝6.0，其中对于两个平均值之间无相差而言，19自由度是远超出0.005概率水平以外。

在癌症治疗和诊断中应用单克隆或多克隆抗体的可能性依赖于谷氨酰胺输送蛋白质在正常和肿瘤细胞中的不同抗原性。从表9  可以看到，6种固型肿瘤细胞都是阳性的，三种Burkitt淋巴瘤中的两种是阳性的，5种白血病都是阴性的，四种正常细胞都是阴性的。当使用对纯化谷氨酰胺运载体蛋白质产生的鼠或兔抗血清探测时，出现的对固型肿瘤的一致阳性应答，暗示临床使用该等谷氨酰胺运载体抗体对于固型肿瘤及至少许多种淋巴瘤将是有效的。表10  示出，抗体反应结果与高速率谷氨酰胺摄取达致极好的相关性，这对于上述的假设是有力的支持，即：去阻遏的谷氨酰胺运载体可能是固型肿瘤的专一性标志物。

Ⅲ.对人氨基酸运载体的抗体

本发明的另一实施方案包括这样的单克隆和多克隆抗体，它们能按本发明识别人氨基酸运载体。对TGTⅡ（按前述）的多克隆抗体的制备程序也可以制备对其他人氨基酸运载体的多克隆抗体。

除去多克隆抗体之外，也可能需要有对人氨基酸运载体的抗原 决定基有专一性的单克隆抗体。例如，因为TGTⅡ对于其他肿瘤细胞是共同的，对于TGTⅡ的抗原决定基的单克隆抗体用于诊断癌的存在可能是有价值的。单克隆抗体也可用于重组体无性繁殖程序，用以离析出对TGTⅡ编码的基因。对于任何运载体的单克隆均可应用与下述制备能识别TGT的单克隆抗体相似的程序。

1.将小鼠、大鼠或其他动物进行对该谷氨酰胺运载体蛋白质的免疫处理，例如可应用纯化的离解TGT、纯化的天然TGT、天然形态的粗制膜蛋白质制剂、或由该运载体的氨基酸序列所制的肽。

2.将免疫处理的小鼠的脾除下，并采用融合实验用经培养的骨髓瘤细胞融合。

3.在选出的用于杂种瘤细胞生长的条件下，将已融合的细胞接种到培养皿中。

4.当该杂种瘤群落开始生长，开始筛选该等杂种瘤。

可应用数种筛选方法来得到结合到肿瘤谷氨酰胺运载体的单克隆抗体。其中一种筛选方法是ELISA测定法，包括以下步骤：

1.将检测板（例如96穴）涂覆纯化的输送蛋白质。

2.得自杂种瘤群落的上清液加入到已涂覆的穴中（阳性反应的抗体将结合到该输送蛋白质的相应抗原决定基上）。

3.将过量的抗体洗去。

4.将IgG结合物（抗-鼠抗体结合到一个酶或其他通讯分子上）加入到这些穴中。

5.将过量的结合物洗掉。

6.加入用于此种酶的底物，并在穴中发生显色反应，将之与来自阳性反应克隆的上清液一起培育。

7.通过培养，生长大量的阳性反应克隆。

8.通过注射到小鼠的腹水中，可以大量生长阳性反应克隆。

但是，由于TGT的独特性质，该等杂种瘤可以用谷氨酰胺输送抑制测定法来筛选。与该运载体结合的单克隆抗体将抑制谷氨酰胺的输送，并且按此方式也可以进行鉴别。此筛选程序包括以下步骤：

1.向检测板（例如96穴）中接种生长到75%汇合程度的HeLa细胞。

2.向这些HeLa细胞中预负荷高浓度谷氨酰胺（2-3mM）。

3.将得自生长中克隆的上清液加入到这些穴中（阳性单克隆抗体将在与膜外表面接触的输送蛋白质的活性位点处结合）。

4.将过量抗体洗去，然后将细胞用含有C-谷氨酰胺的试验浓度谷氨酰胺在准确的时间内培育。

5.用冰冷的0.9%（重量/体积）盐水洗涤，停止摄取放射性谷氨酰胺。

6.利用放射性计数法定量测定在细胞质中标记物存在量（应用三氯乙酸将可溶性组分提取）。

7.利用Lowry分析法估算蛋白质存在总量，结果表示为每毫克蛋白质每分钟加入的谷氨酰胺毫微摩尔数。

8.将每一受试克隆所得的结果与应用对照血清（没有谷氨酰胺输送蛋白抗体）的对照组进行比较，并将相对于对照组显示大于20%谷氨酰胺摄取抑制作用的样品作为阳性结果。

9.可以用培养法或用注入小鼠的腹水中，以生长大量阳性克隆。

还可以做到在谷氨酰胺还载体中远离谷氨酰胺结合位点的区域产生抗体。虽然这些抗体对于诊断肿瘤细胞的存在有相等价值，但它们不能用上述抑制测定法进行筛选。它们可以用其他方法来鉴别。首先，若其受体已离析出来，于是抗体将发生结合但不会阻碍谷氨酰胺的结合。其次，可应用谷氨酰胺受体含量高的细胞来检验它们，并将所得结果与受体量低或无受体的其他细胞的结果进行比较。在反应活性上的差异将 指示该抗体是针对谷氨酰胺受体的可能性。

关于这些单克隆抗体对受体分子本身或对这些分子上结合位点的研究是很普通的，并且常使用多种不同的诊断试验，用以分析该抗体是结合到哪些分子，以及结合到这些分子上哪些部分。这些试验大部分要涉及直接的血清学测定，例如应用差示反应的细胞毒理学或流动细胞计数测定，用以指示该等细胞可能要结合的分子。在这些研究之后，例如可应用放射性标记的细胞膜的免疫沉淀，或在该分子种类可以鉴别时，进行Western（免疫斑点）型分析。这些试验可以鉴别与该等抗体相结合的分子，但并不能指示该分子的哪部分是有反应活性的。其中放射性标记的谷氨酰胺与受体分子的结合作用被抗体所阻碍时，可以进行后随试验。如上所述，这些试验应当是简单易行的，并且在抗体与官能性分子结合的分析中是很标准的。

显然，所得到的抗体将取决于用于使小鼠或其他动物免疫的蛋白质。例如，若从SDS-PAGE得到TGTⅡ，则该蛋白质将是其“离解”或“变性”的形式。那些取决于该运载体蛋白质三维构型的抗体将不能形成。因此，为了得到取决于例如TGTⅡ的三维构型的单克隆（和多克隆）抗体，则动物必须以该蛋白质的天然形式进行免疫处理。至少有两种方法完成这个任务。

首先，可以针对动物体中含有TGTⅡ的肿瘤细胞膜部分进行免疫处理。然后可以按上述相同方式来筛选天然形态的单克隆抗体。另一方法，可以用得自下述重组体方法的纯化天然蛋白质对动物免疫处理。

简言之，所得单克隆抗体的类型不仅取决于所用的氨基酸运载体，还取决于该运载体是否处于其天然形式或离解的形式。类此，所得的抗体可取决于所用的是整个蛋白质抑或只是一个片段或亚单位。

可以生产对于谷氨酰胺运载体的单克隆抗体，这些可以在小鼠、大鼠、其他动物体中产生，甚至可在人体中产生。所有这些单克隆抗 体品种中，凡是能识别谷氨酰胺运载体的部分或其亚单位的，都属于本发明范围。此外，现已认识到，对于专一性是由于保留超变区的情况，可以按现在所述使用抗体的整体、一部分（例如Fab′2或Fab）或使用单链抗体。另外，这些单克隆抗体可由基因工程来设计，于是来自一个种系的序列的片段可以转移到同一或其他种系的基因，用以提供杂种嵌合分子。所有这些具有与谷氨酰胺运载体结合能力的抗体（整体或部分结合）均在本发明范围之内。

Ⅳ.应用重组方法生产运载体

可以获得运载体（或其亚单位）的N-端和部分氨基酸序列，可以合成寡核苷酸探查物，并且可以由标准方法获得cDNA和基因组克隆，包括探查不同来源和不同种系的cDNA和基因组库。此处所述的谷氨酰胺运载体的离析将自然导至在一个种系（人类）的cDNA和基因组克隆的无性繁殖，但还应导至应用种系交叉杂化而在其他种系中离析出运载体。用于基因无性繁殖的方法很多，通常是尝试进行导致离析出该基因的数种方法。这些可以包括使用多克隆抗血清或单克隆抗血清以及表达体系;对于抗原表达在细胞表面的细胞离析而导致离析出cDNA;转染方法;信使RNA选择程序;鉴别限制片段长度的多态性，导至基因无性繁殖或易位。这些方法现已成为标准方法，并于全世界许多实验室中使用，此处不必详述。一个重要特征是从cDNA和基因组克隆所得核苷酸序列以及它们由于基因多态性、组织多态性、基因重排或交替拚接而带来的变化，或任何其他导致谷氨酰胺运载体结构变化的程序。

大肠杆菌细胞，其他细菌，酵母和较高级真核生物细胞可以借助将cDNA克隆到表达载体中而用来合成异类蛋白质，例如谷氨酰胺运载体蛋白质。为达到此目的，首先从已知是表达该目标蛋白质的组织离析（全部）mRNA并从这些mRNA产生cDNA;应用反转录酶来产生第一个单链;应用核糖核酸酶H使RNA模板降解;以及应用DNA聚合酶进行第二个链合 成。然后将这个双股cDNA克隆到适当的表达载体（可以是质粒或是噬菌体）中。在这些载体之中的无性繁殖位点可以是（1）在调节基因的5′编码区，结果是合成一种融合蛋白质;或（2）直接插入到一个适当的启动子/核糖体结合位点的下游位置，结果是合成一种非融合蛋白质。然后可以筛选菌落（质粒载体）或空斑（噬菌体载体），以便应用一种适当探查物来生产目标蛋白质，并且将生产目的蛋白质产品的克隆离析出来并大量生长。因此，例如可以离析出数种λgtll无性繁殖系，它能合成与培育成为纯化的输送蛋白质的多克隆抗体进行反应的蛋白质。

A.克隆实验

能够在原核体系中表达谷氨酰胺运输蛋白（或其一部分）的cDNA克隆的有效性提供了大量生产蛋白质的潜力。纯物质可以用于诊断试验或治疗目的。另外，它可用于产生抗体（单克隆和多克隆）以及使筛选用于抗谷氨酰摄取活性的新化合物（或新单克隆）比现有方法更为简单。作为克隆运输蛋白生产的第一步可以这样进行，例如筛选含有产生纯化运输蛋白的多克隆抗血清的有代表性的Hela细胞cDNA基因库，并分离和纯化几种正克隆。

下面叙述cDNA基因库的特点及可采用的一种筛选体系。如上所述，这种方法只是可用于本发明的几种不同克隆方法中的一种。很明显，本发明是不限于使用任何一种方法的，本领域的技术熟练者会迅速了解到同样属于本发明范畴的其他方法。

1.HeLa细胞cDNA基因库特点

滴定度：1-9×109pfu/ml

体积：0.2ml

mRNA源：Hela衍生的D98-AH2细胞（表现型HDRT）

载体：λgyll

克隆位点：EcoRI

筛选标准（重组体与非重组体的比值）：清噬菌斑与兰噬菌斑的比值

用此筛选标准的（重组体）克隆百分数：81%

独立重组体（即清噬菌斑）数目：1.3×106，

平均插入大小：0.86kb（范围0.48-3.1kb）

2.用抗体制剂筛选HeLa细胞cDNA基因库

可使用的筛选方法的根据如下：将cDNAS克隆到λgtll  EcoRI位点的结果，不仅引起（噬菌体编码的）β-半乳糖苷酶的插入失活，如果插入的定向和读码正确，cDNA插入还可以表达为融合蛋白，可用cDNA编码的蛋白专用抗体进行检测，噬菌体是用异丙基b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和结合于硝基纤维素过滤器上的融合蛋白诱发。然后将过滤器短时浸渍在稀的原生抗体（此情况的多克隆抗血清在鼠宿主内产生纯化的运输蛋白）中进行筛选，洗掉未结合的原生抗体，然后用与酶结合的原宿主的次生抗体检测结合的原生抗体。在此情况下，次生抗体结合物可以是用羊抗鼠IgG（H+L）碱性磷酸酯酶结合物亲合纯化。用有色的磷酸酯酶底物混杂物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）+硝基兰四唑嗡（NBT）进行检测结合次生抗体的磷酸酯酶的结合。

a.筛选方案

1.平板培养细胞。取出E.coli.Y1090r，将单个菌落置于含100μg/ml氨苄青霉素的pH7.5的LB琼脂板上在37℃下培养过夜。从板上的单个菌落开始于37℃下在LB（pH7.5）中生长Y1090r至饱和，同时通气。

2.用cDNA基因库感染细胞。可用0.2ml的过夜细菌培养物（Y1090r）加0.1ml含3×104pfu基因库/平板的噬菌体稀释剂（10mM Tris-HCl，pH7.5，含10mM MgCl2）进行筛选。使用现在提供的抗体制剂，四个板已足够得到几个正结果。

3.平板细胞。在噬菌体加细菌的混合物加入每板3.5ml的LB软琼脂（pH7.5），倾至已有2天的LB琼脂板（pH7.5）上，于42℃下培养3.5小 时。

4.硝基纤维素过滤器的叠置。将平板置于37℃的培养箱。将硝基纤维素滤盘在10mM异丙基β-D-半乳糖吡喃糖苷（IPTG）水液中进行预浸渍。将平板叠置于IPTG处理过的干过滤器之上，在37℃下培养3.5小时。

5.制备筛选用过滤器。将各板移至室温下，在过滤器上做记号以便在其后能使过滤器与平板对齐，小心地从琼脂上取下过滤器，置含150mMNaCl和0.05%（V/V）吐温20（TBST溶液）的100mMTris-HCl（pH8.0）中洗涤，除去任何粘附的琼脂。为饱和非特定蛋白连接的位点，可将该过滤器在含1%的牛血清蛋白的TBST溶液中培养30分钟，每一过滤器使用7.5ml溶液。

6.原生抗体的预处理。在用血清筛选硝基纤维素过滤器之前立即用E.coli提取物处理原生抗体溶液（即鼠抗运输蛋白），可用100μg/ml的E.coli提取物将抗血清稀释至1/10000，并且培养时间可用30分钟。

7.在原生抗体中培养。将该过滤器在含稀释至1/100的原生抗体的TBST中培养30分钟，每一过滤器用7.5ml溶液。

8.洗涤过滤器，将过滤器在20ml等分的TBST中洗涤至少3次，每次10分钟。

9.次生抗体的培养。然后将滤纸移至含稀释至1/7500的次生抗体结合物（用亲合羊抗鼠IgG（H+L）碱性磷酸酯酶结合物纯化的）的新鲜TBST中，在室温下培养30分钟，每个过滤器用7.5ml溶液。

10.洗涤过滤器。重复步骤8。

11.用磷酸酯酶底物培养。将过滤器用滤纸吸干，然后移至底物显色溶液中。对于5ml的底物溶液，是将33μl的硝基兰四唑嗡（NBT）贮存液（50mg/ml于70%二甲基甲酰胺中）加到5ml含100mM NaCl和5mM MgCl2的100mM Tris-HCl（pH9.5）中，混合后加入16.5μl5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）贮存溶液（50mg/ml于二甲基甲酰胺中），再 进行混合，避强光培养1-4小时。在过滤器上出现正克隆显紫空斑。

12.停止显色。当空斑能为肉眼可见并在背景变暗前，弃掉底物溶液并将过滤器移至20mM  Tris-HCl（pH8.0，含5mM  EDTA）以终止磷酸酯酶的反应。然后将过滤器干燥贮存或在溶液中贮存。

b.进一步筛选

初筛选一般每板得到平均约2个“+”号，即初筛选的“+”号总频率是每1.5×104空斑约1。取出自初筛选板推定的正克隆，移至有宿主细菌E.Coli Y1090r.的次级筛选板。将正空斑在方格图形模板上排列好，每板也包括负（对照）空斑，按初筛选（步骤4-12）对板进行处理。自初筛选板推定的正空斑有约有75%在次级筛选是正的。将此纯化方法重复2次，在第三次筛选板上“+”号频率约为80-100%，在第四次筛选时所有空斑均为“+”号。第四次筛选的“+”号可以大量生长并可用标准方法（Davier et.al.，1986，Basic Method in Molecular Biology，）Elsevier Publishers，New York）自其制备DNA。

然后，克隆过的天然谷氨酰胺运载分子或其片段可用于生产单克隆或多克隆抗体。

另外，得自SDS-PAGE解离蛋白能够序列化而得到运载体的氨基酸序列。从氨基酸序列可制备DNA探针，为DNA的互补股探测cDNA基因库。用cDNA克隆或低聚核苷酸探针或本领域技术熟练者已知的其他技术可以从基因库分离出基因克隆。并且，使用这些试剂可以分离出同类cDNAs或人类或其他动物的基因。用这种方法可以得到为生产天然蛋白编码的基因。表达方法如前所述。

必须强调的是，可以试用的方法有好几种。如果一种方法（如详述于上的方法）失败了，本领域技术熟练者将会意识到其他的方法可能凑效。下列书刊可作为引荐：DNA  Cloning，A  practical  Approach，Vols，Ⅰ-Ⅲ，ed，M.D.Glover，I.R.L.press，Washington，D.C.（1985）; Current  protocols  in  Molecular  Biology，Vols.Ⅰ  and  Ⅱ，ed.F.M.Ausubel  et  al.，Wiley  &Sons（1987）;Molecular  Cloning，A  Laboratory  Manual  T.Maniat  is  et  al.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory（1982）。

B.序列变异

编码运载体的核苷酸序列由于下述各原因而能改变。

1.遗传密码核苷酸改变的简并性不一定使氨基酸编码改变。例如，密码子GUU确定缬氨酸残基，正如密码子GUC、GUA、GUG所确定的，它们是由单个的核苷酸而区别的。

2.二或三个核苷酸的改变可产生相同的氨基酸。例如密码子UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG均亮氨酸编码。密码子AGU、UCC、UCU、UCA和UCG编码丝氨酸。

3.改变一或二个核苷酸可产生保守氨基酸的改变，不一定能较大程度地影响蛋白质的功能。例如，密码子UUC确定亮氨酸、AUU确定了异亮氨酸、UCG规定了色氨酸、UUU确定了苯丙氨酸-均为保守改变。

4.等位基因变异。编码蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列以及生成物可出现在同种的单个成员之间。这些变异产生于编码蛋白核苷酸序列的变化，因此，不同形式的相同基因（称为等位基因）产生了氨基酸序列稍有不同的蛋白质，但仍有相同的功能。

5.差异mRNA拼接的结果可出现变异，由编码序列（编码成熟蛋白的DNA）的许多不同片段（外显子）组成的一个基因产生RNA的拼接，使从某些外显子衍生的RNA部分被除去。外显子的选择在不同细胞类型中可以是不相同的。

6.具有相同功能的蛋白质，例如主要的组织相容性蛋白可由相关基因产生，许多蛋白基因族已有叙述，例如免疫球蛋白，它有核苷酸和氨基酸序列变异，但保留了抗原结合的初始功能。这种同类蛋白是用同类 基因编码的。这些基因是由一个原基因的复制或者基因转换而产生的。

可以用下述方法有意识地引起变异：

1.用点突变、重排或将相关或不相关的DNA插入cDNA或编码功能蛋白的基因克隆使克隆cDNA或基因DNA突变。这种突变（变异物）克隆可用于产生变异蛋白或多肽，在本文中则可用于产生具有谷氨酰胺运输功能的变异蛋白或多肽。

2.有或未裂解产品的修复/重排的蛋白质（体外合成蛋白或正常的细胞合成蛋白）的酶裂解。

3.化学改变

4.辐射法。

本发明也包括使用谷氨酰胺运载体（肽）和合成的或由基因工程方法得到的变异肽的片段。其他运载体是在同种核酸、蛋白和功能水平的各类之中或各类之间的。因为实质上序列同类，本发明所述的cDNA克隆将能分离相关的序列。

V.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物

本发明的另一实施方案是提供适用治疗癌症的抗谷氨酰胺和谷氨酰胺类似物或其生理上可接受的盐，具有如下（Ⅰ）的通式：

式中

X选自CR5R6、NH、NOH和O;

W选自CO、SO2、R7p＝O

V为

R1选自OCH2ph、OR13、NH2和NHNH2，其中的R13选自H和一个C1～5取代或非取代的、环状或非环状的、饱和或不饱和的烃基;

R2选自由R13、NH2、（C＝O）R13和（C＝O）OR13所限定的基团;

R3选自由R13所限定的基团;

R4选自由R13所限定的基因、囟素和（C＝O）R1;

R5和R6可分别选自囟素和R13所限定的基团;

R7选自由OR14和NR15R16所限定的基团，其中R14、R15和R16分别选自H、C1～5取代或未取代、饱和或不饱和、环状或非环状的烃基，也可被C5-6芳环或杂芳环所取代;

R8选自由R14、OR14、氨基、酰氨基、NO和NO2所限定的基团;

R9选自由R14所限定的基团;或R8和R9与氮原子一起代表3-8元的取代或非取代、饱和或不饱和的杂环;

R10选自R14、OR14、氨基和酰基所限定的基团;

R11和R12选自由R14和酰氨基所限定的基团。

另外，V-W-X-CH2还可代表

基团，其中R17选自由R14、SO2Cl和（C＝O）-R14所限定的基团;

R18和R19分别选自由R14、囟素和取代R14所限定的基团，取代R14是R14在四元环的α碳上被一离去基团（例如OMs、OTs和囟素，但不限于在此）所取代;

另一供选样的是V-W-X代表

基团，其中的R20选自由R14、OR14和NHR14和（C＝O）R14所限定的基团;

或者其中的ZR21为囟素;

Z选自O、S和NR14;

R21选自由甲磺酰基、甲苯磺酰基、（C＝O）R14和

C1～5取代或非取代、环状或非环状、饱和或不饱和的烃基所限定的基团;

或者R20和R21与

一起形成一五元或六元可以进一步取代或非取代的杂环。

值得注意的式（Ⅰ）所限定的化合物的种类包括（但不限于）通式（Ⅱ）的化合物或其生理上可接受的盐：

式中的X选自CH2、NH、NOH或O，R1、R2、R8和R9如上所定义。

值得注意的式（Ⅱ）所限定的化合物的种类包括（但不限于）通式（Ⅲ）的化合物或或其生理上可接受的盐：

式中的X为CH2、NH、NOH或O;

R23为H（当R8选自由OH、NHR14、（C＝O）NHR14和（C＝O）N（R14）OH所限定的基团时）;

R23为OH（当R8选自由（C＝O）NHR14和（C＝O）N（R14）OH所限定的基团时）;

或者R23和R8分别选自前述R14所限定的基团;

或者R23和R8与氮原子一起形成取代或未取代、饱和或不饱和的五元或六元杂环。

值得注意的式（Ⅲ）所限定的化合物的种类包括（但不限于）：

A：式

化合物或其生理上可接受的盐，式中R8和R9如前所定义。

B：式

化合物或生理上可接受的盐，式中R26为H、OH或NO，R24和R25分别选自H、OR13、SR13、NR13、NO2、CHO、CO2H或囟素，其中R13如前所定义;

C：式

化合物或其生理上可接受的盐，式中R27和R28分别选自H和OH;

D：式

化合物或其生理上可接受的盐，式中R29选自

其中的X为OH、OMs、OTs或囟素，R30和R31分别选自前述由R13所限定的基团。

“C1～5取代或非取代、饱和或不饱和、环状或非环状烃基”包括烷基、链烯基或炔基，包括以有助于将这类化合物与肿瘤浆细胞膜的谷氨酰胺载运蛋白结合的或化合物一经运输后就改进作用的取代物所取代的直链和支链以及1-5个碳原子的环烃基。

“3-8元的环烃”包括3-8元的饱和或不饱和的烃环，这种烃环可含1-3个杂原子（N、O或S）并可被有助于这种化合物与肿瘤浆细胞膜的谷氨酰胺载运蛋白结合的或化合物一经运输后就改进作用的取代基所取代。

“3-8元的环烃”最好选自由一个或多个如OH、SH、NHR13、NO2、CHO、COOR13或囟素（R13如前所定义）之类的极性基团所取代的C5-6芳烃或杂芳烃。

“氨基”包括一级、二级和三级氨基、NR8R9（R8和R9如前所定义）。

“酰氨基”包括C（O）NR8R9（R8和R9如前所定义）。

通式（Ⅰ）、（Ⅱ）和（Ⅲ）化合物的可能的盐包括例如所有的酸或碱加成盐。生理上可接受的盐通常由无机酸或有机酸或碱衍生而来。生 理上不可接受的盐（例如最初作为加工产品而得到的盐，如以工业规模制备本发明的化合物中得到的盐）可用已知方法转化成生理上可接受的盐。生理上可接受的盐有水溶性和水不溶性酸加成或碱加成盐，这样的盐有氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、葡萄糖酸、苯甲酸、丁酸、磺基水杨酸、马来酸、月桂酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、硬脂酸、甲苯磺酸、甲磺酸、水杨酸、钠、钾和铵盐。

