一种溶瘤病毒及其应用
阅读：325发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种溶瘤病毒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 溶瘤病毒 及其应用，涉及 生物 技术领域。该溶瘤病毒的保藏号为CCTCC No.V201809。该溶瘤病毒具有抗 肿瘤 效应，可用于制备一种 抗肿瘤效果 卓越的抗肿瘤药物。，下面是一种溶瘤病毒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒的保藏号为CCTCC NO V201809。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒为新城疫病毒。
3.一种载体，其特征在于，所述载体装载有权利要求1或2所述的溶瘤病毒。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为免疫效应细胞。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述免疫效应细胞为CIK细胞。
6.一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将溶瘤病毒溶液与免疫效应细胞溶液接触，所述溶瘤病毒溶液中的溶瘤病毒为权利要求1或2所述的溶瘤病毒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶瘤病毒的感染复数为10～
100MOI，所述免疫效应细胞溶液的细胞密度为1ⅹ106～5ⅹ106细胞/mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞为CIK细胞。
9.如权利要求1或2所述的溶瘤病毒，或权利要求3～5任一项所述的载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，其包括有权利要求1～2任一项所述的溶瘤病毒或权利要求3～5任一项所述的载体。
一种溶瘤病毒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 溶瘤病毒(Oncolytic virus)是优先感染并杀死肿瘤细胞的一类 病毒。初期，部分肿瘤细胞被溶瘤病毒特异性感染和破坏。随后，溶 瘤病毒在肿瘤细胞进行复制和繁殖，释放出新的感染性病毒颗粒感染 和破坏其他肿瘤细胞。溶瘤病毒通过直接溶解肿瘤细胞
或者刺激宿主 产生抗肿瘤免疫反应来发挥溶瘤的功效。病毒具有抗肿瘤药物的潜力 在20
世纪初便被发现，但是，直到20世纪60年代才被正式的进行 深入的研究和开发。
或者刺激宿主 产生抗肿瘤免疫反应来发挥溶瘤的功效。病毒具有抗肿瘤药物的潜力 在20
世纪初便被发现，但是，直到20世纪60年代才被正式的进行 深入的研究和开发。
[0003] 目前已有多种病毒包括腺病毒，呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱 疹病毒、新城疫病毒和牛痘病毒等在临床上作为溶瘤剂进行检测，且 自然界中的仅少数病毒可以自然的发生溶瘤(如呼肠孤病毒、塞内卡 病毒以及新城疫病毒等)。由国家管理机构批准的第一个溶瘤病毒是 遗传修饰的ECHO-7肠道病毒RIGVIR，2004年在拉脱维亚批准用于 治疗皮肤黑色
素瘤。后来(分别在2015年和2016年)，格鲁吉亚(国 家)和亚美尼亚也批准了这一规定。
2005年，中国公司上海三维 (Sunway)生物技术有限公司注册了一种名为H101的基因修饰
溶瘤 腺病毒，并获得了国家食品药品监督管理局的监管部门批准，用于治 疗头颈部肿瘤。
2015年，USFDA和欧盟EMA批准T-VEC作为第一 个溶瘤疱疹病毒(一种改良的单纯疱疹病
毒)，用于治疗黑色素瘤， 也是目前最成功的一款溶瘤病毒。
素瘤。后来(分别在2015年和2016年)，格鲁吉亚(国 家)和亚美尼亚也批准了这一规定。
2005年，中国公司上海三维 (Sunway)生物技术有限公司注册了一种名为H101的基因修饰
溶瘤 腺病毒，并获得了国家食品药品监督管理局的监管部门批准，用于治 疗头颈部肿瘤。
2015年，USFDA和欧盟EMA批准T-VEC作为第一 个溶瘤疱疹病毒(一种改良的单纯疱疹病
毒)，用于治疗黑色素瘤， 也是目前最成功的一款溶瘤病毒。
[0004] 新城疫病毒属于禽副粘病毒科，是禽类的致命病毒，但对于人类 支造成轻微的流感样症状或结膜炎。新城疫病毒可通过病毒复制使细 胞毒性病毒蔓延到身体的每一个癌
细胞，但是病毒中和抗体的免疫系 统的生产可能会限制这种可能性。
