本发明要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤的中药制剂,该药物抗肿 瘤效果显著,毒性较小,且工艺稳定,可以进行大规模工业化生产。
为解决上述技术问题,本发明一种抗肿瘤的中药制剂,主要包含鸦胆 子超临界提取物。
本发明选用符合中国2005版药典标准的鸦胆子药材,
粉碎成粗粉, 经二步二
氧化
碳超临界萃取得到萃取物,其中第一步萃取,萃取压
力为 15~20MPa,萃取
温度35~50℃,萃取流速为0.6~4.8kg/m2·s,萃取时 间为1~3小时;第二步萃取,加1~5倍量
乙醇做夹带剂,萃取压力为 20~25MPa,萃取温度35~50℃,萃取流速为1.2~4.8kg/m2·s,萃取时 间为1~3小时,回收乙醇,两部分合并即得鸦胆子超临界提取物。
本发明一种抗肿瘤的中药制剂可以由鸦胆子超临界提取物直接与常 规的辅料制成,或者由所述鸦胆子超临界提取物经过微囊化包裹后,形成 毫微囊,再与常规的辅料一起制成。优选方案为将鸦胆子超临界提取物经 过微囊化包裹后,形成毫微囊,再与常规的辅料一起制成。
本发明一种抗肿瘤的中药制剂可以是粉针剂、注射剂、片剂、胶囊剂、 颗粒剂、滴丸剂、外用贴剂、凝胶剂或
软膏剂。
将上述鸦胆子超临界提取物作为原料,采用改进的高效微囊的制备方 法,制成以鸦胆子超临界提取物为囊心组分,以药用高分子材料为囊材的 粒径在500nm以下范围可控的尺度均一的毫微囊,如制备成粒径100nm 左右,尺寸均一的毫微囊,在一定的乳化均质成囊条件下,获得尺寸均一 的毫微囊。所说的乳化均质条件是指借助乳化剂等附加剂或与高压均质机 联合作用下,可分散得到尺寸均一,粒子稳定性好,不团聚的乳液体系, 经自聚或交联聚合后,得到本发明要求的毫微囊。
所述的药用高分子材料,包括天然高分子材料、半合成高分子材料和 人工合成的高分子材料。其中天然高分子材料包括明胶、阿拉伯胶、海藻 酸盐、蛋白类、
淀粉类,但常用的是明胶和淀粉类,因为这两类材料降解 好、且生产成本较低;其中半合成高分子材料常用的是
纤维素类、聚乙烯 吡咯烷
酮,因为它们的成囊工艺较为简单,操作方便;人工合成的高分子 材料常用的是聚乳酸类和聚氰基
丙烯酸烷基酯类材料,其中聚乳酸类材料 包括聚乳酸、聚乳酸共聚乙醇酸及聚己内酯,以聚乳酸为最佳,这些材料 具有良好的组织相溶性、毒性低等优点;其中聚氰基丙烯酸烷基酯类高分 子材料,包括甲酯、乙酯、丁酯、异丁酯和己酯,其中丁酯为最佳,因为 聚氰基丙烯酸丁酯具有
生物降解性、毒性小、以及在体内耐受性好等多方 面的优点,受到广泛运用。
由于毫微囊包囊材料的不同,其具体制法是有区别的,它可以采用乳 化聚合法、天然高分子法或喷雾(液中)干燥法中的一种。其制备方法如下: 先将鸦胆子超临界提取物溶解在
溶剂中,然后与聚氰基丙烯酸烷基酯类药 用高分子材料的溶液混合成均一的“油相”,继将油相在搅拌下,用注射 器缓慢射入含有附加剂的水相中,控制搅拌速度、溶液温度和pH值、囊 材和囊心物比例、搅拌时间,使微粒尺寸在500nm以下范围调控,由高分 子材料
单体聚合,包裹药物,直接形成毫微囊。或者先将鸦胆子超临界提 取物溶解在溶剂中,然后与非
水溶性药用高分子材料的溶液混合成均一的 “油相”,继将油相在搅拌下,缓慢加入至含有附加剂的水相中,形成一 种乳状液,另外也可将上述溶解在溶剂中的鸦胆子超临界提取物加入到含 有水溶性药用高分子材料与附加剂的水相中,在搅拌下形成乳状液,再通 过高压均质机进行均质处理,在高压均质过程中调控物料在均质机中的压 力和温度,及内循环次数,使通过均质处理的乳液中的微粒尺寸在500nm 以下范围调控,形成稳定的均一的超细乳液,最后完成包埋、聚合或交联 成毫微囊。
本发明中药制剂的用量和
疗程可根据剂型、患者的年龄、
疾病的轻重 程度作适当调整,但一般为每日口服3次,每次2克,以1个月为一个疗 程,可连续使用3个疗程或更长时间。
本发明具有以下有益效果:本发明中药制剂与传统鸦胆子油及其制剂 相比,由于其中有效部位完整,含量较高,因此鸦胆子超临界提取物及其 毫微囊的抗肿瘤功效相应有较大提高,便于临床给药与科学判断药物的功 效,从而有利于鸦胆子制剂走向国际市场。此外,由鸦胆子超临界提取物 的毫微囊制成的制剂具有高效、低毒、吸收快、利用率高的优点,在治疗 肿瘤时疗效确切,使用方便,无毒
副作用,更有利于推广应用。
附图说明
