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协调的体内基因表达

阅读：725发布：2021-06-27

专利汇可以提供协调的体内基因表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了包括DNA构建体和RNA转录本的核酸，在导入到动物组织中后，它们能够诱导两到三个顺反子的协调表达。本发明的2-或3-顺反子多核苷酸包括编码并共表达HIV基因产物的多核苷酸，编码与HIV无关的 抗原 的基因免疫刺激基因产物，所述免疫刺激基因产物包括但不限于GM-CSF，白细胞介素，干扰素和作为T-细胞共刺激因子的 蛋白质 B7族的成员。本发明方法和多核苷酸通常可用于在单个细胞内协调任何两个或多个基因的体内表达。，下面是协调的体内基因表达专利的具体信息内容。

1.在导入到哺乳动物细胞后，能够诱导细胞中至少两个基因产物的 共表达的多核苷酸，其含有：
在真核细胞中第一顺反子上游并在第一顺反子转录控制下操作的 第一转录启动子；
在第一顺反子下游的第二顺反子，其位于第一转录启动子或第二转 录启动子的转录控制下；
可任选的在第二顺反子下游的第三顺反子，其位于第一转录启动子 或第二转录启动子或第三转录启动子的转录控制下；和
在第一，第二和第三顺反子每一个之后的转录终止子。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码病原体或癌相 关抗原的至少一个致免疫表位。
3.权利要求2的多核苷酸，其中所述病原体是病毒。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所述病毒是人免疫缺损病毒 (HIV)。
5.权利要求2的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码选自env，gag， gag/pol，gag/蛋白酶，不编码功能性聚合酶的gag和部分pol，以及pol 的人免疫缺损病毒(HIV)基因。
6.权利要求1的多核苷酸，其中如果所述第一顺反子编码HIV基 因，所述第二顺反子就编码人免疫缺损病毒(HIV)REV基因，其有 效表达依赖于表达HIV基因的细胞内REV基因产物的存在。
7.权利要求6的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码选自env，gag 和pol的HIV晚期基因。
8.权利要求7的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码HIV gp160， HIV gp120，HIV gp41，没有CD4结合位点的HIV gp120和带有免疫 学改变的V3的HIVenv，改变的V3具有改变的糖基化模式或取代的 V3环顶。
9.权利要求6的多核苷酸，其中所述第三顺反子编码细胞因子或T 细胞共刺激元件。
10.权利要求9的多核苷酸，其中所述细胞因子是干扰素，GM- CSF或白细胞介素。
11.权利要求9的多核苷酸，其中所述T细胞共刺激元件是编码B7 蛋白质的基因。
12.权利要求1的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码REV非依赖 性的人免疫缺损(HIV)表位，所述第二顺反子编码细胞因子，所述 第三顺反子编码T细胞共刺激元件，其中所述各顺反子也可以以不同 的顺序存在。
13.权利要求12的多核苷酸，其中所述第二顺反子编码白细胞介 素，干扰素或GM-CSF，而第三顺反子编码B7蛋白质。
14.权利要求1的多核苷酸，其中第二顺反子和第三顺反子二者之 一受位于第一顺反子上游的转录启动子的转录控制，在第二和第三顺反 子每一个的上游提供具有内部核糖体进入位点(IRES)功能的序列， 以有效地完成第二和第三顺反子在双或三顺反子信使RNA上的翻译， 所述信使RNA是从第一顺反子的开始，经过第二和第三顺反子的每一 个，直到第二和第三顺反子之后的转录终止子转录的。
15.权利要求14的多核苷酸，其中所述IRES选自脑心肌炎病毒 (EMCV)IRES，猪水痘病毒IRES和脊髓灰质炎病毒IRES。
16.权利要求14的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码人免疫缺损 病毒(HIV)REV依赖性基因，所述第二顺反子编码REV，所述第 三顺反子编码T细胞共刺激元件或细胞因子，此外，其中所述第一顺 反子之前有一转录启动子，所述第二和第三顺反子之前均有一IRES， 没有转录启动子。
17.权利要求16的多核苷酸，其中所述第一顺反子编码HIV gp160，第一顺反子之前有一细胞肥大病毒的速发早期启动子，所述第 二顺反子编码HIV REV，可选用的第三顺反子编码干扰素，GM- CSF，白细胞介素或B7蛋白质。
18.一种多核苷酸，其含有不能在真核细胞中复制，但在将所述多 核苷酸导入到真核组织后，能够体内表达以生产基因产物的相邻核酸序 列，其中所述基因产物作为一种免疫刺激剂或作为能够产生免疫应答的 抗原，其中所述核酸序列编码：
剪接的REV基因；
剪接的人免疫缺损病毒(HIV)致免疫表位；和
可选的细胞因子或T细胞识别元件。
19.权利要求18的多核苷酸，其中所述HIV致免疫表位选自gag，gag -蛋白酶或env或其致免疫亚单位；所述细胞因子是白细胞介素-12， 而T细胞共刺激元件是B7蛋白质。
20.权利要求19的多核苷酸，其中所述env致免疫表位选自HIV gp160，HIVgp120和HIVgp41。
21.权利要求19的多核苷酸，其中所述gag致免疫表位是p17，p24 或p15。
22.一种多核苷酸，其含有编码HIVgag，gag-蛋白酶或env致免疫 表位的第一基因，含REV应答元件(RRE)或已经被修饰而含一RRE 的基因，与适于在哺乳动物中表达基因的转录启动子可操作相连的基 因，与内部核糖体进入位点(IRES)相连的基因和与编码REV基因 产物的基因相连的IRES。
23.多核苷酸构建体： a)V1Jns-revIIIB，它具有接口序列  SEQ.ID：56： 5′-GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTC ATC AAG-3′， 和 SEQ.ID：57： 5′-GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT CT/GAT ATC GCA CTA
    BGH                                        rev... TTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TGT-3′ b)V1Jns-gp160IIIB，它具有接口序列  SEQ.ID：58： 5′-CTT AGA TC/A ACC ATG AGA GTG AAG GA GAA ATA TCA GCA CTT GTG CMVinta               gp160 GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG CAC CAT GCT CCT TGG GAT GTT GAT GAT CTG TAG TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT-3′， 和SEQ.ID：59： 5′-CTG GCA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TC/A GAT AGT GTC CCC ATC TTA
BGH                                          gp160 TAG CAA AAT CCT TTC CAA GCC CTG TCT TAT TCT-3′ c)pGEM-3-IRES，它具有接口序列  SEQ.ID：62： 5′-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/AAT TCC G…
   pGEM-3(SP6)               IRES 和SEQ.ID：63： 5′-A CCC GGG GAT CCT CT/A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA…
   pGEM-3(T7)                      IRES d)pGEM-3-IRES/revIIIB，它具有接口序列  SEQ.ID：65： 5′-TAT GGC CAC AAC C/AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA
    IRES                     rev CCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT-3′ 和SEQ.ID：66： 5′-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/AGA CTA TAG CGT GAT AAG AAA TCG AGG
    pGEM-3                   rev ACT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3′ e)pGEM-3-RRE/IRES/revIIIB，它具有接口序列  SEQ.ID：68： 5′-TTG CAT GCC TGC AGG T/GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG/C
    pGEM-3                                             RRE CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-3′
IRES-5′ 和SEQ.ID：69： 5′-GGG GCG GAA TT/T AGA GTC A/ATT GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTA
                                              RRE-3′ ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC...-3′ f)V1Jns-(tat/rev SD)，它具有接口序列  SEQ.ID：71： 5′-AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA/TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT
  CMVintA                              tat/rev SD AGA GGA CGG TGA/CTG CAG AAA AGA CCC ATG GAA A-3′
                       CMVintA g)V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)，它具有接口序列 SEQ.ID：73：     5′-GGC ACA GCA GAT C/AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CAC TAT TCT TTA
    BGH                 rev GCT CCT GAC TCC TGA CTC-3′ 和SEQ.ID：74： 5′-GGA ATT/TGA GTC ATC/CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC CAA-3′
     IRES                    gp160 h)V1Jns-gag-prtIIIB(SD)，它具有接口序列  SEQ.ID：75：   5′-CTT AGA TC/C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3′
      CMVintA                  gag(SD)   和SEQ.ID：76：   5′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC
      BGH                       prt   TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′   1)V1Jns-gag-prtIIIB，它具有接口序列  SEQ.ID：77：   5′-CTT AGA TC/CAC CAT GGG TGC GAG AGC GTC AGT ATT AA GCG GGG   CMVintA                     gag   GGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT…-3′   和SEQ.ID：78：   5′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC
      BGH                      prt TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′ j)V1Jns-tPA，它具有接口序列  SEQ.ID：79： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT C/ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC
    CMVintA                   tPA  leader TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/G ATC
                                                       BGH TGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3′ k)V1Jns-tPA-gp120MN，它具有接口序列  SEQ.ID：80： 5′-TTC GTT TCG CCC AGC GA/TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3′
    tPA                        gp120MN 和SEQ.ID：81： 5′-GGC ACA GCA GAT C/CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3′
    BGH                     gp120MN l)V1J-SIVMAC251p28gag，它具有接口序列  SEQ.ID：82： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT CT/ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT
    CMVintA                     p28gag… GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3′ 和SEQ.ID：83： 5′-GGC ACA GCA GAT CT/TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC CGG TCC-3′
    BGH                       p28gag m)V1J-SIVMAC251nef，它具有接口序列  SEQ.ID：84： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT C/GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATG
    CMVintA                             nef… AGG CAA TCC AAG CCG GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3′ 和SEQ.ID：85： 5′-GGC ACA GCA GAT CA/C CTA GGT TAG CCT TCT TCT AAC CTC TTC CTC
    BGH                  nef… TGA CAG GCC TGA CTT GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3′ n)V1Jns-tat/rev/env：它具有接口序列  SEQ.ID：86： 5′-ACC GTC CTT AGA T/TC GAC ATA GCA GAA TAG GCG TTA CTC GAC AGA
    CMVintA              tat/rev/env GGA GAG CAA GAA ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG-3′ 和SEQ.ID：87： 5′-GGC ACA GCA GAT C/C GAG ATG CTG CTC CCA CCC CAT CTG CTG-3′.
    BGH                 tat/rev/env
24.一种多核苷酸，在将其导入到脊椎动物组织，包括人组织后， 它诱导体内抗HIV中和抗体，HIV特异性T细胞免疫应答，或保护性 免疫应答，其中，所述多核苷酸含有编码选自HIVgag，HIVgag-蛋白 酶和HIV env之基因产物的基因，含REV反应元件(RRE)的基因， 与适于在哺乳动物中表达基因的转录启动子可操作相连的基因，与内部 核糖体进入位点(IRES)相连的基因和与第二基因相连的IRES，编 码REV基因产物的第二基因。
25.在单细胞中共表达至少两个基因产物的体内方法，其包括将约1 ng-100mg权利要求1的多核苷酸导入到脊椎动物组织中。
26.在脊椎动物中诱导抗HIV表位的免疫应答的方法，其包括将约1 ng-100mg权利要求6的多核苷酸导入到脊椎动物组织中。
27.在脊椎动物中诱导抗HIV表位的免疫应答的方法，其包括将约1 ng-100mg权利要求14的多核苷酸导入到脊椎动物组织中。
28.用REV依赖性HIV基因诱导体内免疫应答的方法，其包括：
a)分离REV依赖性的HIV基因；
b)将分离的基因与调节序列相连以便在导入到活组织中后，依靠 与控制序列有效地相连而使所述基因可被表达，所述控制序列指导所述 基因的转录起始和随后的翻译；
c)将可表达的基因导入到活组织中；和
d)将编码HIV REV的基因以反式或顺式导入到HIV REV依赖性 基因。
29.权利要求28的方法，其还包括用另外的可表达HIV基因加强或 用重组纯化的HIV基因产物加强。
30.权利要求28的方法，其中所述REV依赖性HIV基因编码gag 或env基因产物。
31.用HIV毒株诱导抗感染或疾病的免疫反应的方法，其包括将来 自第一HIV毒株的HIV基因导入到脊椎动物组织中，以便所诱导的免 疫反应中和第一HIV毒株感染，而且中和由与第一毒株异源的毒株引 起的感染，其中所述HIV基因编码保守的REV依赖性HIV表位，以顺 式或反式提供功能性REV。
32.诱导抗HIV感染的免疫应答的疫苗，其含有权利要求1的多核 苷酸和药物学可接受的载体。
33.在灵长类中诱导抗HIV免疫应答的方法，包括将权利要求1中 的多核苷酸导入到灵长类的组织中，同时不经肠施用白细胞介素12。
34.权利要求33的方法，其中所述多核苷酸的第一顺反子编码HIV gp160，所述多核苷酸的第二顺反子编码HIV REV，所述多核苷酸的 第三顺反子编码B7。
35.一种多核苷酸，其含有：    
a)真核转录启动子；
b)接在转录启动子3’方向的编码致免疫HIV表位的开放阅读框 架，其中所述开放阅读框架在开放阅读框架5’侧有一剪接供体序列， 在开放阅读框架的任何位置的REV反应元件和编码开放阅读框架翻译 终止的终止密码子；
c)在所述开放阅读框架翻译终止密码子3’方向的内部核糖体进入 位点(IRES)；
d)编码剪接的HIV REV基因的开放阅读框架，其3’端是翻译终止 密码子；
e)可选的，在REV翻译终止密码子的3’方向，有一第二IRES， 其后有编码免疫调节或免疫刺激基因的开放阅读框架，所述基因选自 GM-CSF，IL-12，干扰素和B7蛋白质的基因；
f)在最后的开放阅读框架后有一转录终止信号。
36.诱导抗原递呈细胞以刺激细胞毒和T辅助细胞增殖效应物功能 的方法，所述功能包括分泌HIV抗原特异性的淋巴因子，所述方法包 括：
a)在体内将脊椎动物细胞暴露于多核苷酸，所述多核苷酸含有编 码抗原性HIV表位的序列，可选地为HIV REV的序列，和编码B7蛋 白质的序列。
37.权利要求36的方法，其中所述HIV表位选自env，gag和pol。
38.权利要求36的方法，其中所述多核苷酸编码在各HIV表位， REV和B7蛋白质之间的IRES。
39.一种多核苷酸，其含有编码如下元件的序列：
a)真核转录起始信号；
b)HIV基因开放阅读框架(ORF)，其前有一异源前导序列以使 所述HIV基因ORF的表达不依赖于HIV REV基因产物的存在；
c)在HIV ORF翻译终止密码子3’方向，作为内部核糖体进入位点 (IRES)的序列；
d)在IRES的3’方向编码T细胞共刺激元件的ORF序列；和
e)在T细胞共刺激元件翻译终止密码子3’方向的转录终止信号。
40.权利要求39的多核苷酸，其中在(b)中的所述HIV基因ORF是 tPAgp120或tPAgp160。
41.一种多核苷酸，其含有编码如下元件的序列：
a)真核转录起始信号；
b)HIV基因开放阅读框架(ORF)，其前有一异源前导序列以使 所述HIV基因ORF的表达不依赖于HIV REV基因产物的存在；
c)在HIV ORF翻译终止密码子3’方向，作为内部核糖体进入位点 (IRES)的序列；
d)HIV基因开放阅读框架(ORF)，其前有一异源前导序列以使 所述HIV基因ORF的表达不依赖于HIV REV基因产物的存在；和
e)在HIV基因ORF翻译终止密码子3’方向的转录终止信号。
42.含有多表达构建体的组合物，所述多表达构建体分别均能够在 哺乳动物组织中诱导一个以上顺反子的表达，所述顺反子编码与致病的 病原体或肿瘤相关的抗原。
43.免疫宿主脊椎动物的方法，其包括以下步骤：
将编码至少第一和第二肽或多肽的非感染的、非整合的多核苷酸 与宿主组织直接接触而导入，当所述第一和第二肽或多肽在所述宿主中 作为翻译产物而生产时，它们之中每一个都是致免疫或免疫调节的，其 中所述第一肽或多肽由位于第一转录启动子的操纵控制下的多核苷酸 的片段编码，而第二肽或多肽由位于第一转录启动子操纵控制下的多核 苷酸的片段编码，在编码第一肽或多肽的多核苷酸片段与编码第二肽或 多肽的多核苷酸片段之间未提供转录终止子，或第二肽或多肽由位于第 二转录启动子操纵控制下的多核苷酸片段编码，此时在编码第一肽或多 肽的多核苷酸片段与编码第二肽或多肽的多核苷酸片段之间提供转录 终止子，由此，第一和第二肽或多肽均在所述宿主的单个细胞内产生， 从而导致免疫作用。
44.含有附图2所示元件的多核苷酸构建体，其中在图中所示的第 一，第二和第三顺反子编码下列物质任何两个或三个的组合：
1)tPA-gp120MN；
2)gp160IIIB/IRES/REVIIIB；
3)gp160IIIB；
4)REVIIIB；
5)tat/REV/gp160；
6)REV/gp160；
7)gp160MN；
8)来自临床相关的初级HIV分离物的gp160；
9)nef，用来自临床相关毒株的基因；
10)gagIIIB；
11)tPA-gp120IIIB；
12)gp160，其带有以下结构突变：来自临床相关HIV毒株的 V3环取代；在数个构建体上进行数个突变，如可变环的除去，Asn突 变以除去立体碳水化合物结构位阻，中和抗体表位；CD4结合位点分 离(knockout)突变；
13)带有适当前导序列的gp41，象tPA信号肽中的前导序列一 样；
14)gag：与上述#5构建体相似，用来自临床相关毒株的基因；
15)rev：用于gp160和gag双顺反子；
16)B7编码序列；
17)GM-CSF序列；
18)白细胞介素序列；
19)肿瘤相关的抗原；
20)编码除HIV以外的病原体表达的抗原的基因，所述基因 如，但不限于，流感病毒核蛋白，血细胞凝集素，基质，神经氨酸酶和 其他抗原蛋白质的基因；单纯性疱疹病毒基因；人乳头瘤病毒基因；结 核病抗原基因；甲，乙或丙型肝炎病毒基因；和这些以及其他抗原的基 因的组合以至少形成双顺反子构建体，所述双顺反子构建体可与多种其 他多顺反子构建体组合以提供能够产生抗所有递呈的病原体或肿瘤抗 原的免疫反应的混合液组合物；
其中附图2中的A和B是内部核糖体进入位点或终止上游顺反子转 录的转录终止序列和启始下游顺反子转录的转录启动子序列的组合。

说明书全文

1.发明领域

本文描述了在体内单细胞中协调表达外源基因的方法，所述外源基 因经多顺反子多核苷酸构建体导入到脊椎动物的组织中。所述方法会 产生抗外源基因表达产物的免疫反应。在脊椎动物中可以使用本发明 方法和多核苷酸构建体以产生抗由单细胞表达的抗原决定基的免疫反 应。协调表达导致基因产物的表达得到改善，而所述基因产物可能在 此之前表达得很差。它还会因通过相同细胞表达的T-细胞抗原而提 供T细胞刺激信号，从而提高细胞的免疫反应。以编码人免疫缺损病 毒(HIV)抗原的多核苷酸构建体作为本方法的一个实施方案。

2.发明背景

研制抗病毒，特别是象HIV这样的高突变率病毒的疫苗的主要问题 是不同病毒分离物或毒株之间病毒被膜蛋白的多样性，需要引发抗所 述病毒的中和和保护性免疫反应。由于小鼠和人的细胞毒性T淋巴细 胞(CTL)均能识别来自保守内部病毒蛋白的抗原表面决定基而且它 们在抗病毒免疫反应中是重要的，因此，已经努力研制CTL疫苗，所 述疫苗引发抗不同病毒株的异源保护作用。

当CD8+CTL的T细胞受体识别与MHCI型分子相关的病毒肽时， 它们可杀死病毒感染的细胞。这些肽是内源合成的病毒蛋白。因此， CTL通过识别来自保守病毒蛋白的抗原表面决定基就可提供跨毒株的 保护作用。与有关CTL识别的MHCI型相关的肽来源于存在于或跨过 胞质或内质网的蛋白质。进入核内体加工途径的外源蛋白质(如MHC II型分子提供的抗原)在产生CD8+CTL反应中通常没有作用。

产生CTL反应需要复制载体以便在细胞内产生蛋白质抗原或将肽 导入到细胞溶质中。这些方法有限制它们作为疫苗使用的不足之处。 反转录病毒载体对多肽的大小和结构有限制，所述多肽可作为融合蛋 白而得到表达，同时保持重组病毒复制的能力。

此外，载体如痘苗所进行的随后免疫的有效性可能还被抗载体自身 的免疫反应所危害。另外，病毒载体和改性的病原体本身的危险性有 可能妨碍其用于人[R.R.Redfield等，新英格兰医学杂志316，673(1987)； L.Mascola等，国际医学进展149，1569(1989)]。此外，选择所出现的 肽抗原表面决定基取决于个体MHC抗原的结构；因此，由于在远系繁 殖种群中MHC单模标本的多样性，肽疫苗可能会有有限的有效性。

Benvenisty，N.，和Reshef，L.[PNAS 83，9551-9555，(1986)]表 明，可以表达经腹膜内(i.p.)，静脉内(i.v.)或肌肉内(i.m.)导入小鼠中的 CaCl2沉淀的DNA。将DNA表达载体经肌肉内注射到小鼠中会导致肌 肉细胞摄取DNA，然后表达由所述DNA编码的蛋白质[J.A.Wolff等， 科学，247，1465(1990)；G.Ascadi等，自然，352，815(1991)]。质粒作 为游离体保持，但并不复制。随后在大鼠，鱼和灵长类的骨骼肌中和 大鼠心肌中i.m.注射后观察到持续的表达。在WO90/11092(1990， 10，4)中报告了用核酸作为治疗剂的技术，其中用裸多核苷酸接种 脊椎动物。

肌肉内免疫对于此方法不是必需的。因此，Tang等人[自然，356 152-154(1992)]公开了将用编码牛生长激素(BGH)之DNA包被的金 微射弹导入到小鼠的皮肤内，从而在所述小鼠中生产抗BGH抗体。 Furth等人[生物化学年鉴205，365-368，(1992)]表明可以用喷射注射器 (jet injector)转移活动物的皮肤，肌肉，脂肪和乳腺组织。最近由 Friedman，T.，[科学，244，1275-1281(1989)]综述了导入核酸的方法。 Robinson等人[新疫苗(包括防治艾滋病)现代进展1992年会议论文 摘要，冷泉港实验室，p92]报告了将鸟流感病毒DNA通过i.m.，i.p.，i.v. 施用到鸡中可提供抗致命攻击的保护作用。但是，Robinson等人并未 公开使用了何种鸟流感病毒基因。另外，只肯定了H7特异性免疫反 应；并未讨论导入了跨毒株的保护作用。Zhu等人[科学，261：209- 211(1993年7月9日)；还可参见WO93/24640，1993年12月9日]表明 将DNA：阳离子脂质体复合物经静脉内注射到小鼠中会导致全身表达 克隆的转基因。最近，Ulmer等人[科学259：1745-1749，(1993]报告了 通过注射编码流感病毒蛋白质的DNA而产生的抗流感病毒感染的异 源保护作用。

