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新的抗CXCR4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途

阅读：110发布：2021-12-07

专利汇可以提供新的抗CXCR4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于癌症诊断的新的、分离的抗CXCR4 抗体。特别地，本发明的抗体识别单体和同源二聚体的CXCR4，而不识别异源二聚体的CXCR4。，下面是新的抗CXCR4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其包含：i)含有下列3个CDR的重链，所述CDR分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；和ii)含有下列3个CDR的轻链，所述CDR分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体选自：
a.抗体，其具有含有下列3个CDR的重链，所述CDR分别为具有序列SEQID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；以及含有序列SEQ ID No.8的轻链可变结构域；
b.抗体，其具有含有序列SEQ ID No.7的重链可变结构域；以及含有下列3个CDR的轻链，所述CDR分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3；或
c.抗体，其具有含有序列SEQ ID No.7的重链可变结构域；和含有序列SEQID No.8的轻链可变结构域。
3.根据权利要求1或2任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体
427aB1包含：
a)重链，所述重链包含：
·下列3个CDR，所述CDR分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、
具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；
以及含有序列SEQ ID NO.8的轻链可变结构域；和
·重链可变结构域，所述重链可变结构域具有序列SEQ ID NO.7；以及
b)轻链，所述轻链包含：
·下列3个CDR，所述CDR分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、
具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3；
和
·轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有序列SEQ ID No.8。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其中所述抗体能够结合作为单体和/或同源二聚体的CXCR4。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其用于体外或离体诊断与CXCR4表达相关的致癌疾病，或者用于体外或离体确定与CXCR4表达相关的致癌疾病的发展的预后。
6.根据权利要求5所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述致癌疾病由与作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的表达相关的致癌疾病所组成。
7.根据权利要求1至6任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体是鼠抗体。
8.根据权利要求1至7任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体不阻断抗体515H7结合CXCR4。
9.根据权利要求1至8任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其特征在于所述抗体没有体内抗肿瘤活性。
10.一种鼠杂交瘤，其能够分泌根据权利要求1至9任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
11.根据权利要求10所述的鼠杂交瘤，其中所述的杂交瘤在2008年6月25日以编号I-4018保藏在法国巴黎巴斯德研究所的CNCM。
12.一种分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸：
a)核酸、DNA或RNA，其编码根据权利要求1至8任一项所述的抗体、或其衍生化合物或功能片段；
b)核酸，其包含的DNA序列含有选自序列SEQ ID No.9至14的序列、或者与序列SEQ ID No.9至14经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
c)核酸，其包含的DNA序列含有序列SEQ ID No.15或16，或者与序列SEQID No.15或
16经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；
d)从如a)、b)或c)定义的核酸翻译而来的RNA；
e)如a)、b)和c)定义的核酸的互补核酸；以及
f)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高度严谨的条件下与序列SEQ ID No.15或16、或者与序列SEQ ID15或16经最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列、或者其互补序列进行杂交。
13.一种载体，其包含如权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其转化有或包含如权利要求13所述的载体。
15.一种产生抗体、或其抗原结合片段或衍生物的方法，其特征在于所述方法包括步骤：a)在培养介质中并且在适当的培养条件下培养如权利要求14所述的宿主细胞；和b)从所述培养介质或所述培养细胞中回收所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
16.一种用于体外或离体检测表达单体/同源二聚体的CXCR4的肿瘤存在的方法，其中所述方法包括步骤：
(a)使来自所述受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及
(b)检测所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与生物样本的结合。
17.一种用于体外或离体确定在来自受试者的肿瘤中表达作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比的方法，所述方法包括步骤：
(a)使来自受试者的样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及
(b)定量在样本中表达作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比。
18.一种用于体外或离体确定在来自受试者的肿瘤中作为单体和/或同源二聚体的单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平的方法，所述方法包括步骤：
(a)使来自受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；以及
(b)定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与在生物样本中的单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过免疫组织化学（IHC）或FACS，优选通过IHC测量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平。
20.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤评分的方法，所述方法包括步骤：
(a)使来自受试者的生物样本接触根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物；
(b)定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与在所述生物样本中作为单体和/或同源二聚体的单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平；以及
(c)通过将来自受试者的所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物的结合的量化水平与适当等级进行比较，为肿瘤评分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的适当等级基于两个参数，其是染色强度和阳性细胞的百分比。
22.根据权利要求20或21任一项所述的方法，其中所述的适当等级是0至8的等级，其中“无反应性”评分为0，在“67-100%反应比例”的比例中的强反应性评分为8。
23.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括步骤：
(a)根据权利要求20、21或22任一项为来自受试者的肿瘤评分；和
b)确定肿瘤状态是评分3至8的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]；或
(c)确定肿瘤状态是评分0至2的[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]。
+
24.根据权利要求20或21任一项所述的方法，其中所述的适当等级是0至3 的等级，其中无肿瘤细胞膜反应性评分为0，以及在10％以上肿瘤细胞中的强烈完全的反应性评分+
为3。
25.一种用于体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括步骤：
(a)根据权利要求20、21或24任一项为来自受试者的肿瘤评分；和
+ +
(b)确定肿瘤状态是2 或3 评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]；或
+
(c)确定肿瘤状态是0或1 评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]。
26.一种用于确定致癌疾病是否对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感的方法，所述方法包括步骤：
(a)根据权利要求23或25体外或离体确定受试者的肿瘤状态，和
(b)如果状态是[单体/同源二聚体的CXCR4（+）]，则确定致癌疾病对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感。
27.一种用于体外或离体确定治疗方案效果的方法，所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，所述方法包括步骤：
(a)在第一时间点提取自所述受试者的生物样本中根据权利要求18或19确定单体/同源二聚体的CXCR4的第一表达水平；
(b)在第二较后的时间点提取自所述受试者的生物样本中根据权利要求18或19确定单体/同源二聚体的CXCR4的第二表达水平；
(c)确定获自(a)的水平与获自(b)的水平之比；以及
(d)当步骤(c)之比大于1时，确定所述治疗方案的效果为高；或者
(e)当步骤(c)之比小于或等于1时，确定所述治疗方案的效果为低。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，其包括向所述受试者施用CXCR4抑制剂。
29.一种用于选择癌症患者的体外或离体方法，所述癌症患者经预测能够或不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益，所述方法包括步骤：
(a)根据权利要求18或19所述的方法，确定在所述患者中单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平；
(b)根据权利要求18或19所述的方法，确定来自健康个体的单体/同源二聚体的CXCR4的参考表达水平；和
(c)确定获自步骤(a)的水平与获自步骤(b)的水平之比；和
(d)如果步骤(c)之比大于1，则选择经预测从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者；或者
(e)如果步骤(c)之比小于或等于1，则选择经预测不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述的CXCR4抑制剂是单克隆抗体515H7。
31.一种试剂盒，其至少包含根据权利要求1至9任一项所述的、或通过权利要求15所述的方法所获得的、或通过根据权利要求10或11所述的杂交瘤所产生的抗体、或其抗原结合片段或衍生物。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其特征在于所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物被标记。
33.根据权利要求31或32任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于检测在所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4之间结合程度的试剂。
34.根据权利要求31至33任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于定量在所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4之间结合水平的试剂。
35.根据权利要求31至34任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于为单体/同源二聚体的CXCR4表达水平评分的阳性和阴性对照样本。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其进一步包含特异性识别鼠抗体的多克隆抗体，优选所述多克隆抗体被标记。

说明书全文

新的抗CXCR4抗体及其用于检测和诊断癌症的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及在患者中预后和/或诊断和/或治疗监测（therapy monitoring）增殖性疾病的领域。更具体的，本发明涉及能够特异性结合CXCR4的抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。本发明也包括所述抗体用于检测和诊断与CXCR4表达相关的病理性过度增殖性致癌疾病（pathological hyperproliferative oncogenic disorders）的用途、和相应的方法。在某些实施方案中，所述疾病是与CXCR4相对于正常而言升高的表达相关的致癌疾病，或任何其它与CXCR4过表达相关联的病理学。本发明最终包括至少含有这种抗体的产物和/或组合物或试剂盒，以用于某些癌症的预后或诊断或治疗监测。

背景技术

[0002] 趋化因子是小的分泌肽，特别是免疫反应期间其控制着白细胞沿被称为趋化因子梯度的配体化学梯度的迁移（Zlotnick A.等人，2000）。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体（其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR）的结合，趋化因子被分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。

[0003] 许多癌症具有复杂的趋化因子网络，其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体，并可以响应趋化因子梯度。人类癌症活检样本和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加相关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有不同的趋化因子受体表达谱，但是趋化因子受体4（CXCR4）是最常发现的。来自至少23种不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的人类癌症的细胞表达CXCR4受体（Balkwill F.等人，2004）。

[0004] 趋化因子受体4（也称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR）作为包含352个或360个氨基酸的两种同种型存在。同种型a具有Genbank登录号NP_001008540所述的氨基酸序列，而同种型b具有Genbank登录号NP_003458所述的氨基酸序列。残基Asn11是糖基化的，残基Tyr21是通过添加硫酸基团修饰的，以及Cys109和186通过二硫桥在受体的细胞外部分进行结合（Juarez J.等人，2004）。

[0005] 该受体由不同类型的正常组织、初始非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞表达，且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞转运（trafficking）、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。

[0006] CXCR4受体在大量癌症中过表达，所述癌症包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、结肠癌（Ottaiano A.等人，2004）、乳癌（Kato M.等人，2003）、前列腺癌（Sun Y.X.等人，2003）、肺癌（小细胞癌和非小细胞癌（Phillips R.J.等人，2003））、卵巢癌（Scotton C.J.等人，2002）、胰腺癌（Koshiba T.等人，2000）、肾癌、脑癌（Barbero S等人，2002）、成胶质细胞瘤和淋巴瘤。

[0007] 迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子-1（SDF-1）或CXCL12。SDF-1在淋巴结、骨髓、肝、肺中大量分泌，肾、脑和皮肤分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别，该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II（vMIP-II）。

[0008] CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用，直接参与导致转移的迁移、侵入。实际上，癌细胞表达CXCR4受体，它们迁移并进入系统循环。然后，癌细胞被滞留（arrested）在产生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那里其增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤（Murphy PM.,2001）。该轴也通过激活细胞外信号调节的激酶（ERK）途径（Barbero S.等人，2003）和血管生成（Romagnani P.,2004）参与细胞增殖。实际上，CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成，其转而增加了CXCR4/SDF-1的表达（Bachelder R.E.等人，2002）。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）聚集在肿瘤的缺氧区域，经刺激后与肿瘤细胞合作并促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达（Mantovani A.等人，2004）。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞（HSC）的转运/归巢，可在新生血管形成中起作用。证据显示除了HSC之外，功能性CXCR4也在来自其它组织（组织定向干细胞=TCSC）的干细胞上表达，因此SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱（chemottracting）CXCR4+TCSC中起关键作用，但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源（癌症干细胞理论）。对于人类白血病，和最近对于几种实体肿瘤，比如脑和乳房，证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以衍生自正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞的CXCR4+的肿瘤实例，比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌（Kucia M.等人，2005）。

