一种用于桑黄栽培的种子培养基
阅读：1025发布：2021-02-20
专利汇可以提供一种用于桑黄栽培的种子培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于桑黄栽培的 种子 培养基，所述种子培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣1～40%、氮源0.05～0.5%、余量为 水 ；其中，所述氮源为无机氮源或有机氮源，所述无机氮源为铵盐；有机氮源为玉米浆、 酵母 粉、蛋白胨或麸皮中的一种或二种以上的任意组合。本发明中药黄残渣通过添加适当营养成分可以很好的应用于栽培桑黄，可实现中药残渣的资源化利用；栽培桑黄子实体 抗 肿瘤 效果 明显，具有很大的经济价值，对药用 真菌 桑黄的保护和开发利用有良好的促进作用。，下面是一种用于桑黄栽培的种子培养基专利的具体信息内容。
一种用于桑黄栽培的种子培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及一种种子培养基，尤其涉及一种将黄芪残渣用于桑黄栽培的种子培养基。
背景技术
[0002] 随着人们对保健意识的逐渐增强，中医作为传统医疗受到越来越多患者的支持和肯定，人们对中草药的需求量越来越大，许多药企开发出了各种各样中药产品，如中药用品、中药饮片以及中药浴剂等。然而在大批中药产品的出现，大量的中药残渣也随之出现。中药残渣成为中药企业中最严重的污染源之一，大多数的企业因中药残渣数量大、堆积体积大、味道浓烈等原因难以形成合理的资源化利用，直接将其作为废物排放，给周边环境带来严重的污染。随着国家对环境治理力度的加大，中药废渣直接排放必将得到治理，如何进行中药废渣的处理和再利用，变废为宝，是一个新发展方向。
[0003] 中药残渣中含有丰富的粗纤维、粗脂肪、淀粉、粗多糖、粗蛋白质等有机物质以及微量元素等成分，甚至有些中药残渣还含有部分该中药的活性成分，这些丰富的成分为利用中药类培养药用真菌奠定了物质基础。
[0004] 药用真菌由于富含多糖类、多肽类以及其他丰富的生物活性成分，具有抗肿瘤、降血脂、调节机体免疫、保护心脑血管等多种药用价值，而倍受欢迎。桑黄是一种非常重要的要用真菌。桑黄在中国，桑黄的使用从汉朝起至今已经有2000多年的历史了，中国最早的本草学著作《神农本草经》就已经有了“桑寄生”的药物功效记载。《本草纲目》记载桑黄能“利五脏，宣肠胃气，排毒气”；现代研究证实桑黄多糖能够缓解疼痛、食欲不振、体重减轻及疲劳倦怠等癌症特有的症状，提高生活品质。现代随着桑黄在抗癌症和保健品方面的开发与应用，导致桑黄野生资源的极度匮乏，需要通过人工栽培满足临床和保健品等开发的需要。当前桑黄真菌的人工栽培原料主要以椴木为主，以桑树椴木栽培桑黄品质为佳，市场接受程度也较高，但毕竟桑树资源有限，而且种植生长年限长，这导致桑黄的产量低或品质不佳，市场优质资源紧缺，变相推高了市场桑黄的价格，也给增高了产品开发和临床用药的成本，给社会用药带来压力，如何寻找与桑树一样的优质的基质来替代桑树，作为桑黄的栽培基质迫在眉睫。
发明内容
[0005] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种以中药黄芪残渣为原料的用于桑黄栽培的种子培养基。
[0006] 一种用于桑黄栽培的种子培养基，所述种子培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣1～40%、氮源0.05～0.5%、余量为水；其中，所述氮源为无机氮源或有机氮源，所述无机氮源为铵盐；有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨或麸皮中的一种或二种以上的任意组合。
[0007] 优选地，所述种子培养基为固体培养基，所述固体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣5～20%、氯化铵0.05～0.5%、琼脂1～5%、余量为水。氯化铵作为固体培养基中的氮源。
[0008] 优选地，所述种子培养基为液体培养基，所述液体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣1～5%、氯化铵0.05～0.2%、葡萄糖0.1～3.0%、余量为水。氯化铵作为液体培养基中的氮源，葡萄糖作为液体培养基中的碳源。
[0009] 优选地，所述种子培养基为袋料培养基，所述袋料培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣30～40%、氯化铵0.05～0.15%、余量为水。氯化铵作为袋料培养基中的氮源。