A.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物的合成

通式（Ⅰ）-（Ⅲ）的化合物可用下面概括的一系列方法进行合成。合成方法有赖于X、W和V的性质。合成一般是需要保护基团的，前体的保护基团的选择是根据最终产物所要求的功能基的。保护基的使用以及保护和脱保护的方法都是本领域技术熟悉者所熟知的（例如T.W.Greene，“Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis”，John  Wiley  &  Sons，1981一书所述）。

包括R1-R4的各种基团也是熟知的基团，并可用公开的合成方法或按本发明公开的技术引入这些基团。合成中的取代次序或置换时间取决于R1-R4和其他取代物的性质。总之，本领域普通技术人员将会使用各种方法制备本发明的化合物并将根据为X、W、V和R1-R4所选择的各个基团而进行合成。

式（Ⅰ）-（Ⅲ）的其中X为CH2、W为C＝O的化合物可以从适合地保护了的谷氨酸衍生物来合成，如方案1和方案2（图51和52）。这些被保护的衍生物包括焦谷氨酸衍生物2和3以及谷氨酸半酯6和7。这些化合物中有些是有商品供应的，需要时进行合成可能也不会很贵。

如方案2所示，化合物6和7的活化以使其适合于亲核取代（例如用各种胺R8R9NH）可用两种主要方法达到目的，即用形成混合酐的方法（例如8）或形成活泼酯（例如9）。两种方法都有文献记载（例如 Goodman  et  al.（1962）J.Am.Chem.Soc.，89，5012;Dutta  et  al.（1971）J.Chem.Soc（Perkins  C），2896;Kim  et  al.（1975）J.Chem.Soc.Chem.Commun.，473）并在文后提供的实施例中加以说明。

X代表CH2、W不是C＝O的通式（Ⅰ）化合物的制备可将适合地保护的去氢丙氨酸衍生物（例如10）与磷酰基负碳离子11或硫酰基负碳离子12反应。另外，如方案3（图52）的实例所示，这些化合物可用乙酰基氨基丙二酸二乙酯13与适合地膦酸乙烯酯14或磺酸乙烯酯的反应进行合成（参见例如Maier et al（1983）Phosphorus Sulfur 17，1）。如W为SO2、X为CH时，也可用高胱氨酸来合成这些衍生物。

X为O而W为C＝O的式（Ⅰ）-（Ⅲ）的化合物通常是用适合的被保护的丝氨酸衍生物，例如16（方案4，图54）。在V由NR8R9（R8和R9如前所定义）代表的情况下，用光气与被保护的丝氨酸反应将会形成氯代甲酸酯，此产物再与胺亲核剂R8R9NH反应生成氨基甲酸酯17，如方案4（图54示例。在W不是C＝O的情况下，式（Ⅰ）化合物可用适合的磺酸或膦酸或其活泼衍生物（例如酰氯）与丝氨酸衍生物反应进行合成。

X为N或NOH、W为C＝O的式（Ⅰ）-（Ⅲ）化合物可以用适合保护形式的3-氨基丙氨酸18或3-羟氨基丙氨酸19与适合的异氰酸酯20或酰氯21反应进行合成，如方案5（图55）所示。在W不是C＝O的情况下，式（Ⅰ）化合物可用类似于方案5所示的步骤合成。在这些情况下，适合地保护了的3-氨基丙氨酸18或3-羟氨基丙氨酸19衍生物能够与适当取代了的膦酰囟或磺酰囟进行反应（方案6;图56）。

V-W-X-CH2代表

基的式（Ⅰ）化合物（式中的R17、R18、R19如前所定义）可由适合地保护了的链烯基甘氨酸22用“〔2+2〕环加成”在热分解的条件下与取代异氰酸酯23进行合成制备，如方案7（图57）示例。

V-W-X代表

基的式（Ⅰ）化合物（式中Z为O、R20和R21如前所定义）可在脱水条件下用适合地保护了的谷氨酸形式（如24）与甲苯磺酰氯和吡啶反应生成腈25。此腈再与醇R OH进行部分溶剂分解，得到亚胺醚26，如方案8（图58）示例（参见例如：Hirotsu et al（1970）Biochim Biophys.Acta，222，540。亚氨胺基醚可进一步用亚氨氮进行烷基化或酰化来合成。另外，可在取代酰胺27的酰胺氧上进行酰基化或烷基化，得到的是亚氨基醚或亚氨基酯28。

腈25或简单亚胺醚26（R21＝甲基或乙基）也可作为Z为S或N的化合物的前体化合物。因而将25或26（R21＝甲基或乙基）与硫醇（R21SH）或胺（R21R14NH）（其中的R21和R14如前所定义）反应可望分别得到衍生物29和30（方案9，图59）。

可用类似的方法以合成R20和R21与

基连接在一起的式（Ⅰ）化合物，生成可进一步取代或非取代的5元或6元杂环。例如将25或26（R21＝甲基或乙基）与β-氨基醇、硫醇或胺（如NH2CH2CH2ZH，Z＝O、S、NH）反应，可望分别得到二羟慀唑、△2-噻唑啉和咪唑啉-衍生物（31，Z＝O、S、NH）（参见例如：“Comprehe-nsive Heterocyclic Chemistry”，Eds.A.R.Katritzky & C.W.Rees，Pergamon Press，1984，V.5，469;V.6，228-229，309）。这些衍生物还可用相应的噁唑、噻唑或咪唑衍生物（32，Z＝O、S、NH）进行氢化来制取，如方案9（图59）所述。这种方法可以扩展用于相应的六元杂环化合物与进一步取代的实例。

B.抗肿瘤设计策略

化学合成程序（program）应该与生物化学程序高度结合并能导之以计算机辅助的分子模拟。如以下所讨论的，生物学分析即结合参数（Bm、K′s）与谷氨酰胺运输抑制和肿瘤生长测定一起能够鉴定至少三类有治癌潜力的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物。

基本分子模拟研究可作为有潜力的合成靶分子的鉴定方法做出粗结构比较。因为能提供新合成化合物的进一步的试验数据，所以能够研究上述每一种化合物的定量的结构一活性关系。这种关系与观察到的有各种物理和化学性质的化合物的生物活性互相关联。例如最低能量构象、原子并列、临界偶极矩、静电电势等，这些都可在程序中从分子模拟和 /或分子轨道计算中得到。

这种方法已成功地鉴定了谷氨酰胺的γ-酰氨基的结构改变，它仍能让所得到的类似物由肿瘤细胞的谷氨酰胺运载体有效并有选择性地进行运输。这种类似物仍能受到一定程度的细胞毒性。

Ⅵ.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物的筛选方法

本发明的另一实施方案包括筛选抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物的方法以测定肿瘤细胞和淋巴细胞中有关谷氨酰胺运输的结合参数和运输抑制以及这种化合物对细胞生长的作用。从所得到的结果（将在下面进行讨论）可以鉴定潜在的有抗癌作用的化合物。应该意识到的是，同类型的筛选方法也可用于有关其他人类氨基酸运载体的其他化合物的筛选。

A.结合参数

下面的步骤用以测定抗谷氨酰胺化合物和类似物的结合参数。

1.溶液

所有溶液均以HBSS制备，以5%（W/V）碳酸氢钠将pH调至7.2。预培养试验溶液含谷氨酰胺化合物和类似物的浓度范围为0.25mM至20mM，预培养对照溶液含1mM谷氨酰胺。NEM培养液含相同浓度的类似物或对照谷氨酰胺以及1mM NEM。放射性溶液为含0.05mCi3H-NEM/ml的0.1mM NEM。

2.步骤

将含0.2mg蛋白质/ml的膜制剂在11600g（Eppendorf微型离心机）下离心2分钟，将碎片在室温下再悬浮于100μl的预培养试验液或对照溶液中，轻微搅拌10分钟。再于室温下在每一样品中加入100μl  NEM培养溶液，继续搅拌10分钟。然后将膜悬浮液于11600g下离心2分钟，碎片在1ml新鲜的HBSS中洗涤2次。将膜碎片于室温下以轻微搅拌再悬浮于100μl的H-NEM溶液中1小时。在标记期末，在11600g 下将膜悬浮液离心2分钟，接着在1ml冰冷却的0.9%（w/v）NaCl溶液中洗涤3次。用旋涡法将碎片溶于200μl OOS样品缓冲液中，每隔5分钟旋涡一分钟，为时15分钟，然后在-20℃下贮存。用Lowry分析法测定各样品的总蛋白质含量并以每样品30μl涂于12%聚丙烯酰胺凝胶分离的行上，再把膜蛋白用SDS-PAGE分离并用考马斯兰染色。将有用的染色蛋白（包括谷氨酰胺载运蛋白）从凝胶上切下，溶于30%H2O2和0.9mM CuSO4的∶1∶1溶液，在室温下过夜，并进行放射性记数，其结果以毫微摩尔H-NEM/毫克总蛋白表示结合于蛋白质带上的标记量。

3.结合参数的估计和推导

此步骤是对抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物根据以1mM  NEM在HBSS中将膜培养10分钟它们保护谷氨酰胺结合位点的能力的两个主要结合参数进行估价。首先在NEM存在下在谷氨酰胺或类似物的一个浓度（配位体）范围中，对膜进行培养，因为NEM与硫醇位点的反应是共价的并因此是不可逆的，NEM与谷氨酰胺位点的反应受配位体阻碍的程度是用先将膜洗涤后再将它们重新暴露于相同浓度的氚化NEM（NEM＊）中来测定的。在第一次培养中NEM＊占据了被配位体分子保护的位点。在第一次培养中对固定NEM浓度使用一系列的配位体浓度就可利用双重相交图（double  reciprocal  plot）（图24）以得到一个估计的相对解离常数（K's）和最大结合常数（Bm）。下面的反应方案10显示前者是一相对值，因为每一个配位体结合反应的进行是与NEM相竞争的;后者只要配位体的结合是可逆的就应给出最大结合时的绝对值。配位体的结合是可逆的，它们将通过速度常数Ks形成紧密的结合或共价键配合物（CS）

方案10

在第一次培养结束时出现的CS与载体总数（Co）的比是由下述方程提供的：

CS/Co＝S/{Ks（1+K2.〔NEM〕）+S（1+K3）｝

其中KS＝K-1/K1由此可引导出一个新常数：

K′s＝Ks（1+K2〔NEM〕）

〔NEM〕在培养中保持不变

这些基本术语中，Bm代表一个化合物与谷氨酰胺运载体结合点逆向结合的能力，Bm＝3.45（谷氨酰胺）是最高可能值并显示化合物能够结合然后再呈未结合状态。其低值（例如小于1.0）显示化合物与谷氨酰胺运载体是不可逆结合的。K's显示化合物与运载体的拟合程度。其低值（小于1.5）显示其拟合程度比较好，高值显示其拟合程度不太好。

B.运输抑制的测定

一个给定的抗谷氨酰胺化合物或谷氨酰胺类似物是否能抑制运输可由上述第二部分C2a的方法进行测定。抑制运输的实验要求在用于将谷氨酰胺与细胞质结合的所有谷氨酰胺试验溶液中有适合的谷氨酰胺类似物浓度。常规培养期由3分钟延长到10分钟。

C.生长抑制测定

抗谷氨酰胺化合物对在培养中HeLa细胞生长的作用的研究是在一段时间后培养物的总蛋白含量改变后进行的。在25cm2的塑料锥形瓶中接种HeLa细胞培养物使得到20%的会合。在开始建立期24小时后，将培养基更换成含1mM试验化合物的新鲜培养基。需每天将新鲜培养基加入培养物中，培养状况需用显微镜检验术和照相术小心监视。每24小时收集一次培养物（n＝3），收集3天，用下述的方法收获细胞：

1.将培养物在0.9%（W/V）NaCl溶液中洗涤3次，然后在室温向锥形瓶中加入5ml  0.9%（W/V）NaCl溶液，历时10分钟。

2.用橡胶沉淀帚将细胞从锥形瓶表面刮下帚入一玻璃试管。

3.将试管在200g下离心10分钟（Clements台架顶离心机），碎片用0.9%（W/V）NaCl溶液洗涤2次。

4.将细胞碎片在100℃于1ml  0.1M  NaOH溶液中消化过夜，用Lawry分析法测定各样品的总蛋白含量。

5.测定结果以相对于未受到类似物影响的对照样品的蛋白质量表示。

在使用两种抗谷氨酰胺化合物以进行生长抑制研究的实验中要求使用三个对照组：一为分别对照每一化合物的效果，另一对照正常生长。

D.淋巴细胞中的谷氨酰胺运输

淋巴细胞在有丝分裂发生时要求相当量的谷氨酰胺。单个淋巴细胞对谷氨酰胺摄取实际上是很低的，但大量的淋巴细胞的存在意味着在活性期中有相当量被摄取。因此，谷氨酰胺由于其在淋巴细胞生物学上的代谢作用而在免疫体系中起重要作用。所以抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物对淋巴细胞的潜在作用也应通过筛选进行检查。例如，对癌细胞和淋巴细胞均具毒性的化合物可能是不需要的。再者，那些增强有丝分裂发生的化合物在刺激免疫体系以对抗与免疫有关的疾病（如爱滋病和癌症）可被证明是有用的。另外，抑制有丝分裂发生但对淋巴细胞没有毒性的化合物（例如免疫抑制剂）可能也是有用的。

现将HeLa细胞和淋巴细胞对谷氨酰胺摄取的对比示于图30中。谷氨酰胺运入HeLa细胞在0.25mM-4mM的浓度范围内是二相的并在巯基试剂NEM（1mM）中培养20分钟后有50%被抑制。此结果指明巯基是位于谷氨酰胺运载体蛋白质的活性位点上的，这些基团的修饰导致谷氨酰胺运输的抑制。

1.材料和方法

按常规方法;淋巴细胞是取自牛颈静脉的新鲜全血，有些实验来自静脉针刺的新鲜人血。淋巴细胞是用包括Ficoll Paque的标准技术用密度梯度离心法从红血球中分离出来的。组织培养材料得自Flow实验室（美国）。U-14C-谷氨酰胺得自Amersham（澳大利亚）。

将新分离出的细胞再悬浮于RPMI 1640培养基中，其浓度为107细胞/毫升。将伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A）加入最终浓度为2.5μg/ml的悬浮液。在混合物中通过5%CO2和95%空气的混合气，于37℃下培养48小时。

测定谷氨酰胺的运输时，需将淋巴细胞再悬浮于含氚化水的PBS A中至最终浓度为5μCi/ml，历时30分钟。将50微升的样品分成四份，每一份加入0.5μl的预热至37℃并含20μl蔗糖溶液（10%W/V）的微离心管中，其上有一层50μl的硅油（Versilube 5-50，General Electric，N.Y.）。在一记录时间（O）于每一试管中再加入50μl14C-谷氨酰胺。谷氨酰胺浓度由0.1mM变至20mM时，每一溶液的放射性水平是保持恒定的。

曝露期末，将细胞离心通过硅油层终止运输，使用M.S.E.Microcent-aur离心机，11600g，离心时间60秒。在头15秒钟内绝大多数的淋巴细胞在蔗糖层中出现，3H是用作出现在蔗糖层中的细胞数的指示剂。

将各试管浸入液氮中冷冻，然后在计数前将底层蔗糖切入塑料小闪烁瓶中。为保证淋巴细胞芽的分散，需将含有闪烁剂的小瓶和切断的试管底部在轨道振摇器中振摇过夜。自结果计算14C/3H比率作为每一淋巴细 胞对谷氨酰胺摄取的测定。

2.用谷氨酰胺类似物研究抑制

这些实验需在上述的摄取测定之前将淋巴细胞悬浮液与一系列浓度的类似物在PBS  A中培养20分钟。

图31所示为用伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A）刺激后14C-谷氨酰胺被正常淋巴细胞摄取的时间过程。图32所示为在有和无伴刀豆球蛋白A的存在时谷氨酰胺摄入牛淋巴细胞的摄取速率，以nmol/mg蛋白/min表示。图32也显示了由于被动扩散的摄取。

3.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物对淋巴细胞代谢的作用

a.使用MTT测定的正常细胞株的化学敏感性试验

用四唑嗡盐（MTT）的还原进行化学敏感性试验作为评价的终点。这种独特的测定方法已经进行自动化，并在文献报告中进一步得到改进使甲 产物能更好地溶解以便进行吸收的测定。MTT测定是用微量滴定板和扫描板读数计测定各个穴中的吸收率来进行的，因而能容许多浓度的几种药物对几种细胞株的重复试验。过去的工作者已经发现MTT试验能得到与克隆基因的和染料排除的测定高度相关的应答曲线，因此，对于给定的细胞株，以MTT作细胞培养以后得到的溶解的甲 产物的光密度正好与每个穴中的活细胞数成正比。

b.方法

将细胞悬浮液用RPMT 1640和10%（V/V）FBS稀释至4×106细胞/ml。每穴加入100μl细胞悬浮液，然后再加入50μl Con A（最后浓度2.5μg/ml）和50μl类似物溶液。

将平板在37℃于5%CO2/95%空气中培养48小时。每穴加入20μl MTT。继续在37℃培养4小时。除去上清液，加入50μl DMSO以溶解结晶。读取560nm波长时的溶液吸收率。

细胞排除锥虫兰染料的能力，常常用作其生活力的指示剂。将淋巴细 胞悬浮液稀释至大约有100个细胞出现在Neubauer血细胞计数计的视野里。将排除染料的细胞和吸收染料的细胞的比用直接计数的方法进行几次评价。

C.抑制的谷氨酰胺类似物对体外淋巴细胞有丝分裂发生的刺激

已经发现，在谷氨酰胺类似物的低抑制浓度下，能够由于暴露于伴刀豆蛋白A而诱发的淋巴细胞有丝分裂发生的程度是有规律地被刺激的。一般说来，在浓度的数量级为1/10可观察到对有丝分裂发生显著抑制，通常细胞分裂率是以50%有规律的增加的。图33-38所示为用染料排除法测定的淋巴细胞的存活和用MTT分析测定的相对有丝分裂对于谷氨酰胺类似物浓度范围的关系。

我们把此看作为“毒物刺激作用”（即低浓度毒性对生长的刺激作用）的普通现象的特殊例子，这一现象按下面方法进行利用是可能的，即药物运送至肿瘤（对体内的其他细胞的某些“渗漏”是不可避免的）实际上是使身体天然免疫性处于被刺激而不是被抑制状态的浓度。因此，本发明所述的化合物、组合物、制剂和它们的剂量可设计为能促使免疫体系的毒物刺激作用而不是抑制作用，设计为促使肿瘤的生长抑制而不是毒物刺激作用。

d.用抑制的谷氨酰胺类似物抑制淋巴细胞有丝分裂发生

将MTT测试结果与在同样条件下的染料排除测定结果进行比较：当染料排除测定有生活力时，MTT测定原则是根据线粒体活性而定。

已经观察到，所有被试的类似物都显示出使用MTT的抑制浓度范围，其前有激发范围。抑制范围又在细胞死亡以前，因此许多类似物存在着一个浓度范围，在此范围内细胞首先受到激发产生分裂。在较高范围时，细胞被推入“休眠”期，在更高的浓度时，细胞被杀死。在癌症和其他疾病治疗中药物行为的所有这些范围都是需要计划探讨的。

E.筛选试验结果

1.结合参数

表5-8 总结了各种有关受试配位体结合参数的数据以及这些数据如何与谷氨酰胺运输和细胞生长有关。因此，在S是饱和的条件下所发现的C.NEM＊的量在实验末了时是与Ks成反比的，并且在Ks趋于0时，方程式简化成S/{S+Ks（1+K2NEM）}，而且所有载体转化成CS，最大程度地形成C.NEM＊。表8 的配位体分成四类（A-D）。A类由化合物1-3组成，并代表Bm值接近谷氨酰胺Bm值（＞2.5n mol/mg蛋白质）的那些配位体。因为它们在饱和条件下有保护谷氨酰胺位点的能力（由洗涤时NEM＊的最大结合指示出），所以A类配位体被认为是与运载体分子可逆结合的。这样的化合物在谷氨酰胺载体上运输的方法恰如谷氨酰胺本身，这已由使用14C-组氨酸的其他实验所证实。所有此类的化合物对HeLa细胞生长都是有效果的。

B类配位体的Bm值在1.0至2.5n  mol/mg蛋白之间。这些化合物或者是它们与运载体蛋白的结合方法使结合位点上的配位体的反应非常弱，因此它们在与NEM竞争时不能将位点饱和，或者这些化合物仅是中程度可逆，与NEM的竞争是中程度的，由此对第二次用NEM＊培养所提供的位点产生中程度的阻滞。可以见到，这些化合物中之一，即谷氨酸-γ-酰肼是到目前所试验的最强有力的谷氨酰胺运输抑制剂，并且对HeLa细胞生长相对而言只有很小的作用。

C类配位体由Bm值小于1.0n  mol/mg蛋白的化合物组成，它们明显地阻止谷氨酰胺的运输（大于20%）。方案10中所提出的机理指示，这组化合物应由不可逆结合剂组成。这类配位体中出现三个已知的共价键结合剂（β-氯丙氨酸、重氮丝氨酸和重氮氧代正亮氨酸）这一事实对上述机理和此分类系统提供了有确定性的证据。这三个化合物关键性地阻止了HeLa细胞的生长。其他牢固的结合剂有力地阻止了运输，但对生长的影响很小，特别是化合物C.2应是低毒并在另一毒性剂存在时可能是一极好的阻滞剂。

D类配位体是由在谷氨酰胺位点结合较弱的化合物或者主动结合在运载体上不是谷氨酰胺的位点上。当运输实验和生长实验完成后化合物D.9和12可移出D类。化合物D.14在进一步地研究。因为如果它是通过谷氨酰胺运载体运输的话，会以极小量进入细胞。这将导致此化合物可为高毒性化合物的结论。化合物A.3和D.14所显示的性质上的明显对比是应当注意的，其中将甲基加到谷氨酰胺异羟肟酸上，其结果是损失了抑制运输的能力，但保留了抑制生长的能力，虽然只有50%的谷氨酸异羟肟酸的作用。化合物D.10（N-乙酰基谷氨酰胺）能激活谷氨酰胺的运输，因这一发现曾假设此化合物不是结合在谷氨酰胺位点上的而是在极其邻近的可作为正效应的地方。

2.生长抑制作用测定

抗谷氨酰胺化合物对培养中的HeLa细胞生长作用的结果示于表4，以受化合物48小时作用后相对于未受该化合物作用的对照培养物产生的抑制量表示。所确定的抗肿瘤化合物即氮丝氨酸、氨甲喋呤、重氮氧代正亮氨酸（DON）和β-氯丙氨酸都有明显的抑制细胞生长的作用。在被试的新化合物中，只有两个对生长有明显的效果，即谷氨酸-γ-单异羟肟酸和谷氨酸-γ-甲基单异羟肟酸。抗谷氨酰胺化合物与氨甲喋呤结合使用时不能产生任何可感觉得到的协同效应。

3.运输抑制作用测定

a.抗血清对在HeLa细胞中谷氨酰胺运输的作用

谷氨酰胺运输蛋白抗血清的作用曾用兔和小鼠试验示于图6。在1%抗血清存在下，用1mM的谷氨酰胺时，谷氨酰胺摄入HeLa细胞的摄取率抑制了25%。

b.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物对在HeLa细胞内谷氨酰胺运输的作用

用大鼠进行的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物对谷氨酰胺摄入 HeLa细胞的摄取率的作用示于表5中，用1mM的谷氨酰胺时发现许多化合物都能抑制谷氨酰胺摄取率，这些化合物包括谷氨酸-（2-羟乙基）酰胺、谷氨酸衍生物（参见表2）、谷氨酸-γ-二乙基酰胺、环化谷氨酸-γ-三（羟甲基）甲酰胺、谷氨酸-γ-双（羟乙基）酰胺和谷氨酸-γ-对硝基苯胺。

表8  中的化合物代表了广泛的化学功能性，在此观察中所使用的测定都是在初筛选的基础上进行的，这将为最终的化学策略指明道路。因此，在大多数情况下，例如运输的抑制是用浓度为1mM的谷氨酰胺和类似物进行的，因为该浓度代表人体内所希望的谷氨酰胺最佳浓度。所以其结果提供了生理反应的初始指示。在有足够信息以发展基于化学功能性的研究策略之后便可进行更详细的剂量应答实验。

将化合物分成A-D四类与工作假说有关，此工作假说是为叙述与NEM和NEM＊对照的配位体的可逆和不可逆结合的机理而提出的，如方案10所示。此分类基于两个主要可测定的变量-3H-NEM最大结合试验和运输抑制。A类化合物是3H-NEM结合水平接近于谷氨酰胺结合水平的化合物。它们被认为是可逆性程度接近谷氨酰胺的在谷氨酰胺位点上的反应。B类化合物是3H-NEM结合为中水平的化合物，因此被认为有中等的可逆性。C类化合物是呈现非常低的3H-NEM结合水平的化合物，但也能明显地抑制运输（＞20%）。这类化合物被认为在谷氨酰胺运载体位点上有不可逆结合的能力。D类化合物是也具有低水平3H-NEM结合的能力的化合物，但也能最低限度地抑制运输（＜20%）。这类化合物被认为是对运载体位点具有最小的结合能力。

