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针对渐进性糖化终极产物受体（RAGE）的抗体及其用途

阅读：1083发布：2020-06-29

专利汇可以提供针对渐进性糖化终极产物受体（RAGE）的抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请涉及分离的蛋白质，特别是单克隆抗体，且特别是CDR嫁接的人源化抗体，其与RAGE蛋白质结合。具体而言，这些抗体具有抑制RAGE与其各种配体结合的能力。本申请中描述的抗体或其部分用于治疗特征在于RAGE的病理生理学配体或由RAGE的病理生理学配体诱导的疾病或病症，例如错折叠（missfotd）的蛋白质如淀粉状蛋白β和渐进性糖化终极产物。，下面是针对渐进性糖化终极产物受体（RAGE）的抗体及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种包括抗原结合结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够结合人渐进性糖化终极产物受体（RAGE）分子的表位，所述抗原结合结构域包括3个具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列的重链可变区互补性决定区（CDRs），以及3个具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列的轻链可变区CDRs。
2.根据权利要求1的抗体，其进一步包括具有SEQ ID NO：1所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：5所示序列的轻链可变结构域。
3.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是7F9抗体。
4.根据权利要求1的抗体，其进一步包括人受体构架。
5.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体包括嵌合抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、重组抗体或人抗体。
6.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体具有选自IgG、IgA、IgE、IgM和IgD的同种型。
7.根据权利要求6的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
8.根据权利要求1的抗体，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv。
9.一种分离的核酸，其编码权利要求1、2或3中任一项的抗体的氨基酸序列。
10.一种药物组合物，其包括权利要求1、2或3中任一项的抗体和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10的组合物在制备治疗哺乳动物疾病的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述药物用于治疗选自下述的神经学疾病：肌萎缩性侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱病症、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病，或用于治疗脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病。
13.权利要求12的用途，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默氏病。

说明书全文

针对渐进性糖化终极产物受体（RAGE）的抗体及其用途

[0001] 本申请是国际申请日为2009年5月8日、国际申请号为PCT/IB2009/051915、进入国家阶段的申请号为200980126432.4、发明名称为“针对渐进性糖化终极产物受体（RAGE）的抗体及其用途”的PCT申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本申请涉及抗体，特别是单克隆抗体，且特别是其CDR嫁接的人源化形式，其可以用于治疗和诊断阿尔茨海默氏病（AD）、中枢神经系统细胞变性、学习与记忆力缺损、淀粉状蛋白β的异常转运以及与渐进性糖化终极产物受体（RAGE）相关的其他神经炎性（neuroinflammatrory）状况。具体地，本发明涉及与RAGE结合的抗体及其片段。

背景技术

[0003]阿尔茨海默氏病（AD）是老年人中最频繁的痴呆原因，在超过65岁的那些群体中具有
约10％的发生率。随着年龄增加，该疾病的可能性也上升。世界上，存在受该疾病侵袭的约
1500万人，并且寿命预期中的进一步增加预期在接下来的数十年间受该疾病侵袭的人的数目增至约3倍。考虑到前述，存在关于用于AD治疗的巨大和立即的需要。用此种治疗，受侵袭的患者可能能够维持功能和活跃生活方式多年，超过如果没有此种治疗不可能的那种。
因此，对于患者及其护理者，不仅存在关于此种治疗的财务问题，还存在“生活质量”问题。

[0004] 从分子观点来看，AD的特征在于异常聚集的蛋白质的沉积。在细胞外淀粉状蛋白斑的情况下，这些沉积物主要由淀粉状蛋白-β-肽丝（Aβ）组成，并且在细胞内神经原纤维缠结（NFTs）的情况下，主要由tau蛋白质组成。AD的特征还在于增加的RAGE神经元表达。RAGE是免疫球蛋白家族的多配体（multi-ligand）受体，其起关于Aβ的信号转导细胞表面受体的作用。

[0005] 在小鼠中的Aβ40输注已通过几个组显示导致脑血管的血管收缩和脑血流量（CBF）的降低。患有AD的患者还具有减少的脑血流量。在其中转基因动物超表达蛋白质淀粉状蛋白前体蛋白质（APP）的AD小鼠模型中，所述APP导致引起斑形成的疾病，RAGE已被暗示为疾病进展中的致病因子（Deane等人Nature Medicine 9（7）第907-913页，2003；
Arancio等人EMBOJ，1-10，2004）。

[0006] RAGE已显示与Aβ-肽结合。这种相互作用的抑制阻抑转基因动物模型中的Aβ积累；因此，RAGE被认为与AD有关。用sRAGE（可溶性RAGE）以及抗RAGE抗体的治疗也已显示降低斑数目（Deane等人，2003）。通过抗体阻断RAGE与淀粉状蛋白的相互作用可以变成用于AD患者的治疗；然而，由动物血清生成的现有多克隆抗体不适合于人的长期治疗。

[0007] RAGE与Aβ的相互作用公开于WO 2006/077101 A1中，其描述了缺乏v-结构域的RAGE竞争Aβ与RAGE的结合，以及代表RAGE的C末端结构域部分，主要是C1-结构域
的肽的竞争。抗RAGE抗体与RAGE的v-结构域的相互作用公开于WO2007109749（A2）中；
其还描述了不同配体（S100b、HMGB1（高速泳动族1蛋白质）、淀粉状蛋白aβ）的结合将经由与这个结构域结合与RAGE结合。

[0008] WO 2008/137552 A2公开了与RAGE的不同结构域结合的特定单克隆抗RAGE抗体。所述抗体的大多数抑制人RAGE与HMGB1和CpG DNA的复合物的相互作用。

[0009] WO 2006/077101涉及命名为RAGE的AGER-RME和AGER-CDP的肽的鉴定、功能性和用途。所述肽尤其可应用于鉴定且制备RAGE结合配体，如抗RAGE抗体。本发明描述了与RAGE的C-结构域结合的新单克隆抗体，以及与Aβ和对于RAGE中的C1和C2-结构域
的单克隆抗体结合的特定相互作用和竞争。

发明内容

[0010]本发明提供了与RAGE特异性结合的结合分子，特别是抗体；本发明的代表性抗RAGE抗
体可以包括SEQ ID NOs：1、5、9、13、17和21中显示的至少一个抗体可变区氨基酸序列，或其个别CDRs或相关CDR序列，如下文更详细地说明的。

[0011] 具体而言，本发明提供了与RAGE结合的单克隆抗体，更具体而言与RAGE的C-结构域结合的单克隆抗体。

[0012] 在本发明中包括的是抗RAGE抗体，其与RAGE特异性结合，并且包括具有与SEQ ID NOs.：5、13和21中的任何一种至少90％等同的氨基酸序列的轻链可变区，或是所述序列中包括的抗体的RAGE结合片段。

[0013] 还包括的是抗RAGE抗体，其与RAGE特异性结合，并且包括具有与SEQ ID NOs.：1、9和17中的任何一种至少90％等同的氨基酸序列的重链可变区，或是所述序列中包括的抗体的RAGE结合片段。

[0014] 本发明的具体实施方案由几种单克隆抗体代表，所述单克隆抗体能够与RAGE的C-结构域结合，并且阻断Aβ-球聚体（globulomers）的结合。更具体而言，本发明描述了单克隆抗体11E6，其与RAGE的C-2结构域结合，不与具有用于生成多克隆抗体的氨基酸序列的肽结合，并且能够体内中和Aβ1-40对小鼠中的脑脉管系统的作用。

[0015] 本发明的抗RAGE抗体包括与RAGE的C-结构域特异性结合的抗体。

[0016] 本发明的抗RAGE抗体包括如上所述的抗RAGE抗体或RAGE结合片段，其选自嵌合抗体、CDR嫁接的或人源化的抗体、单链抗体、融合蛋白和人抗体。

[0017] 在各种实施方案中，本发明的抗体是重组抗体或单克隆抗体。本申请的特定中和抗体在本文中被称为mAb7F9、mAb11E6和mAb4E5及其功能抗体片段，并且具有与mAb7F9、mAb11E6和mAb4E5等同的性质的其他抗体和功能抗体片段，预期作为本发明的部分，所述性质例如以低解离动力学和高中和能力与RAGE的高亲和力结合。然而，本申请的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白免疫原性RAGE多肽或其片段编码的氨基酸残基，其可以通过本领域已知的任何方法进行测定。例如，结合亲和力可以通过竞争ELISAs、c RIAs、BIAcore或KinExA技术进行测量。解离速率也可以通过BIAcore或KinExA技术进行测量。结合亲和力和解离速率通过表面等离振子共振使用例如BIAcore进行测量。

[0018] 本申请的单克隆抗体之一，mAb7F9抗体，与包括重链可变区（VH区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述重链可变区包括SEQ ID NO：1；以及分别为SEQ ID NO：1的残基31-35、50-68和101-108的SEQ ID NOs. 2、3和4的序列。本发明的mAb7F9抗体与包括轻链可变区（VL区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5，以及分别为SEQ ID NO：5的残基24-34、50-56、89-97的SEQ ID NOs. 6、7和8的序列。

[0019] 本申请的另一种单克隆抗体，mAb11E6抗体，与包括重链可变区（VH区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述重链可变区包括SEQ ID NO：9；以及分别为SEQ ID NO：9的残基31-35、50-66和99-109的SEQ ID NOs. 10、11和12的序列。本发明的mAb11E6
抗体与包括轻链可变区（VL区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：13，以及分别为SEQ ID NO：13的残基24-34、50-56、89-97的SEQ ID NOs.
14、15和16的序列。mAb11E6与RAGE的C-2结构域结合，不与具有用于生成多克隆抗体的氨基酸序列的肽结合，并且能够体内中和Aβ1-40对小鼠中的脑脉管系统的作用。

[0020] 本申请的另一种单克隆抗体，mAb4E5抗体，与包括重链可变区（VH区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述重链可变区包括SEQ ID NO：17；以及分别为SEQ ID NO：17的残基31-35、50-66和99-109的SEQ ID NOs. 18、19和20的序列。本发明的mAb4E5
抗体与包括轻链可变区（VL区）的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：21，以及分别为SEQ ID NO：21的残基24-34、50-56、89-97的SEQ ID NOs.
22、23和24的序列。

[0021] 还预期与本申请的RAGE相互作用的分离的单克隆抗体可以是糖基化的结合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合部分包括一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历进一步加工，称为翻译后修饰。具体地，糖（糖基）残基可以酶促添加，称为糖基化的过程。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白质称为糖基化的蛋白或糖蛋白。蛋白质糖基化依赖于目的蛋白质的氨基酸序列，以及蛋白质在其中表达的宿主细胞。不同生物可以产生不同糖基化酶（例如，糖基转移酶和糖苷酶），并且具有可用的不同底物（核苷酸糖）。由于此种因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可能依赖于具体蛋白质在其中表达的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。

[0022] 本申请的抗体包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。此外，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。具体地，抗体包括κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基置换是本领域已知的（Winter等人美国专利号5,648,260；5,624,821）。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性（CDC）以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在一些情况下，这些效应子功能是治疗抗体所需的，但在其他情况下，可能是不需要的或甚至有害的，这依赖于治疗目的。特定人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与Fcγ Rs和补体C1q结合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体（FcRn）是决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，置换抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基，例如抗体的Fc区，从而使得改变抗体的效应子功能。
附图说明

[0023]图1A -1C 显示重组和杂交瘤衍生的抗人RAGE单克隆抗体7F9、11E6和4E5与重组人
RAGE的ELISA结合。

[0024] 图2显示通过斑点印迹结合表征单克隆抗体7F9、11E6和4E5。

[0025] 图3A - 3C显示HTRF测定结果，其显示sRAGE - Aβ-球聚体-单克隆抗体竞争。

[0026] 图4显示HTRF sRAGE - Aβ-球聚体结合。

[0027] 图5显示Aβ-球聚体与sRAGE-Fc和RAGE v-结构域的结合。

[0028] 图6A - 6C显示本发明的单克隆抗体与不同RAGE片段的ELISA结合实验。

[0029] 图7A – 7C显示本发明的单克隆抗体与不同RAGE片段的ELISA结合实验。

[0030] 图8a – 8f显示通过不同剂量的Aβ1-40诱导的脑血流量改变。

[0031] 图9a – 9c显示11E6在Aβ1-40诱导的脑血流量中的改变中的作用。

[0032] 图10显示在用不同剂量的11E6或对照抗体处理的老年Tg2576小鼠中观察到的脑血流量改变。

[0033] 图11显示抗体11E6保护海马神经元免于Aβ诱导的发动蛋白切割。上图：显示代表来自单次实验的重复实验条件的样品，并且在上方指出处理浓度（以µM表示）。不添加Aβ的细胞显示大部分完整的（～100 kDa）发动蛋白I信号（第一个条），其在用5µM Aß处理的细胞中减少且逆转至～90kDa切割产物（第二个条）。抗体11E6处理（第三个条）阻止切割，而Ig1对照抗体（第四个条）无显著保护作用。下图：3次独立实验的发动蛋白信号的定量（在针对0µM Aß处理标准化后，表示为%发动蛋白+/- SEM）揭示11E6的统计学上显著的保护作用（单因素方差分析（One-way ANOVA），Kruskal Wallis检验随后为Dunns检验；*指出p<0,05）
图12显示在大鼠海马切片培养中11E6（A）或对照抗体（B）对球聚体诱导的突触传递
强阻抑的影响。0.1 µM 11E6完全逆转球聚体诱导的缺陷（参见（A））。

[0034] 图13显示用抗体11E6的12周处理对Tg2576小鼠中的淀粉状蛋白斑沉积的作用。显示在11E6或IgG1对照抗体处理（n=19/组）后，如通过用抗Aβ抗体6G1标记检测的，由斑覆盖的面积（A,B）和斑数目（C,D）。用11E6处理使新皮质中由沉积物覆盖的面积和沉积物数目分别减少24.5％（A）和26.8％（C）。统计学分析揭示强趋势（括号中的星号，p<0.06；
Mann-Whitney U检验）。减少在额皮质中是统计学上显著的（星号，p<0.05；Mann-Whitney U检验），其中在11E6处理后，沉积物面积减少23.5％（B），并且其数目减少26.8％（D）。

[0035] 序列表SEQ ID NO：1：mAb VH 7F9的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：mAb VH 7F9 CDR-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：mAb VH 7F9 CDR-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO：4：mAb VH 7F9 CDR-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO：5：mAb VL 7F9的氨基酸序列
SEQ ID NO：6：mAb VL 7F9 CDR-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO：7：mAb VL 7F9 CDR-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO：8：mAb VL 7F9 CDR-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO：9：mAb VH 11E6的氨基酸序列
SEQ ID NO：10：mAb VH 11E6 CDR-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO：11：mAb VH 11E6 CDR-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO：12：mAb VH 11E6 CDR-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO：13：mAb VL 11E6的氨基酸序列
SEQ ID NO：14：mAb VL 11E6 CDR-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO：15：mAb VL 11E6 CDR-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO：16：mAb VL 11E6 CDR-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO：17：mAb VH 4E5的氨基酸序列
SEQ ID NO：18：mAb VH 4E5 CDR-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO：19：mAb VH 4E5 CDR-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO：20：mAb VH 4E5 CDR-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO：21：mAb VL 4E5的氨基酸序列
SEQ ID NO：22：mAb VL 4E5 CDR-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO：23：mAb VL 4E5 CDR-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO：24：mAb VL 4E5 CDR-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO：25：人Igγ1重链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO：26：人Igκ轻链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO：27：编码OmpA-[RAGE（23-340）]-6His的构建体#1（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：28：编码6His-（Thr）-[RAGE（24-129）]的构建体#2（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：29：编码6His-（Thr）-[RAGE（24-234）]的构建体#3（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：30：编码6His-（Thr）-[RAGE（24-336）]的构建体#4（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：31：编码6His-（Thr）-[RAGE（130-234）]的构建体#5（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：32：编码6His-（Thr）-[RAGE（130-336）]的构建体#6（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：33：编码6His-（Thr）-[RAGE（235-336）]的构建体#7（粗体）的全长质粒核苷酸序列
SEQ ID NO：34：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#1
SEQ ID NO：35：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#2
SEQ ID NO：36：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#3
SEQ ID NO：37：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#4
SEQ ID NO：38：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#5
SEQ ID NO：39：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#6
SEQ ID NO：40：编码的氨基酸序列RAGE蛋白质#7
SEQ ID NO:41：Igγ-1恒定区突变氨基酸序列
SEQ ID NO:42：Igγ-2恒定区氨基酸序列
SEQ ID NO:43：构架氨基酸序列VH7-4.1/JH6 FR1
SEQ ID NO:44：构架氨基酸序列VH7-4.1/JH6 FR2和VH1-2/JH6 FR2
SEQ ID NO:45：构架氨基酸序列VH7-4.1/JH6 FR3
SEQ ID NO:46：构架氨基酸序列VH7-4.1/JH6 FR4和VH1-2/JH6 FR4
SEQ ID NO:47：构架氨基酸序列VH1-2/JH6 FR1
SEQ ID NO:48：构架氨基酸序列VH1-2/JH6 FR3
SEQ ID NO:49：构架氨基酸序列1-12/L5/JK2 FR1
SEQ ID NO:50：构架氨基酸序列1-12/L5/JK2 FR2
SEQ ID NO:51：构架氨基酸序列1-12/L5/JK2 FR3
SEQ ID NO:52：构架氨基酸序列1-12/L5/JK2 FR4和3-15/L2/JK2 FR4
SEQ ID NO:53：构架氨基酸序列3-15/L2/JK2 FR1
SEQ ID NO:54：构架氨基酸序列3-15/L2/JK2 FR2
SEQ ID NO:55：构架氨基酸序列3-15/L2/JK2 FR3
SEQ ID NO:56：CDR嫁接的氨基酸序列VH 11E6.1-GL
SEQ ID NO:57：CDR嫁接的氨基酸序列VH 11E6.2-GL
SEQ ID NO:58：CDR嫁接的氨基酸序列VL 11E6.1-GL
SEQ ID NO:59：CDR嫁接的氨基酸序列VL 11E6.2-GL
SEQ ID NO：60：hRAGE的氨基酸序列
SEQ ID NO：61：husRAGE片段的氨基酸序列
SEQ ID NO：62：人源化抗体序列VH h11E6.1
SEQ ID NO：63：人源化抗体序列VL h11E6.1
SEQ ID NO：64：人源化抗体序列VL h11E6.2
SEQ ID NO：65：人源化抗体序列VL h11E6.3
SEQ ID NO：66：人源化抗体序列VL h11E6.4
SEQ ID NO：67：人源化抗体序列VH h11E6.5
SEQ ID NO：68：人源化抗体序列VH h11E6.9
SEQ ID NO：69：人源化抗体序列VH h11E6.16
SEQ ID NO:70：RAGE衍生的肽NtermR31的氨基酸序列
SEQ ID NO:71：RAGE衍生的肽1的氨基酸序列
SEQ ID NO:72：RAGE衍生的肽2的氨基酸序列
SEQ ID NO:73：RAGE衍生的肽3的氨基酸序列
SEQ ID NO:74：RAGE衍生的肽4的氨基酸序列
SEQ ID NO:75：RAGE衍生的肽5的氨基酸序列
SEQ ID NO:76：RAGE衍生的肽6的氨基酸序列
SEQ ID NO:77：RAGE衍生的肽7的氨基酸序列
SEQ ID NO:78：RAGE衍生的肽8的氨基酸序列
SEQ ID NO:79：RAGE衍生的肽9的氨基酸序列
SEQ ID NO:80：RAGE衍生的肽10的氨基酸序列
SEQ ID NO:81：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:82：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:83：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:84：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:85：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:86：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:87：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:88：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:89：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:90：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:91：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:92：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:93：寡核苷酸引物的核苷酸序列
SEQ ID NO:94：寡核苷酸引物的核苷酸序列
详述
1. 一般定义
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人
员通常理解的含义。术语的含义和范围应是清楚的，然而，在任何潜在含糊的情况下，本文提供的定义优于任何词典或外部定义。另外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。此外，术语例如“元件”或“组分”包含包括一个单位的元件和组分，以及包括超过一个亚单位的元件和组分，除非另有具体说明。

[0036] 一般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的名称及其技术是本领域众所周知且通常使用的那些。本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论，除非另有说明。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常实现的或如本文描述的。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的名称及其实验室程序和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗。

[0037] 为了本发明可以更容易理解，下文定义了所选择的术语。

[0038] 如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，并且也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。

[0039] 术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其起源或衍生来源不与在其天然状态下伴随其的天然结合的组分结合的蛋白质或多肽；基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在与它天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将与其天然结合的组分“分离”。蛋白质也可以通过分离致使基本上不含天然结合的组分，其中使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。

[0040] 如本文使用的，术语“回收”指通过分离致使化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程，例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。

[0041] 术语“渐进性糖化终极产物受体（RAGE）”指定免疫球蛋白家族中的多配体受体，其尤其结合可溶性Aβ肽、S100b和HMGB1（也称为两性蛋白（amphoterin））。RAGE介导响应与这些配体结合的病理生理学相关的细胞改变。超表达RAGE和人APP的转基因动物显示空间学习与记忆中的早期异常，从而指出RAGE是在阿尔茨海默型病理学中关于Aβ诱导的神经元扰动的辅因子，并且暗示RAGE是改善细胞功能障碍的潜在治疗靶。