[0009] 使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移（Muller A.等人，2001）。简而言之，已表明针对CXCR4受体（单抗173R&D系统）的单克隆抗体显著地减少了SCID小鼠中常位（orthotopic）乳癌模型（MDA-MB231）中淋巴结转移的数量。另一个研究（Phillips R.J等人，2003）使用抗SDF-1的多克隆抗体也显示SDF-1/CXCR4轴在常位肺癌模型（A549）的转移中起决定性作用，但是在该研究中，其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它研究也描述了使用CXCR4的siRNA双链体（Liang Z.等人，2005）生物稳定的CXCR4肽拮抗剂（Tamamura H.等人，2003）对体内转移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD3100（Rubin J.B.等人，2003；De Falco V.等人，2007）或单抗（专利WO2004/059285A2）对体内肿瘤生长的抑制。因此，CXCR4是经验证的用于癌症的治疗靶。

[0010] 趋化因子受体2(CXCR2)是另一种趋化因子受体，也被描述为肿瘤学中感兴趣的靶。实际上，CXCR2在几种肿瘤细胞类型中传递自分泌细胞生长信号，也可以通过促进血管生成间接地影响肿瘤生长(Tanaka T.等人2005)。

[0011] CXCR2趋化因子受体包含360个氨基酸。其主要在内皮细胞中表达，尤其是在新生血管形成期间。几种趋化因子结合CXCR2受体：CXCL5、-6、-7、IL-8、GRO-α、-β和γ，其属于ERL+促血管生成趋化因子。所述CXCR2受体与CXCR4受体共享序列同源性：37%的序列同一性和48%的序列同源性。CXCR2/配体轴参与几种肿瘤生长机制，比如转移(Singh RK.等人，1994)、细胞增殖(Owen J.D.等人，1997)和ERL+趋化因子介导的血管生成(Strieter R.M.等人，2004；Romagnani等人，2004)。最后，与肿瘤相关的巨噬细胞和嗜中性粒细胞是炎症诱导的肿瘤生长的关键元素，趋化因子比如CXCL5、IL-8和GRO-α启动嗜中性粒细胞的募集。

[0012] 二聚化作为调节G蛋白偶联受体功能的通用机制出现，所述G蛋白偶联受体是趋化因子受体(Wang J.和Norcross M，2008)。已经表明响应趋化因子结合的同源二聚化和异源二聚化是启动和改变许多趋化因子受体的信号传导所需要的。不断有证据支持所述受体二聚体或寡聚体可能是趋化因子受体的基本功能单元的概念。在没有配体的情况下，发现了趋化因子受体二聚体，并且趋化因子诱导受体二聚体的构象变化。已知CXCR4与例如δ阿片类受体(DOR)(Hereld D.,2008)或CCR2(Percherancier Y.等人,2005)形成同源二聚体，也形成异源二聚体。在后一个实例中，源自CXCR4的跨膜结构域的肽通过阻断配体诱导的所述二聚体的构象转换而抑制活化(Percherancier Y.等人，2005)。另一个研究表明CXCR4-TM4肽（CXCR4的跨膜区的合成肽）降低了CXCR4同源二聚体的原体（protomer）之间的能量转移，并且抑制了恶性细胞中SDF-1诱导的迁移和肌动蛋白聚合(Wang J.等人，2006)。最近，也描述了CXCR7与CXCR4形成功能性异源二聚体，并且增强了SDF-1诱导的信号传导(Sierro F.等人，2007)。组成型异源二聚体的其它实例包括显示CXCR1和CXCR2相互作用以及形成各自同源二聚体的研究。对于它们中任一个与另一GPCR(α(1A)肾上腺素受体)都没有记录到相互作用，表明CXCR1和CXCR2相互作用的特异性(Wilson S.等人，
2005)。

[0013] 如前所述，CXCR4和CXCR2受体是令人感兴趣的肿瘤靶点。干扰那些受体将通过减少肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞迁移和侵入、肿瘤对嗜中性粒细胞和巨噬细胞的募集和通过抑制CXCR4癌症干细胞，以非常有效的方式抑制肿瘤生长和转移。

[0014] 申请人已经公开了单克隆抗体，称为515H7和414H5，其结合CXCR4/CXCR4同源二聚体和CXCR4/CXCR2异源二聚体两者，并诱导两者的构象变化，其具有强的抗肿瘤活性（参见WO2010/037831）。

发明内容

[0015] 本发明旨在提供至少一种可用作检测和/或监测致癌疾病的诊断或预后工具的试剂，特别是特征在于CXCR4表达、或者由异常CXCR4表达所介导的那些。

[0016] 特别地，本发明提供可用于诊断或预后目的的能够结合CXCR4的新的分离的抗体。

[0017] 出人意料地以及与现有技术中的抗体对比，申请人已经生成能够特异性地结合CXCR4的存在抗体，所述抗体以CXCR4 单体或CXCR4/CXCR4同源二聚体的形式表达。在另一方面，本发明的抗体并不显著地结合任何已知的CXCR4/X异源二聚体，以及更具体地并不结合包括CXCR4/CXCR2异源二聚体。将在本说明书下文中讨论，这种性质关于诊断领域的极大兴趣。

[0018] 本发明的其它特点和优点将从下列详述和实例中显明。

[0019] 在第一方面，本发明涉及分离的抗体、或其抗原结合片段或衍生物之一，其以高亲和力结合CXCR4，优选结合人类CXCR4，并因此可用于诊断由CXCR4表达所介导的病理性过度增殖性致癌疾病。

[0020] 本发明的其它特点和优点将从下列详述和实例中显明。

[0021] 优选地，本发明包括根据本发明的的抗体、其衍生的化合物或其功能片段，其通过遗传重组或化学合成而获得。

[0022] 在第一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。

[0023] 应理解，“单克隆抗体”意思是来源于几乎同质的抗体群的抗体。更特别地，除了可以以最小比例发现的很少可能天然出现的突变之外，群中的单个抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体是由来源于单个细胞克隆(例如杂交瘤、用编码同质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码同质性抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的同质性抗体组成，其特征通常是一个且仅一个种类和亚类的重链，和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性且针对单一抗原的。另外，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原的单一表位。

[0024] 典型的IgG抗体包含通过二硫键结合的两条相同重链和两条相同轻链。每个重链和轻链都包含恒定区和可变区。每个可变区包含三个被称为“互补决定区”（“CDR”）或“超变区”的段，其主要负责与抗原的表位相结合。其通常按照从N端的顺序编号被称作CDR1、CDR2和CDR3。可变区中较为高度保守的部分被称作“框架区”。

[0025] 存在三个重链CDR和三个轻链CDR。本文所用术语CDR或CDRs表示，根据情况，包含负责抗体与其识别的抗原或表位通过亲和性结合的大多数氨基酸残基的这些区中的一个或几个、或者甚至全部这些区。

[0026] 根据本发明，抗体的CDR将根据IMGT编号系统来定义。从根据IMGT的CDR推导出根据Kabat的CDR，对本领域技术人员是显而易见的。根据Kabat的CDR必须视作本发明范围的一部分。

[0027] 无论抗原受体、链类型或物种如何，都将IMGT唯一的编号定义为比较可变结构域 [Lefranc M.-P.,Immunology Today18,509(1997)/Lefranc M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V. 和 Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT唯一编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23(第1个CYS)、色氨酸41(保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色
氨酸118(J-PHE或J-TRP)。所述IMGT唯一编号提供了框架区(FR1-IMGT：位置1至
26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区
CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，CDR-IMGT长度(在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13])成为关键信息。在2D图解中使用IMGT唯一编号，命名为IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M. 和 Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q. 和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，并在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用[Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。

[0028] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含至少一个互补决定区（CDR），其氨基酸序列选自氨基酸序列SEQ ID NO.1至6、或者至少一个CDR其序列与序列SEQ ID NO.1至6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性。

[0029] 在更优选的实施方案中，本发明的抗体包括i)重链，根据IMGT编号系统所定义的，其含有下列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一个，其中CDR-H1含有序列SEQ ID No.1、CDR-H2含有序列SEQ ID No.2以及CDR-H3含有序列SEQ ID No.3；和/或ii)轻链，根据IMGT编号系统所定义的，其含有下列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中至少一个，其中CDR-L1含有序列SEQ ID No.4、CDR-L2含有序列SEQ ID No.5以及CDR-L3含有序列SEQ ID No.6。

[0030] 在另一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含重链，所述重链含有根据IMGT所定义的下列三个CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-H1含有序列SEQ ID No.1、CDR-H2含有序列SEQ ID No.2以及CDR-H3含有序列SEQ ID No.3。

[0031] 根据再一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物包含轻链，所述轻链含有根据IMGT所定义的下列三个CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-L1含有序列SEQ ID No.4、CDR-L2含有序列SEQID No.5以及CDR-L3含有序列SEQ ID No.6。

[0032] 在一个优选的实施方案中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物包含重链，所述重链含有下列三个CDR，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：

[0033] -CDR-H1含有序列SEQ ID No.1、或者与序列SEQ ID No.1经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

[0034] -CDR-H2含有序列SEQ ID No.2、或者与序列SEQ ID No.2经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和

[0035] -CDR-H3含有序列SEQ ID No.3、或者与序列SEQ ID No.3经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

[0036] 在另一优选的实施方案中，本发明的抗体、或其功能片段或衍生物包含轻链，所述轻链含有下列三个CDR，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

[0037] -CDR-L1含有序列SEQ ID No.4、或者与序列SEQ ID No.4经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

[0038] -CDR-L2含有序列SEQ ID No.5、或者与序列SEQ ID No.5经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和

[0039] -CDR-L3含有序列SEQ ID No.6、或者与序列SEQ ID No.6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

[0040] 在又一个实施方案中，抗体、或其功能片段或衍生物包括：

[0041] -重链，所述重链含有根据IMGT所定义的下列三个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ IDNo.3的CDR-H3，或者与序列SEQ ID No.1、2或3分别经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和

[0042] -轻链，所述轻链含有根据IMGT所定义的下列三个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3，或者与序列SEQ ID No.4、5或6分别经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

[0043] 在本发明的意义上，两条核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”指两条进行比较的序列之间在最佳比对后获得的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学上的，并且两条序列之间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列之间的比较通常在已对其进行最佳比对后通过比较序列而进行，所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的最佳比对，除手工比较之外，还可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)（Ad.App.Math.2：482）、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)（J.Mol.Biol.48:443）、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988)（Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444）或通过使用这些算法的计算机软件（威斯康星遗传学软件包，遗传学计算机组，575Science Dr.,Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P）进行。

[0044] 通过比较两条最佳比对的序列确定两条核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中与用于两条序列之间最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸或氨基酸序列可具有添加或删除。通过如下方法计算百分比同一性：确定两条序列之间相同氨基酸或核苷酸残基的位置数目，将相同位置的数目除以在比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100以获得两条序列之间的百分比同一性。

[0045] 例如，从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可获得的BLAST程序“BLAST2序列”（Tatusova等人，“Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol，1999，Lett.174：247-250），可以与缺省参数一起使用（特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选的矩阵是例如程序建议的“BLOSUM62”矩阵）；直接通过所述程序计算两条待比较序列之间的百分比同一性。