用本发明就可满足能够引发抗病原体和肿瘤抗原的所需免疫反应的 特异性治疗和预防剂的需要。在所述治疗方法中特别重要的是诱导T 细胞免疫反应的能力，所述T细胞免疫反应可防止因病毒毒株而引起 的感染或疾病，而所述病毒毒株与得到所述抗原基因所来自的毒株是 异源的。由于HIV突变迅速，而且已经鉴定了许多致病性强的分离物， 所以这是HIV的显著特点[参见例如，LaRosa等，科学，249：932- 935(1990)，鉴定了245种不同的HIV分离物]。

为了与这种多样性相适应，研究人员试图用肽免疫来产生CTL。因 此Takahash等人[科学，255：333-336(1992)]报告了诱导有广泛交叉反 应的细胞毒性T细胞，所述T细胞识别一种HIV被膜(gp160)决定 基。他们认识到得到真正交叉反应性的CTL反应的困难，而且表明在 T细胞的引发或再刺激(是很严格的)和从已经被刺激的CTL引发效 应物功能(包括细胞毒性)之间有不同。 Wang等人[美国国家科学院院刊，90：4156-4160(1993)]报道了通过肌 肉内接种克隆的基因组(未剪接的)HIV基因而在小鼠中引发免疫反 应。所达到的免疫反应水平很低，而且所述系统使用了部分小鼠乳腺 肿瘤病毒(MMTV)长末端重复(LTR)启动子和部分猴病毒40 (SV40)启动子和终止子。已知SV40可能通过整合到宿主细胞DNA 中而转化细胞。因此，与本文所描述的系统不同，Wang等人描述的 系统并不适用于人。另外，Wang等人的DNA构建体含有编码邻接 Tat/REV-gp160-Tat/REV编码序列的主要HIV基因组片段(图1)。 正如在下文详细描述一样，为了得到高水平表达的gp160，这是一个 次最佳系统。一个缺陷是Tat的表达对卡氏肉瘤的发展有影响 [Y.N.Vaishav和F.W.WongStaal，生物化学研究年鉴(1991)]。

WO93/17706描述了给动物接种疫苗以预防病毒的方法，其中用一 基因构建体包被载体颗粒，然后将所述包被的载体颗粒加速导入动物 细胞中。就HIV而言，建议主要使用完整基因组，去掉长末端重复。 那种方法会给受体带来一定的危险。通常HIV构建体应含有至少约50 ％的HIV基因组以确保疫苗的安全。因此，如果用基因传递技术导入 有用的人HIV疫苗就会有许多问题。

本发明使用已知方法将多核苷酸导入活组织中以诱导蛋白质的表 达。本发明提供了将HIV和其他蛋白质导入抗原加工途径以有效产生 HIV特异性CTL和抗体的免疫原。所述药物作为疫苗诱导细胞和体液 抗HIV和HIV中和免疫反应是有效的。本发明通过提供多核苷酸免疫 原而解决了某些问题，所述多核苷酸免疫原在其被导入到动物中时， 可以指导有效地表达HIV蛋白质和表位，而不会带来与那些方法相关 的危险。所产生的免疫反应在识别HIV，抑制HIV复制，鉴定并杀死 HIV感染的细胞方面是有效的，而且有抗许多HIV菌株的交叉反应。 因此，本发明提供了抗HIV的有用的免疫原本发明还提供了多核苷酸 构建体，所述构建体能够在体内的单个细胞中共表达一种以上的基因 产物。这点由HIV基因表达系统来说明，其中第一个基因的表达依赖 于第二个基因产物在相同细胞中的共表达。由于成功地达到了所述的 体内共表达，现在可预测这种类型的多核苷酸构建体可用于体内共表 达许多组合的基因产物，包括但不限于除HIV相关抗原以外的病毒抗 原，癌相关的抗原和免疫调节或免疫刺激基因产物。

发明综述

本发明公开了在导入到动物组织中后，能够诱导两到三种顺反子协 调表达的核酸，包括DNA构建体和RNA转录本。在一个实施方案中， 协调表达了编码HIV蛋白质的两个顺反子，并引发了抗一种以上基因 产物的HIV特异性免疫反应。产生了应答人免疫缺损型病毒(HIV) 不同毒株的病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和通常为 毒株特异性的抗体。所述CTL在体内的产生，象病毒感染一样，通常 要求所述抗原的内生表达。为了产生呈现于免疫系统的病毒抗原，而 不会限制直接的肽传递或病毒载体的利用，将编码HIV蛋白质的多核 苷酸直接导入到脊椎动物体内组织，用所述组织内的细胞摄取所述多 核苷酸，然后被产生并加工编码的蛋白质以呈递到免疫系统中。在小 鼠中，这会导致HIV特异性CTL和抗体的产生。在灵长类可得到相似 的结果。通过编码并共表达HIV基因产物，作为T细胞共刺激元件的 免疫刺激基因产物(包括但不限于GM-CSF，白细胞介素，干扰素 和B7蛋白质)的2-或3-顺反子核酸多核苷酸就可得到这些结果。 通常将本发明的方法用于协调任何两个或三个基因的体内表达。因 此，本发明的各种实施方案包括病毒抗原和免疫刺激基因产物的协调 表达以及肿瘤抗原和免疫刺激基因的协调表达。

附图的简要描述 图1  HIV基因组图。 图2  本发明多核苷酸构建体的图，所述构建体能够在单个细胞中诱 导多达三个基因产物的体内协调表达，所述基因产物分别由三个顺反 子中的一个编码(I，II和III)。片段A和B表示包括转录终止信号 和启动子或内部核糖体进入位点(IRES)的对照序列。 图3  HIV被膜多核苷酸免疫原构建体的详细图，所述构建体含有 CMV-intA转录启动子，5’-剪接供体，HIV gp160(表明 gp120，gp41和REV反应性元件，RRE)，内部核糖体进入位点 (IRES)，REV顺反子，BGH转录终止子，和由原核转录启动子驱 动的新霉素抗性标记。 图4  表明了特异性调节元件的双顺反子的HIVenv和gag多核苷酸 免疫原构建体的详细图。 图5  由HIV多核苷酸免疫原诱导的gp160表达的Western印迹分 析。该结果大致反映了在一个多核苷酸构建体中一个以上基因产物在 单个细胞中的共表达：只编码gp160的多核苷酸(见道B，从左边数 第四道)未表达可检测的gp160，但反向加入REV(通过共转染只编 码REV的构建体)，就有较好的gp160表达(道A，从左边数第四 道)。无论是否反向加入REV，基因组tat/REV/env构建体只表达低 水平的gp160(道A和B，第三道)。但是，双顺反子gp160/IRES/REV 构建体表达很多gp160(道A和B，从左边数第五道)。用编码gp 160/IREV/REV的双顺反子构建体得到的表达最好，所述构建体在gp 160编码序列的5’端有一剪接供体(SD)(道A和B，右边道)。 由于当REV以反向(道A右边道)提供时未增加表达，，所以被表达 的REV水平不限制所述系统。 图6  V1J序列。 图7  V1Jneo序列。 图8  CMVintABGH序列。 图9  在应答V1J-SIV-p28多核苷酸构建体接种的恒河猴中产生 的细胞毒性T淋巴细胞(不依赖REV)。该SIV p28等同于HIV的 p24gag。因此，用编码多核苷酸构建体的gag可诱导群特异性抗原的 特异性CTL。 图10  在应答痘苗-SIVp28核酸接种中产生的细胞毒性T淋巴细胞。 这表明与表达相同抗原的复制抗原(牛痘)相比，用编码多核苷酸的 (图9)  gag可诱导相似的CTL[见Shen L.等，科学252：440- 443，1991]。 图11  载体V1R的序列。 图12  由V1Jns-tPA-gp120，200μg/小鼠每轮，两轮，诱导的抗体。 图13  用来自V1Jns-tPA-gp120(MN)DNA接种的非洲绿猴的血 清中和HIV-1(MN)病毒。道A和B表示在暴露于表明稀释度的 血清后，用HIV-1(MN)感染的C8166细胞p24gag蛋白质生产 的降低，所述血清来自V1Jns-tPA-gp120DNA接种的猴。病毒接种(每 样品TCID50)后，在10天的组织培养物中得到数据。 图14  V1Jns-tPA-gp120接种的小鼠的T细胞有长期的抗原特异性T 淋巴细胞记忆反应。在杀死前6个月受免疫的小鼠接受两次1.6mcg的 疫苗DNA。将脾T细胞与5mcg/ml重组gp120蛋白质一起体外培养。 增殖gp120特异性T细胞。刺激指数(SI；将3H-胸苷掺入gp120 处理的T细胞：T细胞未接受抗原)。 图15  由来自V1Jns-tPA-gp120DNA接种的小鼠的T细胞分泌1型T 辅助(TH1)淋巴细胞细胞因子。rgp120处理后，检测图13中所示 样品细胞培养上清液中分泌的γ-干扰素和白细胞介素4(IL-4)。 免疫小鼠分泌大量的γ-干扰素和少量的IL-4，这表明这种疫苗诱 导TH1样反应。对照小鼠有很少量的干扰素分泌，而IL-4水平是背 景水平。 图15  在V1Jns-tPA-gp120DNA接种的小鼠中抗gp120细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)活性。gp120DNA接种后，两只小鼠(2006和 2008)有对gp120肽(P18)特异性的MHCI限制的CTL活性。在没 有P18的这些小鼠或以前未接种的对照小鼠中未观察到活性。   图16  用V1Jns-gp160/IRES/rev和V1Jns-tPA-gp120DNA疫苗接种 的恒河猴中的抗-gp160CTL活性。所有四只接受这些疫苗的猴的T淋 巴细胞培养物表明MHCI有限地杀死已经用痘苗-gp160处理的自体 靶细胞。在用“空白”DNA疫苗(没有基因插入的V1Jns)免疫的四 只对照恒河猴中未观察到CTL活性。

发明的详细描述

本发明提供了在直接导入到动物组织中后，能够诱导两个或三个顺 反子协调表达的活性，包括DNA构建体和RNA转录本。在一个实施 方案中，说明了编码HIV蛋白质的两个顺反子的协调表达，并引发了 抗一种以上基因产物的HIV特异性免疫反应。产生了应答不同人免疫 缺损型病毒(HIV)毒株的病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)和通常为毒株特异性的抗体。象病毒感染一样，通常体内产 生所述CTL需要所述抗原的内生表达。为了产生呈现于所述免疫系统 的病毒抗原，不限制直接的肽传递或病毒载体的利用，将编码HIV蛋 白质的多核苷酸直接导入到脊椎动物体内组织中，由所述组织内的细 胞摄取所述多核苷酸，然后在所述免疫系统中生产并加工被编码的蛋 白质。在小鼠中，这样导致产生HIV特异性CTL和抗体。在灵长类中 得到了相似的结果。用编码并共表达HIV基因产物，作为T细胞共刺 激元件的免疫刺激基因产物(包括但不限于GM-CSF，白细胞介素， 和B7蛋白质)的两-或三-顺反子核酸多核苷酸也可以得到这些结 果。本发明的方法和多核苷酸通常用于任何两或三个基因的

体内协调表达。因此，本发明的不同实施方案包括病毒抗原和免疫 刺激基因产物的体内协调表达以及肿瘤抗原和免疫刺激基因的协调表 达。

本发明提供多核苷酸，当其被直接导入的脊椎动物体内，包括哺乳 动物如灵长类和人中后，在所述动物中诱导所编码的蛋白质的表达。

如本文所用，多核苷酸是含有必需的调控元件的核酸，以便导入到 活脊椎动物细胞中后，能够指导细胞机制以生产由含所述多核苷酸之 基因编码的翻译产物。

在本发明的一个实施方案中，所述多核苷酸是含有与转录启动子操 作相连的HIV基因的多脱氧核糖核苷酸。在本发明的另一实施方案 中，所述多核苷酸疫苗含有编码HIV基因的多核糖核酸，所述HIV基 因适合于由真核细胞机制(核糖体，tRNA和其他翻译因子)翻译。由 所述多核苷酸编码的蛋白质是除在病理条件下，在正常动物中没有的 蛋白质，(即一种异源蛋白质)如与人免疫缺损型病毒(HIV)，获 得性免疫缺损综合症(AIDS)的病因学因子相关的蛋白质，激活所述 动物的免疫系统以产生保护性的免疫反应。由于这些外源蛋白质是由 动物自身的组织产生的，所以以与相关生物的，HIV感染实际发生时 相似的方式，由主要组织相容性系统(MHC)加工所表达的蛋白质。 正如在本说明书中所说明的，其结果就是诱导抗同源病原体的免疫反 应。

因此，本发明人制备了核酸，当其被导入到生物系统中后，诱导HIV 蛋白质和表位的表达。所诱导的抗体反应是所表达的HIV蛋白质特异 性的，而且中和HIV。另外，诱导了特异性识别并破坏HIV感染的细 胞的细胞毒性T淋巴细胞。本发明人还研制了多核苷酸，借此，在导 入体内后，有效地表达猴免疫缺损型病毒(SIV)基因。这一成果是 显著的，因为只有很接近地模拟人疾病，AIDS的动物模型是使用SIV 的次人灵长类模型。因此，通过比较用HIV和SIV多核苷酸免疫原体 内得到的效果，就可以表明本发明免疫原作为疫苗的效力。

本领域专业人员在本文的教导下，可得出本发明的许多实施方案。 因此，以本文公开的成功的本发明为基础，可以成功地使用不同的转 录启动子，终止子，载体或特定的基因序列。

本发明提供了使用多核苷酸的方法，在其导入到哺乳动物组织中 后，在体内单个细胞中诱导两个或多个不同的，独立的基因产物的共 表达。由于特定HIV基因含有已知为REV反应性元件(RRE)的序 列，所以所述模型是严格的。除非已知为REV的另一HIV基因也在表 达含HIV基因的RRE的细胞内，否则不能有效地表达这些基因。将所 述现象描述为REV依赖性。    

Pavlakis和Felber，WO93/20212描述了消除序列的方法，所述序列 可诱发转录本的不稳定性，而且还得到特定HIV基因的某些REV非依 赖性。该方法通常不适用于所有的所述基因，而且耗费时间并需要多 基因修饰。此外，所述基因的表达水平和免疫原性可能因REV依赖性 的消除而受到损害。

本发明提供了不同的解决方法，这些方法得到REV非依赖性并不需 要多步操作REV依赖性的HIV基因。另外，本发明适用于表达REV 非依赖性的基因以及表达REV依赖性的基因。本文所描述的REV依 赖性表达系统在本发明中是有用的而且还可以用作说明在体内单细胞 中共表达一个以上所需基因产物的严格系统。因此，在有益于体内给 定的细胞中共表达一种以上基因产物的任何环境中，均可使用本文所 描述的方法和多核苷酸构建体。

本文举证的一种情况是，共表达免疫原性的表位和T细胞识别因子 家族中已知为B7的一个成员。最近，Steven Edgington[生物技术， 11：1117-1119，1993]描述了在激活消除肿瘤的CD8+CTL过程中，B7 和抗原递呈细胞表面上表位的主要组织相容性复合物(MHC)出现的 协调作用。一旦在抗原递呈细胞(APC)表面的MHC分子呈现了T 细胞受体(TCR)表位，通过与CTLA-4或CD28结合，在相同APC 表面上表达的B7即作为第二信号。其结果是迅速分裂CD4+辅助T细 胞，这样传递信号使CD8+增殖并杀死APC。因此，我们在本文中说 明通过协调表达REV基因而有效地表达并产生抗含RRE的HIV REV 依赖性基因的免疫反应，从而结论性地证明通过诱导编码两个甚至三 个顺反子的多核苷酸(定义为携带有关多肽链信息的一段核酸)来协 调表达一个以上基因。

由于本发明的许多应用都是用于抗病毒接种，所以常常将所述多核 苷酸称为多核苷酸疫苗(PNV)。这并不是说这些多核苷酸在免疫刺 激和抗肿瘤治疗上的其他应用，就可以忽略或认为其在本发明的范围 之外。

在本发明的一个实施方案中，将编码HIV基因产物的基因插入到表 达载体中。所述载体含有由真核RNA聚合酶识别的转录启动子，和在 HIV基因编码序列末端的转录终止子。尽管本领域专业人员知道许多 已知的其他启动子，如可以使用强免疫球蛋白或其他真核基因启动子 但在一个优选的实施方案中，所述启动子是带内含子A序列的巨细胞 病毒启动子(CMV-intA)。优选的转录终止子是牛生长激素终止 子。CMVintA-BGH终止子的组合(图8，SEQ ID：13)是特别 优选的。另外，为了有助于在原核细胞中制备多核苷酸，还可以优选 地在所述表达载体中包括位于原核启动子控制下的抗生素抗性标记以 便表达在真核细胞中本没有的抗生素。可以使用氨苄青霉素抗性基 因，新霉素抗性基因或任何其他药物学可接受的抗生素抗性标记。在 本发明的一个优选的实施方案中，所述抗生素抗性基因编码新霉素抗 性的基因产物。此外，为了有助于通过在原核生物中发酵来高水平生 产所述多核苷酸，有利的是所述载体含有原核复制起点并且是高拷贝 量的。许多市售原核克隆载体都可以提供这些益处。在本发明优选的 实施方案中，通过已知为pUC的市售载体提供这些功能。但是需要除 去非必需的DNA序列。因此，在本发明的一个实施方案中除去了pUC 的lacZ和lacI编码序列。还要使所述载体不能在真核细胞中复制。这 样使多核苷酸疫苗序列整合到受体基因组中的危险降到最低。

在另一实施方案中，使用表达载体pnRSV，其中用劳氏肉瘤病毒 (RSV)的长末端重复(LTR)作为启动子。在另一实施方案中，使 用V1，它是一种突变的pBR322载体，在所述载体中克隆了CMV启 动子和BGH转录终止子。在本发明一个具体优选的实施方案中，将 V1和pUC19组合以得到称为V1J的表达载体(SEQ ID：12)。将 HIV基因，如gp120，gp41，gp160，gag pol env或任何可诱导抗HIV免疫 反应(抗体和/或CTL)的其他HIV基因克隆到V1J或另一适宜的表 达载体中。除去由HIV基因组编码的功能反转录酶和整合酶功能元件 可以使所述多核苷酸疫苗编码序列整合到受体基因组中的危险降到最 小。在另一实施方案中，从V1J中除去氨苄青霉素抗性基因，然后用 新霉素抗性基因取代以得到V1J-neo(SEQ ID：14)，根据本发明可以将 任何数量的不同HIV基因克隆到所得的载体中。在另一实施方案中， 载体是V1Jns，它与V1Jneo相同，但除已将单个Sfi1限制位点插入到 V1J-neo2114位置的单个Kpn1位点。Sfi1位点在人基因组DNA中 的发生率很低(约每100,000个碱基1个位点)。因此通过简单地 用Sfi1消化提取的基因组DNA可以小心监测所述表达载体是否整合到 了宿主DNA。在另一方案中，载体是V1R。在该载体中，从所述载 体中尽可能多地除去非必需的DNA以得到高度紧密的载体。该载体是 V1Jns的衍生物并示于图11(SEQ ID：100)中。该载体允许使用 更大的插入片段，而不必担心会编码不必要的序列，而且当编码特异 性流感病毒基因的构建体被导入到周围组织中时，可以由细胞最恰当 地摄取。在图11中，缺失的V1Jneo部分用缺口表示，而插入序列用 粗体表示，但V1Jneo标号未变。根据本领域专业人员已知的方法就可 以完成前述的载体修饰和研制的方法。但是尽管是用常规方法得到 的，所述的特定产物对于它们所适用的特定目的也是特别有用的。

本发明的一个实施方案掺入了编码HIVgp160，gp120，gag和来自著 名实验室修改的HIV毒株如SF2，IIIB或MN的其他基因产物的基 因，这是因为已经得到了大量有关的资料，如表明通过第一次施用HIV IIIb V3环特异性单克隆抗体[Emini等，自然，355：728-730，1992]或用 重组gp120而不是gp160接种[Berman等，自然，345：822-825，1990] 可以使黑猩猩免于HIV IIIB病毒的致命攻击。本领域专业人员可以知 道用与HIV-1基因功能相似的HIV-2毒株的基因可以产生与本文 所述HIV-1构建体的相似的免疫反应。得到这些基因的克隆和操作 方法是本领域专业人员熟知的。

最近已经认识到引发抗实验室修改的HIV毒株的免疫反应对于中和 HIV的初级野外分离物是不够的[参见例如Cohen，J.，科学，262：980- 981，1993]。因此在本发明的另一实施方案中，将来自强HIV初级野外 分离物的基因插入到多核苷酸免疫原中。这可通过制备病毒基因的 cDNA拷贝，然后将个体基因亚克隆到所述多核苷酸免疫原中来完成。 许多HIV毒株的许多基因序列在GENBANK可公开得到，所述HIV初 级野外分离物可从国立过敏和传染性疾病研究所(NIAID)得到， NIAID与Quality Biologica公司[17581林德堡大街，盖斯堡，马里 兰，20879]订立了合同以便可得到这些毒株。现在还可从世界卫生组 织(WHO)[HIV分离和表征网络，疫苗发展单位，研究局，艾滋病 全球规划，CH-1211  日内瓦27，瑞士]得到这些毒株。本领域专业人员 从这项工作可以看出本发明的实用性之一就是提供体内以及体外的检 测和分析系统以便得出HIV序列多样性与HIV中和血清学的关系以及 其他参数。根据本领域专业人员熟知的方法可以完成这些不同基因的 分离和克隆。因此，本发明还提供系统鉴定HIV毒株和疫苗序列的生 产方法。HIV毒株初级分离物基因的掺入提供了诱导抗病毒临床分离 物的免疫反应的免疫原，因此符合本领域尚未满足的需要。此外，随 毒性分离物的改变，可以修饰所述免疫原以便按需要得到新序列。