[0042] RAGE的结构尚未得到解决。与其他蛋白质的同源性导致其中RAGE具有几个结构域的模型。这些结构域与免疫球蛋白类似命名：（i）在N末端上的V样结构域：在免疫球蛋白中的这个等价结构域结合抗原，并且代表在这些蛋白质内的唯一结合区。在RAGE中，这个结构域与一些配体如S100结合（Ostendorp等人EMBOJ. 26,3875,2007；Leclerc等人JBC 282,31317,2007）。与RAGE中的v样结构域结合的单克隆抗体竞争不同配体S100b、HMGB1和淀粉状蛋白β的结合（WO2007109749（A2）），从而暗示这些配体也将经由这个相同结构域与RAGE结合。（ii）第一个C2样结构域：在RAGE内的2个结构域与免疫球蛋白的C2结构域具有同源性；这些结构域之一已被称为C1（也由Ostendorp等人BBRC 2006使用的名称）。与这个结构域结合的几个配体已得到描述，例如S100A12（也被称为ENRAGE或钙粒蛋白C），其以Kd = 90 nM的亲和力结合（Hofmann等人Cell 97，889，1999；Xie等人JBC，282，4218，2007）。Aβ与S100A12竞争这个结构域，从而暗示Aβ也与C1-结构域结合。（iii）第二个C2样结构域：这个结构域被称为C2（也由Ostendorp等人BBRC 2006使用）。RAGE配体S100A6与C2结构域结合，并且针对来自C2结构域的肽生成的抗体显示关于这种结合与S100A6竞争；该抗体导致SH-SY5Y中减少的信号转导（Leclerc等人JBC
282,31317,2007）。

[0043] “RAGE结构域”可以与现有技术中提供的不同定义一致进行定义。

[0044] 根据Xie等人2007，J. Biol. Chem.，第282卷:4218-4231，h RAGE结构域的下述定义适用：- V结构域（SEQ ID NO：60的氨基酸24-129），
- C1结构域（SEQ ID NO:60的氨基酸130-234），
- C2结构域（SEQ ID NO:60的氨基酸235-336），
根据由Hudson等人，The FASEB Journal. 2008；22:1572-1580的更近期定义，h RAGE（根据SEQ ID NO:60的404个氨基酸残基）具有由下述组成的细胞外区域（SEQ ID NO:60的氨基酸1–342）
- 信号肽（SEQ ID NO:60的氨基酸1–22），随后为3个免疫球蛋白样结构域，包括
- Ig样V型结构域（SEQ ID NO:60的氨基酸23–116）和
- 2个Ig样C2型1/2结构域（SEQ ID NO:60的氨基酸124–221；也指定为C1结构
域；和SEQ ID NO:60的氨基酸227–317，也指定为C2结构域）；
- 单个跨膜结构域（SEQ ID NO:60的氨基酸343–363），
和
- 短胞质尾区（SEQ ID NO:60的氨基酸364–404）。

[0045] 鉴于高度同一性，特别就结构域V、C1和C2的定义而言，并且除非另有说明，可以应用定义中的每一种，以限定本发明的结合蛋白的结合特征。

[0046] 如上所述，RAGE能够经由不同结构域结合不同配体。来自与其他配体的竞争实验的结果看起来指出Aβ与C1-结构域结合（Hofmann等人Cell 97，889，1999或Xie等人JBC，282，4218，2007）。作为RAGE配体的非限制性例子，可以提及：
- 渐进性糖化终极产物（AGEs）,（Baynes J.W.，1991，Diabetes. 1991，40:405-412；
Ahmed K.A.，2007，J Clin Biochem Nutr. 41（2）:97-105）；
- S100/钙粒蛋白家族的成员（例如，钙粒蛋白C（也称为ENRAGE和S100A12）、
S100A1、S100A4、S100A11、S100A13、S100B和S100P）；
- 淀粉状蛋白-ß-肽（Aß），如例如Aß 1-40肽
- 淀粉状蛋白-ß球聚体；如例如Aß1-42、Aß12-42、 Aß20-42球聚体（参见Barghorn等人，球形淀粉状蛋白ß 肽1-42寡聚体– 阿尔茨海默氏病中同质和稳定的神经病理学蛋白质）Journal of Neurochemistry. 95（3）:834-847，November 2005；WO2007/062852；
WO2008/150949；全部引入本文作为参考）；
- 白细胞（eukocyte）整联蛋白（例如，Mac-1）
如本文使用的，术语“RAGE”特指人RAGE，也指定为“hRAGE”或“huRAGE”。除非另有说明，术语“RAGE”也包括从不同于人的其他物种如例如啮齿类动物如小鼠或大鼠中分离或获得的RAGE分子；或牛RAGE分子。

[0047] 术语“sRAGE”指衍生自RAGE的细胞外结构域的可溶形式RAGE。例如，衍生自人RAGE的sRAGE分子，也指定为husRAGE，包括人RAGE（参见SEQ ID NO：60）的氨基酸残基1 – 331（参见SEQ ID NO：61）。

[0048] 如本文使用的，“生物学活性”指如本文定义的RAGE的所有固有生物学性质。

[0049] 如本文使用的，关于抗体、蛋白质或肽与第二个化学种类的相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”意指相互作用依赖于在化学种类上的特定结构（例如，如下文定义的“抗原决定簇”或“表位”）的存在；例如，抗体识别且结合特定蛋白质结构，而不是普遍地与蛋白质结合。如果抗体对于表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中包含表位A（或游离的、未标记的A）的分子的存在，将减少与抗体结合的标记的A的量。

[0050] 如本文使用的，术语“抗体”泛指包含4条多肽链――2条重（H）链和2条轻（L）链的任何免疫球蛋白（Ig）分子，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生，其保留Ig分子的基本表位结合特征。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。它的非限制性实施方案在下文讨论。抗体被说成“能够结合”分子，如果它能够与分子特异性反应，从而使分子与抗体结合的话。

[0051] 如本文使用的，“单克隆抗体”意指抗体分子的制剂，其共享共同的重链和共同的轻链氨基酸序列，与包含不同抗体的混合物的“多克隆”抗体制剂形成对比。单克隆抗体可以通过几种新技术如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及由杂交瘤衍生的抗体例示的经典方法（例如，通过由杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，例如标准Kohler和Milstein杂交瘤方法（（1975）Nature 256:495-497）生成。

[0052] 在全长抗体中，每条重链由重链可变区（本文缩写为HCVR或VH）和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域――CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区（本文缩写为LCVR或VL）和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域――CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区（CDR）的高变区，由称为构架区（FR）的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：
FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如，IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG 4、IgA1和IgA2）或亚类。

[0053] 如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”（或简单地“抗体部分”或“抗体片段”）指抗体的一种或多种片段，其保留与抗原（例如，RAGE）特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性（dual specific）或多特异性形式；与2种或更多种不同抗原特异性结合。术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段例子包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab'）2片段，包括由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）包括单个可变结构域的dAb片段（引入本文作为参考的Ward等人,（1989）Nature341:544-546，Winter等人，PCT公开WO 90/05144 A1）；和（vi）分离的互补性决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science242:423-426；和Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883）。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位（参见例如，Holliger，P.等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448；Poljak，R.J.等人（1994）Structure2:1121-1123）。此种抗原结合部分是本领域已知的（Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering（2001）Springer-Verlag. New York. 第790页（ISBN 3-540-41354-5）。

[0054] 如本文使用的，术语“抗体构建体”指包括与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本发明的一个或多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包括通过肽键连接的2个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的（参见例如，Holliger，P.等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448；Poljak，R.J.等人（1994）Structure2:1121-1123）。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的并且在表1中表示。

[0055] 表1：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其
他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附（immunoadhesion）分子的部
分。此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov，S.M.等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101），以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用，以制备二价和生物素化scFv分子（Kipriyanov，S.M.等人（1994）Mol. Immunol. 31:1047-1058）。抗体部分例如Fab和F（ab'）2片段可以使用常规技术由全抗体制备，例如全抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。

[0056] 如本文使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体（例如，特异性结合人RAGE的分离的抗体基本上不含特异性结合除人RAGE外的抗原的抗体）。然而，特异性结合人RAGE的分离的抗体可以与其他抗原例如来自其他物种的RAGE分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。

[0057] 如本文使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变），例如，在CDRs且特别是CDR3中。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。

[0058] 如本文使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体（下文进一步描述），从重组、组合人抗体文库中分离的抗体（Hoogenboom H.R.,（1997）TIB Tech. 15:62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,（2002）Clin. Biochem. 35:425-445；
Gavilondo J.V.和Larrick J.W.（2002）BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.和Chames P.（2000）Immunology Today 21:371-378），从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如，Taylor，L. D.等人（1992）Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Kellermann S-A. 和 Green L.L.（2002）Current Opinion in Biotechnology 13:593-597；Little M.等人（2000）Immunology Today 21:364-370），或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法包括人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变（或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其衍生自人种系VH和VL序列且与其相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系谱内。

[0059] 术语“嵌合抗体”指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。嵌合抗体可以通过重组分子生物学技术产生，或可以物理地缀合在一起。

[0060] 术语“CDR嫁接的抗体”指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列置换为另一个物种的CDR序列，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs（例如，CDR3）已置换为人CDR序列。

[0061] 术语“Kabat编号”、“ Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指对在抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变（即，高变）的氨基酸残基编号的系统（Kabat等人（1971）Ann. NY Acad，Sci.190:382-391，和Kabat，E.A.等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242）。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31到35，对于CDR2为氨基酸位置50到65，且对于CDR3为氨基酸位置95到102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24到34，对于CDR2为氨基酸位置50到56，且对于CDR3为氨基酸位置89到
97。

[0062] 如本文使用的，术语“受体”和“受体抗体”指提供或编码构架区中一个或多个的至少50、55、60、65、70、75或80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另外一个实施方案中，术语“受体”指提供或编码构架区和一个或多个恒定区中的一个或多个的抗体氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，术语“受体”指人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码构架区中一个或多个的至少50、55、60、65、70、75或80％，特别地，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列。
按照这个实施方案，受体可以包含在人抗体的一个或多个特定位置上不存在的至少1、至少
2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体（例如，本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或商购可得的抗体）。

[0063] 如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的可变区的每一个中存在3个CDRs，其对于可变区的每一个指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中存在的一组3个CDRs。这些CDRs的确切边界已根据不同系统进行不同定义。由Kabat描述的系统（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health，Bethesda，Md.（1987）和（1991））不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。
Chothia和同事（Chothia &Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917（1987）和Chothia等人，Nature 342:877-883（1989））发现在Kabat CDRs内的特定亚部分采用几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性。这些亚部分指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDRs，其具有与Kabat CDRs重叠的边界。限定与Kabat CDRs重叠的CDRs的其他边界已由Padlan（FASEB J. 9:133-139（1995））和MacCallum（J Mol Biol 262（5）:732-45（1996））描述。另外其他的CDR边界定义可能不严格遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管它们可以按照下述预测或实验发现进行缩短或延长：特定残基或残基组或甚至整个CDRs不显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种定义的CDRs，尽管具体实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDRs。

[0064] 如本文使用的，术语“规范（canonical）”残基指限定如由Chothia等人（J. Mol. Biol. 196:901-907（1987）；Chothia等人，J. Mol. Biol. 227:799（1992），两者都引入本文作为参考）定义的特定规范CDR结构的CDR或构架中的残基。根据Chothia等人，许多抗体的CDRs的关键部分具有几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上的很大多样性。每个规范结构主要指定关于形成环的氨基酸残基邻接区段的一组肽主链扭角。

[0065] 如本文使用的，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的抗体。在具体实施方案中，供体抗体是来自与构架区由其获得或衍生的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的背景中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的非人抗体。

[0066] 如本文使用的，术语“构架”或“构架序列”指可变区减去CDRs的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以通过不同系统进行确定，所以对构架序列的含义实施相应不同解释。6个CDRs（轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3）也将在轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区（FR1、FR2、FR3和FR4），其中CDRs位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。未将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如由其他人提及的，构架区代表在单条天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR's。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，并且FRs代表构成构架区的
4个亚区中的2个或更多个。

[0067] 人重链和轻链受体序列是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链受体序列选自表2和表3中所述的序列。关于人构架序列FR1 - FR4的不同组合在所述表中阐述。

[0068] 表2：人重链受体序列表3：人轻链受体序列
如本文使用的，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指通过非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变的成熟过程。（参见例如，Shapiro等人，Crit. Rev. Immunol. 22（3）：183-200（2002）；
Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol. 484:13-30（2001））。由本发明的各种实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当在那个物种中在治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。

[0069] 如本文使用的，术语“关键”残基指在可变区内的特定残基，其对抗体特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响。关键残基包括但不限于下述中的一个或多个：与CDR相邻的残基、潜在糖基化位点（可以是N或O-糖基化位点）、稀有残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、在Vernier区带内的残基、和在可变重链CDR1的Chothia定义和第一个重链构架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。

[0070] 术语“人源化抗体”一般指包括来自非人物种（例如，小鼠）的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL序列的至少部分已改变成更“人样”，即与人种系可变序列更相似。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列内，以置换相应的非人CDR序列。

[0071] 具体地，如本文使用的，术语“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，并且包括基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架（FR）区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区（CDR）。如本文使用的，在CDR背景中的术语“基本上”指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少50、55、60、65、70、75或80％，特别是至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％等同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包括至少一个且一般2个可变结构域（Fab、Fab'、F（ab'）2、FabC、Fv）的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区与非人免疫球蛋白（即，供体抗体）的那些对应，并且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。具体地，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少部分，一般是人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体仅包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。

[0072] 人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgY、IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括但不限于IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包括来自超过一个类别或同种型的序列，并且可以选择特别的恒定结构域，以使用本领域众所周知的技术最优化所需效应子功能。

[0073] 人源化抗体的构架和CDR区无需与亲本序列精确对应，例如供体抗体CDR或共有构架可以通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失进行诱变，从而使得在那个位点上的CDR或构架残基与供体抗体或共有构架不对应。然而，在具体实施方案中，此种突变将不是广泛的。通常，至少50、55、60、65、70、75或80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，并且特别地至少95％人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的那些对应。如本文使用的，术语“共有构架”指共有免疫球蛋白序列中的构架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见例如，Winnaker，From Genes to Clones（Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany
1987）。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由在家族中在那个位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果2个氨基酸同样频繁出现，那么任何一个都可以包括在共有序列中。

[0074] 如本文使用的，“Vernier”区带指构架残基亚群，其可以调整CDR结构且精调与抗原的拟合，如由Foote和Winter描述的（1992，J. Mol. Biol. 224:487-499，这引入本文作为参考）。Vernier区带残基形成在CDRs下的层，并且可以影响CDRs的结构和抗体的亲和力。

[0075] 如本文使用的，术语RAGE与其配体之一的“结合的抑制”包含所述配体结合活性的部分（如例如约1 - 10％或更多，特别是约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％或更多）或完全减少。所述“结合的抑制”可以通过本领域可用的任何合适方法进行测定，优选通过如本文例示的任何方法，如例如本文描述的HTRF测定。

[0076] 如本文使用的，术语“中和”指当结合蛋白特异性结合靶蛋白质时，靶蛋白质的生物学活性的中和。中和可以是所述结合蛋白与靶结合的不同方法的结果。例如，中和可以通过靶区域中的结合蛋白结合引起，其不影响与靶分子的受体结合。可替代地，结合蛋白的结合可能导致受体与靶结合的阻断，所述阻断最终中和靶蛋白质活性。所述不同机制的每一种可以根据本发明发生。

[0077] 具体地，中和结合蛋白是中和抗体，其与RAGE的结合导致RAGE生物学活性的中和。具体地，中和结合蛋白结合RAGE，并且使RAGE的生物学活性减少至少约1 - 10％，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或更多。通过中和结合蛋白的RAGE生物学活性中和可以通过测量本领域众所周知和/或实验部分中例示的RAGE生物学活性的一种或多种指示物进行评估，如具体在实施例5、6、10和16 - 19中。例如，中和RAGE中和RAGE与Aβ-球聚体的结合，如下文实施例5和6中测量的。

[0078] 在动物模型中在体内测定的“可溶性Aβ1-40肽诱导的脑血容量减少的抑制”涉及部分或完全抑制，如例如至少约1 - 10％，至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或更多，如果与未处理的对照比较，或具体地，如果与阴性、单克隆或多克隆、免疫球蛋白同种型对照比较的话。

[0079] 如在超表达人APP的动物模型中在体内“脑血容量的改善”涉及CBV统计学上显著的改善，如果与未处理的对照比较，或具体地，如果与阴性、单克隆或多克隆、免疫球蛋白同种型对照比较的话。

[0080] 如在超表达人APP的动物模型中在体内测量的“淀粉状蛋白斑数目和/或淀粉状蛋白斑面积的减少”涉及部分或完全减少，如例如至少约1 - 10％，至少约15％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或更多，如果与未处理的对照比较，或具体地，如果与阴性、单克隆或多克隆、免疫球蛋白同种型对照比较的话。

[0081] 在体外“聚集的Aβ1-40肽诱导的海马神经元发动蛋白切割的抑制”涉及部分或完全抑制，如例如至少约1 - 10％，至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或更多，如果与未处理的对照比较，或具体地，如果与阴性、单克隆或多克隆、免疫球蛋白同种型对照比较的话。

[0082] 在体外“Aβ1-42球聚体诱导的突触传递减少的逆转”涉及部分或完全逆转，如例如至少约1 - 10％，至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或更多，如果与未处理的对照比较，或具体地，如果与阴性、单克隆或多克隆、免疫球蛋白同种型对照比较的话。

[0083] 如本文使用的，“中和单克隆抗体”意指抗体分子的制剂，其在与特定抗原结合后能够竞争且抑制所述抗原的天然配体的结合。在本申请的具体实施方案中，本发明的中和抗体能够与RAGE竞争与其配体中的至少一种结合，具体是选自Aβ肽、Aβ球聚体、S100b和两性蛋白的配体，并且阻止RAGE生物学活性或功能。

[0084] 术语“活性”包括活性，例如对于抗原的抗体例如与RAGE抗原结合的抗RAGE抗体的结合特异性/亲和力，和/或抗体例如与RAGE的结合中和RAGE的生物学活性的抗RAGE抗体的中和能力。

[0085] RAGE的“生物学功能”或“活性”可以描述为关于Aβ的信号转导细胞表面受体或介导蛋白质转运到细胞内或通过细胞的受体的那种。

[0086] 术语“表位”或“抗原决定簇”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在特定实施方案中，表位决定簇包括分子的化学上活性的表面定组（grouping），所述分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在特定实施方案中，可以具有特定三维结构特征，或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在特定实施方案中，当抗体优先识别在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。

[0087] 如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象，其通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变实现，例如使用BIAcore系统（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典和Piscataway，NJ）。关于进一步描述，参见Jönsson，U.等人（1993）Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jönsson，U.等人（1991）Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.等人（1995）J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnnson，B.等人（1991）Anal. Biochem. 198:268-277。

[0088] 如本文使用的，术语“kon”意指关于抗体与抗原结合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数，如本领域已知的。

[0089] 如本文使用的，术语“koff”意指关于抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数，如本领域已知的。

[0090] 如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，如本领域已知的。

[0091] 如本文使用的，术语“标记的结合蛋白”指具有掺入的标记的蛋白质，所述标记提供用于鉴定结合蛋白。具体地，标记是可检测标记，例如放射性标记的氨基酸的掺入或使生物素化（biotinyl）部分与多肽附着，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白检测（例如，包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白）。3 14 35
用于多肽的标记的例子包括但不限于，下述：放射性同位素或放射性核素（例如，H、C、S、
90 99 111 125 131 177 166 153
Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho或 Sm）；荧光标记（例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体）、酶促标记（例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位）；和磁性试剂，例如钆螯合物。

[0092] 术语“抗体缀合物”指与第二化学部分例如治疗或细胞毒性剂化学连接的结合蛋白，例如抗体。术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。具体地，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷（tenoposide）、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

[0093] 如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，其不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子（例如蛋白质，例如抗体），或分子组合（assemblies）（例如抗原/抗体复合物）组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。在符合给定的、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位的重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有三个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，2nd ea.，第20 1-16页，Oxford University Press，New York，New York,（1999）."
如本文提及的，术语“多核苷酸”意指2个或更多个核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸、或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA，但特别是双链DNA。

[0094] 如本文使用的，术语“分离的多核苷酸”应意指这样的多核苷酸（例如，基因组的、cDNA或合成来源的，或其一些组合），由于其来源，“分离的多核苷酸”：不与在自然界中“分离的多核苷酸”与之一起发现的多核苷酸的全部或部分结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界不作为较大序列的部分存在。

[0095] 如本文使用的，术语“载体”意指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。特定载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如，非附加型哺乳动物载体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因组一起复制。此外，特定载体能够指导它与之可操作地连接的基因的表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”（或简单地，“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意欲包括此种其他形式的表达载体，例如病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒），其提供等价功能。