细胞，但是病毒中和抗体的免疫系 统的生产可能会限制这种可能性。
发明内容
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种溶瘤病毒，其具有溶瘤能力，可 用于制备抗肿瘤药物。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种载体，其能够装载溶瘤病毒，精 准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增强抗肿瘤效果 的优点。
[0007] 本发明的第三目的在于提供一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细 胞的制备方法，能够制备出具有溶瘤效果的免疫效应细胞。
[0008] 本发明的第四目的在于提供上述载体或上述溶瘤病毒在制备抗 肿瘤药物中的应用，其能够制备出能够精确靶向肿瘤且抗肿瘤效果卓 越的抗肿瘤药物。
[0009] 本发明的第五目的在于提供一种抗肿瘤药物，其具有抗肿瘤效果 卓越的优点。
[0010] 本发明是这样实现的：
[0011] 本发明提供了一种溶瘤病毒，其保藏号为CCTCC NO V201809。
[0012] 本发明提供了一种载体，该载体装载有上述的溶瘤病毒。
[0014] 本发明提供了上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物中的 应用。
[0015] 本发明提供了一种抗肿瘤药物，其包括有上述的溶瘤病毒或上述 的载体。
[0016] 本发明具有以下有益效果：
[0017] 本发明实施例提供的溶瘤病毒，其保藏号为CCTCC No. V201809。该溶瘤病毒具有溶瘤能力，可用于制备抗肿瘤效果卓越的 抗肿瘤药物。
[0018] 本发明实施例提供的包含上述溶瘤病毒的载体，该载体能够转载 溶瘤病毒，精准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增 强抗肿瘤效果的优点。
[0019] 本发明实施例提供的装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方 法，其包括将上述溶瘤病毒与免疫效应细胞容易接触，该方法能够制 备出靶向性好，抗肿瘤效果卓越的免疫效应细胞。
[0020] 本发明实施例提供上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物 中的应用。该应用能够制备出抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中 所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发 明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通 技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。
[0023] 图1为本发明第二实施例提供的装载溶瘤病毒的免疫效应细胞 的共聚焦结果图；
[0024] 图2为本发明第三实施例提供的NDV/FMW感染肺癌细胞后的 细胞存活图；
[0025] 图3为本发明第三实施例提供的NDV/FMW感染甲状腺癌细胞 后的细胞存活图；
[0027] 图5为本发明第三实施例提供的装载NDV后CIK细胞中CD8+T cell以及CD3+CD56+NKT cell的变化结果图；
[0028] 图6为本发明第四实施例提供的裸鼠皮下瘤体积变化结果图；
[0029] 图7为本发明第五实施例提供的CIK、NDV/FMW以及 NDV/FMW+CIK的HE染色结果图；
[0030] 图8为本发明第六实施例提供的NDV在肿瘤细胞以及CIK细胞 中的复制能力结果图；
[0031] 图9为本发明第一对比例提供的流式细胞仪检测CIK细胞装载 NDV的效率结果图。
具体实施方式
[0032] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对 本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明 具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0033] 下面对本发明实施例的溶瘤病毒及其应用进行具体说明。