为了保持术语的一致性，本文按下列习惯描述多核苷酸免疫原构建 体：

“载体名称-HIV毒株-基因-附加元件”。因此，在MN毒株的 gp160基因克隆到表达载体V11Jneo中的构建体中，本文所给的名称是 “V11Jneo-MN-gp160”。在下文将详细描述加到所述构建体中 的附加元件。自然，由于病毒病原毒株的变化，也可以改变用于加入 到药物中的最佳精确基因。但是，正如下文所说明的，由于诱导了能 够抵御异源毒株的细胞毒淋巴细胞反应，与全病毒或以亚单位多肽为 基础的疫苗相比，在本发明的免疫原和疫苗中，毒株变异性就不太重 要。另外，对药物进行简单操作就可插入一个新基因，所以这是一种 用分子生物学标准技术容易完成的调整。

为了完整地描述本发明，提供HIV的下列背景。人免疫缺损型病毒 有核糖核酸(RNA)基因组，其结构列在图1中。根据本发明方法的 教导，为了产生用于克隆和操作的cDNA拷贝，就必须用本领域熟知 的方法反转录所述的RNA基因组。在所述基因组的两端，各有一个作 为启动子的长末端重复序列。在这两个末端之间，所述基因组在不同 的阅读框架中编码gag-pol-env作为主要基因产物：gag是群特异性抗 原；pol是反转录酶或聚合酶；在另外的阅读框架中该区还编码引起翻 译后如将gp160加工成gp120和gp41的病毒蛋白酶，；env是被膜蛋 白；vif是病毒粒子感染因子；REV是病毒粒子蛋白表达的调节基 因；neg是负调节因子；vpu是病毒粒子生产力因子“u”；tat是转 录的反向激活因子；vpr是病毒蛋白质r。已经描述了这些元件各自的 功能(见AIDS 89，Montreal，费城科学小组出版物，从中采用了图1)。

在本发明的一个实施方案中，将编码HIV或SIV蛋白质的基因直接 与转录启动子相连。env基因编码一个大的膜结合蛋白，gp160，该 蛋白翻译后被加工成gp41和gp120。可以将gp120基因放在用于表达 的巨细胞病毒启动子的控制下。但是，gp120不与膜结合，因此表达 后，可以从细胞中分泌出来。由于在感染的细胞中，HIV倾向于保持 休眠，因此需要产生针对细胞结合的HIV表位的免疫反应。本文通过 体内表达细胞膜相关的表位，gp160，以引发免疫系统就可达到该目 的。然而，在没有REV的情况下，由于不从未剪接的基因的核中排出， gp160的表达受到抑制。为了理解该系统，必须详细描述HIV的生活 周期。

在HIV的生活周期中，感染宿主细胞后，HIV RNA基因组反转录 成可以作为单个转录单位整合到宿主基因组DNA中的原病毒DNA。 LTR提供了从5’到3’(gag，pol，env)转录HIV基因的启动子以形 成未剪接的全部基因组的转录本。未剪接的转录本作为可翻译gag和 pol的mRNA，而有限的剪接对于翻译env编码的基因是必须的。由于 在基因组设置中，如图1所示，REV和env是重叠的，因此为了调节 待表达的基因产物REV，必须剪接一次以上。为了转录env，必须停 止REV转录，反之亦然。另外，从核中排出未剪接的RNA要求存在 REV。但为了使REV在该方法中发挥功能，在转录本上必须存在REV 反应元件(RRE)[Malim等，自然，338：254-257(1989)]。

在本发明的多核苷酸疫苗中，通过提供完全剪接的基因来消除特定 HIV基因的强制性剪接(即：提供所需基因产物的完全开放阅读框架， 而不需转换阅读框架或消除非编码区；本领域的普通技术人员应该知 道，在剪接特定的基因时，在得到精确的序列方面有一定的自由度； 但是，只要得到功能编码序列，这就是可接受的)。因此在一个实施 方案中，剪接gp160的完整编码序列，剪接REV序列，以便不需要各 基因产物的间歇性表达。此外，研究了REV经调节表达的特征以便 使HIV编码的REV依赖性的免疫原性的基因产物的表达最优。

为了使REV作为在胞质中待翻译的来自核的转录本输出物，除在被 输出的转录本上需要存在REV反应元件(RRE)外，REV还需要在 含RRE之基因的5’侧至少有一个剪接供体位点[Lu等，美国国家科学 院院刊，87：7598-7602，(1990年10月)，Chang和Sharp，细胞， 59：789-795(1989年12月1日)]。本发明人设想，在与待表达基因相同 的表达载体的一个位置上，多核苷酸提供REV编码序列以便共表达 REV和REV反应基因，而不需进行任何剪接。因此，在本发明优选的 实施方案中，将HIV基因紧接转录启动子，如CMV启动子的下游， 剪接的REV编码序列放在第一个编码序列的3’(也称为下游)位置。 自然，可以改变这些基因的顺序。但是优选的是使免疫原性的HIV顺 反子直接紧邻转录启动子以确保产生的所有转录本编码全部顺反子。

共表达基因的一种方法依赖于用表达不同基因的不同载体共转染培 养中的细胞。对于REV依赖性基因，以反向方式提供REV基因产物。 但这对于本发明目的是次优的，尽管并未在本发明范围之外，但由于 体内共转染给定细胞以达到REV的可获性的可能性很低，而这种可获 性对于REV依赖性免疫原性的HIV基因产物的强表达是必需的。另一 方法是在给定的载体上提供数个启动子，各启动子分别控制不同基因 的表达。这等于顺式提供REV基因产物。根据本发明可以使用这种方 法。在所述的实施方案中，它对于各种启动子和它们反方向控制的基 因来说是优选的。但是，由于在这种类型的多基因载体中启动子之间 已知的竞争性干扰，所以认为该实施方案也是次优的。

Ghattas等人[分子和细胞生物学，11，No.12：5848-5859(1991年12 月)]，Kaufaman等人[核酸研究19，No.16：4485-4490(1991)]和Davies [病毒学杂志66，No.4：1924-1932(1992年4月)]已描述了脑心肌炎病毒 (EMCV)前导序列中的内部核糖体进入位点(IRES)。他们报告 说可以用上游启动子启动双顺反子mRNA转录的系统，在IRES位于 两个基因之间时，可以很好地表达5’和3’的开放阅读框架。Chen等人 [病毒学杂志，67：2141-2145，1993]报告了一个系统，其中用来自猪泡囊 (vesiculor)病病毒(SVDV)的5’非翻译区(NTR)构建双顺反 子病毒，所述双顺反子病毒用于共表达来自一个感染病毒载体的一个 转录本的两个基因。

本发明人还发现掺入协调表达含REV反应元件(RRE)的HIV基 因，内部核糖体进入位点(IRES)和REV编码序列的核酸构建体可 以有效地表达REV和REV依赖性基因产物。参考图2和3可以更好 地理解本发明的该实施方案。图2表示一个一般化的实施方案，而图3 表示本发明的具体实施方案，根据上述的命名系统，是V1Jns- gp160(RRE)-IRES-REV。免疫原性的HIV基因所来自的HIV毒株与所 讨论的说明性目的无关，但是，可预测任何REV依赖性基因产物的表 达是有效的，象引发抗REV和REV依赖性基因产物的免疫反应是以 本专利的公开为基础的一样。根据图3中所示的实施方案，载体是上 述的V1Jns。因此根据本领域熟知的方法，载体提供启动子 (CMVintA)和终止子(BGH)以及原核复制原点以便有利于通过 发酵用所述构建体转化的细菌来大规模生产HIV多核苷酸疫苗。由于 没有真核复制原点，该构建体不能在真核组织中复制。紧接在HIV基 因之前提供来自天然产生的rev/tat剪接供体(rev/tatSD)的剪接供体 位点。gag/pol/env编码序列含有REV反应元件(RRE)或在其之前， 在形成新的转录本后，RRE提供REV结合并从核中输出REV依赖性 mRNA所必需的信号。然后在内部核糖体进入位点(IRES)提供用于 再启动反应所需的序列以便有效地翻译下游REV编码序列。用该方 法，在与REV依赖性基因产物相同的多核苷酸上顺式提供REV基因 产物。

在本发明的另一方案中，在PNV中包含了第三个顺反子。利用组织 特异性转录启动子和增强子，完成了编码作为B7抗原递呈细胞表面蛋 白的所述免疫刺激蛋白的基因，人颗粒细胞/单核细胞集落刺激因子 (GM-CSF)基因和如白细胞介素和干扰素的细胞因子基因。通过 推广前述有关REV和REV依赖性基因，顺式将IRES插入到REV之 后，B7基因之前，通过在与双顺反子REV依赖性HIV基因相同的载 体构建体，IRES-REV构建体上提供第二启动子或用不同构建体反 式提供B7或GM-CSF基因。即使反式提供可增强抗由本发明免疫 原编码的HIV基因产物的免疫反应，这些基因产物的一般化免疫刺激 效果也足够了。特别是对于B7，优选的是在MHC-I分子的缝隙相 同细胞递呈的HIV表位也递呈B7。抗原表位和B7的共递呈关闭了T 细胞激活所需的开关。调节是否引发显著体液或细胞免疫反应[参见 Afonso等，科学，263：235-237，1993]的细胞因子，特别是IL-2在导 入PNV的同时静脉内提供或包含在PNV中作为第三顺反子，由此确 保白细胞介素的定位生产。这些免疫刺激和免疫调节蛋白质的基因， 包括GM-CSF(见Shaw和Kamin，细胞，46：659-667，1986)，白 细胞介素-12(见Wolf，S.等，免疫学杂志，146：3074-3081，1991) 和B7(见Gordon等，免疫学杂志，143：2714-2722，1989；有关B7蛋白 质家族新成员的克隆和序列，见Azuma，M.等，自然，366：76-79，1993； 和Freemian，G.等，科学，262：909-911，1993)是已知的，而且用本领 域已知的方法，根据本发明很容易将其克隆并掺入到PNV中。优选的 用于该目的的基因是人基因以使抗这些蛋白质的免疫反应最小，从而 使被表达的蛋白质完成它们的免疫调节和免疫刺激功能。若HIV基因 已经提供了REV独立性，就可以完全除去REV顺反子，可以构建编 码B7基因家族成员的第二顺反子和编码另一基因产物如ZL-12的第 三顺反子。

无论何时需要限制特定组织型多核苷酸的表达，只要使用组织特异 性启动子或增强子，如肌肉肌酸激酶(MCK)增强子元件。例如，单 核细胞是不再分裂的分化到最后的细胞。将外源DNA整合到染色体中 看起来需要细胞分裂和蛋白质合成。因此，将蛋白质表达限制在非分 裂细胞如单核细胞中是优选的。然而，在PNV所导入的许多组织中， 为了完成表达使用CMV启动子就足够了。

在下列描述的本发明的不同实施方案中，使用上述基本示例。从基 本构想的设计偏离，增加或减去作为本发明不同方面的重要部分。

本专利公开举证了以双或三顺反子HIV多核苷酸免疫原作为多核苷 酸疫苗，PNVs以产生体液免疫以及跨毒株的细胞抗病毒免疫。当要求 在体内单个细胞中共表达所编码的基因产物时，无论是否与HIV相 关，所述系统对于任何两或三顺反子都是有用的。但是，假如给定HIV 在受感染种群和受干扰个体内的突变倾向，根据本发明产生的双体液 和细胞免疫反应对于抑制HIV感染是特别有效的。为了配制用于HIV 的有效保护性疫苗，需要对例如gp160(env在各种HIV-1，clade B毒株中有约80％的保守性，所述毒株在美国人种群中是普遍毒株) (HIV上的主要中和靶)以及对gp160的保守部分和由gag编码的内 部病毒蛋白质有反应性的细胞毒T细胞的多价抗体。我们已经制备了 含gp160基因的HIV疫苗，所述gp160基因选自普通实验室的毒株； 选自在受感染种群中发现的显著的初级病毒分离物；选自被设计用来 暴露交叉毒株的突变gp160，中和抗体表位；选自其他有代表性的HIV 基因如gag基因(在HIV分离物中有≥95％的保守性)；选自SIV， 它提供检测HIV PNV的动物模型，在所述模型中可以免疫并攻击非人 灵长类以检测病毒负载和疾病的进度。

实际上未发展成免疫缺损状态的所有血清阳性患者均含有抗-gag CTL，而其中约60％的患者表现出交叉毒株，gp160特异性CTL。 在已经发展成已知为AIDS的受感染个体中发现的HIV特异性CTL量 很少，这说明我们发现的成果在于我们可以诱导交叉毒株CTL反应。 由于HIV晚期基因表达是REV依赖性的，所以设计gp160和gag接种 载体以产生REV(约90％保守)，从而有利于REV依赖性的基因表 达。本发明的另一益处是还产生抗REV免疫反应。这就是我们疫苗的 另一优点，由于在细胞感染后很早，而在晚期基因产物合成前几小时 就大量产生REV，由此提供了一个通过疫苗诱导的T细胞反应，包括 CTL和T辅助细胞较早进行干扰的机会。

在本发明的另一实施方案中，制备混合疫苗，其中将不同HIV REV 依赖性基因构建体混合在一起以便除产生抗免疫原性的HIV REV依赖 性基因产物的抗体和CTL外，还产生抗REV CTL反应。根据本实施 方案，将含一个启动子和两个IRES序列的三顺反子构建体中编码 gp160，接着REV，然后B7的一个多核苷酸以另一多核苷酸混合， 后者编码gag基因产物，REV，和B7或另一免疫调节或免疫刺激基 因产物，如IL-12或GM-CSF。在这种方式中，注射一个或多个 核苷酸就可产生抗数个HIV相关免疫原的免疫反应。另外，将含REV 独立的基因产物，如在WO93/20212中描述的，B7的一个多核苷酸和 另一免疫调节或免疫刺激基因，如IL-12或GM-CSF与另一REV 依赖性的或REV独立性的双或三顺反子表达构建体混合在一起。此 外，可以制备并混合编码HIV或其他抗原的多双或三顺反子构建体以 生产多价组合多核苷酸疫苗。

我们的env，REV和gag多核苷酸疫苗构建体在小鼠，兔和灵长类中 诱导免疫反应。监测小鼠中抗env的抗体生产可以确定，所给的构建 体是适宜致免疫的，即高比例的接种动物表现出了抗体反应。小鼠还 提供了适宜检测我们构建体诱导的CTL的最易得到的动物模型，因此 用于评价特定构建体是否能够产生所述的活性。但是，已经表明小鼠 细胞系不支持有效的REV或tat功能。这种观察是在HIV LTR驱动的 晚期基因表达中得到的，而且有限量的数据表明异源启动子可以使 REV在小鼠细胞中发挥作用。兔和猴(非洲绿猴，恒河猴，黑猩猩) 为在较大的非啮齿动物中评价抗体提供了包括灵长类的其他种。由于 抗小鼠血清中所观察到的反转录病毒的高水平内生中和活性，这些种 对于抗血清中和试验小鼠也是优选的。这些数据表明用我们的疫苗产 生了足够的免疫原性，从而在黑猩猩/HIVIIIB攻击模型的试验中得到 得到作用。在科学界目前出现并逐渐接受的保护的定义正在离开所谓 “消毒免疫力”，这意味着完全抵御HIV感染，以防止疾病。该目的 的许多相关数包括降低血液病毒滴定度，按HIV反转录酶活性，血清 样品的感染性，p24的ELISA检测或血液中其他HIV抗原浓度，增加 的CD4+T细胞浓度以及扩展的存活率计[见例如，Cohen，J.，科学262： 1820-1821，1993，有关讨论抗HIV疫苗效力的引伸定义]。本发明的免疫 原还产生抗HIV感染性(临床的初级野外)分离株的中和免疫反应。 免疫学 A.对env的抗体反应

1.gp160和gp120。用ELISA试验检测表达分泌的gp120或膜结 合的gp160的疫苗载体对于生产env特异性抗体是否是有效的。开始 用gp160转染的细胞溶解产物的免疫印迹分析体外表征我们接种载体 所表达的env。用抗gp41和抗gp120单克隆抗体确认这些数据并定量 分析gp160表达以肉眼观察转染体细胞的gp160表达。在本发明的一 个实施方案中，由于下列原因gp160对于gp120来说是优选的：(1) 开始的gp120载体在小鼠中会引起不一致的免疫原性，而且在非洲绿 猴中反应性很低或没有反应性；(2)由于包含gp41，gp160通过增 加约190个氨基酸残基而引起附加的中和抗体和CTL表位；(3)从 四聚体组装和总的构型来看，gp160表达与病毒env更相似；和(4) 我们发现，象在小鼠，雪貂和非人灵长类中产生中和抗体肥应的膜结 合的流感病毒HA构建体的成功一样[参见Ulmer等，科学，259：1745- 1749，1993；Montgomery，D.等，DBA和细胞生物学，12：777-783， 1993]，抗gp160抗体产生优于抗gp120抗体产生。用下列划线的试验 确定选择哪一类型env或env亚片段的混合物是否是优选的。

2.中和活性的出现和幅度。检测来自兔和猴的ELISA阳性抗血清， 并且表明它们中和同源和异源的HIV毒株。

3.V3对非-V3中和抗体。env PNV的主要目的是产生广泛的中和 抗体。现在已经表明抗V3环的抗体的毒株特异性非常高，而且用此反 应的血清学来确定毒株。

a.非-V3中和抗体似乎主要识别引起CD4结合的gp120内的不 连续的结构表位。抗该区域的抗体是多克隆的和交叉中和更广泛的， 这可能是由于因病毒与其细胞配体结合的需要而强加的突变的限制。 用一个体外试验通过受免疫动物血清检测gp120与固定在96孔培养上 CD4结合的阻断。第二个体外试验检测与代表在塑料上固定的选定的 V3区的合成肽结合的直接抗体。这些试验是抗血清兼容的而且限定了 我们疫苗已产生的中和抗体类型，并提供与病毒中和的体外相关性， 所述抗血清来自在我们的研究中所用的任何动物类型。

b.gp41含至少一个主要的中和决定基，相当于由广泛中和的2F5 单克隆抗体(可从病毒测试系统公司，得克萨斯贸易大楼600，塔维斯 大街，休特4750，休斯顿，TX 77002-3005(美国)或瓦尔得海姆 Pharmazeutika GmgH，玻尔兹曼格斯11，A-1091维恩，奥地利，购买) 识别的高度保守的线性表位，以及其他潜在位点，包括位于gp41 N- 末端的很保守的“融合肽”区。除用上述抗gp41的抗体检测外，将一 个体外试验用于与合成肽结合的抗体，所述合成肽代表固定在塑料上 的这些区。

4.体反应的成熟。在HIV血清阳性患者中，中和抗体反应主要从抗 -V3发展以包括更多的中和抗体，所述抗体含有包括gp41表位的上 述gp120结构区表位。在时间进程和随后的接种过程中监测这些类型 的抗体反应。 B.抗env，REV，nef和gag的T细胞反应性

1.产生CTL反应。在细胞内合成的病毒蛋白质引起MHCI-限制 的CTL反应。这些蛋白质中的每个都在血清阳性患者中引发CTL。我 们的疫苗也能够在小鼠中引发CTL。按照用流感病毒NP说明的，小 鼠品分的免疫遗传有助于所述研究[参见Ulmer等，科学，259：1745- 1749，1993]。已经在Balb/c小鼠中限定了HIV蛋白质env，REV，nef和 gag的数个表位。因此有利于体外CTL培养和细胞毒性试验。另外， 有利的是使用用这些基因转染的同系肿瘤系，如鼠肥大细胞瘤以提供 CTL以及体外抗原特异性再刺激的靶。定义能够引发MHCI型限制性 细胞毒T淋巴细胞之免疫原的方法是已知的[参见CalinLaurens等，疫 苗11(9)：974-978，1993；特别参见Eriksson等，疫苗，11(8)：859-865， 1993，其中在灵长类中作出了在HIVgp120上T细胞激活表位的图谱， 而且发现，包括gp120氨基酸142-192，296-343，367-400 和410-453的数个区域诱导淋巴增殖；此外不连续区248-269和 270-295也是淋巴增殖性的。还发现包括氨基酸152-176的肽也诱 导HIV中和抗体]，而且可以用这些方法鉴定在本发明PNV中所包含 的致免疫表位。另外，可以使用编码gp160，gp120蛋白酶或gag的完 整基因。有关此领域的其他综述参见例如Shirai等人，免疫学杂志 148：1657-1667，1992；Choppin等人，免疫学杂志，147：569-574，1991； Choppin等人，免疫学杂志，147：575-583，1991；Berzofsky等人，临 床研究杂志，88：876-884，1991。如在本文中所用的，T细胞效应物功 能与成熟的T细胞表型有关，如细胞毒性，用于B细胞激活的细胞因 子分泌和/或巨噬细胞和噬中性粒细胞的补充和刺激。

2.TH活性的测量。通过加入重组蛋白质或肽表位来监测得自接种 动物脾细胞培养物恢复特异性抗原的情况。伴随脾抗原递呈细胞 (APC)的出现，通过增殖这些培养物或细胞因子生产来监测所述抗 原激活的T细胞。因细胞因子生产的方式可以将TH反应分成1型或2 型。由于在免疫受损的血清阳性患者中，明显的TH2反应与细胞免疫 力的除去有关，因此可以限定患者中由给定PNV产生的反应类型，从 而控制所得的免疫反应。

3.延迟型超敏反应(DTH)。皮内注射后对病毒抗原的DTH是细 胞初级MHCII限制性免疫力的指标。由于可以从市场上购买已知表位 的重组HIV蛋白质和合成肽，所以在用这些试剂接种的脊椎动物中很 容易确定DTH反应，由此提供诱导细胞免疫力的另一体内相关性。 保护作用    

以上述免疫学研究为基础，可以预测我们的疫苗在脊椎动物中，对 于抗毒性HIV攻击是有效的。用HIVIIIB/黑猩猩攻击模型，在用PNV 构建体或PNV构建体混合物有效接种这些动物后，完成了这些研究， 所述PNV构建体混合物由gp160IIIB，gagIIIB，nefIIIB和REVIIIB组 成。由于已经确定了该毒株致命量的黑猩猩滴定度，所以IIIB毒株就 这点而论是有用的。然而，还要用任何HIV毒株和给定毒株特异性的 或与其异源的表位进行研究。除黑猩猩外，第二个接种/攻击模型是 scid-hu PBL小鼠。随后在小鼠宿主中进行HIV攻击，该模型可以检测 人淋巴细胞免疫系统和我们的疫苗。该系统的优点在于它很容易适用 于任何HIV毒株，而且提供抗HIV初级野外分离物的多个毒株的保护 作用。第三个攻击模型使用杂交HIV/SIV病毒(SHIV)，已表明其 中有些感染恒河猴，并会导致引起死亡的免疫缺损疾病[见Li，J.，等，艾 滋病杂志，5：639-646，1992]。用我们的多核苷酸疫苗构建体对恒河猴 的接种对于随后用致死量SHIV攻击有保护作用。 PNV构建体综述