[0096] 术语“可操作地连接”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以此种方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下达到。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的，术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即，Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；以及需要时，增强蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲包括其存在对于表达和加工必需的组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

[0097] 如本文定义的，“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。

[0098] 如本文使用的，术语“重组宿主细胞”（或简单地“宿主细胞”）意指外源DNA已引入其内的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响，可能在随后世代中发生特定修饰，所以此种后代事实上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。具体地宿主细胞包括选自生物界中的任何一种的原核和真核细胞。特定真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。具体地宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌（E. coli）；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

[0099] 标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化（例如，电穿孔、脂质转染）。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文描述的执行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论。参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989）），其为了任何目的引入本文作为参考。

[0100] 如本领域已知且如本文使用的，“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物（或生物祖先）内的转基因表达在生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中所编码的基因产物的表达。

[0101] 术语“调节”和“调谐”可互换使用，并且如本文使用的，指目的分子活性（例如，RAGE的生物学活性）中的变化或改变。调谐可以是目的分子的特定活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于结合特征、酶促活性、细胞受体激活和信号转导。

[0102] 相应地，如本文使用的，术语“调节剂”是能够改造或改变目的分子的活性或功能（例如，RAGE的生物学活性）的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子的特定活性或功能量级中的增加或减少。

[0103] 如本文使用的，术语“激动剂”指这样的调节剂，当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，其引起分子的特定活性或功能量级中的增加。具体的目的激动剂可以包括但不限于RAGE多肽或多肽、核酸、碳水化合物或与RAGE结合的任何其他分子。

[0104] 如本文使用的，术语“拮抗剂”指这样的调节剂，当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，其引起分子的特定活性或功能量级中的减少。示例性拮抗剂包括但不限于蛋白质、肽、抗体、肽抗体（peptibodies）、碳水化合物或小有机分子。肽抗体在例如WO01/83525中描述。

[0105] 特定目的拮抗剂包括阻断或调节RAGE的生物学或免疫学活性的那些。RAGE的拮抗剂可以包括但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物或与RAGE结合的任何其他分子，特别是与RAGE分子相互作用的单克隆抗体。应当指出与RAGE的相互作用可以导致其他配体/细胞膜组分的结合和中和，并且可以对于针对多重疾病的加性或协同功能有用。

[0106] 如本文使用的，术语“有效量”指治疗的量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，阻止病症的进展，引起病症的消退，阻止与病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种治疗（例如，预防或治疗剂）的一种或多种预防或治疗作用。

[0107] 如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于来自生物（living thing）或以前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、犬、兔和其他动物。此种物质包括但不限于血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

[0108] 2. 具体实施方案本发明的具体实施方案在下文列出：
-7 -2 -1
1. 分离的结合蛋白，其以1 x 10 M或更少的KD和1 x 10 s 或更少的koff速率常
数与人RAGE解离，两者都通过表面等离振子共振测定。

[0109] 2. i）实施方案1的结合蛋白，其与人RAGE结合，并且调节特别是抑制RAGE与其配体中的至少一种结合的能力，如在标准体外测定中测定的，如例如HTRF测定，如例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例4和5，和其中引用的参考文献。

[0110] ii）实施方案1的结合蛋白，其能够抑制RAGE介导的生物学活性。

[0111] iii）结合蛋白，特别是根据前述实施方案之一的，具有下述生物学活性中的至少一种：a. 在动物模型如C57BL/6雌性小鼠中在体内可溶性Aβ1-40肽诱导的脑血容量（CBV）
减少的抑制，如例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例10和其中引用的参考文献；
b. 在超表达人APP的动物模型如转基因Tg2576小鼠模型中在体内脑血容量的改善，
如例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例16和其中引用的参考文献；
c. 在超表达人APP的动物模型如转基因Tg2576小鼠模型中在体内淀粉状蛋白斑数目
和/或淀粉状蛋白斑面积的减少，如例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例19和其中引用的参考文献；
d. 在体外聚集的Aβ1-40肽诱导的海马神经元如得自胚胎大鼠的海马神经元发动蛋
白切割的抑制，如例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例17和其中引用的参考文献；
e. 在海马切片培养中测定的，在体外Aβ1-42球聚体诱导的突触传递减少的逆转，如
例如在实验部分中更详细描述的，特别是实施例18和其中引用的参考文献。

[0112] 3. 实施方案1或2的结合蛋白，其中所述配体选自Aβ肽、Aβ-球聚体、S100b和两性蛋白。

[0113] 4. 前述实施方案之一的结合蛋白，其是中和结合蛋白。

[0114] 5. 前述实施方案之一的结合蛋白，其能够阻断特别是抑制Aβ球聚体与人RAGE的结合。

[0115] 6. 前述实施方案之一的结合蛋白，其中所述其中所述Aβ球聚体是Aβ1-42。

[0116] 7. 前述实施方案之一的结合蛋白，其中所述结合蛋白与人RAGE的C1-和/或C2-结构域的至少一个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基相互作用。

[0117] 8. 根据前述实施方案之一的结合蛋白，其是人源化抗体。

[0118] 9. 根据前述实施方案之一的结合蛋白，其包括抗原结合结构域，所述结合蛋白能够结合人RAGE分子的表位，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR由SEQ ID NO.：4、12和20组成的氨基酸序列的CDR-H3组；和与所述序列之一具有至
少50％，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列；
由SEQ ID NO.：8、16和24组成的氨基酸序列的CDR-L3组；和与所述序列之一具有至
少50％，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

[0119] 10. 包括抗原结合结构域的结合蛋白，所述结合蛋白能够结合人RAGE分子的表位，所述抗原结合结构域包括包含选自下述的氨基酸序列的至少一个CDR：由SEQ ID NO.：4、12和20组成的氨基酸序列的CDR-H3组；和与所述序列之一具有至
少50％，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列；
由SEQ ID NO.：8、16和24组成的氨基酸序列的CDR-L3组；和与所述序列之一具有至
少50％，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

[0120] 11. 根据前述实施方案之一的结合蛋白，其进一步包括至少一个CDR，所述至少一个CDR包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、10、18组成的CDR-H1组；或选自由SEQ ID NO：3、11、19组成的CDR-H2组；或选自由SEQ ID NO：6、14、22组成的CDR-L1组；或选自由SEQ ID NO：7、15、23组成的CDR-L2组；和与所述序列之一具有至少50％，如例如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

[0121] 12. 根据前述实施方案任一个的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：13. 根据实施方案12的结合蛋白，其包括至少3个CDRs，所述至少3个CDRs选自由下
述组成的可变结构域CDR组：
或可变结构域组，其中所述3个CDRs中的至少一个是与亲本序列具有至少50％，如例
如至少55、60、65、70、75、80、85、90、95 ％同一性的序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。

[0122] 14. 根据实施方案13的结合蛋白，其包括至少2个可变结构域CDR组。

[0123] 15. 根据实施方案14的结合蛋白，其中所述至少2个可变结构域CDR组选自下述：
VH 7F9组和VL 7F9组；
VH 4E5组和VL 4E5和
VH 11E6组和VL 11E6组。

[0124] 16. 根据前述实施方案之一的结合蛋白，其进一步包括人受体构架。

[0125] 17. 根据实施方案16的结合蛋白，其中所述人受体构架包括选自SEQ ID NO：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53 54和55的至少一个氨基酸序列。

[0126] 18. 前述实施方案任一个的结合蛋白，其包括选自SEQ ID NO：56和57的至少一个重链可变结构域；和/或选自SEQ ID NO：58和59的至少一个轻链可变结构域。

[0127] 19. 实施方案18的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NOs：56和58 ；56和59 ；
SEQ ID NOs：.57和58 ；57和59。

[0128] 20. 根据实施方案16 – 19中任何一个的结合蛋白，其中所述人受体构架包括在关键残基上的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：与CDR相邻的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与RAGE表位相互作用的残基；
能够与CDR相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区带内的残基；
能够进行副谷氨酸（para-glutamate）形成的N末端残基；和
和在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域
中的残基。

[0129] 21. 根据实施方案20的结合蛋白，其中所述关键残基选自（重链序列位置）：1、2、68、70、72、76、85、89、95
（轻链序列位置）：11、13、43、49、58、70、87。

[0130] 22. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。

[0131] 23. 实施方案16 – 22中任何一个的结合蛋白，其中所述人受体构架包括至少一个构架区氨基酸取代，如例如1 - 20、1 - 15、1 – 10个，或2、3、4、5、6、7、8或9个取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人受体构架等同的至少70个氨基酸残基。

[0132] 24. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个（构架突变的）可变结构域：（重链序列）SEQ ID NO：62、67、68和69；
（轻链序列）SEQ ID NO：63、64、65和66。

[0133] 25. 实施方案24的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：
SEQ ID NOs：62和63 ；62和64 ；62和65 ；62和66 ；；
SEQ ID NOs：67和63 ；67和64 ；67和65 ；67和66 ；
SEQ ID NOs：68和63 ；68和64 ；68和65 ；68和66 ；
26. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合选自RAGE分
子的靶。

[0134] 27. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其能够与人RAGE结合。

[0135] 28. 实施方案27的结合蛋白，其具有下述另外功能特征中的至少一个：与小鼠和大鼠RAGE结合。

[0136] 29. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节特别是中和选自RAGE分子的靶的生物学功能。

[0137] 30. 实施方案29的结合蛋白，其中所述结合蛋白调节特别是抑制RAGE与其配体中的至少一个结合的能力。

[0138] 31. 实施方案30的结合蛋白，其中所述结合蛋白调节特别是抑制下述相互作用中的至少一种：人RAGE与Aβ肽、Aβ球聚体、S100b和两性蛋白的结合。

[0139] 32. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和RAGE生物学活性，如例如初级神经元中Aβ诱导的发动蛋白切割，海马切片中球聚体诱导的突触缺陷，Aβ诱导的CBV中的降低。

[0140] 33. 实施方案32的结合蛋白，其中所述RAGE分子是RAGE或RAGE片段，如sRAGE。

[0141] 34. 实施方案33的结合蛋白，其中所述RAGE选自人、大鼠和小鼠。

[0142] 35. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白与所述靶具有选2 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1
自下述的结合速率常数（kon）：至少约10M s ；至少约10 M s ；至少约10 M s ；至少约
5 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
10M s ；至少约10 M s 和至少约10 M s ，如通过表面等离振子共振测量的。

[0143] 36. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白与所述靶具有选自-2 -1 -3 -1 -4 -1 -5 -1下述的解离速率常数（koff）：至多约10 s ；至多约10 s ；至多约10 s ；至多约10 s ；和-6 -1
至多约10 s ，如通过表面等离振子共振测量的。

[0144] 37. 前述实施方案中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白与所述靶具有选自-7 -8 -9 -10下述的解离常数（KD）：至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约10 M；至多约-11 -12 -13
10 M；至多约10 M；和至多10 M。

[0145] 38. 包括前述实施方案中任何一个中所述的结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体进一步包括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。

[0146] 39. 根据实施方案38的抗体构建体，其中所述结合蛋白选自免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR嫁接的抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab’，
F（ab’）2，
Fv，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单结构域抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，
双重可变结构域免疫球蛋白，和
双特异性抗体。

[0147] 40. 根据实施方案38和39中任何一个的抗体构建体，其中所述结合蛋白包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域，
人IgG1恒定结构域，
人IgG2恒定结构域，
人IgG3恒定结构域，
人IgG4恒定结构域，
人IgE恒定结构域，
人IgD恒定结构域，
人IgA1恒定结构域
人IgA2恒定结构域
人IgY恒定结构域，和
相应突变的结构域。

[0148] 41. 根据实施方案38 - 40中任何一个的抗体构建体，其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域：SEQ ID NO：25、41、42和26。

[0149] 42. 包括实施方案38 - 41中任何一个中所述的抗体构建体的抗体缀合物，所述抗体缀合物进一步包括选自下述的试剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。

[0150] 43. 根据实施方案42的抗体缀合物，其中所述试剂是选自下述的显像剂：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。

[0151] 44. 根据实施方案43的抗体缀合物，其中所述显像剂是选自下述的放射性标记：3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153
H、C、S、Y、Tc、 In、I、 I、Lu、 Ho和 Sm。

[0152] 45. 根据实施方案42的抗体缀合物，其中所述试剂是选自下述的治疗或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。

[0153] 46. 根据实施方案38 - 41中任何一个的抗体构建体，其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。

[0154] 47. 根据实施方案42 - 45中任何一个的抗体缀合物，其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。

[0155] 48. 根据实施方案1 - 37中任何一个的结合蛋白，其中所述结合蛋白作为晶体存在。

[0156] 49. 根据实施方案38 - 41中任何一个的抗体构建体，其中所述抗体构建体作为晶体存在。

[0157] 50. 根据实施方案42 - 45中任何一个的抗体缀合物，其中所述抗体构建体作为晶体存在。

[0158] 51. 根据实施方案48的结合蛋白，其中所述晶体是无载体药物控释晶体。

[0159] 52. 根据实施方案49的抗体构建体，其中所述晶体是无载体药物控释晶体。

[0160] 53. 根据实施方案50的抗体缀合物，其中所述晶体是无载体药物控释晶体。

[0161] 54. 根据实施方案48的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更大的体内半衰期。

[0162] 55. 根据实施方案49的抗体构建体，其中所述抗体构建体具有比所述抗体构建体的可溶性配对物更大的体内半衰期。

[0163] 56. 根据实施方案50的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有比所述抗体缀合物的可溶性配对物更大的体内半衰期。

[0164] 57. 根据实施方案48的结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物学活性。

[0165] 58. 根据实施方案49的抗体构建体，其中所述抗体构建体保留生物学活性。

[0166] 59. 根据实施方案50的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物保留生物学活性。

[0167] 60. 分离的核酸，其编码实施方案1-37中任何一个的结合蛋白氨基酸序列。

[0168] 61. 分离的核酸，其编码实施方案38-41中任何一个的抗体构建体氨基酸序列。

[0169] 62. 分离的核酸，其编码实施方案42-45中任何一个的抗体缀合物氨基酸序列。

[0170] 63. 载体，其包括根据实施方案60 - 62中任何一个的分离的核酸。

[0171] 64. 实施方案63的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。

[0172] 65. 宿主细胞，其包括根据实施方案63和64中任何一个的载体。

[0173] 66. 根据实施方案65的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

[0174] 67. 根据实施方案66的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

[0175] 68. 根据实施方案67的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

[0176] 69. 根据实施方案68的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。

[0177] 70. 根据实施方案69的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自下述的动物细胞：哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。

[0178] 71. 根据实施方案69的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自HEK细胞、CHO细胞、COS细胞和酵母细胞。

[0179] 72. 根据实施方案71的宿主细胞，其中所述酵母细胞是啤酒糖酵母。

[0180] 73. 根据实施方案70的宿主细胞，其中所述宿主细胞是昆虫Sf9细胞。

[0181] 74. 产生能够结合RAGE的蛋白质的方法，其包括在足以产生能够结合RAGE的结合蛋白的条件下，在培养基中培养实施方案65 – 73中任何一个的宿主细胞。

[0182] 75. 蛋白质，其根据实施方案74的方法产生。

[0183] 76. 用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括（a）制剂，其中所述制剂包括根据实施方案48 – 50中任何一个的结晶产物蛋白质，和成分；和
（b）至少一种聚合载体。

[0184] 77. 根据实施方案76的组合物，其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（氨基酸）、聚（酐）、聚（酯肽）、聚（酯）、聚（乳酸）、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚（b-羟基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二氧杂环己酮）（poly(dioxanone)）；聚（乙二醇）、聚（（羟丙基）甲基丙烯酰胺、聚[（有机）磷腈]、聚（原酸酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯烷酮）、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖（glycaminoglycans）、硫酸化多糖（polyeaccharides）、其掺和物和共聚物。

[0185] 78. 根据实施方案76的组合物，其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇（lactitol）、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。

[0186] 79. 用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的根据实施方案77和78中任何一个的组合物的步骤。

[0187] 80. 药物组合物，其包括实施方案1 – 59中任何一个的产物，和药学上可接受的载体。

[0188] 81. 实施方案80的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体起用于增加所述结合蛋白的吸收或分散的佐剂的作用。

[0189] 82. 实施方案81的药物组合物，其中所述佐剂是透明质酸酶。

[0190] 83. 实施方案82的药物组合物，其进一步包括用于治疗其中RAGE活性有害的病症的至少一种另外的治疗剂。

[0191] 84. 实施方案83的药物组合物，其中所述另外的试剂选自：治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药（NSAID）、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇（corticosteriod）、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物治疗、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。进一步的例子是：Dimebon、抗Aβ抗体、β-分泌酶抑制剂、tau-调节剂、认知增强剂如例如5-HT6拮抗剂、胆固醇酯酶（cholesterinase）抑制剂（例如，他克林（tactrine）、多奈哌齐、霉司替明或加兰他敏）、部分NMDA受体阻断剂（例如，美金刚胺）、糖胺聚糖模拟物（例如，Alzhemed）、γ分泌酶的抑制剂或变构调节剂（例如，R-氟比洛芬）、促黄体素阻断促性腺激素释放激素激动剂（例如，亮丙瑞林）、5-羟色胺（serotinin）5-HTlA受体拮抗剂、螯合（chelatin）剂、神经元选择性L-型钙通道阻断剂、免疫调谐剂、淀粉状蛋白原纤维生成抑制剂或淀粉状蛋白蛋白沉积抑制剂（例如，M266）、另一种抗体（例如，bapineuzumab）、5-HTla受体拮抗剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、用于渐进性糖化终极产物的受体蛋白质、PARP刺激物、5-羟色胺6受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激剂、选择性CB1拮抗剂、针对苯二氮杂受体的不全激动剂、淀粉状蛋白β生产拮抗剂或抑制剂、淀粉状蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7不全拮抗剂、靶向PDE4的治疗剂、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂。

[0192] 85. 用于减少人RAGE活性的方法，其包括使人RAGE与实施方案1 – 59中任何一个的产物接触，从而使得人RAGE活性减少。

[0193] 86. 用于减少有此需要的受试者中hRAGE与选自Aβ肽、球聚体、S100b和两性蛋白的至少一种配体结合的方法，其包括给受试者施用实施方案1 – 59中任何一个的产物的步骤。

[0194] 87. 用于治疗受试者的与RAGE活性相关的病症的方法，其包括施用单独或与其他治疗剂组合的实施方案1 – 59中任何一个的产物的步骤。

[0195] 88. 用于减少患有其中RAGE活性有害的病症的受试者中的RAGE活性的方法，其包括给受试者施用单独或与其他治疗剂组合的实施方案1 – 59中任何一个的产物。

[0196] 89. 实施方案88的方法，其中所述病症包括选自下述的神经学疾病：肌萎缩性（Amytropic）侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症（Post Polio）、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎（Myelitits）、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏（Huntington’s）舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病（Morbus Parkinson）、steel-Richard综合征、唐氏（Down’s）综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱病症、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病；糖尿病和所产生的并发症如糖尿病性视网膜病、肾病、脉管并发症；动脉粥样硬化并发症、肺纤维化、癌症尤其是黑素瘤、其他淀粉样变性。

[0197] 90. 结合蛋白的分离的CDR，所述结合蛋白如实施方案1 – 51中任何一个中定义的。

[0198] 91. 分离的结合蛋白，其与渐进性糖化终极产物受体（RAGE）蛋白质的至少一个表位特异性相互作用。

[0199] 92. 实施方案91的分离的结合蛋白，其中所述分离的蛋白是单克隆抗体或其抗原结合片段。

[0200] 93. 根据实施方案92的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括VH和VL结构域。

[0201] 94. 根据实施方案92的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体减少RAGE与其配体结合的能力。

[0202] 95. 根据实施方案94的配体，其中所述配体包括Aβ肽、球聚体、S100b和两性蛋白。

[0203] 96. 根据实施方案92的单克隆抗体，其中所述抗体能够阻断Aβ球聚体与RAGE的结合。

[0204] 97. 根据实施方案92的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：具有选自SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 17的氨基酸序列的重链可变
区；
具有选自SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 21的氨基酸序列的轻链可变
区；
具有氨基酸序列SEQ ID No. 25的人免疫球蛋白γ1重链恒定区；和
具有氨基酸序列SEQ ID No. 26的人免疫球蛋白κ轻链恒定区。

[0205] 98. 实施方案93的单克隆抗体，其中所述抗原结合结构域包括至少一个互补性决定区（CDR），其包括与选自SEQ ID NOs：2、3、4、6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19和20的序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

[0206] 99. 根据实施方案93的单克隆抗体，其中所述VH结构域包括重链可变区，其包括与选自SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 17的序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

[0207] 100. 根据实施方案99的单克隆抗体，其中所述VH结构域包括至少一个CDR区，其包括与选自SEQ ID NOs：2、3、4、10、11、12、18、19和20的序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

[0208] 101. 根据实施方案100的单克隆抗体，其中所述VH结构域包括选自SEQ ID NOs：2、3、4；SEQ ID NOs. 10、11、12；SEQ ID NOs. 18、19和20组的至少3个CDR区。