[0010] 优选地，所述固体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残15%、氯化铵0.1%、琼脂2%、余量为水。
[0011] 优选地，所述液体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣3%、氯化铵0.05%、葡萄糖2%、余量为水。
[0012] 优选地，所述袋料培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣33.3%、氯化铵0.1%、余量为水。
[0013] 优选地，所述种子培养基的栽培温度为20～30℃。
[0014] 优选地，所述液体培养基的接种量为10%。
[0015] 优选地，所述袋料培养基的接种量为2%。
[0016] 本发明中药黄残渣通过添加适当营养成分可以很好的应用于栽培桑黄，可实现中药残渣的资源化利用；栽培桑黄子实体抗肿瘤效果明显，具有很大的经济价值，对药用真菌桑黄的保护和开发利用有良好的促进作用。
具体实施方式
[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0018] 中药黄芪残渣：由浙江中医药大学中药饮片有限公司提供；桑黄菌株：由浙江中医药大学生物与制药工程实验中心提供；人胃癌Mkn45细胞：由浙江中医药大学学校生物工程学院细胞工程实验室提供。
[0019] 实施例1
[0020] 在自然pH条件下，一种用于桑黄栽培的种子培养基，所述种子培养基为固体培养基，所述固体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣5～20%、氯化铵0.05～0.5%、琼脂2%、余量为水。
[0021] 对黄芪残渣和水按比例进行培养，黄芪残渣重量百分比含量分别为5%、10%、15%及20%，氮源（氯化铵）分别为0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。将桑黄菌株在不同固体培养基上进行点接种，以桑黄菌落直径大小分析培养效果，其结果如表1、表2所示。以黄芪残渣制作栽培桑黄用的固体培养基，分析最适黄芪残渣固体培养基的配方，为进一步改造残渣袋料培养基提供依据。因为黄芪残渣富含适合桑黄生长所需碳元素，可以不考虑固体培养基中碳源问题。
[0022] 表1不同黄芪残渣含量的菌落直径
[0023]黄芪残渣含量（%） 5 10 15 20
菌落直径（cm） 2.0 3.7 4.0 3.8
菌落直径（cm） 2.0 3.7 4.0 3.8
[0024] 表2不同氯化铵含量的菌落直径
[0025]氯化铵含量（%）0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5
菌落直径（cm） 2.8 3.8 4.5 3.8 3.0 2.5 2.0 1.8
菌落直径（cm） 2.8 3.8 4.5 3.8 3.0 2.5 2.0 1.8
[0026] 实验结果显示，在自然pH条件下，经过五天培养后，黄芪残渣含量在10%、15%、20%时，桑黄生长良好，15%的条件下桑黄菌落直径最大。经过四天培养后，氮源（氯化铵）含量为0.1%时，桑黄菌落直径最大，而随氮源含量的增加或减少，其菌落直径逐渐变小。因此在自然pH条件下，黄芪残渣重量百分比含量15%，氮源（氯化铵）重量百分比含量0.1%、琼脂2%、余量为水，该条件为桑黄的最佳生长条件。
[0027] 另外，选取温度条件分别为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃，以点接种的方式在固体培养基上进行培养，以菌落直径大小为指标分析桑黄生长的最适温度，其结果如表3所示。
[0028] 表3不同温度的菌落直径
[0029]温度（℃） 25 26 27 28 29 30
菌落直径（cm） 4.5 4.8 5.1 6.0 5.1 4.9
菌落直径（cm） 4.5 4.8 5.1 6.0 5.1 4.9
[0030] 实验结果显示桑黄在经过八天的培养后，菌落直径已经出现了明显的差异，温度在25～28℃之间，随着温度的升高，菌落直径越来越大，在28℃的时候菌落直径是最大的，而29℃和30℃的时候菌丝圈却开始变小。
[0031] 实施例2
[0032] 一种用于桑黄栽培的种子培养基，所述种子培养基为液体培养基，所述液体培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣1～5%、氯化铵0.05～0.2%、葡萄糖0.1～3.0%、余量为水。