将HIV和其他基因优选的连接到对于多核苷酸接种特别优化的表达 载体中。根据本发明的公开，生产数种所述载体的方法是可能的。基 本上除去了所有的额外DNA，只剩下了必需的元件：转录启动子，致 免疫表位，带有它们自己的启动子或IRES的编码免疫增强或免疫调节 基因的其他顺反子，转录终止子，细菌复制起点和抗生素抗性基因(如 前所述)(见图2)。本领域专业人员应该理解导入体外转录的RNA 以生产由本发明DNA对应物编码的多顺反子mRNA自然构成了本发 明的必要部分。为了达到该目的，需要使用转录启动子，并用T7或 SP6启动子这样的强RNA聚合酶启动子，并用线性化的DNA模板进 行连续转录。这些方法是本领域熟知的。

HIV晚期基因，如env和gag的表达是REV依赖性的，而且要求 REV反应元件(RRE)存在于病毒基因转录本上。在缺乏REV的情 况下，通过用如来自tpa(组织型纤溶酶原激活物)的异源前导肽，优 选用如发现于商度表达的哺乳动物蛋白质的前导肽，如免疫球蛋白前 导肽来取代gp120前导肽即可产生分泌形式的gp120。我们已将tPA- gp120嵌合基因插入到在转染细胞(RD，人横纹肌肉瘤系)有效表达 分泌的gp120的V1Jns载体中。我们还研究了以IRES(IRES＝内部 核糖体进入位点)为基础的双顺反子V1Jns载体，所述载体含有gp160 (含RRE)和在转染细胞系(293，人胚胎肾细胞系；和RD)中有 效表达gp160的REV。在未加入REV表达载体而转染后，单顺反子 gp160不生产任何蛋白质。双顺反子gp160/REV生产出与共转染gp160 和REV单顺反子载体相似量的gp160。从这些研究可以预测，相对于 gp160和REV载体的混合物而言，双顺反子载体在经肌肉内导入体内 后，能够更有效地表达gp160，这是由于双顺反子保证在结构上扩展 的多核肌肉细胞内gp160构建体和REV接近。这种双顺反子策略还可 以保证在载体转录本区域内，包含RRE后表达gag。它还支持在双或 三顺反子PNV中表达无关的基因，如共表达HIV致免疫表位，流感病 毒致免疫表位，癌相关的抗原和免疫调节基因如白细胞介素，B7和 GM-CSF。 代表性的构建体组分包括(但不限于)(见图2，顺反子I，II和III)：   1  tPA-gp120MN   2  gp160IIIB/IRES/REVIIIB；   3  gp160IIIB；   4  REVIIIB；   5  tat/REV/gp160(弱表达gp160的基因组IIIB克隆)；   6  REV/gp160；   7  gp160MN；   8  夹自临床相关的初级HIV分离物的gp160；   9   nef，用来自临床相关毒株的基因；   10  gagIIIB：为抗-gag CTL；   11  tPA-gp120IIIB：为黑猩猩研究；   12  带结构突变的gp160：来自HIV临床相关毒株的V3环取代； 在数个构建体上的数个突变，如除去可变环，Asn突变以除去立体 (steric)结构的碳水化合物障碍，中和抗体表位；和CD4结合位点拆卸 (knockout)突变；   13  gp41：特异性地引发抗-gp41中和抗体，特别是位于跨膜区 之前的2F5单克隆抗体表位，它在许多毒株中有广泛的保守性。在没 有gp120的情况下，很难表达所述肽，而且需要数种策略，如最近的 报道发现剪接到流感病毒HA环顶的2F5表位能够引发HIV中和抗 体；另外，提供适宜的前导序列，如在tPA信号肽中的前导序列就可 以表达所述的基因产物；   14  gag：与上述#5的构建体相似，用来自临床相关毒株的基因；   15  rev：为gp160和gag双顺反子；   16  B7编码序列；   17  GM-CSF序列；   18  白细胞介素序列，特别是编码IL-12的；   19  肿瘤相关的抗原；   20  编码由除HIV以外的病原体表达的抗原的基因，所述抗原包括 但不限于流感病毒核蛋白，血细胞凝集素，基质，神经氨酸酶和其他 抗原蛋白质；单纯性疱疹病毒基因；人乳头瘤病毒基因；结核病抗原； 甲，乙或丙型肝炎病毒抗原；以及其组合和其他抗原以至少形成双顺 反子构建体，所述构建体可以与多种其他的多顺反子构建体组合以提 供能够引起抗所有代表的病原体或肿瘤抗原之免疫反应的混合液组合 物。

在HIVenv构建体中，本领域专业人员可以识别表达编码各种envV3 环氨基酸序列的核酸的需要性。作为一个实例，任何或所有下列氨基 酸序列或其部分均可由本发明的HIV多核苷酸免疫原编码：

用于PNV构建体的gp160V3环序列的总结 北美/欧洲共有序列，SEQ.ID：1： CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysSerIleHisIleGlyProGlyArgAla PheTyrThrThrGlyGluIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCys MN. SEQ.ID：2： CysThrArgProAsnTyrAsnLysArgLysArgIleHisIleGlyProGlyArgAla PheTyrThrThrLysAsnIleIleGlyThrIleArgGlnAlaHisCys IIIB(HXB2R)，SEQ.ID：3： CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArgIleArgIleGlnArgGlyProGly ArgAlaPheValThrIleGlyLysIleGlyAsnMetArgGlnAlaHisCys 116-v. SEQ.ID：4： CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysGlyIleHisIleGlyProGlyArgAla PheTyrThrThrGlyLysIleIleGlyAsnIleArgGlnAlaHisCys 452-p，SEQ.ID：5： CysThrArgProSerAsnAsnAsnThrArgLysSerIleHisIleGlyProGlyLys AlaPheTyrAlaThrGlyAlaIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCys 146-v，SEQ.ID：6： CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgArgSerIleHisIleAlaProGlyArgAla PheTyrAlaThrGlyAspIleIleGlyAspIleArgGlnAlaHisCys

通过用本发明的非复制质粒DNA免疫，来说明多核苷酸HIV免疫 原抗随后的病毒攻击的保护性效力。由于不涉及感染剂，不需要组装 病毒颗粒，允许进行决定基选择，所以这样是有利的。此外，由于在 不同HIV毒株中，gag和蛋白酶以及数种其他病毒基因产物的序列是 保守的，所以能够达到抗毒性HIV毒株攻击的保护作用，所述HIV毒 株与克隆基因所来自的毒株同源或异源。

肌肉内注射编码gp160的DNA表达载体产生抗随后的病毒攻击的 显著保护性免疫力。具体说，产生了gp160特异性抗体和初级CTL。 尽管可变被膜蛋白质有抗原漂移，但抗保守蛋白质的免疫反应还可有 效。由于不同HIV基因产物有一定程度的保守性，而且由于为应答细 胞内表达和MHC加工而产生了CTL，所以可预测许多病毒基因会引 起与gp160的相似的反应。因此，按克隆并连接在表达载体中所表明 的(见下文)，已经克隆了许多这些基因以便这些构建体是可获得形 式的致免疫剂。

本发明提供了不需自我复制剂或佐剂就可诱导交叉毒株保护性免疫 力的方法。另外，用本发明的多核苷酸免疫有许多优点。首先，接种 方法应该可用于肿瘤和感染剂，原因是CD8+CTL反应对于生理学过 程都是重要的[K.Tanaka等，免疫研究年鉴，6，359(1988)]。因此，引 发抗转化过程中重要的蛋白质的免疫反应可能就是癌症保护或免疫治 疗的有效方法。第二，在注射病毒蛋白质和人生长激素DNA后产生高 滴定度抗被表达蛋白质的抗体[见如，D.-cTang等，自然，356，152， 1992]，这表明这是容易得到的，而且是制备分离的或与细胞毒T淋巴 细胞疫苗组合的基于抗体的疫苗的高度有效的方法，所述细胞毒T淋 巴细胞疫苗以保守抗原为靶。

与常规蛋白质纯化方法相比，DNA构建体生产和纯化的容易性促 进了组合疫苗的产生。因此，可以制备，混合并同时施用如编码gp160， gp120，gp41或任何HIV基因的多种构建体。最后，由于注射DNA 后保持蛋白质的表达[H.lin等，循环，82，2217(1990)；E.Hansen等， FEBS通讯290，73(1991)；S.Jiao等，人体基因治疗，3，21(1992)；J.A. Wolff等，人体分子基因治疗，1，363(1992)]，B-和T细胞记忆的保留 延长[D.Gray和P.Matzinger，实验医学杂志，174，969(1991)；s.Oehen 等，出处同上，176，1273(1992)]，由此产生了长效的体液和细胞介 导的免疫力。

用制备和纯化DNA构建体的标准分子生物学技术就能够制备本发 明的DNA免疫原。尽管标准分子生物学技术足以生产本发明的产物， 但是本文公开的特异性构建体提供了产生跨毒株和初级HIV分离物 中和的多核苷酸免疫原，这是迄今为止用标准未激活的全病毒或亚单 位蛋白质疫苗所不能得到的结果。

被导入到疫苗受体中的可表达DNA或被转录的RNA量取决于所用 的转录和翻译启动子的强度和被表达基因产物的免疫原性。一般，将 免疫或预防有效剂量的约1ng-100mg优选约10μg-300μg直接施 用到肌肉组织中。还可使用皮下注射，皮内导入，通过皮肤传递，和 其他的施用方式如腹膜内，静脉内或吸入。还可以进行加强免疫。用 HIV多核苷酸免疫原接种后，还可以用HIV蛋白质免疫原如 gp160，gp120和gag基因产物加强。在不经肠导入本发明PNV的同时 或之后，不经肠使用，如静脉内，肌肉内，皮下或以其他方式施用白 细胞介素-12蛋白质是有利的。    

所述多核苷酸可以是裸露的，即与任何蛋白质，佐剂或损害受体免 疫系统的其他试剂无关。在这种情况下，要求所述多核苷酸是在生理 学可接受的溶液中，如但不限于无菌盐水或无菌缓冲的盐水。另外， 可以将所述DNA与脂质体如卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质 体相连，作为DNA-脂质体混合物，或者所述DNA可以与本领域已 知的佐剂相混合以加强免疫反应，所述佐剂如蛋白质或其他载体。使 用有助于细胞摄取DNA的试剂，如但不限于钙离子，也是有利的。本 文提到的这些试剂是作为转染促进剂和药物学可接受的载体。用多核 苷酸包被微射弹(microprojectiles)的技术是本领域已知的，而且与本发 明有关的也是有用的。    

因此，本发明的一个实施方案是多核苷酸，在其导入到哺乳动物组 织中后，可在体内单个细胞中诱导两个或三个不同的不连续的基因产 物的共表达，所述多核苷酸含有：

第一个转录启动子，它位于转录控制的第一顺反子的上游和位于其 中，在真核细胞中可有效地操作：在第一顺反子下游的第二顺反子， 它位于第一转录启动子或第二转录启动子的转录控制下；任选地第三 顺反子位于第二顺反子的下游，它位于第一转录启动子，第二转录启 动子，或第三转录启动子的转录控制下；

在第一，第二和第三顺反子后都有转录终止子，除非其后紧接的是 没有其自己的转录启动子的另一顺反子。

在另一实施方案中，本发明是一多核苷酸，它含有在真核细胞中不 能复制，但在将多核苷酸导入到真核组织体内后，能够被表达以产生 基因产物的连续核酸序列。所编码的基因产物优选地是作为免疫刺激 剂或作为能够产生免疫反应的抗原。因此，在本实施方案中的核酸序 列编码剪接的REV基因，人免疫缺损型病毒(HIV)致免疫表位，和 可选的，细胞因子或T细胞共刺激因子如B7家族蛋白质的成员。

在另一实施方案中，本发明是在体内单个细胞中共表达两个或三个 不同基因产物的方法，包括将约0.1μg-100mg的本发明多核苷酸 导入到脊椎动物组织中。

在另一实施方案中，本发明是用REV依赖性HIV基因在体内诱导 免疫反应的方法，包括：

a)分离REV依赖性HIV基因；

b)将所分离的基因与调节序列相连以便借助于可操作相连的控制 序列而使所述基因可表达，在所述控制序列导入到活组织中后，可指 导所述基因的转录起始和随后的翻译。

c)将可表达的基因导入到活组织中；

d)将编码HIV REV的基因反式或顺式导入到HIV REV依赖性基 因中；和

e)另外，可用附加的可表达HIV基因强化。

本发明的另一实施方案涉及诱导抗原递呈细胞以刺激HIV抗原特异 性的细胞毒T细胞增殖的方法。这包括将脊椎动物体内细胞暴露与多 核苷酸，所述多核苷酸由抗原HIV表位，REV(如果抗原HIV表位 依赖于REV的有效表达)，和B7编码序列组成。

下列实施例将进一步描述本发明，但不是为了将本发明限定到具体 的实施例。 材料描述 载体，pF411和pF412：从R.Gallo的实验室构建的载体pSP62亚克隆 这些载体。pSP62是从生物技术研究实验室公司得到的试剂。pSP62 有一个HXB2基因组的12.5 kb xbaI片段，所述基因组是从λHXB2 亚克隆的。pSP62的SalI和XbaI消化产生HXB2片段：5’-XbaI/SalI， 6.5 kb和3’-SalI/XbaI，6kb。将这些插入片段亚克隆到pUC18的SmaI 和SalI位点，产生pF411(5’-XbaI/salI)和pF412(3’-XbaI/SalI)。 pF411含gag/pol，而pF412含tat/rev/env/nef。

Repligen试剂：

重组rev(IIIB)，#RP1024-10

重组gp120(IIIB)，#RP1001-10

抗-rev单克隆抗体，#RP1029-10

抗-gp120mAB，#1C1，#Rp1010-10

AIDS研究和有关的试剂程序： 抗-gp41mAB杂交瘤，Chessie8，#526

                   实施例1 用于疫苗生产的载体 A)：从pCMVIE-AKI-DHFR[Y.Whang等，病毒学杂志，61，1796 (1987)]构建表达载体V1。通过用EcoRI消化所述载体而除去AKI和 DHFR基因，然后自我连接。所述载体不含CMV启动子中的内含子A， 所以将其作为有一缺失的内部SacI位点[在按B.S.Chapman等，核酸研 究，19，3979(1991)计数的1855位]的PCR片段加入。用于PCR反应的 模板是pCMVint-Lux，它是通过连接来自pCMV6a120[B.S.Chapman 等，出处同上]的HindIII和NheI片段而制成的，所述HindIII和NheI 片段包括hCMV-IE1增强子/启动子和内含子A，将其插入到pBL3的 HindIII和XbaI位点而产生pCMVIntBL。将来自RSV-Lux[J.R.de Wet等，分子细胞生物学，7，725，1987]的1881碱基对的萤光素酶基因片 段(HindIII-SmaIKlenow补平)克隆到经Klenow补平和磷酸酶处理 的pCMVIntBL的SalI位点。 覆盖内含子A的引物是：

5′引物，SEQ.ID：7：

5′-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3′；3′引物，SEQ ID：8：

5′-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3′    

为除去SacI位点而使用的引物是：

有义引物，SEQ ID：9：

5-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3′

和反义引物，SEQ ID：10：，

5′-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3′

用Sac I和Bgl II切割所述PCR片段，然后将其插入到已用相同酶 切割过的载体中。 B)：V1J表达载体，SEQ ID：12：

我们产生V1J的目的是从我们的载体V1中取出启动子和转录终止 元件以便将其放在一个更确定的位置，从而得到更紧密的载体，并提 高质粒的纯化率。

V1J是从载体V1(见实施例1)和pUC18衍生的，后者是可以从 市场上购买的质粒。用SspI和EcoRI限制酶消化V1，产生两个DNA 片段。从琼脂糖电泳凝胶中纯化较小的片段，它含有控制异源基因表 达的CMVintA启动子和牛生长激素(BGH)转录终止元件(SEQ ID：13)。然后用T4DNA聚合酶“平整”该DNA片段的末端以便 使其易与另一“末端平整”的DNA片段相连。

选择pUC18提供所述表达载体骨架。已知它可产生高产率的质粒， 而且对其序列和功能特征都非常了解，并且是最小的。通过用HaeII 限制酶部分消化，我们从该载体中除去整个lac操纵子，所述操纵子对 于我们的目的没有用处，而且还会损害质粒产率和异源基因的表达。 从琼脂糖电泳凝胶中纯化剩下的质粒，用T4DNA聚合酶作成平整末 端，用牛肠碱性磷酸酶处理，然后与上述CMVintA/BGH元件相连。 得到在pUC骨架中，启动子元件有两个可能的方向的质粒。其中之一 在大肠杆菌中有很高的DAT产率，将其称为V1J(SEQ ID：12)。 通过连接区的序列分析来证明所述载体的结构，并表明其异源基因的 表达与V1可比或比V1高。 C)：V1Jneo表达载体，SEQ ID：14：

需要除去含V1J之细菌中用于抗生素筛选的ampr基因，原因是氨苄 青霉素不能用于大规模发酵罐。用Ssp I和Eaml 105I限制酶消化除去 VIJpUC骨架中的ampr基因。用琼脂糖凝胶电泳纯化剩下的质粒，用 T4DAT聚合酶作成平整末端，然后用牛肠碱性磷酸酶处理。用PstI限 制酶切出得自转座子903并含在pUC4K质粒中的市售kanr基因，用琼 脂糖凝胶电泳纯化，然后用T4DNA聚合酶作成平整末端。将所述片段 与V1J骨架相连，然后得到在两个方向均可能带kanr基因的质粒，分 别称为V1Jneo#’s1和3。通过限制酶消化分析，连接区的DNA测序 来确定每个质粒，表明产生与V1J相似量的质粒。V1Jneo载体在异源 基因产物的表达方面也可与V1J相比。我们果断地选择V1Jneo#3(下 文称为V1Jneo，SEQID：14)作为表达构建体，它在与V1J中ampr 基因相同的方向上含有kanr基因。 D)：V1Jns表达载体：

将一个Sfi I位点加到V1Jneo中以便有利于整合研究。将市售的13 个碱基对的SfiI接头(新英格兰生物实验室)加在所述载体BGH序列 内的KpnI位点。用KpnI将V1Jneo线性化，凝胶纯化，用T4DNA聚 合酶补平，然后与平整的Sfi I接头相连。用限制酶图谱选择克隆分离 物，用接头的序列分析确定。将所述新载体称为V1Jns。在V1Jns(带 Sfi I)中异源基因的表达与V1Jneo(带KpnI)中相同基因的表达相 当。 E)：pGEM-3-IRES：

当将脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)并置 在两个基因之间时，它可以使在一个mRNA转录本内有效表达所述的 两个基因。我们利用所述的非编码基因片段来产生用于多核苷酸疫苗 的双顺反子表达载体。将EMCVIRES片段亚克隆为来自pCITE-1质粒 (Novagen公司)的0.6kb的EcoRI/BssHII消化片段。将所述片段用琼脂 糖凝胶纯化，用T4DNA聚合酶作成平整末端，然后将其连接到已经用 XbaI消化，用T4DNA聚合酶平整末端化并已磷酸化的pGEM-3(普洛 麦格公司)中。得到在pGEM-3中所述DNA有两个可能的方向的克隆 并用DNA测序确定各连接位点。构建双顺反子载体的优选方向是位于 接近pGEM-3内BamHI位点的IRES内的NcoI位点。将所述载体称为 pGEM-3-IRES。 F)：pGEM-3-IRES*：

制备在IRES序列内含PCR寡聚物赋予之突变的第二个IRES载体 (IRES*)，与野生型IRES相比，所述突变可使IRES驱动的表达最 优。分别用下列有义和反义寡聚物，使用pCITE-1质粒(Novagen公司) 完成IRES*的PCR扩增：5’-GGT ACA AGA TCT ACT ATA GGG AGA CCG GAA TTC CGC-3’，SEQ.ID：11，和5’-CCA CAT AGA TCT GTT CCA TGG TTG TGG CAA TAT TAT CAT CG-3’SEQ，ID：15。反 义密码子中划线的突变残基从IRES 3’末端NcoI/Kozak序列中所含的 优选ATG中消除了一个上游ATG。 G)：pGEM-3-IRES/REV：

用合成寡聚物从pCV-1(目录#303，NIH艾滋病研究和参考规划) 扩增HIVIIIbREV。有义和反义寡聚物分别是：5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC AGC-3’，SEQ.ID：16和5’- CCA CAT AGA TCT GAT ATC GCA CTA TTC TTT AGC TCC TGA CTC C-3’，SEQ ID：17。这些寡聚物在翻译开放阅读框架的任一末端提 供BglII位点，在rev3’末端的BglII位点正上游提供EcoRV位点。PCR 后，用NcoI(位于Kozak序列内)和BglII限制酶处理REV基因然 后与已用NcoI和BgHI限制酶处理的pGEM-3-IRES相连。用DNA测 序确定各连接接口和完整的0.3 kb REV基因。 H)：V1Jns-tPA：

为了提供分泌的异源前导肽序列和/或膜蛋白质，修饰V1J组织特异 性纤溶酶原激活剂(tPA)前导序列。将两个合成的互补寡聚物退火， 然后连接到已用BglII消化的V1Jn中。有义和反义寡聚物是5’-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3’ ，SEQ.ID：18：，和5’-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3’，SEQ.ID：19：。在有义寡聚物中划线的是Kozak 序列。这些寡聚物含用于连接BglII裂解之序列的悬垂碱基。连接后破 坏了上游的BglII位点，但保留了下游的BglII位点以便进行连接。用 DNA测序确定这两个连接位点和tPA前导序列。另外，为了与我们的 共有优化的载体V1Jns(＝带SfiI位点的V1Jneo)一致，通过用T4DNA 聚合酶将KpnI位点制成平整末端，然后与SfiI接头(目录#1138，新 英格兰生物实验室)连接，从而将SfiI限制位点放在V1Jn-tPA的BGH 终止子区内的KpnI位点。用限制酶消化和琼脂糖凝胶电泳确定所述修 饰。 I)：V1Jns-HIVIIIbREV：

按上述有关pGEM-3-IRES/REV的描述用PCR扩增REV，用BglII 限制酶消化，然后连接到已用BglII和牛肠碱性磷酸酶处理的V1Jns 中。用DNA测序确定连接接口，通过体外转染RD细胞和免疫印迹分 析(大于1μg得到的REV/106细胞)确定REV表达。 J)：pGEM-3-RRE/IRES/REV：