图1是YDZ含药血清对HepG2细胞活力的影响示意图,其中,YDZ是 鸦胆子超临界萃取物,HepG2是肝癌细胞株。
以下通过
实施例对本发明作进一步的阐述:
实施例1:鸦胆子超临界提取物的制备
称取鸦胆子粗粉5kg,置萃取器中,启动二氧化碳高压
泵,通过背压
阀和高压泵转速联合调节使萃取器的压力和二氧化碳的流量维持在设定 参数,其中第一步萃取,萃取压力为20MPa,萃取温度35℃,萃取流速为 4.8kg/m2·s,萃取时间为1小时;第二步萃取,加4倍量乙醇做夹带剂, 萃取压力为25MPa,萃取温度35℃,萃取流速为4.8kg/m2·s,萃取时间 为1小时,回收乙醇,两部分合并即得流动性好,
颜色较深的鸦胆子超临 界提取物。
实施例2:鸦胆子超临界提取物的制备
称取鸦胆子粗粉5kg,置萃取器中,启动二氧化碳高压泵,通过背压 阀和高压泵转速联合调节使萃取器的压力和二氧化碳的流量维持在设定 参数,其中第一步萃取,萃取压力为15MPa,萃取温度50℃,萃取流速为 0.6kg/m2·s,萃取时间为3小时;第二步萃取,加5倍量乙醇做夹带剂, 萃取压力为20MPa,萃取温度50℃,萃取流速为1.2kg/m2·s,萃取时间 为3小时,回收乙醇,两部分合并即得流动性好,颜色较深的鸦胆子超临 界提取物。
实施例3:鸦胆子超临界提取物的制备
称取鸦胆子粗粉5kg,置萃取器中,启动二氧化碳高压泵,通过背压 阀和高压泵转速联合调节使萃取器的压力和二氧化碳的流量维持在设定 参数,其中第一步萃取,萃取压力为18MPa,萃取温度40℃,萃取流速为 1.8kg/m2.s,萃取时间为1.5小时;第二步萃取,加1倍量乙醇做夹带剂, 萃取压力为23MPa,萃取温度45℃,萃取流速为2.4kg/m2·s,萃取时间 为2小时,回收乙醇,两部分合并即得流动性好,颜色较深的鸦胆子超临 界提取物。
实施例4:乳化聚合法制备鸦胆子超临界提取物毫微囊
①
处方:
油相:无水乙醇 50ml 聚氰基丙烯酸丁酯 0.5g
鸦胆子超临界提取物(实施例1) 3.0g
水相:水 200ml 葡聚糖 2.0g 吐温20 1.0g
②制备工艺:取聚氰基丙烯酸丁酯加入乙醇中分散均匀成白色乳浊 液,加入鸦胆子超临界提取物,分散均匀。
冰箱中冷却至20℃。另取吐 温20及葡聚糖加入水中溶解后,冰箱中冷却至20℃。取出后用稀
盐酸调 节pH值为3,搅拌水相,使转速为600rpm,将油相注射入水相中。完毕 后继续搅拌2小时后砂芯漏斗过滤,滤液呈乳状,测定粒径在100纳米左 右,加甘露醇
喷雾干燥固化即得。
实施例5:天然高分子法制备鸦胆子超临界提取物毫微囊
①处方:
油相:芝麻油 100ml 明胶溶液 100ml(1000g/L)
鸦胆子超临界提取物(实施例2) 3.0g
水相:水 200ml
硫酸钠 2.0g 吐温80 1.0g
②制备工艺:取明胶溶液,加入鸦胆子超临界提取物,在芝麻油中乳 化均匀。将形成的乳状液在冰水浴中冷却,使明胶完全胶凝,用丙酮稀释 并洗去芝麻油。另取吐温80及硫酸钠加入水中溶解后,在冰箱中冷却至 10℃。取出后两相混匀,进高压均质机均质,控制压力为400bar,温度 25℃,内循环3次,回收丙酮,过0.45μm的微孔滤膜,测定粒径在200 纳米左右,加甘露醇通过
冷冻干燥或喷雾干燥固化即得。
实施例6:半合成高分子喷雾干燥法制备鸦胆子超临界提取物毫微囊
①处方:
油相:无水乙醇 100ml 磷脂170 2g
鸦胆子超临界提取物(实施例3) 80g
水相:水 300ml 聚乙烯吡咯烷酮K30 10g
吐温80 5g 甘露醇 80g
②制备工艺:取磷脂170与鸦胆子超临界提取物,用无水乙醇溶解, 作为油相。另取吐温80、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇加入水中溶解,作为 水相。将两相混匀,进高压均质机均质,控制压力为300bar,温度25℃, 内循环4次,测定粒径为50nm左右,冷冻干燥或喷雾干燥固化即得。
实施例7:合成高分子液中干燥法制备鸦胆子超临界提取物毫微囊
①处方:
油相:丙酮 15ml 聚乳酸 0.1g 卵磷脂 0.2g
鸦胆子超临界提取物(实施例3) 1g
水相:水 500ml 泊洛沙姆 1g
②制备工艺:取聚乳酸和卵磷脂用丙酮溶解,加入鸦胆子超临界提取 物,混合均匀,作为油相。另取泊洛沙姆加入水中溶解,作为水相。将两 相缓慢混匀,进高压均质机均质,控制压力为800bar,温度20℃,内循 环3次,回收丙酮,离心,去除上清液,冷冻干燥固化即得,测定粒径为 150nm左右。
