确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法专利检索-抗肿瘤效果药理专利检索查询-专利查询网

确定单克隆抗体的抗 肿瘤效果的方法

阅读：272发布：2020-05-11

专利汇可以提供确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法和所述方法在减少补充试验中的应用。，下面是确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，其包含以下连续步骤：
a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；
3
b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小，直到肿瘤大小超出100mm ；
c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和
d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于另外的步骤
e)将啮齿类动物杀死和进一步研究副作用。
3.减少临床前啮齿类动物试验的方法，其特征在于
a)利用根据权利要求1所述的方法，评估由杂交瘤产生的单克隆抗体的抗肿瘤效果，和
b)优先考虑1至3种单克隆抗体，优选1种单克隆抗体，用于进一步临床前评估。

说明书全文

确定单克隆抗体的抗 肿瘤效果的方法

[0001] 本发明涉及一种用于在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法和该方法在减少补充试验中的应用。

[0002] 发明背景

[0003] 用于治疗性的肿瘤疗法的单克隆抗体需经过价格昂贵且费时的评价过程。通常它们通过，例如，用相应的肿瘤抗原或其抗原片段免疫产生杂交瘤而获得，所述杂交瘤产生针对所述肿瘤抗原的单克隆抗体。在进行大量的评估之前，必须经过一个费时的纯化过程，随后先在体外对它们进行评估，继而用于临床前的动物研究。体外研究主要是确定单克隆抗体与其相应肿瘤抗原结合的亲和力和对人类肿瘤细胞的生长抑制，这是临床前动物试验的先决条件。然而，已经显示体外肿瘤细胞的生长抑制与在体内异种移植物动物研究中的功效并不总具有相关性。已经显示在体外具有良好的抗增殖活性的抗体在临床前在体内模型中是完全失活的，而在体外灭活的抗体可发挥显著的体内功效。因此，总体来说，关于此类抗体的临床前动物试验是费时费力的，且由于体外研究的较差预测潜能，不得不测试大量不同的抗体。因此，减少临床前动物试验以及较少的耗时程序在研发抗肿瘤疾病的单克隆抗体中是一项重要的任务。

[0004] Staquet和Giles-Komar(Hybridoma 2006；25：68-74)中描述了一种体内评估单克隆抗体的方法。他们把在基质胶中的杂交瘤通过皮下注射进小鼠。四天后，将肿瘤细胞通过皮下注射进同一小鼠，随时间测量肿瘤生长。与对照的杂交瘤相比，减慢的肿瘤生长或无肿瘤生长显示了由相应杂交瘤产生的单克隆抗体的抗增殖效果。使用这种方法使得把具有抗肿瘤活性的抗体从不具有抗肿瘤活性的抗体中区分出来成为可能。然而这种方法允许在抗增殖潜力的抗体间的区分可能性没有或极低，这些抗体仍然需要从杂交瘤纯化并再次测试以进一步评估其抗增殖潜能。

[0005] 发明概述

[0006] 本发明的一个方面是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含以下连续步骤：

[0007] a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；

[0008] b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过100mm3；

[0009] c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和

[0010] d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。

[0011] 与纯化和体外预选后的传统测试和优化相比，根据本发明所述的方法是在免疫后鉴定、区分和优化新的具有抗肿瘤效果的治疗性抗体更为迅速和有效的方法。

[0012] 本发明的另一方面是所述方法用以减少临床前试验的应用。

[0013] 本发明的详细描述

[0014] 本发明的一个实施方案是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含以下连续步骤：

[0015] a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；

[0016] b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过100mm3；

[0017] c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和

[0018] d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。

[0019] 在步骤a)中，优选所述施用是经皮下的、同位的或静脉内注射，更优选的是经皮下注射，肿瘤细胞是来自于人的，啮齿类动物优选的是小鼠或大鼠，更优选的是小鼠。