[0046] 对于表现出与参考氨基酸序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选的实例包括包含参考序列，某些修饰，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或取代，截短或延伸的那些。在取代一个或更多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选其中被取代的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的取代。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被结构性氨基酸之一所取代的，然而并未改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸和以下限定的那些具体实例。

[0047] 等同氨基酸可根据其与被取代氨基酸的结构同源性或根据可能产生的各种抗体之间生物活性的比较性测试结果而确定。

[0048] 作为非限制性实例，下表1概述可进行却没有引起相应改变的抗体的生物活性发生显著改变的可能取代；在相同条件下，反向取代自然是可能的。

[0049] 表1

[0050]原始残基取代
Ala(A) Val,Gly,Pro
Arg(R) Lys,His
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala
His(H) Arg
Ile(I) Leu
Leu(L) Ile,Val,Met
Lys(K) Arg
Met(M) Leu
Phe(F) Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr,Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Phe,Trp
Val(V) Leu,Ala

[0051]

[0052] 如本领域技术人员已知的，在所述六种CDR之间最大的可变性（长度和组合物）发现于所述三种重链CDR，以及更具体地发现于此重链的CDR-H3。

[0053] 在具体的实施方案中，本发明涉及鼠抗体、或其衍生化合物或功能片段。

[0054] 在另一个实施方案中，本发明公开抗体、以及其抗原结合片段或衍生物，所述抗体包含：

[0055] 重链，所述重链含有基于CDR的“IMGT”定义的下列三个CDR：

[0056] -序列SEQ ID No.1、或者与序列SEQ ID No.1经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H1；

[0057] -序列SEQ ID No.2、或者与序列SEQ ID No.2经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H2；和

[0058] -序列SEQ ID No.3、或者与序列SEQ ID No.3经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3；以及

[0059] 轻链，所述轻链含有下列3个CDR：

[0060] -序列SEQ ID No.4、或者与序列SEQ ID No.4经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L1；

[0061] -序列SEQ ID No.5、或者与序列SEQ ID No.5经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2；和

[0062] -序列SEQ ID No.6、或者与序列SEQ ID No.6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3。

[0063] 在优选的实施方案中，本发明涉及抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其包括i)重链，其含有下列三个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2以及具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；和ii)轻链，其含有下列三个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2以及具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3。

[0064] 在本发明另一优选的实施方案中，所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物选自：

[0065] a)抗体，其具有包含下列3个CDR的重链，分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；以及含有序列SEQ ID No.8的轻链可变结构域；

[0066] b)抗体，其具有含有序列SEQ ID No.7的重链可变结构域；以及包含下列3个CDR的轻链，分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3；以及

[0067] c)抗体，其具有含有序列SEQ ID No.7的重链可变结构域；和含有序列SEQ ID No.8的轻链可变结构域。

[0068] 根据又一实施方案，本发明涉及抗体427aB1、或其抗原结合片段或衍生物之一，所述抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID No.7的重链可变结构域序列，或者与序列SEQ ID No.7经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和/或其中其包含含有氨基酸序列SEQ ID No.8的轻链可变结构域序列，或者与序列SEQ ID No.8经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

[0069] 在另一优选的实施方案中，本发明提供抗体427aB1、或其抗原结合片段或衍生物，所述抗体427aB1包含：

[0070] a)重链，所述重链包含：

[0071] ·下列3个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID No.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID No.3的CDR-H3；以及含有序列SEQ ID No.8的轻链可变结构域，和

[0072] ·重链可变结构域，所述重链可变结构域具有序列SEQ ID NO.7；以及

[0073] b)轻链，所述轻链包含：

[0074] ·下列3个CDR，分别为具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID No.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID No.6的CDR-L3；和

[0075] ·轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有序列SEQ ID No.8。

[0076] 本发明也涉及源自本发明所述抗体的任何化合物。

[0077] 抗体的“抗原结合衍生物”或“衍生物”具体地意思是为保留其被识别的能力而包含原始抗体的肽支架和至少CDR之一的结合蛋白。这样的衍生化合物是本领域技术人员公知的。

[0078] 特别地，本发明的抗体、或衍生化合物或其抗原结合片段特征在于所述衍生化合物由包含嫁接至少一个CDR的肽支架的结合蛋白组成，所述CDR以这样的方式嫁接以保留最初抗体的全部或部分互补位识别性质。在一个优选实施方案中，所述抗原结合蛋白是肽支架和所述至少一个CDR的融合蛋白。

[0079] 本发明所述的6个CDR序列中的一个或更多个序列也可存在于各种免疫球蛋白的蛋白支架上。在这种情况下，所述蛋白序列使得可能重建适合所嫁接的CDR正确折叠的肽骨架，使其保留其互补位抗原识别性质。

[0080] 本领域技术人员将知道选择用于CDR嫁接的蛋白支架类型的方法。更具体地，已知，要选择这样的支架必须满足尽可能多的标准（Skerra A.,J.Mol.
Recogn.,2000,13:167-187）：

[0081] -良好的系统发育保守性；

[0082] -已知的三维结构（例如，通过晶体学、NMR光谱或本领域技术人员已知的任何其它技术所确定的）；

[0083] -尺寸小；

[0084] -很少或没有转录后修饰；和/或

[0085] -易于生产、表达和纯化。

[0086] 最后，如上所述，这种肽支架包括1至6个来自原始抗体的CDR。优选地，但不是必须地，本领域技术人员将选择至少一个来自重链的CDR，后者被认为主要与抗体的特异性相关。选择一个或更多个相关CDR对于本领域技术人员是显而易见的，其将随后选择适合的已知技术（Bes等人,FEBS letters508,2001,67-74）。

[0087] 因此，本发明涉及抗体、或其衍生化合物或功能片段，其中肽支架选自蛋白，所述蛋白是a)系统发育非常保守地、b)结构结实的、c)公知的3-D分子组织、d)尺寸小的和/或e)包含通过删除和/或插入可被改变而不改变稳定性性质的区。

[0088] 根据优选的实施方案，所述肽支架选自：i）来自纤连蛋白的支架，优选3型纤连蛋白结构域10、脂质运载蛋白、抗运载蛋白（anticalin）、来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还原蛋白A或带有重复基序比如“锚蛋白重复”（Kohl等人,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705）、“犰狳蛋白重复”、“富有-亮氨酸重复”和“三角形四肽重复（tetratricopeptide repeat）”的蛋白；或者iii）神经元NO合酶的蛋白抑制剂（PIN）。

[0089] 本发明的另一方面涉及上述抗体的功能片段。

[0090] 更具体地，本发明靶向抗体、或其衍生化合物或功能片段，其中所述功能片段选自片段Fv、Fab、(Fab’)2、Fab’、scFv、scFv-Fc和双特异抗体（diabodies）、或者其半衰期已被延长任何片段，例如聚乙二醇化的（PEGylated）片段。

[0091] 通过根据本发明抗体的抗原结合片段（或“功能片段”：处于本申请的目的，这两个术语同义），在本文其指，例如片段Fv、scFv（sc=单链）、Fab、F（ab’）2、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体、或通过化学修饰延长半衰期的任何片段，比如增加聚亚烷基二醇，如聚乙二醇（聚乙二醇化）（聚乙二醇化的片段称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F（ab’）2-PEG和Fab’-PEG）或通过并入脂质体、微球体或PLGA。特别地，根据本发明的所述片段含有至少一个本发明特征性的CDR，以使得片段保留（甚至部分保留）母体抗体的结合活性和特异性。

[0092] 优选地，所述抗原结合片段将包含或包括其所源自的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其所来自的抗体相同的结合特异性和足够的亲和性。所述片段的所述亲和性优选地至少等于其所来自的抗体的亲和性的1/100，更优选地至少
1/10。

[0093] 这样的抗原结合片段含有至少5个氨基酸，优选6、7、8、10、15、25、50或100个其所来自的抗体序列的连续的氨基酸。

[0094] 根据本发明，通过这样的方法比如酶消化，包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶、和/或通过化学还原切割二硫桥从本发明的抗体可获得抗原结合片段。所述抗体片段还可以通过重组遗传技术或肽合成而获得。

[0095] 为清楚起见，下表2概述与本发明的抗体427aB1相对应的各种氨基酸序列。

[0096] 表2（其中Mu.=鼠的）

[0097]

[0098] 根据另一方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤。

[0099] 优选地，所述杂交瘤是在2008年6月25日以参考号I-4018保藏在法国巴黎巴斯德研究所（Institute Pasteur）的CNCM的杂交瘤。通过融合Balb/C免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2/O-Ag14系的细胞获得所述杂交瘤。

[0100] 根据本发明另一优选的实施方案，所述单克隆抗体（本文指427aB1）、或其抗原结合片段或衍生物通过所述杂交瘤分泌。

[0101] 本发明的新方面涉及分离的核酸，特征在于其选自下列核酸：

[0102] a)核酸，DNA或RNA，其编码根据本发明的抗体或其衍生化合物或功能片段；

[0103] b)核酸，其包含的DNA序列含有选自序列SEQ ID No.9至14的序列、或者与序列SEQ ID No.9至14经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

[0104] c)核酸，其包含的DNA序列含有序列SEQ ID No.15或16，或者与序列SEQ ID No.15或16经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

[0105] d)从如a)、b)或c)定义的核酸翻译而来的RNA；

[0106] e)如a)、b)和c)定义的核酸的互补核酸；以及

[0107] f)至少18个核苷酸的核酸，其能够在高度严谨的条件下与序列SEQ ID No.15或16、或者与序列SEQ ID15或16经最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列、或者其互补序列进行杂交。

[0108] 下表3概述关于本发明的抗体427aB1的各种核苷酸序列。

[0109] 表3（其中Mu.=鼠的）

[0110]

[0111]

[0112] 术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”，“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换使用，表示无论有无修饰的确定核酸的片段或区域的精确核苷酸序列，其含有或不含非天然核苷酸，是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。

[0113] “与优选序列经最佳比对后表现出至少80%，优选85%、90%、95%和98%百分比同一性的核序列”表示，就参考核序列而言，表现出某些修饰，比如，尤其是删除、截短、延长、嵌合融合和/或取代，尤其是点突变（punctual）的核序列。优选的，这些是编码与参考序列相同氨基酸序列的序列，这涉及遗传密码的简并、或优选在高度严谨的条件下（尤其如下所限定的那些）倾向于和参考序列特异性杂交的互补序列。

[0114] 在高度严谨的条件下杂交表示以这样的方式选择涉及温度和离子强度的条件，其允许在两条互补DNA片段之间维持杂交。基于纯粹说明性的基础，出于限定上述多核苷酸片段的目的，杂交步骤高度严谨的条件有利地如下。

[0115] DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两步进行：（1）在含有5×SSC（1×SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液）、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠（SDS）、10×Denhardt’s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑鱼精子DNA的磷酸缓冲液（20mM，pH7.5）中，于42℃下预杂
交3小时；（2）在取决于探针长度的温度下进行20小时初步杂交（即：42℃对应于探针>100个核苷酸长度），随后是在2×SSC+2%SDS中，于20℃下进行两个20分钟的洗涤，在
0.1×SSC+0.1%SDS中，20℃下进行一个20分钟的洗涤。在0.1×SSC+0.1%SDS中，在对应探针>100个核苷酸长度的60℃下进行30分钟的最终洗涤。根据Sambrook等描述的操作，本领域技术人员可以为更长或更短的寡核苷酸，调整特定尺寸多核苷酸的上述高度严谨的杂交条件（Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory；第三版，2001）。