实施例8:粉针剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊(实 240g
施例6)
葡萄糖 120g
甘露醇 240g
维生素C 100g
双蒸水加至 1000ml
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物毫微囊与葡萄糖、甘露醇、维生 素C加入双蒸水中溶解均匀,封装冷冻干燥即得。
实施例9:注射剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊(实 100g
施例5)
甘油 22.5g
1,2-丙二醇 100g
维生素E 2.5g
胆酸 30g
精制豆油 25g
磷脂 33.3g
双蒸水加至 1000ml
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物毫微囊与甘油、1,2-丙二醇、 维生素E、胆酸加入双蒸水中溶解均匀,将磷脂溶解于精制豆油,两相高 压乳化均匀,封装即得。
实施例10:片剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊(实 500g
施例4)
微晶
纤维素 100g
乳糖 400g
羧甲基淀粉钠 50g
滑石粉 25g
硬脂酸镁 25g
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物毫微囊与微晶纤维素、乳糖、 羧甲基淀粉钠混合均匀,
流化床一步制粒,加入滑石粉和硬脂酸镁,混合 均匀,压片
包装即得。
实施例11:胶囊剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊(实 700g
施例7)
改良淀粉 200g
糊精 50g
硬脂酸镁 50g
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物毫微囊与改良淀粉、糊精混合 均匀,流化床一步制粒,加入硬脂酸镁,混合均匀,灌装胶囊包装即得。
实施例12:颗粒剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊(实 500g
施例4)
微晶纤维素 200g
乳糖 200g
羧甲基淀粉钠 50g
硬脂酸镁 50g
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物毫微囊与微晶纤维素、乳糖、 羧甲基淀粉钠混合均匀,流化床一步制粒,加入硬脂酸镁,混合均匀,颗 粒包装即得。
实施例13:滴丸剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物(实施例2) 400g
PEG6000 500g
甘油 100g
②制备工艺:将鸦胆子超临界提取物、甘油与PEG6000加热熔融, 并搅拌均匀,保温60℃,滴入10℃的液体
石蜡中,收集滴丸,擦去表面 的石
蜡油,包装即得。
实施例14:外用贴剂的制备
①处方:
组成 药库层 粘贴层
鸦胆子超临界提取物(实施 200g 50g
例1)
聚异丁烯MML-100 300g 200g
聚异丁烯LM-MS 350g 400g
蓖麻油 500g 400g
汽油 5000g 3000g
②制备工艺:按药库层处方和粘附层处方量称取各成分,分别溶解, 将药库层溶液涂布在70微米厚的
铝塑膜上,烘干或自然干燥,形成约60 微米厚的药库层;将粘附层溶液涂布在200微米厚的
硅纸上,干燥,制成 约50微米厚的粘附层。将粘附层复合到药库层,切成合适大小的小片即 得。
实施例15:凝胶剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物毫微囊 300g
(实施例4)
卡波普 100g
乙醇 100g
甘油 50g
聚山梨酯-80 2g
尼泊金乙酯 1g
氢氧化钠 4g
蒸馏水加至 1000g
②制备工艺:将卡波普与聚山梨酯-80、鸦胆子超临界提取物毫微囊 及600ml水混合;氢氧化钠用水适量溶解后加入上液,搅匀;再将尼泊金 乙酯溶于乙醇后逐渐加入搅匀,即得淡黄色透明凝胶。
实施例16:软膏剂的制备
①处方:
鸦胆子超临界提取物(实施例 200g