为了制备由REV反应元件(RRE)组成的盒，为了发生REV依赖 性表达，所述元件就需在RNA转录本上，用下列合成寡聚物，经PCR 得到来自HIV毒株HXB2的RRE：有义寡聚物：5’-GGT ACA TGA TCA GAT ATC GCCC GGG C CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AG-3’，SEQ.ID：20：；和反义寡聚物，5’-CCA CAT TGA TCA G CTT GTG TAA TTG TTA ATT TCT CTG TCC-3’，SEQ.ID：21：；。这些寡 聚物在所述插入片段的任一末端提供了BclI限制位点，在插入片段的 5’端提供了EcoRV和SrfI位点。将RRE制成平整末端，在位于IRES 前的HincII限制位点连接到PGEM-3-/IRES/REV中。用限制酶图谱和 跨连接接口的DNA测序确定连接产物。

                   实施例2 gp120疫苗：

按如下构建表达为gp120的REV依赖性env基因：从HIV的MN 毒株中PCR克隆gp120，所述毒株携带天然前导肽序列(V1Jns- gp120)或用组织纤溶酶原激活剂(tPA)前导肽取代天然前导肽的融合 序列(V1Jns-tPA-gp120)。已经表明tPA-gp120表达是REV独立性 的[B.S.Chapman等，核酸研究，19，3979(1991)；应注意到，在产生 gp120基因REV独立性方面，其他前导序列也可提供相似的功能]。利 用上述载体，制备gp120构建体就可达到该目的： I.gp120疫苗构建体：

A)：V1Jns-tPA-HIVMNgp120：：用设计的寡聚物经PCR扩增 HIVMNgp120基因(Medimmune公司)以除去所述肽前导序列中的前 30个氨基酸，并且有利于克隆到V1Jns-tPA中，以产生由tPA前导肽， 在30个氨基酸残基后接剩余gp120序列的嵌合蛋白质。所述设计使得 可以进行REV独立性的gp120表达并从含所述质粒的细胞中分泌可溶 的gp120。所用的有义和反义PCR寡聚物是5’-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3’，SEQ.ID：22：，和5’-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3’SEQ.ID：23：。划线的是翻译终止密码子。这些寡聚物在 翻译开放阅读框架的任一末端含BamHI限制酶位点，所述开放阅读框 架在有义寡聚物的BamHI的3’端含一个BclI位点。用BclI接着用 BamHI相继消化PCR产物，然后连接到已用BglII消化，接着用牛肠 碱性磷酸酶处理的V1Jns-tPA中。将所得的载体测序以确定在tPA前 导序列和gp120编码序列之间的框内融合，用转染的RB细胞的免疫印 迹分析确定gp120表达和分泌。因此，将编码tPA-HIVMNgp120的载 体包含在表达gag，B7或其他抗原的双或三顺反子构建体中是有用 的。

B)：V1-tPA-HIVMNgp120：用我们较早的基本疫苗表达载体的版本， V1(见核酸药物专利)制备与上述嵌合-tPA-HIVMNgp120载体有轻微 不同的载体，所述V1含有与V1Jns-tPA不同的tPA前导肽序列。

在前述任一PNV构建体中，在翻译终止密码子之后，免疫调节基 因，如B7的下游克隆有一IRES序列，这样提供根据本发明方法有用 的双或三顺反子多核苷酸。这些PNV有效地表达两个基因产物。

C)：V1Jns-tPA-HIVIIIBgp120：该载体除使用HIVIIIB的gp120序列 外，其余均类似于I.A.。所使用的有义和反义PCR寡聚物分别是： 5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC- 3’，SEQ.ID：24：，和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3’，SEQ.ID：25：。这些寡聚物在插入片段的 任一末端提供了BclI位点，在3’末端BclI位点上游提供EcoRV。5’ 末端的BclI位点使得可以连接到V1Jns-tPA的BglII位点以得到编码 tPA前导序列和不带其天然前导序列的gp120的嵌合tPA-gp120基因。 用限制消化和DNA测序确定连接产物。 II.体外gp120疫苗表达：

在转染的人横纹肌肉瘤(RD)细胞中检测这些构建体的体外表 达。从RD细胞中分泌的tPA-gp120的量表明V1Jns-tPA-gp120载体 生产分泌的gp120。。 III.体内gp120接种： 见图12(小鼠数据)：

由分泌的gp120引发的抗-gp120ELISA滴定度

种                     GMT(范围)

小鼠               5310(1.8×103-1.5×104)   (2轮后，200μg/轮)

兔                 143(75-212)   (3轮后，2mg/轮)

非洲绿猴           171(＜10-420)   (2轮后，2mg/轮) *用V1Jns-tPA-gp120IIIB作为接种载体，肌肉内注射。 V1Jns-tPA-gp120MNPNV诱导的II型MHC限制的T淋巴细胞gp120特 异性抗原反应性。杀死用200μg V1Jns-tPA-gp120MN接种了两次的 Balb/c小鼠，取出其脾脏，体外确定辅助T淋巴细胞与重组gp120的 反应性。用PBMC(外周血单核细胞)，使用5μg/ml 4×105细胞 /ml的重组gp120IIIB(Repligen，目录号#RP1016-20)完成T细胞增殖试 验。只在培养基中通过培养所述细胞来得到由这些细胞所摄取的3H- 胸苷的基本水平，而用2μg/ml ConA刺激来诱导最大增殖。ConA -诱导的反应性峰在～3天，在那时将其与对照培养基样品一起收集， 而在5天收集抗原处理的样品和另一对照培养基。将接种的小鼠反应 与天然的，年龄匹配的同种小鼠相比较。正如预期的，对于天然和免 疫的小鼠，ConA阳性对照均有很高的增殖。在接种的小鼠中，用gp120 处理得到很强的辅助T细胞记忆反应，而天然小鼠不反应(特异反应 性阈值是一个＞3-4的刺激指数(SI)；SI是样品cpm/培养基cpm的比 值)。与这些小鼠分别为5643和11900的抗-gp120ELISA滴定度相 比，接种小鼠的SI分别是65和14。令人惊奇地是，对这两只小鼠而 言，抗体较高的应答者的T细胞反应性明显低于具有较低抗体滴定度 的小鼠。该试样表明分泌的gp120在体内有效地激活了辅助T细胞， 并产生了强抗体反应。另外，这些免疫反应中的每一个均可用与由接 种PNV编码抗原异源的抗原来确定(IIIB对MN)：

有V1Jns-tPA-gp120MN接种后脾脏T细胞对rgp120的增殖反应   Avg.CPM    刺激指数   小鼠  #(agp120滴度)3培养基1   ConA1   培养基2

rgp1202   #1(天然的＜10)  339(1)  185，358(546)  187(1)  574(3)   #2(天然的＜10)  237(1)  229，775(969)  283(1)  511   (1.8)   #3(免疫；5643)  317(1)  221，003(697)  354(1)   23，109(65)   #4(免疫；11，900)229(1)  243，427(1063)235(1)

  3384(14)

1在用3H-胸苷24小时后的第4天收集细胞。使用2μg/ml浓度 的ConA。

2在用3H-胸苷24小时后的第5天收集细胞。使用5μg/ml浓度 的重组gp120IIIB。

3.使用2轮200μgDNA/小鼠(Balb/c)后，抗-gp120IIIB互为终点 的ELISA滴定度和完成的增殖试验。

前述的数据清楚地表明用多核苷酸疫苗抗原体内有效地表达了相关 HIV抗原，并引发了对所表达基因产物的特异性免疫反应。通过在 gp120翻译终止密码子下游包含一个编码REV，B7，gag或其他与 HIV无关的抗原(如流感病毒核蛋白或血细胞凝集素编码基因)的第 二或第三顺反子，很容易修饰所述构建体以形成双顺反子PNV。

                         实施例3 gp160疫苗

除分泌的gp120构建体外，我们还制备了全长膜结合的gp160的表 达构建体。除gp120的外，gp160构建体的基本原理是(1)对于CTL 刺激和生产包括gp41的中和抗体可得到更多的表位，直接抗它的是潜 在HIV中和单克隆抗体(2F5，见上文)；(2)相对于病毒产生的 gp160，可以得到更接近于天然蛋白质的结构；和(3)用于免疫原性的 膜结合流感病毒HA构建体的成功[Ulmer等，科学，259：1745-1749， 1993；Montgomery，D.等，DNA和细胞生物学，12：777-783，1993]。

gp160保留了基本的REV依赖性，甚至还带有异源前导肽序列。因 此，开发了两种不同与用于gp120表达的策略，以制备gp160表达载 体：(1)将一基因组HIV DNA片段亚克隆到V1Jns中，报告认为所 述片段对于含tat，REV和整个gp160的异源gp160表达(V1Jns- tat/REV/env)是有效的，[Wang等，美国国家科学院院刊，90：4156- 4160(1993年5月)；在那项研究中的所有数据是在核酸注射前24小时， 使用丁哌卡因注射而得到的。由于已知丁哌卡因引起肌肉损坏，显然， 这是一种不能用于免疫人的方法]，和(2)将最小gp160ORF经PCR 克隆到EMCV内部核糖体进入位点(IRES)前的双顺反子载体中以 有效地在gp160翻译后再引发编码REV之第二顺反子的翻译。所述构 建体可以确保同时有效地生产gp160和REV蛋白质(V1Jns- gp160/IRES/rev)。除单顺反子载体V1Jns-gp160和V1Jns-REV 外，还逐个制备出了这些载体。由于在文献和我们自己的试验中，有 迹象表明在异源表达系统中，env mRNA需要有稳定作用的tat/REV 剪接供体(SD)位点，因此，通过将所述SD插入到env ORF的上游， 还制备了V1Jns-gp160和V1Jns-gp160/IRES/REV。按如下制备这 些疫苗构建体。 I.gp160疫苗构建体：

将tat/rev剪接供体(SD)在V1Jns内的PstI位点(这是这两种载 体内唯一的PstI位点)插入到gp160的紧邻的上游，从而制备两种gp160 表达载体，V1Jns-gp160和V1Jns-gp160/IRES/REV(见下文A 和B)。设计编码SD的合成互补寡聚物以连接到PstI位点，连接后， 保留在插入片段5’末端的原位点，但是破坏3’末端的位点。所用的寡 聚物序列是：5’-GTC ACC GTC CTC TAT CAA AGC AGT AAG TAG TAC ATG CA-3’，SEQ.ID：26：和5’-TGT CAT ACT TAC TGC TTT GAT AGA GGA CGG TGA CTG CA-3’，SEQ.ID：27：。通过限制酶消化图谱和 跨整个SD/PstI区的DNA测序来确定所得的质粒。 A).V1Jns-HIVIIIbgp160：用PCR从，pF412质粒扩增HIVIIIbgp160，所 述pF412含得自HIVIIIb克隆HXB2之基因组HIVIIIb的一半3’末端。 PCR有义和反义寡聚物分别是：5’-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3’，SEQ.ID：28：，和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C- 3’，SWQ.ID：29：。划线部分是Kozak序列和翻译终止密码子。这些寡聚 物在env基因的两个末端的翻译开放阅读框架外均提供了BclI限制酶 位点。(BclI-消化位点可与BglII消化位点的连接相容，消化后，对 这两种酶均丧失了敏感性。选择BclI用于PCR克隆gp160，是由于该 基因含有内BglII和BamHI位点)。如上所述，这些寡聚物还在BclI 位点前紧接着插入一EcoRV位点以用于PCR衍生的其他基因。将扩增 的gp160基因经琼脂糖凝胶纯化，用BclI消化，然后连接到已经用BglII 消化和牛肠碱性磷酸酶处理的V1Jns中。所克隆的基因为约2.6 kb， 用DNA测序确定gp160与V1Jns的连接。 B).V1Jns-HIVIIIbgp160/IRES/REV：用HinDII和SmaI限制酶(在 pGEM-3多接头区中所含的)消化pGEM-3-IRES/REV，以取出整个 IRES/REV序列(～0.9 kb)，然后与已用EcoRV消化并用磷酸酶处理 的V1Jns-HIVIIIbgp160相连。该过程产生了一个8.3 kb的双顺反子 V1Jns，所述V1Jns含gp160，接着是IRES和指导这两种HIV基因产 物表达的REV。用DNA测序证明所有的连接区。 C).V1Jns-tPA-HIVIIIbgp160：该载体与上述实施例2(C)中的相似， 区别是用PCR得到了不含天然前导序列的全长gp160。有义寡聚物与 在I.C.中所用的相同，而反义寡聚物是5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3；，SEQ ID：30：。这些 寡聚物在插入片段的任一末端提供了BclI位点，在3’末端Bcli位点的 紧上游提供了一个EcoRV。5’末端的BclI位点使得可以连接到 V1Jns-tPA的BglII位点以得到一嵌合tPA-gp160基因，所述嵌合基因 编码tPA前导序列和不含其天然前导序列的gp160。用限制酶消化和 DNA测序确定连接产物。 D).V1Jns-tat/rev/envIIIB：该表达载体是在D.Rekosh等人[美国国家科 学院院刊，85，334(1988)]描述一种载体后组合成的，使用了包 含整个未剪接tat，rev和env的HIV-1IIIB克隆(HXB2)的“基因 组”片段。用BgIII消化V1Jns，用T4DNA聚合酶补平，然后用牛肠 碱性磷酸酶处理。用限制酶消化得到在pF412中所含的IIIB基因组的 SalI/XhoI片段，然后用T4DNA聚合酶补平。用限制酶消化和DNA测 序确定连接产物。 E).V1Jns-rev/envIIIB：该载体是上述D节中所描述的载体的一种变 种，区别是缺失了在外显子I中的整个tat编码区直到REV开放阅读框 架的开始。用PstI和KpnI限制酶消化V1Jns-gp160IIIB(见上述A节) 以除去gp160基因的5’区。用PCR扩增从HXB2基因组克隆中得到编 码第一REV外显子到gp160的KpnI位点的DNA片段。有义和反义 PCR寡聚物分别是5’-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3’，SEQ.ID：31：和5’-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3’，SEQ，ID：32：。这些寡聚物 在所述DNA片段的5’和3’末端提供了PstI和KpnI限制酶位点。用PstI 和KpnI消化所得的DNA，从琼脂糖电泳凝胶中纯化，然后与V1Jns- gp160(PstI/KpnI)连接。用限制酶消化确定所得的质粒。 II.gp160疫苗的体外表达：

用gp160和REV表达构建体瞬时转染RD和293细胞。图5中用抗 gp41单克隆抗体的Western印迹分析(Chessie 8，NIH艾滋病研究和参 考规划#526)表明，V1Jns-gp160(SD)表达gp160需要加入V1Jns- REV(在瞬时转染中该载体产生＞1μgREV/106个细胞)。V1Jns- gp160/IRES/REV有效表达gp160，而不需反式加入REV，这确定了 所述双顺反子的功能。用抗gp120单克隆抗体(1C1， Repligen，#RP1010-10)进行的免疫印迹观察发现了相似的结果。对每 个载体都观察到gp160到gp120和gp41的蛋白水解加工。将REV反 式加入到双顺反子gp160/REV载体中并不会导致成熟更多的gp160表 达，这表明在该载体中REV表达并不限制gp160表达。如果在双顺反 子gp160/REV构建体中包含tat/REVSD，则gp160的表达会提高，这 表明了该位点对于最佳REV-依赖性gp160表达是重要的。我们还惊 奇地发现在进行瞬时转染时，双顺反子gp160/REV比基因组 tat/REV/env构建体表达的gp160多10倍，这再次表明该载体对于gp160 表达是高效的。

这些载体提供了用于gp160质粒接种的核酸构建体，所述gp160质 粒含有gp160和REV基因，这两个基因或在不同的质粒上或在相同的 质粒上。在tpa-gp160构建体的情况下，不需要顺式或反式提供REV 以有效表达gp160，因此，可以让其他基因插入到双顺反子构建体中。

对于REV依赖性构建体，重要的是检测接种后有效gp160表达是否 需要使REV存在于相同质粒上，原因是在肌肉内注射后，肌肉细胞只 摄取了少量的DNA，而个体肌肉细胞(每个有数百个核)在细胞内的 接近位置不可能接受不同质粒的拷贝。 III.用gp160疫苗体内接种：

用编码gp160的PNV比较三种不同载体策略在非人灵长类中诱导抗 -gp120抗体反应的能力：接种使用(1)用V1Jns- gp160IIIB/IRES/REV(SD)的双顺反子gp160/REV；(2)基因组 gp160构建体V1Jns/tat/rev/envIIIB；和(3)单顺反子载体，V1Jns- gp160IIIB(SD)和V1Jns-REV的混合物。用2mg/动物的接种剂量以一个 月的间隔接种三次，同时抽血。列出了用每种载体接种猴子后，用重 组gp120IIIB得到的抗-gp120ELISA滴定度。在恒河猴和非洲绿猴中 双顺反子gp160/REV均引发了抗体反应，而在接种两次后(即一个月 后进行第二接种)，基因组gp160和混合的单顺反子载体没有引发可 检测的抗体。通过使用重组gp41(ABT)作为固定底物的BIAcore测定 法来进行测量，接受了双顺反子gp160/REV的所有四种猴还产生了特 异性的抗-gp41反应性(数据为列出)。从这些猴中得到的血清还表 明：抗V3IIIB ELISA反应性的滴定度为～50-100。这些结果证明，用 多顺反子PNV诱导的体内表达与用体外转染方法得到的结果不同，在 所述体外转染方法中是用共三种载体策略表明gp160表达。特别注意 到，与双顺反子gp160/REV相比，体外转染导致与混合单顺反子gp160 和REV载体等量的表达(见图5)。这些试验证明，我们的双顺反子 PNV在体内接种后产生了有效的协调表达，而用多顺反子接种的其他 方法则做不到这点。见图9，表明了两只非洲绿猴和两只恒河猴和一 只兔的免疫反应。

在2mgDNA/轮接种的非人灵长类中，由gp160PNV引发的

抗-gp120ELISA滴定度

                          滴度

载体/种           第二轮后    第三轮后

V1Jns-tat/rev/envIIIB：

非洲绿猴    (#1)    ＜20         ND1

            (#2)    ＜20         ND

            (#3)    ＜20         ND   V1Jns-gp160IIIB+V1Jns-rev2：

非洲绿猴    (#1)    ＜20         ND

            (#2)    ＜20         ND

            (#3)    ＜20         ND   V1Jns-gp160IIB/IRES/rev：

非洲绿猴    (#1)      85         90

            (#2)      75         60

恒河猴      (#1)     165        175

            (#2)     290        260   1ND＝未确定   2该PNV表示两种单顺反子载体的等摩尔混合物    

在2mgDNA/轮接种的非人灵长类中，由gp160/rev双顺反子

引发的抗-V3IIIBELISA滴定度

种         动物#       滴定度(第三轮    接种后)

          非洲绿猴       (#1)            70

                         (#2)            45

            恒河猴       (#1)            55

                         (#2)           100

用V1Jns-gp160IIIB/IRES/rev作为接种载体

                      实施例4 SIV疫苗

从SIVMBC251病毒分离物的基因组克隆中经PCR克隆构建SIVenv 构建体，V1Jn-SIV gp152，通过DNA测序确定与载体的两个连接。 所述毒株与在新英格兰地区灵长动物中心(NRPC)用于对恒河猴的感染 性SIV攻击的病毒同源。制备相似的构建体，其中编码前导肽区的DNA 使用其他密码子，但仍保留天然氨基酸序列。这样降低了所述构建体 的REV依赖性，并得到更稳定的mRNA转录本。按如下制备这些疫苗 构建体。 I.SIV疫苗构建体：

A).V1J-SIV MAC251P28GAG：选择被称为p28gag的SIVgag 的中心肽用于检测在非人灵长类中产生CTL的多核苷酸疫苗。gag的 该区编码macaque猴的已知CTL表位，其MHC I型单元型为Mamu- A01。因此，在用适当的gag质粒接种后，携带该单元型的猴应当对 该gag表位有CTL反应性。尽管SIV和HIVgag基因均含有REV依赖 性调节序列，但p28 gag表达对REV的依赖性似乎较小，以致在没有 REV的情况下，至少可得到一些表达。

用常规合成寡脱氧核糖核苷酸从质粒p239SpSp5’(从NIH艾滋病研 究和参考规划，目录#829得到的)经PCR扩增后，用BglII限制酶位点将 SIVp28gag克隆到表达载体V1中。该质粒编码SIVMAC239基因组的 5’那一半。SIVMAC239是SIVMAC251体外传代的结果， SIVMAC251与亲本病毒相比有一些突变。在这些病毒p28gag的氨基 酸序列是相同的。PCR有义和反义寡聚物是：5’-GGT ACA GAG TCT ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT GGT AAC- 3’，SEQ.ID：33：，和5’-CCA CAT AGA TCT TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC C-3’，SEQ ID：34：。这些寡核苷酸在翻译开放框架外提供 了BglII限制酶，共有Kozak翻译起始密码子(划线的)和翻译终止密 码子(划线的)。琼脂糖凝胶纯化PCR产生的p28gag，用BglII消化， 然后连接到BglII处理的，磷酸酶处理的V1中。随后用BglII限制酶 位点，将该基因亚克隆到我们的优化表达载体，V1J中，称为V1J- SIVp28gag。克隆的基因约0.7kb长。通过对各构建体的DNA序列分 析，确定V1JCMV启动子和p28gag5’末端的连接位点。用SIV感染的 macaque猴的血浆，进行Western印迹分析，来比较V1J和V1构建体 的SIVp28蛋白质的体外表达以检测gap蛋白质。V1J-SIVp28gag 构建体始终产生最多适当分子量的产物。用更优化的V1Jneo，V1Jns和 V1R载体得到了相似的结果，甚至改善的结果。

B).V1J-SIVMAC251 nef：从编码整个SIVMAC251基因组 (Dr.Vanessa Hirsch，NIAID.NIH.Rockville，MD；现在目录为#133， NIH艾滋病研究和参考规划)的质粒pBK28，经PCR扩增后，克隆 SIV nef。PCR有义和反义寡聚物是5’-GGT CAC ACC AGT GGT GGA GCT ATT TCC ATG AGG-3’，SEQID：35和5’-CCT AGG TTA GCC TTC TTC TAA CCT CTT CC-3’SEQ ID：36。划线的是Koza位点和翻译 终止密码子。将扩增的nef基因经琼脂糖凝胶纯化，用T4DNA聚合酶 作成平整末端，用T4 DNA激酶使5’末端磷酸化，然后克隆到已用牛 肠碱性磷酸酶磷酸酶化的V1J的纯端BglII限制酶位点。克隆的基因 约0.76 kb。用DNA测序确定V1JCMV启动子和nef的5’末端的连接 位点。用Western印迹分析和HIV nef抗血清(目录号#331，NIH艾 滋病研究和参考规划)显示体外表达。