[0209] 102. 根据实施方案93的单克隆抗体，其中所述VL结构域包括轻链可变区，其包括与选自SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 21的序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

[0210] 103. 根据实施方案102的单克隆抗体，其中所述VL结构域包括至少一个CDR区，其包括与选自SEQ ID NOs：6、7、8、14、15、16、22、23和24的序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

[0211] 104. 根据实施方案103的单克隆抗体，其中所述VL结构域包括选自SEQ ID NOs：6、7、8；SEQ ID NOs. 14、15、16；SEQ ID NOs. 22、23和24组的至少3个CDR区。

[0212] 105. 实施方案92的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是小鼠抗体、人源化抗体、全人、嵌合抗体、人源化抗体的抗原结合片段、或嵌合抗体的抗原结合片段。

[0213] 106. 实施方案92的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是选自Fab片段、Fab'片段、F（ab'）2片段和Fv片段的抗原结合片段。

[0214] 107. 杂交瘤细胞系，其生产根据实施方案96的单克隆抗体或其抗原结合片段。

[0215] 108. 实施方案107的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自小鼠、人、大鼠、绵羊、猪、牛、山羊和马杂交瘤。

[0216] 109. 产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体与RAGE蛋白质的至少一个表位特异性结合。

[0217] 110. 实施方案107的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自小鼠和人杂交瘤。

[0218] 111. 实施方案107的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自大鼠、绵羊、猪、牛、山羊和马杂交瘤。

[0219] 112. 包括分离的核酸包括分离的核酸的载体，所述分离的核酸编码实施方案97的氨基酸序列中的任何一种，其中所述载体选自pcDNA；pTT；pTT3；pEFBOS；pBV；pJV；和pBJ。

[0220] 113. 用根据实施方案112的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。

[0221] 114. 实施方案113的宿主细胞，其中所述动物细胞是选自HEK293、CHO和COS的哺乳动物细胞。

[0222] 115. 产生根据实施方案91的分离的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合蛋白的条件下在培养基中培养宿主细胞，收集培养基，并且纯化所产生的分离的结合蛋白。

[0223] 116. 药物组合物，其包括根据实施方案99或102中任何一个的单克隆抗体或抗原结合部分，和药学上可接受的载体。

[0224] 117. 治疗疾病或病症的方法，其包括施用实施方案99或102的单克隆抗体，其与RAGE中的C2-结构域结合。

[0225] 118. 实施方案117的方法，其中所述病症包括选自下述的神经学疾病：肌萎缩性侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱病症、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病。

[0226] 119. 实施方案105的抗体，其包括至少一个VH区，其包括选自SEQ ID NO：56和57的氨基酸序列。

[0227] 120. 实施方案105的抗体，其包括至少一个VL区，其包括选自SEQ ID NO：58和59的氨基酸序列。

[0228] 121. 实施方案119或120的抗体，其通过VH或VL序列中的1 – 10个突变另外修饰。

[0229] 122. 实施方案121的抗体，其中所述突变选自构架回复突变以及Vernier和VH/VL界面残基的突变。

[0230] 123. 前述所述实施方案之一的抗体或结合蛋白，其抑制RAGE与HMGB1-CpG DNA复合物的结合；或前述所述实施方案之一的抗体或结合蛋白，其不抑制RAGE与HMGB1-CpG DNA复合物的结合。

[0231] 3. 抗RAGE抗体的生成3.1. 梗概
应用的抗体可以通过合适宿主（例如脊椎动物，包括人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼类、两栖动物，以及在鸟类、爬行动物和鱼的卵中）的免疫接种而生成。为了生成本申请的抗体，宿主用本发明的免疫原性RAGE多肽或其片段进行免疫接种。术语“免疫接种”在本文中指对免疫库（repertoire）呈递抗原的过程，无论库存在于天然遗传上未改变的生物，还是转基因生物中，包括进行修饰以展示人工hum5an免疫库的那些。类似地，“免疫原性制剂”是包含可增强抗原的免疫原性的佐剂或其他添加剂的抗原制剂。

[0232] 动物的免疫接种可以通过本领域已知的任何方法完成。参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1990。用于免疫接种非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域众所周知的。
参见例如，Harlow和Lane以及美国专利号5,994,619。在具体实施方案中，RAGE抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此种佐剂可以通过使其在局部沉积物中隔离保护多肽免于快速分散，或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统的其他组分的物质。具体地，如果待施用多肽，那么免疫接种程序表将涉及在几周期间展开的多肽的2次或更多次施用。

[0233] 预期动物宿主用与完整或破裂细胞的细胞膜结合的抗原进行免疫接种，并且本申请的抗体通过与本发明的免疫原性多肽结合进行鉴定。在用抗原免疫接种动物宿主后，可以从动物中获得抗体。通过放血或处死动物从动物中获得含抗体血清。血清可以如其从动物中获得那样使用，免疫球蛋白级分可以从血清中获得，或抗体可以从血清中纯化。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，从而具有性质的异质排列。

[0234] 3.2 使用杂交瘤技术的抗RAGE单克隆抗体单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样技术进行制备，包括杂交瘤、重组体和噬
菌体展示技术、或其组合的使用。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术进行生产，包括本领域已知和例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988）；Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier，N.Y.，1981）中教导的那些（所述参考文献整体引入作为参考）。如本文使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是通过其产生的方法。

[0235] 使用杂交瘤技术用于生产且筛选特定抗体的方法是本领域常规和众所周知的。在一个实施方案中，本发明提供了生成单克隆抗体的方法以及通过方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中特别地，杂交瘤通过下述生成：使从用本发明的抗原免疫接种的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并且随后在由融合得到的杂交瘤中筛选分泌能够与本发明的多肽结合的抗体的杂交瘤克隆。简言之，小鼠可以用RAGE抗原进行免疫接种。在具体实施方案中，RAGE抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此种佐剂可以通过使其在局部沉积物中隔离保护多肽免于快速分散，或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统的其他组分的物质。具体地，如果待施用多肽，那么免疫接种程序表将涉及在几周期间展开的多肽的2次或更多次施用。

[0236] 一旦检测出免疫应答，例如在小鼠血清中检测出对于抗原RAGE特异的抗体，就收获小鼠脾并且分离脾细胞。随后通过众所周知的技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合RAGE的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠可以生成一般包含高水平抗体的腹水。

[0237] 在另一个实施方案中，产生抗体的无限增殖化杂交瘤可以由免疫接种的动物进行制备。在免疫接种后，处死动物并且使脾B细胞与无限增殖化骨髓瘤细胞融合，如本领域众所周知的。参见例如，Harlow和Lane，同上。在具体实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌性细胞系）。在融合和抗生素选择后，使用RAGE或其部分、或表达RAGE的细胞筛选杂交瘤。在具体实施方案中，使用酶联免疫测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA），特别是ELISA，执行初始筛选。ELISA筛选的例子在引入本文作为参考的WO 00/37504中提供。

[0238] 产生抗RAGE抗体的杂交瘤进行选择、克隆且就所需特征进行进一步筛选，包括强壮杂交瘤生长、高抗体生产和所需抗体特征，如下文进一步讨论的。杂交瘤可以进行培养，并且在体内在同系动物中，在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠中，或在体外细胞培养中扩增。筛选、克隆且扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。

[0239] 在具体实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另一个具体实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中使人非分泌性骨髓瘤与表达抗RAGE抗体的人细胞融合。

[0240] 识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如，本发明的Fab和F（ab'）2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切产生，其中使用酶例如木瓜蛋白酶（以产生Fab片段）或胃蛋白酶（以产生F（ab'）2片段）。F（ab'）2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CHI结构域。

[0241] 3.3 使用SLAM的抗 RAGE单克隆抗体在本发明的另一个方面，使用本领域中被称为选择淋巴细胞抗体法（SLAM）的程序，由单个、分离的淋巴细胞生成重组抗体，如美国专利号5,627,052，PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:7843-7848中所述。在这种方法中，使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如来源于上述免疫接种的动物中的任何一种的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原RAGE、RAGE的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联，并且用于鉴定分泌对于RAGE具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定目的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，并且随后可以在合适免疫球蛋白恒定区（例如，人恒定区）的背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。来源于体内选择的淋巴细胞的用扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞随后可以经历在体外的进一步分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对RAGE的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以在体外进行处理，例如通过体外亲和力成熟方法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。

[0242] 3.4 使用转基因动物的抗RAGE单克隆抗体在本发明的另一个实施方案中，通过用RAGE抗原免疫接种包括一些或全部人免疫球
蛋白基因座的非人动物生产抗体。在具体实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，工程改造的小鼠品系，其包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体生产方面缺陷。参见例如，Green等人Nature Genetics 7:13-21（1994）以及美国专利号5,916,771、
5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10
月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的WO 98/16654，1998
年6月11日公开的WO 98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10
日公开的WO 99/45031，1999年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的
WO 00 09560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体样人谱，并且生成抗原特异性人Mabs。通过引入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小的、种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％的人抗体谱。参见Mendez等人，Nature Genetics 15:146-156（1997），Green和Jakobovits J. Exp. Med.
188:483-495（1998），其公开内容在此引入作为参考。

[0243] 3.5 使用重组抗体文库的抗RAGE单克隆抗体体外方法也可以用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异
性的抗体。用于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，并且包括在例如下述中描述的方法：Ladner等人美国专利号5,223,409；Kang等人PCT公开号WO 92/18619；
Dower等人PCT公开号WO 91/17271；Winter等人PCT公开号WO 92/20791；Markland等
人PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人
PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人（1991）Bio/Technology9:1370-1372；Hay等人（1992）Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huse等人（1989）Science246:1275-1281；McCafferty等人，Nature（1990）348:552-554；Griffiths等人（1993）EMBO J12:725-734；Hawkins等人（1992）J Mol Biol 226:889-896；Clackson等人（1991）Nature352:624-628；Gram等人（1992）PNAS89:3576-3580；Garrad等人（1991）Bio/Technology9:1373-1377；Hoogenboom 等人（1991）Nuc Acid Res19:4133-4137；和Barbas等人（1991）PNAS88:7978-7982，美国专利申请公开20030186374，和PCT公开号WO
97/29131，其各自的内容引入本文作为参考。

[0244] 重组抗体文库可以来自用RAGE或RAGE的部分免疫接种的受试者。可替代地，重组抗体文库可以来自首次用于实验的受试者，即尚未用RAGE免疫接种的受试者，例如来自尚未用人RAGE免疫接种的人受试者的人抗体文库。通过用包括人RAGE的肽筛选重组抗体文库选择本发明的抗体，以从而选择识别RAGE的那些抗体。用于进行此种筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如前述段落中的参考文献中描述的。为了选择对于hRAGE具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如以特定koff速率常数与人RAGE解离的那些，领域已知的表面等离振子共振法可以用于选择具有所需koff速率常数的抗体。为了选择对于hRAGE具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC50的那些，可以使用用于评估hRAGE活性抑制的本领域已知的标准方法。

[0245] 在一个方面，本发明涉及结合人RAGE的分离的抗体或其抗原结合部分。具体地，抗体是中和抗体。在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。

[0246] 例如，本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示法生成。在噬菌体展示法中，功能抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由谱或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。用抗原可以选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。在这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括由噬菌体表达的fd和M13结合结构域，所述噬菌体具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的Fab、Fv或dsFv抗体结构域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示法的例子包括公开于下述中的那些：Brinkman等人，J. Immunol. Methods
182:41-50（1995）；Ames等人，J. Immunol. Methods 184:177-186（1995）；Kettleborough等人，Eur. J. Immunol. 24:952-958（1994）；Persic等人，Gene 187 9-18（1997）；Burton等人，Advances in Immunology 57:191-280（1994）；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO
95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；
5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；
5,733,743和5,969,108；其各自整体引入本文作为参考。

[0247] 如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且用于生成全抗体，包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文详细描述的。例如，还可以采用重组生产Fab、Fab'和F（ab'）2片段的技术，其中使用本领域已知的方法，例如公开于PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12（6）:864-869（1992）；和Sawai等人，AJRI 34:26-34（1995）；和Better等人，Science 240:1041-1043（1988）中的那些（所述参考文献整体引入作为参考）。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术的例子包括在美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203:46-88（1991）；Shu等人，PNAS 90:7995-7999（1993）；和Skerra等人，Science 240:1038-1040（1988）中描述的那些。

[0248] 对于通过噬菌体展示筛选重组抗体文库可替代的，可以应用本领域已知用于筛选大型组合文库的其他方法，以鉴定本发明的双重特异性抗体。一种类型的可替代表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白质融合物表达的那种，如在Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及在Roberts，R.W.和Szostak，J.W.（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:12297-12302中描述的。在这种系统中，通过合成mRNAs的体外翻译，产生在mRNA及其编码的肽或蛋白质之间的共价融合物，所述合成mRNAs在其3'末端上携带嘌呤霉素，肽基受体抗生素。因此，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物（例如，组合文库）中富集，这基于所编码的肽或蛋白质例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列可以通过如上所述的重组方法表达（例如，在哺乳动物宿主细胞中），并且此外，可以实施进一步亲和力成熟，这通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环实现，其中突变已引入一种或多种最初筛选的序列内，或通过用于重组抗体的体外亲和力成熟的其他方法实现，如上所述。

[0249] 在另一种方法中，本发明的抗体还可以使用本领域已知的酵母展示法生成。在酵母展示法中，遗传方法用于使抗体结构域与酵母细胞壁栓系，并且在酵母表面上展示它们。具体地，此种酵母可以用于展示由谱或重组抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明抗体的酵母展示法的例子包括引入本文作为参考的Wittrup等人美国专利号6,699,658中公开的那些。

[0250] 4.本发明的特定重组 RAGE抗体的产生本发明的抗体可以通过本领域已知的许多方法中的任何一种产生。例如，由宿主细胞
表达，其中通过标准技术将编码重和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”意欲包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中表达抗体是优选的，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为此种真核细胞（且特别地哺乳动物细胞）比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠和免疫学活性的抗体。

[0251] 用于表达本发明的重组抗体的特定哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括在Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与DHFR选择标记一起使用，例如如R.J. Kaufman和P.A. Sharp（1982）Mol. Biol.159:601-621中描述的）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过使宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达，或特别地抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。

[0252] 宿主细胞还可以用于产生功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解关于上述程序的变异在本发明的范围内。例如，可能希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码重和轻链中任一或两者的一些或所有DNA，其对于与目的抗原结合不是必需的。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包括。此外，通过经由标准化学交联法使本发明的抗体与第二种抗体交联，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重和轻链对于除目的抗原外的抗原特异。

[0253] 在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的具体系统中，通过磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内，所述重组表达载体编码抗体重链和抗体轻链。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞，以允许表达抗体重和轻链，并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并且从培养基中回收抗体。再进一步地，本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直至合成本发明的重组抗体来实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。

[0254] 4.1 抗RAGE抗体表4是本发明的特定抗hRAGE抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表。

[0255] 表4：抗huRAGE抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表前述分离的抗RAGE抗体CDR序列确立了依照本发明分离的RAGE结合蛋白新家族。为
了生成且选择就hRAGE而言具有特定RAGE结合和/或中和活性的本发明CDR's，可以使用本领域已知用于生成本发明的结合蛋白且评估那些结合蛋白的RAGE结合和/或中和特征的标准方法，包括但不限于本文具体描述的那些。

[0256] 4.2 抗RAGE嵌合抗体嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单
克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison，Science 229:1202（1985）；Oi等人，BioTechniques 4:214（1986）；Gillies等人，（1989）J. Immunol. Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；
4,816,567；和4,816,397，其整体引入本文作为参考。此外，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术（Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger等人，1984，Nature 312:604-608；Takeda等人，1985，Nature 314:452-454，其整体引入本文作为参考），其通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因来实现。

[0257] 在一个实施方案中，通过用人IgG1恒定区置换本文描述的鼠单克隆抗人RAGE抗体的重链恒定区产生本发明的嵌合抗体。

[0258] 4.3 抗RAGE CDR嫁接的抗体本发明的CDR嫁接的抗体包括来自人抗体的重和轻链可变区序列，其中用本发明的非
人如例如鼠抗体的CDR序列置换VH和/或VL的CDR区中的一个或多个。来自任何人抗体
的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而，在此种构架上的直链置换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与原始鼠抗体越同源，使鼠CDRs与人构架组合将引入CDRs中可以减少亲和力的变形的可能性越少。因此，优选选择为置换除CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％序列同一性。更优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70％序列同一性。更加优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75％序列同一性。最优选除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80％序列同一性。用于产生CDR嫁接的抗体的方法是本领域已知的（Jones等人，Nature 321:522-525（1986）；美国专利号
5,225,539）。

[0259] 在一个具体实施方案中，本发明提供了具有如表5中所述的VH和/或VL链的CDR嫁接的抗体。

[0260] 表5：CDR嫁接的抗体衍生自mAb 11E6的CDR序列以粗体字母陈述。还参考通过陈述相应SEQ ID NOs（还
参见表2和3）的特定构架序列（FR1 - FR4）。

[0261] 4.4 抗RAGE人源化抗体人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非人物种的
一个或多个互补性决定区（CDRs）和来自人免疫球蛋白分子的构架区。公开了已知的人Ig序列，例如，
Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S. Dept.
Health（1983），各自整体引入本文作为参考。此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期或任何其他合适特征，如本领域已知的。

[0262] 人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变特别是改善抗原结合。这些构建取代通过本领域众所周知的方法进行鉴定，例如通过CDR和构架残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的构架残基，和序列比较，以鉴定在特定位置上的稀有构架残基。（参见例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature 332:323（1988），其整体引入本文作为参考。）三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其举例说明且展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基且与共有和输入序列组合，从而使得达到所需抗体特征，例如对于一种或多种靶抗原增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最充分地与影响抗原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述中描述的那些：Jones等人，Nature 321:522（1986）；Verhoeyen等人，Science 239:1534（1988）），Sims等人，J. Immunol. 151：2296（1993）；Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196:901（1987），Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285（1992）；Presta等人，J. Immunol.
151:2623（1993），Padlan，Molecular Immunology 28（4/5）:489-498（1991）；Studnicka等人，Protein Engineering 7（6）:805-814（1994）；Roguska.等人，PNAS 91:969-973（1994）；PCT公开WO 91/09967、PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400，美国专利号5,565,332、5,723,323、
5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5,714,352、
6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567，各自整体引入本文作为参考，包括其中引用的参考文献。

[0263] 5. 本发明的抗体的进一步的实施方案5.1融合抗体和免疫粘附素
本申请还描述了可以制备的融合抗体或免疫粘附素，其包括与另一种多肽连接的本申
请的RAGE抗体的全部或部分。在一些实施方案中，仅RAGE抗体的可变区与多肽连接。在其他实施方案中，本申请的RAGE抗体的VH结构域与第一种多肽连接，而抗体的VL结构域与第二种多肽连接，所述第二种多肽以允许VH和VL结构域彼此相互作用以形成抗原结合部位的方式与第一种多肽结合。在其他实施方案中，VH结构域通过接头与VL结构域分开，所述接头允许VH和VL结构域彼此相互作用（参见下文在单链抗体下）。VH-接头-VL抗体随后与目的多肽连接。融合抗体用于将多肽导向表达RAGE的细胞或组织。目的多肽可以是治疗剂例如毒素，或可以是诊断剂例如酶；其可以是容易显现的，例如辣根过氧化物酶。此外，可以制备融合抗体，其中2种（或更多种）单链抗体彼此连接。如果人们希望产生在单条多肽链上的二价或多价抗体，或如果人们希望产生双特异性抗体，那么这是有用的。

[0264] 一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本申请的抗体或抗体部分由另一种功能分子（例如，另一种肽或蛋白质）衍生或连接。例如，本申请的标记的结合蛋白可以通过使本申请的抗体或抗体部分与一种或多种其他分子实体在功能上连接（通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式）而衍生，所述其他分子实体例如核酸、另一种抗体（例如，双特异性抗体或双抗体）、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子（例如，链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签）的结合的蛋白质或肽。

[0265] 本申请的抗体或抗体部分可以由其衍生的有用可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可以用可检测酶衍生，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生时，它通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致可检测的有色反应产物。抗体还可以用核酸、生物素衍生，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。

[0266] 5.2 单链抗体本申请包括结合本发明的免疫原性RAGE的单链抗体（scFv）。为了产生scFv，使VH和
V编码DNA与编码柔性接头例如编码氨基酸序列（Gly4-Ser）的DNA可操作地连接，从而使得VH和VL序列可以作为邻接单链蛋白质表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接（参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-42 6；Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883；McCafferty等人，30 Nature（1990）34 8：552- 554）。单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个VH和VL的话，二价的，如果使用2个VH和VL的话，或多价的，如果使用超过2个VH和VL的话。经由接头偶联的2个所述scFv片段被称为“双抗体”，所述形式也由本发明包括。