对运输和生长产生最大效果的化合物是已知的三种化合物：α-氯丙氨酸、重氮丝氨酸和DON（化合物C.1、3和5）。这三种化合物都具有很低的Bm值，这是由于它们在活性位点上都是共价键反应的这一事实，因而是活性位点的不可逆竞争者。这就确证了它们在分类上归于C类化 合物。因为这些化合物在运载体上的活性位点是以共价键结合的，所以它们在24小时内使细胞死亡的能力是多少成问题的。但也须看到，在这些条件下共价结合的出现相对说来是低的，以致配位体的运输将通过结合反应的初始阶段进行，直至所有的位点都被共价结合的配位体固定下来，在这点上进一步的运输（除了非饱和运输）应当停止。

Huber等人（Int.J.Cancer，41，752-755）支持这种假说，他们显示了小鼠p388白血病细胞中14C-DON的摄取接近最大值，约3分钟。因为DON似乎在这些细胞里未能代谢，这一最终状态必须是代表内流和外流之间的反应物稳定状态，或者代表进一步内流和外流停止的这一点，并且DON的最终浓度代表已被陷入细胞中的分子作为运输位点被配位体共价结合而饱和的结果。如果前者是事实，那么外流实验应在接近最终细胞浓度下显示接近于0的14C-DON潴留。事实上，在头4分钟内DON有约50%的下降，在10分钟末时仍有40%的DON存在于细胞中，这指出了DON的外流基本上已经停止。因此可以做出这样的结论：仍然存在的DON已被内部结合，或者说明运输位点以结合的配位体饱和使DON被陷入细胞内。后者似乎是最有可能的解释，因为在同一论文中已经证明了从细胞中释放出的内部DON已在薄层色谱上分离出来。

再者，β-氯丙氨酸、重氮丝氨酸和DON的Ks'（与NEM竞争的解离常数）都比谷氨酰胺的K's（＝1.33）值大三倍以上，说明了在谷氨酰胺结合点上这些化合物的适合性是很差的，也说明肿瘤谷氨酰胺结合位点的专一性可能有相当的改进。Ks'值最低是β-氯丙氨酸（4.34mM），最高的是DON（7.1mM），与所发现的后者产生最低的谷氨酰胺抑制是相一致的，这些DON的结果再次得到Huber等人的工作所支持，Huber等人显示了小鼠p388白血病细胞中14C-DON的摄取由于“L”运输体系使其至少部分处于中间程度，因此证实了谷氨酰胺运输位点缺乏专一性。以DON（正亮氨酸衍生物）的结构观点出发，DON的主要运载体是亮氨酸优选 体系，这个可能性并不使人奇怪。已经发现，HeLa细胞中依赖于Na+的谷氨酸运输不被亮氨酸所抑制，因此不被“L”型运载体传递的。

具有最低Ks'值同时非常紧密结合（低Bm）的化合物是化合物C.2（谷氨酸-γ-对硝基苯胺）。此化合物的结构使其成为紧密结合的自动候补者，再一次在C类中找到它的位置。此化合物产生显著的对谷氨酰胺运输的抑制性，但对生长的作用却很小，产生仅以小量运输的可能性。因此，这样的化合物可望具有相对低的毒性，但同时会明显减低谷氨酰胺的细胞内浓度（谷氨酰胺的缺点，常常使HeLa细胞中的谷氨酰胺浓度剧烈下降），由此降低了对高毒性化合物（如异噁唑乙酸和其他C类活性化合物）的细胞抗性。化合物A.2（酰肼衍生物）产生最有效的谷氨酰胺运输抑制作用，但对生长只有很小的作用。因为此化合物有很高的Bm值，必须假定有大量的化合物运输进入细胞并具有最小的毒性作用。后一发现与早期酰肼对癌细胞作用的动物实验观察报告是一致的。另一方面，化合物A.3（异羟肟酸）对细胞生长有主要作用，但对运输的作用较小。化合物B.2和C.6证明了在Ks'和运输抑制间存在很好的反比关系。将谷氨酰胺的γ-酰氨基上的取代物数目加倍，得到了加倍的Ks'值和减半的运输抑制作用。对化合物D.14进行进一步的研究，该化合物的运输显然是最小的，但竞产生22%的生长抑制作用。如果确证了这些结果，此化合物将会是所有被试化合物中最强的生长抑制剂。

以上讨论导致下述有关各被试化合物活性的结论：

1.在谷氨酰胺活性位点显现共价结合并且是强的运输和生长抑制剂的已知抗肿瘤化合物（化合物C.1、3和5）显示了具有相对低的Ks'值，并因此在运载体位点上无最适合的可能。这一结论得到Huber等人工作的有力支持，他们证明了DON的运输部分是由“L”运输体系传递的。因此，有可能至少有一个这样的化合物（特别是DON）可被进一步修饰以在固体肿瘤细胞中为谷氨酰胺载体位点提供有明显较大亲合力（低Ks' 值的结构。

2.化合物A.3（谷氨酰胺-γ-异羟肟酸）在谷氨酰胺位点上是可逆结合的并证明是谷氨酰胺运输和生长的优良抑制剂。因此，此化合物与其相关化合物D.14（甲基异羟肟酸）的性质须作进一步研究，它们似乎没有任何对谷氨酰胺位点的结合活性，但仍然对生长产生明显作用。

3.化合物B.1（酰肼衍生物）对所有研究的化合物的谷氨酰胺运输具有最好的效果，但对生长的作用最小。需要进一步研究此化合物对其他较毒的化合物有可能的增强效果，因为在此化合物存在下肿瘤细胞会缺乏谷氨酰胺，肿瘤生长的要求会缓和地被平衡。

4.化合物C.1（硝基苯胺）是一紧密结合剂并在μM级水平是有活性的，是有力的谷氨酰胺运输抑制剂，因为此化合物是一紧密结合剂，所以在其Ks值以下的水平将是有活性的，因此应该是有可忽视的毒性。此化合物在毒性更大的试剂存在下对肿瘤生长的作用也应进行研究。

5.除化合物D.14以外，其余的D.7至D.18化合物具有很小的抑制活性或不具有抑制活性。脲基丙氨酸和异噁唑乙酸是属于这一组的，虽然它们需进行进一步的实验。此组的例外化合物是化合物D.10（N-乙酰基谷氨酰胺）。此化合物激活了运载体Ⅲ的活性，并且因为它是正常代谢产物，所以它是完全无毒的。建议将此化合物用来激活运输体系以进一步增加抽运适合的类似物进入肿瘤细胞的抽运率。

需要知道的是，谷氨酰胺类似物所必须具有的以使其被谷氨酰胺运输体系以最大效率带入癌细胞的最佳性质是用本发明所给出的筛选试验和结果能够做出评价的。

基于上述讨论的结果，能够研究一个适合于治疗癌症的抗谷氨酰胺化合物或谷氨酰胺类似物的结构模型。因此由这些结果可以预言由癌细胞膜的谷氨酰胺运输体系运入癌细胞的化合物，代替要求进入肿瘤细胞的胞外谷氨酰胺。一旦抗谷氨酰胺化合物或谷氨酰胺类似物在癌细胞 内存在，必抑制大多数谷氨酰胺所要求的酶，特别是涉及DNA合成中的酶，这样便使细胞死亡。使这样的化合物特别具有毒性是不必要的，因为可以设计大量的能被载入癌细胞（此运输体系是要求活化能的体系）谷氨酰胺类似物，如果类似物不被代谢，它们将会变成对细胞有高毒性的产物。

上面提出的证据也为下述的未来发展提供了基础：即具有主要性质能特别瞄准肿瘤细胞并由此直接或间接产生DNA和RNA的临界抑制的新谷氨酰胺的未来发展。这种类似物提供了使它们对肿瘤细胞的专一性能使其对正常细胞的细胞毒性明显地降低的希望，而这种正常细胞通常是伴随癌症的化学治疗存在的。

需要注意的是，本发明的应用不只是限于单个的类似物，也可以两个或多个类似物协同使用。

4.使用线粒体的抑制和代谢研究

在探索在细胞中抑制谷氨酰胺运输的抗谷氨酰胺化合物时也可检查这种化合物是否抑制谷氨酰胺输入线粒体。也可以进行使用线粒体的新陈代谢研究。过去，肿瘤线粒体的研究主要限于艾氏腹水癌细胞（Ehrlich  Ascites  Cell）和肝癌，因为相对说来是比较容易的，可得到用于实验目的的适合的材料。另一方面，从培养组织制备线粒体在取得足够材料方面是有相当困难的。线粒体呼吸作用和代谢作用研究的主要限制是大量细胞的可用性。但下面述及的大规模微载体技术可从培养物中分离出足够量的线粒体，因而使实验可以进行。

得自Flow实验室的HeLa细胞是会合状态的。将这些细胞在含FBS（10%V/V）的NEM中生长。细胞以1∶2的分裂比传代并置于含FBS（10%V/V）的培养基199中。这些细胞需以数天适应新的培养基。此后，与谷氨酰胺摄取率测定比较，其行为类似于长期在培养基199中培养的细胞。

由于Cytodex  1或3微载体珠的粘附性，所用的玻璃器皿在使用前 都应该硅氧烷化。可将Surfasil在甲苯中的10%（V/V）溶液随意涂于玻璃表面，液体滴干后，将玻璃器皿过夜晾干。干后将玻璃器皿在蒸馏水中冲洗10次，然后置烘炉中干燥，即可备用。如果过多的微载体珠附着在容器表面，容器需再进行硅氧烷化。

Cytodex  1或3微载体珠（2g微珠/100ml  PBS  A）在硅氧烷化的瓶中水合过夜。次日，弃掉旧PBS  A，加入100ml新鲜PBS  A。微珠在使用前需进行消毒（121℃，1.2atm，20分钟）。

让微珠进行沉淀，倾掉上清液，再悬浮于培养基119中（50ml/克微珠）。数分钟后，微珠沉降并弃掉上清液，再将步骤重复一次，最后将微珠再悬浮于培养基199中（25ml/克微珠）。

在含微珠的烧瓶中加入由4-5个会合的200ml培养烧瓶收集的细胞，再加入10%（V/V）FBS以中和ATV的作用并促进细胞附在微珠上（Grinell，1976）。将微珠和细胞移入250ml的微载体容器（Techne）。如有大量培养物，则使用1.5升的微载体容器，其中6g微珠中加入16-20个200ml培养烧瓶中得到的细胞。

将培养物置于微载体搅拌器（Techne）上进行间歇式搅拌（每分钟40转，工作时间2分钟，间歇时间30分钟）24小时使有最大的附着，以后以每分钟40转的速度连续搅拌微珠。次日，在培养物中再加入100ml含FBS（10%V/V）的培养基199。每两天弃掉一半培养基，以新鲜培养基补充，以保证达到最大生长率。

由于细胞的生长率很高，所以需要不断地监测培养基的pH。保持培养基的pH是将NaHCO加入小的培养烧瓶中。NaHCO不能长时期维持大培养烧瓶中的pH水平。此问题以使用Hepes（20mM）作为缓冲试剂得到解决。每日取出一小部分培养物以便测定微珠上的细胞生长率。测定方法是将微珠置于2片分裂的盖玻片之间的载玻片上（载波片是置于微珠上的盖玻片的支承体）使细胞易于观察。

微载体培养中生长的细胞是用于全细胞呼吸研究和制备线粒体的。所用的收获技术的详细情况如下所述。定期检查细胞培养物和培养基中存在的生物污染物。取出感染的培养物用高压釜破坏污染源。用于研究呼吸和谷氨酰胺（谷氨酸酯）氧化的HeLa细胞线粒体是如下得到的。

会合HeLa细胞载体培养物是用作制取线粒体的材料源的。会合培养物的收获和线粒体的分离如下：让微珠沉降，倾出培养基，然后以PBS  A（pH7.6;100ml/克微珠）再洗涤2次，此后，将微珠再悬浮于含EDTA（pH7.6，0.02%W/V）的PBS  A（于50ml/克微珠）中，搅拌5-10分钟（每分钟30转）。搅拌完毕后，让微珠沉降，倾出培养基。

将微珠再悬浮于含EDTA/ATV混合物（50∶50）的PBS  A中（50ml/克微珠）并转移至一硅氧烷化的250ml锥形烧瓶中，不时摇晃烧瓶，然后置于37℃的培养箱中以保证最大的细胞脱附。取样品在显微镜下监察细胞脱附率。让微珠沉降，取出上清液和悬浮细胞在Damon  IEC离心机上于180g下离心5分钟将细胞分离出来，再将细胞最后悬浮于小体积的H-培养基+EDTA中。

将上面的处理方法重复3次以得到最大的产量。合并各部分细胞，除毛地黄皂苷处理步骤省略外，按文献所述方法分离线粒体。将分离出的线粒体再悬浮于500ml  H-培养基，使用前贮存于冰上。线粒体在冰上的保存时间最长为12小时，12小时后弃掉。

Ⅶ.诊断应用

到现在，对于本领域的技术人员已显而易见，许多种生物制品如单克隆抗体、多克隆抗体以及运载体蛋白质可以用于检验癌症。还可了解到，已有许多种方法来诊断循环系统（血液，血浆）或细胞中，或任何身体分泌物如尿液、泪水、奶汁、粪便、脊髓液等等之中谷氨酰胺或谷氨酰胺运载体的存在。这些方法的基础首先是应用对谷氨酰胺运载体的单克隆或多克隆抗体，然后是应用谷氨酰胺运载体或它们的部分作为体 系中的抗原。按此方式，可以建立许多基于现有免疫学技术的不同诊断体系。例如，抗原（谷氨酰胺运载体）可以粘附到一个板，抗体将在这里结合上去。在血清或其他分泌液中存在该运载体（或者它的抗体）将抑制这种结合，于是可以测定出来;测定方法可以有ELISA测定，放射免疫测定，免疫放射测定或化学发光或其他许多方法。还常常将这种简单抗体反应改变，包括使用二种抗体-一种作为“捕获者”，另一种作为“捕获-标记”测定的读出体系，从而捕获循环系统的或分泌的谷氨酰胺酰胺运载体。此外，应用荧光、免疫过氧化物酶或放射性方法直接测定组织中的运载体。这些方法中常使用塑料检测板、粘附到珠上、化学发光等等。属于谷氨酰胺运载体的抗原可以整体或部分应用，并包括合成该受体的肽片段或该运载体的按基因工程设计的部分。此外，如前所述，可以制备多种对于此运载体的抗体。

有可能将本发明包括的诊断产品联合使用，例如用于三夹层或竞争测定。可以了解到，本发明的诊断产品可应用于很广泛种类的测定，并且不限于在任何具体测定或模式中使用。测定类型举例包括以下任一种：结合测定，三夹层测定，酶免疫测定，荧光免疫测定，放射免疫测定，竞争测定，免疫放射测定，免疫荧光测定，或发光免疫测定。

诊断用产物可以用常规标记物加以标记，如酶，放射性同位素，一种粒子，荧光分子，游离基，化学发光分子，生物发光分子，噬菌体或金属。其他一些标记物对本领域技术人员也是显而易见的。

还可了解到，若将一种氨基酸运载体例如肿瘤谷氨酰胺运载体用作为诊断产物，该运载体可以是其天然形式或解离的形式，或是整体运载体蛋白质，或者是它们的片段或亚单位。

还容易了解到，诊断产物例如单克隆抗体、谷氨酰胺或其类似物可以与放射性同位素结合并于活体内应用。然后该诊断产物可以注射到患者体内，它将选择性地结合到或输送到肿瘤中。在适当时间后，对患 者进行辐射造影扫描，确定所存在的任何肿瘤的位置。

本发明的诊断产物还可用于对生物组织进行检验，例如活组织检查。例如，可将组织标本与带标记物的单克隆抗体接触，使之发生结合。若带标记的抗体保持结合于该组织的标本，则在该标本中存在有肿瘤细胞。

在一段时间内重复进行该检验方法，并定量测定所探查到的标记物，于是就提供了监测患者体内癌症进展的方法。

本发明的诊断产物还可用作为生物传感器，特别是作为免疫学生物传感器，用于探查免疫结合的成对单元的存在。生物传感器是利用生物分子或组织的装置，利用它们的天然形式，修饰的形式或它们的功能性片段作为传感设备的部件。这些分子可以以不同方式与信号变换装置相附接，例如加入到脂膜中，包覆在金属颗粒、光导纤维、压电晶体之上，或利用其他方法和手段。这样，就有可能灵敏地测量不同物质的存在，例如可用电位测量、纤维光学、表面等离子体共振以及压电测量。

HeLa细胞、HeLa细胞膜、谷氨酰胺运载体或它们的片段或是对谷氨酰胺运载体的抗体（或它们的片段），可用于与生物传感器中的信号变换装置相附接。在使用HeLa细胞或HeLa细胞膜（例如空泡）的情况下，可以探查和监测离子、氨基酸（例如谷氨酰胺）、生长因子的存在。在使用谷氨酰胺运载体、其片段或其修饰形式作为该生物传感器的部件时，可以探查或监测谷氨酰胺的存在。能识别谷氨酰胺运载体的抗体或其片段可用于探查细胞或各种生物液体标本中该运载体或其片段的存在。这些生物物质可以单独使用或联合使用。

Ⅷ.治疗应用

本发明提供用于治疗癌症患者的数种治疗组合物及方法。这些组合物及方法一般可分为两类：输送抑制剂和/或细胞毒性剂。

A.输送抑制剂

输送抑制剂的主要功能是除去肿瘤细胞正常生物合成所需的谷氨 酰胺。人们相信若能将这些细胞中的谷氨酰胺基本去除，它们将会衰弱，最终会死亡，和/或变成更易感受细胞毒性剂或生物体自身免疫防御能力。例如，相信谷氨酰胺对谷氨酰胺合成酶有作用，即抑制谷氨酰胺进入细胞可影响谷氨酰胺合成酶以及其他细胞酶例如谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转移酶。于是就潜在着引起多种不同的问题的可能，其中有些可能与癌生长没有关系。

此外，除下述的化合物之外，还有些化合物也显示能抑制谷氨酰胺输送，它们也可按本发明来使用。也就是说，本发明的另一实施方案包括使用能抑制谷氨酰胺输送的化合物，以便实质上以选择性方式来治疗肿瘤。因此，例如乌本苷和汞撒利等化合物也可应用，但对所有这些化合物还需要进行广泛的基本研究。

1.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物

有一类能抑制谷氨酰胺摄取的化合物就是前述的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物。特别受注意的是那些具有很高输送抑制能力的化合物及类似物，即至少约20%抑制率，较好是至少约40%，最好是至少约60%抑制率。还要求这些化合物具有低的K's值，亦即低于约1.5mM，最好低于约1.0mM。由这些数值表示该类似物对于谷氨酰胺运载体是具较高专一性的结合剂。若该类似物的Bm值大于约1.0毫微摩尔/毫克蛋白质，则该类似物将可能被输送到该细胞中。否则，该类似物将可能只结合到该运载体的结合位点，从而抑制了其他分子输送到该细胞中。借助于去除该细胞的谷氨酰胺，使该细胞衰弱，因此易于感受其他细胞毒性剂和/或身体自身免疫防御能力的作用。

2.抗体

能够与运载体的活性输送位点结合的单克隆或多克隆抗体同样也可能抑制谷氨酰胺向该细胞内的输送。可以联合使用单克隆和多克隆抗体或由它们衍生的产物，同样也可将抗体和也是输送抑制剂的谷氨酰胺类 似物（或其他氨基酸类似物）联合使用。

应用最近研究成的重组DNA方法，可以制造按本发明的修饰的抗体。这些抗体的修饰例如可以从一种抗体取一个或多个结合位点并将它/它们放在另一抗体上。另外，抗体的修饰可以是加入新的位点使之与其他化合物结合，或者是加入蛋白质毒素使之成为整个抗体分子的一部分。对于本领域技术人员而言，许多这种改变都是显而易见的，并且这些改变也包括在本发明范围内。

3.组氨酸及其他氨基酸

业已表明组氨酸是对谷氨酰胺摄入到HeLa细胞的具高度竞争力的抑制剂，使在1mM的谷氨酰胺摄取速率达到50%抑制。在细胞生长培养基中存在高浓度组氨酸可以大大抑制谷氨酰胺从培养基到该细胞的细胞质中的输送作用。在正常生理条件下组氨酸含量很低，所以不影响谷氨酰胺被HeLa细胞的摄入。然而，若在培养基中存在高浓度的组氨酸，谷氨酰胺进入HeLa细胞的作用可被阻止，于是造成细胞内谷氨酰胺枯竭的状态。

对谷氨酰胺被肿瘤细胞摄入的抑制可导致谷氨酰胺成为枯竭状态，结果有可能使细胞衰弱。组氨酸是HeLa细胞摄取谷氨酰胺的高竞争性抑制剂，因此预料若存在有足够高浓度，它们显著地干扰谷氨酰胺进入这些细胞。在这项研究中，将组氨酸加入到培养HeLa细胞株的培养基中，然后在一定期间内监测这些细胞的生长。示于图60中的结果显示，当存在1mM组氨酸时，与未接触高浓度组氨酸的对照组相比，在前48小时内HeLa细胞的生长是相对停顿的。但是，过了48小时之后，显示这些细胞已恢复到与对照组差不多的生长速率。这些细胞能在48小时之后恢复原状的原因尚未清楚，可能是由于这些细胞代谢的转移，以补偿谷氨酰胺枯竭的状态。然而，这项研究提供了这样的证据，就是阻止谷氨酰胺进入肿瘤细胞足以引起对肿瘤的某种程度损伤，使那些细胞处于相对 衰弱的状态。还有，然后可以利用这种衰弱状态再给以已知的或新的抗癌药物，从而对肿瘤细胞的细胞毒性作用起到附加或协同的作用。还有这样的可能，就是在有阻止剂存在下，对那些已知或新抗癌药物的需用量可以显著降低，从而在治疗时减轻对正常细胞的不希望的细胞毒性作用。

如表15  所示，其他的氨基酸也可以抑制谷氨酰胺被HeLa细胞中的摄入作用，因此也有可能具有作为抑制剂的治疗价值。可以提供任何机制，即TGTⅠ-Ⅲ，扩散等等来抑制摄入，从而发挥抑制作用。

B.细胞毒性剂

本发明还提供数种细胞毒性剂。

1.抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物

具有良好生长抑制作用的谷氨酰胺类似物可能是优良的细胞毒性剂，当这种类似物具有较低K's时，尤其是这样，从而表明它很可能选择性地结合到肿瘤细胞，而不是结合到正常健康细胞。还希望该等有细胞毒性的谷氨酰胺类似物具有高的Bm值，于是表明这样的趋势，亦即使显著量的类似物进入该细胞中。低的Bm值表示该类似物可能是简单地结合到细胞膜外面的输送蛋白质，而不是输送到细胞之内。将谷氨酰胺或其类似物修饰并使它们具有毒性，也是本发明的实施方案之一。其方法例如可以将已知的或新的毒性分子、原子或基团加入到谷氨酰胺或其类似物的结构中。

2.连接到细胞毒性剂的抗体

本发明的另一方案是提供对肿瘤谷氨酰胺运载体的单克隆或多克隆抗体，可将这些抗体结合到新的或已知的细胞毒性剂。关于已知的毒性剂例如可以是本来是选择性不够的化学治疗剂（它们在用其他方法时是没有足够的选择性的），或放射性同位素。这些抗体还可以结合到本发明的新颖抗谷氨酰胺化合物或类似物。当化学治疗剂与本发明的抗体连 接时，最好将该化学治疗剂改性处理，使得若是该单克隆和化学治疗剂之间的键断开时，该化学治疗剂不会进入任何非靶细胞中。这样，化学治疗剂只有在保持结合状态才有效用，因此它能保持选择性。其他应用“药物前体”的类似方法对于本领域的技术人员是显而易见的，故而也包括在本发明范围内。

3.连接至谷氨酰胺或其类似物的药剂

将已知或新的细胞毒性剂连接至谷氨酰胺、抗谷氨酰胺化合物或谷氨酰胺类似物之后，就存在着由谷氨酰胺或其他化合物选择性地将这些药剂输送到肿瘤细胞的细胞质中的可能性，从而将细胞杀死或使之衰弱。这些药剂包括放射性同位素、药物或毒素。为能得到成功，其连接和药剂的设计必须使它们不破坏谷氨酰胺或其他化合物可逆地结合并被输送的能力。这样，谷氨酰胺或其类似物将毒性药剂带到癌细胞中。

C.其他化合物

已经了解到，肿瘤细胞的一项关键性功能是谷氨酰胺结合到谷氨酰胺运载体，将该谷氨酰胺输送通过细胞，然后是在细胞内的谷氨酰胺代谢作用。已经描述了数种抑制此过程的化合物、组合物及方法，例如使用谷氨酰胺类似物、抗体、组氨酸以及细胞毒性剂。但是，本领域的技术人员在读了本说明书之后，将立即认识到其他一些物质包括酶能以某种方式抑制谷氨酰胺运载体向细胞中输送谷氨酰胺或其类似物的功能。因此，这些物质是在本发明范围之内。在本发明范围内还包括其后谷氨酰胺在细胞内代谢的抑制剂。已经明了到，已描述的类似物中有许多种可能具有此种功能，亦即不单是阻止谷氨酰胺与运载体的结合，还抑制谷氨酰胺在细胞内代谢的途径。