[0034] 一方面，本发明实施例提供一种溶瘤病毒，具体为新城疫病毒 NDV/FMW株，该病毒株已保藏于2018年2月6日中国典型培养物 保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC NO V201809。 该溶瘤病毒具有溶瘤能力，能够用于制备抗肿瘤药物中。该溶瘤病毒 的溶瘤能力可以通过向肿瘤细胞组织注射该溶瘤病毒溶液，肿瘤细胞 变小，说明该溶瘤病毒对肿瘤组织具有溶瘤能力。
[0035] 溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，可通过多种机 制发挥抗肿瘤作用。然而，机体的免疫监视作用使溶瘤病毒不能高效 到达肿瘤部位而不足以治疗肿瘤。
因此，本发明实施例提供一种载体， 其装载有上述溶瘤病毒。细胞载体作用溶瘤病毒的容器，可是溶瘤病 毒逃避免疫监视，两者联合，具有更好的抗肿瘤功效。
因此，本发明实施例提供一种载体， 其装载有上述溶瘤病毒。细胞载体作用溶瘤病毒的容器，可是溶瘤病 毒逃避免疫监视，两者联合，具有更好的抗肿瘤功效。
[0036] 该载体包括有免疫效应细胞、间充质干细胞、内皮系细胞以及肿 瘤细胞中的一种或多种。优选地，该免疫效应细胞可以包括有抗原特 异性T细胞、细胞因子诱导的杀伤细
胞、肿瘤相关的巨噬细胞、外周 血淋巴细胞以及树突状细胞。
胞、肿瘤相关的巨噬细胞、外周 血淋巴细胞以及树突状细胞。
[0037] 优选地，该免疫效应细胞为CIK细胞。CIK细胞，英文名称为 Cytokine induced killer，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种新型的 免疫活性细胞，增值能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。 CIK细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，能够精确地靶向肿瘤细胞，但 不会伤及正常细胞，杀瘤谱广，安全性好。装载有上述溶瘤病毒的 CIK细胞，其结合了CIK细胞的肿瘤靶向性以及溶瘤病毒的肿瘤杀 伤力，达到了更好的抗肿瘤效果。
[0039] 该制备方法包括将溶瘤病毒溶液与免疫效应细胞溶液接触，溶瘤 病毒溶液中的溶瘤病毒为上述本发明实施例提供的溶瘤病毒 NDV/FMW。
[0040] 进一步地，溶瘤病毒的感染复数为10～100MOI，免疫效应细胞 溶液的细胞密度为1ⅹ106～5ⅹ106细胞/mL。
[0041] 溶瘤病毒的感染复数可以为：10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、 56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、
88、90、92、94、96、98或100MOI。
88、90、92、94、96、98或100MOI。
[0042] 免疫效应细胞溶液的细胞密度可以为：1ⅹ106细胞/mL、1.5ⅹ106细胞/mL、2ⅹ106细胞/mL、2.5ⅹ106细胞/mL、3ⅹ106细胞/mL、3.5ⅹ106细胞/mL、4ⅹ106细胞/mL、4.5ⅹ106细胞/mL或5ⅹ106细胞/mL。
[0043] 当溶瘤病毒的感染复数为10～100MOI，免疫效应细胞溶液的细 胞密度为1ⅹ106～5ⅹ106细胞/mL时，溶瘤病毒能够最大量的被CIK细 胞运载。
[0044] 此外，本发明还提供上述溶瘤病毒或载体在制备抗肿瘤药物中的 应用。
[0045] 本发明实施例还提供一种抗肿瘤药物，其包括有上述溶瘤病毒或 上述免疫效应细胞。
[0046] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0047] 第一实施例
[0048] 本实施例提供的一种装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞(CIK细 胞)的制备方法。
[0049] CIK细胞的诱导及增值
[0050] 实验耗材
[0051] X-VIVO 15无血清培养基：1000mL/瓶，生产商为 Lonza,Walkersville,MD,USA；IL-2(重组人白细胞介素-2)：20万IU/ 支和100万IU/支，生产商为山东泉港药业有限公司；
IL-1α(重组人 白细胞介素-1α)：10μg/支，生产商为PEPROTECH；CD3抗体(抗 CD3单抗)：500μg/支，生产商为e-Bioscience；IFN-γ(重组人IFN- γ)：1.0mg/支，生产商为PEPROTECH。
IL-1α(重组人 白细胞介素-1α)：10μg/支，生产商为PEPROTECH；CD3抗体(抗 CD3单抗)：500μg/支，生产商为e-Bioscience；IFN-γ(重组人IFN- γ)：1.0mg/支，生产商为PEPROTECH。