[0267] 5.3 双特异性抗体本申请进一步包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其中一种特异性对于本申请的免
疫原性RAGE多肽。例如，可以生成双特异性抗体，其通过一个结合结构域与本发明的免疫原性RAGE多肽特异性结合，并且通过第二个结合结构域与第二种分子特异性结合。此外，可以生成包含超过一个VH和VL的单链抗体，其与本发明的免疫原性多肽和另一种分子特异性结合，所述另一种分子与逐渐减弱的髓磷脂介导的生长锥瓦解和神经突增生和萌发的抑制相关。使用众所周知的技术可以生成此种双特异性抗体，例如Fanger等人Immunol Methods 4：72-81（1994）以及Wright和Harris，20（同上）。

[0268] 在一些实施方案中，使用来自本发明抗体的可变区中的一个或多个制备双特异性抗体。在另一个实施方案中，使用来自所述抗体的一个或多个CDR区制备双特异性抗体。

[0269] 5.4 衍生化和标记的抗体本申请的抗体或抗原结合片段可以由另一种分子（例如，另一种肽或蛋白质）衍生或连接。一般而言，这样衍生抗体或抗原结合片段，从而使得与本发明的免疫原性多肽结合不受衍生化或标记不利影响。

[0270] 例如，本申请的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体在功能上连接（通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式），所述其他分子实体例如另一种抗体（例如，双特异性抗体或双抗体）、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、和/或可以介导抗体或抗原结合片段与另一种分子（例如，链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签）的结合的蛋白质或肽。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他或不同蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子（Kipriyanov等人（1995）Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101），以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用，以制备二价和生物素化scFv分子（Kipriyanov等人（1994）Molecular Immunology 31:1047-1058）。抗体部分例如Fab和F（ab’）2片段可以使用常规技术由全抗体制备，例如全抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。

[0271] 通过使2种或更多种抗体（具有相同类型或不同类型，例如以制备双特异性抗体）交联可以产生衍生化抗体。合适交联剂包括具有通过合适间隔基分开的2种不同反应基团的异双功能（例如，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）或同双功能（例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯）的那些。此种接头可从Pierce Chemical Company，Rockford，Ill获得。

[0272] 衍生化抗体还可以是标记的抗体。例如，本发明的抗体或抗体部分可以由其衍生的检测试剂是荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。抗体还可以用对于检测有用的酶进行标记，例如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。在用可检测酶标记的实施方案中，抗体通过加入该酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，辣根过氧化物酶用过氧化氢和二氨基联苯胺。抗体还可以用生物素进行标记，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。抗体还可以用由次级报道分子识别的预定多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位）进行标记。RAGE抗体或其抗原片段还可以用放射性标记的氨基酸进行标记。放射性标记可以用于诊断和治疗用途。放射性标记的RAGE抗体可以在诊断上例如用于测定受试者中的RAGE受体水平。进一步地，放射性标记的RAGE抗体可以在治疗上用于治疗脊髓损伤。

[0273] 用于多肽的标记的例子包括但不限于，下述放射性同位素或放射性核素，15N，35S，90 99 lll 125 131 177 166 153
Y，Tc， In， I，I， Lu，Ho， Sm。RAGE抗体或其抗原片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇（PEG）、甲基或乙基、或碳水化合物基团。这些基团可以用于改善抗体的生物学特征，例如增加血清半衰期或增加组织结合。此外，用于多肽的标记可以包括核酸，例如用于通过PCR检测或增强基因表达的DNA，或siRNA以阻抑具有RAGE的细胞或组织中的基因表达。

[0274] RAGE抗体的类别和亚类可以通过本领域已知的任何方法进行测定。一般而言，抗体的类别和亚类可以使用对于抗体的特定类别和亚类特异的抗体进行测定。此种抗体是商购可得的。类别和亚类可以通过ELISA、蛋白质印迹以及其他技术进行测定。可替代地，类别和亚类可以这样进行测定：测序抗体重和/或轻链的全部或部分恒定结构域，使其氨基酸序列与免疫球蛋白各个类别和亚类的已知氨基酸序列比较，并且测定抗体的类别和亚类。

[0275] 5.5 双重可变结构域免疫球蛋白如本文使用的，双重可变结构域（DVD）结合蛋白或免疫球蛋白是这样的结合蛋白，其包括2个或更多个抗原结合部位并且是四价或多价结合蛋白，如例如二价和四价。术语“多价结合蛋白”在本说明书中用于指示包括2个或更多个抗原结合部位的结合蛋白。多价结合蛋白特别进行工程改造，以具有2个或更多个抗原结合部位，并且一般不是天然存在的抗体。
术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多种相关或无关靶的结合蛋白。此种DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多种抗原。
包括2种重链DVD多肽和2种轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVD Ig。DVD Ig的每
一半包括重链DVD多肽和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包括重链可变结构域和轻链可变结构域，具有与抗原结合有关的总共6个CDRs/抗原结合部位。DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法公开于美国专利申请号11/507,050中，并且引入本文作为参考。本发明意欲包括包含能够结合RAGE的结合蛋白的DVD结合蛋白。具体地，DVD结合蛋白能够结合RAGE和第二种靶。第二种靶选自抗炎MAB活性（IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、TNFα/β、IFN-β、γ、LIF、OSM、CNTF、PF-4、血小板碱性蛋白（PBP）、NAP-2、β-TG、MIP-1、MCP2/3、RANTES、淋巴细胞趋化因子（lymphotactin））、转运介导蛋白（胰岛素受体、运铁蛋白受体、凝血酶受体、瘦蛋白受体、LDL受体）、其他神经再生MABs（NgR、Lingo、p75、CSPG（例如NG-2、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖）透明质酸、mAG、生腱蛋白、NI-35、NI-250、IMP、基底膜蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖（phosphacan）、nogo-A、OMGP、Sema4D、Sema 3A、肝配蛋白（ephrin）B3、肝配蛋白A2、肝配蛋白A5、MAG、EphA4、丛蛋白（plexin）B1、TROY、wnts、ryk rec.、BMP-2、BMP-4、BMP-7）、神经保护MAB活性（EGF、EGFR、Sema 3）、抗淀粉状蛋白βMABs（例如m266、
3D6（bapineuzumab）、抗球聚体MABs 7C6）、CNS定位的受体和转运蛋白（5-羟色胺受体、多巴胺受体、DAT、Asc-1、GlyT1）。

[0276] 5.6 双重特异性抗体本申请还描述了“双重特异性抗体”技术。双重特异性抗体可以充当激动剂、拮抗剂、或以不同组合的两者。双重特异性抗体是其中VH链与第一种抗原结合，并且VL链与另一种抗原结合的抗体，如WO2008082651中例示的。

[0277] 5.7 结晶的抗体本申请的另一个实施方案提供了结晶的结合蛋白。如本文使用的，术语“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，其不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子（例如蛋白质，例如抗体），或分子组合（例如抗原/抗体复合物）组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。在符合给定的、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位的重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有三个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第2版，第20
1-16页，Oxford University Press，New York，New York,（1999）。

[0278] 具体地，本申请描述了如本文公开的完整RAGE抗体及其片段的晶体，和包括此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物更大的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物学活性。

[0279] 本发明结晶的结合蛋白可以根据本领域已知且如引入本文作为参考的WO02072636中公开的方法产生。

[0280] 5.8 糖基化的抗体本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包
括一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白质生产可以经历进一步加工，称为翻译后修饰。具体地，糖（糖基）残基可以酶促添加，称为糖基化的过程。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白质称为糖基化的蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的
效应子功能具有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期具有最低限度作用（R. Jefferis，Biotechnol. Prog. 21（2005），第11–16页）。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性具有作用。在可变结构域中的糖基化可能对抗原结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻（Co，M.S.,等人，Mol. Immunol.（1993）30:1361- 1367），或导致对于抗原增加的亲和力（Wallick，S.C.,等人，Exp. Med.（1988）168:1099-1109；Wright，A.,等人，EMBO J.（1991）10:2717 2723）。

[0281] 本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知的技术生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。

[0282] 在另外一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分的糖基化是修饰的。例如，可以制备无糖基化（aglycoslated）抗体（即，抗体缺乏糖基化）。可以改变糖基化，以例如增加抗体对于抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以制备一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区糖基化位点的消除，以从而消除在那个位点上的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此种方法在PCT公开WO2003016466A2，以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述，其各自整体引入本文作为参考。

[0283] 另外或可替代地，可以制备本发明修饰的抗体，其具有改变的糖基化类型，例如具有减少量的岩藻糖残基的岩藻糖基化不足（hypofucosylated）抗体，或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已证实增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域中已得到描述，并且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields，R. L.等人（2002）J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana等人（1999）Nat. Biotech. 17:176-1，以及欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342 80，其各自整体引入本文作为参考。

[0284] 蛋白质糖基化依赖于目的蛋白质的氨基酸序列，以及蛋白质在其中表达的宿主细胞。不同生物可以产生不同糖基化酶（例如，糖基转移酶和糖苷酶），并且具有可用的不同底物（核苷酸糖）。由于此种因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可能依赖于具体蛋白质在其中表达的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。具体地，糖基化的结合蛋白包括糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。

[0285] 本领域技术人员已知不同蛋白质糖基化可能导致不同蛋白质特征。例如，与在哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质的那种相比较，在微生物宿主例如酵母中产生，且利用酵母内源途径糖基化的治疗蛋白质的功效可以减少。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，并且在施用后显示减少的体内半衰期。在人和其他动物中的特异性受体可能识别特异性糖基残基，且促进蛋白质从血流中的快速清除。其他不利作用可能包括蛋白质折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白质或因子识别、抗原性或变应原性中的改变。因此，从业者可能更喜欢具有特定糖基化组成和模式的治疗蛋白质，例如与人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中产生的那种等同或至少相似的糖基化组成和模式。

[0286] 表达与宿主细胞那种不同的糖基化蛋白质可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来达到。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰，以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质（糖蛋白）显示与动物细胞特别是人细胞那种等同的蛋白质糖基化（美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT公开WO2005100584 A2）。

[0287] 此外，本领域技术人员将认识到，目的蛋白质可以使用进行基因工程改造以表达各种糖基化酶的宿主细胞文库表达，从而使得文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目的蛋白质。从业者随后可以选择且分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白质。具体地，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白质显示出改善或改变的生物学性质。

[0288] 5.9 抗独特型抗体除结合蛋白外，本发明还涉及对于本发明的此种结合蛋白特异的抗独特型（抗Id）抗
体。抗Id抗体是识别一般与另一种抗体的抗原结合区相关的独特决定簇的抗体。抗Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物进行制备。免疫接种的动物将识别且响应免疫接种抗体的独特型决定簇，并且产生抗Id抗体。抗Id抗体还可以用作“免疫原”，以在另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗Id抗体。

[0289] 6. 抗体的用途已知其与人RAGE结合的能力，本申请的中和抗体或其部分可以用于检测人RAGE（例
如，在生物学样品例如血清或血浆中），其中使用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）或组织免疫组织化学。本申请提供了用于检测生物学样品中的人RAGE的方法，其包括使生物学样品与本发明的抗体或抗体部分接触，并且检测与人RAGE结合的抗体（或抗体部分）或未结合的抗体（或抗体部分），以从而检测生物学样品中的人RAGE。抗体用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺（dichlorotriazinylamine）荧光素、丹磺酰
3 14 35 90
氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；和合适放射性材料的例子包括 H、C、S、Y、
99 111 125 131 177 166 153
Tc、In、 I、I、 Lu、Ho、 Sm。

[0290] 本申请的抗体和抗体部分特别能够在体外和体内中和人RAGE活性。因此，本发明的此种抗体和抗体部分可以用于抑制RAGE与其配体结合且因此中和所产生的活性。

[0291] 在另一个实施方案中，本申请提供了用于减少受试者中的RAGE活性的方法，有利地来自患有其中RAGE所产生的活性有害的疾病或病症的受试者。本申请提供了用于减少患有此种疾病或病症的受试者中的RAGE活性的方法，其通过经由使用本申请的单克隆抗体阻止RAGE与其配体中的至少一种如Aβ-球聚体结合来实现。本发明的抗体特别是本文公开的人源化抗体可以施用于人受试者用于治疗目的。此外，本申请的抗体可以施用于表达抗体能够与之结合的RAGE的非人哺乳动物，以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此种动物模型可以用于评价本发明的抗体的治疗功效（例如，测试施用剂量和时程（time course））。

[0292] 如本文使用的，术语“其中RAGE活性有害的病症”意欲包括这样的疾病和其他病症，其中RAGE或其所产生的活性在患有病症的受试者中的存在已显示负责或怀疑负责病症的病理生理学，或是促进病症恶化的因素。因此，其中RAGE活性有害的病症是其中RAGE活性的减少预期减轻病症的症状和/或进展的病症。可以用本发明的抗体治疗的病症的非限制性例子包括在下文涉及本发明抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。

[0293] 认识到RAGE在与包括神经学疾病的多种疾病相关的病理学中起重要作用，所述神经学疾病选自肌萎缩性侧索硬化、臂丛损伤、脑损伤包括外伤性脑损伤、大脑性瘫痪、Friedrich氏共济失调、Guillain Barre、脑白质营养不良、多发性硬化、小儿麻痹症后的后遗症、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、脊髓瘤、中风、横贯性脊髓炎、痴呆、老年性痴呆、轻度认知缺损、阿尔茨海默相关痴呆、亨廷顿氏舞蹈症、迟发性运动障碍、运动过度、躁狂症、Parkinson病、steel-Richard综合征、唐氏综合征、重症肌无力、神经外伤、脉管淀粉样变性、伴淀粉样变性脑出血I、脑炎症、Friedrich氏共济失调、急性意识错乱症病、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、糖尿病肾病、脓毒症、类风湿性关节炎和相关炎性疾病。糖尿病和所产生的并发症如糖尿病性视网膜病、肾病、脉管并发症；动脉粥样硬化并发症、肺纤维化、癌症尤其是黑素瘤、其他淀粉样变性。（参见例如下述参考文献：淀粉样变性、癌症、关节炎、Crohn氏病、慢性和急性炎性疾病：Schmidt AM等人：J Clin Invest. 2001年10月；108（7）:949-55.；心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症：Yan SD等人：Eur J Clin Invest. 1997年3月；27（3）:179-81；朊病毒相关疾病：Sasaki N等人：Neurosci Lett.2002年6月28日；326（2）:117-20；脉管炎（vascularitis）、肾病、视网膜病和神经病：
Thornalley PJ.:Int Rev Neurobiol. 2002；50:37-57；阿尔茨海默病：Weldon DT等人：
Geriatrics. 1997年9月；52 Suppl 2:S13-6；Yan SD等人：Biochim Biophys Acta. 2000年7月26日；1502（1）:145-57；类风湿性关节炎、骨关节炎：Drinda S等人：.Rheumatol Int. 2004年3月26日；肠病：Foell D等人：Gut. 2003年6月；52（6）:847-53；多发性硬化：Yan SS等人：Nat Med. 2003年3月；9（3）:287-93；牛皮癣：Foell D等人：
Rheumatology（Oxford）. 2003年11月；42（11）:1383-9 ：狼疮：Tanji N等人：J Am Soc Nephrol. 2000年9月；11（9）:1656-66；一般的自身免疫疾病、脓毒症：Liliensiek B等人：J Clin Invest. 2004年6月；113（11）:1641-50；动脉硬化和再狭窄：Schmidt AM等人：Circ Res. 1999年3月19日；84（5）:489-97）。

[0294] 此外，如先前讨论的，上文描述的配偶体任何一个之间的DVD免疫球蛋白或双重特异性抗体可以是有用的。如上所述的此种抗体制剂可以用于治疗此种疾病。

[0295] 本申请的抗体也可以与允许跨膜转移的肽组合，以包括细胞内靶蛋白质的靶向。此种肽序列可以包括但不限于，tat、触角足（antennapedia）、poly-args、一些抗微生物肽。
此种肽可以允许转移通过膜，包括细胞质膜，以及上皮和内皮膜，包括血脑屏障、肠粘膜、脑膜等。

[0296] 本申请的抗体或抗体部分还可以与一种或多种另外的小分子治疗剂一起施用，所述小分子治疗剂在其中RAGE活性与之有关的病症治疗中有用，如前述段落中讨论的。应当理解本申请的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外试剂例如治疗剂组合使用，所述另外试剂通过技术人员就其预期目的进行选择。例如，另外试剂可以是领域公认为对于治疗通过本发明抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。

[0297] 7. 药物组合物本发明还提供了包括本发明的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物
组合物。包括本发明抗体的药物组合物用于但不限于下述用途：诊断、检测或监控病症，预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状，和/或研究。在具体实施方案中，组合物包括本发明的一种或多种抗体。在另一个实施方案中，药物组合物包括本发明的一种或多种抗体，和除本发明抗体外用于治疗其中RAGE活性有害的病症的一种或多种预防或治疗剂。
具体地，预防或治疗剂已知用于或已用于或目前用于预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状。依照这些实施方案，组合物可以进一步包括载体、稀释剂或赋形剂。

[0298] 本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。一般地，药物组合物包括本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括下述的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性。

[0299] 各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体和预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞（参见例如，Wu和Wu，J. Biol. Chem. 262:4429-4432（1987））、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸的构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下）、硬膜外（epidurala）施用、瘤内施用和粘膜施用（例如，鼻内和经口途径）。此外，可以采用肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其各自整体引入本文作为参考。
在一个实施方案中，本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）进行施用。在具体实施方案中，本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，并且可以连同其他生物学活性试剂一起施用。施用可以是全身或局部的。

[0300] 在具体实施方案中，可能需要将本发明的预防或治疗剂局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于下述达到：局部输注，通过注射，或借助于植入物，所述植入物是多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶（sialastic）膜、聚合物、纤维基质（例如Tissel®）或胶原基质。在一个实施方案中，有效量的本发明拮抗剂的一种或多种抗体局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，有效量的本发明的一种或多种抗体与有效量的除本发明抗体外的一种或多种治疗（例如，一种或多种预防或治疗剂）组合局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理和/或改善病症或其一种或多种症状。

[0301] 在另一个实施方案中，预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，泵可以用于达到控释或持续释放（参见Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald等人，1980，Surgery 88:507；Saudek等人，1989，N. Engl. J. Med. 321:574）。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明治疗的控释或持续释放（参见例如Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise（编辑），CRC Pres.，Boca Raton，Fla.（1974）；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball（编辑），Wiley，New York（1984）；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；还参见Levy等人，1985，Science 228:190；During等人，1989，Ann. Neurol. 25:351；Howard等人，
1989，J. Neurosurg. 7 1:105）；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；
和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物例子包括但不限于聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸）、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚（甲基丙烯酸）、聚乙醇酸交酯（PLG）、聚酐、聚（N-乙烯吡咯烷酮）、聚（乙烯醇）、聚丙烯酰胺、聚（乙二醇）、聚丙交酯（PLA）、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物（PLGA）和聚原酸酯。在优选实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，不含可沥滤杂质，贮存稳定，无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置，从而仅需要全身剂量的部分（参见例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页（1984））。

[0302] 控释系统在由Langer的综述（1990，Science 249:1527-1533）中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于产生包括本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人，1996，"Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189，Song等人，1995，"Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397，Cleek 等人，1997，"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular
Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854，和Lam等人，1997，"Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760，其各自整体引入本文作为参考。

[0303] 在具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，所述核酸可以在体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适核酸表达载体的部分，并且这样施用，从而使得其变成细胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体（参见美国专利号4,980,286），或通过直接注射，或通过使用微粒轰击（例如，基因枪；Biolistic，Dupont），或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过与已知进入核的同源异型框样肽连接施用（参见例如，Joliot等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:1864-1868）。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。

[0304] 本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内（例如，吸入）、经皮（例如，局部）、跨粘膜和直肠施用。在具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类的药物组合物。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。需要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因（lignocamne），以减轻在注射部位处的疼痛。

[0305] 如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂的形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub. Co.，Easton，Pa.（1995）。对于不可喷雾的局部剂型，一般采用粘性至半固体或固体形式，其包括与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，并且具有特别大于水的动态粘度。合适制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，需要时，其进行灭菌或与用于影响各种性质例如渗透压的助剂（例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐）混合。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中特别与固体或液体惰性载体组合的活性成分与加压挥发物（例如气体推进剂，例如氟利昂）在混合物中包装或包装在挤压瓶中。需要时，保湿剂（moisturizer）或湿润剂也可以加入药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。

[0306] 如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。具体地，用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以方便地以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂的形式递送，使用合适推进剂（例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体）。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药液筒（由例如明胶组成），其包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

[0307] 如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊（gelcaps）、溶液、悬浮液等的经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学上可接受的赋形剂进行制备，例如粘合剂（例如，预凝胶玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素）；充填剂（例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙）；润滑剂（例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅）；崩解剂（例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠）；或湿润剂（例如，十二烷基硫酸钠）。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可以作为干燥产物呈现，用于在使用前用水或其他合适载体构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂进行制备，例如悬浮剂（例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪）；乳化剂（例如，卵磷脂或阿拉伯胶）；非水载体（例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油）；和防腐剂（例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸）。合适时，制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于一种或多种预防或治疗剂的缓慢释放、控释或持续释放。

[0308] 本发明的方法可以包括用气溶胶化剂（aerosolizing agent）配制的组合物的肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO
92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其各自整体引入本文作为参考。在具体实施方案中，本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.）进行施用。