[0116] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体。

[0117] 特别地，本发明提供携带这种核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

[0118] 本发明的载体优选地包含允许在给定的宿主细胞中表达核苷酸序列的元件。为表达本发明的抗体，将编码所述抗体重和/或轻链的多核苷酸插入至表达载体中，以使得所述基因可操作地连接于转录和翻译序列。“可操作地连接的”序列包括与目的基因相邻的表达控制序列、以及通过反式或远处作用以控制目的基因的表达控制序列两者。本文所用术语“表达控制序列”指多核苷酸序列，其对影响表达和加工其所连接的编码序列是必要的。表达控制序列包括恰当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号，例如剪切和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即Kozak共有序列）；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时增强蛋白分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子和转录终止序列。
术语“控制序列”旨在以最低程度包括其存在对表达和加工必不可少的所有成分，以及也可包括其存在变得有利的附加成分，例如前导序列（leader sequence）和融合配偶体序列（fusion partner sequence）。

[0119] 本文所用的术语“载体”，旨在指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。载体中的一种类型是“质粒”，其指附加DNA段可被连接至其中的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中附加DNA段可被连接至病毒基因组中。某些载体在其所引入的宿主细胞中能够自发地复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型（episomal）哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可通过引入至宿主细胞得以整合至宿主细胞的基因组内，因此同宿主基因组一起复制。

[0120] 根据本发明的载体也可含有允许所述载体在宿主细胞中稳定维持的序列。很容易意识到，这样的具有指定复制起点的序列将根据宿主细胞类型而变。本领域技术人员根据所用宿主细胞可选择和优化这些各种元件。为此目的，可将核苷酸序列插入所选宿主内的自我复制载体中或是所选宿主的整合载体。

[0121] 通过本领域技术人员通常使用的方法制备这样的载体，并且可通过标准方法，例如脂质转染、电穿孔、热休克或化学方法将所得的克隆引入合适的宿主。

[0122] 本发明也针对通过本发明所述的载体转化的宿主细胞，或者含有本发明所述载体的宿主细胞。

[0123] 所述宿主细胞可选自原核或真核系统，例如细菌细胞，也如酵母细胞或动物细胞、尤其哺乳动物细胞。也可用昆虫或植物细胞。

[0124] 本发明也涉及含有根据本发明的转化细胞的除人以外的动物或植物。

[0125] 本发明的另一方面涉及产生根据本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物的方法，特征在于所述方法包括步骤：a)在适当的条件下在适当的介质中使根据本发明的宿主细胞生长；和b)回收所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物。

[0126] 随后，从培养介质或细胞提取物中可纯化所得的表达抗体。本发明抗体的可溶形式可从培养物上清中回收。随后，通过用于纯化免疫球蛋白分子的本领域任何已知方法可将其纯化，例如通过色谱（例如，离子交换、亲和性、特别是通过亲和Fc的蛋白A等等）、离心、溶解性的差异（differential solubility）或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术。对本领域普通技术人员而言，合适的纯化方法将是显而易见的。

[0127] 本发明的多肽也可通过化学合成制备。这样的制备方法也在本发明的范围内。本领域技术人员已知通过浓缩片段或通过在溶液中的传统合成的用于化学合成的几种方法，例如固相技术（尤其参见Steward等人,1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford,111,第二版）或部分固相技术。在本发明中也包括通过化学合成所获得的且含有相应的非天然氨基酸的多肽。通过本发明的方法可获得的抗体、或其抗原结合片段或衍生物也包括在本发明中。

[0128] 如上述，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物能够结合作为单体和/或同源二聚体的CXCR4。

[0129] 令人惊讶地，申请人也已证明所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物不显著结合作为异源二聚体的CXCR4。优选地，所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物不结合CXCR4/CXCR2异源二聚体。

[0130] 已知现有技术的抗体，例如515H7能够结合作为单体、同源二聚体或异源二聚体的CXCR4(WO2010/037831)。与之相反，因为本发明的抗体能够区分同源和异源二聚体，因而其显示出对CXCR4同种型的强特异性。这种性质使得本发明的抗体成为差异筛选的优选工具，例如表征肿瘤。

[0131] 通过“作为单体和/或同源二聚体的CXCR4”或“单体/同源二聚体的CXCR4”（出于本申请的目的，这两个术语同义并意味着可互换使用），本文指单体形式的CXCR4，即不与任何蛋白配偶体参与任何物理相互作用；和/或同源二聚体形式的CXCR4，即与另一CXCR4分子形成复合物。表达“作为单体和/或同源二聚体的CXCR4”或“单体/同源二聚体的CXCR4”意为特别地排除CXCR4异源二聚体，即CXCR4与除CXCR4自身以外的任何其它蛋白配偶体的二聚体。具体地来说，表达“作为单体和/或同源二聚体的CXCR4”或“单体/同源二聚体的CXCR4”特别地排除CXCR4/CXCR2异源二聚体。

[0132] 因此，本发明涉及上述抗体、或其抗原结合片段或衍生物，其用于体外或离体诊断和/或预后与CXCR4表达相关的致癌疾病。

[0133] 因此，本发明涉及和CXCR4表达相关的致癌疾病的体外或离体诊断和/或预后的方法，其包括检测本发明的抗体、或其片段或衍生物结合CXCR4的步骤。

[0134] 在优选的实施方案中，所述致癌疾病由与CXCR4单体和/或同源二聚体表达相关的致癌疾病组成。

[0135] 如本文所用“诊断”疾病指鉴定或检测与单体/同源二聚体的CXCR4表达相关的或介导的病理性过度增殖性致癌疾病的存在、监测疾病的进展、以及鉴定或检测指示与CXCR4单体和/或同源二聚体表达相关的疾病的细胞或样本的过程。

[0136] 如本文所用“预后”表示从疾病恢复的可能性或预测疾病的可能发展或结果。例如，如果来自受试者的样本用本发明抗体染色呈阴性，那么对那个受试者的“预后”优于对单体/同源二聚体的CXCR4染色呈阳性的样本。以适当等级针对单体/同源二聚体的CXCR4表达水平给样本评分，如将在下文更加详述。

[0137] 以本领域技术人员已知的一些方式可测试本发明的抗体、或其片段或衍生物结合CXCR4，包括CXCR4单体、CXCR4/CXCR4同源二聚体以及CXCR4/CXCR2异源二聚体。一种这样的方法称为BRET分析，详述在WO2010/037831中。515H7抗体可方便地用作结合分析的阳性对照。

[0138] 本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物可以是鼠抗体。然而，因为这样的抗体包含本文所述抗体的CDR，所以这样抗体的嵌合或人源化版本也应视作本发明范围的部分。

[0139] 重要地，本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物不阻断515H7结合CXCR4。因为这两种抗体不竞争CXCR4，因此在使用515H7抗体的治疗期间可以使用本发明的抗体而不干扰所述治疗。因此，在监测基于所述抗体515H7的疗法效力（efficacy）上，例如通过肿瘤的体内成像，本发明的抗体是关键的工具。

[0140] 在本发明更优选的实施方案中，所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物不具有任何体内抗肿瘤活性。

[0141] 因为这种性质允许使用抗体以筛选患者、或者在治疗过程后使用对患者无任何影响或后果的药剂（agent），所述性质在诊断应用中极为受到关注。因为抗体427aB1对患者无影响，所以这种性质使得抗体427aB1成为筛选待治疗患者的优选工具。本领域技术人员将会识别，通过生成能够识别作为单体和同源二聚体的CXCR4、且没有体内抗肿瘤活性的抗体，申请人提供真正新颖性和创造性的抗体。

[0142] 所述抗体可以以免疫缀合物或标记抗体的形式存在以获得可检测的和/或可量化的信号。当本发明的抗体与合适的标记或其它适合的可检测的生物分子或化学品一起使用时，其特别可用于体外和体内诊断和预后应用。

[0143] 用于免疫分析的标记通常对本领域技术人员是已知的。这样的标记尤其包括酶、放射性同位素、以及荧光、发光和发色物质，包括有色颗粒比如胶体金或乳胶珠。各种类型的标记和将标记缀合至本发明抗体的方法对于本领域技术人员是公知的，如下述的那些。

[0144] 如本文所用，术语“和作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达相关的致癌疾病”意欲指这样的疾病和其它病症，其中在患所述疾病的受试者中出现的高水平的单体/同源二聚体的CXCR4（异常）已被证实或疑似和疾病的病理生理或造成疾病恶化的因素相关。例如，通过CXCR4的水平升高，优选在患所述疾病受试者的感染细胞或组织中的细胞表面的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的水平升高，可证明这样的疾病。作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平的升高，例如使用本发明的抗体427aB1可检测到。

[0145] 在某些实施方案中，当涉及作为单体和/或同源二聚体的CXCR4时，“升高的表达”指蛋白或基因的表达水平，其表明与对照相比在表达上显示统计学上显著提高（通过RNA表达或蛋白表达测量的）。

[0146] 在另一实施方案中，本发明涉及在受试者中检测表达单体/同源二聚体CXCR4的肿瘤存在的方法，所述方法包括步骤：a)将本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物施用于受试者；和b)检测所述抗体的结合，其中所述结合表明存在肿瘤。

[0147] 本发明的优选方面是用于在受试者中离体检测表达单体/同源二聚体CXCR4的肿瘤存在的方法，其中所述方法包括步骤：

[0148] (a)用本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物接触来自所述受试者的生物样本，以及

[0149] (b)检测所述抗体与生物样本的结合。

[0150] 本发明的抗体的结合可通过技术人员可利用的各种分析加以检测。虽然本发明包括任何用于执行所述分析的合适手段，但是特别可以提到FACS、ELISA、western印迹法和IHC。

[0151] 在另一实施方案中，本发明涉及在受试者中检测表达单体/同源二聚体CXCR4的肿瘤的定位的方法，所述方法包括步骤：

[0152] a)将根据本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物施用于所述受试者；和[0153] b)检测所述抗体的结合，其中所述结合表明存在肿瘤。

[0154] 为检测表达肿瘤的存在，可使用本领域技术人员已知的许多技术。然而，优选的方法是IHC或FACS。

[0155] 本发明的另一方面涉及在来自受试者的肿瘤中体外或离体确定表达作为单体/同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比的方法，所述方法包括步骤：

[0156] (a)用根据本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物接触来自受试者的生物样本，以及

[0157] (b)在所述生物样本中定量表达作为单体/同源二聚体的CXCR4的细胞的百分比。

[0158] 本发明的又一方面涉及在来自受试者的肿瘤中体外或离体确定单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平的方法，所述方法包括步骤：

[0159] (a)使来自受试者的生物样本接触根据本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，以及