C).V1Jn-SIVMAC251gp152：从质粒pBK28 PCR扩增后，将称为 gp152的SIVenv克隆到V1Jneo中(见核酸药物专利)。PCR有义和 反义寡聚物是5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA TGT CTT GGG AAT CAG C-3’，SEQ ID：37：和5’-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GTA TGA GTC TAC TGG AAA TAA GAG G-3’，SEQ ID：38。划线的是Kozak 位点和琥珀翻译终止密码子。PCR产物在两个末端的翻译开放阅读框 架外均有BglII限制酶位点，在3’-末端的BglII前，琥珀终止密码子 后还有一个EcoRV位点。这对于随后的克隆步骤提供了方便的限制酶 位点。将扩增的gp152基因经琼脂糖凝胶纯化，BglII消化，然后与已 用BglII消化并用磷酸酶处理的V1Jn相连。克隆的基因的为2.2Kb用 DNA测序确定gp152的各末端与V1JnCMV启动子和BGH终止子区的 连接。 II  带SIV疫苗的体内疫苗：

已经用两个SIV基因构建体接种恒河猴，并且在非人灵长类中已经 产生了特异性的CTL反应(见图4)。

将V1J-SIVp28 gag和V1J-SIVnef以3 mg/接种的量肌肉内注 射到Macaca mulatta猴中，相隔一个月注射3次，所述V1J-SIV p28 gag表达相当REV独立性的gag中心肽。带Mamu-A01 MHCI单元型 的恒河猴的gag特异性CTL反应主要受p28 gag内单肽表位的限制。 接受V1J-SIVp28 gag的Mamu-A01+猴在第二次注射后一个月的开 始有gag特异性的CTL活性，而接受该DNA的Mamu-A01-猴和接受 V1J对照DNA的猴没有CTL反应。在体外，分别在第二和第三轮接种 后，检测到gag肽再刺激的CTL和初级CTL。这些CTL活性水平可 以与用痘苗-gag接种而产生的水平相比。随后，在产生反应的动物 中的CTL水平降低。V1J-SIV nef-接种的动物没有特异性CTL反 应，尽管更精确的检测，如在gag CTL检测中所用的(即未给恒河猴 定义显著的MHCI单元型/nef肽关系，以致用未知效力的肽进行刺激， 并没有阳性对照)可以提供不同的结果。

                      实施例5 其他疫苗构建体：

A.V1Jns-HIVIIIBgag/pol-RRE/IRES/REV：通过PCR扩增带数个改 变的HIVIIIBgag-pol序列来制备编码带有或不带有pol蛋白酶区的gag 的双顺反子表达载体。包含pol的蛋白酶(prt)片段可以将gag蛋白 水解加工成含成熟衣壳颗粒的不同肽(如p17，p24，p15等)，而删去该 酶会导致以不成熟的衣壳颗粒形式合成p55。不能包含更多的pol序列 以避免可能与pol反转录酶和整合酶活性相关的潜在安全问题。不论是 否加工成成熟形式，对于从细胞中排出的gag衣壳颗粒，在开始Met 两个位置后，Gly氨基酸的豆蔻酰化是必须的。该Gly残基的诱变消 除了豆蔻酰化，而且不会再从细胞中排出gag颗粒。gag的这些修饰 使得我们可以确定在用所述gag载体接种后，抗gag CTL的产生是否 受蛋白水解加工和/或从细胞中衣壳排出的影响。下文所列的有些载体 含有位于gag开放阅读框架上游的剪接供体(SD)位点。这些载体使 得我们可以确定所述SD对于优化gag的rev-依赖性表达与含tat/revSD 可使gp160表达最佳一样，是否是必需的。

1).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV：分别用下列有义和反义寡 聚物，经PCR扩增得到gag-prt编码DNA片段：5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GGT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC- 3’，SEQ ID：39：和5’-CCA CAG GGA TCC GC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC TAA TGA-3’，SEQ ID：40：。这些寡聚物在所 述片段的任一末端提供了BamHI限制酶位点，包含NcoI位点的Kozak 翻译起始序列，和在3’末端BamHI上游的SrfI位点。用SrfI位点将来 自经用ECORV限制性酶切割的pGEM-3-RRE/IRES/REV的 RRE/IRES/REV盒克隆到gag-prt的紧下游。经DNA测序确定所有的 连接接口，然后再用限制酶图谱确定所述构建体。

2).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV(SD)：按上述载体1制 备所述载体，不同之处仅在于：使用的PCR有义寡聚物是：5’-GGT ACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3’，SEQ ID ：41：。这样可以包含在gag序列开始的上游SD位点。用限制酶图谱和 连接接口的DNA测序确定所述该构建体。

3).V1Jns-HIVIIIBgag-prt/RRE/IRES/REV(w/o豆蔻酰化)：按上述 载体1制备所述载体，不同之处仅在于：使用的PCR有义寡聚物是： 5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3’，SEQ ID：42。

4).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV：按上述载体1制备所述载体， 不同之处仅在于：使用的PCR反义寡聚物是：5’-CCA CAT GGA TCC GCC CGG GCC TTT ATT GTA ACG AGG GGT CGT TGC-3’，SEQ ID：43。

5).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV(SD)：按上述载体4制备所 述载体，不同之处仅在于：所用的PCR有义寡聚物是：5’-GGT ACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3’，SEQ ID：44。

6).V1Jns-HIVIIIBgag/RRE/IRES/REV(w/o豆蔻酰化)：按上述载体 5制备所述载体，除所用的PCR有义寡聚物是5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3’，SEQ ID：45。

B.V1Jns-HIV nef：所述载体使用一个nef基因，所述基因来自用 与于SIV nef类似的有义和反义PCR寡聚物感染的群体中的代表性毒 株。

C.pGEM-3-X-IRES-B7：(其中X＝任何抗原基因)作为双顺反 子疫苗构建体的实例，所述构建体可协调表达编码免疫原的基因和编 码免疫刺激蛋白质的基因，从B淋巴瘤细胞系CH1(从ATCC得到的) PCR扩增鼠B7基因。B7是一蛋白质家族的成员，所述蛋白质通过在 主要组织相容性复合物I和II中的抗原，提供T细胞激活所必需的共 刺激。CH1细胞是B7 mRNA的良好来源，原因是它们有组成型激活 的表型，而B7主要由激活的抗原递呈细胞，如B细胞和巨噬细胞表达。 再用cAMP或IL-4和用标准硫氰酸胍方法制备的mRNA体外刺激这 些细胞。使用用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer cetus)和 寡聚物引物(5’-GTA CCT CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3’， SEQ ID：46：)的mRNA完成cDNA合成，所述寡聚物是位于B7 翻译开放阅读框架下游的B7特异性的。分别用下列有义和反义PCR 寡聚物，经PCR扩增B7：5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3’，SEQ ID：47：，和5’-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAT GAA GAC GGT CTG TTC-3’，SEQ ID：48：。 这些寡聚物在所述插入片段的末端提供了BglII限制酶位点，和含NcoI 限制位点的Kozak翻译起始序列，以及正好位于3’-末端的BglII位点 前的另一NcoI限制性位点。NcoI消化产生了适于克隆到已被NcoI有 化的PGEM-3-IRES中的片段。所得载体，pGEM-3-IRES-B7含很容易 转移到V1Jns-X(其中X代表抗原编码基因)中的IRES-B7盒。

D.pGEM-3-X-IRES-GM-CSF：(其中X＝任何抗原基因)该载 体含有类似于在上述C部分中描述的那些的盒，除使用免疫调节细胞 因子，GM-CSF而不是B7外。GM-CSF是巨噬细胞分化和刺激 细胞因子，已经表明它可在体内引发潜在的抗肿瘤T细胞活性 [G.Dranoff等，美国国家科学院院刊，90，3539，91993)]。

E.pGEM-3-X-IRES-IL-12：(其中X＝任何抗原基因)该载体 含有类似于在上述C部分中描述的那些的盒，除使用免疫调节细胞因 子，IL-12而不是B7外。已经表明IL-12对于改变对细胞，T细 胞优势的途径的免疫反应有影响，所述的免疫反应与体液应答相反 [L.Alfonso等，科学，263，235，1994]。

F.V1Jns-HIVxgp160/IRESrevIIIB(SD)：该载体类似于在上述I.B. 中描述的载体，除使用得自各种临床毒株的gp160基因，而不是得自 实验室毒株IIIB的gp160外。

G.V1Jns-PR8/34/HA-IRES-SIVp28 gag

就经IRES元件的协调表达而言，该构建体提供了与SIVp28gag基 因一致的流感病毒血细胞凝集作用基因(HA)。分别用下列有义和 反义寡聚物，经PCR扩增PR8/34/HA基因：5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG AAG GCA AAC CTA CTG TGC CTG-3’，SEQ.ID：49，和5’- CCA CAT AGA TCT GAT ATC CTA ATC TCA GAT GCA TAT TCT GCA CTG C-3’，SEQ.ID：50：。所得的DNA片段在任一末端含有BglII 限制酶位点，在3’-末端有EcoRV位点。BglII消化后，将该基因克 隆到先用BglII消化，然后用碱性磷酸酶处理过的V1Jns中。通过NcoI 和BglII消化，从V1J-SIVp28gag中切出SIVp28gag。用NcoI和BamHI 消化pGEM-IRES，然后直接与p28gag/NcoI/BglII连接。通过用SmaI 和HindII限制消化取出IRES-p28gag盒，然后连接到V1Jns- A/PR8/34/HA的EcoRV位点。通过PNV接种(HA)，这些基因的体 内协调表达可以产生潜在的抗体反应，同时必需T细胞辅助，在局部 环境中提供所述的辅助以促进第二基因产物(SIVp28gag)的CTL反 应。该构建体还表明了利用本发明PNV和方法以产生抗多抗原的免疫 反应的能力，不论所述抗原是否与HIV有关。本领域专业人员应该理 解，所述类型的构建体可以与其他，双或三顺反子构建体混合以生产 多价组合的多核苷酸疫苗。

H.V1Jns-tPA-gp160IIIB/IRES/SIVp28gag：用EcoRV消化V1Jns- tPA-gp160IIIB，然后用牛肠碱性磷酸酶处理，再与通过限制酶SmaI 和HindII消化已经从pGEM-3-IRES-SIVp28中取出的IRES-SIVp28gag 相连。这些基因的体内协调表达可以将产生强辅助T细胞反应的蛋白 质(gp160)与提供I型MHC-相关的CTL表位(SIVp28gag)的 蛋白质偶联。设计该疫苗，以用来免疫恒河猴，使其产生抗env中和 抗体和CTL以及抗SIVgagCTL。随后用适当的SHIV病毒攻击物攻击 这些猴[见J.li.et.al.，J.A.I.D.S.5，639-646(1992)]。

I.V1Jns-tPA-gp120IIIB/IRES/SIVp28gag：按V1Jns-tPA- gp160IIIB/IRES/SIVp28gag构建所述载体，除用V1Jns-tPA-gp120IIIB 代替gp160基因外。按上述完成接种和SHIV攻击。

J.V1Jns-tPA-gp120IIIB/IRES/HIVgag/IRES/rev：该载体与上述的 相似，除三顺反子不但提供了gp120，还提供了gag和rev表达。

K.V1Jns-tPA-gp160IIIB/IRES/HIVgag/IRES/rev：该载体与上述的 相似，除三顺反子不但提供了gp160，还提供了gag和rev表达。

                      实施例6 HIV细胞毒T淋巴细胞的检测：

象用于接种小鼠的一样，说明本节描述的方法。灵长类可以使用基 本相似的检测方法，除必须建立作为各动物靶细胞的自体B细胞系 外。人可以使用E-B病毒，恒河猴可以使用疱疹B病毒来完成。为 了将红细胞与白细胞分开，使用Ficoll-Hypaque离心，从新鲜抽出的血 液或脾中得到外周血单核细胞(PBMC)。对于小鼠，使用淋巴结也 可以。从PBMC中通过在IL-2(20U/ml)和伴刀豆蛋白A(2μ g/ml)中体外培养6-12天或通过使用等量辐射的抗原递呈细胞的特 异性抗原制备效应物CTL。特异性抗原可以由合成肽(通常9-15 个氨基酸)或经工程加工后表达适当抗原的痘苗病毒构建体组成，所 述合成肽是所用动物MHC元型体CTL识别的已知表位。靶细胞可以 是同种的或MHC单元型匹配的细胞系，所述细胞系已经处理递呈与 CTL体外刺激所述一样的适当抗原。对于Balb/c小鼠，可以使用10μ M浓度的p18肽(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn， SEQ ID：51，HIV MN毒株)以便用辐射的同种脾细胞体外再刺激 CTL，在细胞毒性试验前，以1-10μM的浓度于37℃保温约2小 时，在所述试验中而用所述肽使靶细胞敏感。对于H-2dMHC单元型 小鼠，鼠肥大细胞瘤细胞系p815提供了良好的靶细胞。通过于37℃ 将靶保温1-2小时(0.2m Ci～5×106细胞)，然后将所述靶细胞洗 涤数次，用Na51CrO4负载抗原敏感化的靶细胞，所述Na51CrO4是在用 CTL杀死靶细胞后，从所述靶细胞内释放的。以不同比例的效应物： 靶，如100∶1，50∶1，25∶1等将CTL群体与靶细胞混合，一 起沉淀，在收集上清液前在37℃保温4-6小时，然后用γ计数器检 测上清液中释放的放射性。将细胞毒性计算为从靶细胞中可释放的总 计数的百分比(用0.2％Triton X-100处理得到的)，已经从总计数中 减去了从靶细胞中的自发释放。

                        实施例7 HIV特异性抗体的检测：

用特异性重组蛋白质或合成肽为底物抗原，设计ELISA以检测抗 HIV的抗体。在摇晃平台上，用在50μl/孔PBS(磷酸缓冲盐水)溶 液中，2μg/ml的重组抗原于4℃覆盖96孔微滴定板。抗原由重组 蛋白质(gp120，rev：Repligen公司；gp160，gp41：美国生物技术公司)或 合成肽(对应于来自IIIB等病毒分离物序列的V3肽：美国生物技术公 司，单克隆抗2F5的gp41表位)组成。用洗涤缓冲液(PBS/0.05％吐 温20)将培养板漂洗4次，然后在室温加入200μl/孔的阻断缓冲液 (在PBS/0.05％吐温20中的1％Carnation milk溶液)阻断1小时同 时振荡。以所需的稀释范围，用阻断缓冲液稀释前血清和免疫血清并 以每孔100μl加入。将培养板在室温保温1小时，同时振荡，然后用 洗涤缓冲液洗涤4次。然后将与辣根过氧化物酶结合的第二抗体(抗 恒河猴Ig，南方生物技术联合公司；抗小鼠和抗兔Ig，Jackxon免疫研究 公司)(用阻断缓冲液以1∶2000稀释)以100μl/孔加到各样品中， 在室温保温1小时，同时振荡。用洗涤缓冲液将培养板洗涤4次，然 后通过加入100μl/孔邻苯二胺(o-PD，Calbiochem公司)来显色， 所述邻苯二胺溶液在pH4.5的100 mM柠檬酸缓冲液中，浓度为1 mg/ml。在450nm读培养板的吸收值，包括动力学的(反应的前10分 钟)和10和30分钟终点的(Thermomax microplate reader，分子器件公 司)。

                        实施例8 HIV中和抗体的检测：

按如下完成使用得自被接种动物血清的HIV分离物试验的体外中和 作用。在使用前将试验血清和免疫前血清在56℃加热失活60分钟。 将滴定量的HIV-1加到1∶2系列稀释的试验血清中，在加入到96 孔微滴定板中的105MT-4人淋巴样细胞中之前，在室温保温60分 钟。在37℃将病毒/细胞混合物保温7天，然后通过用四唑嗡染料将培 养物染色来检测病毒介导的细胞杀死作用。通过防止病毒介导的细胞 死亡来观察病毒的中和作用。

                  实施例9 在用有毒性的HIV-1攻击后对黑猩猩的保护作用：

迄今为止，唯一的动物HIV攻击模型是使用黑猩猩。尽管黑猩猩中 不发生与HIV相关的免疫缺损疾病，但可以用某些HIV病毒分离物感 染它们。虽然正在研究其他分离物的攻击原种，如SF2的，但是到目 前为止在该模型中最常用的毒株是IIIB毒株(BH10)。我们设想用 类似于接种其他非人灵长类的方法，用来自本文所述的HIV-1IIIB毒 株(HXB2克隆)滴定的HIVenv和gag-pol构建体接种黑猩猩，以得 到抗-HIV体液和细胞应答。尽管象我们的接种构建体基因一样，用 于黑猩猩的BH10攻击病毒是IIIB衍生的，但是，在该种病毒内有不 均匀性，以致HXB2只是病毒接种物中至少三种IIIB变异体中的仅有 一种。因此，用HXB2基因接种的猴的IIIB攻击试验不完全是同源的。

我们用0.1-3mg质粒/轮的剂量，用多核苷酸HIV基因疫苗给黑猩猩 接种3-5轮。在表征了疫苗诱导的体液和CTL抗-HIV反应后，通 过静脉内施用在使用前用生理盐水稀释1∶25的HIV-1IIIB接种物， 用10-140CID50(50％的黑猩猩感染剂量)攻击这些猴子。通过用 从试验黑猩猩的PBMC中得到的DNA，检测HIV-1病毒特异性的 DNA序列来监测黑猩猩的感染。(参见实施例10的详细描述)。可以 将疫苗介导的保护作用描述为对攻击病毒的反应范围，所述范围从完 全摧毁免疫力(在感染后不能检测到病毒)到由攻击原种诱导的病毒 血症显著减弱和/或延迟。尽管显然，摧毁免疫力是接种最优选的反应， 但是使用人疫苗而减弱或延迟的病毒血症会显著地影响免疫缺损疾病 的发生。

                        实施例10 临床HIV分离物基因的分离：

从感染的用ConA处理激活的PBMC中克隆HIV病毒基因。得到病 毒基因的优选方法是使用位于所需基因侧的特异性寡聚物，从感染的 细胞基因组中用PCR扩增。得到病毒基因的第二种方法是从感染细胞 的上清液中纯化病毒RNA，然后用PCR从所述RNA制备cDNA。该 方法非常类似于上述克隆鼠B7基因的方法，除所用的PCR寡聚物和 使用的随机六聚体产生cDNA而不是特异性的引物寡聚物。

通过将感染细胞沉淀溶解在STE溶液(10 mMNaCl，10 mMEDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0)中来纯化基因组DNA，所述STE 溶液中已分别加入终浓度为0.1mg/ml和5％的蛋白酶K和SDS。在 56℃将所述混合物保温过夜，然后用0.5体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶ 24∶1)抽提。通过加入终浓度为0.3M的乙酸钠和两体积的冰冷乙醇 来沉淀水相。从溶液中沉淀出DNA后，将所述DNA重悬在0.1×TE 溶液(1×TE＝10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。此时加入 SDS达到0.1％，和2U的RNAse A，在37℃保温30分钟。用酚/氯 仿/异戊醇抽提所述溶液，然后按前述用乙醇沉淀。将DNA悬浮在0.1X TE中，通过其在260 nm的紫外线吸收值来测量定量。将样品贮存在 -20℃，直到用于PCR。

用Perkin-Elmer Cetus试剂盒，和分别使用下列gp160有义和反义寡 聚物的方法完成PCR：5’-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3’，SEQ ID：52：和5’-GGG CTT GTC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3’，SEQ ID：53：。这些寡聚物在所得DNA 片段的3’末端加入了一个SrfI位点。将PCR衍生的片段克隆到V1Jns 或V1R接种载体中，通过DNA测序确定V3区和连接接口位点。

                   实施例11 跨疫苗构建体接口的序列：

克隆实施例10中的基因。在每种情况下，用下列引物确定从5’启 动子区(CMVintA)到克隆基因的接口序列：CMVinta引物5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG -3’，SEQ ID：54：，它产生了编码序 列的序列。这与终止子/编码序列邻接，还列出了其接口。用下列引物 产生该序列：BGH引物5’-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3’，SEQ ID：55：，它产生了非编码链的序列。在各种情况下，根据来自GENBANK 的已知序列检索所述序列以便克隆并确定来自这些或其他HIV分离物 的基因的序列。接口的位置用“/”表示，这不代表序列中的任何不连 续。在各序列中的第一个“ATG”是各克隆基因的翻译起始密码子。 所提供的各序列代表有关设计的HIV基因的完全的，可得到的且可表 达的DNA构建体。所述命名延用惯例：“载体名称-HIV毒株-基因”。 每个构建体的生物效力按前文实施例用相同的方法列出：

跨CMVintA和HIV基因5’接口和跨HIV基因和BGH终止子表达 构建体的序列，使用不同的HIV毒株和蛋白质： 1.V1Jns-revIIIB： SEQ ID：56： 5’GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTC ATC AAG-3’

rev….