[0309] 本发明的方法可以包括施用配制用于通过注射（例如，通过单次快速静脉注射或连续输注）肠胃外施用的组合物。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型（例如，在安瓿或多剂容器中）呈现。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和／或分散剂。可替代地，活性成分可以为粉末形式，用于在使用前用合适载体（例如，无菌无致热原水）构建。本发明的方法可以另外包括施用配制为积存（depot）制剂的组合物。此种长效制剂可以通过植入（例如，皮下或肌内）或通过肌内注射进行施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料（例如，作为在可接受油中的乳剂）或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶衍生物（例如，作为微溶盐）。

[0310] 本发明的方法包括施用配制为中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和由阳离子形成的那些，例如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺，三乙胺，2－乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。

[0311] 一般地，组合物的成分分开或以单位剂型混合在一起提供，例如作为在指示活性剂的量的密封容器例如安瓿或囊剂（sachette）中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是通过注射时，可以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得成分可以在施用前混合。

[0312] 具体地，本发明还提供了本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种包装在指示试剂的量的密封容器例如安瓿或囊剂中。在一个实施方案中，本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物供应，并且可以重构（例如，用水或盐水）至合适浓度以用于施用于受试者。具体地，本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末供应，其单位剂量为至少5 mg，更特别地至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg。本发明的冻干预防或治疗剂或药物组合物应在其原始容器中贮存于2℃－8℃，并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用，特别在5天内、在72小时内、在48小时内、在24小时内、在12小时内、在6小时内、在5小时内、在3小时内、或在1小时内。在可替代的实施方案中，本发明的预防或治疗剂、或药物组合物中的一种或多种在指示试剂的量和浓度的密封容器中以液体形式供应。具体地，所施用组合物的液体形式在密封容器中以至少0.25 mg/ml供应，更特别地至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其原始容器中贮存于2℃－8℃。

[0313] 本发明的抗体和抗体部分可以掺入适合于肠胃外施用的药物组合物内。具体地，抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸（1-50 mM），最佳地5-10mM，在pH 5.0 - 7.0（最佳地pH 6.0）下。其他合适缓冲液包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰在0-300 mM（对于液体剂型最佳地150 mM）浓度下的溶液毒性。对于冻干剂型可以包括冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖（最佳地0.5-1.0％）。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包括膨胀剂，主要是1-10％甘露糖醇（最佳地2-4％）。稳定剂可以用于液体和冻干剂型，主要是1-50 mM L-甲硫氨酸（最佳地5-10 mM）。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为
0-0.05％聚山梨醇酯-80（最佳地0.005-0.01％）包括。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为用于肠胃外施用的可注射溶液的包括本发明抗体和抗体部分的药物组合物，可以进一步包括用作佐剂的试剂，例如用于增加治疗蛋白质（例如，抗体）吸收或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶例如Hylenex®（重组人透明质酸酶）。在可注射溶液中透明质酸酶的添加改善在肠胃外施用特别是皮下施用后的人生物利用率。它还允许具体更少疼痛和不适的更大的注射部位体积（即大于1 ml），以及最低限度的注射部位反应发生率（参见引入本文作为参考的WO2004078140、US2006104968）。

[0314] 本发明的组合物可以为多种形式。这些包括液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液（例如，可注射和可输注溶液）、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。具体形式依赖于预期施用方式和治疗应用。一般的特定组合物为可注射或可输注溶液的形式，例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。具体施用方式是肠胃外（例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内）。在具体实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个具体实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射进行施用。

[0315] 治疗组合物一般必须是无菌和在制造和贮存条件下稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以这样制备：将需要量的活性化合物（即，抗体或抗体部分）与上文列出的成分之一或组合一起掺入合适溶剂中，需要时，随后为过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内进行制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列出那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冻干粉末的情况下，具体制备方法是真空干燥和喷雾干燥，这由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以这样维持：例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小，和通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来引起。

[0316] 本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法进行施用，尽管对于许多治疗应用，具体施用途径/方式是皮下注射、静脉内注射或输注。如本领域技术人员将认识到的，施用途径和/或方式将依赖于所需结果而改变。在特定实施方案中，活性化合物可以与保护化合物免于快速释放的载体一起进行制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

[0317] 在特定实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物（和若需要，其他成分）也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，并且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片（wafer）等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必需用预防其失活的材料包被化合物，或使化合物与预防其失活的材料共施用。

[0318] 补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在特定实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种另外治疗剂共配制和/或共施用，所述另外治疗剂对于治疗其中RAGE活性有害的病症有用。例如，本发明的抗RAGE抗体或抗体部分可以与一种或多种另外抗体共配制和/或共施用，所述另外抗体结合其他靶（例如，结合细胞因子或结合细胞表面分子的抗体）。此外，本发明的一种或多种抗体可以与前述治疗剂中的2种或更多种组合使用。此种联合治疗可以有利地利用更低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

[0319] 在特定实施方案中，针对RAGE或其片段的抗体与本领域已知的半衰期延长载体连接。此种载体包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。此种载体在例如美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述，其为了任何目的在此引入作为参考。

[0320] 在具体实施方案中，施用包括编码本发明抗体或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用所表达的或可表达的核酸执行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。

[0321] 关于本领域可用的基因疗法的方法中的任何一个可以根据本发明使用。关于基因疗法的方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.
32:573-596；Mulligan，Science 260:926- 932（1993）；以及Morgan和Anderson，1993，Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月，TIBTECH 11（5）:155-215。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel等人（编辑），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY（1993）；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY（1990）中描述。基因疗法的各种方法的详述公开于引入本文作为参考的US20050042664 A1中。

[0322] RAGE在与如本文上文定义的多种疾病相关的病理学中起关键作用。淀粉状蛋白Aβ-肽输注到动物内导致在arteriolose中如同炎症应答的应答，脑血流量中的减
少。这些作用可以通过针对RAGE的抗体阻止（Rhodin，J.等人World Congress for
Microcirculation，submitted Papers，7th，Sydney，Australia，2001 年 8 月 19-22日,543-547； Deane等人Nature med. 2003）。RAGE在AD患者和其中人APP基因已超表达的转基因小鼠的微脉管系统（microvasculature）中是上调的（Deane等人Nature med.
2003）。使用其中人APP基因表达且RAGE超表达的双重转基因小鼠，显示正常RAGE基因的超表达导致学习中的损害，斑中的增加，而显性失活发信号缺陷RAGE变体的超表达导致学习中的改善和较低的斑水平（Arancio等人2004 EMBO J. 2004）。1和2型糖尿病
的动物模型中的实验揭示配体-RAGE轴的拮抗作用阻抑糖尿病环境例如RAGE敲除小鼠
中脉管和炎性细胞干扰的发展和进展，并且抗RAGE抗体已用于显示关于例如糖尿病肾病的动物模型中的改善（Ravichandran R.等人CANADIAN JOURNAL OF DIABETES. 2006；30（4）:422，Myint Khin等人Diabetes（2006），55（9），2510；De-Vriese等人Journal of the American Society of Nephrology 2003，14/8，2109，Jensen等人Renal effects of a neutralising RAGE-antibody in long-term streptozotocin-diabetic mice. The Journal of endocrinology，2006，188，493）。在肥胖2型糖尿病小鼠中的中和RAGE抗体的正面长期肾作用由Flyvbjerg 等人（Diabetes，2004，53，1，第166-72页）显示。RAGE敲除小鼠用于显示RAGE在脓毒症中的牵涉（Birgit Liliensiek等人J Clin Invest. 2004 June 1；113（11）：1641–1650；Receptor for advanced glycation end products（RAGE）regulates sepsis but not the adaptive immune response）。阻断衍生自抗RAGE IgG的F（ab）2片段减少MOG或MBP诱导的EAE中的炎症应答（Yan，S.S.等人2003. Nat.
Med. 9:287–293.）显示了RAGE在癌症中的牵涉（Abe-R等人Journal of Investigative Dermatology，2004，122/2（461-467）。在荷瘤小鼠中，生存率延长，并且通过使用抗RAGE中和抗体的治疗抑制自发性肺转移。

[0323] 本发明的抗体和抗体部分可以用于治疗患有此种疾病的人。

[0324] 应当理解本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外试剂例如治疗剂组合使用，所述另外试剂通过技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外试剂可以是领域公认为对于治疗通过本发明抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。

[0325] 应进一步理解待包括在本发明内的组合是对于其预期目的有用的那些组合。下文阐述的试剂用于举例说明目的且不预期是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下文列表的至少一种另外试剂。组合还可以包括超过一种另外试剂，例如2种或3种另外试剂，如果组合是这样的，从而使得所形成的组合物可以执行其预期功能的话。

[0326] 本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性例子包括下述：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-ß1a（Avonex；Biogen）；干扰素-ß1b（Betaseron；Chiron/Berlex）；干扰素α-n3）（Interferon Sciences/Fujimoto）、干扰素-α（Alfa Wassermann/J&J）、干扰素ß1A-IF（Serono/Inhale Therapeutics）、聚乙二醇化干扰素α 2b（Enzon/Schering-Plough）、共聚物 1（Cop-1；Copaxone；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.）；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨（clabribine）；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或拮抗剂，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子例如TNFα或IL-1发信号的试剂（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂）、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R）、和抗炎细胞因子（例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ）。

[0327] 其中本发明的抗体或其抗原结合部分可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的具体例子包括干扰素-β例如IFNß1a和IFNß1b；考帕松、皮质类固醇、胱天蛋白酶抑制剂例如胱天蛋白酶-1抑制剂、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、以及针对CD40配体和CD80的抗体。

[0328] 具体地，本发明的结合蛋白和抗体可以用于治疗淀粉样变性，例如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。应当理解本发明的结合蛋白和抗体可以单独或与至少一种另外试剂组合使用，所述另外试剂适合于治疗上述疾病之一。所述至少一种另外试剂可以通过技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外试剂可以是治疗剂例如胆固醇酯酶抑制剂（例如，他克林、多奈哌齐、霉司替明或加兰他敏）、部分NMDA受体阻断剂（例如，美金刚胺）、糖胺聚糖模拟物（例如，Alzhemed）、γ分泌酶的抑制剂或变构调节剂（例如，R-氟比洛芬）、促黄体素阻断促性腺激素释放激素激动剂（例如，亮丙瑞林）、5-羟色胺5-HTlA受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙通道阻断剂、免疫调谐剂、淀粉状蛋白原纤维生成抑制剂或淀粉状蛋白蛋白沉积抑制剂（例如，M266）、另一种抗体（例如，bapineuzumab）、5-HTla受体拮抗剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、用于渐进性糖化终极产物的受体蛋白质、PARP刺激物、5-羟色胺6受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激剂、选择性CB1拮抗剂、针对苯二氮杂受体的不全激动剂、淀粉状蛋白β生产拮抗剂或抑制剂、淀粉状蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7不全拮抗剂、靶向PDE4的治疗剂、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂（即，目前公认或未来公认为对于治疗通过本发明抗体或结合蛋白治疗的疾病或状况有用的那些试剂）。另外试剂还可以是对治疗组合物赋予有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。

[0329] 本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，例如阿来组单抗（alemtuzumab）、屈大麻酚、尤迈（Unimed）、达克珠单抗（daclizumab）、米托蒽醌、盐酸扎利罗登（xaliproden hydrochloride）、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗（natalizumab）、辛纳必醇（sinnabidol）、α-免疫因子（a-immunokine） NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林（calagualine）、CPI-1189、LEM（脂质体被囊化的米托蒽醌）、THC.CBD（大麻素激动剂）MBP-8298、美苏帕玛（mesopram）（PDE4抑制剂）、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素（neurovax）、哌非尼酮allotrop 1258（RDP-1258）、sTNF-R1、他仑帕奈（talampanel）、特立氟胺（teriflunomide）、TGF-β2、替利莫肽（tiplimotide）、VLA-4拮抗剂（例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen）、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。

[0330] 本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以通过本领域技术人员决定，并且可以根据因素而改变，所述因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，和抗体或抗体部分在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量还是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或在疾病较早阶段时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

[0331] 剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答（例如，治疗或预防应答）。例如，可以施用快速灌注剂，可以随着时间过去施用几个分份剂量，或可以如由治疗情形的紧急状态指示的按比例减少或增加剂量。以单位剂型配制肠胃外组合物用于容易施用和剂量一致是特别有利的。如本文使用的，单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明单位剂型的详细说明由下述指示且直接依赖于下述：（a）活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和（b）配合这种用于治疗个体中的敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。

[0332] 关于本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20 mg/kg，更具体地1-10 mg/kg。应当指出剂量值可以随着待减轻的状况类型和严重性而改变。应进一步理解对于任何具体受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断，应随着时间过去调整特定剂量方案，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并且不意欲限制请求保护的组合物的范围或实践。

[0333] 对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明方法的其他合适修饰和适应是显而易见的，并且在不背离本发明或本文公开的实施方案的范围的情况下可以使用合适等同方案进行。尽管目前已详细描述了本发明，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括用于举例说明目的并且不预期是本发明的限制。

[0334] 实验部分实施例1：优选的抗 huRAGE抗体
1.1 杂交瘤和抗体的产生。

[0335] Balb/c和A/J小鼠，4-6周龄，用人RAGE进行皮下免疫接种且加强。动物每3周进行注射，开始于在完全弗氏佐剂中30 μg的初次注射，和在不完全弗氏佐剂中30 μg的注射加强。在融合前4天，选择用于融合的小鼠用在盐水中的10 µg hRAGE进行静脉内注射。取出来自免疫接种的动物的脾，并且制备单细胞悬浮液。从培养中收获SP2/0骨髓瘤细胞并且洗涤。使脾细胞和肿瘤细胞以5:1的比混合，并且使用标准技术使用50％PEG 3000融
5
合（Kohler和Milstein，1975）。将融合的细胞以2.5x10脾细胞/孔的密度接种在96孔板中的选择培养基中。使融合物在37℃下温育7-10天。当观察到肉眼可见的集落时，取出上清液并且在hRAGE ELISA中测试。

[0336] 通过有限稀释法亚克隆产生具有所需特征的mAbs的杂交瘤。通过ELISA就与hRAGE的结合测定含亚克隆的上清液。使用Zymed EIA Isotyping试剂盒测定mAbs的重和轻链亚类。

[0337] 1.2. 关于每种鼠抗人RAGE mAb的可变区氨基酸序列的测定。

[0338] 对于每种氨基酸序列测定，通过离心分离约10x106杂交瘤细胞，并且根据制造商的说明书用Trizol（Gibco BRL/Invitrogen，CA.）加工，以分离总RNA。使用SuperScript第一链合成系统（First-Strand Synthesis System）（Invitrogen，CA）根据制造商说明书，对总RNA实施第一链DNA合成。寡脱氧胸苷酸（oligo（dT））用于引发第一链合成，以+选择聚腺苷酸化（poly（A）） RNA。随后通过PCR用引物扩增第一链cDNA产物，所述引物设计用于扩增鼠免疫球蛋白可变区（Ig引物组（Ig-Primer Sets），Novagen，WI）。使PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，切割，纯化，并且随后用TOPO克隆（Cloning）试剂盒亚克隆到pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen，CA）内，并且转化到TOP10化学制成的感受态（chemically competent）大肠杆菌（Invitrogen，CA）内。对转化体执行集落PCR，以鉴定包含插入片段的克隆。使用QIAprep Miniprep试剂盒（Qiagen，Valencia，CA），从包含插入片段的克隆中分离质粒DNA。在2条链上测序质粒中的插入片段，以测定可变重链或可变轻链DNA序列，其中使用M13正向和M13反向引物（Fermentas Life Sciences，Hanover MD）。3种单克隆抗体7F9、11E6和4E5的可变重链和可变轻链序列及其3个可变重链CDRs和3个可变轻链
CDRs在上表4中列出。

[0339] 1.3.重组抗人 RAGE抗体的构建和表达在细菌中通过同源重组用编码人IgG1恒定区的cDNA片段置换编码鼠抗人RAGE单克
隆抗体7F9、11E6和4E5的重链恒定区的DNA。用人κ恒定区置换这些抗体各自的轻链
恒定区（上表1）。通过将连接到pBOS或pTT3表达质粒中的嵌合重和轻链cDNAs共转染
（Mizushima和Nagata，Nucleic Acids Research 1990，第18卷，第5322页），在COS细胞或293细胞中瞬时表达全长嵌合抗体。通过A蛋白琼脂糖（Protein A Sepharose）层析纯化包含重组嵌合抗体的细胞上清液，并且通过加入酸性缓冲液洗脱结合的抗体。使抗体中和且透析到PBS内。

[0340] 1.4. 重组抗人RAGE mAbs和杂交瘤衍生的抗人 RAGE mAbs的 ELISA结合。

[0341] 纯化的嵌合抗人RAGE单克隆抗体在竞争ELISA中就其结合人RAGE的能力进行测试。重组嵌合抗人RAGE单克隆抗体或杂交瘤衍生的抗人RAGE单克隆抗体在PBST + 10％Superblock（Pierce Biotech，Rockford，IL）中稀释，并且补足为在320 µg/mL - 0.0156 µg /mL（7F9和11E6）和160 µg /mL - 0.0078 µg /mL（4E5）的各种浓度的2x贮存液。生物素化的杂交瘤衍生的抗人RAGE单克隆抗体（7F9-生物素、11E6-生物素和4E5-生物素）以8 µg /mL在PBST+10％Superblock中制备。使等体积（50 μL）的每种重组嵌合抗人RAGE单克隆抗体或杂交瘤衍生的抗人RAGE单克隆抗体和每种相应生物素化的杂交瘤衍生的抗RAGE mAbs混合。随后将50 μL这种混合物加入用重组人RAGE以2 µg /mL预包
被的ELISA板中，并且在室温下温育1.5小时。孔用PBS+ 0.05％Tween-20洗涤3次。链
霉抗生物素蛋白HRP（1 mg/mL）在PBST + 10％Superblock中稀释1:16000；加入50 L/孔，并且使板在室温下温育1小时。板用PBS+ 0.05％Tween-20洗涤3次。将50 µL TMB 溶液（Sigma，St Louis，MO）加入每个孔中，并且在室温下温育10分钟。通过加入1N硫酸终止反应。板在450 nm的波长下分光光度地读取读数。结果显示于图1A、1B和1C中。

[0342] 实施例2：重组人 sRAGE（husRAGE）的产生重组husRAGE蛋白质293/6.1 sRAGE His 6在HEK293细胞（ATCC CRL-1573）中表达
且纯化。用于生成稳定表达的表达载体是“pcDNA3（-）6.1 C HIS A”。

[0343] 根据 Sambrook和 Russel（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第 3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001）使用分子生物学标准技术。使用Superscript RT-PCR系统（Invitrogen，Carlsbad USA），将来自人淋巴细胞（PBL）的总RNA逆转录成cDNA。使用寡核苷酸引物RAGE-SE ：CCG AAT TCC GGA AGC AGG ATG GCA GCC G（SEQ ID NO：81）和RAGE-AS：CCC TCG AGC CCC TCA AGG CCC TCA GTA CTA CT（SEQ ID NO：82），从cDNA（上文获得的）扩增RAGE cDNA，从而得到如参考序列NM-001136中描述的RAGE cDNA。PCR片段在琼脂糖凝胶上运行，用QIAquick Gelextraction Kit（Qiagen GmbH，德国）纯化且提取。其后用限制性内切核酸酶EcoR1和XhoI切割cDNA。使所得到的片段凝胶纯化，并且连接到已用XhoI/EcoR1预切割的载体pcDNA 3（Invitrogen，USA）内。在转化到大肠杆菌XL-1 blue细胞（Invitrogen，USA）内后，鉴定阳性重组克隆。验证这个克隆的序列，并且使用质粒mini-Kit（Qiagen，德国）分离pcDNA3/RAGE 2.6质粒DNA。由pcDNA3/RAGE 2.6扩增关于RAGE的细胞外部分的编码区，husRAGE，其中使用PCR和引物N-SE A：AGT AAC GGC CGC CAG TGT GCT GGA ATT CGG A （SEQ ID NO：83）和C-SE B：CCG GTA CCA CCT GCA GTT GGC CCC TCC TCG CC（SEQ ID NO：84）。所得到的PCR产物用限制性内切核酸酶EcoR1 和 Kpn1切割，如上所述凝胶纯化，并且连接到已用EcoR1/Kpn1预切割的“pcDNA3.1（-）Myc HIS”（Invitrogen，USA）内。使用Superfect（Qiagen，德国）根据制造商说明书，将所得到的质粒“pcDNA 3（-）6.1 C HIS A”转染到HEK293细胞内。使用在MEM培养基（Medium）（#M4528，Sigma，德国）+ 10％FCS，2 mM L-谷氨酰胺（L-Glutamin），100 U/ml青霉素/链霉抗生物素蛋白（Pennicillin/Streptavidin）（Invitrogen，USA）中的800 μg/ml G418完成抗性细胞的选择。通过细胞悬浮液的连续稀释克隆单细胞导致克隆“293/6.1 sRAGE His 6”的鉴定，所述克隆将husRAGE分泌到细胞培养基内，如通过蛋白质印迹证实的，其中使用RAGE特异性抗体（Santa Cruz；# sc5563）。对于足够量的husRAGE蛋白质的表达和纯化，使这个克隆在含血清细胞培养基（参见上文）中在细胞工厂（Nunc，德国）中生长。随后将细胞转换到无血清培养基Pro293a-CDM（#12-764Q，BioWhittaker，Belgiun），并且在37℃温育3天。收获80升无细胞培养基，并且使用Hemoflow F-Series High-Flux柱（Fresenisus Medical Care AG，德国）浓缩至1400 ml的体积。