[0160] (b)在所述生物样本中定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平。

[0161] 所述抗体与单体/同源二聚体的CXCR4表达水平的结合水平可通过免疫组织化学（IHC）或FACS，优选地通过IHC进行测量。

[0162] 一旦确定了存在于测试样本中作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的量，其结果可以和对照样本的量相比较，所述对照样本的量是以和测试样本相似的方式获得的，但来自于未患有与作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达相关的过度增殖性致癌疾病的个体。如果单体/同源二聚体的CXCR4的水平在测试样本中显著提高，可得出这样的结论，其所来自的受试者患有或将发展为所述疾病的可能性增加。

[0163] 关于靶向抗肿瘤治疗的发展，采用免疫组织学技术的诊断给出在受体表达水平上的原位信息，从而使得能够选择需要这样治疗的对根据受体表达水平的治疗易感的患者。

[0164] 确定分期具有潜在的预后价值，并为最佳治疗的设计提供标准，Simpson等人J.Clin.Oncology18:2059(2000)。例如，对实体肿瘤的治疗选择基于肿瘤分期，其常使用来自美国癌症联合会（AJCC）的肿瘤/结节/转移（Tumor/Node/Metastasis，TNM)测试来进行。众所周知，虽然这个测试和分期系统对于在患者中已经诊断出实体肿瘤的阶段提供一些有价值信息，但是其是不精确和不充分的。特别是，它不能鉴定肿瘤进展的最早期。

[0165] 因此，本发明涉及体外或离体确定受试者肿瘤评分的方法，所述方法包括步骤：

[0166] (a)用本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物接触来自受试者的生物样本，[0167] (b)在所述生物样本中定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4的结合水平；以及

[0168] (c)通过将来自受试者的所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物的结合的量化水平与适当等级进行比较，为肿瘤评分。

[0169] 在优选实施方案中，当组织样本是福尔马林固定的、甲醛取代固定的比如糖固定的（Glyco-fixx fixed-）、石蜡包埋的和/或冷冻的时，用于诊断的所述抗体能够结合靶向受体。

[0170] 优选地，通过免疫组织化学（IHC）或FACS，更优选地通过IHC测量单体/同源二聚体的CXCR4表达水平。

[0171] 任何常规的危害分析方法可用于评价作为单体和/或同源二聚体的CXCR4预后值。代表性的分析方法包括Cox回归分析，这是用于存在删失情形下存活或时间-对-事件数据建模的半参数方法（Hosmer和Lemeshow,1999;Cox,1972）。相对于其它存活分析，如寿命表或Kaplan-Meyer、Cox允许在模型中纳入预测变量（协变量）。用常规分析方法，如Cox能够检验关于原发性肿瘤中单体/同源二聚体CXCR4表达状态与疾病复发的时间-对-发作（无疾病存活时间、或时间对转移性疾病）或时间对因疾病导致的死亡（整个存活时间）的关系的假设。Cox回归分析也被视为Cox比例风险分析。这种方法是检验肿瘤标志物对患者存活时间预后值的标准。当用于多变量模型时，平行测试几种协变量的作用，从而可以确定具有独立预后值的个体协变量，即最有用的标志物。术语阴性或阳性的“单体/同源二聚体的CXCR4状态”在本文中也指[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]或[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0172] 在诊断或监测癌症期间可给样本“评分”。以最简单的形式，通过免疫组织化学目测检验样本以判断评分是阴性或阳性范畴（categorial）。更为定量的评分涉及判断两个参数：取样细胞的染色强度和染色的（“阳性”）细胞的比例。

[0173] “单体/同源二聚体的CXCR4状态”在本文指，基于确定单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平，将肿瘤划分至作为单体和/或同源二聚体的CXCR4阳性[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]、或作为单体和/或同源二聚体的CXCR4阴性[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]类别。所述CXCR4的表达水平可通过本领域技术人员可用的任何合适方法加以检测和测量，比如免疫组织化学（IHC）或FACS。

[0174] 在本发明的一个实施方案中，为确保标准化，可在不同等级上针对单体/同源二聚体的CXCR4表达水平可给样本评分，其中的大多数基于评估反应产物的强度和阳性细胞的百分比（Payne等人,Predictive markers in breast cancer–the present,Histopathology2008,52,82-90）。

[0175] 在更优选的实施方案中，所述评分包含使用基于两个参数的适当等级，所述两个参数是染色强度和阳性细胞的百分比。

[0176] 作为第一个实例，基于来自快速Allred评分（Quick Allred scoring）对雌激素受体和黄体酮受体的IHC评估的启示，结合反应性强度评分和染色细胞比例评分，在从0至8的整体等级上针对单体/同源二聚体的CXCR表达水平可给样本评分(Harvey JM,Clarck GM,Osborne CK,Allred DC;J.Clin.Oncol.1999;17;1474-1481)。更具体来说，在0至3的等级上对反应性强度的第一个标准进行评分，0对应于“无反应性”和3对应于“强反应性”。在0至5的等级上对反应比例的第二个标准进行评分，0对应于“无反应性”和5对应于“67-100%比例反应性”。反应性强度评分和反应比例评分可随后加和以产生0至8的总分。

[0177] 0至2的总分视为阴性，而3至8的总分视为阳性。

[0178] 根据这个等级，在本说明书中使用的术语肿瘤的阴性或阳性“单体/同源二聚体的CXCR4状态”指分别对应于在Allred等级上的0至2或3至8评分的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达水平。

[0179] 下文表4说明根据Allred方法用于解释IHC结果的指南。

[0180] 表4

[0181]

[0182] 在优选的实施方案中，根据本发明的方法指0至8等级的适当等级，其中无反应性评分为0，在67-100%反应比例中的强反应性评分为8。

[0183] 在另一实施方案中，提供体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，其中所述方法包括步骤：

[0184] (a)根据Allred等级为来自受试者的肿瘤评分；和

[0185] (b)确定肿瘤状态是Allred评分3至8的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]；或

[0186] (c)确定肿瘤状态是Allred评分0至2的[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]。

[0187] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为3的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0188] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为4的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0189] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为5的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0190] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为6的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0191] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为7的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0192] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为8的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0193] 在本发明的另一具体方面，肿瘤是Allred评分为3至8的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0194] 作为第二个实例，基于对HER-2受体的IHC评估的传统评分的启示，例如，在一定程度上更简单的评分方法对于单体/同源二聚体的CXCR4表达水平可为样本评分，所述评分方法将染色强度（优选膜染色）和显示染色的细胞比例整合为从0至3+的组合等级。

[0195] 在这个等级（指所述经简化的等级）中，0和1+是阴性而2+和3+代表阳性染色。虽然，1+至3+的评分可被重编码为阳性，因为各阳性评分和零分（阴性）相比是可能和显著升高的复发和致死性疾病风险相关，但是阳性评分中提高的强度可提供额外的风险降低。

[0196] 一般而言，在本说明书中使用的术语肿瘤的阴性或阳性的“单体/同源二聚体的CXCR4状态”，指在经简化的等级上分别与评分0-1+或2+-3+相对应的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达水平。应当仅考虑侵袭性肿瘤的完全周缘膜反应性，其通常类似“铁丝织网（chicken wire）”外观。根据目前的指南，对作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的评分为临界（评分2+或3+）的样本需要经过进一步分析。如果作为非限定性实例，对照不符合预期、伪影参与大部分样本以及样本具有正常乳腺导管（内参）的强的膜阳性，其表明了过度的抗原复原，则应通过FISH或任何其它方法否定、和或再次重复或测试IHC分析。

[0197] 为清楚起见，下表5概括了这些参数。

[0198] 表5

[0199]

[0200]

[0201] 在优选实施方案中，根据本发明的方法涉及适当等级是0至3+的等级，其中无膜反应性的肿瘤细胞评分为0，在10％以上肿瘤细胞中的强烈完全的反应性评分为3+。

[0202] 更具体地，如上所述，所述适当等级是0至3的等级，其中没有膜反应性的肿瘤细胞评分为0；在10％以上的肿瘤细胞中微弱察觉到的膜反应性评分为1+；在10％以上的肿瘤细胞中从弱到中度的完全膜反应性评分为2+；以及在10％以上的肿瘤细胞中强烈完全反应性评分为3+。

[0203] 因此，本发明的另一实施方案提供体外或离体确定来自受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包w括步骤：

[0204] (a)根据上述经简化的等级为来自受试者的肿瘤评分；和

[0205] (b)确定肿瘤状态是2+或3+评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]；或

[0206] (c)确定肿瘤状态是0或1+评分的[单体/同源二聚体的CXCR4(-)]。

[0207] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是评分为2+的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0208] 在本发明的一个具体方面，肿瘤是评分为3+的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]；

[0209] 在本发明的另一具体方面，肿瘤是评分为2+或3+的[单体/同源二聚体的CXCR4(+)]。

[0210] 根据本发明的测试或分析结果可以以任何各种格式体现。

[0211] 结果可以定性地体现。例如，测试报告可仅表明是否检测到具体的多肽，也许还具有检测限的指征。结果可以以半定量显示。例如，可限定各种范围，以及可为所述范围分配提供某种程度定量信息的评分（如取决于所用等级的0至3+或者0至8）。这样的评分可反映各种因素，例如在其中检测到作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的细胞数目、信号强度（其可表明单体/同源二聚体的CXCR4或CXCR4携带细胞的表达水平）等。结果可以以定量方式显示，如以在其中检测到多肽（CXCR4）的细胞的百分比、以蛋白浓度等。

[0212] 测试提供的输出类型将根据测试的技术限制和与多肽检测相关的生物学显著性而不同，这对本领域普通技术人员是可以理解的。例如在某些多肽的情况下，纯定性输出（例如，在某种检测水平是否检测到多肽）提供显著性信息。在其它情况下，更加定量的输出（例如，在测试样本中多肽表达水平相对于正常水平之比）是必须的。

[0213] 本发明也涉及用于确定致癌疾病是否对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感的方法，所述方法包括步骤：

[0214] (a)如上述体外或离体确定受试者的肿瘤状态，和

[0215] (b)如果状态是[单体/同源二聚体的CXCR4（+）]，则确定致癌疾病对使用CXCR4拮抗剂的治疗易感。

[0216] 在优选的实施方案中，所述CXCR4拮抗剂是上述的抗CXCR4抗体、或其片段或衍生物。

[0217] 在另一方面，本发明涉及诊断受试者中与单体/同源二聚体的CXCR4表达相关的病理性过度增殖性致癌疾病或对病理状态的易感性的方法，所述主题包括：

[0218] (a)确定样本中单体/同源二聚体的CXCR4的存在或缺失，和

[0219] (b)基于所述作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的存在或缺失，诊断病理状态或对病理状态的易感性。

[0220] 在本发明的方法中，检测表达单体/同源二聚体的CXCR4的细胞或单体/同源二聚体的CXCR4水平升高通常指示患者患有或疑似存在单体/同源二聚体的CXCR4介导的疾病。

[0221] 因此，本发明提供用于预测个体癌症发展风险的方法，所述方法包括在生物样本中检测单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平，其中高的单体/同源二聚体的CXCR4表达水平表明具有发展为癌症的高风险。

[0222] 已观察到CXCR4表达与几种癌症类型中进展的肿瘤分期显著相关（Schimanski等人,J Clin Oncol,ASCO Annual Meeting Proceedings Part I.,24(18S):14018,2006;Lee等人,Int J Oncol.,34(2):473-480,2009;Pagano,Tesi di dottorato,Universitàdegli Studi di Napoli Federico II,2008）。