[0052] 实验方法
[0054] 收集血常规检查外周血中白细胞≥3×106/mL，淋巴细胞计数≥6 ×105/mL的外周血50mL。取50mL离心管，将收集的外周血缓慢注 入离心管中，进行全血离心，20℃，2000r/min离心10min。待离心 结束后，吸取上层血浆于一支50mL离心管中，56℃，灭活30min备 用。
[0056] 收集两个管分离液中单个核细胞层(乳白色细胞环)至50mL离 心管中，加入生理盐水至50mL，离心(20℃，2000r/min，8min)。 然后弃上清，扣摇，加入生理盐水至50mL，离心(20℃，2000r/min 离心5min)，重复洗涤两次。弃上清，扣摇，向离心管中加入一定量 的细胞培养液，用吸管将细胞吹吸均匀移至细胞培养瓶中，培养液刷 洗一次离心管。
[0057] 培养瓶液体总量约50mL，加入2.5mL灭活血浆和γ-干扰素， γ-干扰素的终浓度1000IU/mL，混合均匀。显微镜观察细胞数量和 状态，置于饱和湿度，37℃，5％CO2培养箱中，进行培养24小时。
[0058] 第二天，从培养箱中取出培养24h的细胞，肉眼观察培养液颜色， 培养液透明度，镜下观察细胞数量及状态。加入一支混合因子(CD3 抗体终浓度：100ng/mL；IL-2终浓度：1000IU/mL；IL-1α终浓度： 1ng/mL)，置于饱和湿度，37℃，5％CO2培养箱中，继续培养。
[0059] 第五天，肉眼观察培养液颜色，镜下观察细胞数量和生长状态， 确认CIK细胞活性。确认后的细胞转至两个细胞培养瓶中，培养基 中含IL-2 1000U/mL,置于饱和湿度，37℃，5.0％CO2培养箱中，继 续培养。
[0060] 第十五天，获得可用于装载NDV的CIK细胞。
[0061] CIK细胞的鉴定
[0062] 培养瓶中CIK细胞为无色半透明细胞悬浊液。采用自动细胞计 数仪台盼蓝染色法，细胞存活率不低于90％。使用流式细胞仪检测， CD3+CD56+与CD3-CD56+之和大于等于
20％。采用CCK-8试剂盒， 当效靶比为20:1时，应保证CIK细胞对白血病细胞株K562杀伤率 大于50％。
20％。采用CCK-8试剂盒， 当效靶比为20:1时，应保证CIK细胞对白血病细胞株K562杀伤率 大于50％。
[0063] 将分离得到的CIK细胞体外培养14天，用PBS清洗三次，然后 用X-VIVO.15无血清培养基重悬调整细胞密度为1×106～1× 107/mL，细胞存活率不低于90％。
[0064] 调整CIK细胞溶液浓度至5ⅹ106细胞/mL，随后取含有上述溶瘤 病毒(FMW)的溶瘤病毒溶液，将溶瘤病毒溶液以10MOI的感染复 数与CIK细胞溶液混合得到混合溶液，将混合溶液在37℃下孵育4 小时，PBS洗去未结合的病毒，X-VIVO.15无血清培养基重悬后， 得到装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞。
[0065] 第二实施例
[0066] 验证第一实施的例制备方法制得的免疫效应细胞装载有溶瘤病 毒。
[0067] 实验方法
[0068] 采用激光共聚焦显微镜观察第一实施例提供的装载溶瘤病毒的 免疫效应细胞CIK细胞。具体地，在六孔板中放入细胞爬片，接种 CIK细胞悬液(2mL/孔)，放入培养箱预培养24小时，10MOI溶瘤 病毒(NDV/FMW)在37℃下感染CIK细胞4小时。
[0069] 取出爬片，PBS清洗2次，每次5分钟；4％多聚甲醛固定15分 钟，PBS清洗2次，每次5分钟；0.03％Triton 100透化10分钟， PBS清洗2次，每次5分钟；HN(NDV病毒蛋白)抗体4℃孵育过 夜，PBS清洗2次，每次5分钟；羊抗兔红色荧光二抗室温孵育30 分钟，PBS清洗2次，每次5分钟；DAPI染色10分钟，PBS清洗2 次，每次5分钟；用含猝灭剂的封片剂封片，共聚焦观察HN蛋白分 布。
[0070] 实验结果
[0071] 共聚焦结果如附图1所示，观察附图1可知，NDV病毒(溶瘤 病毒)蛋白HN分布于细胞膜表面，结果显示NDV成功装载到CIK 细胞表面。
[0072] 第三实施例
[0073] 验证装载溶瘤病毒后对CIK细胞的影响。
[0074] 装载NDV对肿瘤细胞以及对CIK细胞的细胞存活影响
[0075] 实验方法