[0020] 在步骤b)中，测量肿瘤大小直到肿瘤大小达到100mm3-300mm3。

[0021] 在步骤c)中，优选所述施用是皮下注射在基质胶中或在空心纤维中、更优选在基质胶中的杂交瘤。

[0022] 任选地，增加另外的步骤e)，其中杀死所述啮齿类动物和并进一步研究副作用。

[0023] 由所述杂交瘤产生的所述单克隆抗体是结合在所述肿瘤细胞的细胞表面表达的肿瘤抗原的抗体，所述肿瘤细胞用于本发明所述的方法中。

[0024] 在此所用的术语“单克隆抗体”是一致的氨基酸组成的抗体分子的制剂。这些单克隆抗体由用各自的肿瘤抗原免疫后的杂交瘤产生。可通过任何适当的方法将抗原引入例如，小鼠或大鼠或其它动物中用于免疫。优选地，单独或联合合适的免疫调节剂(例如：CFA)经脾脏内、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、皮下来免疫动物。每一种抗原的剂量优选地在
1-500μg范围内。可以分离由此产生的小鼠淋巴细胞并根据标准方案利用PEG或电融合与人或异源骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。电融合是基于一种可逆性的细胞膜结构变化，包括它们完整的结构(细胞核，细胞膜，细胞器，细胞质)从而产生一种新的能存活的细胞，所述结构变化由电场的作用而导致并可应用在广范的细胞种类以融合两种以上同源或异源的细胞。这导致产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体适合于本发明所述的方法。

[0025] 在这里所用的术语“结合”或“特异性结合”指在体外测试、优选地，在利用表达野生型抗原的CHO细胞的基于细胞的ELISA中，抗体与肿瘤抗原的表位的结合。结合是指-8 -13 -910 M以下，优选10 M-10 M的结合亲和力(KD)。抗体与抗原的结合可以通过BIAcore测试(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)来研究。结合的亲和力用术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)，kD(离解常数)和KD(kD/ka)来定义。

[0026] 由于以下原因，根据本发明所述的方法与传统的测试纯化抗体方法相比代表一种改进(参见表1)。在抗体纯化前通过优化，只有最有效的抗体，最感兴趣的杂交瘤需要为进一步的鉴定而纯化，这意味着抗体纯化的数量显著减少，加速了新治疗性抗体的研发和减少了总体上为治疗性抗体研发所需付出的测试努力(相比于如果必须测试许多纯化的抗体而言)。另外，常常忽略(这种忽略是由于它们在杂交瘤中的低产率，使得难以获得足够的纯化抗体，而非由于它们的治疗性能)进行进一步评估的产率低的杂交瘤的抗体更容易获得评估它们治疗性能的机会。

[0027] 表1：传统方法与新杂交瘤技术的比较

[0028]

[0029]

[0030] *在体外单克隆抗体对增殖具有微小活性但在体内具说服力的活性的实例存在。

[0031] **3D共同培养可能，但在体内情形仍无合适反映。

[0032] 本发明的另一方面是减少临床前啮齿类动物测试的方法，其特征在于[0033] a)用于评估由杂交瘤产生的单克隆抗体的抗肿瘤效果，所述方法用于鉴定上述单克隆抗体的抗肿瘤效果，和

[0034] b)优化1至3种单克隆抗体，优选一种单克隆抗体，用于进一步的临床前评估。

[0035] 所述进一步临床前评估可以在同样的或其它临床前动物试验中进行。使用这种在早期优化的方法，只有少量的单克隆抗体药物候选者需在另外的临床前动物试验中评估，从而取代在临床前动物试验中广泛测试大范围的纯化抗体。因此，可以实现减少多至50％的在啮齿类动物中临床前动物试验。

[0036] 以下提供的实施例和附图用以帮助对本发明的理解，本发明的真正的范围在后附的权利要求书中提出。可以理解在不脱离本发明精神的前提下可以对程序进行修改。

附图说明

[0037] 图1.使用根据Staquet et al的方法(实施例1)时，在Calu-3异种移植物模型中产生抗体的杂交瘤对肿瘤生长的作用。

[0038] 图2.在根据本发明的新方法(实施例2)中，在Calu-3异种移植物模型中产生抗体的杂交瘤对肿瘤生长的作用。

[0039] 图3.在根据本发明的新方法(实施例3)中，在Calu-3异种移植物模型中纯化的抗体对肿瘤生长的作用。

[0040] 实施例1

[0041] 在人肺肿瘤异种移植物中产生抗HER3抗体的杂交瘤的作用(Staquet et al.的方法)

[0042] 根据Staquet和Giles-Komar公开的方法，将产生针对HER3的抗体的四种不同杂5
交瘤注射进雌性BALB/c裸鼠内。杂交瘤(5×10)和100微升基质胶在4℃混合后立即经皮下注射进肩部。Ag8细胞用来作对照。一周以后，在细胞表面表达Her3抗原的Calu-3肿
6
瘤细胞(5×10/100微升)通过皮下注射进对侧肩部。随后在接下来10天用测径器测量肿瘤的体积。