[0223] 因此，本发明也涉及评估肿瘤侵袭性的方法。本文所用“肿瘤侵袭性”指肿瘤快速生长和倾向于迅速扩散。在一个实施方案中，所述方法包括步骤：

[0224] (a)确定个体肿瘤样本中细胞表达的单体/同源二聚体的CXCR4水平，和

[0225] (b)确定在稍后时间取自相同个体的等同组织样本中表达的单体/同源二聚体的CXCR4水平，

[0226] (c)计算获自状态(a)的表达水平与获自步骤(b)的表达水平之间的比，

[0227] 其中，在不同时间的肿瘤样本中的单体/同源二聚体的CXCR4表达之比提供了癌症进展风险的信息。

[0228] 在优选的实施方案中，获自步骤(a)的水平和获自步骤(b)的水平之比小于1，则表示侵袭性。在另一个实施方案中，比值大于或等于1表示无侵袭性。

[0229] 本发明又一方面是监测对单体/同源二聚体的CXCR4靶向治疗的响应的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达。当所述治疗启动单体/同源二聚体的CXCR4的下调和/或降解时，这样的监测可能非常有用。

[0230] 特别地，监测细胞表面的单体/同源二聚体的CXCR4表达可能是用于评估在临床试验期间的治疗效果和“个体化”治疗的关键工具。

[0231] 因此，这个应用提供用于确定对受试者合适的治疗方案的方法。

[0232] 单体/同源二聚体的CXCR4水平的升高或降低指示与单体/同源二聚体的CXCR4相关的癌症的演变。因此，通过测量表达单体/同源二聚体的CXCR4的细胞数目的增加或者存在于各种组织或细胞中单体/同源二聚体的CXCR4浓度的变化，有可能确定旨在减轻CXCR4相关恶性肿瘤的具体治疗方案是否有效。

[0233] 因此，本发明也针对确定治疗方案效果的方法，所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，所述方法包括步骤：

[0234] (a)在第一时间点提取自受试者的生物样本中确定单体/同源二聚体的CXCR4的第一表达水平；

[0235] (b)在第二较后的时间点提取自受试者的生物样本中确定单体/同源二聚体的CXCR4的第二表达水平；

[0236] (c)确定获自(a)的水平与获自(b)的水平之比；以及

[0237] (d)当步骤(c)之比大于1时，确定所述治疗方案的效果为高；或者

[0238] (e)当步骤(c)之比小于或等于1时，确定所述治疗方案的效果为低。

[0239] 在优选的实施方案中，所述治疗方案设计用于在患有单体/同源二聚体的CXCR4相关致癌疾病的受试者中缓解所述疾病，所述治疗方案包括向所述受试者施用CXCR4抑制剂。

[0240] 本发明另一优选的实施方案提供用于选择癌症患者的方法，所述癌症患者经预测能够或不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益，所述方法包括步骤：

[0241] (a)确定在所述患者中单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平；

[0242] (b)确定来自健康个体的单体/同源二聚体的CXCR4的参考表达水平；

[0243] (c)确定获自步骤(a)的水平与获自步骤(b)的参考水平之比；以及

[0244] (d)如果步骤(c)之比大于1，则选择经预测从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者；或者

[0245] (e)如果步骤(c)之比等于或小于1，则选择经预测不能从施用治疗量的CXCR4抑制剂中获益的患者。

[0246] 在本说明书的意义上，表达“CXCR4抑制剂”或“CXCR4抑制剂化合物”指能够结合CXCR4并抑制CXCR4配体结合的任何化合物或分子。作为非限定性实例，CXCR4抑制剂包括AMD3100和AMD3465。其它可用的CXCR4抑制剂包括，但不限定于CTCE-0214；CTCE-9908；CP-1221(线性肽、环肽、天然氨基酸、非天然氨基酸和肽模拟化合物（peptidomimetic compounds）；T140 和类似物；4F- 苯甲酰-TN24003；KRH-1120；KRH-1636；KRH-2731；
polyphemusin（无对应中译文）类似物；ALX40-4C；或者在WO01/85196、WO99/50461、WO01/94420、WO03/090512中描述的那些，其中每一个通过引用并入本文。

[0247] 在优选的实施方案中，所述抑制剂是单克隆抗体，例如在专利WO2008/060367和WO2009/140124中描述的那些。

[0248] 在最优选的实施方案中，所述CXCR4抑制剂是单克隆抗体 515H7（WO2010/037831）。

[0249] 本发明的目的还提供与作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达相关的致癌疾病的体内成像方法。这样的方法用于体内定位肿瘤以及监测其侵袭性。同样，这样的方法也用于监测进展和/或监测在患者中对治疗的响应，所述患者之前诊断为患有单体/同源二聚体CXCR介导的癌症。

[0250] 在第一方面，本发明提供体内成像试剂，所述试剂包括根据本发明的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，所述抗体、或其片段或衍生物优选是标记的，更优选放射性标记的。可向患有单体/同源二聚体的CXCR4介导的癌症的患者施用所述试剂与药学有效载体的组合。本发明也关注所述试剂在患有单体/同源二聚体的CXCR4介导的癌症的患者的医疗成像中的用途。本发明的方法包括步骤：

[0251] (a)向所述患者施用成像有效量的成像试剂，和

[0252] (b)检测所述试剂。

[0253] 在第一个实施方案中，成像试剂包括靶向部分和活性部分。

[0254] 如本文所用，术语“靶向部分”指在细胞表面上特异性识别和结合单体/同源二聚体的CXCR4的剂。在具体实施方案中，靶向部分是特异性结合单体/同源二聚体的CXCR4的抗体、或其片段或衍生物。特别地，靶向部分是上述的抗体、或其片段或衍生物。本文所用的“活性部分”是允许体内检测所述成像试剂的剂。根据本发明的活性部分特别包括放射性元素，例如锝-99m（99mTc）、铜-67（Cu-67）、钪-47（Sc-47）、镏（Luthetium）-77（Lu-177）、铜-64（Cu-64）、钇-86（Y-86）或碘-124（I-124）。

[0255] 在哺乳动物如人类中以有效量施用成像试剂用于诊断用途，然后检测成像试剂的定位和积累。可通过放射性核素成像、放射性闪烁摄影术、核磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、计算机轴断层扫描、X-射线或磁共振成像法、荧光检测和化学发光检测以检测成像试剂的定位和积累。

[0256] “生物样本”可以是任何取自受试者的样本。这样的样本必须允许确定本发明生物标志物的表达水平。因此，样本的性质将取决于肿瘤的性质。优选地，如果所述癌症是液体肿瘤，则生物样本通过检测活化的Akt和/或Erk蛋白以确定所述生物标志物表达水平，所述生物样本包括样本，诸如血液样本、血浆样本、或淋巴样本。本文的“液体肿瘤”指血液或骨髓的肿瘤，即，如白血病和多发性骨髓瘤的血液恶性肿瘤。优选地，所述生物样本是血液样本。实际上，通过从患者处完全无害的血液采集可获得这样的血液样本，因此所述血液样本允许CXCR4抑制剂响应或不响应表型的非侵入性诊断。

[0257] 当癌症是固体癌症时，本文所用“生物样本”也包括待测患者的固体癌症样本。这样的固体癌症样本允许技术人员进行本发明生物标志物水平的任何类型的测量。在某些情况下，根据本发明的方法可进一步包括从患者中取固体癌症样本的初级步骤。“固体癌症样本”指肿瘤组织样本。即使在癌性的患者中，肿瘤位点的组织也包括非肿瘤健康组织。因此，“癌症样本”应限于取自患者的肿瘤组织。所述“癌症样本”可以是活检样本或取自手术切除治疗的样本。

[0258] 根据一方面，来自患者的样本是癌细胞或癌组织。

[0259] 根据本领域技术人员已知的方法可取得和制备（如果必要的话）这种样本。

[0260] 在本发明中的癌细胞或癌组织并无具体限制。

[0261] 如本文所用，术语“癌”指或描述哺乳动物中通常以细胞增殖失控为特点的生理状态。本文使用的术语“癌”和“癌性的”意为包括所述疾病的所有期。因此，本文所用的“癌”可包括良性和恶性肿瘤两者。癌的实例包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴恶性肿瘤。更特别地，根据本发明的癌选自鳞状细胞癌（如上皮鳞状细胞癌）、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠道癌和胃肠道间质癌的胃部或胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏的或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、雀斑恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤（包括低等级的/滤泡性的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）；小淋巴细胞（SL）NHL、中间级/滤泡性NHL；中间级的弥漫性NHL；高等级的免疫母细胞性NHL；高等级的淋巴母细胞性NHL；高等级的小无核裂细胞NHL；巨大肿块（bulky disease）NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血病）；慢性淋巴细胞性白血病（CLL）；急性淋巴母细胞性白血病（ALL）；毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病（CML）；急性淋巴细胞白血病（AML）；和移植后淋巴增生性障碍（PTLD）、以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿（如脑肿瘤相关的）、梅格斯综合征、脑、以及头颈癌，以及相关的转移。

[0262] 在优选的实施方案中，所述癌选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和结肠癌。在更优选的实施方案中，所述癌包括淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

[0263] 有利地，相对于对照细胞或样本中的水平（也作“参考水平”或“参考表达水平”）比较或测量作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达水平。“参考水平”、“参考表达水平”、“对照水平”和“对照”在本说明书中可互换使用。如本文所用，对照水平”表示在相比较的对照细胞中测量的分开的基线水平，其通常没有疾病或癌症。其能来自相同的个体，或自另一正常个体或不具有患病或测试样本所获自的相同疾病的个体。在本发明的背景中，术语“参考水平”指单体/同源二聚体的CXCR4表达的“对照水平”，其用于评价患者含癌细胞样本中单体/同源二聚体的CXCR4表达的测试水平。

[0264] 例如，当在患者生物样本中的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的水平高于作为单体和/或同源二聚体的CXCR4参考水平时，所述细胞将视作具有作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的高水平表达、或过度表达。

[0265] 可以通过多种方法确定参考水平。表达水平可因此限定表达单体/同源二聚体的CXCR4细胞的数目。可选择地，表达水平可限定所述单体/同源二聚体的CXCR4的表达水平，不依赖于表达单体/同源二聚体的CXCR4的细胞数目。

[0266] 因此，可以通过单体/同源二聚体的CXCR4参考比例规定每个患者的参考水平，其中通过任何本文所述确定参考水平的方法可确定参考比例。

[0267] 例如，对照可以是采用各种形式的预定的值。其可以是单个的截止值，如中位数或平均值。所述“参考水平”可以是单独均等地适用于每个患者个体的单个数字，或者参考水平可以根据具体的患者亚群而不同。因此，例如对于相同癌症，年长的男性和较年轻的男性相比可能具有不同的参考水平，以及对于相同癌症，女性和男性相比可能具有不同的参考水平。或者，所述“参考水平”可以通过测量非致癌的癌细胞中作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的表达水平来确定，所述非致癌的癌细胞来自与待测瘤细胞的组织相同的组织。并且，“参考水平”可能是在患者瘤细胞中的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4相对于在同一患者非肿瘤细胞中作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平的特定比例。所述“参考水平”也可以是体外培养细胞的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平，其可经操作以模拟肿瘤细胞、或者其可以用其它任何方式操作，所述其它任何方式产生能精确地确定参考水平的表达水平。另一方面，基于比较组可建立“参考水平”，例如在不具有升高的单体/同源二聚体的CXCR4水平的组和具有升高的单体/同源二聚体的CXCR4水平的组中。比较组的另一个实例是具有特定疾病、病状或症状的组和没有疾病的组。可以安排预定值，例如将受测群体等（或不等）分至各组，如低风险组、中等风险组和高风险组。