[0076] 采用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit 8)检测细胞活力。具体地， 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，放入培养箱预培养24小时。 (此处的细胞悬液为以下几种细胞：肺癌细胞(A549和H460)，甲状 腺癌细胞(THJ-16T和THJ-29T)，人胚肺成纤维细胞(MRC-5)， CIK细胞)。不同MOI(0.001，0.01，0.1，1)NDV/FMW感染肺癌 细胞(A549和H460)、甲状腺癌细胞(THJ-16T和THJ-29T)、人胚 肺成纤维细胞(MRC-5)、CIK细胞24，48和72小时。提前1小时 向每孔加入10uL的CCK8溶液，继续培养1小时。用酶标仪测定 450nM处吸光度。其中，MOI
(muhiplieity of infection，感染复数， 及病毒颗粒数/细胞数的比值)。实验结果如附图
2～4所示。
(muhiplieity of infection，感染复数， 及病毒颗粒数/细胞数的比值)。实验结果如附图
2～4所示。
[0077] 实验结果
[0079] 装载NDV对CIK细胞中的CD8+T以及NKT细胞的影响
[0080] 实验方法
[0081] 在6cm平皿中接种CIK细胞悬液(4mL/皿)，放入培养箱预培 养24小时。10MOI NDV/FMW在37℃下感染CIK细胞4小时。分 别收集感染和未感染NDV的CIK细胞，离心(2000转每分钟，五 分钟)去上清。加入CD8抗体，或者加入CD3和CD56抗体。流式 分选CD8+或CD3+和CD56+的CIK细胞，计算在装载NDV前后CIK 细胞中的比值。结果如附图5所示。
[0082] 实验结果
[0083] 根据附图5可知，NDV装载前后，CD8+T细胞以及NKT细胞 数量没有变化，说明装载NDV后不影响CIK细胞活性。
[0084] 第四实施例
[0085] 验证第一实施例的制备方法制得的装载NDV后的CIK细胞的溶 瘤能力。
[0086] 实验方法
[0087] 取6周龄裸鼠40只，皮下注射H460细胞(1×107/只)。待裸鼠 皮下肿瘤达到200cm2(约14天)，将40只荷瘤裸鼠随机分为4组， 每组10只。分别为A：PBS空白对照组；B：CIK治疗组；C：NDV/FMW 治疗组；D：NDV/FMW转载CIK(NDV/FMW-CIK)治疗组。瘤内 注射，每周2次，治疗5周。每5天测量裸鼠皮下瘤体积，共记录 40天，绘制折线图，如附图6所示。
[0088] 实验结果
[0089] 根据附图6可知，装载NDV/FMW的CIK(NDV/FMW-CIK) 治疗与CIK治疗组以及NDV/FMW治疗组比较，CIK (NDV/FMW-CIK)抑制肿瘤生长能力最强。
[0090] 第五实施例
[0091] 本实施例提供免疫组化方法检测第一实施例的制备方法制备的 装载有NDV的CIK细胞对老鼠肿瘤的效果。
[0092] 实验方法
[0093] 取6周龄裸鼠20只，皮下注射H460细胞(1×107/只)。待裸鼠 皮下肿瘤达到200cm2，将20只荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只。 分别为A：PBS空白对照组；B：CIK治疗组；C：NDV/FMW治疗 组；D：NDV/FMW转载CIK(NDV/FMW-CIK)治疗组。瘤内注射， 每周2次，治疗3周。3周后将荷瘤裸鼠麻醉后安乐死，取肿瘤组织 制作病理切片。采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin，HE)， HE染色步骤如下：
[0094] 石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片4小时脱蜡，PBS冲洗3次， 每次5分钟。按照以下流程处理切片：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ) 5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙 醇1min→蒸馏水清洗5min。滴加苏木素染色5min，流水冲洗。滴加 盐酸乙醇分化30s，蒸馏水浸泡15min，滴加伊红液染色2min，常规 脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％ 乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳
酸(3：1)1min →二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封片。
酸(3：1)1min →二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封片。
[0095] 免疫组化检测CD3阳性率(指示CIK细胞)