3)
单硬脂酸甘油酯 250g
凡士林 100g
十二烷基硫酸钠 20g
氮酮 10g
蒸馏水加至 1000g
②制备工艺:将油相单硬脂酸甘油酯、凡士林加热至80℃,鸦胆子 CO2超临界提取物、氮酮、十二烷基硫酸钠、水加热略高于80℃,将水相 缓缓加到油相,边加边搅拌,渐渐成软膏。
以下通过试验例对本发明的有益效果作进一步的阐述:
试验例1:鸦胆子超临界提取物及其毫微囊体外抗肿瘤作用研究及血 清药理学研究
1.1材料
1.1.1
试剂与药品
鸦胆子超临界萃取物(YDZ)、YDZ
纳米乳颗粒(粒径500nm) (Nanocap-YDZ-500nm)均由国家中药制药工程技术研究中心/上海中药制 药技术有限公司提供。YDZ生药得率4.0%,批号:040709。载药量Nanocap- YDZ-500为25%,YDZ纳米乳颗粒溶解于生理盐水得YDZ纳米乳;YDZ溶解 于含有2%土温80生理盐水得YDZ乳液。YDZ乳液与YDZ纳米乳实验剂量 均以YDZ计算。
DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium)购自Gibco公 司,含2.2mg/mLNaHCO3、2.385mg/mL Hepes、100U/mL青霉素、100μg/mL
链霉素、100U/mL卡那霉素、5mg/L酚红,pH7.2;MTT[溴化-(4,5-二 甲基-2-塞唑基)-2,5-二苯基四氮唑]购自Amresco公司,临用PBS液溶 解;胰蛋白酶(trypsin)购自Serva公司,临用D-Hanks液溶解,含 0.04%EDTA-2Na pH7.2;Hepes购自Sigma公司;新生
牛血清(newborn calf serum,NCS)购自杭州四季青
生物工程公司;二甲亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO),购自永华特种化学试剂厂;PBS液:8.00mg/mL NaCl、 0.20mg/mL KCl、1.56mg/mL Na2HPO4·H2O、0.20mg/mL KH2PO4;D-Hanks液: 8.00mg/mL NaCl、0.40mg/mL KCl、0.06mg/mL Na2HPO4·H2O、0.06mg/mL KH2PO4、0.35mg/mLNaHCO3、Glucose 1.00mg/mL、20mg/L酚红。
1.1.2动物与细胞:雄性昆明小鼠,体重20±2g,由江苏省青龙山实 验动物场提供,合格证号:SCXK苏-2002-0018。肝癌细胞株HepG2由中 国药科大学新药筛选中心提供。
1.1.3仪器:HERA细胞
培养箱,美国Therma Elemental公司;XSZ-D 倒置生物
显微镜,重庆光学仪器厂;洁净
工作台,苏净集团安泰公司;Z323K 冷冻高速离心机,德国Hermle labor tecknik公司;Sunrise遥控酶标 仪,奥地利Tecan GmbH公司。
1.1.4统计分析:应用EXCEL与NDST4.4统计
软件进行统计,数据用 表示,比较组间差异行t或t’检验。
1.2方法与结果
1.2.1YDZ与Nanocap-YDZ-500nm含药血清制备
雄性ICR小鼠,体重22±2g,随机分为3组:YDZ30,60mg/kg组与 空白对照组。小鼠ig给予YDZ乳液,给药量为20mL/kg体重,bid×3.5d, d4最后一次给药后1h,摘眼球取血,4℃下静置1-2h,4000rpm×10min 离心二次,收集血清,0.22μm微孔滤膜
正压过滤除菌,-20℃下冷冻备 用。另同法制备YDZ 30mg/kg含药血清、Nanocap-YDZ-500nm 30mg/kg含 药血清与空白血清。
1.2.2YDZ对HepG2细胞活力的影响
取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中,用10%NCS DMEM培养 液置37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞用D-Hanks液洗1次后,换无 血清DMEM培养液,设空白对照组6孔,实验组设0.1,1.0,10,100,1000 μg/mL5个YDZ浓度,每浓度6孔。