另外非常可能的是，氨基酸也可能由谷氨酰胺运载体所输送，并且它们的类似物还可能是比谷氨酰胺类似物功能更强的抑制剂。例如，上述的组氨酸能抑制对谷氨酰胺的摄取作用。因此，通过谷氨酰胺运载 体例如TGT Ⅰ-Ⅲ而进入的治疗用产物如氨基酸、它们的类似物或其他化合物也是在本发明范围内。

D.联合治疗

本发明的治疗应用是采取联合治疗方式，特别是在使用一个类型的化合物来抑制谷氨酰胺的输送时，从而使该细胞衰弱，治疗的其余部分包括给以包括前述者在内的已知的或新的细胞毒性剂药物，利用该等肿瘤细胞衰弱的机会发挥药物作用。

E.药物组合物和治疗方法

本发明的另一实施方案是关于药物组合物，其中包括上述的抗谷氨酰胺化合物，以及对生理作用合格的辅助剂或载体。这些组合物可按本领域技术人员公知的方法来配制。因此，按本发明的具生理活性的抗谷氨酰胺化合物可以原样使用，或优选方式是与适当的药物辅助剂组合使用，并制成片剂、糖衣锭、胶囊、栓剂、乳剂、悬浮液或溶液等剂型。

本领域的技术人员对于适用于所要的药物配制剂的辅助剂也是熟悉的。除可用溶剂、胶凝剂、栓剂基料、制片辅助剂和其他用于活性成分的赋形剂之外，还可使用抗氧剂、分散剂、乳化剂、消泡沫剂、矫味剂、防腐剂、加溶剂、着色料等等。在每一具体情况下，该等活性抗谷氨酰胺化合物、类似物或组合物所需的最适给药剂量和方法，可由本领域技术人员通过例常实验来确定。

按本发明的药物配制剂形式的抗谷氨酰胺化合物、类似物或组合物还可以含有一种或多种其他类药物的具生理活性的具体品种，例如甾类和/或非甾类抗炎剂、免疫抑制剂、硫酸化葡糖胺/多糖和其他硫酸化碳水化物、痛觉缺失剂和退热剂。

本发明的抗谷氨酰胺化合物、类似物或组合物可以口服、直肠或注射方式给药，例如在治疗皮肤癌时采取经皮给药;采取的药物制剂形式，包括至少一种活性化合物并且含有适用于药物的载体，它们可以是固体 或半固体物、或液体稀释液、或胶囊或气溶胶施药器。其中活性组分可以占固体/半固体/液体制剂的0.1-99%（重量），更具体讲，对注射剂可含0.5-20%（重量），适于口服的制剂含2-50%（重量）。

关于口服用含至少一种按本发明化合物或组合物的药物制剂，其按剂量给药单位的制备方法可以是将选定的化合物或组合物与一种固体粉末状载体混合，所用载体例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉类如马铃薯淀粉、玉米淀粉或支链淀粉、纤维素衍生物或明胶，还混入一种润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、蜡状聚乙二醇，然后压制成片剂。还可将按上述制成的片剂用浓的糖溶液制成糖衣片剂，糖溶液中可含有阿拉伯胶、明胶、滑石粉、二氧化钛等组分，或者将片剂用一种溶于易挥发有机溶剂或混合溶剂中的硝化纤维素来做包衣。

将选定的化合物或组合物与一种植物油混合并封装入软明胶囊壳中，即制成软明胶胶囊。硬明胶胶囊可以含有选定的化合物或组合物与固体粉末状载体所成混合物，所述载体例如有乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉类如马铃薯淀粉或玉米淀粉，或支链淀粉、纤维素衍生物或明胶。

直肠给药的给药单位的制剂可以制备成包括该活性物质与植物油或石蜡油制成混合物的栓剂剂型。

用于口服的液体制剂可以是糖浆或悬浮液形式，例如含约0.2-20%（重量）该选定化合物或组合物的溶液，其余部分是糖和乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物。

注射用的非肠道给药溶液可以制成选定化合物或组合物的溶液，其优选浓度范围约0.5-10%（重量）。这些溶液中还可以含有稳定剂和/或缓冲剂，可制成各种剂量的安瓿，便于使用。

按本发明的选定化合物或组合物，采用经皮给药方式的适宜每日剂量可以是100-500毫克，优选为200-300毫克，按星期剂量可以是每1-3星期25-2000毫克。

本发明的抗谷氨酰胺化合物和类似物预期可用于治疗癌症。因此本发明还涉及患癌症动物的治疗方法。该方法包括向动物给以具治疗活性的和生理可接受量的一种或多种上述治疗用化合物或组合物或上述治疗用化合物和组合物的混合物。

F.免疫抑制剂和免疫刺激剂

业已表明，谷氨酰胺会被受激发的淋巴细胞所摄取。因此，本发明的抗谷氨酰胺化合物和类似物还可用作为免疫抑制剂和免疫刺激剂。这些免疫抑制剂和免疫刺激剂将可用于治疗对移植的排斥、移植物对宿主疾病、自动免疫疾病、免疫疾病如艾滋病等。本领域的技术人员将能容易地明了到许多种用途。

因为淋巴细胞能输送谷氨酰胺，因此本发明的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物被输送到淋巴细胞中就会按所希望的效果而切除增殖中的淋巴细胞，或是刺激淋巴细胞。需要按前述对抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物进行简单筛分，以确定它们对淋巴细胞的效应。有可能按前述来离析和鉴别淋巴细胞谷氨酰胺运载体，例如TGTⅡ。治疗人类的药物配制剂和方法将与上述的相同或相似。

Ⅸ疫苗

本发明的另一实施方案是提供用于对癌症免疫的疫苗。该疫苗组成中最好含有全体处于天然形式的输送蛋白质，或至少它们的亚单位能具有输送谷氨酰胺的活性。可以将数种不同的运载体、或其片段或亚单位协同给药，以便在宿主体内产生对数种不同运载体的免疫应答。例如，所给的疫苗可以是对活性输送有作用的含TGTⅠ、TGTⅡ和TGTⅢ的疫苗，或它们的片段或亚单位。然后由宿主产生对这些运载体的免疫应答。在这些运载体初出现时，宿主将提供会与该等运载体结合的抗体，从而抑制向处于早期阶段的肿瘤细胞输送谷氨酰胺。于是这些肿瘤细胞变成易被宿主的免疫防御能力所摧毁。

X实施例

下面的实例1～79说明了本发明的抗谷氨酰胺化合物和谷氨酰胺类似物的制备方法，但是没有任何限制的含意。实例1～79所用的一般实验方法、设备、溶剂和试剂如下：

乙醚和四氢呋喃是用钠蒸馏处理，再在少量二苯酮存在下，第二次用钠蒸馏处理。吡啶用氢氧化钠粒干燥，在使用之前蒸馏。三乙胺也是用氢氧化钠粒干燥，在使用之前蒸馏。蒸馏产物存放在深色瓶中，瓶中有林德型13号分子筛。甲醇与少量镁屑和碘一起加热干燥，直到碘色消失。然后再加入些甲醇，在干燥氮气下蒸馏该产物。在有些实验中，用HPLC级甲醇代替了无水甲醇。可使用所供应的无水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯（AR级）和沸点为30～40℃的汽油（AR级）。用林德型4A分子筛干燥二甲基甲酰胺，并用真空蒸馏（沸点：76℃/40mm）。将蒸馏的产物贮存在有分子筛的深色瓶中，直到使用。苯胺与氢氧化钾粒一起在真空中蒸馏，在使用前存放在有林德型4 分子筛的深色瓶中。在真空下蒸馏苯甲基溴（沸点：85～87℃/10mm），并存放在4℃温度下用铝箔包封的瓶中，直到使用。乙酐在使用之前蒸馏（沸点：138℃）。蒸馏的乙酐存放在氮气下。

色谱法：

薄层色谱法（t.l.c.）

使用下列的体系之一作为上行溶剂系，尽可能地进行标准样品和共斑点的试验，并列出Rf值。

（1）商用的硅胶色谱板（Merck，DC-Plastikfoline  Kieselgel  60F  254）;溶剂体系是在括号中所指出的。色谱板在紫外光下观察，并浸入到5%乙醇的磷钼酸中展开，再放在烘箱中加热至100℃。

（2）商用的纤维素色谱板（Merck，DC-Plastikfoline  Cellulose）;溶剂体系是正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液（22∶10∶10）。色谱板的展开，将它浸入1%茚三酮的丙酮中（该丙酮已加有1%吡啶），然后再加热 至100℃。

真空加速色谱法（快速色谱法）

将TLC硅胶（Merck，kieselgel  60）吸收剂以干法装入带有烧结玻璃盘的柱中。按照常用方法应用真空加速洗脱法。

离子交换色谱法

使用阳离子和阴离子交换介质进行分离。将这些介质以水的淤浆装入离子交换柱中，并用适当离子的可溶性盐的1摩尔溶液处理使其转化成所需的离子形式。然后将柱用蒸馏水洗涤，并装入混合物。洗脱液系统在括号中指出，离子交换介质如下：

Ⅰ.Amberlite  IR-20（分析级），BDH

Ⅱ.Amberlite  IDC-50（分析级），BDH

Ⅲ.Amberlite  CG-120（分析级），BDH

Ⅳ.Amberlite  CG-120（分析级），BDH

Ⅴ.Bio-Gel  Bio-rex5（分析级），Bio-Rod

硅胶过滤（离子排斥法）色谱法

在使用前，将Sephadex  LH-20存放在甲醇中，以甲醇淤浆的形式，装入重力色谱杆中。用洗脱液洗涤硅胶，直到柱床沉定，然后将混合物用作为薄层，洗脱液是二氯甲烷和汽油的混合物，在括号中指出了其比例。

高效液相色谱法（HPLC）

使用Water  HPLC装置，该装置包括带有U6K注射器和R401/（402）差示折光计的590型泵，以及可变波长的紫外线一可见光481型检测器。HPLC是指如下所列出的，在括号中指出了溶剂体系。梯度洗脱是用Varian双溶剂泵和相同的注射器/检测器配合设备进行。

Ⅰ.分析级硅胶

Ⅱ.制备级硅胶

Ⅲ.分析级逆相

最终的氨基酸衍生物的纯度，用Waters氨基酸分析剂使用HPLC法测定。

中压液相色谱法（MPLC）

MPLC是使用带有Rheodyne型50特氟隆注射器和waters  R402制备差示折光计的FMI-RP泵进行。所用的柱是指下面所列出的，在括号中指出了溶剂体系。

Ⅰ.Fertigsaule  Kieselgel  60，C级（Merck）

Ⅱ.Lobar  Fertigsanle  Kieselgel  60，B级，40～60m，（Merck）

Ⅲ.Lober  Lichromoprep  PR-8，A级，43～60m，（Merck）

红外（IR）光谱

所有红外光谱使用Perkin-Elmer型297光栅分光光度计记录。样品是以两氯化钠盘之间的液膜（l.f.）或液体石蜡糊（液体石蜡）记录的，或以四氯化碳（CCl4）或含氘氯仿（CDCl3）用1mm氯化钠中空穴来记录。主要的吸收作用以cm-1记录。

核磁共振谱（NMR）：

1H NMR谱

质子核磁共振谱是用Bruker AM-300分光计（300.133MHz）记录。化学位移用与四甲基硅（TMS）内标在氘氯仿（CDCl3）溶剂中的相关值表示。所用的其他溶剂是氘甲醇（CD3OD）和氧化氘。溶剂和标准物是在括号中所表示的。偶合常数（J）用赫兹表示，有多种标记，如单峰（S），双重峰（d），三重峰（t），四重峰（q），五重峰（qi），六重峰（SX），多重峰（m）和宽峰（b）。偶合的表示是用图形。核极化效应实验（NOE）在进行实验时说明。

13C NMR谱

碳-13核磁共振谱是用Bruker AM-300分光计（75.47MHz）记录。可使用所有1H去偶的和DEPT或非共振谱。所有参数用与质谱法相类似的方法表示。两种数据即Cosy和XY-相关实验当使用时说明。

熔点（m.p.）

熔点是用Reichert热阶段装置和Olympus显微镜测定的。所有熔点是没有校正的，并用摄氏温度表示。

旋光度

手性化合物的旋光度是用Perkin-Elmer（4）型极谱仪测定。在所有的测量中，除另有说明外，都使用了钠的D线。溶剂在括号中表示，浓度以mg/ml表示。所有的测量是在光程长度为10cm的1ml套层石英穴中进行。每个样品进行5次测定，并计算出平均旋光度。

其它方面

除非另有说明，所有反应都是在室温（平均25℃）下进行，搅拌是在干燥氮气（N2）下进行。

用实例1～79制备的化合物1～78如下：

化合物号  名称

1.N-苯甲氧甲酰-L-谷氨酸酐

2.Z-L-焦谷氨酸

3.Z-L-焦谷氨酸叔丁酯

4.Z-L-谷氨酸γ-甲酯

5.Z-L-谷氨酸α-叔丁基-γ甲酯

6.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯

7.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯

8.Z-L-谷氨酸α-苯甲基-γ-2′-吡啶基酯

9.Z-L-谷氨酸γ-异羟肟酸

10.L-谷氨酸γ异羟肟酸

11.Z-L-谷氨酸γ-2′-羟基乙酰胺

12.L-谷氨酸γ-2′-羟基乙酰胺

13.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-甲酰胺

14.Z-L-谷氨酸γ-甲酰胺

15.L-谷氨酸γ-甲酰胺

16.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-酰肼

17.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-N′-甲基酰肼

18.Z-L-谷氨谷γ-N′-甲基酰肼

19.L-谷氨酸γ-N′-甲基酰肼

20.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-2′-羟乙基酰肼

21.Z-L-谷氨酸γ-2′羟乙基酰肼

22.L-谷氨酸γ-2′羟乙基酰肼

23.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-异羟肟酸

24.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-N-酰苯胺

25.Z-L-谷氨酸α-γ-N-酰苯胺

26.L-谷氨酸-γ-N-酰苯胺

27.Z-L-谷氨酸-α-苯甲酯-γ-2′-羟基乙酰基

28.Z-L-谷氨酸-α-苯甲基-γ-2′-氨乙基酯

29.L-谷氨酸γ-2′-氨基乙酯

30.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-三（羟甲基）甲酰胺

31.L-谷氨酸γ-三（羟甲基）甲酰胺

32.L-谷氨酸γ-三（羟甲基）甲酰胺环化产物

33.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-双（羟乙基）酰胺

34.L-谷氨酸γ-双（羟乙基）酰胺

35.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-1′，1′-二甲基-2′-羟乙基酰胺

36.L-谷氨酸γ-1′、1′-二甲基-2′-羟乙酰胺

37.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-乙酰胺

38.L-谷氨酸γ-乙酰胺

39.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-二乙酰胺

40.L-谷氨酸γ-二乙酰胺

41.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-N-（2′-羟乙基）酰哌嗪

42.L-谷氨酸γ-N-（2′-羟乙基）哌嗪

43.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-酰吗啉

44.L-谷氨酸γ-酰吗啉

45.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-0-甲基异羟肟酸

46.L-谷氨酸γ-0-甲基异羟肟酸

47.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-硫代乙酰胺

48.L-谷氨酸γ-2′-硫代乙酰胺

49.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-甲氧基乙酰胺

50.L-谷氨酸γ-2′-甲氧基乙酰胺

51.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-氯乙酰胺

52.L-谷氨酸γ-2′-氯乙酰胺

53.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-羟基酰苯胺

54.L-谷氨酸γ-2′-羟基酰苯胺

55.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-3′-氯酰苯胺

56.L-谷氨酸γ-3′-氯酰苯胺

57.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-4′-氯酰苯胺

58.L-谷氨酸γ-4′-氯-酰苯胺

59.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-酰哌啶

60.L-谷氨酸γ-酰哌啶

61.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-3′-羟基酰哌啶

62.L-谷氨酸γ-3′-羟基酰哌啶

63.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-[1-（4-甲基哌嗪基）]酰胺

64.L-谷氨酸γ-[1-（4-甲基哌嗪基）]酰胺

65.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（4-吗啉基）酰胺

66.L-谷氨酸γ-（4-吗啉基）酰胺

67.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-氟乙酰胺

68.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′，2′，2′-三氟乙酰胺

69.L-谷氨酸γ-2′，2′，2′-三氟乙酰胺

70.Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-0-甲基羟肟酸酯

71.Z-L-谷氨酸γ-0-甲基羟肟酸酯

72.L-谷氨酸γ-0-甲基羟肟酸酯

73.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（2-吡啶基）甲酰胺

74.L-谷氨酸γ-（2′-吡啶基）甲酰胺

75.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-丙-2-稀基酰胺（烯丙酰胺

76.L-谷氨酸γ-丙酰胺

77.Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（2-甲磺酰氧乙基）酰胺

78.二氢噁唑类似物

实例1

N-苯甲氧甲酰-L-谷氨酸酐（Ⅰ）（Z-L-谷氨酸酐）

（参见，例如：Le  Quesne，W.J.&  Young，G.T.（1954）J.Chem.Soc.，1950，Klieger，E  &  Gibian.H.（1961）Justus  Liebig′s  Ann.Chem.640.145～157）。

Z-L-谷氨酸（25.0克.0.089摩尔）在乙酸酐（150毫升）中的混合物搅拌6小时，直到所有的Z-L-谷氨酸溶解。随着在真空（30℃，2mm）中逐步除去过量的乙酸酐，使反应完成，得到一油状物。用无水乙醚（2× 50ml）洗涤该油状物，再用无水汽油（2×50ml）洗涤，真空中干燥纯产物，得到白色结晶固体（23.1g，99%），m.p.91～94℃（参见：klieger，E  &  Gibian.H.（1961）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，640，145～157页，m.p.92～93℃）。重复这种制备方法，得到95～99%产率的所需产物。在此阶段，没有进一步纯化所得酸酐。

实例2

Z-L-焦谷氨酸（2）

（参见：例如Klieger，E  &  Gibian.H.（1962）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，655，195～211）

将酸酐（Ⅰ）（19.1g，0.072mol）和二环己胺（14.5ml，0.088mol）在无水乙醚（60ml）和无水THF（40ml）中的溶液在氮气下搅拌过夜。过滤出在此反应中生成的固体物，用乙醚洗涤，再用沸腾的甲醇重结晶，得到Z-L-焦谷氨酸（21.0g，80%）的纯白色二环己胺（DCHA）盐。将DCHA（21.0g）的乙酸乙酯（120ml）和盐酸（1M，120ml）的溶液搅拌过夜，形成游离酸。过滤出DCHA盐酸化物，用乙酸乙酯（3×100ml）提取过滤物。用硫酸钠干燥合并的有机相，在真空下除去溶剂，得到白色结晶产物（17.50g，总产率为68%），m.p.136～138℃（文献：Klieger，E.& Gibian.H.（1962）Justus Liebig's Ann.Chem.，655，195～211，139～139℃）。然后，重复这一反应过程，得到所需产物，总产率为65～75%。质子和13C核磁共振谱分析与参考文献值（Klieger，E.& Gibian.H.（1962）Justus Liebig's Ann.Chem.655，195～211）比较很好。

1H NMR（CDCl3）：δ2.10（1H m），2.50（3H m），4.72（1H，dd J＝9.3，2.7），5.30（2H s），7.35（5H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ21.72（CH2），30.99（CH2），58.44（CH），68.56（CH2），128.04（芳族 CH），128.45（芳族 CH），128.59（芳族 CH），134.88（芳族 C），151.09（氨基甲酸酯）172.98（酰胺），175.62（酸）.

实例3

Z-L-焦谷氨酸叔丁酯（3）

（参见：例如，Kliegger，E.&  Gibian.H.（1962）Justus  Liebig's  Ann.Chem，655，195-211;Anderson，G，W.&  Callahan.F.M.（1962）J.Am.Chem.Soc.，82，3359～3363）。

方法A：

Z-L-焦谷氨酸（10g，0.038mol）溶解在用异丁烯饱和的二氯甲烷（DCM）（120ml）中。慢慢地加入硫酸（98%，3ml），将异丁烯鼓泡入溶液中1小时。然后，在用t.l.c（硅胶，20%汽油/醚）测定已没有起始原料后，先用水（2×50ml），再用碳酸氢钠溶液（10%，2×50ml）洗涤该DCM溶液，用硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，得到两种产物的混合物，用快速色谱法（20%汽油/乙醚）分离，得到酯（3）（Rf.0.3，6g，50%）.m.p.55～57℃[α]20D为-29.0（C＝2.04，DMF）和α，γ-二叔丁基-Z-L-谷氨酸酯[Rf.0.6，2g，18%）。然后，重复该反应步骤，制得各种量的二酯副产物，所需酯的产率为40～75%。用高氯磺酸或对甲苯磺酸或三氟化硼合二乙醚代替磺酸催化剂也没有提高产率。

方法B：

将Z-L-焦谷氨酸（20g，0.076mol）溶解在乙酸叔丁酯（300ml）中。向该溶液中加入高氯酸（70%，1ml），将该混合物在塞好的烧瓶中，0℃温度下搅拌过夜。该反应这样进行，用乙酸乙酯（150ml）稀释，用水（2×50ml），碳酸氢钠溶液（10%，2×50ml）和饱和氯化钠溶液（1×50ml）洗涤。用硫酸钠干燥该反应溶液，并在真空下除去溶剂，得到纯产物（3）（Rf.0.3，20%汽油/乙醚，9.31g，39%），m.p.57～59℃。该化合物用NMR（1H和13C）方法测定与异丁烯反应产物相同。

1H NMR（CDCl3）：δ1.38（9H s），2.03（1H dddd J＝2.7，3.2，9.5，13.1），2.31（1H dddd J＝9.2，9.3，10.5，13.1），2.49（1H ddd J＝3.2，9.2，17.5），2.63（1H ddd J＝9.5，10.5，17.5），4.54（1H d，d J＝2.7，9.3），5.23，5.29（2H AB J＝12.3），6.50（1H b）7.36（5H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ21.58（CH2），27.52（CH3），30.70（CH2），59.14（CH），67.85（CH2），82.18（C），127.86（芳族 CH），128.09（芳族 CH），128.25（芳族 CH），134.90（芳族 C），150.64（氨基甲酸酯），169.86（酰胺），172.78（酯）.

实例4

Z-L-谷氨酸γ-甲酯（4）

（参见：例如：Hanby，W.E.Waley，S.G，Watson，J  &  Ambrose，E.J.（1950）].J.Chem，Soc.，3239～3249）

方法A：用氯甲酸苯甲酯保护L-谷氨酸γ-甲酯

（参见：Hanby，W.E.，Waley，S.G.Watson，J.&  Ambrose.E.J.（1950）J.Chem.Soc，3239～3249）。

将L-谷氨酸γ-甲酯（5.0g，0.031mol）溶解在碳酸氢钠溶液（20%，20ml）中，将pH值调节至9.00向该溶液中加入氯甲酸苯甲酯（4.84ml，0.034mol），将混合物冷却至5℃。搅拌该反应混合物过夜，然后，用t.l.c.（纤维素，Rf，0.24）测定没有起始的酯存在，通过调节pH值为2.0而使反应停止，用乙酸乙酯（3×60ml）提取。合并有机层，用水（10ml）洗涤，并用硫酸钠干燥。再在真空下除去溶剂，得到白色结晶固体物（8.0g，87.5%），m.p.71～73℃（参见：Hanby，W.E.waley，S.G.WATSON，J.& Ambrose.E.J.（1950）J.Chem.Soc.3239～3249，72～73℃），[α]为-14.3（C＝10.60，甲醇）（参见：[α]20D为-15.3（C＝7.46，1.4M KHCO3）），再用t.l.c.纯化（纤维素，Rf为0.80）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.02（1H dddd J＝6.6，7.8，14.3，14.3），2.23（1H dddd J＝5.5，7.4，14.3，14.2），2.45（2H m），3.65（3H s），4.42（1H ddd J＝5.5，7.8，8.0），5.11（2H s），5.61（1H d J＝8.0），7.30（5H m），8.53（1H b）.

方法B：Z-L-谷氨酸的可选择酯化反应

将Z-L-谷氨酸（5.62g，0.02mol）溶解在无水甲醇（20ml）中。向该溶液中加入乙酰氯（1.60ml，0.024mol），该混合物搅拌过夜（参见：Hanby，W.E.Waley，S.G.Watson，J.& Ambrose，E.J.（1950）J.Chem.Soc.3239～3249）。此后，溶液为浅黄色。加入吡啶（2ml），将该混合物再搅拌24小时。T.L.C.（硅胶，5%汽油/乙酸（0.1）在乙醚中）表明主要产物是二甲酯（Rf为0.58），用1H NMR谱确认。

实例5

Z-L-谷氨酸α-叔丁基-γ-甲酯（5）

（参见：例如，Tashner，E，Wasielewski，C.，Sokolowska，T.&  Biernat.J.F（1961）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，646，127～133）。

按上述方法用乙酸叔丁酯处理甲酯（4）（7.00g，0.024mol），得到两种产物的混合物，如t.l.c.（硅胶，60%乙醚/汽油，Rf0.84，0.22）所示。用快速色谱法（硅胶，20%乙醚/汽油）分离这些组份，得到α-叔丁酯（5）（4.90g，58.7%），为粘稠油状物（Rf.0.22，t.l.c.硅胶，60%乙醚/汽油）。具有较高Rf的组分是α-γ-二叔丁酯。

1H NMR（CDCl3）：δ1.45（9H s），1.97（1H dddd J＝7.9，8.1，14.2，14.3），2.23（1H bddd J＝6.5，8.3，14.3），2.39（2H m），3.66（3H s），4.28（1H ddd J＝6.5，7.5，7.9），5.10（2H s），5.37（1H d J＝7.5），7.34（5H m）.