[0043] 图1表明杂交瘤分泌的抗体抑制肿瘤生长。然而根据测量的肿瘤体积，没有区别，因此，没有进行关于抗肿瘤功效的不同杂交瘤的优化。

[0044] 实施例2

[0045] 在人肺肿瘤异种移植物中产生抗HER3抗体的杂交瘤的效果(新优化的方法)[0046] Calu-3肿瘤细胞(5x 106/100微升)通过皮下注射进雌性Balb/c裸鼠。44天3
后肿瘤负载小鼠被随机化并分成不同组。肿瘤体积的平均值为130mm。与Staquet和Giles-Komar所描述的方法相反，产生抗Her3抗体的杂交瘤和基质胶混合，经皮下注射进肿瘤细胞注射处的对侧。另外，两个杂交瘤(克隆31和克隆33)也被包含于本实验中。Ag8细胞再次被用作杂交瘤对照。

[0047] 图2表明注射杂交瘤克隆33，12和29后23天诱发最强的抗肿瘤效果。相反，克隆18，30和31对肿瘤生长无作用，并如预期地，杂交瘤Ag8是无效的。这种优化的方法允许针对其抗肿瘤效果，筛选不同的杂交瘤。

[0048] 比较图1和图2说明新技术优于Staquet和Giles-Komar所描述的方法。这种应用描述了把杂交瘤注射进负载了已建立肿瘤的小鼠中，因而可以得出针对由杂交瘤分泌的抗体的效果更确切地反映在临床情形中的结论。

[0049] 实施例3

[0050] 评估在人肺肿瘤异种移植物中从杂交瘤上清液纯化的抗体的抗肿瘤效果[0051] 这个实施例描述了传统技术用以研发治疗性抗体并支持了实施例2中描述的实验结果。

[0052] 从6个不同的杂交瘤上清液中纯化抗Her3抗原的抗体。在相应的异种移植物中测试这些抗体的抗肿瘤活性。

[0053] Calu-3肿瘤细胞(5x106/100微升)经皮下被注射进雌性Balb/c裸鼠。35天后负3
载肿瘤的小鼠被随机化和分成不同组。肿瘤体积的平均值为80mm。将小鼠连续5周每周
1次腹膜内注射不同的抗体。在研究全程中用测径器每周两次测量肿瘤体积测径器。从克隆12衍生而来的抗体(肿瘤生长抑制达66％)，从克隆33纯化的抗体(肿瘤生长抑制达
50％)和从克隆29而来的抗体(肿瘤生长抑制达47％)被鉴定为对肿瘤生长抑制最有效的抗体。相反，从克隆18，30和31纯化的抗体是无效的(图3)。

[0054] 比较图2和图3表明注射进已建立肿瘤的小鼠的杂交瘤显示出的抗肿瘤活性与从相应杂交瘤上清液纯化后的纯化抗体的治疗效果相当。

[0055] 此外，对于无效的杂交瘤，来自这些杂交瘤的纯化抗体不缩小肿瘤生长。这些结果显示了改进的方法的有效性。

[0056] 这意味着在评估治疗性抗体中实验性的努力明显减少，因为纯化已不再被需要用来作评估和优化。

标题	发布/更新时间	阅读量
穿心莲内酯在制备提高博来霉素抗肿瘤效果的药物中的应用	2020-05-12	603
光动力抗菌和光动力抗肿瘤方面有显著的效果。碱性氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物的本发明的新型碱性氨基酸修饰氨基四苯基卟啉制备方法及用途化合物，在生理条件下带有阳离子电荷，抗菌谱	2020-05-13	940
突变型Bik的抗肿瘤效果	2020-05-11	392
溶瘤病毒的增殖方法和抗肿瘤剂	2020-05-13	163
一种抗肿瘤纳米药物	2020-05-13	359
具有抗肿瘤效果的咪唑并恶唑衍生物及包括其的药物组合物	2020-05-12	187
藁本内酯作为抗肿瘤药物的辅助药物的用途	2020-05-13	54
抗肿瘤效果增强剂和抗肿瘤剂	2020-05-11	577
丹酚酸B和昔布类药物联合用药的抗肿瘤效果	2020-05-11	86
一种抗肿瘤小分子多肽及应用	2020-05-13	85

确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法

确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法

附图说明

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：