[0344] 使用固定化金属离子亲和层析（IMAC）通过Diarect AG（Freiburg，德国）和用于螯合的琼脂糖FF（Amersham-Bioscience，瑞典）完成蛋白质纯化。根据制造商的说明书完成柱的平衡和来自细胞上清液的含六-His的蛋白质与基质的结合。使用分级梯度用渐增浓度的咪唑完成蛋白质的洗脱。使用蛋白质印迹和抗HIS抗体，就含六-His的蛋白质分析洗脱的级分。纯化的husRAGE在250 –500 mM咪唑下特异性洗脱。使阳性级分组合，浓缩且针对PBS透析3次（2 x 4小时，1 x 16小时）。

[0345] 如上文对于husRAGE蛋白质所述，通过分子生物学中的标准技术生成缺少人RAGE的前101个氨基酸的N末端缩短形式的husRAGE（102-331-sRAGE-HIS）。通过用于husRAGE（1-331）的相同基本程序生成这种蛋白质。使用上文描述的质粒（pcDNA3/RAGE 2.6）以及2种引物（CGA AGC TTG ATG AAC AGG AAT GGA AAG GAG ACC AAG （SEQ ID NO：85）和TCC TCG AGC ACC TGC AGT TGG CCC CTC CTC GCC T（SEQ ID NO：86）），通过PCR扩增关于husRAGE的较短形式的DNA。在片段的琼脂糖凝胶和洗脱后，用限制性内切核酸酶HindIII和XhoI切割所得到的纯片段，并且再次使用琼脂糖凝胶和洗脱纯化。将片段连接到用限制性内切核酸酶HindIII和XhoI预切割的psecTAG 2A（Invitrogen，USA）内。在转化到大肠杆菌“TOP10 One Shot”细胞（Invitrogen，USA）内后，挑取阳性克隆，并且分离质粒DNA。使用Freestyle表达系统（Invitrogen，USA），将在表达载体中的DNA转染到HEK293 F细胞内。在表达96小时后，无细胞上清液用于使用Ni-NTA Superflow珠（Quiagen，德国）的纯化。根据制造商的说明书完成平衡和结合。结合的蛋白质在缓冲液（PBS、160 mM NaCl、150 mM咪唑，pH8.0）中洗脱。使含蛋白质的级分组合，并且在4℃针对TBS（Tris缓冲盐水；pH 7,4）透析过夜。分光光度地测量测定纯化的husRAGE（102-331）浓度。

[0346] 如上文对于husRAGE蛋白质所述，通过分子生物学中的标准技术生成缺少在人RAGE氨基酸130后的氨基酸的C末端缩短形式的husRAGE –融合蛋白（1-130-sRAGE-Fc）。使用上文描述的质粒（pcDNA3/RAGE 2.6）以及2种引物（GCACCATGGCAGCCGGAACAGCAGTTG （SEQ ID NO：87）和GAGTCTCGAGGCAGAATCTACAATTTCTG（SEQ ID NO：88）），通过PCR扩增关于husRAGE的较短形式的DNA。在片段的琼脂糖凝胶和洗脱后，用限制性内切核酸酶NcoI和XhoI切割所得到的纯片段，并且再次使用琼脂糖凝胶和洗脱纯化。将片段连接到用限制性内切核酸酶NcoI和XhoI预切割的质粒pENTR4内。将连接混合物转化到大肠杆菌“TOP10 One Shot”细胞（Invitrogen，USA）内，以生成pENTR4-RAGE 1-130。挑取阳性克隆，并且分离质粒DNA。使用位点特异性重组和通路克隆系统（Invitrogen，Carlsbad，USA；attL x attR）连同克隆pENTR4 hRAGE 1-130的DNA和载体pcDNA3.1（+）Zeo hIgG λ hc 257-Stop的DNA，构建（参见下文）在转化到“TOP10 One Shot”细胞（Invitrogen，USA）内和纯化后编码husRAGE-1-130-Fc的质粒（质粒被称为：pEXP hRAGE 1-130/hIgG λ hc 257-Stop）。使用Freestyle Expression系统和293F细胞表达这种质粒（实施例2.1）和使用G蛋白（Protein G）-珠纯化来自细胞上清液所产生的蛋白质（实施例2.2）导致具有>95％纯度的蛋白质。

[0347] 实施例3：pcDNA3.1（+）Zeo hIgG λ hc 257- Stop的构建在PCR聚合酶链反应中，2种寡核苷酸引物（gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgccc
agcacc （SEQ ID NO：91）；ctagtctagatcatttacccggagacagggag （SEQ ID NO：92））用于扩增关于来自人胎盘cDNA文库（Clontech # HL5014a）的hIgG λ重链的DNA序列，其中使用EasyA聚合酶。使所得到的DNA凝胶纯化（如上所述），使用来自制造商的说明书克隆到pcDNA3.1 V5-His TOPO Vektor（pcDNA3.1/V5/His TOPO TA Expression Kit Invitrogen #K4800-01）内，并且如上所述转化到大肠杆菌TOP10细胞内。鉴定阳性克隆，并且使用PCR和寡核苷酸引物（gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc（SEQ ID NO：93）；
ctagtctagatcatttacccggagacagggag（SEQ ID NO：94））纯化所得到的质粒DNA（命名为：
pcDNA3.1（V5His）FC/hIgG λ hc Nr.2/7）。扩增DNA的hIgG λ hc部分，用EcoRV/XbaI切割，连接到EcoRV/XbaI预切割的pcDNA3.1（+）Zeo载体DNA内，并且转化到大肠杆菌TOP10细胞内。所得到的质粒命名为：pcDNA3.1（+）Zeo hIgG λ hc 257-Stop，并且用于进一步工作，以表达N末端与免疫球蛋白IgG重链的C末端部分框内融合的蛋白质。

[0348] 3.1. 蛋白质在HEK293F细胞中的转染和表达已在Free Style 293表达培养基（Expression Medium）中在培养中生长2 – 3天的
HEK 293F细胞在400 g下离心，并且弃去上清液。使细胞沉淀重悬浮于培养基中，并且在
28 ml新鲜培养基中调整至3x107细胞，转移至125 ml锥形瓶，并且在培养箱中在37℃、8％CO2下在150 rpm的定轨摇床上温育，直至建立转染混合物。

[0349] 具有293fectin-DNA复合物的转染混合物如下建立：（i）30 µg DNA用Opti-MEM I稀释至1000 µl总体积（对照1000 µl Opti-MEM I）且
混合。

[0350] （ii）35 µl 293fectin（Invitrogen #12347-019；1ml）用Opti-MEM I稀释至1000 µl总体积，混合且在室温温育5分钟。

[0351] 将来自（i）和（ii）的DNA混合物和239fectin-溶液转移至新管，轻轻混合，并且在室温温育25分钟后，加入在锥形瓶中的细胞中。

[0352] 细胞与这种转染混合物在培养箱中在37℃、8％CO2下在150 rpm的定轨摇床上温育指示的时间。通过在400 g离心10分钟收获细胞上清液。

[0353] 3.2. 使用G蛋白 -琼脂糖（Protein G-Sepharose）纯化RAGE-Fc融合蛋白为了使来自细胞上清液的蛋白质与珠偶联，使珠（G蛋白-琼脂糖4 Fast Flow
（Amersham Bioscience）在PBS中洗涤3次，这通过使珠悬浮于PBS中和在13,500 rpm离心，弃去上清液实现。使珠与待偶联的各自细胞上清液（300 ml细胞上清液/ml珠）在旋转器上在室温温育1 – 2小时。珠用PBS洗涤3次，并且与细胞上清液一起在4℃温育12小时或过夜。在温育后，珠如上用PBS洗涤3次。通过将200 µl 140mM NaCl + 0.1M甘氨酸加入珠沉淀中且在旋转器上温育30分钟洗脱结合的蛋白质。在离心后，立即通过加入2 M Tris中和上清液，以使pH调整至7.1 – pH 7.4。弃去珠沉淀。所获得的探针针对PBS透析，并且以等分试样冷冻贮存于-20℃。从R&D系统（编号1145-RG；Recombinant Human RAGE/Fc Chimera）获得含RAGE的完全细胞外胞外域的RAGE-Fc融合蛋白。

[0354] 3.3. 抗体与非变性形式的RAGE肽或片段的斑点印迹结合。

[0355] 斑点印迹用于评价抗体与非变性形式的RAGE肽或片段的结合。所使用的蛋白质是sRAGE-蛋白质（1-331 sRAGE-HIS）或N末端缩短的形式（102-331-sRAGE-HIS）。通过Biotrend根据标准方法排序且合成（在AMS 222合成仪上使用Fmoc/tBu-化学的固相肽合成）包含游离羧基末端的肽。肽进行HPLC纯化，并且使用RP-HPLC完成每种肽就纯度的分析。所有肽具有>80％的纯度。通过质谱分析法验证肽的特性。

[0356] 所使用的肽是跨越人RAGE蛋白质的细胞外区域的30聚体。大多数肽的净电荷是相似的。

[0357] 由在1xPBS中以1 µl体积的不同量蛋白质/肽（30 ng、10 ng、3 ng、1 ng、0.3 ng、0.1 ng、0.03 ng和0.01 ng）组成的斑点一式两份地点在Hybond-ECL硝化纤维素膜（Nitrocellulose Membrane）（Amersham，RPN68D）上。使膜干燥并且通过使膜在室温振荡1小时用Western Blocking试剂（Roche，编号1921673）阻断非特异性结合。弃去阻断试剂并且使膜与抗体以7.14 nM的浓度温育（振荡，在室温下1小时）。单克隆抗体是ML37-7F9、ML37-11E6、ML37-4E5，从R&D系统商购可得的抗体（例如AF1145）。印迹用1xPBS洗涤4次（每次5分钟，伴随在室温下的振荡温育）。印迹随后与在Western Blocking 试剂（Roche，编号192173）中1:2000稀释的山羊抗小鼠IgG AP第二抗体（Sigma 编号A-7434）一起温育。1小时温育如前所述（振荡，室温）。滤器在1X PBS中洗涤4次（各5分钟）。根据制造商说明书用NBT/BCIP底物溶液（Roche，编号1697471）产生信号。在10分钟后用双蒸水（bi-distilled water）终止显色。参见图2。

[0358] 尽管husRAGE在斑点印迹中通过本发明的所有3种单克隆抗体和通过多克隆抗体AF1145（来自商业来源，R&D）检测出，但肽无一通过本发明的单克隆抗体检测出。然而，多克隆抗体检测出几种肽。如由Ostendorp等人（EMBOJ. 26,3875,2007）描述的，的确包括用于生成多克隆抗体的氨基酸序列的肽9，通过商购可得的多克隆抗体明确检测出。这些结果指出本发明的单克隆抗体明确识别与商购可得抗体不同的表位。

[0359] 通过在大肠杆菌中表达的人sRAGE的RAGE突变体的分析完成结合的进一步表征。单克隆抗体11E6和4E5与C2结构域周围的区域结合，这是因为结合在缺乏氨基酸235-336的缺失突变体中丧失，并且结合在由氨基酸235-336组成的突变RAGE蛋白质中是明显的。

[0360] 实施例4：使用 HTRF技术在 Aβ1-42-球聚体和衍生自 husRAGE的蛋白质之间的相互作用。

[0361] 该测定基于可从CIS Bio International（Bagnols，法国）获得的HTRF（均相时间分辨荧光）技术。

[0362] HTRF供体和受体-组分，Anti-6HIS-Europiumcryptate（CIS Bio目录号：61HISKLA；500孔/13 µg）和链霉抗生物素蛋白（Streptavidin） XL – 665（CIS Bio目录号：611SAXLA，500孔/250µg）各自溶解于250 µl双蒸水中。这些贮存液在PBS，0.1 ％BSA，pH 7.4中稀释100倍，以获得具有终浓度3.7 nM Anti6His-Cryptate和60.6 nM 链霉抗生物素蛋白 XL-665的工作溶液。生物素化Aβ-球聚体的10 µM、5 µM、2.5 µM、1.25 µM、0.625 µM、312.5 nM、156.25 nM溶液（用于制备Aβ-球聚体的1/5 Aβ1-42肽是生物素化-淀粉状蛋白β蛋白（Biotinyl-Amyloid ß-Protein）（1-42）（Bachem 编号H-5642）根据Barghorn等人（J. Neurochemistry，第95卷，no 3，第834-847页，2005和WO/2007/062852；国际申请号PCT/EP2006/011530）进行制备；所使用的球聚体浓度基于用于生成球聚体的Aβ1-42单体浓度进行计算。在相同缓冲液（PBS、0.1％BSA，pH 7.4）中制备生物素化Aβ-球聚体的10 µM、 5 µM、 2.5 µM、 1.25 µM、 0.625 µM、 0.312 µM、 0.156 µM溶液。使4 µl这些溶液或4 µl缓冲液与4 µl 1 µM重组husRAGE蛋白质混合，并且使溶液在室温温育1小
时，随后加入4 µl每种溶液（3.7 nM Anti6His-Cryptate和60.6 nM 链霉抗生物素蛋白XL-665）。

[0363] 使测定在4℃温育2小时。在加入4 µl 2M KF贮存液后，在BMG Pherastar荧光仪器（BMG Labtech GmbH，德国）中以HTRF模式测量HTRF信号。使用不含抗体的最大限度信号曲线和仅使用Anti6HIS-Cryptate –或链霉抗生物素蛋白XL –溶液的本底结果。使用GraphPad Prism 4（GraphPad Software，San Diego，USA），根据通过制造商CisBio的说明书计算％DeltaF值。

[0364] 实施例5：使用 HTRF技术通过抗体抑制 Aβ1-42-球聚体与 husRAGE的结合使用如上所述的基本规程，伴随少数修饰。HTRF供体和受体-组分在PBS，pH 7.4，
0.1％BSA中稀释40倍，对于Anti-6HIS-Europiumcryptate至10.25 nM，并且对于链霉抗生物素蛋白XL-665至151.5 nM。

[0365] 使用针对husRAGE的纯化单克隆抗体（MABs）或对照免疫球蛋白（小鼠IgG1和小鼠IgG2a；编号M-5284 rsp. No. M-5409；Sigma，德国）作为对照抗体。

[0366] 在384孔板中以20 µl的总体积执行测定。对于每个测定点：使4 µl 1 µMhusRAGE与4 µl测试抗体或IgG对照抗体以2 µM、1 µM、0.5 µM、0.25 µM、0.125 µM、62.5 nM、31.25 nM、15.62 nM、7.81 nM、3.9 nM的浓度在室温温育1小时。完成不含husRAGE和不含抗体的用于本底的对照。获得不含抗体的最大限度信号。随后，加入4 µl 800 nM生物素化Aβ-球聚体，以及2 µl 10.25 nM用于Anti-6HIS-Europiumcryptate和151.5 nM用于链霉抗生物素蛋白XL-665。通过加入结合缓冲液（1xPBS pH 7.4；0.1％BSA）调整体积中的差异。使测定温育另外1小时。在加入4 µl 2M KF贮存液后，在BMG Pherastar荧光仪器（BMG Labtech GmbH，德国）中以HTRF模式测量HTRF信号。使用不含抗体的最大限度信号曲线和仅使用Anti6HIS-Cryptate –或链霉抗生物素蛋白XL –溶液的本底结果。
使用GraphPad Prism 4（GraphPad Software，San Diego，USA），根据通过制造商CisBio的说明书计算％DeltaF值。结果显示于图3A、3B和3C中。该图中指出的浓度是在20 µl测定体积中的蛋白质终浓度。

[0367] 如图4中所示，表达RAGE的所有3个结构域的husRAGE的确与淀粉状蛋白Aβ-球聚体结合。由缺乏大部分v-结构域的人sRAGE组成的RAGE突变蛋白质（RAGE102-331）的确以更高亲和力与淀粉状蛋白Aβ-球聚体结合，从而指出在人RAGE内用于与Aβ-球聚体结合的结构域在C末端内。

[0368] 实施例6：使用 ALPHA筛选测定技术的 Aβ-球聚体与 RAGE蛋白质的结合这种测定以20 µl体积在测定缓冲液（25 mM HEPES、100 mM NaCl pH 7.4和0.1％BSA）中执行。所使用的供体珠是链霉抗生物素蛋白包被的（Perkin Elmer；6760002S），并且所使用的受体珠是A蛋白（Protein A） ALPHALISA（Perkin Elmer；CUSM64133000EA），用196 µl测定缓冲液预稀释各4 µl的珠。

[0369] 使用384孔Proxi-Plate（Perkin Elmer，编号6006280），供体珠装载有生物素-aβ-球聚体（参见上文），其中使用4 µl预稀释的供体珠和6µl生物素化-aβ-球聚体的200 nM溶液。

[0370] 受体珠装载有不同量的RAGE-Fc融合蛋白，其中使用4 µl预稀释的受体珠和6µl不同稀度的RAGE-Fc融合蛋白（从例如100 µg/ml开始）。

[0371] 装载（蛋白质与珠的结合）在黑暗中在室温进行30分钟。

[0372] 通过使预装载的供体和受体珠制剂在黑暗中组合另外180分钟开始Aβ-球聚体与RAGE的结合。在ALPHA-Quest仪器（Perkin Elmer）中用1秒的时间延迟测量信号。使用GraphPadPrism 软件完成进一步分析。在不同实验中但使用相同技术，使Aβ-球聚体与由所有3个结构域组成的RAGE-Fc的结合与Aβ-球聚体与仅由v-结构域（huRAGE的氨基酸1-130）组成的RAGE-Fc突变蛋白质的结合相比较。如图5中所示，淀粉状蛋白Aβ-球聚体与可溶性RAGE的3个结构域的结合是强的，并且淀粉状蛋白Aβ-球聚体与RAGE的
v-结构域的结合是可忽略的。因为Aβ-球聚体与RAGE的结合在C末端区域中发生，所以优选与这些结构域结合的抗体将预期竞争这种结合。

[0373] 实施例7：大肠杆菌 RAGE片段的构建、表达和纯化7.1. 构建体的制备
如下生成表6中列出的大肠杆菌RAGE构建体。通过PCR扩增由模板质粒pcDNA 3（-）
6.1 C HIS A产生构建体1，其中使用正向引物（atgctacatatgaaaaagacagctatcgcgatt gcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctcaaaacatcacagcc（SEQ ID NO：89））和反向引物（atgctactcgagtcagtggtggtgg tggtggtgagttcccagccctgatcctcccacagagcctgcagttggcccctcc （SEQ ID NO：90）），其引入用于亚克隆到pET29的类似位点内的Nde I和Xho I限制位点。使用构建体1作为模板生成剩余构建体（#2 - #7，表6）。由构建体1 PCR扩增编码RAGE氨基酸残基24-129、24-234、24-336、130-234、130-336、235-336的序列。所得到的DNA片段在1.0％琼脂糖凝胶上运行，并且使用来自Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒（Gel Extraction Kit）纯化DNA。用NdeI和XhoI消化DNA片段，并且连接到类似消化的pET28a内。将连接混合物转化到Max Efficiency DH5α感受态细胞内，并且在包含50 mg/L卡那霉素的LB琼脂板上铺平板。在37℃过夜温育后，将关于每个克隆的3个集落接种到包含50 mg/L卡那霉素的3 ml LB液体培养基内，并且在37℃振荡过夜。使用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit 分离DNA，并且使用T7启动子和T7终止子特异性引物测序插入片段。编码构建体#1 - #7的质粒的DNA序列作为SEQ ID Nos.：27-33列出，并且相应翻译区域作为SEQ ID Nos 34-40列出。

[0374] 表6：RAGE构建体大肠杆菌菌株BL21（DE3）用构建体#1质粒DNA转化，在包含卡那霉素（50 mg/L）的
LB板上铺平板，并且在37℃温育过夜。第二天，用CFU接种14个冯巴赫瓶，各自包含1L含卡那霉素（50 mg/L）的Terrific Broth，并且在培养箱中在37℃振荡（180 rpm）放置。当培养物达到OD600nm 0.47时，将瓶转移至30℃培养箱（仍在180 rpm振荡），并且通过加入0.4 mM IPTG诱导表达。在诱导后4小时通过离心（15,900 g，8分钟，4℃）收获细胞，并且随后使细胞糊（cell paste）冷冻于-80℃直至纯化时。