[0096] 免疫组化步骤：
[0097] 石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片4小时脱蜡，PBS冲洗3次， 每次5分钟。取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液加热至沸腾，将脱蜡水化后 的切片放入已沸腾的缓冲液中，微波处理10分钟，流水自然泠却， PBS冲洗3次，每次5分钟。在切片滴加3％H2O2，室温孵育10分 钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。吸干PBS，每滴加CD3抗体(1： 200)，室温下孵育3小时，PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加辣根过 氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3次， 每次5分钟。吸干PBS液，滴加新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)， 显微镜下观察5分钟。然后苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗， 蓝化，切片经95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→
100％乙醇 (I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二 甲苯(I)1min→
二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封片。
100％乙醇 (I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二 甲苯(I)1min→
二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封片。
[0098] 实验结果
[0099] HE染色结果如附图7所示，根据图7可知CIK、NDV/FMW以 及NDV/FMW+CIK出现肿瘤细胞坏死现象。CD3抗体(作为CIK细 胞指示标记)染色显示，在CIK和NDV/FMW+CIK治疗组小鼠切片 中可检测到CD3表达，且NDV/FMW中CD3的数量大大多于CIK 中CD3的数量，说明NDV/FMW和CIK的融合能够有效增加免疫原 力，有效增强细胞的抗肿瘤能力。
[0100] 第六实施例
[0101] 验证NDV在肿瘤细胞以及CIK细胞中的复制能力。
[0102] 实验方法
[0103] 在6孔板中接种细胞悬液(2mL/孔)，放入培养箱预培养24小 时，(此处的细胞悬液为以下几种细胞，细胞个数均为6000/孔，肺癌 细胞(A549和H460)，甲状腺癌细胞(THJ-16T和THJ-29T)，CIK 细胞。)0.01MOI NDV/FMW感染肺癌细胞(A549和H460)、甲状 腺癌细胞
(THJ-16T和THJ-29T)、人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、 CIK细胞24，48和72小时。收集细胞和细胞上清冻融3次，离心收 集上清(待测病毒液)。在96孔板中接种DF1细胞(NDV的宿主细胞， 用于测量病毒滴度)悬液(100uL/孔)，放入培养箱预培养24小时。 将待测病毒液10倍比稀
释(10-1-10-11)，分别加入96孔板每列，每 个梯度病毒8个复孔，继续培养(5％CO2，37℃)；5～7天后观察病 变，计算病毒滴度，滴度用Reed-Muench两氏法精确算出，实验结 果如附图
8所示。
(THJ-16T和THJ-29T)、人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、 CIK细胞24，48和72小时。收集细胞和细胞上清冻融3次，离心收 集上清(待测病毒液)。在96孔板中接种DF1细胞(NDV的宿主细胞， 用于测量病毒滴度)悬液(100uL/孔)，放入培养箱预培养24小时。 将待测病毒液10倍比稀
释(10-1-10-11)，分别加入96孔板每列，每 个梯度病毒8个复孔，继续培养(5％CO2，37℃)；5～7天后观察病 变，计算病毒滴度，滴度用Reed-Muench两氏法精确算出，实验结 果如附图
8所示。
[0104] 实验结果