[0033] 黄芪残渣重量百分比含量选取1%、2%、3%、4%、5%，碳源（葡萄糖）重量百分比含量为0、1%、2%、3%，氮源（氯化铵）重量百分比含量为0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，桑黄菌株按
10%的接种量接种于液体培养基，25℃，160r/min条件下发酵培养，桑黄的生长状况如表4所示。
10%的接种量接种于液体培养基，25℃，160r/min条件下发酵培养，桑黄的生长状况如表4所示。
[0034] 表4桑黄的生长状况
[0035]黄芪残渣 生长状况 标准化 葡萄糖 生长状况 标准化 氯化铵 生长状况 标准化
1% + 1 0 + 1 0 ++ 2
2% ++ 2 1% ++ 2 0.05% +++ 3
3% +++ 3 2% +++ 3 0.10% ++ 2
4% ++ 2 3% +++ 3 0.15% + 1
5% ++ 2
1% + 1 0 + 1 0 ++ 2
2% ++ 2 1% ++ 2 0.05% +++ 3
3% +++ 3 2% +++ 3 0.10% ++ 2
4% ++ 2 3% +++ 3 0.15% + 1
5% ++ 2
[0036] 注：+表示桑黄菌丝生长状况，+越多桑黄长势越好
[0037] 利用中药黄芪残渣制作成栽培桑黄用的液体培养基，从残渣与水分的比例、碳源、氮源三个方面探讨黄芪残渣培养桑黄的最适液体培养基。实验结果表明，在液体培养基中加入3%的黄芪残渣，桑黄的生长状况最好。在液体培养基中添加碳源和适量的氮源，有利于桑黄在液体环境中生长。碳源在2%和3%时，生长状况没有明显差异，当氮源达到0.05%时，生长状况最好，而氮源过低不利桑黄的生长，过高将抑制桑黄的生长，而与之前固体培养基中氮源相比，液体培养基的最适桑黄生长的氮源含量明显低于固体培养基中添加的氮源含量。因此在自然pH条件下，黄芪残渣重量百分比含量3%，葡萄糖重量百分比含量2%，氮源（氯化铵）重量百分比含量0.05%，余量为水，上述条件为桑黄在液体培养基中的最佳生长条件。
[0038] 实施例3
[0039] 一种用于桑黄栽培的种子培养基，所述种子培养基为袋料培养基，所述袋料培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣30～40%、氯化铵0.05～0.15%、余量为水。
[0040] 黄芪残渣与水的重量比为1：1.8（黄芪残渣35.66%、水64.19%）、1：2.0（黄芪残渣33.3%、水66.6%）、1：2.2（黄芪残渣31.23%、水68.72%），氮源（氯化铵）重量百分比含量为0、0.05%、0.1%、0.15%，桑黄菌株按2%的接种量接种于袋料培养基，从残渣与水的比例及氮源含量两个因素分析袋料培养基配方，其生长状况如表5所示。
[0041] 表5 桑黄生长状况
[0042]黄芪残渣：水（重量比） 1：1.8 1：2.0 1：2.2
生长状况 + ++ ++
标准化 1 2 2
氮源含量 0 0.05% 0.10% 0.15%
生长状况 + ++ +++ ++
标准化 1 2 3 2
生长状况 + ++ ++
标准化 1 2 2
氮源含量 0 0.05% 0.10% 0.15%
生长状况 + ++ +++ ++
标准化 1 2 3 2
[0043] 注：+表示桑黄菌丝生长状况，+越多，桑黄长势越好。
[0044] 实验表明，黄芪残渣与水的重量比在1：2.0和1：2.2时，生长状况没有明显差异。在氮源（氯化铵）中经过二十五天的栽培观察，氮源（氯化铵）重量百分比含量为0.1%时，桑黄的生长状况最好。
[0045] 因此，袋料培养基包括下述重量百分比的组分：黄芪残渣33.3%、氯化铵0.1%、余量为水，即黄芪残渣栽为250g，水500g，氯化铵为0.10%时，有利于桑黄袋料的栽培。
[0046] 桑黄菌株按2%的接种量接种于袋料培养基，将接菌后的残渣菌袋置于室内温度（目的在于考察自然温度下，袋料培养基中桑黄的生长状况）、26℃、28℃、30℃这四个温度下进行栽培，分析袋料栽培的最适温度，其结果如表6所示。
[0047] 表6 不同温度的生长状况
[0048]温度（℃） 室内温度 26 28 30
生长状况 + ++ +++ ++
标准化 1 2 3 2
生长状况 + ++ +++ ++
标准化 1 2 3 2
[0049] 实验现象表明，温度在28℃的时候，袋料栽培桑黄生长状况最好，在经过两个月时间的栽培后成功栽培出桑黄子实体，并且出现木质部，因此桑黄袋料栽培的最适温度为28℃。
[0050] 实施例4