(序列在PCR寡聚物的5’末端开始，。见下文#7有关完全的rev5’ 末端序列) SEQ ID：57： 5’-GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT CT/GAT ATC GCA CTA

    BGH rev... TTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TGT-3’ 2. V1Jns-gp160IIIB： SEQ ID ：58： 5’-CTT AGA TC/A ACC ATG AGA GTG AAG GA GAA ATA TCA GCA CTT GTG

CMVinta gp 160

GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG CAC CA T GCT CCT TGG GAT GTT GAT GAT CTG TAG TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT- 3’ SEQ.ID：59： 5′-CTG GCA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TC/A GAT AGT GTC CCC ATC TTA

    BGH                                       gp160 TAG CAA AAT CCT TTC CAA GCC CTG TCT TAT TCT-3′ 3.pGEM-3-IRES：[使用SP6(5′-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3′，SEQ.ID：60：)和T7(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′. SEQ.ID：61：)引物测序，Promega Biotech] SEQ.ID：62： 5′-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/AAT TCC G…

pGEM-3(SP6)                 IRES SEQ.ID：63： 5′-A CCC GGG GAT CCT CT/A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA…

pGEM-3  (T7)                       IRES 4.pGEM-3-IRES/revIIIB：[rev 3′末端使用T7测序引物(Promega)，   IRES/rev接口使用IRES 3′-寡聚物(5′-GG GAC GTG GTT TTC   C-3′，SEQ.ID：64：)] SEQ.ID：65： 5′-TAT GGC CAC AAC C/AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA

    IRES                     rev CCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT-3′ SEQ.ID：66：     5′-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/AGA CTA TAG CGT GAT AAG AAA TCG AGG

    pGEM-3                   rev ACT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3′ 5.pGEM-3-RRE/IRES/revIIIB：[使用SP6测序寡聚物 (Promega)和IRES 5′-寡聚物，5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′， SEQ.ID：67：] SEQ.ID：68： 5′-TTG CAT GCC TGC AGG T/GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG/C

pGEM-3                        RRE CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-3′

IRES-5′ SEQ.ID：69： 5′-GGG GCG GAA TT/T AGA GTC A/ATT GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTA

                                             RRE-3′ ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC…-3′ 6.V1Jns-(tat/rev SD)：[供V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)和

V1Jns-gp160IIIB(SD)使用；使用与gp160互补的寡聚物，

朝gp1605末端方向读并读至CMVintA以测序：

5-CCA TCT CCA CAA GTG CTG-3，SEQ.ID：70：] SEQ.ID：71： 5′-AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA/TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT

   CMVintA                             tat/rev SD AGA GGA CGG TGA/CTG CAG AAA AGA CCC ATG GAA A-3′

                     CMVintA 7.V1Jns-gp160IIIB/IRES/revIIIB(SD)：[使用IRES 5-寡聚物测定 gP160/IRES接口的序列，5′-G CTT CGG CCA GTA ACG-3′’ SEQ.ID：73： 5′-GGC ACA GCA GAT C/AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CAC TAT TCT TTA

    BGH                  rev GCT CCT GAC TCC TGA CTC-3′ SEQ.ID：74： 5′-GGA ATT/TGA GTC ATC/CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC CAA-3′

    IRES                     gp160 8.V1Jns-gag-prtIIIB(SD)： SEQ.ID：75： 5′-CTT AGA TC/C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3′

    CMVintA                  gag(SD) SEQ.ID：76： 5′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC

    BGH                      prt TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′ 9.V1Jns-gag-prtIIIB： SEQ.ID：77： 5′-CTT AGA TC/CAC CAT GGG TGC GAG AGC GTC AGT ATT AA GCG GGG CMVintA                     gag GGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT…-3′ SEQ.ID：78： 5′-GGC ACA GCA GAT C/CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC

   BGH                       prt TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC…-3′ 10.V1Jns-tPA： SEQ.ID：79： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT C/ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC

CMVintA                       tPA前导序列 TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/G ATC

 BGH TGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3′ 11.V1Jns-tPA-gp120MN： SEQ.ID：80： 5′-TTC GTT TCG CCC AGC GA/TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3′

    tPA                      gp120MN SEQ.ID：81： 5′-GGC ACA GCA GAT C/CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3′

   BGH                      gp120MN 12.V1J-SIV.MAC251 p28 gag SEQ.ID：82： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT CT/ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT

  CMVintA                     p28 gag... GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3′ SEQ.ID：83： 5′-GGC ACA GCA GAT CT/TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC CGG TCC-3′

   BGH                       p28 gag 13.V1J-SIV. MAC251nef SEQ.ID：84： 5′-TCA CCG TCC TTA GAT C/GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATG

   CMVintA                              nef..... AGG CAA TCC AAG CCG GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3′ SEQ.ID：85： 5′-GGC ACA GCA GAT CA/C CTA GGT TAG CCT TCT TCT AAC CTC TTC CTC

   BGH                  nef.... TGA CAG GCC TGA CTT GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3′ 14.V1Jns-tat/rev/env： SEQ.ID：86： 5′-ACC GTC CTT AGA T/TC GAC ATA GCA GAA TAG GCG TTA CTC GAC AGA

   CM VintA              tat/rev/env GGA GAG CAA GAA ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG-3′ SEQ.ID：87： 5′-GGC ACA GCA GAT C/C GAG ATG CTG CTC CCA CCC CAT CTG CTG-3′

   BGH                  tat/rev/env

                   实施例12 T细胞增殖试验：

可以从上文按实施例6所述得到PBMC，并按PBMC种群内的增殖 确定的，检测对特异性抗原的记忆反应。用在收集前，加到培养的最 后18-24小时的细胞培养物中的3H-胸苷来监测增殖。如果已经发 生了增殖，细胞收集器将含同位素的DNA留在滤器上，而静止细胞未 掺入同位素，就不能以游离形式留在滤器上。对于啮齿类或灵长类，4 ×105的细胞铺在共200μl的完全培养基(RPMI/10％胎牛血清)的 96孔微滴定板上。仅用PBMC和培养基确定背景增殖反应，而用1- 5μg/ml的凝集素，如植物血细胞凝集素(PHA)或伴刀豆蛋白A (ConA)产生的非特导性反应作为阳性对照。特异性抗原由已知的肽 表位，纯化的蛋白质或灭活的病毒组成。肽的抗原浓度为1-10μM， 而蛋白质的为1-10μg/ml。凝集素诱导的增殖反应峰在3-5天的细 胞培养中，而抗原特异性峰在5-7天。若得到超过培养基背景至少3 倍的放射性计数，而且常常作为与背景的比率或刺激指数(SI)给出， 则表明发生了特异性增殖。已知HIVgp160含数种已知引起 gp160/gp120免疫的或HIV感染的个体之T细胞增殖的肽。其中最常 用的是：T1 (LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla， SEQ.ID：88：)；T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys， SEQ.ID：89：)；和，TH4 (AspArgValIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg，SEQ.ID：90：). 已经表明这些肽刺激用抗原致敏感化的小鼠，非人灵长类和人的PBMC 的增殖。 参考文献： L.亚瑟等，病毒学杂志，63，5046(1989). [chimp/HIV攻击模式/病毒 中和测试] T.曼尼阿蒂斯等，分子克隆：实验指南， P280，冷泉港实验室， 冷泉港，纽约(1982) [基因组DNA纯化] E.艾米尼等， 病毒学杂志，64，3674(1990)[chimp攻击， 中和测试]

                   实施例13 载体V1R的制备

在持续优化我们的基本接种载体的努力中，我们制备了V1Jns的衍 生物，称为V1R。构建该载体的目的是得到最小的疫苗载体，即没有 不必需的DNA序列，但它仍保留了全部V1J和V1Jns提供的优化的异 源基因表达特征和高质粒产率。我们从文献和试验中确定了(1)在 pUC骨架内的区含可除去但不会影响细菌的质粒产率的大肠杆菌复制 起点；(2)如果插入细菌终止子代替，就可以除去卡那霉素开放阅 读框架后的kanr基因3’区；和(3)可以从BGH终止子的3’端那一半 除去～300bp，而不会影响其调节功能(在BGH元件内的原KpnI限制 酶位点后)。

用PCR从分别代表CMVintA启动子/BGH终止子，复制起点和卡那 霉素抗性元件的V1Jns合成三个DNA片段以构建V1R。用PCR寡聚 物将各片段的特有限制酶加到各片段末端：CMVintA/BGH终止子加 SspI和XhoI；kanr基因加EcoRV和BamHI；和orir加BclI和SalI。 选择这些酶位点是因为它们可以将各PCR衍生的DNA片段与各位点 丢失后的产物直接相连：EcoRV和SspI剩下可互相连接的平整末端 DNA，而BamHI和BclI与SalI和XhoI一样剩下互补的悬垂末端。用 PCR得到这些片段后，用上述表明的适当限制酶消化各片段，然后在 含所有三种DNA片段的一种反应混合物中连接在一起。设计ori的d5’ 末端以包括在该区中正常发现的T2rho独立性的终止子序列，以便它 能够提供卡那霉素抗性基因的终止信息。通过限制酶消化(＞8种酶) 和连接接口的DNA测序确定连接的产物。在V1R内使用病毒基因的 DNA质粒产率和异源表达与V1Jns的相似。载体大小的净减小为1346 bp(V1Jns＝4.86 kb；V1R＝3.52 kb)，见图11，SEQ ID：45：。

用于合成V1R的PCR寡聚物序列(在下列序列的括号中，划线并 鉴定的是限制酶位点)： (1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3′[Sspl]， SEQ.ID：91：，     (2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3′[Xhol]， SEQ.ID：92：      

(用于CMVintA/BGH片段) (3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC- 3′[EcoRV]，SEQ.ID：93： (4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3′ [BamHI]，SEQ.ID：94：

(用于卡那霉素抗性基因片段) (5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG- 3′[Bcll]，SEQ.ID：95：， (6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3′[Sall] SEQ.ID：96：

(用于大肠杆菌复制起点)

使用下列寡聚物测定V1R连接接口的序列：

5′-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3′，SEQ.ID：97：[CMVintA/kanr 接口]

5′-CAA TAG CAG GCA TGC-3′，SEQ.ID：98：[BGH/ori接口]

5′-G CAA GCA GCA GAT TAC-3′，SEQ.ID：99：[ori/kanr]

                   实施例14

PNV研制最重要的HIV基因是env和gag。env和gag对于病毒或 异源表达均需要HIV调节rev蛋白质。因为这些基因产物的有效表达 对于PNV功能是必需的，所以为了接种目的试验两种类型的载体，即 rev依赖性和rev独立性载体。除非特别说明，所有基因均来自HIV- 1(IIIB)实验室分离物。

A.env：根据所使用的基因片段的大小，通过用来自组织特异性纤 溶酶原激活剂(tPA)基因的前导肽取代env的天然前导肽，然后在 含有CMV内含子A的CMV启动子后表达所得的嵌合基因，可以得到 不同效力的rev独立性载体env表达。V1Jns-tPA-gp120是用该方式构 建的分泌gp120载体的实例，所述载体的功能是在接种的小鼠和猴中 产生抗gp120免疫反应。

公开的报道表明，膜固定的蛋白质与分泌蛋白质相比可诱导更实质 性的抗体反应。膜固定的蛋白质还可诱导对其他免疫表位的抗体反 应。为了检测该假设，制备V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/env。按用 体外转染的RD细胞的免疫印迹分析所表明的，tPA-gp160载体产生可 检测量gp160和gp120，而不用加入rev，尽管表达比rev/env，rev 依赖性的gp160表达质粒得到的更低。这可能是由于抑制区的存在， 在包括在gp41的COOH-末端的gp160内的多位点得到gp160转录 本后，可赋予rev依赖性。    

制备经设计含截断形式的tPA-gp160，tPA-gp143和tPA-gp150的 载体以便通过消除这些抑制序列来提高env的总表达。截断的gp160 载体没有含肽基元(如Leu-Leu)的细胞内gp41区，已知所述肽基元 使膜蛋白转化成溶酶体而不是细胞表面。因此，认为与全长gp160相 比，p143和gp150可增加蛋白质到细胞表面的运输，而这些蛋白质在 DNA接种后，能够更好地引发抗gp160抗体。

研究在转染体细胞中gp160/gp120表达的定量ELISA以确定这些载 体以及其他载体(载体rev/tPA-gp160)的相对表达能力，所述其他载 体构成了tPA-gp160和rev/env特征。体外转染293细胞，然后定量 分析细胞相关的对分泌的/释放的gp120产生了下列结果：

(1)对于类似的质粒对rev/env和rev/tPA-gp160，用tPA前导 序列取代gp160的天然前导肽不会增加gp160的表达或释放的gp120 量。这表明在这些细胞中，前导肽不会导致使gp160不能充分地到达 细胞表面。

(2)与细胞内保持的对到达细胞表面的相似比例的rev/env相比， tPA-gp160表达少5-10X的gp160。

(3)与只有低水平的细胞相关的gp143之rev/env相比，tPA- gp143分泌3-6X多的gp120，从而证实gp160的胞质尾会使gp160 在细胞内滞留，但通过部分缺失该序列可以克服这一问题。

(4)在细胞和培养基中，tPA-gp150只有很低水平的gp160，这 表明了该构建体的一个问题或所述截断蛋白质的内在不稳定性。

用转染的293细胞，从初级HIV分离物(含North American共有 序列V3肽环；巨噬细胞向性和非合胞体诱导的表型)的tPA-gp120有 高表达/分泌的gp120，表明已经以功能形式将其克隆。

                      实施例15 血清学试验 A.抗体反应：

1.gp120PNVs：

用V1Jns-tPA-gp120(100，10，1μg：3X)完成小鼠的ID对IM接种试 验。ID接种在开始的时候在低剂量似乎是有利的，但在三轮后，所有 剂量均是等价的。

用V1Jns-tPA-gp120(MN)PNV接种恒河猴(RHM)和非洲绿 猴(AGM)。在这两种灵长类中，gp120抗体的峰GMT有5倍以上 的不同：1780(AGM)和310(RHM)。这些结果表明，与RHM 相比，在AGM中可引发实际上较大的抗体滴定度，并说明通过AGM 接种可以得到较高的HIV中和滴定度。

2.gp160PNVs：在三次注射前，小鼠的V1Jnx-rev/env接种(IM) 不会产生gp160抗体，但在一轮后，ID接种就产生反应，而且比在总 IM试验中产生的都高(GMTs＝2115(ID)和95(IM)；200μg/小 鼠)。这表明rev依赖性构建体通过ID途径作为免疫原更好。

用V1Jns-rev/envID或IM接种的RHM有峰(在4-5次接种(2mg/ 轮)后分别为，GMTs＝790和140)。这些结果与用小鼠发现的一致， 表明rev依赖性PNV对于通过ID接种产生的抗体有较大的效力，尽管 rev独立性构建体V1Jns-tPA-gp120没有这样的作用。接受tPA- gp160DNA(IM)的RHM比接受rev/env的RHM有较低的可变性更 大的抗体反应，从而证实了我们的结论，该载体比rev/env有效表达少 4-7X的gp160。

B.体外病毒中和作用

由Qualty Biologicals，Inc.(QBI)，用HIV(MN)作为病毒来源完成 感染性降低中和试验(读出p24 gag产量)。在低病毒供给时(100 TCID50)，与匹配的prebleed血清相比，在所有抗血清的1/10稀释的 血清中观察到完全中和，在高达1/80稀释的所有样品中，病毒的生产 降低了至少80-90％。但在高病毒供给(1000 TCID50)时，在任何 样品中均未观察到中和作用。

供给100 TCID50病毒，然后用tPA-gp120(IIIB)DNA接种，从而检测 RHM的HIV(IIIB)中和作用(QBI)。在两个不同的试验中，在 10倍稀释的血清中观察到最好的中和结果(p24 gag降低40-99 ％)，在稀释达80倍的某些样品中观察到gag降低。在该试验中最一 致的样品的抗-gp120抗体ELISA终点滴定度至少为2000-3000。

类似地，用rev/env DNA接种后，检测RHM的HIV(IIIB)中和 作用(QBI)。总的来说，观察到低水平的中和作用：以10倍稀释的 血清中，三分之二的RHM有84％的中和作用，在随后稀释20或40 倍时，观察到p24 gag降低，而一个样品没有任何中和的迹象。这些样 品的抗-gp120抗体ELISA滴定度为700-800，表明在中和试验中， 这是检测得自gp160 DNA疫苗试验血清的最小有用滴定度范围。

C.增强免疫力的促进剂

完成数个试验来检测质粒DNA形成，已经报告了所述质粒DNA的 形成在接种后可增加DNA的摄取，并提高在小鼠和猴接种中报道基因 的表达或免疫反应。根据报道基因表达的迹象，高渗蔗糖(高达20- 25％，w/v)DNA溶液可以使DNA摄取的分布更均一，并在试验中 使用，其中在用rev/gp160质粒接种啮齿类和非人灵长类中引发实质性 的gp160特异性抗体。还报告了麻醉剂丁哌卡因(0.24-0.75％，w/v)当用 作IM注射预处理或与等渗盐溶液中的DNA共注射时，在小鼠和非人 灵长类中显著增强DNA疫苗介导的免疫反应。

用丁哌卡因的结果表明，用0.5％溶液IM处理会导致实质的死亡 率。死亡率随所用溶液的体积和小鼠是否在麻醉下(≥0.1 mL w/o麻 醉得到最高的死亡率)注射而变化。我们试验用0.25％溶液，但由于预 处理或共处理并使用gp120或rev/env PNVs而没有显著的死亡率。使 用丁哌卡因预处理三个接种轮次的预备试验相对于对照小鼠而言，免 疫反应没有任何增强，而试验ID和IM位点预处理或共处理的大规模 试验在注射一次后抗体水平没有任何提高，而在有些组中抗体反应似 乎有所降低。在目前的研究种计划了三中接种。

所述蔗糖形成试验检测在文献中描述的不同条件。在含0.1 mg/mLtPA-gp120质粒的盐或PBS溶液中，检测10，15，20和25 ％的蔗糖浓度。用IM或ID途径共注射，检测所有样品，除25％蔗糖 /PBS组在IM DNA/PBS注射前15-30分钟接受该溶液外。在第一次 接种后的，来自血液的血清数据的抗体反应没有任何提高。

                    实施例16 T淋巴细胞反应： A.增殖和细胞因子分泌

用抗原体内引发的T淋巴细胞在外源加入引发抗原后，在体外细胞 培养中可以增殖并分泌细胞因子。反应T细胞通常有MHCII型限制的 CD4+(辅助细胞)表型。根据抗原刺激后它们分泌的细胞因子的类型， 可将辅助T细胞按功能分组：TH1细胞主要分泌IL-2和g-干扰 素，而TH2细胞与IL-4，IL-5和IL-10分泌有关。TH1淋巴 细胞和细胞因子促进细胞免疫力，包括CTL和DTH反应，而TH2细 胞和细胞因子促进体液免疫力的B细胞激活。以前我们用rgp120IIIB 为体外抗原，用HIVtPA-gp120PNVs接种后，在小鼠和非人灵长类 (AGM和RHM)中试验这些反应，并表明在小鼠中来自两个种接种 的T细胞体外对gp120有增殖反应，而且这些反应是TH1样的和长期 的(＞6个月)用revPNV继续这些研究。

1.小鼠研究：检测用200μg V1Jns-rev3X或1X接种的小鼠对重 组rev(r-rev)蛋白质的体外增殖。3X接种的小鼠的刺激指数(SI：带 和不带免疫抗原的免疫细胞的增殖比率)为9-12，而接受1X的小 鼠与背景相同(SI＝2-3)。来自所有rev疫苗的脾T细胞，但不 是对照小鼠，分泌g-干扰素来应答r-rev抗原(2.4-2.8 ng/ml，3X；0.4-0.7 ng/ml，1X)，而在培养上清液中未检测到IL-4(对g-干扰素和IL -4的检测敏感度分别为47和15 pg/ml)，表明这些T细胞反应是 TH1样的，与我们发现gp120 DNA疫苗的一样。细胞因子分泌可能是 比用于确定T细胞记忆反应的特异性抗原更敏感的检测。在接种后至 少6个月的试验小鼠中发现了相似的结果。在任何疫苗血清中都未象 对该细胞内预期蛋白质的那样检测到rev抗体。

2.猴子研究：在用V1Jnx-rev接种两次后，三只RHM对r-rev有强 的体外T细胞增殖(SI＝9-30)。在任何猴子中均未检测到抗-rev 抗体。这些结果与上述小鼠/rev试验相符，证实了用rev PNVs可以诱 导强T细胞反应而不会同时诱导抗体反应。

用tPA-gp120 DNA接种RHM的其他试验表明(i)接种一次后得到对 rgp120的体外T细胞增殖；(ii)第二次接种后，初级反应得到加强； 和(iii)用与SHIV-感染的RHM一样的这些疫苗得到了相似的增殖(分 别为SI＝5-70和5-35)。

B.抗-env细胞毒T淋巴细胞

在一次接种后的六星期，用tPA-gp120(IM)和 gp160/IRES/rev(ID)PNV接种的四只RHM猴中的两只有显著的抗同源 靶细胞CTL活性(以10∶1 E/T，＞20％裂解)。第二次接种后两星 期，所有四只猴子的细胞毒性为在20∶1E/T20-35％裂解。在该试 验中所有CTL活性均是MHCI型限制的：在所有四只猴子中，CD8＋T 细胞的去除完全除去了细胞毒性。CTL反应在数个月内消弱，而再接 种后，加强到≥原水平。将这些CTL活性表征为在RHM中观察到的 疫苗介导的反应的最大潜力。 序列表 (1)一般资料：

(i)申请人：Shiver，John W

           Liu，Margaret A

           Perry，Helen C

(ii)发明题目：协调的体内基因表达

(iii)序列数目：100

(iv)相关地址：

(A)收件人：Christine E.Carty

(B)街道：126 Lincoln Avenue，P.O.Box 2000

(C)城市：Rahway

(D)州：New Jersey

(E)国家：美国

(F)邮政编码  07065

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容的

(C)操作系统：PC-COS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25

(vi)当前的申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(viii)代理/代理人资料；

(A)姓名：Carty，Christine E.