实例6

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯（6）

（参见：Tashner，E.，Wasielewski，C.，Sokolowska，T.&Biernat.J.F.（1961）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，646，127～133）

方法A：化合物（3）的开环（参见：例如Klieger，E.&  Gibian.H.（1962）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，655，195～211）。

将叔丁酯（3）（500mg，156mmol）溶解在丙酮（7ml）中，再向其中加入氢氧化钠溶液（1M，1.9ml）。使该溶液回流1小时，再用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油）监测。此后，观察到有小量的起始物，用盐酸（0.2M）酸化至pH值为1.5来停止该反应，然后用DCM（3×25ml）提取。合并有机层，用硫酸镁干燥，在真空下除去溶剂，制得两种产物（Rf：0.05，0.78，硅胶80%乙醚/汽油）的混合物，用快速色谱法（硅胶，DCM然后用乙酸乙酯）分离该混合物，得到起始的酯（3）（220mg，44%）和叔丁酯（6）（328mg，65%）。用甲醇为溶剂重复该实验，得到5-甲酯，产率为35～50%。

实例7

方法B：化合物（5）的水解（参见：例如Tashner，E.Wasielewski，C.，Sokolowska，T.&  Biernat.J.F.（1961）Justus  Liebig's  Ann.Chem，646，127～133;Shin，C.G.，Yonezawa，Y.&  Wanatabe.E.（1985）  Tetrahedron  Lett，26，85～88.）

将二酯（5）（4.90g，1.39mmol）溶解在甲醇（20ml）和水（5ml）中。向该溶液中加入氢氧化锂-水合物（0.64g，1.42mmol），将该混合物在0℃温度下搅拌1小时。然后，在真空下除去溶剂（大约20℃），将残余物溶解在水（50ml）中。该溶液用乙酸乙酯（2×20ml）提取，然后酸化至pH值为1.5，再用乙酸乙酯（3×20ml）提取。用硫酸钠干燥最后的提取物，在真空下除去溶剂，得到叔丁酯（6）（3.27g，70%，Rf0.5，t.l.c.硅胶，60%乙醚/汽油）。接着，重复这种制备方法，得到化合物（6），产率70～80%。

1H NMR（CDCl3）：δ1.45（9H s），1.98（1H dddd J＝7.9，8.4，14.2，14.3），2.20（1H m），2.40（2H m），4.30（1H ddd J＝8.1，7.9，6.5），5.09（2H s），5.59（1H d J＝8.1），7.31（5H m），7.75（1H bs）.

实例8

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯（7）

（参见：Morley，J.S.（1967）J.Chem.Soc.（c）.，2410～2421）。

在15℃温度下，将Z-L-谷氨酸（50.0g，0.178mol）溶解在二甲基甲酰胺（DMF）（50ml）中。向该溶液加入三乙胺（24.64ml，0.178mol）和苯甲基溴（23.24ml，0.195mol）。该反应混合物在15℃温度下放置6小时，然后温热至室温过夜。此后，加入冰水（300ml），再用乙酸乙酯（3×160ml）提取该混合物。合并提取物，用冰水（2×50ml）洗涤，然后，用硫酸钠干燥。真空下除去溶剂，残余物溶解在乙酸乙酯（180ml）中。向该溶液加入二环己胺（38.67g，42.36ml，0.214mol），将该混合物搅拌6小时。此后，过滤收集所得固体物，用冷却的乙酸乙酯（60ml）洗涤，在真空烘箱中干燥，得到二环己胺盐，为吸湿的白色固体物（97.8g，99%）。将该粗产物用沸腾的乙醇（250ml）重结晶，得到纯盐（66.5g，68%），将其溶解在乙酸乙酯（300ml）和盐酸（3.5M，70ml，2当量）中，搅拌2小时。过滤该混合物，并分离各层。用乙酸乙酯（2×50ml）提取水溶液层。合并有机层，用冷却水（50ml）洗涤，用硫酸钠干燥。真空下除去乙酸乙酯，得到无色油状物，用乙醚/汽油（1∶1，25ml）研制来结晶。抽气干燥该产物4小时，得到α-苯甲酯（7）（44.5g，99.5%，总产率67.5%），m.p.96～98℃（参见：Morley，J.S.（1967）J.Chem.Soc.（C）.，2410～2421，m.p.97～98℃），[α]20D为-18.9（C＝10.60，DMF）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.98（1H dddd J＝7.2，8.1，14.2，14.3）2.21（1H m），2.39（2H m），4.48（1H ddd J＝6.5，7.2，8.1），5.10（2H s），5.10，5.14（2H ab），5.57（1HδJ＝8.1），7.33（10H m），8.8（1H b）.

13C NMR（CDCl3）：δ27.25（CH2），29.74（CH2），53.25（CH），67.25（CH2-O），67.34（CH2-O），127.98（芳族 CH），128，13（芳族 CH），128.21（芳族 CH），128，44（芳族 CH），128.56（芳族 CH），135.00（芳族 C），136.00（芳族 C），156.06（氨基甲酸酯）171.68（酯），177.67（酸）.

实例9：

Z-L-谷氨酸α-苯甲基，γ-2′-吡啶基酯（8）

（参见：S.Kim.J.I.Lee和Y.K.Ko.，（1984），Tetrahedron  lett.25，no  43，4943～4946或A.S.Dutta和J.S.Morley，（1981），J.Chem，Soc.（C）2896～2902）。

将Z-L-谷氨酸α-苯甲酯（7）（881mg，2.37mmol）溶解在无水吡啶（7ml）中，在5℃温度下与2-羟基吡啶（405mg，4.26mmol）和二环己基碳化二亚胺（DCC）（645mg，3.08mmol）反应24小时。然后，在真空下除去吡啶而停止反应。将粗产物再溶解在乙酸乙酯（4ml）中，并过滤除去不溶的二环己脲。用碳酸氢钠溶液（2×3ml）提取乙酸乙酯溶液，然后再用饱和氯化钠溶液（1×3ml）提取。在真空下从有机层除去溶剂，得到粗产物（8）。用色谱法将粗产物纯化（硅胶，50%汽油/乙酸乙酯，得到2′-吡啶基酯（8）（1.01g，91%），其中还含有少量的二环己脲。

1H NMR（CDCl3）：δ2.12（2H m），2.34（2H m），4.55（1H m），5.11 5.18（4H 2 xAB's），5.60（1H d J＝6.8），7.04（1H m），7.20-7.74（12H m），8.37（1H m）.

亲核试剂与中间体的反应

下面实例说明本发明式Ⅰ化合物的制备方法。

实例10

Z-L-谷氨酸γ-异羟肟酸（9）

将Z-L-焦谷氨酸（500mg，1.78mmol）溶解在THF（2ml）中。向该溶液加入羟胺水溶液（1.8ml，4M，7.12mmol），该水溶液加入羟胺水溶液是这样制备的，在5℃温度下将羟胺盐酸化物溶解在水中，用氢氧化钠溶液将pH值调节至8.0。4小时后，用t.l.c.（纤维素，Rf为0.49，起始物的Rf为0.63）测定反应完成。用调节pH为2.0来处理该混合物，在大 约15℃温度下，在真空中除去溶剂，然后用THF（2×10ml）和乙酸乙酯（2×10ml）提取残余物。从合并的提取物中除去溶剂，得到白色固体物。该物用氯仿重结晶，得到化合物（9），为白色结晶固体（535mg，96%）。接着，重复上述实验步骤，得到异羟肟酸（9），产率80～95%。

实例11

L-谷氨酸γ-异羟肟酸（10）

L-谷氨酸γ-异羟肟酸（0.50g）溶解在HPLC级甲醇（4ml）中，加入10%钯-炭。在氢气下搅拌该混合物。直到在硅胶色谱板上的样品斑点没有紫外线活性。此后（0.5～1小时），将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用水（5ml）洗涤该垫。将过滤液和洗涤液合并，在真空中除去溶剂，得到γ-异羟肟酸（10）（270mg，98%），m.p.145～146℃，[α]20D为-7.6（C＝10.71，H2O）。

1H NMR（D2O/DCl）：δ1.92（2H m）2.12（2H m）3.83（1H t J＝7.6）

化合物（10）的质子NMR和熔点与从Sigma公司购得的真实化合物的性能相同。

实例12

Z-L-谷氨酸γ-2′-羟乙酰胺（11）

将Z-L-焦谷氨酸（2）（2.0g，7.6mmol）溶解在THF（20ml）和水（1ml）中。向该溶液中加入乙醇胺（1.4ml），搅拌过夜进行反应。按照上述方法来停止反应，得到粗产物。用在Sephadex  SP-C25色谱法纯化该物料，用水洗脱。除去水，得到化合物11，为油状物（2.0g，81%）。

1H NMR（D2O/DCl）：δ1.7（1H m）1.9（1H m）2.1（2H m）3.05（2H q）3.17（1H t）3.40（2H t）3.95（1H m）4.90（2H s）7.17（5H m）.

实例13

L-谷氨酸γ-2′-羟乙酰胺（12）

将衍生物（11）（600mg）溶解在HPLC级甲醇（5ml）中，该甲醇中已加入了10%钯-炭（60mg）。按上述方法氢化该混合物，得到化合物（12），为白色粉末（340mg，97%），m.p.210～210.5℃，[α]20D为+7.3（C＝10.96，水）。HPLC分析（氨基酸分析器）表明，产物的纯度大于99%，只有小于1%的谷氨酸杂质。

1H NMR（D2O/DCl）：δ2.17（2H dddd J＝2.2，4.7，3.3，14.8）2.46（2H ddd J＝3.3，1.8，14.8）3.32（2H t J＝5.3）3.64（2H t J＝5.4）3.92（1H dd J＝2.2，4.8）.

13C NMR（D2O）：δ27.40（CH2）32.80（CH2）42.91（CH2）54.72（CH）61.33（CH2）174.11（酰胺）176.98（酸）.

实例14

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-甲酰胺（13）

将甲胺（24%水溶液，50ml，0.37mmol）加到叔丁酯（3）（89mg，0.28mmol）的甲醇（1ml）搅拌溶液中。0.5小时后，用t.l.c.（硅胶，75%乙醚/汽油）测定没有起始物了。在真空下除去溶剂和甲胺来停止反应，用t.l.c.快速色谱法（45%乙醚/汽油）测定该粗产物显示得到了两种产物的混合物。在真空下除去溶剂，得到γ-甲酰胺，为白色结晶固体物（59mg，60%），m.p.109～109.5℃[α]20D为+3.9（C＝1.1，氯仿）。主要的副产物是γ-甲酯（34mg，35%），是由甲醇盐竞争性的开环而形成的。在THF中重复反应，去除了副反应产物，并提高了产率，产率为88%。

MS  M+  350，m/e249（55%），174（27%），98（27%），92（15%），91（100%），84（22%），73（15%），57（28%），42（16%），19（13%）.

1H NMR（CDCl3）：δ1.45（9H s）1.19（1H m）2.19（1H m）2.22（2H m）2.78（3H bd J＝4.6）4.20（1H m）5.10（2H s）5.60（1H bd J＝7.5）6.03（1H bs）7.34（5H m）.

13C NMR CDCl3）：δ26.28（CH3）27.90（CH3）29.11（CH2）32.44（CH2）54.01（CH）66.93（CH2）82.43（C）128.02 128.13 128.47（芳族 CH's）136.21（芳族 C）156.57（氨基甲酸酯）171.02（酰胺）172.57（酯）.

实例15

Z-L-谷氨酸γ-甲酰胺（14）

（参见：Anderson，G.W.&  Callahan，F.M.（1962）J.Am，Chem  Soc.）

将γ-甲酰胺（13）（33mg，0.10mmol）溶解在冷却的三氟乙酸（TFA）中（参见：例如，Bryan，D.B.Hall，R.F.Holden，K.G.Huffman，W.F.&Gleason，J.G.（1977），J.Am.Chem.Soc.，99，2353～2355），该混合物在冰浴中搅拌0.5小时。然后，用t.l.c.（硅胶，5%甲醇/氯仿）检测显示所有的起始酯都反应了。真空下除去TFA来停止反应，得到粗产物，为浅黄色油状物。用快速色谱法（5%甲醇/氯仿）来纯化该粗产物，真空下除去溶剂，得到白色结晶固体物（24mg，85%）。将酸（14）重结晶（氯仿/汽油），得到用于光谱分析的纯化样品，m.p.117～118℃，[α]20D为+16.2（C＝1.0，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.00（1H m）2.17（1H m）2.30（2H m）2.71（3H bd J＝4.3）4.29（1H m）5.06（2H s）6.12（1H bd J＝7.2）6.67（1H bs）7.30（5H m）9.36（1H bs）.

实例16

L-谷氨酸γ-甲酰胺（15）

（参见：Lichtenstein，N.（1942）J.Am.Chem.Soc.，64，1021～1022）

Z-L-谷氨酸γ-甲酰胺（14）（2.40g，8.15mmol）溶解在无水乙醇（50ml）中，再加入10%钯-碳催化剂（260mg）。该混合物用通用方法氢化，t.l.c.监测紫外线活性的消失。4小时后，起始的酸全部反应了，过滤混合物来停止反应。用水（2×10ml）洗涤催化剂，真空下，从洗涤液和过滤物的混合物中除去溶剂。将残余物重结晶（80%乙醇/水），得到纯的氨基酸（15）（1.01g，79%），为白色结晶固体物，m.p.193.5～194℃（参见：Lichtenstein，N.（1942）J.Am.Chem.Soc.64，1021～1022，m.p.192℃），[α]20D为+4.1（C＝1.23，水）（参见：[α]20D为+6.5），该产物的纯度可由氨基酸分析器使用HPLC法确认。

1H NMR（D2O）：δ2.12（2H m）2.39（2H m）2.71（3H s）3.75（1H bt J＝6.7）.

13C NMR（D2O）：δ26.49（CH3）27.24（CH2）32.12（CH2）58.88（CH）174.81（酰胺）175.78（酸）.

化合物（3）的开环可由下述的一系列亲核试剂来进行。在每种情况下，实验的方法与前述说明是相同的。

实例17

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-酰肼（16）

（参见：例如，Klieger，E.&  Gibian  H.（1962）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，655，195～211和Tashner，E，Wasielewski，C.，Sokolowska，T.&  Biernat，J.F.（1961）Justus  Liebig's  Ann.Chem.，646，127～133）

将酯（3）（118mg，0.37mmol）与水合肼（16μl，0.32mmol）反应，得到γ-酰肼（16），为白色结晶固体物（124mg，95%），m.p.95～100℃，（参见：Shin，C.G.Yonezawa，Y.&  Wanatabe，E.（1985）Tetrahedron  Lett.，26，85～88。m.p.112～113℃）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.45（9H s）1.90（1H m）2.22（3H m）3.87（1H bs）4.22（1H bt J＝7.4）5.11（2H s）5.54（1H bd J＝7.4）7.37（5H m）.

实例18

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-N′-甲基酰肼（17）

将酯（3）（288mg，0.9mmol）与甲基肼（60μl，1.13mmol）反应，得到γ-N′-甲基酰肼（17），为玻璃态，产率较低（103mg，31%）。

MS  M+365，m/e  320（2%）309（71%）292（16%）136（32%）130（59%）113（76%）91（59%）84（71%）57（100%）46（95%）42（63%）29（51%）19（63%）18（57%）.

1H NMR（CDCl3）：δ1.43（9H s）1.92（1H m）2.18（3H m）2.57（3H m）3.57（1H bs）4.20（1H bt J＝8.0）5.08（2H s）5.80（1H d J＝8.0）7.32（5H m）7.87（1H bs）.

13C NMR（CDCl3）：δ27.90（CH3）28.91（CH2）30.66（CH2）39.16（CH3）53.93（CH）67.01（CH2）82.49（C）128.06（芳族 CH）128.15（芳族 CH）128.47（芳族 CH）136.17（芳族 C）156.37（氨基甲酸酯）170.30（酰胺）171.93（酸）.

实例19

Z-L-谷氨酸γ-N′-甲基酰肼（18）

将γ-N′-甲基酰肼（17）（77mg，0.21mmol）与TFA反应，得到游离酸（18）（28mg，90%），为透明玻璃态，[α]20D为-10.0（C＝1.0，水）。

1H NMR谱确认除去了叔丁基基团。

实例20

L-谷氨酸γ-N′-甲基酰肼（19）

在10%钯-炭（3mg）存在下，将酸（18）（23mg，0.07mmol）氢化，得到氨基酸（19），为透明玻璃态（10mg，83%）。

1H NMR（D2O）：δ2.09（2H m）2.33（2H m）2.53（3H bs）3.65（1H m）7.43（1H s）.

实例21

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-2′-羟乙基酰肼（20）

保护的焦谷氨酸（3）（4.0g，12.5mmol）与羟乙基肼（2.09g，27.6mmol）反应，得到酰肼（20）（4.90g，99%），为吸湿的白色固体物，用t.l.c.法纯化（硅胶，10%甲醇/氯仿，Rf为0.53，[α]20D为+3.3（C＝2.8，氯仿））。

1H NMR（CDCl3）：δ1.45（9H s）1.90（1H m）2.23（3H m）2.90（2H m）3.55（2H m）4.20（1H m）5.09（2H s）5.70（1H bd J＝7.9）7.34（5H m）8.02（1H bs）.

13C NMR（CDCl3）：δ27.93（CH3）29.31（CH2）30.66（CH2）53.51（CH）58.75（CH2）60.05（CH2）67.16（CH2）82.76（C）128.12（芳族 CH）128.27（芳族 CH）128.53（芳族 CH）136.07（芳族 C）154.54（氨基甲酸酯）170.84（酰胺）173.53（酯）.

实例22

Z-L-谷氨酸γ-2′-羟乙基酰肼（21）

在过量TFA下，将酰肼（20）（4.7g）脱酯化，得到酸（20），再用快速色谱法（10%甲醇/氯仿）纯化，得到纯化合物（21）（3.8g，94%），m.p.88～95℃，分解。

1H NMR（D2O）：δ1.93（1H m）2.14（1H m）2.30（2H m）2.94（2H m）3.63（2H m）4.03（1H m）5.13（2H s）7.43（5H m）.

实例23

L-谷氨酸γ-2′-羟乙基酰肼（22）

用通用方法将酸（21）（2.1g）氢化，得到氨基酸（22）（1.24g，99%），为吸湿的白色固体物。

1H NMR（D1O）：δ2.00（2H m）2.36（2H m）3.18（2H t J＝4.9）3.58 3.60（2H d AB J＝12.66）3.87（1H t J＝7.7）.

13C NMR（D2O）：δ27.10（CH2）29.56（CH2）53.03（CH）53.83（CH2）57.05（CH2）171.23（酰胺）175.43（酸）.

实例24

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-异羟肟酸（23）

将保护的焦谷氨酸（3）（5.0g，15.6mmol）溶解在HPLC级甲醇（20ml）中。向该溶液加入羟胺盐酸化物（27ml，2.4M，62.5mmol），该盐酸化物已用氢氧化钠将pH值调节至8.0。将反应混合物搅拌24小时，然后用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油）检测出已没有起始物存在。用调节pH值至2.0来处理该混合物，用乙醚（3×100ml）提取该混合物。蒸发干醚提取物，得到粘稠的油状物（4.80g，87%），用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油，Rf为0.21）测定显示这种油为单一的化合物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.43（9H s）1.90（1H m）2.15（1H m）2.21（2H m）4.18（1H m）5.09（2H s）5.78（1H bd）7.30（5H m）.

实例25

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-酰苯胺（24）

将酸（6）（3.61g，10.7mmol）溶解在无水THF（25ml）中，并冷却至5℃。加入三乙胺（1.63ml，11.7mmol），混合物搅拌大约2分钟。然后，加入氯甲酸乙酯（1.13ml，11.7mmol），再搅拌该混合物3分钟。然后加入苯胺（2.92ml，32mmol）的THF（5ml）溶液，将混合物放置约0.5小时暖至室温。2小时后，用t.l.c.法（硅胶，50%乙醚/汽油）观察有少量的起始酸。真空下除去溶剂，得到粗混合物，将该混合物溶解在DCM（50ml）中，用水（20ml），0.1M盐酸（10ml）和饱和氯化钠（20ml）洗涤。从无水溶液中蒸发掉溶剂，得到粗酰苯胺（24），用快速色谱法（70%乙醚/汽油）纯化，得到浅黄色固体物（2.58g，59%）。用乙醚/汽油重结晶，得到白色固体物，m.p.136～137℃，[α]20D为-18.5 （C＝11.25，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.44（9H s）1.97（1H m）2.35（1H m）2.43（2H m）2.80（1H bs）4.30（1H m）5.11（2H s）5.66（1H d J＝7.6）7.10（1H m）7.34（7H m）7.60（2H m）.

实例26

Z-L-谷氨酸γ-酰苯胺（25）

在0℃下，用过量TFA（1ml）处理酯（24）（206mg，0.5mmol）。用t.l.c.（70%乙醚/汽油）监测该反应，2小时后，还剩有大量的起始酯，因而将反应混合物暖至室温。再过2小时，用t.l.c.测定显示已没有起始酯了，在真空中除去TFA，而得到粗产物（25）。用四氯化碳研制，得到纯化酸（25）（158mg，89%），为白色粉末，m.p.155～158℃，[α]20D为-9.03（C＝10.73，甲醇）。

1H NMR（CH3OD）：δ1.99（1H m）2.24（1H m）2.49（2H m）4.23（1H m）5.06（2H s）7.06（1H m）7.29（8H m）7.51（1H m）.

实例27

L-谷氨酸γ-酰苯胺（26）

向酸（25）（1.02g，2.87mmol）的无水甲醇（16ml）溶液加入5%钯-炭（203mg）。该混合物氢化2小时，然后用t.l.c.（25%甲醇/氯仿）检测显示没有起始酸存在的证据。将该混合物用通用方法处理，得到纯产物（26）（636mg，99%），为白色结晶固体物，m.p.210～210.5℃，[α]20D为+8.9，（C＝8.90，水）。

1H NMR（D2O）：δ2.20 2.24（2H dAB J＝7.7）2.59（2H dt J＝7.7，5.0）3.82（1H t J＝5.0）7.25（1H m）7.42（4H m）.

实例28

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-羟乙基酰胺（27）

将α-苯甲酯（7）（1.27g，3.42mmol）溶解在THF（6ml），并冷却至5℃。向该溶液中，加入三乙胺（0.48ml，3.5mmol），搅拌该混合物约2分钟。此后，加入氯甲酸乙酯（0.38ml，3.5mmol），将混合物再搅拌3分钟。慢慢地向反应混合物中，加入乙醇胺（0.41ml）的THF（1.5ml）溶液，使该混合物暖至室温。10分钟后，用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油），检测已没有起始酯可被检测到。在真空中除去反应混合物中的溶剂，将所得的油状物溶解在乙酸乙酯（50ml）中。用5%碳酸氢钠（10ml）和水（10ml）洗涤该乙酸乙酯，然后用硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油，Rf为0.10和硅胶10%甲醇/氯仿，Rf为0.60）纯化，得到化合物（27）（1.10g，75%），为无色油状物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.93（2H m）2.20（2H m）3.28（1H m）3.43（1H m）3.65（2H m）4.37（1H mt J＝7.9）5.08（2H s）5.08，5.11（2H AB）5.88（1H d J＝7.9）0.38（1H bs）7.33（10H m）.

实例29

L-谷氨酸γ-2′-羟基乙酰胺（12）

将酰胺（27）（600mg）的甲醇（5ml）溶液用10%钯-炭（60mg）氢化，得到氨基酸（11）（210mg，76%），它用1H NMR鉴定与由Z-L-焦谷氨酸开环制备的产物相同，m.p.210～211℃（参见：实例13，m.p.210～210.5℃），[α]20D为+6.88（C＝9.39，水）（参见：实例13，[α]20D为+7.3（C＝10.96，水））。

实例30

Z-L-谷氨酸α-苯甲基-γ-2′-氨基乙酯（28）

将α-苯甲酯（7）（2.0g，5.39mmol）的THF（9ml）溶液在5℃温度 下，用三乙胺（0.75ml，540mmol）处理2分钟。然后，加入氯甲酸乙酯（0.52ml，5.4mmol），将混合物搅拌约3分钟。向上述混合物中慢慢地加入Z-乙醇胺（1.16g，6mmol）和三乙胺（1.5ml，10.8mmol）的THF（5ml）溶液，搅拌该反应混合物0.5小时，在此期间使该混合物暖至室温。再将反应混合物搅拌24小时，然后，用t.l.c.（硅胶，0.1%乙酸/乙醚）检测没有起始酯（7）存在。将反应混合物用上述方法处理，得到用1H NMR确认为Z-乙醇胺和二酯（8）的混合物（1∶4）（2.8g，91%）。用快速色谱法（t.l.c.硅胶，0.1乙酸/乙醚，Rf为0.517，0.510）应用各种溶剂（80%乙醚/汽油;60%乙醚/1%丙酮的汽油）都没有能分离两组分，所以对整个混合物进行氢化。

1H NMR（CDCl3）：δ1.93（1H m）2.10（1H m）2.34（2H m）2.52（2H m）3.73（1H m）4.12（2H m）4.51（4H s）5.03（1H bd）7.24（10H m）.