[0268] 通过比较患有相同癌症的患者群体中作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平也可确定参考水平。例如，这可以通过直方图分析实现，其中整个患者群以图表呈现，其中第一个轴表示作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平，第二个轴表示其肿瘤细胞表达给定水平的作为单体和/或同源二聚体的CXCR4的群中患者数目。通过鉴定具有相同或相似作为单体和/或同源二聚体的CXCR4水平的群的亚群可确定两个或多个患者分组。然后，基于最能区分这些分组的水平可确定参考水平。参考水平还可以表示两个或更多个标志物的水平，其中之一是单体/同源二聚体的CXCR4。例如，通过各标志物水平值的比例可表示两个或更多标志物。

[0269] 同样，与已知患有和作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达相关病状的群体相比，表面健康的群体将具有不同的“正常”范围。因此，所选的预定值可考虑个体落入的类别。使用不超出本领域普通技术人员所用的常规实验可选择合适的范围和类别。通过“升高的”、“增加的”表示高于所选的对照。通常，对照将基于合适的年龄段内表面健康的正常个体。

[0270] 还应理解，根据本发明的对照可能是除了预定值之外的与实验材料平行测试的材料样本。实例包括同时从相同受试者获得的组织或细胞，例如，单个活检标本的部分、或来自受试者单一细胞样本的部分。

[0271] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于和作为单体和/或同源二聚体的CXCR4表达相关的致癌疾病的体内成像的药物组合物，所述组合物包含本发明的单克隆抗体、或其抗原结合片段或衍生物，所述抗体、或其衍生物的片段是标记的且能够体内结合作为单体和/或同源二聚体的CXCR4；和药学上可接受的载体。在另一方面，本发明提供对上述方法有用的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体。

[0272] 本发明范围内还包括用于进行诊断分析的包装材料，其包含具有说明书的预定量的试剂组合，例如试剂盒。所述试剂盒包含用于体外检测和定量单体/同源二聚体的CXCR4的抗体，如在ELISA或Western印迹中。本发明的抗体可以在试剂盒中提供用于体外检测和定量单体/同源二聚体的CXCR4，如在ELISA或Western印迹中。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括底物和酶所需的辅因子（如底物前体，其提供可检测的发色团或荧光团）。此外，可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液（如封闭缓冲液或裂解缓冲液）等等。这种试剂盒可包括贮器，其经划分以容纳一个或更多个如瓶、试管等的容器，这样的容器盛放本发明分开的组件。例如，一个容器可包含结合不溶或部分可溶载体的一抗。第二容器可包含以冻干形式或在溶液中的可溶、可检测-标记的二抗。贮器还可含有第三容器，其盛放以冻干形式或在溶液中的可检测标记的三抗。这种性质的试剂盒可用在本发明的夹心分析法中。标签或包装插页可提供组合物的描述以及体外预期或诊断用途的说明书。

[0273] 以含有赋形剂的干粉（通常为冻干粉）形式提供试剂，所述干粉经溶解将提供具有合适浓度的试剂溶液。

[0274] 在本发明的又一方面，以标记有可检测部分的形式提供本文详述的单克隆抗体、或其抗原结合片段或衍生物，使得其可包装在并使用在如试剂盒中以诊断或鉴定具有前述抗原的细胞。这样的标记的非限定性实例包括荧光团，例如异硫氰酸荧光素；发色团、放射性核素、生物素或酶。这样标记的抗体或结合片段可用于抗原的组织定位、ELISA、细胞分选、以及其它免疫技术，其用于检测或定量单体/同源二聚体的CXCR4和诸如携带此抗原的细胞。

[0275] 本发明还包括试剂盒，其中所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物被标记。

[0276] 还提供试剂盒，其用作从细胞中纯化或免疫沉淀单体/同源二聚体的CXCR4的阳性对照。为分离和纯化单体/同源二聚体的CXCR4，所述试剂盒可包含与珠偶联（如琼脂糖珠）的本文所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物。可提供试剂盒，其包含用于体外或离体检测和定量单体/同源二聚体的CXCR4的抗体，如在ELISA或Western印迹中。所述试剂盒包括容器以及容器上的或所附的标签或包装插页。容器容纳至少包含一种本发明的抗体、或其结合片段或衍生物的组合物。可包括附加的容器，其包含如稀释剂和缓冲液、对照抗体。标签或包装插页可提供组合物的描述以及体外预期或诊断用途的说明。

[0277] 更具体地，本发明涉及通过本领域技术人员已知的任何方法确定肿瘤的单体/同源二聚体的CXCR4状态的试剂盒。在优选实施方案中，正如将在实验性实施例中所描述的，本发明涉及用于通过IHC方法或FACS确定肿瘤的单体/同源二聚体的CXCR4状态的试剂盒。

[0278] 在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒至少包括如上述的抗单体/同源二聚体的CXCR4的抗体、或其抗原结合片段或衍生物，所述抗体优选被标记。

[0279] 在优选的实施方案中，所述试剂盒用于在受试者中体外检测表达单体/同源二聚体的CXCR4的肿瘤的存在和/或定位，其进一步包括用于检测所述抗CXCR4抗体与单体/同源二聚体的CXCR4之间结合程度的试剂。

[0280] 根据本发明的试剂盒可进一步包括用于定量所述抗体、或其抗原结合片段或衍生物与单体/同源二聚体的CXCR4之间的结合水平的试剂。

[0281] 在又一个实施方案中，根据本发明的试剂盒进一步包括用于为单体/同源二聚体的CXCR4表达水平评分的阳性和阴性对照样本。

[0282] 所述试剂盒可进一步包括特异性识别鼠抗体的多克隆抗体。有利地，所述多克隆抗体被标记。

[0283] 本发明的其它特征和优势在实施例和附图的随后描述中得以体现，附图的说明在下文表示。

附图说明

[0284] 图1显示了427aB1单抗在细胞裂解液中识别CXCR4单体和同源二聚体两者。

[0285] 图2A和2B显示427aB1单抗免疫沉淀CXCR4单体和同源二聚体两者。

[0286] 图3A、3B、3C、3D和3E显示通过FACS分析显示427aB1单抗识别在细胞膜上的CXCR4。

[0287] 图4A和4B通过FACS分析说明427aB1单抗甚至在抗CXCR4515H7治疗单抗存在下与在细胞膜上的CXCR4结合。

[0288] 图5显示427aB1单抗不调节CXCR4/CXCR2异源二聚体构象。

[0289] 图6显示427aB1单抗对于在Nod/Scid小鼠中的MDA-MB-231异种移植肿瘤生长模型没有效果。

[0290] 图7显示在RAMOS上a)使用m427aB1的IHC染色和b)使用mIgG1的IHC染色。

[0291] 图8显示KARPAS299异种移植肿瘤上a)使用427aB1的IHC染色和b)使用mIgG1的IHC染色。

具体实施方式

[0292] 实施例1：抗CXCR4427aB1单克隆抗体（Mab）的产生(F50067-006(5C)427aB1 cl1B,CNCM编号I-4018)

[0293] 为产生针对CXCR4的单克隆抗体，用重组NIH3T3-CXCR4细胞和/或对应于CXCR4细胞外N端和环的肽免疫接种Balb/c小鼠。在第一次免疫接种时，用完全弗氏佐剂中的抗原皮下（s.c.）免疫接种6-16周龄的小鼠一次，接着用不完全弗氏佐剂中的抗原s.c.免疫接种2至6次。通过眼眶后放血监测免疫应答。通过ELISA（如下述）筛选血清，并且使用具有较高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行融合。在处死并切除脾脏前两天，用抗原静脉内加强小鼠。

[0294] -ELISA

[0295] 为了选择产生抗CXCR4抗体的小鼠，通过ELISA测试来自免疫接种的小鼠的血清。简而言之，以5μg当量肽/mL用缀合至BSA的纯化的[1-41]N端肽包被微量滴定板，在4℃下以100μl/孔孵育过夜，然后用250μl/孔的PBS中的0.5%明胶封闭。将来自CXCR4免疫接种的小鼠的血浆稀释液加入至每孔中，并在37℃下孵育2小时。用PBS洗涤板，然后在
37℃下，用缀合至HRP的羊抗鼠IgG抗体（Jackson Laboratories）孵育1小时。在洗涤之后，用TMB底物使板显影，5分钟之后通过加入100μl/孔的1M H2SO4终止该反应。使用出现最高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行抗体生产。

[0296] -生产针对CXCR4的单抗的杂交瘤的产生

[0297] 用PEG将从出现最高滴度的抗CXCR4抗体的Balb/c小鼠中分离的小鼠脾细胞融5
合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O。将细胞以约1×10/孔涂布于微量滴定板，接着在包含超培养基+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+1x HAT的选择介质中孵育2周。然后，通过ELISA筛选各孔的抗CXCR4单克隆IgG抗体。然后通过限制稀释将分泌抗体的杂交瘤亚克隆至少两次，体外培养以生产用于进一步分析的抗体。

[0298] 实施例2：427aB1单抗在细胞裂解液中识别CXCR4单体和同源二聚体两者

[0299] 在PBS中洗涤两次NIH3T3-hCXCR4转染的细胞、MDA-MB-231（乳房）和U937(AML)癌细胞。使用下列缓冲液：20mM TrisHCl pH8.5,100mM(NH4)2SO4,10%甘油、1%CHAPSO和1%6
蛋白酶抑制剂混合物在4℃将100.10 细胞/ml裂解30分钟。通过在+4℃以10000g离
心20分钟收集细胞裂解物，并通过以427aB1单抗为一抗的western印迹法加以分析。图
1显示单抗427aB1识别在NIH3T3-CXCR4上的CXCR4单体和同源二聚体两者。癌细胞系
MDA-MB-231和U937似乎表达以同源二聚体为主的CXCR4。