(B)登记号：36,090

(C)参考资料/文档号：19188Y

(ix)通讯资料：

(A)电话：(908)594-6734

(B)电传：(908)594-4720 (2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro 1               5                   10                  15 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

        20                  25                  30 Ala His Cys

    35 (2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2： Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro 1               5                   10                  15 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Thr Ile Arg Gln

        20                  25                  30 Ala  His  Cys

      35 (2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3： Cys  Thr  Arg  Pro  Asn  Asn  Asn  Thr  Arg  Lys  Arg  Ile  Arg  Ile  Gln  Arg 1                   5                        10                       15 Gly  Pro  Gly  Arg  Ala  Phe  Val  Thr  Ile  Gly  Lys  Ile  Gly  Asn  Met  Arg

           20                       25                       30 Gln  Ala  His  Cys

      35 (2)SEQ ID NO：4的资料：    

(i)序列特征：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： Cys  Thr  Arg  Pro  Asn  Asn  Asn  Thr  Arg  Lys  Gly  Ile  His  Ile  Gly  Pro 1                   5                        10                       15 Gly  Arg  Ala  Phe  Tyr  Thr  Thr  Gly  Lys  Ile  Ile  Gly  Asn  Ile  Arg  Gln

           20                       25                       30 Ala  His  Cys

      35 (2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5： Cys  Thr  Arg  Pro  Ser  Asn  Asn  Asn  Thr  Arg  Lys  Ser  Ile  His  Ile  Gly 1                   5                        10                       15 Pro  Gly  Lys  Ala  Phe  Tyr  Ala  Thr  Gly  Ala  Ile  Ile  Gly  Asp  Ile  Arg

           20                       25                       30 Gln  Ala  His  Cys

      35 (2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：两种

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6： Cys  Thr  Arg  Pro  Asn  Asn  Asn  Thr  Arg  Arg  Ser  Ile  His  Ile  Ala  Pro 1                   5                        10                       15 Gly  Arg  Ala  Phe  Tyr  Ala  Thr  Gly  Asp  Ile  Ile  Gly  Asp  Ile  Arg  Gln

           20                       25                       30 Ala  His  Cys

      35 (2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG (2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG (2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC (2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GTTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC (2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

GGTACAAGAT CTACTATAGG GAGACCGGAA TTCCGC (2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

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(B)类型：核酸 (C)链型：两种 (D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假设：无 (iv)反义：无 (xi)序列描述：SEQ ID NO：12： TCGCGCGTTT   CGGTGATGAC   GGTGAAAACC   TCTGACACAT   GCAGCTCCCG   GAGACGGTCA           60 CAGCTTGTCT   GTAAGCGGAT   GCCGGGAGCA   GACAAGCCCG   TCAGGGCGCG   TCAGCGGGTG          120 TTGGCGGGTG   TCGGGGCTGG   CTTAACTATG   CGGCATCAGA   GCAGATTGTA   CTGAGAGTGC          180 ACCATATGCG   GTGTGAAATA   CCGCACAGAT   GCGTAAGGAG   AAAATACCGC   ATCAGATTGG          240 CTATTGGCCA   TTGCATACGT   TGTATCCATA   TCATAATATG   TACATTTATA   TTGGCTCATG          300 TCCAACATTA   CCGCCATGTT   GACATTGATT   ATTGACTAGT   TATTAATAGT   AATCAATTAC          360 GGGGTCATTA   GTTCATAGCC   CATATATGGA   GTTCCGCGTT   ACATAACTTA   CGGTAAATGG          420 CCCGCCTGGC   TGACCGCCCA   ACGACCCCCG   CCCATTGACG   TCAATAATGA   CGTATGTTCC          480 CATAGTAACG   CCAATAGGGA   CTTTCCATTG   ACGTCAATGG   GTGGAGTATT   TACGGTAAAC          540 TGCCCACTTG   GCAGTACATC   AAGTGTATCA   TATGCCAAGT   ACGCCCCCTA   TTGACGTCAA          600 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(i)序列特征：

(A)长度：2196个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

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(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

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(i)序列特征：

(A)长度：4864个碱基对

(B)类型：核酸

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(iii)假设：无

(iv)反义：无

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(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15： CCACATAGAT CTGTTCCATG GTTGTGGCAA TATTATCATC G             41 (2)SEQ ID NO：16的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16： GGTACAAGAT CTACCATGGC AGGAAGAAGC GGAGACAGC                39 (2)SEQ ID NO：17的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17： CCACATAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGCTCCTGAC TCC           43 (2)SEQ ID NO：18的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：78个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18： GATCACCATG GATGCAATGA AGAGAGGGCT CTGCTGTGTG CTGCTGCTGT GTGGAGCAGT    60 CTTCGTTTCG CCCAGCGA                                                  78 (2)SEQ ID NO：19的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：78个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19： GATCTCGCTG GGCGAAACGA AGACTGCTCC ACACAGCAGC AGCACACAGC AGAGCCCTCT    60 CTTCATTGCA TCCATGGT                                                  78 (2)SEQ ID NO：20的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：52个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20： GGTACATGAT CAGATATCGC CCGGGCCGAG ATCTTCAGAC TTGGAGGAGG  AG    52 (2)SEQ ID NO：21的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21： CCACATTGAT CAGCTTGTGT AATTGTTAAT TTCTCTGTCC               40 (2)SEQ ID NO：22的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22： CCCCGGATCC TGATCACAGA AAAATTGTGG GTCACAGTC                39 (2)SEQ ID NO：23的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23： CCCCAGGAAT CCACCTGTTA GCGCTTTTCT CTCTGCACCA CTCTTCTC      48 (2)SEQ ID NO：24的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24： GGTACATGAT CACAGAAAAA TTGTGGGTCA  CAGTC                   35 (2)SEQ ID NO：25的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：47个碱基对    

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25： CCACATTGAT CAGATATCTT ATCTTTTTTC TCTCTGCACC ACTCTTC       47 (2)SEQ ID NO：26的资料：    

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26： GTCACCGTCC TCTATCAAAG CAGTAAGTAG TACATGCA               38 (2)SEQ ID NO：27的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

TGTACTACTT ACTGCTTTGA TAGAGGACGG TGACTGCA            38 (2)SEQ ID NO：28的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸    

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28： GGTACATGAT CAACCATGAG AGTGAAGGAG AAATATCAGC               40 (2)SEQ ID NO：29的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29 CCACATTGAT CAGATATCCC CATCTTATAG CAAAATCCTT TCC           43 (2)SEQ ID NO：30的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA    

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30： CCACATTGAT CAGATATCCC CATCTTATAG CAAAATCCTT TCC           43 (2)SEQ ID NO：31的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31： GGTACACTGC AGTCACCGTC CTATGGCAGG AAGAAGCGGA GAC           43 (2)SEQ ID NO：32的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对    

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32： CCACATCAGG TACCCCATAA TAGACTGTGA CC                       32 (2)SEQ ID NO：33的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：     GGTACAAGAT CTACCATGGG ACCAGTACAA CAAATAGGTG GTAAC         45 (2)SEQ ID NO：34的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性    

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34： CCACATAGAT CTTTACATTA ATCTAGCCTT CTGTCCC                 37 (2)SEQ ID NO：35的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35： GGTACAACCA TGGGTGGAGC TATTTCCATG AGG                      33 (2)SEQ ID NO：36的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：  线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36： CCTAGGTTAG CCTTCTTCTA ACCTCTTCC                           29 (2)SEQ ID NO：37的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37： GGTACAAGAT CTACCATGGG ATGTCTTGGG AATCAGC                  37 (2)SEQ ID NO：38的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38： CCACATAGAT CTGATATCGT ATGAGTCTAC TGGAAATAAG AGG         43 (2)SEQ ID NO：39的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39： GGTACAGGAT CCACCATGGG TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC          42 (2)SEQ ID NO：40的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：50个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40： CCACATGGAT CCGCCCGGGC TTACATCTCT GTACAAATTT CTACTAATGC    50 (2)SEQ ID NO：41的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸    

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41： GGTACAGGAT CCCCGCACGG CAAGAGGCGA GGG                      33 (2)SEQ ID NO：42的资料：

(i)序列特征：    

(A)长度：42个碱基对    

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：  线性

(ii)分子类型：  cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42： GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC            42 (2)SEQ ID NO：43的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA    

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：43： CCACATGGAT CCGCCCGGGC CTTTATTGTG ACGAGGGGTC GTTGC         45 (2)SEQ ID NO：44的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种    

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44： GGTACAGGAT CCCCGCACGG CAAGAGGCGA GGG                      33 (2)SEQ ID NO：45的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：45： GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC            42 (2)SEQ ID NO：46的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：   GTACCTCATG AGCCACATAA TACCATG                           27 (2)SEQ ID NO：47的资料：

(i)序列特征：    

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：   GGTACAAGAT CTACCATGGC TTGCAATTGT CAGTTGATGC             40 (2)SEQ ID NO：48的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ  ID  NO：  48： CCACATAGAT CTCCATGGGA ACTAAAGGAA GACGGTCTGTTC                 42 (2)SEQ ID NO：49的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：   GGTACAAGAT CTACCATGAA GGCAAACCTA CTGGTCCTG                           39 (2)SEQ ID NO：50的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：46个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50： CCACATAGAT CTGATATCCT AATCTCAGAT GCATATTCTG CACTGC                    46 (2)SEQ ID NO：51的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：   Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn   1               5                   10                  15 (2)SEQ ID NO：52的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52： GAAAGAGCAG AAGACAGTGG CAATGA                                  26 (2)SEQ ID NO：53的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：40个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：53： GGGCTTTGCT AAATGGGTGG CAAGTGGCCC GGGCATGTGG                40 (2)SEQ ID NO：54的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54： CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG                                    23 (2)SEQ ID NO：55的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55： GGAGTGGCAC CTTCCAGG                                           18 (2)SEQ ID NO：56的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：56： GGAGACAGCG  ACGAAGACCT  CCTCAAGGCA  GTCAGACTCA  TCAAG    45 (2)SEQ ID NO：57的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：71个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57： GATGGCTGGC AACTAGAAGG CACAGCAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGCTCCTGAC        60 TCCAATATTG T                                                             71 (2)SEQ ID NO：58的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：119个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58： CTTAGATCAA CCATGAGAGT GAAGGAGAAA TATCAGCACT TGTGGAGATG GGGGTGGAGA    60 TGGGGCACCA TGCTCCTTGG GATGTTGATG ATCTGTAGTG CTACAGAAAA ATTGTGGGT    119 (2)SEQ ID NO：59的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：78个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：   CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATCAGAT AGTGTCCCCA TCTTATAGCA AAATCCTTTC    60   CAAGCCCTGT CTTATTCT                                                  78 (2)SEQ ID NO：60的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60： GATTTAGGTG ACACTATTAG                                           19 (2)SEQ ID NO：61的资料

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA    

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：

                                                          20 TAATACGACT CACTATAGGG (2)SEQ ID NO：62的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：62： CATGCCTGCA GGTCGACTCT AAATTCCG                                    28 (2)SEQ ID NO：63的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对    

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：63： ACCCGGGGAT  CCTCTAGCGC  GCTTGTCTCT TGTTCCA                           37 (2)SEQ ID NO：64的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：

                                                           15 GGGACGTGGT TTTCC (2)SEQ ID NO：65的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：66个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65： TATGGCCACA ACCATGGCAG GAAGAAGCGG AGACAGCGAC GAAGACCTCC TCAAGGCAGT    60 CAGACT                                                               66 (2)SEQ ID NO：66的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：90个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：   CTCGAGCCAT GGGCCCCTAG ACTATAGCGT GATAAGAAAT CGAGGACTGA GGTTATAACA    60   TCCTCTAAGG TGGTTATAAA CTCCCGAAGG                                     90 (2)SEQ ID NO：67的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：67： GCTTCGGCCA GTAACG                                                   16 (2)SEQ ID NO：68的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：87个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：68： TTGCATGCCT GCAGGTGGTA CATGATCAGA TATCGCCCGG GCCGAGATCT TCAGACTTGG     60 AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAG                                          87 (2)SEQ ID NO：69的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：79个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：   GGGGCGGAAT TTAGAGTCAA TTGATCAGCT TGTGTAATTTG TTAATTTCTC TGTCCCACTC    60   CATCCAGGTC GTGTGATTC                                                  79 (2)SEQ ID NO：70的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70： CCATCTCCAC AAGTGCTG                                                18 (2)SEQ ID NO：71的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：77个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：71： AGATCTAAGG ACGGTGACTG CATGTACTAC TTACTGCTTT GATAGAGGAC GGTGACTGCA    60 GAAAAGACCC ATGGAAA                                                   77 (2)SEQ ID NO：72的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无    

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：72： GCTTCGGCCA GTAACG                                                      16 (2)SEQ ID NO：73的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：62个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无    

(xi)序列描述：SEQ ID NO：73： GGCACAGCAG ATCAGATGGG GATCTGATAT CGCACTATTC TTTAGCTCCT GACTCCTGAC    60 TC                                                                   62 (2)SEQ ID NO：74的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对    

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：74： GGAATTTGAG TCATCCCCAT CTTATAGCAA AATCCTTTCC  AA           42 (2)SEQ ID NO：75的资料：    

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：  核酸

(C)链型：  两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ  ID  NO：75： CTTTAAGATCCC CGCACGGCAA GAGGCGAGGG GCGGCGACTG GT          42 (2)SEQ ID NO：76的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：70个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：76： GGCACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT    60 TTCTTCTGTC                                                           70 (2)SEQ ID NO：77的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：70个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：77： CTTAGATCCA CCATGGGTGC GAGAGCGTCA GTATTAAGCG GGGGGAGAAT TAGATCGATG      60 GGAAAAAATT                                                             70 (2)SEQ ID NO：78的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：70个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：78： GGCACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT    60 TTCTTCTGTC                                                           70 (2)SEQ ID NO：79的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：118个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：79： TCACCGTCCT TAGATCACCA TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT    60 GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCAGCGA GATCTGCTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCC     118 (2)SEQ ID NO：80的资料：

(i)序列特征：    

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：80： TTCGTTTCGC CCAGCGATCA CAGAAAAATT GTGGGTCACA GTC         43 (2)SEQ ID NO：81的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：81： GGCACAGCAG  ATCCACGTGT  TAGCGCTTTT  CTCTCTCCAC  CAC    43 (2)SEQ ID NO：82的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：80个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：   TCACCGTCCT TAGATCTACC ATGGGACCAG TACAACAAAT AGGTGGTAAC TATGTCCACC    60   TGCCATTAAG CCCGAGAACA                                                80 (2)SEQ ID NO：83的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：44个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：83： GGCACAGCAG ATCTTTACAT TAATCTAGCC TTCTGTCCCG GTCC             44 (2)SEQ ID NO：84的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：80个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：84： TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGGG TGGAGCTATT TCCATGAGGC AATCCAAGCC     60 GGCTGGAGAT CTGACAGAAA                                                 80 (2)SEQ ID NO：85的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：85个碱基对

(B)类型：核酸    

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：85： GGCACAGCAG ATCACCTAGG TTAGCCTTCT TCTAACCTCT TCCTCTGACA GGCCTGACTT    60 GCTTCCAACT CTTCTGGGTA TCTAG                                          85 (2)SEQ ID NO：86的资料：    

(i)序列特征：

(A)长度：90个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：86： ACCGTCCTTA GATTCGACAT AGCAGAATAG GCGTTACTCG ACAGAGGAGA GCAAGAAATG    60 GAGCCAGTAG ATCCTAGACT AGAGCCCTGG                                     90 (2)SEQ ID NO：87的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：87： GGCACAGCAG ATCCGAGATG CTGCTCCCAC CCCATCTGCT G                            41 (2)SEQ ID NO：88的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(v)片段类型：内部的

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：   Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala   1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：89的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无 

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：89： His  Glu  Asp  Ile  Ile  Ser  Leu  Trp  Asp  Gln  Ser  Leu  Lys 1                   5                        10 (2)SEQ ID NO：90的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：90： Asp  Arg  Val  Ile  Glu  Val  Val  Gln  Gly  Xaa  Tyr  Arg  Ala  Ile  Arg 1                   5                        10                        15 (2)SEQ ID NO：91的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：91： GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG                             33 (2)SEQ ID NO：92的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：92： CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC                      36 (2)SEQ ID NO：93的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性    

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：93： GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC                    38 (2)SEQ ID NO：94的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：     CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC                   37 (2)SEQ ID NO：95的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：95：   GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG               39 (2)SEQ ID NO：96的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：96： CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG                      35 (2)SEQ ID NO：97的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸    

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：                                                             GAGCCAATAT AAATGTAC                                               18 (2)SEQ ID NO：98的资料：

(i)序列特征：    

(A)长度：15个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：98： CAATAGCAGG  CATGC                                                15 (2)SEQ ID NO：99的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无    

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：99： GCAAGCAGCA  GATTAC                                          16 (2)SEQ ID NO：100的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3547个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列描述：SEQ ID NO：100：

(xi)SEQUENCE DESCRIPTION：SEQ ID NO：100： GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT        60 GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA       120 TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG       180 GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGACG       240 TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA       300 CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT       360 GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC       420 TTTCCTACTT GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT       480 TGGCAGTACA TCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAC       540 CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG CACCAAAATC AACGGGACTT TCCAAAATGT       600 CGTAACAACT CCGCCCCATT GACGCAAATG GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT       660 ATAAGCAGAG CTCGTTTAGT GAACCGTCAG ATCGCCTGGA GACGCCATCC ACGCTGTTTT       720 GACCTCCATA GAAGACACCG GGACCGATCC AGCCTCCGCG GCCGGGAACG GTGCATTGGA       780 ACGCGGATTC   CCCGTGCCAA   GAGTGACGTA   AGTACCGCCT   ATAGAGTCTA   TAGGCCCACC             840 CCCTTGGCTT   CTTATGCATG   CTATACTGTT   TTTGGCTTGG   GGTCTATACA   CCCCCGCTTC             900 CTCATGTTAT   AGGTGATGGT   ATAGCTTAGC   CTATAGGTGT   GGGTTATTGA   CCATTATTGA             960 CCACTCCCCT   ATTGGTGACG   ATACTTTCCA   TTACTAATCC   ATAACATGGC   TCTTTGCCAC            1020 AACTCTCTTT   ATTGGCTATA   TGCCAATACA   CTGTCCTTCA   GAGACTGACA   CGGACTCTGT            1080 ATTTTTACAG   GATGGGGTCT   CATTTATTAT   TTACAAATTC   ACATATACAA   CACCACCGTC            1140 CCCAGTGCCC   GCAGTTTTTA   TTAAACATAA   CGTGGGATCT   CCACGCGAAT   CTCGGGTACG            1200 TGTTCCGGAC   ATGGGCTCTT   CTCCGGTAGC   GGCGGAGCTT   CTACATCCGA   GCCCTGCTCC            1260 CATGCCTCCA   GCGACTCATG   GTCGCTCGGC   AGCTCCTTGC   TCCTAACAGT   GGAGGCCAGA            1320 CTTAGGCACA   GCACGATGCC   CACCACCACC   AGTGTGCCGC   ACAAGGCCGT   GGCGGTAGGG            1380 TATGTGTCTG   AAAATGAGCT   CGGGGAGCGG   GCTTGCACCG   CTGACGCATT   TGGAAGACTT            1440 AAGGCAGCGG   CAGAAGAAGA   TGCAGGCAGC   TGAGTTGTTG   TGTTCTGATA   AGAGTCAGAG            1500 GTAACTCCCG   TTGCGGTGCT   GTTAACGGTG   GAGGGCAGTG   TAGTCTGAGC   AGTACTCGTT            1560 GCTGCCGCGC   GCGCCACCAG   ACATAATAGC   TGACAGACTA   ACAGACTGTT   CCTTTCCATG            1620 GGTCTTTTCT   GCAGTCACCG   TCCTTAGATC   TGCTGTGCCT   TCTAGTTGCC   AGCCATCTGT            1680 TGTTTGCCCC   TCCCCCGTGC   CTTCCTTGAC   CCTGGAAGGT   GCCACTCCCA   CTGTCCTTTC            1740 CTAATAAAAT   GAGGAAATTG   CATCGCATTG   TCTGAGTAGG   TGTCATTCTA   TTCTGGGGGG            1800 TGGGGTGGGG   CAGCACAGCA   AGGGGGAGGA   TTGGGAAGAC   AATAGCAGGC   ATGCTGGGGA            1860 TGCGGTGGGC   TCTATGGGTA   CGGCCGCAGC   GGCCGTACCC   AGGTGCTGAA   GAATTGACCC            1920 GGTTCCTCGA   CCCGTAAAAA   GGCCGCGTTG   CTGGCGTTTT   TCCATAGGCT   CCGCCCCCCT            1980 GACGAGCATC   ACAAAAATCG   ACGCTCAAGT   CAGAGGTGGC   GAAACCCGAC   AGGACTATAA            2040 AGATACCAGG   CGTTTCCCCC   TGGAAGCTCC   CTCGTGCGCT   CTCCTGTTCC   GACCCTGCCG            2100 CTTACCGGAT   ACCTGTCCGC   CTTTCTCCCT   TCGGGAAGCG   TGGCGCTTTC   TCAATGCTCA            2160 CGCTGTAGGT   ATCTCAGTTC   GGTGTAGGTC   GTTCGCTCCA   AGCTGGGCTG   TGTGCACGAA            2220 CCCCCCGTTC   AGCCCGACCG   CTGCGCCTTA   TCCGGTAACT   ATCGTCTTGA   GTCCAACCCG            2280 GTAAGACACG   ACTTATCGCC   ACTGGCAGCA   GCCACTGGTA   ACAGGATTAG   CAGAGCGAGG            2340 TATGTAGGCG   GTGCTACAGA   GTTCTTGAAG   TGGTGGCCTA   ACTACGGCTA   CACTAGAAGG            2400 ACAGTATTTG   GTATCTGCGC   TCTGCTGAAG   CCAGTTACCT   TCGGAAAAAG   AGTTGGTAGC           2460 TCTTGATCCG   GCAAACAAAC   CACCGCTGGT   AGCGGTGGTT   TTTTTGTTTG   CAAGCAGCAG           2520 ATTACGCGCA   GAAAAAAAGG   ATCTCAAGAA   GATCCTTTGA   TCTTTTCTAC   GTGATCCCGT           2580 AATGCTCTGC   CAGTGTTACA   ACCAATTAAC   CAATTCTGAT   TAGAAAAACT   CATCGAGCAT           2640 CAAATGAAAC   TGCAATTTAT   TCATATCAGG   ATTATCAATA   CCATATTTTT   GAAAAAGCCG           2700 TTTCTGTAAT   GAAGGAGAAA   ACTCACCGAG   GCAGTTCCAT   AGGATGGCAA   GATCCTGGTA           2760 TCGGTCTGCG   ATTCCGACTC   GTCCAACATC   AATACAACCT   ATTAATTTCC   CCTCGTCAAA           2820 AATAAGGTTA   TCAAGTGAGA   AATCACCATG   AGTGACGACT   GAATCCGGTG   AGAATGGCAA           2880 AAGCTTATGC   ATTTCTTTCC   AGACTTGTTC   AACAGGCCAG   CCATTACGCT   CGTCATCAAA           2940 ATCACTCGCA   TCAACCAAAC   CGTTATTCAT   TCGTGATTGC   GCCTGAGCGA   GACGAAATAC           3000 GCGATCGCTG   TTAAAAGGAC   AATTACAAAC   AGGAATCGAA   TGCAACCGGC   GCAGGAACAC           3060 TGCCAGCGCA   TCAACAATAT   TTTCACCTGA   ATCAGGATAT   TCTTCTAATA   CCTGGAATGC           3120 TGTTTTCCCG   GGGATCGCAG   TGGTGAGTAA   CCATGCATCA   TCAGGAGTAC   GGATAAAATG           3180 CTTGATGGTC   GGAAGAGGCA   TAAATTCCGT   CAGCCAGTTT   AGTCTGACCA   TCTCATCTGT           3240 AACATCATTG   GCAACGCTAC   CTTTGCCATG   TTTCAGAAAC   AACTCTGGCG   CATCGGGCTT           3300 CCCATACAAT   CGATAGATTG   TCGCACCTGA   TTGCCCGACA   TTATCGCGAG   CCCATTTATA           3360 CCCATATAAA   TCAGCATCCA   TGTTGGAATT   TAATCGCGGC   CTCGAGCAAG   ACGTTTCCCG           3420 TTGAATATGG   CTCATAACAC   CCCTTGTATT   ACTGTTTATG   TAAGCAGACA   GTTTTATTGT           3480 TCATGATGAT   ATATTTTTAT   CTTGTGCAAT   GTAACATCAG   AGATTTTGAG   ACACAACGTG           3540 GCTTTCC                                                                               3547

                  本发明题目

              协调的体内基因表达

           与其他申请相关的交叉申请

本申请是未结案的美国系列号08/207526(1994年3月7日提交) 的接续申请。

                  发明背景

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