实例31

L-谷氨酸γ-2′-氨基乙酯（29）的合成

将二酯（28）（2.0g）的甲醇（10ml）溶液用10%钯-炭（200mg）催化剂氢化，得到单一产物L-谷氨酸（460mg，88%校正的产率）。用t.l.c.（硅胶，10%甲醇/氯仿）或粗产物的1H NMR证实没有γ-2′-氨基乙酯存在。

实例32

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-三（羟甲基）甲酰胺（30）

将α-苯甲酯（7）（1.4g，3.77mmol）溶解在THF（5ml）中，再与三乙胺（600ml，4.5mmol）、氯甲酸乙酯（410ml，4.5mmol）和三（羟甲基）甲胺（2g，18.9mmol）的THF（5ml）和水（4ml）的溶液反应。将粗产物进行快速色谱法（100%氯仿）纯化，得到纯产物（30）（1.46g，79%），为吸湿的白色玻璃态，[α]20D为-12.0（C＝12.27，甲醇）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.16（1H m）2.27（3H m）3.54 3.63（6H AB）4.41（1H m）4.70（3H bs）5.10（2H s）5.10 5.14（2H AB）5.93（1H d J＝8.3）6.66（1H bs）7.31（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ28.03（CH2）32.12（CH2）53.21（CH）61.71（C）62.82（CH2）67.15（CH2）67.32（CH2）127.97（芳族 CH）128.20（芳族 CH）128.47（芳族 CH）128.56（芳族 CH）135.03（芳族 C）135.89（芳族 C）156.35（氨基甲酸酯）71.85（酰胺）173.62（酯）.

实例33

L-谷氨酸γ-三（羟甲基）甲酰胺（31）的合成

将酰胺（30）（1.10g）的甲醇（20ml）溶液用10%钯-炭催化剂氢化，使该混合物通过硅藻土床过滤，真空下除去溶剂，以较低产率得到单一化合物。用0.1M盐酸洗涤硅藻土床，再得到大部分产物。在真空下除去溶剂，得到环化氨基酸（32）（520mg，92%），为吸湿的白色固体物。在不用盐酸下，再次重复上述实验步骤，得到环化氨基酸（32）（70%），为吸湿的白色粉末。

1H NMR（32）（D2O）：δ1.87（2H dddAB J＝6.6，7.2，7.4）2.36（2H dd J＝7.2，7.4）3.35（4H s）3.74（1H t J＝6.6）4.39（2H s）

在D20中加入氢氧化锂后，在4.39处出现峰，3.35处的峰提高到6H。

13C NMR（D2O）：δ24.3（CH2）28.8（CH2）51.7（CH）59.0（CH2）59.6（C）61.9（CH2）171.1（酰胺）173.0（酯）.

实例34

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-双（羟乙基）酰胺（33）

在15℃温度下，酸（7）（3.76g，10.1mmol）的THF（10ml）溶液与三乙胺（1.55ml，11.1mmol）、氯甲酸乙酯（1.06ml，11.1mmol）和双（羟乙基）胺（3.4ml，30.3mmol）反应1小时。用通用方法处理该反应物，得到双（羟乙基）酰胺（33）（2.81g，59%），用t.l.c.（10%甲醇/氯仿，Rf为0.63，起始酸的Rf为0.48）[α]20D为-9.98（C＝16.08，甲醇）测定表明为纯化合物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.75（1H m）1.90（1H m）2.08（2H m）3.00（2H m）3.07（2H m）3.55（4H m）3.96（1H m）4.62（2H s）4.62 4.75（2H AB）7.20（10H m）.

实例35

L-谷氨酸γ-双（羟乙基）酰胺（34）

将双（羟乙基）酰胺（33）（2.15g）在甲醇（20ml）中用10%钯-炭（250ml）催化剂氢化。用通用方法处理该混合物，得到氨基酸（34）（1.08g，92%），为吸湿的白色粉末。

1H NMR（D2O/DCl）：δ2.02（2H m）2.17（2H m）3.06（2H m）3.65（2H m）4.03（4H m）5.02（1H m）.

13C NMR（D2O）：δ27.64（CH2）29.01（CH2）50.57（CH2）52.14（CH2）53.35（CH）60.54（CH2）60.74（CH2）172.31（酰胺）173.53（酸）.

实例36

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-1′，1′-二甲基-2′-羟乙酰胺（35）

将α-苯甲酯（7）（3.57g，9.61mmol）溶解在THF（10ml）中。向该混合物中加入三乙胺（1.47ml，10.57mmol）、氯甲酸乙酯（1ml，10.6mmol）和1，1-二甲基-2-羟乙胺（2.75ml，29mmol），在15℃温度下搅拌该混合物1小时。用通用方法处理，接着用色谱法（70%乙醚/汽油）纯化该粗产物，得到化合物（35），为无色油状物（4.08g，96%），[α]20D为-9.5（C＝12.61，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.20（6H s）1.92（1H m）2.16（3H m）3.48 3.50（2H AB J＝11.5）4.36（1H m）5.05（2H s）5.05 5.12（2H AB）6.01（1H d J＝8.0）6.20（1H s）7.30（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ24.03（CH3）24.18（CH3）28.02（CH2）32.51（CH2）53.33（C）55.74（CH）66.87（CH2）67.09（CH2）69.61（CH2）127.89（芳族 CH）128.01（芳族 CH）128.09（芳族 CH）128.32（芳族 CH）128.44（芳族 CH）135.03（芳族 C）135.98（芳族 C）156.26氨基甲酸酯 171.78（酰胺）172.50（酸）.

实例37

L-谷氨酸γ-1′，1′-二甲基-2′-羟乙基酰胺（36）

将酰胺（35）（2.20g）的HPLC级甲醇（20ml）溶液用10%钯-炭（220g）为催化剂氢化，得到氨基酸（36）（1.10g，99%），为吸湿的白色固体物，[α]20D为+6.82（C＝11.04，H2O）。

1H NMR（D2O）：δ1.04（6H s）1.99（2H m）2.24（2H m）3.43（2H s）3.89（1H t J＝6.45）.

13C NMR（D2O）：δ22.93（CH3）25.53（CH2）31.66（CH2）52.11（CH）54.91（C）66.87（CH2）171.40（酰胺）173.59（酸）.

实例38

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-乙酰胺（37）

将酸（7）（5.27g，14.2mmol）的THF（40ml）溶液用三乙胺（2.23ml，16.0mmol）、氯甲酸乙酯（1.53ml，16.0mmol）和无水乙胺（1.9ml，28.0mmol）在5℃温度下反应1小时。用通用方法完成该反应，得到粗产物（37），用氯仿/乙醚（1∶4）重结晶，得到乙酰胺（37）（5.01g，88%），用t.l.c.（80%乙醚/汽油，Rf为0.19）测定为均匀物，m.p.121～121.5℃，[α]20D为-6.02（C＝13，.13，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.09（3H t J＝7.3），1.82（1H m），1.99（1H m），2.17（2H m），3.24（2H dq J＝7.0，7.3），4.39（1H m），5.10（2H s），5.12，5.17（2H AB J＝12.4），5.70（2H bd J＝7.0），7.33（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ14.7（CH2），28.4（CH2），32.4（CH2），34.4（CH2），53.6（CH），67.0（CH2），67.3（CH2），128.0（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.2（芳族 C），136.1（芳族 C），156.3（氨基甲酸酯C＝O），171.5（C＝O），171.8（C＝O）.

实例39

L-谷氨酸γ-乙酰胺（38）

将γ-乙酰胺（37）（1.13g）用10%钯-炭（140mg）为催化剂在甲醇（20ml）中氢化。用通用方法处理该混合物，得到氨基酸（38）（460mg，92%），为白色结晶固体物，m.p.213-214.5℃，〔α〕20D为+7.8（C＝12.47，H2O），〔α〕 为+2.8（C＝12.47，H2O）。

1H NMR（D2O）：δ0.95（3H t J＝7.3），2.01（2H m），2.25（2H m），3.00（2H q J＝7.3），3.80（1H t J＝6.3）.

13C NMR（D2O）：δ11.1（CH3），23.7（CH2），29.1（CH2），32.2（CH2），50.6（CH），170.0（C＝O），171.6（C＝O）.

实例40

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-二乙酰胺（39）

将α-苯甲酯（7）（3.04g，8.19mmol）溶解在THF（15ml）。向该溶液中加入三乙胺（1.25ml，9.0mmol）、氯甲酸乙酯（0.86ml，9.6mmol）和二乙胺（1.86ml，1.8mmol），将混合物在15℃温度下搅拌1小时。用通用方法处理，得到粗产物（38），为无色油状物（3.23g，92%），用t.l.c.测定（硅胶，80%乙醚/汽油，Rf为0.24）该物为均匀的，〔α〕20D为-6.89（C＝10.05，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.05（6H t J＝7.1），2.20（4H m β和η质子），3.15（2H q J＝7.1），3.24（2H q J＝7.1），4.37（1H m α质子），5.03 5.07（2H AB），5.14 5.19（2H AB），6.06（1H bd J＝7.7NH质子），7.29（10H m芳族）.

13C NMR（CDCl3）：δ14.9（CH3），27.9（CH2），28.4（CH2），31.9（CH2），34.6（CH2），54.9（CH），68.0（CH2），68.5（CH2），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.6（芳族 CH），128.8（芳族 CH），136.2（芳族 C），136.9（芳族 C），157.1（氨基甲酸酯C＝O），171.9（C＝O），172.6（C＝O）.

实例41

L-谷氨酸γ-二乙酰胺（40）

将二乙酰胺（39）（1.32g）用10%钯-炭（120mg）作催化剂在HPLC级甲醇（20ml）中氢化，得到氨基酸（40）（600mg，95%），为白色结晶固体物，熔点：201-203℃，〔α〕20D为+8.34（C＝13.45，H2O）。

1H NMR（D2O）：δ1.00（6H t J＝7.4），2.03（2H m），2.34（2H m），3.01（2H q J＝7.4），3.11（2H q J＝7.4），3.85（1H t J＝6.6）.

13C NMR（D2O）：δ13.2（CH3），26.0（CH2），26.1（CH2），29.3（CH2），30.6（CH2），51.1（CH），168.9（C＝O），171.1（C＝O）.

实例42

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-N-（2′-羟乙基）酰哌嗪（41）

方法A：混合的酐

在5℃温度下，将α-苯甲酯（7）（4.07g，10.97mmol）的THF（25ml）溶液与三乙胺（1.68ml，12.0mmol）、氯甲酸乙酯（1.15ml，12.0mmol）和N-2′-羟乙基哌嗪（1.6ml，14.0mmol）反应1小时。用通用方法处理该反应物，得到N-2′-羟乙基酰哌嗪（41）粗产物，用快速色谱法（10%甲醇/氯仿）纯化，再用柱色谱法（sephadex LH-20，60% DCM/汽油）纯化，得到化合物（41）（4.54g，86%），用t.l.c.（10%甲醇/氯仿，Rf为0.21）测定为均匀物，〔α〕20D为-5.03（C＝9.54，DCM）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.01（1H m），2.21（1H m），2.39（6H m），2.50（2H m），3.31（4H bm），3.59（2H m），4.40（1H m），5.10（4H m），5.68（1H bd J＝8.0），7.31（10H m）.

方法B：用2-羟基吡啶活化酯（8）

在5℃温度下，将活化的酯（8）在二氯甲烷（20ml）中的溶液加入到搅拌着的1-（2′-羟乙基）哌嗪（2.5ml，14.3mmol）的二氯甲烷（20ml）溶液中。搅拌该反应混合物3.5小时，然后用t.l.c.（硅胶，3%甲醇/氯仿）检测显示没有起始酯存在。用水（3×10ml）洗涤反应溶液，并在真空下除去溶剂，得到所需产物（41）（3.28g，57%），为浅黄色油状物。旋光度和1HNMR表明它与上述测定的相同。测定了该化合物的1H-13C在小范围内相关。

13C NMR（CDCl3）：δ27.2（CH2），28.8（CH2），41.5（CH2），45.1（CH2），52.3（CH2），52.8（CH2），53.7（CH），57.7（CH2-N），66.7（CH2-OH），127.9（芳族 CH），128.0（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），135.2（芳族 C），136.0（芳族 C），156.0（氨基甲酸酯C＝O），170.0（酰胺C＝O），171.8（酯 C＝O）.

实例43：

L-谷氨酸γ-N-（2′-羟乙基）酰哌嗪（42）

将酰胺（41）（0.32g）用5%钯-炭（71mg）作为催化剂在HPLC级甲醇（10ml）中氢化，得到氨基酸（42）粗产物。用离子交换色谱法（Ⅱ体系，NH4形式，水然后1M氨水）部分纯化该粗混合物。大规模地重复该实验，难以得到纯的最终产物。在较高温度下，γ-羟乙基酰哌嗪很不稳定，结果得到的是难以分离的分解产物混合物。

1HNMR（D2O）：δ2.06（2Hddd J＝6.6，7.0，7.1，β质子），2.60（8Hm含有2g质子、4个哌嗪环质子和2个N-CH2质子），3.57（4Hm含有4个哌嗪环质子），3.65（1Ht，J＝6.6 α质子），3.73（2H，t J＝6.0 CH2-OH质子）

13C NMR（D2O）：δ26.9（CH2），29.9（CH2），39.9（2 x CH2），43.5（2 x CH2），52.7（CH2），55.3（CH），59.4（CH2），174.0（酰胺 C＝O），175.2（酸 C＝O）.

实例44

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-酰吗啉（43）

将α-苯甲酯（7）（1.80g，4.84mmol）溶解在THF（15ml）中，在THF（5ml）中与三乙胺（0.74ml，5.3mmol）、氯甲酸乙酯（0.51ml，5.3mmol）和吗啉（0.51ml，6.0mmol）反应。用通用方法处理，并将粗产物重结晶（乙醚/汽油1∶1），得到纯化合物（43）（1.81g，85%），为白色固体物，m.p.62-65℃，〔α〕20D为-10.40（C＝10.58，DCM）

1H NMR（CDCl3）：δ2.04（1H m），2.27（3H m），3.26（2H m），3.58（6H m），4.40（1H m），5.15（4H m），5.73（1H bd J＝7.2），7.34（10H m）

13C NMR（CDCl3）：δ27.4（CH2），28.7（CH2），42.0（CH2），45.6（CH2），53.7（CH），66.4（CH2），66.7（CH2），66.9（CH2），67.2（CH2），128.1（芳族 CH），128.2 （芳族  CH），128.4（芳族  CH），128.5（芳族  CH），128.6（芳族  CH），135.3（芳族  C），135.4（芳族  C），156.0氨基甲酸酯C＝O），170.3（C＝O），171.8（C＝O）.

实例45

L-谷氨酸γ-酰吗啉（44）

方法A：催化氢化

将酰吗啉（43）（2.42g，5.49mmol）用10%钯-炭（242mg）作为催化剂在HPLC级甲醇（30ml）中氢化，得到氨基酸（44）粗产物，为白色固体物，用水/丙酮（1∶2）（1.175g，92%）重结晶，m.p.166-169℃，t.l.c.（纤维素，70%乙醇/水）测出Rf为0.61，有少量L-谷氨酸（Rf为0.69）杂质，〔α〕20D为-0.8（C＝10.0，甲醇）。

1H NMR（D2O）：δ2.12（2H m），2.60（2H t），3.57（4H t），3.74（5H m）.

13C NMR（D2O）：δ28.24（CH2），32.06（CH2），44.62（2 x CH2），48.32（CH2），56.52（CH），68.68（2x CH2），175.16（酸 C＝O），176.35（酰胺 C＝O）.

方法B：在甲醇中转移氢化

将酰吗啉（43）（223mg，0.5mmol）溶解在无水乙醇（10ml）中，向该溶液加入10%钯-炭（24mg）和环己-1，4-二烯（480μl，10eq.）。在室温和干燥氮气下，将反应混合物搅拌1小时。然后，过滤混合物，用水洗涤该木炭。在真空下除去溶剂，得到氨基酸（44），由t.l.c.（纤维素，乙醇70%/水30%）测定为单一产物。

实例46

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-O-甲基异羟肟酸（45）

将0-甲基羟胺盐酸化物（5g）溶解在蒸馏的吡啶（10ml）中，并在70℃下蒸馏。在-78℃下，收集蒸馏物，它含有大量的吡啶和游离0-甲基羟胺。

将α-苯甲酯（7）（5.0g，13.4mmol）溶解在THF（30ml）中，并与三乙 胺（1.42g，1.94ml，14.8mmol）、氯甲酸乙酯（1.52g，1.34ml，14.8mmol）和0-甲基羟胺蒸馏产物在吡啶中反应。将混合物搅拌1小时，然后，在真空下除去溶剂，用t.l.c.（80%乙醚/汽油）测定得到的是三种产物的混合物。用色谱法（硅胶，50%乙醚/汽油，再用80%乙醚/汽油）纯化，得到所需产物（45），为白色结晶固体物（4.15g，77%），m.p.143-145℃，〔α〕20D为-8.01（C＝11.67，氯仿）。其它组分鉴定是起始酯（7）和0-甲羟胺的氨基甲酸乙酯。

1H NMR（CDCl3）（45）：δ2.19（4H m β和γ质子），3.69（3H s CH3），4.36（1H m α质子），5.08（2H s 苄基 CH2），5.15 5.19（2H AB 苄基 CH2），7.31（10H m 芳族）.

13C NMR（CDCl3），（45）：δ28.6（CH2），29.2（CH2），53.4（CH），64.2（CH3），67.2（CH2），67.4（CH2），128.0（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.0（芳族 C），135.9（芳族 C），156.5氨基甲酸酯C＝O），169.8（C＝O），171.6（C＝O）.

实例47

L-谷氨酸γ-0-甲基异羟肟酸（46）

将保护的0-甲基异羟肟酸（45）（3.4g）用10%钯-炭（400mg）作为催化剂在甲醇（50ml）中氢化2小时。过滤所得混合物，用热水（3×5ml）洗去该木炭，得到原产物（46）。真空下除去溶剂，得到氨基酸（46），为吸湿的白色固体物（1.35g，90%），〔α〕20D为+9.20（C＝9.87，H2O/HCl 1滴）。

1H NMR（D2O/DCl）：δ2.23（2H m），2.44（2H m），3.58（3H s），3.75（1H t J＝7.1）.

13C NMR（D2O/DCl）：δ26.4（CH2），28.7（CH2），54.4（CH），64.5（CH3），171.2（C＝O），174.1（C＝O）.

实例48

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-硫代乙酰胺（47）

将α-苯甲酯（7）（4.67g，12.6mmol）溶解在无水THF（40ml）中，并冷却至5℃。该溶液与三乙胺（3.82g，5.30ml，36mmol）反应，然后与氯甲酸乙酯（1.63g，1.44ml，14mmol）反应，再与氯甲酸乙酯（1.63g，1.44ml，14mmol）反应，并搅拌5分钟。此后，加入2-硫代乙胺盐酸化物固体（1.7g，14mmol），将混合物搅拌4小时。真空除去溶剂，得到粗产物，然后在二氯甲烷（50ml）中再溶解，用水（2×40ml）洗涤。用二氯甲烷（70ml）再提取该水性提取物，合并有机提取物，用硫酸钠干燥，再在真空下除去溶剂。将粗产物用色谱法（硅胶，95%乙醚/汽油，100%乙醚和5%甲醇/氯仿）纯化，得到所需产物（47），为蜡状白色固体物（3.7g，74%），m.p.95-97℃，〔α〕20D为-5.24（C＝12.40，二氯甲烷）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.00（2H m），2.24（2H m），2.73（2H t J＝6.3），3.46（2H ddd J＝6.3，6.3，6.5），4.35（1H m），5.06（2H s），5.09 5.13（2H AB），5.90（1H d J＝7.9 NH 质子），6.62（1H t J＝6.5 SH质子），7.31（10H m 芳族）.

实例49

L-谷氨酸γ-2′-硫代乙酰胺（48）

将2′-硫代乙酰胺（199mg）的无水液氨（50ml）溶液用10%钯-炭（98mg）作为催化剂氢化4小时。然后，让氨蒸发掉，所得混合物悬浮在甲醇中。用硅藻土垫过滤甲醇（5ml）悬浮物，然后用水（5ml）洗涤。真空下除去溶剂，得到起始酰胺和所需氨基酸（48）的混合物。该粗混合物溶解在氯仿（5ml）中，用水（2×5ml）提取，冷冻干燥水溶液提取物，得到氨基酸（48）（28mg）。真空下从有机层除去溶剂，得到未反应的起始酰胺（49）（159mg）。

实例50

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-甲氧乙酰胺（49）

将α-苯甲酯（7）（4.11g，11.07mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶液中加入三乙胺（1.80ml，12.17mmol），氯甲酸乙酯（1.30ml，12.17mmol）和2-甲氧乙胺（1.0g，12.4mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌3小时。然后，用t.l.c.（硅胶;5%汽油/乙醚）测定反应已完成。用通用方法处理，将粗产物重结晶（50%乙醚/汽油），得到化合物（49），为结晶固体物（4.91g，99%），m.p.80-84℃，〔α〕20D为-5.5（C＝8.86，二氯甲烷）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.99（2H m）2.21（2H m）3.33（3H s），3.36（4H bt J＝5.4），4.40（1H m），5.10 5.16（4H m），5.75（1H d J＝7.6），7.34（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ28.3（CH2），32.2（CH2），39.2（CH2），53.6（CH），58.7（CH3），67.0（CH2），67.3（CH2），70.9（CH2），128.1（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.0（芳族 C），135.5（芳族 C），156.2氨基甲酸酯C＝O），169.5（C＝O），170.8（C＝O）.

实例51

L-谷氨酸γ-2′-甲氧乙酰胺（50）

将γ-甲氧乙酰胺（49）（2.51g）在10%钯-炭（264mg）催化剂存在下，在甲醇（20ml）中氢化。用通用方法处理该混合物。用水/甲醇（1∶1）重结晶后，得到氨基酸（50）（1.19g，96%），为白色结晶固体物，m.p.183-185℃，〔α〕20D为+1.6（C＝6.96，H2O），〔α〕 为+17.7（C＝6.96，H2O），Rf为0.30（纤维素，正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10），Rf为0.56（硅胶，70%乙醇/水）。

1H NMR（D2O）：δ2.12（2H m），2.42（2H m），3.35（3H s），3.38（2H t J＝6.2），3.55（2H t J＝6.2），3.75（1H t J＝6.9）.

13C NMR（D2O）：δ27.8（CH2），32.9（CH2），40.3（CH2），55.6（CH），59.4（CH3），71.7（CH2），175.4（C＝O），176.2（C＝O）.

实例52

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-氯乙酰胺（51）

将2′-羟乙酰胺（27）（3.89g，9.39mmol）溶解在二氯甲烷（30ml）中，向该溶液加入三乙胺（1.85ml，12.5mmol）、二甲氨基吡啶（DMAP）（132mg，11mol%）和甲磺酰氯（1.08ml，12.5mmol），并将混合物在5℃温度下搅拌3小时。使反应混合物暖至室温，然后，搅拌2天。用通用方法处理，用色谱法（硅胶，10%汽油/乙醚，10%汽油/乙酸乙酯，100%乙酸乙酯）纯化，得到白色固体物，用重结晶（50%氯仿/四氯化碳）再进一步纯化，得到化合物（51）（2.05g，56%），为结晶固体物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.98（1H m），2.19（3H m），3.55（4H m），4.42（1H m），5.06 5.16（4H 2 x AB's），5.65（1H d J＝7.8），7.34（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ28.5（CH2），32.2（CH2），41.3（CH2），43.7（CH2），53.5（CH），67.1（苄基 CH2），67.3（苄基 CH2），128.1（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），131.5（芳族 C），136.0（芳族 C），153.2氨基甲酸酯C＝O），171.7（酰胺C＝O），173.1（酯 C＝O）.

实例53

L-谷氨酸γ-2′-氯乙酰胺（52）

将2′-氯乙酰胺（51）（2.04g）用10%钯-炭（226mg）作为催化剂在甲醇（30ml）中氢化。用通用方法处理该混合物，得到氨基酸（52）（843g，100%）

1H NMR（D2O）：δ2.16（2H m），2.46（2H m），3.54（2H t J＝5.6），3.66（2H t J＝5.6），3.84（1H t J＝6.2）.

13C NMR（D2O）：δ27.7（CH2），32.9（CH2），42.6（CH2），44.6（CH2），55.1（CH），174.7（C＝O），176.2（C＝O）.