培养48h后,在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中,加入终 浓度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔,继续培养4h后,小心吸取上清90μl, 再加入DMSO 50μl/孔,微型
振荡器上振荡5min,Sunrise遥控酶标仪测 定光吸收值,
波长570nm。抑制率(%)=(1-A实/A对)×100%。
表1 YDZ对HepG2细胞活力的影响
组别 浓度(μg/mL) A570 抑制率(%) IC50(μg/mL) 对照组 YDZ 1000 100 10 1 0.262±0.039 0.050±0.005c 0.124±0.029c 0.126±0.051b 0.237±0.035 80.8 52.5 51.8 9.3 31.8
0.1 0.254±0.018 3.1
ap<0.05 b p<0.01 cp<0.001相对于对照组
表1显示,0.1-1000μg/mL YDZ对HepG2细胞活力有不同程度的抑 制作用,抑制率为3.1-80.8%,其中10-1000μg/mL YDZ作用有极显著性 (p<0.001-0.01),IC50为31.8μg/mL。
1.2.3YDZ含药血清对HepG2细胞活力的影响
取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中,用10%NCS DMEM培养 液置37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞用D-Hanks液洗1次后,换无 血清DMEM培养液,设0.1%,0.5%,1.0%,5%,10%,20%空白血清对照组, 实验组设0.1%,0.5%,1.0%,5%,10%,20% 30,60mg/kg YDZ含药血清 组。
培养48h后,在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中,加入终 浓度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔,继续培养4h后,小心吸取上清90μl, 再加入DMSO50μl/孔,微型振荡器上振荡5min,Sunrise遥控酶标仪测 定光吸收值,波长570nm。
图1是YDZ含药血清对HepG2细胞活力的影响示意图,其中( n=4),cp<0.001相对于对照组。如图1所示,与空白血清对照组比较, 在0.1%-1.0%实验浓度下,YDZ含药血清对HepG2细胞活力无显著影响; 在5.0%-10.0%实验浓度下,YDZ含药血清对HepG2细胞活力有一定促进作 用;在20%实验浓度下,YDZ含药血清对HepG2细胞活力有极显著抑制作 用(p<0.001)。
1.2.4YDZ与YDZ纳米乳含药血清对HepG2细胞活力的影响
取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中,用10%NCS DMEM培养 液置37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞用D-Hanks液洗1次后,换无 血清DMEM培养液,设5%与10%空白血清对照组,实验组设5%与10%YDZ 含药血清组与Nanocap-YDZ-500nm含药血清组。
培养48h后,在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中,加入终 浓度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔,继续培养4h后,小心吸取上清90μl, 再加入DMSO50μl/孔,微型振荡器上振荡5min,Sunrise遥控酶标仪测 定光吸收值,波长570nm。
表2 YDZ与YDZ纳米乳含药血清对HepG2细胞活力的影响( n=6)
组别 剂量(mg/mL) A570 5% 10% 对照组 Nanocap-YDZ-500nm YDZ 30 30 0.585±0.076 0.484±0.022b# 0.583±0.095 0.730±0.094 0.701±0.055 0.759±0.071
bp<0.01相对于对照组;#p<0.05相对于YDZ