[0051] 1. 桑黄活性成分提取与分析
[0052] 多糖是真菌的一个重要活性部分，对桑黄多糖的活性进行分析，比较液体培养基栽培桑黄、袋料培养基栽培桑黄和野生桑黄间的活性差异性。
[0053] 多糖的提取
[0054] 液体培养基栽培桑黄胞外粗多糖提取：将桑黄发酵液用纱布进行过滤、离心后，收集滤液，然后用95%乙醇进行醇提，得到桑黄粗多糖，保存于4℃备用。
[0055] 袋料培养基栽培与野生桑黄子实体多糖提取：采集袋料培养基栽培桑黄子实体，烘干后和购买的野生桑黄子实体分别过100目筛粉碎，按料液比1：15分别加入水中，分别利用水提醇沉法提取桑黄粗多糖，反复水提三次，醇提三次，收集保存于4℃备用。
[0056] 通过对桑黄发酵液中桑黄胞外粗多糖，袋料栽培桑黄子实体多糖及野生桑黄子实体多糖的提取，最终得到1.32g的桑黄胞外粗多糖浸膏，2.848g的栽培桑黄粗多糖浸膏和3.264g野生桑黄粗多糖浸膏。
[0057] 多糖含量分析
[0059] 用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定多糖含量，测得葡萄糖标液的吸光度以及样品的吸光度，如表7、表8所示。
[0060] 表7葡萄糖的吸光度
[0061]标准液（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度（mg/ml） 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度 0 0.167 0.333 0.514 0.689 0.872
浓度（mg/ml） 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度 0 0.167 0.333 0.514 0.689 0.872
[0062] 表8 桑黄粗多糖吸光度及含量
[0063]
[0064] 通过标准曲线回归方程，可以计算得到：桑黄胞外粗多糖浸膏中粗多糖含量为37%，袋料栽培桑黄提取浸膏中粗多糖含量为43.5%，野生桑黄提取浸膏中粗多糖含量为
51%。
51%。
[0065] 2. 多糖抗肿瘤活性比较
[0066] 实验室保存的人体胃癌细胞MKN45复苏，当MKN45细胞在培养瓶中贴壁率达到70%～80%时，将细胞转接入96孔培养板中，每孔100μl，再置于37℃、5%CO2恒温培养箱培养。24h培养后，以0、50、100、150、200、250、300、600、900μg/ml为浓度梯度给药，补充培养基，使每孔体积达200μl，并在37℃、5%CO2恒温培养箱培养12、24、36、48h。到达指定时间后，往96孔板加20μl的MTT（5mg/ml），并于37℃、5%CO2下孵育4h。然后小心吸取上清液，并在每孔中添加150μl的二甲基亚砜（DMSO），并用酶标仪于570nm下读取OD值。
桑黄胞外多糖在给药12h、24h、36h、48 h的抗肿瘤OD值如表9～12所示。
桑黄胞外多糖在给药12h、24h、36h、48 h的抗肿瘤OD值如表9～12所示。
[0067] 表9 给药12h后的OD值
[0068]
[0069] 表10给药24h后的OD值
[0070]
[0071] 表11 给药36h后的OD值
[0072]
[0073] 表12给药48h后的OD值
[0074]
[0075] 其中，标准偏差：数据值偏离算术平均值的程度；
[0076] 比率1：存活率，比率1= 各组平均值/空白组平均值；
[0077] 比率2：存活细胞的变异系数，比率2= 标准偏差/空白组平均数。
[0078] 袋料栽培桑黄粗多糖在给药12h、24h、36h、48h的抗肿瘤OD值如表13～16所示。
[0079] 表13给药12h后的OD值
[0080]
[0081] 表14给药24h后的OD值
[0082]
[0083] 表15给药36h后的OD值
[0084]
[0085] 表16 给药48h后的OD值
[0086]
[0087] 其中，标准偏差：数据值偏离算术平均值的程度；
[0088] 比率1：存活率，比率1= 各组平均值/空白组平均值；
[0089] 比率2：存活细胞的变异系数，比率2= 标准偏差/空白组平均数。
[0090] 野生桑黄粗多糖在给药12h、24h、36h、48h的抗肿瘤OD值如表17～20所示。
[0091] 表17给药12h后的OD值
[0092]
[0093] 表18给药24h后的OD值
[0094]
[0095] 表19给药36h后的OD值
[0096]
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