实例54

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-羟基酰苯胺（53）

将α-苯甲酯（7）（3.95g，10.64mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶 液加入三乙胺（1.63ml，12mmol）、氯甲酸乙酯（1.11ml，12mmol）和2-羟苯胺（1.74g，12mmol），并将该混合物在15℃温度下搅拌3小时，然后，用t.l.c.（硅胶，10%甲醇）测定反应完成。用通用方法处理，然后将粗产物用色谱法（硅胶，100%氯仿）纯化，得到化合物（53），为白色固体物（2.29g，51%）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.97（1H m），2.34（1H m），2.46（2H m），4.48（1H m），5.10 5.16（4H 2 x AB's），5.73（1H d J＝6.2），6.8-7.3（14H m）.

实例55

L-谷氨酸γ-2′-羟酰苯胺（54）

将2′-羟酰苯胺（53）（1.54g）用10%钯-炭（300mg）作为催化剂在甲醇（30ml）中氢化。用通用方法处理该混合物，用氯仿提取水溶液，得到冷却干燥的氨基酸（54）（0.73g，93%）

1H NMR（D2O）：δ2.24（2H m），2.67（2H m），3.93（1H t J＝6.3），6.97（2H m），7.18（1H m），7.36（1H m）.

实例56

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-3′-氯酰苯胺（55）

将α-苯甲酯（7）（3.81g，10.25mmol）溶解在THF（45ml）中，向该溶液加入三乙胺（1.57ml，12mmol）、氯甲酸乙酯（1.11ml，12mmol）和3-氯苯胺（1.29ml，12mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌1小时。然后，用t.l.c.（硅胶，10%甲醇）测定反应完全。用通用方法处理，得到化合物（55），为浅黄色油状物（5.20g，96%），〔α〕20D为-6.2（C＝8.54，氯仿）。 1H NMR（CDCl3）：δ1.85-2.02（2H m），2.33（2H m），4.43（1H m），5.10 5.16（4H 2 x AB's），5.69（1H d J＝8.0），7.04-7.66（14H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ29.3（CH2），33.4（CH2），53.4（CH），67.4（CH2），67.6（CH2），117.6（芳族 CH），119.7（芳族 CH），124.1（芳族 CH），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），129.8（芳族 CH），134.1（芳族 C），134.3（芳族 C），135.8（芳族 C），138.2（芳族 C），156.2氨基甲酸酯C＝O），170.1（酰胺C＝O），172.9（酯 C＝O）.

实例57

L-谷氨酸γ-3′-氯酰苯胺（56）

将保护的γ-3′-氯酰苯胺（55）（1.0g）用10%钯-炭（101mg）作为催化剂在甲醇（20ml）中氢化1.5小时。过滤所得混合物，并用热水（3×5ml）洗去炭，回收到产物（56）。真空下除去溶剂，得到氨基酸（56）（280mg，52%），为吸湿的白色固体物，〔α〕20D为+7.10（C＝10.2，水）。用t.l.c.（纤维素，正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10，产物的Rf为0.62，谷氨酸的Rf为0.20）测定还有少量的谷氨酸（大约5%），用少量热水（大约500ml）洗涤除去。

1H NMR（D2O/DCl）：δ2.19（2H m），2.61（2H m），3.99（1H t J＝6.7），7.02-7.17（3H m），7.66（1H s）.

实例58

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-4′-氯酰苯胺（57）

将α-苯甲酯（7）（4.16g，11.20mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶液中加入三乙胺（1.72ml，12.3mmol）、氯甲酸乙酯（1.18ml，12.3mmol）和4-氯苯胺（1.79g，14mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌1小时。然后，用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油）测定反应完成。用通用方法处理，真空除去溶剂，得到化合物（57）（5.21g，93%），为结晶固体物，m.p.〔α〕20D为-5.21（C＝12.0，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.99（1H m），2.30（3H m），4.43（1H m），5.11 5.16（4H 2 x AB's），5.63（1H d J＝8.0），7.22-7.48（14H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ29.4（CH2），33.6（CH2），53.4（CH），67.3（CH2），67.6（CH2），121.0（芳族 CH），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.7（芳族 CH），128.9（芳族 CH），129.0（芳族 CH），134.9（芳族 C），135.8（2 x 芳族 C），136.6（芳族 C），156.7氨基甲酸酯C＝O），170.2（酰胺C＝O），171.6（酯 C＝O）.

实例59

L-谷氨酸γ-4′-氯酰苯胺（58）

将保护的4′-氯酰苯胺（57）（2.00g）用10%钯-炭（186mg）作为催化剂在甲醇（10ml）和乙酸乙酯（5ml）中氢化。用通用方法处理该混合物，用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水）纯化，得到氨基酸（58）（1.01g，94%），为无色油状物。〔α〕20D为-7.1（C＝9.10，水）。

1H NMR（D2O）：δ2.22（2H m），2.65（2H m），3.83（1H t J＝6.2），7.25（2H m），7.43（2H m）.

实例60

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-酰哌啶（59）

将α-苯甲酯（7）（5.30g，14.27mmol）溶解在THF（30ml）。向该溶液中加入三乙胺（2.30ml，15mmol）、氯甲酸乙酯（1.60ml，15mmol）和哌啶（1.60ml，15mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌3小时。然后，用t.l.c.（硅胶，100%乙醚）测定反应完成。用通用方法处理，粗产物用色谱法（硅胶，100%氯仿）纯化，得到化合物（59），为黄色油状物（5.37g，86%），用t.l.c.（硅胶，100%氯仿，Rf为0.16;25%乙酸乙酯/汽油，Rf为0.50）测定为均匀物，〔α〕20D为-8.46（C＝13.5，氯仿）。 1H NMR（CDCl3）：δ1.41·1.54（6H bm），2.04（1H m），2.17（1H m），2.29（2H m），3.18（2H m），3.44（2H m），4.36（1H m），5.06 5.14（4H 2AB's），6.14（1H d J＝7.5），7.29（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ24.1（CH2），25.1（CH2），26.9（CH2），28.7（CH2），42.4（CH2），46.0（CH2），53.6（CH），66.3（苄基 CH2），66.7（苄基 CH2），127.6（芳族 CH），127.8（芳族 CH），127.9（芳族 CH），128.0（芳族 CH），128.2（芳族 CH），135.1（芳族 C），136.1（芳族 C），155.9氨基甲酸酯C＝O），169.5（酰胺 C＝O），171.7（酯 C＝O）.

实例61

L-谷氨酸γ-酰哌啶（60）

将γ-酰哌啶（59）（4.03g）用10%钯-炭（430mg）作为催化剂在甲醇（20ml）中氢化。4小时后，用通用方法处理该反应混合物，得到氨基酸（60）（1.68g，85%），用t.l.c.（硅胶;70%乙醇/水，Rf为0.65;纤维素，正丁醇/吡啶/0.4%乙酸水溶液，22∶10∶10，Rf为0.50）测定为均匀物，m.p.162-162.5℃，〔α〕20D为-2.24（C＝15.6，甲醇），〔α〕20D为+1.92（C＝11.5，水）。

1H NMR（D2O）：δ1.33（6H m），1.91（2H dt J＝7.4，6.1），2.40（2H t J＝7.4），3.29（4H m），3.57（1H t J＝6.1）.

13C NMR（D2O）：δ23.6（CH2），25.2（CH2），25.8（CH2），26.0（CH2），28.9（CH2），43.4（CH2），47.1（CH2），54.1（CH），171.9（C＝O），173.9（C＝O）.

实例62

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-3′-羟酰哌啶（61）

将α-苯甲酯（7）（8.53g，22.96mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶液中加入三乙胺（3.60ml，25.5mmol）、氯甲酸乙酯（2.40ml，25.5mmol）和3-羟哌啶（2.65g，26mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌5小时。然后，用t.l.c.（硅胶，100%乙醚）测定反应完成。用通用方法处理，用色谱法（硅胶，100%乙醚，100%乙酸乙酯）纯化该粗产物，得到化合物（61），为无色油状物（8.70g，83%），用t.l.c.（硅胶，100%乙酸乙酯， Rf为0.11）测定为均匀物，〔α〕20D为-3.24（C＝10.5，氯仿）。1HNMR谱表明，产物（61）是两种非对映体的混合物。用HPLC法（硅胶，10%汽油/乙酸乙酯）没能将两种异构体分开。

1H NMR（CDCl2）：δ1.3-2.2（8H 复合 m），3.1-3.7（5H 复合 m），4.42（1H m），5.08 5.16（4H 2 x AB's），5.8（1H bs），7.34（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ21.5和22.7（CH2比 1∶1），27.5（CH2β碳），28.9（CH2γ碳），31.8和32.3（CH2比 1∶1），42.3和45.7（CH2比 1∶1），48.7和52.1（CH2比 1∶1），53.7（CH α碳），65.6和65.9（CH-OH比 1∶1），66.9（苄基 CH2），67.2（苄基 CH2），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.3（芳族 C），136.2（芳族 C），156.8氨基甲酸酯C＝O），170.7（酰胺 C＝O），172.0（酯 C＝O）.

实例63

L-谷氨酸γ-3′-羟酰哌啶（62）

将γ-3′-羟酰哌啶（61）（7.30g）用10%钯-炭（800mg）作为催化剂在甲醇（20ml）中氢化。5小时后，将反应混合物用通用方法处理，得到氨基酸（62）（3.49g，95%），用t.l.c.（硅胶;70%乙醇/水，Rf为0.62;纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10，Rf为0.26）测定为均匀物，m.p.151-152℃，〔α〕20D为-4.00（C＝10.96，水），由选择性地偶合来确定质谱中化学位移的情况。

1H NMR（D2O）：δ1.4-2.0（4H 复合 m），2.11（2H dt J＝6.7，6.6），2.61（2H t J＝6.7），3.2-3.95（6H复合 m）.

13C NMR（D2O）：δ22.5和23.5（CH2），27.4（CH2），30.2（CH2），32.2和32.5（CH2），44.0和47.4（CH2），49.4和53.3（CH2），55.4（CH），66.9和67.0（CH-OH），174.1（酰胺 C＝O），175.2（酸 C＝O）.

实例64

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-〔1-（4-甲基哌嗪基）〕酰胺（63）

将α-苯甲酯（7）（5.80g，15.60mmol）溶解在THF（40ml）中。向该溶液中加入三乙胺（2.45ml，17.1mmol）、氯甲酸乙酯（1.70ml，17.1mmol）和1-氨基-4-甲基哌嗪（2.14ml，17.1mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌16小时。这时，在反应釜中出现了沉淀。将反应混合物用通用的方法处理，得到粗产物（63），将该粗产物用重结晶（50%氯仿/四氯化碳）进一步纯化，得到化合物（63），为结晶固体物（6.96g，95%），用t.l.c.（硅胶，5%甲醇/氯仿，Rf为0.30）测定为均匀物，m.p.174℃〔α〕20D为-6.00（C＝11.0，氯仿）。在氯仿和吡啶中1H和13C NMR实验都表明溶液中存在有哌嗪的两种主要构象。

1H NMR（CDCl3）：δ2.21 and 2.25（3H CH3N-甲基比 2∶1），1.92，2.79（12H 复合 m），4.39（1H m α质子），5.09 5.14（4H 2 x AB's 苄基 质子），5.84（1H d J＝7.3NH 质子），7.33（10H m 芳族 质子）.

13C NMR（CDCl3）：δ26.7和28.6（β CH2比 2∶1），28.1和30.9（g CH2比 2∶1），45.6（CH3N-甲基），53.5和53.9（α CH 比 2∶1），54.1（CH2），54.3（CH2），55.3（CH2），56.2（CH2），66.8和67.3（苄基 CH2），67.0（苄基 CH2），128.0（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.1（芳族 C）136.2（芳族 C），156.1和156.3氨基甲酸酯C＝O比 2∶1），169.1和171.7（酰胺C＝O比 2∶1），171.9和174.9（酯 C＝O比 2∶1）.

1H NMR（D5-哌啶）：δ2.10和2.12（2s，总 3H，比 1∶2，甲基 质子），2.42-3.04（12H m），4.90和4.95（2m，总 1H，比 1∶2，α 甲基），5.26（4H m，苄基质子），7.28（10H m，芳族 质子），8.43（1H t J＝6.8，α NH质子）.

13C NMR（D5-哌啶）：δ27.41和28.09（β CH2比 2∶1），28.86和31.30（γCH2比 2∶1），45.65和45.77（N-甲基 CH1比 2∶1），54.99（CH2），55.00（CH2），55.07（2 x CH2），56.32（αCH），66.55（苄基 CH2），66.83（苄基 CH2），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.7（芳族 CH），128.8（芳族 CH），136.6（芳族 C），137.6（芳族 C）， 157.4氨基甲酸酯C＝O），169.5和172.9（酰胺  C＝O比  2∶1），173.1和174.8（酯C＝O比  2∶1）.

实例65

L-谷氨酸γ-〔1-（4-甲基哌嗪基）〕酰胺（64）

将γ-〔1-（4-甲基哌嗪基）〕酰胺（63）（3.04g）用10%钯-炭（322mg）作为催化剂在甲醇（20ml）中氢化。3小时后，将反应混合物用通用方法处理，得到氨基酸（64）（1.56g，98%），用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水，Rf为0.10;纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10，Rf为0.05）测定是均匀物，m.p.190-192℃，〔α〕20D-5.76（C＝8.2，水）。

1H NMR（D1O）：δ2.09（2H m β质子），2.33（2H mg 质子），2.38（3H s N·甲基），2.75（4H m），2.87（4H m），3.70（1H mα质子）.

13C NMR（D2O）：δ27.9（CH2），31.2（CH2），45.2（CH3N-甲基），54.3（2 x CH2），54.6（2 x CH2），55.5（CH），173.2（酰胺 C＝O），175.8（酸 C＝O）.

实例66

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（4-吗啉代）酰胺（65）

将α-苯甲酯（7）（4.04g，10.87mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶液中加入三乙胺（1.70ml，12.0mmol）、氯甲酸乙酯（1.13ml，12.0mmol）和4-氨基吗啉（1.19ml，12.0mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌2小时。此时，在反应釜中出现沉淀。用通用方法处理，将粗产物用色谱法（硅胶，15%乙酸乙酯/汽油）纯化，得到化合物（65），用重结晶（50%氯仿/四氢化碳）进一步纯化，得到化合物（65），为结晶固体物（3.16g，64%），用t.l.c.（硅胶，10%汽油/乙酸乙酯+1滴乙酸，Rf为0.22）测定为均匀物，m.p.150-151℃，〔α〕20D为-3.80（C＝10.4，氯仿）。在300K 和325K的1H和13C NMR试验表明溶液中存在有吗啉环的两种主要构型。

1H NMR（CDCl3）：δ2.02（m），2.13（3H m），2.52（m），2.75（5H m），3.63（bs），3.73（4H t J＝），4.39（1H ddd J＝），5.08 5.14（4H AB's），5.91（1H dd J＝），6.91（1H bs），7.04（1H bs），7.32（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ26.5和28.3（CH2比 3∶2），28.0和30.8（CH2比3∶2），53.4和53.8（CH比 2∶3），55.2和56.4（CH2比 2∶3），66.1（苄基 CH2），66.2（苄基 CH2），66.7和66.9（CH2比 2∶3），67.0和67.2（CH2比 3∶2），127.9（芳族 CH），128.0（芳族 CH），128.1（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），135.0和135.2（芳族 C比 2∶3），135.9和136.1（芳族 C比 2∶3），155.9和156.3氨基甲酸酯C＝O比io 3∶2），169.2和171.6（酰胺 C＝O比3∶2），171.9和175.1（酯 C＝O比 3∶2）.

实例67

L-谷氨酸γ-（4-吗啉代）酰胺（66）

将γ-（4-吗啉代）酰胺（65）（1.97g）用10%钯-炭（222mg）作为催化剂在甲醇（20ml）中氢化。2.5小时后，将反应混合物用通用方法处理，得到氨基酸（66）（991mg，99%），用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水，Rf为0.63;纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10，Rf为0.15）测定为均匀物，m.p.200℃，〔α〕20D为-2.31（C＝10.2，水）。

1H NMR（D2O）：δ2.11（2H ddd J＝6.9，7.1，7.2β质子），2.33（2H mg 质子），2.83（4H t J＝3.8），3.75（1H t J＝6.9α质子），3.80（4H t J＝3.8）.

13C NMR（D2O）：δ27.6（CH2），31.3（CH2），55.5（CH），56.2（2 x CH2），67.4（2 x CH2），173.3（酰胺 C＝O），175.3（酸 C＝O）.

实例68

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′-氟乙酰胺（67）

将α-苯甲酯（7）（2.50g，6.70mmol）溶解在THF（30ml）中，向该溶液中加入三乙胺（1.03ml，7.40mmol）、氯甲酸乙酯（0.65ml，7.40mmol）和2-氟乙胺盐酸化物（0.72g，7.4mmol）的三乙胺（1ml）溶液，将该混合物在15℃温度下搅拌过夜。然后，用t.l.c.（硅胶，70%乙醚/汽油）测定反应完成。用通用方法处理，将粗产物用色谱法（硅胶，70%乙醚/汽油）纯化，得到化合物（67），为结晶固体物（2.71g，91%），用t.l.c.（硅胶，70%乙醚/汽油）测定为均匀物，〔α〕20D为-9.20（C＝13.0，氯仿）。

1H NMR（CDCl3）：δ1.70（1H m），2.00（1H m），2.22（2H m），3.46（1H m），3.55（1H m），4.37（2H m CH2-F），4.53（1H m），5.09 5.17（4H 2 x AB's苄基 质子），5.69（1H bs NH 质子），6.11（1H bs NH 质子），7.34（10H m 芳族质子）

13C NMR（CDCl3）：δ28.4（CH2），32.2（CH2），39.8（CH2），40.1（CH2），53.5（CH），67.1（苄基 CH2），67.3（苄基 CH2），128.1（芳族 CH），128.2（芳族 CH），128.4（芳族 CH），128.5（芳族 CH），128.6（芳族 CH），135.1（芳族 C），136.1（芳族 C），156.3氨基甲酸酯C＝O），171.7（酰胺 C＝O），172.0（酯 C＝O）.

实例69

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-2′，2′，2′-三氟乙酰胺（68）

将α-苯甲酯（7）（6.10g，16.43mmol）溶解在THF（50ml）中，向该溶液加入三乙胺（2.60ml，17.8mmol）、氯甲酸乙酯（1.8ml，17.8mmol）和2，2，2-三氟乙胺（1.45ml，17.8mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌过夜。然后，用t.l.c.（硅胶，50%乙酸乙酯/汽油）测定反应完成，用通用方法处理，将粗产物用色谱法（硅胶，50%乙酸乙酯/汽油）纯化，得到化合物（68），为结晶固体物（6.81g，%），用t.l.c.（硅胶，50%乙酸乙酯/汽油）测定为均匀物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.96（1H m），2.25（3H m），3.81（2H m），5.10（s），5.17（4H m），5.65（1H d，J＝8.0），6.43（1H b），7.27（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ28.6（CH2），32.1（CH2），40.3（CH2q，J＝35.0），53.4（CH），67.2（CH2），67.4（CH2），124.0（C q，J＝293），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH），128.4（芳族 H）128.6（芳族 CH），128.7（芳族 CH），135.1（芳族 C），136.0（芳族 C），156.5氨基甲酸酯C＝O），171.6酰胺C＝O），172.1（酯 C＝O）.

实例70：

L-谷氨酸γ-2′，2′，2′-三氟乙酰胺（69）

将三氟乙酰胺（68）（3.26g）用10%钯-炭（478mg）作为催化剂在甲醇（50ml）中氢化。1.5小时后，反应混合物用通用方法处理，得到氨基酸（69）（1.65g，99%），用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水，Rf为0.70;纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸的水溶液，22∶10∶10，Rf为0.57）测定为均匀物，m.p.215℃。

1H NMR（D2O）：δ2.13（2H m），2.48（2H dt，J＝7.7，3.3），3.75（1H t，J＝6.2），3.93（2H q，J＝9.3）.

13C NMR（D2O）：δ27.6（CH2），32.7（CH2），41.8（CH2q，J＝34），55.6（CH），125.7（C q，J＝277），175.3（酰胺 C＝O），176.8（酸 C＝O）.

实例71

Z-L-谷氨酸α-叔丁酯γ-0-甲基羟肟酸酯（70）

重氮甲烷的制备（参见：Hudicky，M（1980）J.Org.Chem.，45，5377-5378）如下，将dizald（9g）的乙醚（60ml）溶液滴加到搅拌的氢氧化钾（2.8g）的水（5ml）、乙二醇单甲醚（15ml）和乙醚（10ml）的在冰浴中的溶液中。使该混合物暖至室温，然后用水浴加热至50℃，用常用方法蒸馏出重氮甲烷。自该蒸馏出的醚合的重氮甲烷中加入异羟肟酸（23）（4.0g）的乙醚（20ml）溶液，将混合物在冰浴中冷却。该混合物放置3小时，然 后，结晶化合物沉淀。过量的重氮甲烷用乙酸破坏，过滤回收结晶固体物。t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油）分析该物表明，它是起始异羟肟酸（23），这样将整个混合物再加入新的重氮甲烷，并让其在室温下放置过夜。然后，用t.l.c.（硅胶，45%乙醚/汽油，Rf为0.36，0.23，0.10）测定没有重氮甲烷，只是三种产物的混合物。除去溶剂，得到粗混合物，为浅绿色油状物（3.72g，93%）。将混合物色谱法（硅胶，45%乙醚/汽油）纯化，得到三种化合物（Rf为0.36，2.35g，59%;Rf为0.23，600mg，15%;Rf为0.10，350mg，8%）的纯样品。用NMR谱测定，最大Rf值的组分是0-甲基羟肟酸（70），最小Rf值的组分是二甲基化产物。用另一种方法（参见实例46）合成0-甲基异羟肟酸表明，在异羟肟酸的氧上不发生甲基化反应。色谱分析推论分离出的化合物是0-甲基羟肟酸。将产物（70）分离出为油状物，〔α〕20D为-7.0（C＝10.19，甲醇）。接着，重复该试验过程，得到较低产率的化合物（23）和高产率的二甲基化产物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.38（9H s）1.88（1H ddd J＝8.1，14.2，14.2）2.10（1H ddd J＝6.6，13.2，13.3）2.29（2H d AB J＝6.7，8.1）3.57（3H s）4.20（1H dd J＝7.7，12.9）5.02（2H s）5.42（1H bd J＝6）7.28（5H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ27.64（CH2）27.73（CH3）29.78（CH2）51.51（CH3）53.63（CH）66.68（CH2）82.11（C）127.89（芳族 CH）128.27（芳族 CH）136.13（芳族 C）155.78氨基甲酸酯170.78（亚胺）172.98（酯）.

少量组分（Rf为0.23）：0，0-二甲基化的

1H NMR（CDCl3）：δ1.46（9H s）1.97（1H m）2.06（1H m）2.38（2H m）3.62（3H s）3.71（3H s）4.29（1H dd J＝7.4，12.8）5.01（2H s）5.69（1H bd J＝6）7.33（5H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ22.93（CH2）27.61（CH3）27.72（CH2）53.76（CH3）53.85（CH）61.20（CH3）66.46（CH2）81.74（C）127.75（芳族 CH）128.17（芳族 CH）136.21（芳族 C）155.64氨基甲酸酯163.65（亚胺）1/0.80（酯）.

少量组分（Rf为0.10）：O，N-二甲基化的

1H NMR（CDCl3）：δ1.43（9H s）1.96（1H m）2.15（1H m）2.47（2H m）3.12（3H s）3.59（3H s）4.26（1H m）5.06 5.09（2H AB）5.65（1H bd J＝6.5）7.31（5H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ22.10（CH2）27.33（CH3）31.63（CH2）53.41（CH）53.62（CH3）60.52（CH3）66.16（CH2）81.49（C）127.43（芳族 CH）127.84（芳族 CH）135.85（芳族 C）155.45氨基甲酸酯170.64（亚胺）172.82（酯）.

实例72

Z-L-谷氨酸γ-0-甲基羟肟酸酯（71）

在0℃温度下，将完全保护的羟肟酸（70）（2.10g，5.73mmol）溶解在TFA（9ml）中。反应混合物搅拌1小时，用t.l.c.（硅胶，80%乙醚/汽油）测定。然后，在约20℃和真空下除去TFA，得到的产物用乙醚/汽油（60∶40）重结晶，得到纯化合物（71）（1.73g，98%）。

1H NMR（CDCl3）：δ2.04（1H dddd J＝7.0，7.4，8.0，14.5）2.25（1H dddd J＝5.0，7.0，7.7，14.5）2.46（2H ddddd J＝1.0，7.0，7.4，7.7，8.0）3.66（3H s）4.43（1H ddd J＝1.0，5.0，7.0）5.11（2H s）5.53（1H d J＝7.7）5.94（1H b）7.30（5H m），All couplings were conflrmed by decoupling experiments.

13C NMR（CDCl3）：δ27.28（CH2）30.03（CH2）51.96（CH3）53.19（CH）67.27（CH2）128.13（芳族 CH）128.28（芳族 CH）128.56（芳族 CH）135.96（芳族 C）156.19氨基甲酸酯173.53（亚胺）175.60（酸）.