表2显示,与空白血清对照组比较,在5%与10%实浓度下,YDZ含药 血清对HepG2细胞活力无抑制作用;而等载药剂量下,5%与 10%Nanocap-YDZ-500nm可不同程度抑制HepG2细胞活力,其中以5% Nanocap-YDZ-500nm作用显著(p<0.01);与YDZ含药血清组比较,5% Nanocap-YDZ-500nm可显著提高YDZ细胞毒性(p<0.05)。
1.3结论
体外实验显示,YDZ对肝癌HepG2细胞具有抗肿瘤效应。血清药理学 研究发现,不同实验浓度的YDZ含药血清对HepG2细胞影响不同。在YDZ 含药血清不显示抗肿瘤作用实验浓度下,等YDZ剂量下的YDZ纳米乳却显 示出显著的抗肿瘤效应。
试验例2:YDZ毫微囊抗肝癌尺寸效应血清药理学研究
2.1材料
2.1.1试剂与药品
鸦胆子超临界萃取物(YDZ)、YDZ毫微囊(Nanocap-YDZ-1-4)均由 国家中药制药工程技术研究中心/上海中药制药技术有限公司提供。YDZ 生药得率4.0%,批号:040709。载药量Nanocap-YDZ为0.8g/100mL;YDZ 溶解于含有2%土温80生理盐水得YDZ乳液。YDZ乳液与YDZ纳囊乳液剂 量均以YDZ计算。
DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium)购自Gibco公 司,含2.2mg/mL NaHCO3、2.385mg/mL Hepes、100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、100U/mL卡那霉素、5mg/L酚红,pH7.2;MTT[溴化-(4,5-二 甲基-2-塞唑基)-2,5-二苯基四氮唑]购自Amresco公司,临用PBS液溶 解;胰蛋白酶(trypsin)购自Serva公司,临用D-Hanks液溶解,含 0.04%EDTA-2Na pH7.2;Hepes购自Sigma公司;新生牛血清(newborn calf serum,NCS)购自杭州四季青生物工程公司;二甲亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO),购自永华特种化学试剂厂;PBS液:8.00mg/mL NaCl、 0.20mg/mL KCl、1.56mg/mL Na2HPO4·H2O、0.20mg/mL KH2PO4;D-Hanks液: 8.00mg/mL NaCl、0.40mg/mL KCl、0.06mg/mL Na2HPO4·H2O、0.06mg/mL KH2PO4、0.35mg/mL NaHCO3、Glucose 1.00mg/mL、20mg/L酚红。
2.1.2动物与细胞:雄性昆明小鼠,体重20±2g,由江苏省青龙山实 验动物场提供,合格证号:SCXK苏-2002-0018。肝癌细胞株HepG2由中 国药科大学新药筛选中心提供。
2.1.3仪器:HERA细胞培养箱,美国Therma Elemental公司;XSZ-D 倒置生物显微镜,重庆光学仪器厂;洁净工作台,苏净集团安泰公司;Z323K 冷冻高速离心机,德国Hermle labor tecknik公司;Sunrise遥控酶标 仪,奥地利Tecan GmbH公司。
2.1.4统计分析:应用EXCEL与NDST4.4统计软件进行统计,数据用 表示,比较组间差异行t或t’检验。
2.2方法与结果
2.2.1YDZ与Nanocap-YDZ含药血清制备
雄性ICR小鼠,体重22±2g,随机分为6组:YDZ 30mg/kg组、 Nanocap-YDZ-1-430mg/kg组与空白对照组。小鼠ig给予YDZ乳液,给药 量为20mL/kg体重,bid×3.5d,d4最后一次给药后1h,摘眼球取血,4 ℃下静置1-2h,4000rpm×10min离心二次,收集血清,0.22μm微孔滤 膜正压过滤除菌,-20℃下冷冻备用。
2.2.2Nanocap-YDZ对HepG2细胞活力的影响
取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中,用10%NCS DMEM培养 液置37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞用D-Hanks液洗1次后,换无 血清DMEM培养液,设空白对照组6孔,实验组设8,80,800μg/mL 3 个Nanocap-YDZ-1-4浓度,每浓度6孔。