[0300] 实施例3：427aB1单抗免疫沉淀CXCR4单体和同源二聚体两者

[0301] 使用pH8.5的含有100mM(NH4)2SO4的20mM Tris HCl洗涤NIH3T3-CXCR4细胞沉淀物，随后将其重悬在裂解缓冲液中(pH8.5的20mM TrisHCl，含有100mM(NH4)2SO4、10%甘油、1%CHAPSO和10μL/mL蛋白酶抑制剂的混合物)。使用Potter Elvehjem匀浆器破碎细胞。通过在+4℃以105000g离心1小时收集溶解的膜，随后将其与427aB1单抗偶联的琼脂糖4B珠在+4℃孵育过夜，将混合物倾倒入玻璃柱中，并用裂解缓冲液洗涤。由427aB1单抗捕获的蛋白被洗脱，并通过以抗427aB1单抗为一抗的western印迹法加以分析。合并、浓缩目的馏分并用于WB分析和制备型SDS-PAGE解析（resolution）（4-12%Bis-Tris凝胶）。经银染后，将目的条带从凝胶中切下，并将其提交至使用自动蛋白消化系统MassPREP工作站（Waters,Milford,MA，美国）的凝胶内消化。使用50μL的25mM NH4HCO（3 Sigma,Steinheim,德国）和50μL的乙腈（Carlo Erba Reactifs-SDS,Val de Reuil,法国）洗涤凝胶斑点两次。在25mM NH4HCO3中制备的50μL的10mM DTT在60℃中还原半胱氨酸残基1小时，在25mM NH4HCO3中制备的50μL的55mM碘乙酰胺（Sigma）室温下将还原的半胱氨酸残基进行烷基化20分钟。在凝胶斑点使用乙腈脱水后，通过在25mM NH4HCO3中添加10μL的12.5ng/μl的修饰猪胰蛋白酶（Promega,Madison,WI、美国）在凝胶中室温下过夜消化所述蛋白。使用含有5%甲酸（Riedel-de Seelze，丹麦）的35μL的60%乙腈提取产生的肽，随后
将过量乙腈移除，将所述肽送至nano-LC-MS/MS。将在nanoLC-MS/MS分析期间收集到的质TM
量（mass）数据进行加工，并将其转化成可以提交至MASCOT 搜索引擎的*.mgf文件。使用在MS和MS/MS模式下，以测量0.25Da的容差（tolerance）进行搜索。

[0302] 图2A显示使用427aB1单抗偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀后洗脱的浓缩馏分的western印迹分析。通过427aB1单抗识别在37-43、75和150kDa表观分子量处的三个条带。

[0303] 用427aB1单抗偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀后洗脱的浓缩馏分也通过SDS-PAGE进行解析并通过银染使其可视。从凝胶中切下37-43、75和150kDa处的条带（图2B），对其进行胰蛋白酶消化，并通过上述的LC-MS/MS对其进行分析。将收集到的峰列表提交至Mascot以用于肽序列数据库搜索。在所有条带中都鉴定出CXCR4：TM

[0304] 经由MASCOT 搜索引擎在37-43kDa条带（条带编号1）鉴定出6个CXCR4肽：在N端含有的31-38位肽EENANFNK；在细胞外环2含有的135-146位肽YLAIVHATNSQR和
135-148位肽YLAIVHATNSQRPR以及184-188位肽YICDR；在细胞外环3含有的272-282位肽QGCEFENTVHK；以及在C端含有的311-322位肽TSAQHALTSVSR。

[0305] 75-kDa条带（条带编号2）包含5个CXCR4肽：在CXCR4的N端含有的31-38位肽EENANFNK；在细胞内环2含有的135-146位肽YLAIVHATNSQR；在细胞内环2含有的135-148位肽YLAIVHATNSQRPR；在细胞外环3含有的272-282位肽QGCEFENTVHK；以及在C端含有的TM311-322位肽TSAQHALTSVSR。经由MASCOT 搜索引擎鉴定所述肽。
TM

[0306] 在150-kDa条带（条带编号3）中，经由MASCOT 搜索引擎鉴定出两个CXCR4肽。N端含有的31-38位肽EENANFNK和C端含有的311-322位肽TSAQHALTSVSR。

[0307] 这个研究获得的结果明确表明427aB1单抗免疫沉淀CXCR4。此外，427aB1单抗识别作为单体和同源二聚体的CXCR4。

[0308] 实施例4：通过FACS分析，427aB1单抗识别位于细胞膜的CXCR4

[0309] 在此实验中，通过FACS分析评估427aB1单抗对人CXCR4的特异性结合。

[0310] 使用427aB1单克隆抗体(0-10μg/mL)孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞、MDA-MB-231、Hela、HT-29和U937癌细胞系。然后，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤细胞。接着，将Alexa标记的二抗加入至所述细胞中，并允许在4℃下孵育20分钟。再次洗涤细胞两次。第二次洗涤后，进行FACS分析。

[0311] 这些结合研究的结果提供在图3中。其显示427aB1结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系（图3A），而不结合亲代NIH3T3细胞（结果未示）。这种单抗也能够识别人癌细胞系，例如HT-29结肠癌细胞（图3B）、MDA-MB-231乳癌细胞（图3C）、U937早幼粒细胞性癌细胞（图3D），以及Hela子宫颈癌细胞（图3E），其表明这些细胞系天然表达CXCR4单体和/或同源二聚体。

[0312] 实施例5：通过FACS分析，427aB1单抗甚至在抗CXCR4515H7治疗性单抗存在时结合在细胞膜上的CXCR4

[0313] 在此实验中，通过FACS分析检查抗CXCR4单抗427aB1和515H7对人CXCR4的结合竞争。

[0314] 用生物素化的515H7单抗（5μg/ml）（其识别NIH3T3-CXCR4细胞（图4A））以及或427aB1单抗或515H7单抗（0-1mg/mL）在4℃下首先孵育NIH3T3-hCXCR4转染的细胞1小时。然后，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤细胞。接着，将标记的链霉抗生素蛋白（streptavidin）加入至所述细胞中，并允许在再洗涤两次之前4℃下孵育20分钟。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。这些结合研究的结果提供在图4B中，并显示抗CXCR4单抗
427aB1甚至在515H7单抗存在时结合人CXCR4-NIH3T3。相比之下，如预料中的，生物素化的515H7单抗的存在抑制了未标记的515H7单抗结合CXCR4。

[0315] 实施例6：通过BRET分析，427aB1单抗不调节CXCR4/CXCR2异源二聚体构象

[0316] 此功能分析允许在CXCR2/CXCR4异源二聚体水平上，对SDF-1和/或427aB1单抗与CXCR4受体的结合评价诱导的构象变化。

[0317] 通过采用常规分子生物学技术，将每个研究的相互作用配偶体的表达载体构建成具有相应染料（海肾（Renilla reniformis）荧光素酶，Rluc和黄色荧光蛋白，YFP）的融合蛋白。在进行BRET实验前的两天，用编码相应BRET配偶体（CXCR4-Rluc+CXCR2-YFP）的表达载体瞬时转染HEK293细胞。第二天，将细胞分配至聚赖氨酸预包被的白色96MW板中的完全培养基（补充有10%FBS的DMEM）中。在37℃下，首先用5%CO2培养细胞，以使细胞粘附板。然后，用200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。在BRET试验之前，立即除去DMEM，并用PBS快速洗涤细胞。然后，在存在或不存在抗体下，在37℃下，将细胞在PBS中孵育15分钟，之后加入有或无SDF-1的5μM腔肠素（coelenterazine）H，最终体积50μl。在37℃下孵育5分钟后，在室温继续孵育20分钟，使用Mithras LB940多标记读数器（Berthold）（1s/波长/孔，在室温下重复15次）在485nm和530nm出开始光发射的采集。

[0318] 如前述（Angers等人，2000）进行BRET比例的计算：[（发射530nm）-（发射485nm）×Cf]/（发射485nm），其中对于在相同实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞，Cf=（发射530nm）/（发射485nm）。简化此等式显示出BRET比例对应于两种BRET配偶体存在时获得的比例530/485nm；当该分析中仅仅存在融合至Rluc的配偶体时，通过在相同实验条件下获得的比例530/485nm进行校正。为了易读起见，结果以基底信号的百分比表示。

[0319] CXCR4和CXCR2受体的空间接近性所导致的SDF1（300nM）降低约20%的BRET信号。这也许表明CXCR4/CXCR2异源二聚体的形成或先前存在的二聚体的构象变化（图5）。427aB1单抗不调节SDF-1诱导的CXCR2/CXCR4异源二聚体的构象变化，也不通过其自身的CXCR4/CXCR2空间接近性调节。这表明427aB1单抗对CXCR4/CXCR2异源二聚体构象无影响（图5）。

[0320] 实施例7：在Nod/Scid小鼠中的MDA-MB-231异种移植肿瘤生长模型中的427aB1单抗活性评价

[0321] 这个实验的目的是评估抗CXCR4单抗427aB1针对在Nod/Scid小鼠中的MDB-MB-231异种移植的抑制活性。

[0322] 来自ECACC的MDA-MB-231细胞通常在DMEM介质（Invitrogen Corporation,苏格兰、英国）、10%FCS（Sigma,St Louis MD、美国）中培养。在移植前48小时使细胞进行分裂以使其处于指数生长期。将千万计的MDA-MB-231细胞在PBS中移植至7周龄的Nod/Scid3 3 3
小鼠（Charles River，法国）。在移植后5天，测量肿瘤（34mm

[0323] 在治疗期间未观察到死亡。与PBS对照组相比，对于1mg/剂量的427aB1单抗在D40(p=0.485)没有观察到显著地肿瘤生长抑制。此外，在5周的治疗后单抗427aB1与PBS相比并未减小平均肿瘤体积（图6）。

[0324] 实施例8：427aB1单抗识别存在于细胞膜上的CXCR4（石蜡包埋的肿瘤IHC染色）[0325] 切片进行脱蜡处理、再水化，在98℃预热的EDTA pH8中在98℃放置5分钟以便热诱导表位修复，在温EDTA缓冲液中再在室温放置5分钟。然后将玻片在自来水下冲洗5分钟。在Tris缓冲盐-0.05%吐温20（TBS-T）（Dako S3006）中洗涤三次后，使用过氧化物酶阻断剂（Dako K4007）阻断内源性过氧化物酶活性持续5分钟。在使用抗CXCR-4小鼠单克隆抗体(5μg/ml,克隆427aB1,PierreFabre)或者作为同种型对照的小鼠IgG1/kappa(5μg/ml,X0931,Dako)在4℃孵育过夜之前，用TBS-T洗涤切片并在阻断剂（UltraV block-TA-125UB-LabVision）中孵育5分钟。用TBS-T洗涤切片并用SignalStain Boost IHC检测剂（HRP,M）在室温下孵育30分钟。二氨基联苯胺用于棕色反应产物的显色（Dako K3468）。将玻片浸入苏木精（Dako S3309）4分钟进行复染，在装到Faramount封固介质及盖玻片之前，在PBS中洗涤。在这种免疫组织化学程序中，棕色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，缺失棕色反应产物与阴性染色和未见细胞膜相关。

[0326] 427aB1单抗对各种肿瘤类型的细胞膜进行差别染色。图7和8说明在2个异种移植模型中进行染色，其中对于治疗性抗CXCR-4hz515H7抗体已经描述了抗肿瘤活性：RAMOS和KARPAS299。

[0327] 如图7和8所示，在KARPAS299（图8）中检测到的表达比RAMOS中的低（图7）。这个数据与通过流式细胞术进行的CXCR4表达的研究非常相关。实际上，与KARPAS299相比，RAMOS细胞表达约5倍多的CXCR4水平（抗体结合能力：对于RAMOS为200000，以及对于KARPAS299为40000）。在KARPAS299中膜染色较弱（图8），然而在RAMOS中膜染色显著较高（图7）。

[0328]

[0329] 仅供受理局使用

[0330]

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