实例73

L-谷氨酸γ-0-甲基羟肟酸酯（72）

将游离酸（71）（1.45g，4.69mmol）溶解在甲醇（18ml）中，并加入10% 钯-炭（145mg）。在室温下，将该混合物用常用方法氢化1小时后，全部起始物已参加反应。过滤氢化的混合物，用水（2×10ml）洗涤固体物。从合并的洗涤液和过滤液中除去溶剂，得到粗产物。用沸腾的甲醇重结晶，得到纯氨基酸（72）（670mg，82%），为白色结晶固体物，m.p.186-187℃，〔α〕20D为+9.82（C＝12.46，H2O）。

1H NMR（D2O/DCl）：δ2.01（2H ddddd J＝1.5，2.0，6.3，7.2，7.9）2.43（2H dddd J＝1.5，2.0，7.2，7.9）3.56（3H s）3.62（1H t J＝6.3）.

所有偶合化均由去偶合试验确定

13C NMR（D2O）：δ24.30（CH2）28.56（CH2）51.21（CH3）52.81（CH）172.71（亚胺）174.18（酸）.

实例74

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（2′-吡啶基）甲酰胺（73）

将α-苯甲酯（7）（7.87g，21.19mmol）溶解在THF（100ml）中、向该溶液中加入三乙胺（5.91ml，42.4mmol）、氯甲酸乙酯（2.22ml，23.4mmol）和2-氨甲基吡啶（2-吡啶甲基胺）（2.40ml，23.4mmol），并在15℃温度下搅拌该混合物过夜。然后，用t.l.c.（硅胶，乙酸乙酯）测定，反应完成。用通用方法处理，将粗产物用色谱法（硅胶，乙醚400ml，乙酸乙酯500ml，10%甲醇/氯仿500ml）纯化，得到化合物（73），为结晶固体物（9.57g，98%），用t.l.c.（硅胶，100%乙酸乙酯）测定为均匀物，m.p.132-134℃。用CDCl3进行NMR谱记录试验，结果该化合物分解。

1H NMR（CD2OD）：δ2.0-2.35（2H m），2.39（2H m），4.35（1H dd J＝4.2，4.3），4.43（2H s），5.02-5.09（4H AB 体系），7.36（12H m），7.74（1H m），8.42（1H d J＝7.4）.

13C NMR（CD3OD）：δ27.9（CH2），32.0（CH2），43.4（CH2），53.6（CH），66.9（CH2），67.2（CH2），123.0（杂芳族 CH），123.3（杂芳族 CH），128.1（芳族 CH），128.3（芳族 CH）128.4（芳族 CH），128.6（芳族 CH），139.0（芳族 C），146.7（杂芳族 CH），156.5氨基甲酸酯C＝O），171.6酰胺C＝O），172.1（酯 C＝O）.

实例75

L-谷氨酸γ-（2′-吡啶基）甲酰胺（74）

将2-氨甲基吡啶酰胺（73）（4.76g）用10%钯-炭（650mg）作为催化剂在甲醇（50ml）中氢化。24小时后，将反应混合物用通用方法处理，得到氨基酸（74）（2.43g，99%），用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水，Rf为0.60;纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸水溶液，20∶10∶10，Rf为0.38）测定为均匀物，m.p.185-189℃。

1H NMR（D2O）：δ2.17（2H m），2.53（2H m），3.80（1H t，J＝6.2），4.42（2H d J＝7.4），7.31（2H m），7.77（1H m），8.39（1H d J＝7.3）.

13C NMR（D2O）：δ27.8（CH2），32.9（CH3），45.7（CH2），55.6（CH），123.2（杂芳族 CH），124.5（杂芳族 CH），139.8（杂芳族 CH），149.8（杂芳族 CH），157.8（杂芳族 C），175.4（酰胺 C＝O），176.3（酸 C＝O）.

实例76

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-丙-2-烯基酰胺（烯丙基酰胺）（75）

将α-苯甲酯（7）（3.33g，8.90mmol）溶解在THF（50ml）中，向该溶液中加入三乙胺（1.24ml，9.0mmol），氯甲酸乙酯（0.86ml，9.0mmol）和烯丙胺（0.68ml，9.0mmol），将该混合物在15℃温度下搅拌过夜。然后，用t.l.c.（硅胶，乙酸乙酯）测定反应完成。用常用方法处理，用色谱法（硅胶，80%乙醚/汽油）纯化，得到化合物（75），为结晶固体物（3.31mg，85%），用t.l.c.（硅胶，100%乙醚）测定为均匀物。

1H NMR（CDCl3）：δ2.0-2.18（4H m），3.80（2H ddd J＝5.7，5.5，2.7），4.38（1H m），5.08-5.20（6H m），5.77（1H dddd J＝16.1，10.6，5.7，5.5），5.89（1H bd J～5.8），6.06（1H bd J～5.5），7.32（10H m）.

13C NMR（CDCl3）：δ28.2（CH2），32.1（CH2），41.9（CH2），53.6（CH），66.9（CH2），67.2（CH2），116.3（烯属 CH2），128.0（芳族 CH），128.1（芳族 CH），128.4（芳族 CH）128.5（芳族 CH），133.9（烯属CH），135.1（芳族 C），136.1（芳族 C），156.3氨基甲酸酯C＝O），171.7酰胺 C＝O），172.1（酯C＝O）.

实例77

L-谷氨酸γ-丙酰胺（76）

将烯丙酰胺（75）（3.00g）用钯-炭（300mg）作为催化剂在甲醇（50ml）中氢化。24小时后，用常用方法处理该反应混合物，得到氨基酸（76）（1.06g），用t.l.c.（硅胶，70%乙醇/水，纤维素;正丁醇/吡啶/0.4%乙酸水溶液22∶10∶10）测定为均匀物，m.p.205-207℃。

1H NMR（D2O）：δ0.87（3H t J＝7.3），1.49（2H qt J＝7.3，7.0），2.11（2H dt J＝7.4，6.1），2.38（2H m），3.12（2H t，J＝7.0），3.74（1H t J＝6.1）.

13C NMR（D2O）：δ12.1（CH3），23.2（CH2），28.1（CH2），33.1（CH2），42.7（CH2），55.6（CH），175.4（酰胺 C＝O），175.9（酸 C＝O）.

实例78

Z-L-谷氨酸α-苯甲酯γ-（2′-甲磺酰氧乙基）酰胺（77）

将2′-羟乙酰胺（27）（4.45g，10.8mmol）溶解在DCM（150ml）中，向该溶液中加入三乙胺（3.03ml，21.6mmol）和甲磺酰氯（1.26ml，15.8mmol），并将混合物在25℃温度下搅拌。当加入甲磺酸氯时，溶液立即变成黄色。15分钟后，用t.l.c.（硅胶，85%乙酸乙酯/汽油）测定反应完成。在真空下除去DCM，所得油状物溶解在乙酸乙酯中。用饱和氯化钠溶液洗涤该溶液，将有机层用硫酸钠干燥。除去有机层中溶剂，得到粗产物（77），为黄色油状物。将粗产物用色谱法（硅胶，85%乙酸乙酯/汽油）纯化，得到化合物（77），为黄色油状物。将粗产物用色谱法（硅胶，85%乙酸 乙酯/汽油）纯化，得到化合物（77），为白色固体物（2.67g，62%），用t.l.c.（硅胶，85%乙酸乙酯/汽油）测定为均匀物。

1H NMR（CDCl3）：δ1.98-2.23（4H m），2.71（3H s），3.50（2H t J＝7.2），4.22（2H t J＝7.2），4.31（1H m），5.08-5.15（4H AB 体系），5.89（1H bd J＝6.0），7.33（10H m）.

实例79

二氢噁唑类似物（78）

将2′-甲磺酰氧乙酰胺（77）（872mg，1.77mmol）溶解在无水DCM（5.0ml）中，向该溶液中加入三乙胺（0.5ml，4mmol），并在室温下搅拌该溶液16小时。然后，在真空下除去溶剂，所得油状物溶解在乙酸乙酯（10ml）中。将乙酸乙酯溶液用饱和氯化钠洗涤，并用硫酸钠干燥。从该溶液中除去溶剂，得到白色固体物（689mg，98%），用t.l.c.（硅胶，85%乙酸乙酯/汽油）测定为均匀物。

1H NMR（CDCl2）：δ2.05-2.30（4H m），3.76（2H t J＝9.3），4.17（2H t J＝9.3），4.47（1H m），5.05-5.18（4H AB 体系），7.30（10H m）.

实例80-81说明本发明的多穴载片盖的结构，但是不以任何方式限制本发明。

实例80

本实例说明本发明的6穴载片盖的结构。用带有6个圆平底穴（直径为3.5cm，深为1cm）的组织培养多穴载片作为移送待检测片的基片。当组装载片后，在盖的顶部相应于每个穴的中心部位作上记号。用备 有14mm钻头的孔锯在载片盖相应于每一标记处钻6个孔（1cm的直径）。在钻孔时要仔细，以防止塑料载片盖的破碎。将每个孔插上闪烁管（Kartell，容量为4ml），插法是每个闪烁管的开口向下，闪烁管凸出在载片盖板的上表面之外。每个闪烁管露出盖板下侧的0.5cm，用腈基丙烯酸酯粘合剂（Netweork，800E100，橡胶和塑料类）粘在那里。大约24小时粘合剂自然干燥后即粘结好。图68说明的是6穴载片，图69和70说明的是6穴载片的盖。

实例81

本实例说明本发明的96穴载片盖结构。用带有96个平底穴的组织培养多穴载片（Linbro）作为移送测定载片的半底部。为了进行移送实验，96穴载片的盖板用改进的盖板代替，改进的盖板是用吸移管尖端架座（Flow）的内架制成的。这个内架有96个通道（长度约为3cm，两端开口），这个通道与组织培养载片的96个穴是完全相对应的。吸移管架还在每个转角的底部有支脚，使得96穴载片正好嵌入每个通道的下面。将吸移管架的上顶部用透明聚甲基丙烯酸甲酯按照下述方法粘结而封口。将聚甲基丙烯酸甲酯片（0.55cm厚）切成与吸移管架相同的大小，并放在吸移管架上面通道开口处。在与吸移管架的塑料上直接相接触的聚甲基丙烯酸甲酯的相应处作上光栅标记（即：在每一通道的开口周围）。将吸移架顶部突起的数字和记号锉平，以得到用于粘结的平滑表面。将粘结剂（Acrifix  92，Rohm）涂在聚甲基丙烯酸甲酯的光栅标记上，然后将吸移管架和聚甲基丙烯酸甲酯挤压一起，同时聚甲基丙烯酸甲酯上的粘结剂与吸移管架顶上通道周围的塑料一起熔融。然后放置2小时，再在紫外线下暴露2小时以固定粘结。图71和72说明了96穴载片盖，图73和74说明了与96穴载片有关的盖的情况。

对于本技术领域人员讲，可对本发明的组合物和方法进行各种改进和变化。因而，本发明包括了在本发明提供的改进和变化，它们都包 括在本发明的权利要求或其等同的文件的范围以内。

表4：根据Na+依赖性，在0.75mM谷氨酰胺浓度下摄入速度。已知主要抑制剂的性质和在谷氨酰胺缺乏介质中的活化能力或去抑制性，来将谷氨酰胺运载体分类。

组织 Na+依赖性 V0.75抑制性 去抑制性

HeLa细胞  +  31  组氨酸  -

胎儿肝  +  11.5  组氨酸  +

H35肝癌  +  7.5  组氨酸  +

肠细胞  +  11.5  丙氨酸  N.D.

牛淋巴细胞  +  5.1  丙氨酸  N.D.

克隆细胞  +  4.1  丙氨酸  N.D.

肝细胞  +  4.06  组氨酸  +

大鼠淋巴细胞  +  3.43  丝氨酸  +

肾上皮细胞膜水泡  +  1.28  苯丙氨酸，

缬氨酸  N.D.

肾的Basolateral  赖氨酸，

膜水泡  +  0.085  精氨酸  N.D.

表5：抗谷氨酰胺化合物对谷氨酰胺摄入HeLa细胞的作用。结果用在1mM谷氨酰胺存在下对照组的抑制百分数表示。

这些化合物可产生谷氨酰胺摄入的刺激作用

化合物  浓度（mM）  运输抑制作用（%）

谷氨酰胺  1.0  0

谷氨酸-γ-酰肼  1.0  90

组氨酸  1.0  50

谷氨酸-（2-羟乙基）酰胺  1.0  50

谷氨酸-γ-二乙酰胺  1.0  45

β-氯-丙氨酸  5.0  54′

重氮丝氨酸  5.0  46′

谷氨酸衍生物＊  1.0  33

谷氨酸-γ-单异羟肟酸  0.5  15

1.0  32

5.0  52

10.0  53

ACIVICIN 0.5 172

6-重氮基-5-氧代-L-

正亮氨酸  1.0  30

6-甲基巯基嘌呤核糖核苷  1.0  30

谷氨酸-γ-双（羟

乙基）酰胺  1.0  25

环化的谷氨酸-γ-

三（羟甲基）甲酰胺  1.0  16

（续）

谷氨酸-γ-（1，1-二甲

基-2-羟乙基）酰胺  1.0  10

N-CBZ-L-谷氨酰胺  1.0  10

谷氨酸-γ-2-甲氧

基-乙酰胺  1.0  10

丙氨酸  1.0  5

谷氨酸-γ-乙酰胺  1.0  5

谷氨酸-γ-甲酰胺  1.0  0

谷氨酸-γ-酰吗啉  1.0  0

合欢氨酸

N-乙酰基谷氨酰胺＊  20.0  -

谷氨酸-γ-3′-

羟基哌啶酰胺  1.0  0

鹅膏蕈氨酸＊  40μM

γ-谷氨酰基-甘氨酸  1.0  0

谷氨酸-γ-甲基异

羟肟酸  1.0  0

二硫苏糖醇

谷氨酸-γ-（3-羧基

-4-羟基）酰苯胺＊  1.0  0

L-甲硫氨酸

Sulphoximine＊5.0 -

γ-羟赖氨酸  5.0  0

表6：在0.75mM谷氨酰胺下，用不同细胞系测定谷氨酰胺摄入值。表的上部用短线将固态型肿瘤细胞与正常细胞系和悬浮培养癌细胞系分离开。表4的数据也包括在内。

细胞系  在0.75mM时谷氨酰胺摄入量

（nmol/min/mg蛋白）

HEp-2  66

MM253Cl  47.0

KB  35.0

Detroit-562  32.0

HeLa  31.0

T24  25.5

肝细胞瘤  7.5

MRCS  28.0

MOLT-3  27.0

肠细胞  11.5

胎儿肝  11.5

RBC  9.0

MOLT-4  6.5

＊牛淋巴细胞 5.1

NAMALWA  5.0

ⅡYOYE  5.0

＊人淋巴细胞 4.5

克隆细胞  4.1

肝细胞  4.06

大鼠淋巴细胞  3.43

CCRF-SB  3.2

肾上皮细胞

膜水泡  1.28

肾的Basolateral膜水泡  0.085

＊刺激

表7：在抗谷氨酰胺化合物存在下，HeLa细胞生长的抑制性。其结果用在含有0.7mM谷氨酰胺的介质199下暴露48小时后，相对于对照物的生长抑制性来表示。

化合物  浓度（mM）  生长抑制作用（%）

谷氨酰胺  0.70  0

重氮丝氨酸  0.16μM  95

氨甲蝶呤  4μM  70

6-重氮基-5-氧代-L-

正亮氨酸  0.5  65

谷氨酸-γ-单异羟肟酸  0.25  10

0.5  17

1.0  40

2.0  79

β-氯-丙氨酸  1.0  29

谷氨酸-γ-甲基异羟肟酸  1.0  22

组氨酸  1.0  15

谷氨酸-γ-酰肼  1.0  10

谷氨酸-γ-酰吗啉  1.0  10

谷氨酸-γ-二乙酰胺  1.0  10

谷氨酸-γ-对硝基酰基苯胺  1.0  4

谷氨酸-（2-羟乙基）酰胺  1.0  0

谷氨酸衍生物＊  1.0  0

谷氨酸甲酰胺  1.0  0

合欢氨酸  1.0  0

N-乙酰基谷氨酰胺  1.0  0

谷氨酸-γ-3′-羟基哌啶酰胺  1.0  0

谷氨酸-γ-2-甲氧基乙酰胺  1.0  0

鹅膏蕈氨酸-γ-谷氨酰基

-甘氨酸  1.0  0

环化的谷氨酸-γ-三（羟

甲基）甲酰胺  1.0  0

N-CBZ-L-谷氨酰胺  1.0  0

2.0  0

二硫苏糖醇  -  -

谷氨酸-γ-双（羟乙基）酰胺  1.0  0

ACIVICIN  -  -

谷氨酸-γ-（3-羧基-

4-羟基）酰苯胺  1.0  0

谷氨酸-γ-乙酰胺  1.0  0

L-甲硫氨酸Sulphoximine  -  -

丙氨酸  1.0  0

谷氨酸-γ-（1，1-二甲基-

2-羟乙基）酰胺  1.0  0

表8：同类物结合参数、运载和生长间的关系

关系

化合物  Bm  K′  运输  生长（%）

nmol/mg  （mM）  （%）

蛋白

A.高可逆结合物

1.谷氨酰胺  3.45  1.33  100  100

2.组氨酸  2.86  3.86  50  15

3.谷氨酸-γ-单异

羟肟酸  2.63  1.35  32  40

B.中等可逆结合物

1.谷氨酸-γ-酰肼  2.27  1.28  90  10

2.谷氨酸（2-羟乙基）

酰胺  1.89  4.17  50  0

3.谷氨酸衍生物21.28 0.2 33 0

C.不可逆结合物

1.β-氯-丙氨酸  0.14  4.34  54′  29

2.谷氨酸-γ-对

硝基酰基苯胺  0.136  0.136  50  4

3.重氮丝氨酸  0.21  5.0  46′  95

4.谷氨酸-γ-二

乙酰胺  0.55  10.0  45  10

5.6-重氮基-5-氧代

-L-正亮氨酸  0.375  7.1  30  65

6.Acivicin  0.14  10.7  17′  -

7.谷氨酸-γ-双

（羟乙基）酰胺  0.14  8.0  25  0

在其它位点较差结合物或不可逆结合物

1.环化的谷氨酸-γ-三

（羟甲基）甲酰胺  0.33  7.75  16  0

2.谷氨酸-γ-2-甲氧

基酰胺  1.01  5.26  10  0

3.N-CBZ-L-谷氨酸  0.25  1.18  10  0

4.谷氨酸-γ-（1，1-二甲基-2-  0.1  4.0  10  0

羟乙基）酰胺

5.谷氨酸-γ-乙酰胺  0.10  5.33  5  0

6.丙氨酸  0.017  1.82  5  0

7.谷氨酸-γ-酰吗啉  1.25  0.91  0  10

8.谷氨酸-γ-甲酰胺  1.25  0.34  0  0

9.合欢氨酸  1.15  0.58  -  0

10.N-乙酰基谷氨酰胺  1.12  1.06  0  0

11.谷氨酸-γ-3′-

羟基哌啶酰胺  1.07  5.98  0  0

12.鹅膏蕈氨酸  1.00  4.01  -  -

13.γ-谷氨酰基-甘氨酸  0.36  3.45  0  0

14.谷氨酸-γ-甲基异羟肟酸  0.35  2.51  0  22

15.二硫苏糖醇  0.24  2.5  -  -

16.γ-L-谷氨酰基-3-羧基-

4-羟基酰苯胺  0.11  0.405  0  0

17.L-甲硫氨酸Sulphoximine  0.02  1.82  -  -

注：

1.在1mM浓度的抑制剂存在下用1mM谷氨酰胺进行运输和生长抑制试验。

表9：用抗血清筛选细胞系：

抗原/抗体反应的表示是，与抗血清反应正（+）表示，不与抗血清反应负（-）表示。

细胞系  描述  抗原/抗体反应

HEp-2  ＊人喉癌  +

MM253Cl  ＊人黑素瘤  +

KB  ＊人口癌  +

Detriit-562  ＊人咽癌  +

HeLa  ＊人颈癌  +

T24  ＊人膀胱癌  +

NAMALWA  人非洲淋巴瘤  +

EB2  人非洲淋巴瘤  +

Bordin＊EB转移淋巴细胞 +

JIYOYE  人非洲淋巴瘤  -

MOLT-3  人淋巴母细胞白血病  -

MOLT-4  人淋巴母细胞白血病  -

CCRF-SB  人淋巴母细胞白血病  -

HL60  人淋巴母细胞白血病  -

CEM-C3  人淋巴母细胞白血病  -

MRCS＊正常人肺 -

RBC  正常人红血球  -

淋巴细胞  正常人  -

瑞士 3T3＊正常小鼠 -

注：

＊表示附着单层培养生长的固体型肿瘤细胞系和正常细胞系，其它的都是悬浮培养。

a.将Bordin与是接近的相当的培养型淋巴瘤在一起。

表10：用抗血清筛选细胞系与在0.75mM谷氨酰胺下谷氨酰胺摄入量的关系。抗体应答对与抗血清反应用正（+）表示，不与抗血清反应用负（-）表示。固体型肿瘤细胞系列在表的上部，淋巴瘤细胞系列在表的中部，正常和癌细胞的所有悬浮细胞系列在表的下部。

细胞系  描述  抗原/抗体反应  摄入量

（nmol/min/

mg）

HEp-2  人喉癌  +  66.0

MM253Cl  人黑素瘤  +  47.0

KB  人口癌  +  35.0

Detroit-562  人咽癌  +  32.0

HeLa  人颈癌  +  31.0

T24  人膀胱癌  +  25.5

NAMALWA  人非洲淋巴瘤  +  5.0

JIYOYE  人非洲淋巴瘤  -  5.0

MRC5  正常人肺  -  28.0

MOLT-3  人淋巴母细胞白血病-  27.0

RBC  正常人白血球  -  9.0

MOLT-4  人淋巴母细胞白血病-  6.5

淋巴细胞  人淋巴母细胞白血病-  4.5

CCRF-SB  人淋巴母细胞白血病-  3.2

表11：用于说明曲线特征的样品

运载体样品 KmVmh

1  1  0.15  20  1

2  1  0.15  20  1

2  0.75  20  1

3  1  0.03  10  1

2  0.30  20  1

3  3.00  25  1

4  1  0.15  20  4

2  1.50  20  1

5  1  0.15  20  1

2  1.50  20  4

6  1  0.15  20  4

2  1.50  20  4

7  1  0.50  20  1.5

2  2.00  50  5

8  1  0.03  10  1

2  0.15  20  2

3  1.50  25  4

表12：在与Km有关的不同浓度下的速度比和相当的h值的关系

h V0.5km/VkmVkm/V1.5kmV0.75km/VkmVkm/V1.25km

1  66.7  83  85.7  90

1.2  60.6  81  82.9  88

1.3  57.8  79.5  81.5  87

1.5  52.2  77.2  78.7  86

1.7  47  75.1  76.0  84

1.8  44.6  74.1  74.7  83

2.0  40.0  72.2  72.0  82

2.5  30.0  66.1  65.5  79

3.0  22.2  64.8  59.3  76

3.5  16.2  62.1  53.5  73

4.0  11.8  60.0  48.1  70

4.5  8.5  58.1  43.0  68

5.0  6.1  56.6  38.36  66

6.0  3.1  54.4  30.2  63

7.0  -  53.0  23.5  60

8.0  -  52.0  18.2  58

9.0  -  51.3  14.0  57

10.0  -  50.1  10.7  55

表13：对不同h值的Km/s比率

h Km/S

1  ∞

1.1  8.1

1.2  3.8

1.4  1.9

1.5  1.59

1.6  1.38

1.7  1.23

1.85  1.09

2.0  1.0

2.2  0.92

2.5  0.85

3.0  0.79

4.0  0.76

5.0  0.71

6.0  0.76

10.0  0.8

表14：丙氨酸摄入HeLa细胞的抑制作用的底物保护作用

丙氨酸摄入量

条件  （%）

对照物  100.0

NEM抑制  60.0

100mM  L-丙氨酸  84.5

100mM  D-丙氨酸  58.1

表15：10mM氨基酸对0.25mM谷氨酰胺摄入HeLa细胞的抑制作用。所得结果是4个测定值的平均±S.D.用来抑制摄入量的百分数表示。

0.25mM谷氨酰胺摄入的未抑制值是24.95±3.98fmol/细胞/min

氨基酸  摄入量

（10mM）  （对照物的%）

无  100

αAIB＊  38±6

MeAIB＊  83±8

组氨酸  25±4

天门冬酰胺  20±3

丙氨酸  17±5

丝氨酸  12±2

半胱氨酸  16±4

甲硫氨酸  18±5

甲硫氨酸砜  32±5

甲硫氨酸亚砜  42±4

谷氨酸  85±7

天门冬氨酸酯  82±11

精氨酸  72±10

赖氨酸  100±6

脯氨酸  98±7

缬氨酸  33±2

色氨酸  33±6

异亮氨酸  27±5

亮氨酸  33±4

BCH  38±2

甘氮酸  48±3

DL-2-氨基-4-膦酰基丁酸'  51±8

DL-2-氨基-4-胂羧基丁酸'  51±14

＊[AA]＝25mM

'[AA]＝5mM

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