培养48h后,在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中,加入终 浓度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔,继续培养4h后,小心吸取上清90μl, 再加入DMSO 50μl/孔,微型振荡器上振荡5min,Sunrise遥控酶标仪测 定光吸收值,波长570nm。抑制率(%)=(1-A实/A对)×100%。
表3 Nanocap-YDZ对HepG2细胞活力的影响 n=4)
组别 浓度(μg/mL) A570 抑制率(%) IC50(μg/mL) 对照组 Nano-YDZ-1 Nano-YDZ-2 Nano-YDZ-3 Nano-YDZ-4 800 80 8 800 80 8 800 80 8 800 80 8 0.336±0.041 0.023±0.006c 0.046±0.028c 0.341±0.044 0.034±0.013c 0.205±0.047c 0.255±0.098 0.033±0.009c 0.298±0.060 0.301±0.026 0.038±0.011c 0.184±0.065c 0.279±0.047 93.1 86.3 -1.49 89.9 39.0 24.1 90.2 11.3 10.4 88.7 45.2 16.9 33.9 92.7 216.4 86.5
ap<0.05 b p<0.01 cp<0.001相对于对照组
表3显示,8-800μg/mL Nanocap-YDZ-1-4对HepG2细胞活力有不同 程度抑制作用,IC50分别为Nanocap-YDZ-1 33.9μg/mL、Nanocap-YDZ-2 92.7μg/mL、Nanocap-YDZ-3 216.4μg/mL与Nanocap-YDZ-4 86.5μg/mL。
2.2.3YDZ与Nanocap-YDZ含药血清对HepG2细胞活力的影响
取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板中,用10%NCS DMEM培养 液置37℃、5%CO2培养箱中培养24h。细胞用D-Hanks液洗1次后,换无 血清DMEM培养液,设5%与10%空白血清对照组,实验组设5%与10%YDZ 含药血清组与Nanocap-YDZ-1-4含药血清组。
培养48h后,在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中,加入终 浓度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔,继续培养4h后,小心吸取上清90μl, 再加入DMSO50μl/孔,微型振荡器上振荡5min,Sunrise遥控酶标仪测 定光吸收值,波长570nm。
表4 YDZ与Nanocap-YDZ含药血清对HepG2细胞活力的影响 n=6)
组别 剂量(mg/mL) A570 5% 10% 对照组 Nanocap-YDZ-1 Nanocap-YDZ-2 Nanocap-YDZ-3 Nanocap-YDZ-4 YDZ 30 30 30 30 30 0.320±0.013 0.299±0.016a## 0.293±0.012b### 0.296±0.017a## 0.331±0.027 0.326±0.012 0.368±0.021 0.387±0.023 0.346±0.009a# 0.355±0.028 0.352±0.026 0.378±0.028
ap<0.05 b p<0.01相对于对照组;#p<0.05 ## p<0.01 ###p<0.001相对于YDZ
表4显示,与空白血清对照组比较,在5%与10%实浓度下,YDZ含药 血清对HepG2细胞活力无抑制作用;而等载药剂量下,5%与10% Nanocap-YDZ-1-3可不同程度抑制HepG2细胞活力,其中以Nanocap-YDZ-2 作用显著(p<0.05-0.01);与YDZ含药血清组比较,5%与10% Nanocap-YDZ-1-3可显著提高YDZ细胞毒性,其中以Nanocap-YDZ-2差异 显著(p<0.05-0.001)。
2.3结论
体外实验显示,YDZ毫微囊对肝癌HepG2细胞具有抗肿瘤效应。血清 药理学研究发现,在YDZ含药血清不显示抗肿瘤作用实验浓度下,等YDZ 剂量下的YDZ毫微囊却显示出显著的抗肿瘤效应,其作用强度与毫微囊尺 寸可能有关。