[0105] 其中，对于CIK细胞，当待测病毒液的稀释度为10-8时出现75％ 阳性，当稀释为10-9时出现20％阳性，距离比例＝(高于50％病变 率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百 分数)，即距离比例＝(75％-50％)/(75％-25％)＝0.5。对于
100μL 的稀释液，lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病 变率的稀释度
的对数，即lgTCID50＝0.5×(-1)+(-8)＝-7.5/100uL， TCID50＝108.5/100μL＝109.5/mL
≈3.16×109/mL，将TCID50/mL转换 为PFU/mL(此为病毒颗粒的单位)：病毒滴度＝3.16×
109TCID50/mL ×0.7＝2.2×109PFU/mL。
100μL 的稀释液，lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病 变率的稀释度
的对数，即lgTCID50＝0.5×(-1)+(-8)＝-7.5/100uL， TCID50＝108.5/100μL＝109.5/mL
≈3.16×109/mL，将TCID50/mL转换 为PFU/mL(此为病毒颗粒的单位)：病毒滴度＝3.16×
109TCID50/mL ×0.7＝2.2×109PFU/mL。
[0106] 根据附图8可知，NDV在肺癌细胞以及甲状腺癌细胞中复制， 且呈时间依赖性。NDV在CIK细胞中同样可以复制，但是复制能力 比在肿瘤细胞中的复制能力弱。说明，NDV可以在CIK中复制、存 活，但是不会大规模的杀伤CIK细胞。
[0107] 第一对比例
[0108] 验证第一实施例提供的制备方法中NDV的感染复数。
[0109] 实验方法
[0110] 收集第一实施例提供的制备方法制备好的CIK细胞(活性达到 90％以上)，2000r/min离心5min，PBS重复清洗细胞2次。无血清 培养基重悬CIK细胞，并调整其细胞密度，调整为1×106、5×106以 及1×107各三组。取感染复数为1MOI、10MOI以及100MOI的NDV 分别与
三组不同细胞密度的CIK细胞在37℃下孵育4小时，PBS洗 去未结合的病毒，无血清培养基
重悬细胞，得到装载了NDV的CIK 细胞。抗NDV HN蛋白抗体室温孵育1小时。FITC山羊抗兔
IgG 二抗孵育30min，然后通过流式细胞仪检测NDV装载CIK细胞的效 率，检测结果如附图9所示。
三组不同细胞密度的CIK细胞在37℃下孵育4小时，PBS洗 去未结合的病毒，无血清培养基
重悬细胞，得到装载了NDV的CIK 细胞。抗NDV HN蛋白抗体室温孵育1小时。FITC山羊抗兔
IgG 二抗孵育30min，然后通过流式细胞仪检测NDV装载CIK细胞的效 率，检测结果如附图9所示。
[0111] 根据附图9可知，5×106CIK细胞+10MOI NDV(88.5％)和5 ×106CIK细胞+100MOI NDV(89.6％)两组均接近90％，但5×106 CIK细胞+10MOI NDV组合比5×106CIK细胞+100MOI
NDV组合 消耗更少的NDV，因此，选择5×106CIK细胞+10MOI NDV组合 为最优方案。
NDV组合 消耗更少的NDV，因此，选择5×106CIK细胞+10MOI NDV组合 为最优方案。
[0112] 综上所述，本发明实施例提供的溶瘤病毒，其保藏号为CCTCC No.V201809。该溶瘤病毒具有溶瘤能力，可用于制备抗肿瘤效果卓 越的抗肿瘤药物。
[0113] 本发明实施例提供的包含上述溶瘤病毒的载体，该载体能够转载 溶瘤病毒，精准靶向肿瘤细胞，具有促进病毒特异性免疫反应以及增 强抗肿瘤效果的优点。
[0114] 本发明实施例提供的装载有溶瘤病毒的免疫效应细胞的制备方 法，其包括将上述溶瘤病毒与免疫效应细胞容易接触，该方法能够制 备出靶向性好，抗肿瘤效果卓越的免疫效应细胞。
[0115] 本发明实施例提供上述溶瘤病毒或上述载体在制备抗肿瘤药物 中的应用。该应用能够制备出抗肿瘤效果卓越的抗肿瘤药物。
[0116] 本发明实施例提供的一种抗肿瘤药物，其包括有上述溶瘤病毒或 上述载体，该药物具有能够精确靶向肿瘤且抗肿瘤效果卓越的的优 点。
[0117] 此外，本发明还提供上述载体或溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的 应用以及包括上述溶瘤病毒或包括上述载体的抗肿瘤药物，该抗肿瘤 药物具有抗肿瘤效果卓越的优点。
[0118] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
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