[0375] 通过首先解冻且在180 ml裂解缓冲液[50 mM Tris pH 7.6、300 mM NaCl、10％甘油、0.1％triton X-100、0.5 mM MgCl2、20 mM咪唑、1X Roche无EDTA蛋白酶抑制剂、20 U/ml DNA酶I]中重悬浮～20g细胞沉淀进行RAGE构建体1的纯化。通过在3℃使悬浮液连续3次经过Avestin Emulsiflex微流化床装置（microfluidizer）裂解细胞。随后将澄清的裂解物以2 ml/分钟装载到5 ml HiTrap IMAC柱（GE Healthcare，17-5255-01）上。随后用10 CV洗涤缓冲液[50 mM Tris pH 7.6、300 mM NaCl、10％甘油、20 mM咪唑]洗涤柱。
在洗涤步骤后，使用洗脱缓冲液[50 mM Tris pH 7.6、300 mM NaCl、10％甘油、500 mM咪唑]梯度洗脱RAGE。使含RAGE的级分合并，并且随后针对50mM Tris pH 7.6、20mM NaCl、
10％甘油透析。纯化的材料的质谱分析证实OmpA-前导区已处理掉，并且纯化的材料如预期的从RAGE的残基23开始（即，序列A-Q-N-...）。

[0376] 编码构建体#2- #7的质粒分开转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）内，在包含卡那霉素（50 mg/L）的LB板上铺平板，并且在37℃温育过夜。第二天，用集落接种1L Overnight Express Instant TB Medium（Novagen），并且在30℃振荡19小时。细胞通过离心（15,900 xg，10分钟，4℃）沉淀，并且随后冷冻于-80℃。使沉淀（各5-6克）解冻且重悬浮于50 ml裂解缓冲液[50 mM Tris，pH 8、300 mM NaCl、0.1％Triton X-100、10％甘油、0.2 mg/ml溶菌酶、1 ml蛋白酶抑制剂混合物（cocktail）组III（Calbiochem）、20U/ml benzonase、5 mM Β-巯基乙醇]中。使裂解物在Vibra Cell Sonicator上超声处理2分钟，随后在20K x g离心30分钟。用2 ml柱床体积的ProBond 镍树脂（Nickel Resin）填充来自Bio-Rad的Econo-Pac 10柱，并且用裂解缓冲液平衡。使澄清的裂解物连续3次经过柱，随后用3 x10柱体积（总共60 ml）洗涤缓冲液[2X PBS、20 mM咪唑、10％甘油、5 mM Β-巯基乙醇]洗涤。用5 x 1柱体积（总共10 ml）洗脱缓冲液[2X PBS、500 mM咪唑、10％甘油、5 mM Β-巯基乙醇]从柱中洗脱掉蛋白质。使用Bio-Rad Econo-Pac 10DG Columns将洗脱的材料转移到PBS、10％甘油和1 mM DTT内。

[0377] 7.2. 抗RAGE单克隆抗体 11E6、4E5和 7F9的表达用于杂交瘤细胞扩增的培养基由包含10％超低IgG胎牛血清（Invitrogen - 目
录#16250-078）的BD Cell MAb Quantum Yield Medium（Becton Dickenson – 目录#
220511）组成。简言之，在培养箱（65 rpm、8％CO2、37℃）中在2 L滚瓶振荡中扩增表达
6
RAGE单克隆抗体11E6的鼠杂交瘤细胞系的多重300 ml 种子培养物，直至达到1.0x10细
6
胞/ml的密度。随后将细胞以0.06 x 10细胞/mL的密度接种到在25L Wave BioReactor
中的20L培养基内，所述25L Wave BioReactor操作设置为14次摇动（rock）/分钟、摇动o
角（rock angle）6、温度37℃、和8％CO2喷射率0.15 Lpm。在2天后，通过加入培养基至
6
24 L的终体积进一步扩增培养物，从而导致0.43 x 10细胞/mL的新细胞密度。在扩增至完全体积后12天收获培养物。通过连续离心（Carr ViaFuge，6000 rpm，1.7 Lpm）取出细胞。在将5 mM NaN3（来自1 M NaN3原液 – Hampton Research）加入澄清的培养基中后，材料立即用于纯化过程。

[0378] 用于杂交瘤细胞扩增的培养基由包含10％超低IgG胎牛血清（Invitrogen - 目录#16250-078）的BD Cell MAb Quantum Yield Medium（Becton Dickenson – 目录#220511）组成。简言之，在培养箱（65 rpm、8％CO2、37℃）中在2 L滚瓶振荡中扩增表达RAGE
6
单克隆抗体4E5的鼠杂交瘤细胞系的多重300 ml种子培养物，直至达到1.0x10细胞/ml
6
的密度。随后将细胞以0.12 x 10细胞/mL的密度接种到在25L Wave BioReactor中的5Lo
培养基内，所述25L Wave BioReactor操作设置为12次摇动/分钟、摇动角6、温度37℃、和8％CO2喷射率0.15 Lpm。在4天后，通过加入培养基至24 L的终体积进一步扩增培养
6
物，从而导致0.24 x 10细胞/mL的新细胞密度。摇动率增至14次摇动/分钟。在扩增至完全体积后12天收获培养物。通过连续离心（Carr ViaFuge，6000 rpm，1.7 Lpm）取出细胞。在将5 mM NaN3（来自1 M NaN3原液 – Hampton Research）加入澄清的培养基中后，材料立即用于纯化过程。

[0379] 用于杂交瘤细胞扩增的培养基由包含10％超低IgG胎牛血清（Invitrogen - 目录#16250-078）的BD Cell MAb Quantum Yield Medium（Becton Dickenson – 目录#220511）组成。简言之，在培养箱（65 rpm、8％CO2、37℃）中在2 L滚瓶振荡中扩增表达
6
RAGE单克隆抗体7F9的鼠杂交瘤细胞系的多重300 ml种子培养物，直至达到1.0x10细胞
6
/ml的密度。随后将细胞以0.05 x 10细胞/mL的密度接种到在25L Wave BioReactor中
o
的10L培养基内，所述25L Wave BioReactor操作设置为12次摇动/分钟、摇动角6、温度
37℃、和8％CO2喷射率0.15 Lpm。在4天后，通过加入培养基至25 L的终体积进一步扩增
6
培养物，从而导致0.25 x 10细胞/mL的新细胞密度。摇动率增至14次摇动/分钟。在扩增至完全体积后10天收获培养物。通过连续离心（Carr ViaFuge，6000 rpm，1.7 Lpm）取出细胞。在将5 mM NaN3（来自1 M NaN3原液 – Hampton Research）加入澄清的培养基中后，材料立即用于纯化过程。

[0380] 7.3. 抗RAGE单克隆抗体 11E6、4E5和 7F9的纯化向澄清的杂交瘤培养基中，加入甘氨酸和NaCl分别至3M和1.5M的终浓度。pH用NaOH
调整至8.0。使用5 µm Pall Capsule #120 薄膜滤器过滤材料且装载到200 mL BioSepra A蛋白（Protein A）柱上。用11 CV洗涤缓冲液（20 mM磷酸钠pH 8.0，1mM叠氮化钠）洗涤蛋白质溶液，并且使用50 mM甘氨酸（pH 3.0）的分级梯度洗脱。收集100 mL大小的级分，并且通过测量A280nm测定蛋白质浓度。所有柱加工步骤在4℃运行。合并的材料针对20 L 10 mM Tris pH 8.0在4℃透析过夜。使用SartoBind Q强碱性阴离子交换剂Singlesep Mini药液筒（Sartorius）以10 mL/分钟的流通模式达到进一步层析精加工。抗体不结合柱，并且作为一个库收集。在这个步骤后，使用Amicon搅拌压敏元件（stirred pressure cell）（5000 MWCO膜，75 psi，4℃）使材料浓缩至5 mg/ml。最后，使抗体针对20L PBS缓冲液（10 mM磷酸盐、0.138 M NaCl、0.0027 M KCl，pH 7.4）透析2次，每个循环在4℃进行
24小时。

[0381] 7.4. ELISA结合实验：抗原（纯化的构建体#1-7蛋白质）在包被缓冲液[100 mM NaHCO3，pH 8.2]内稀释至
1µg/ml，并且随后将100 µl所得到的溶液等分试样到96孔Nunc Immuno Plate（Maxi-Sorb Surface，平底，目录# 439454）内。用密封薄膜密封板，并且在4℃温育过夜。第二天，板孔用150 µL PBST缓冲液[Sigma PBS + 0.05％Tween 20]各洗涤3次。随后将300ul阻断
溶液（在PBST中的3％NFDM）加入每个孔中。使板在室温和在100 rpm振荡下温育2小时。
在温育步骤后，每个孔再次用150 uL PBST洗涤3次。加入在PBST/0.5％BSA中制备的各种稀度的100 ul待测试的相应抗体（即7F9、11E6和4E5）。随后用密封薄膜密封板，并且在室温和在100 rpm振荡下温育2小时。接下来，从孔中排出抗体溶液，并且每个孔随后用
200ul PBST洗涤3次。随后向每个孔中加入200ul 1:5000稀释（在PBST/1％NFDM中）的缀合的第二抗体[驴抗小鼠HRPO缀合物，Jackson Immuno Research，目录#715-035-150]。
覆盖板，并且允许在室温在100 rpm振荡时温育1小时。在这次温育后，从孔中取出溶液，并且每个孔用200ul PBST洗涤3次。向每个孔中加入100µL HRPO底物[3,3',5',5'-四
甲基联苯胺液体底物（Liquid Substrate）（TMB），Supersensitive for ELISA，Sigma 目录#T4444]溶液，并且使板在室温温育10分钟。最后，将50 µL 2M H2SO4加入每个孔中，以终止反应，并且使用微量滴定板阅读器测量每个孔的A540nm。

[0382] 这些结合实验的结果显示于图6 A、6B和6C以及图7A、7B和7C中。图6A、6B和6C显示RAGE残基24-234不与RAGE单克隆抗体11E6、4E5或7F9的结合有关。相反，如图7A、7B和7C中所示，RAGE残基235-336足以用于RAGE单克隆抗体11E6和4E5的结合。RAGE
mAb 7F9未显示与这些（大肠杆菌表达的）RAGE片段中的任何一种的任何结合。

[0383] 实施例8：表位作图8.1. 11E6、4E5和 7F9抗体的固定化
约20 mg CNBr活化琼脂糖（Sepharose）快速流动树脂称重到配备35 μm玻璃料
（frit）的3个致密（compact）反应柱内。在用200 μL 1 mM HCl洗涤3次前，允许树脂在
200 μL 1 mM HCl中膨胀。树脂随后用包含500 mM氯化钠的200 μL 100 mM碳酸氢钠缓冲液（pH 8.3）（缓冲液A）漂洗3次。一旦完成，就从柱中冲洗出溶液，从而使得仅薄层缓冲液保留在每种树脂的表面上。约5.5 nmoles抗体固定化至树脂，这需要加入235 μL 7F9（3.4 mg/mL）、500 μL 11E6（1.6 mg/mL）和200 μL 4E5（3.75 mg/mL）。对于7F9和4E5抗体固定化，还包括200 μL缓冲液A。使致密反应柱密封，并且允许通过倒转在室温混合
4小时。一旦完成，就开封致密反应柱，并且用200 μL缓冲液A的3次添加冲洗，以取出未结合的抗体。在冲洗后，将包含100 mM Tris-HCl（pH 8）和500 mM氯化钠的200 μL缓冲液（缓冲液B）加入每个柱中。使柱再次密封且允许通过倒转在室温混合，以封闭在树脂上未结合但活化的位点。在2小时后，开封柱并且首先用包含500 mM氯化钠的200 μL
100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4）（缓冲液C）冲洗，随后为200 μL缓冲液B。这个过程重复另外2次，以确保未结合的抗体的完全取出，且完全封闭在树脂上的剩余附着位点。在偶联抗原前，树脂随后用包含100 mM氯化钠的200 μL 100 mM碳酸氢钠缓冲液（pH 8.3）（缓冲液D）洗涤4次。

[0384] 8.2. 大肠杆菌和BacMam表达的 sRAGE抗原的蛋白酶解切割通过将75 μL大肠杆菌表达的抗原加入11E6和4E5树脂和将125 μL BacMam表达
的抗原加入11E6、4E5和7E9树脂，允许sRAGE抗原与抗体柱结合。使柱密封，并且允许样品通过倒转在室温混合2小时。在这次后，开封柱，并且用200μL缓冲液D的4次添加冲洗。在通过漂洗冲洗后，使树脂以及蛋白酶一起重悬浮于200μL缓冲液D中，所述蛋白酶作为胰蛋白酶、内切蛋白酶（endoproteinase）Glu-C或胰凝乳蛋白酶的0.1 mg/mL溶液生成。
蛋白酶的量在实验之间变化以减弱消化，但范围为抗原超过蛋白酶的按重量计的200-400倍过量。伴随通过倒转混合12小时，允许在室温发生蛋白酶解。在这次后，开封柱，并且冲洗蛋白酶解溶液且保存用于进一步分析。对于实施双重消化的样品，在下一个步骤前，使树脂重悬浮于200 μL缓冲液D和第二种蛋白酶中。对于未在第二种蛋白酶中处理的那些
样品，对柱实施在缓冲液D中的2次个别200 μL洗涤，随后为在缓冲液A中的200 μL洗涤，随后为在缓冲液D中的最后200μL洗涤。每次洗涤分开保留用于以后分析。用在2％甲酸中的3次个别200 μL洗涤，从柱中洗脱含表位的肽。每种洗脱样品分开保留用于以后分析。

[0385] 8.3. 含表位的肽的质谱分析法分析使用Bruker Apex QE 7T 傅立叶变换离子回旋共振（Fourier-Transform Ion
Cyclotron Resonance）（FT-ICR）质谱仪以及Applied Biosystems Q-STAR Pulsar I质谱仪分析样品。对于FT-ICR质谱分析法分析，通过Agilent系列1100毛细管HPLC，将8 μL表位切割样品注射到Jupiter C4反相柱（0.5 x 150 mm，5μ颗粒大小，300 Å孔径）上。样品在含0.1％甲酸的90％水（溶剂A）/含0.1％甲酸的10％乙腈（溶剂B）中以5μL/分钟流速洗涤5分钟以脱盐。通过使流动相组成改变为5％溶剂A/95％溶剂B，使肽洗脱到质谱仪内。需要直接输注用于串联质谱分析法的样品注射到在98％水、1％乙腈和1％甲酸中平衡的蛋白质Microtrap（Michrom）上。在300μL 60％乙腈、40％水和0.1％甲酸中洗脱前，用1 mL平衡溶剂洗涤样品。洗脱液以2 μL/分钟直接输注到FT-ICR质谱仪内。对
于Q-STAR Pulsar质谱仪，通过Agilent系列1100 HPLC，将5-30 μL样品注射到蛋白质Microtrap（Michrom）上。在结合的肽洗脱到在5％溶剂A/95％溶剂B中的质谱仪内前，样品在95％溶剂A/5％溶剂B中洗涤1分钟。

[0386] 与11E6抗体结合的大肠杆菌表达的sRAGE的蛋白酶解切割和含表位的肽的洗脱+揭示具有质量12,204.5 Da的肽的存在。10电荷状态的混合选择和碰撞活化的解离证实
229 346
这种肽的特性，这与残基Val -His （这个His残基是由于六-His标签加入sRAGE蛋白
质中）对应。使用胰蛋白酶随后为胰凝乳蛋白酶蛋白酶解的进一步表位作图揭示C末端六
229 341
组氨酸标签的切割，从而使表位改进至残基Val -His （这个His残基是由于六-His标
签加入sRAGE蛋白质中）。使用蛋白酶解无法获得这个表位的进一步改进。与4E5抗体结合的大肠杆菌表达的sRAGE类似执行的蛋白酶解切割揭示12,204.5 Da的相同肽，其对于
11E6抗体表位观察到。相应地，与11E6或4E5抗体结合的BacMam表达的sRAGE的切割揭
示含质量10,671.9 Da和10,614.0 Da肽的2个主要表位。这些肽与BacMam表达的构建
229 331 229 330
体的C末端匹配，分别跨越残基Val -Gly 和Val -Ala 。

[0387] 与7F9抗体结合的BacMam表达的sRAGE的蛋白酶解切割和含表位的肽的洗脱揭示代表几种重叠肽的多个种类。质谱的去褶合揭示具有质量12,079.6 Da、12,372.9
105 216 105 218
Da、13,477.3 Da和24,132.3 Da的肽。这些质量分别与残基Asn -Arg 、Asn -Arg 、
105 228 105 331 105 216
Asn -Arg 和Asn -Gly 匹配，从而暗示跨越残基Asn -Arg 的最低限度表位。

[0388] 这些结果指示抗体11E6和4E5具有在大肠杆菌和BacMam表达的sRAGE的C末端上的表位，并且抗体7F9识别在BacMam表达的sRAGE的中央结构域上的表位。

[0389] 实施例9：Biacore和表面等离振子共振测量使用Biacore和表面等离振子共振测量来测量本发明的3种单克隆抗体即7F9、11E6
和4E5的亲和力。

[0390] 9.1. 用于抗RAGE结合动力学测定的材料与方法：Biacore 2000仪器用于测量小鼠抗RAGE mAb结合动力学。用于mAb亲和力分析的测
定形式是经由固定化的抗Fc抗体的基于Fc的捕获。采用标准胺偶联规程，以经由伯胺使Fc特异性IgG固定化到CM5传感器芯片（sensorchip）（Biacore）的羧甲基（CM）葡聚糖表面。对于小鼠抗RAGE mAbs的研究，抗小鼠Fc（Biacore，抗小鼠，BR-1005-14）用作固定化的捕获试剂。对Biacore 2000可用的自动化规程用于在传感器芯片的所有4个流动池中固定化8000-10000RU捕获试剂。简言之，通过新鲜制备的1:1 50mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）:200mM 3-（N,N-二甲氨基）丙基-N-乙基碳二亚胺（EDC）激活CM-葡聚糖表面。随后将抗Fc IgG捕获试剂（在10mM乙酸钠中20ug/ml，pH4.5）应用于表面，随后为表面灭活和用1M乙醇胺（pH 8.5）封闭残留反应位点。

[0391] 所采用的运行缓冲液是HBS-EP+ [10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％P20表面活性剂（Biacore）]用于小鼠抗RAGE mAbs。每次实验循环由下述步骤组成：1）抗RAGE mAbs在流动池2、3或4中捕获至50-200RU水平（依赖于抗原）。所有测量都对照不具有捕获的抗RAGE mAb的流动池1进行基准化（reference）。2）抗原注射经过所有4个流动池，以60ul/分钟180ul。在抗原注射后，以60ul/分钟监控解离600秒。3）用低pH甘氨酸再生抗Fc捕获表面。对于动力学测定，RAGE注射是随机化一式两份的20nM – 0.31nM的2倍稀释系列，和仅缓冲液。

[0392] 9.2. 评价和结果使用Biacore评价软件处理数据。简言之，通过首先扣除来自参考池的信号，并且其次通过扣除来自仅缓冲液注射的信号，使数据双重基准化。来自RAGE注射系列的双重基准化的数据随后全局拟合至1:1（Langmuir）结合模型，这包括传质项，以测定结合动力学速率常数ka和kd，以及亲和力KD。

[0393] 表7显示4E5不与小鼠RAGE（Mu-RAGE）结合。11E6和4E5彼此交叉竞争与RAGE结合。7F9不与在大肠杆菌中产生的缺乏糖基化的RAGE结合。

[0394] 表7还显示本发明的3种抗体与人RAGE结合的特异性表位，其经由表位作图，使用保护人sRAGE免于蛋白酶解消化和用质谱分析法鉴定受保护的肽实现。MAb 7F9与C1105 215 229 340
（Asn – Pro ）结合；mAb 4E5与C2（在大肠杆菌RAGE中的Val – Thr ；在哺乳动
229 331
物细胞中产生的husRAGE中的Val – Gly ）结合；并且11E6与C2（在大肠杆菌RAGE
238 314 229 331
中的Val – Arg ；在哺乳动物细胞中产生的husRAGE中的Val – Gly ）结合。

[0395] 表7：抗体与之结合的表位Mab 亲和力（nM）表位小鼠-RAGE
7F9 0.11 C1；糖基化敏感的 +
11E6 0.29 C2；与4E5重叠 +
4E5 2.2 C2；与11E6重叠 -
实施例10：在 C57BL/6雌性小鼠中的体内脑血容量（CBV）研究
10.1. 动物
C57BL/6雌性小鼠（4-6个月大；Taconic，Germantown，New York，USA）维持在于静室中在12小时光照打开/12小时光照关闭的条件下（在06:00时打开）的标准无菌木屑垫层上，其中食物和水可随意获得。总共33只小鼠用于fMRI-CBV研究。所有研究由Abbott institutional Animal Care and Use Committee批准且密切监控，其坚持National
Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals指导方针，在由Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care承认资格的设施中。

[0396] 10.2. 可溶性Aβ肽制剂在Abbott Laboratories合成Aβ1-40（>99％纯）。简言之，用1mM IPTG诱导大肠杆
菌BL21（DE3），并且在18L 发酵罐运行中3小时在41℃表达3小时。收获185克细胞糊。
肽作为内含体表达。细胞在包含0.1％triton X100的0.1M tris缓冲液中裂解。沉淀随后用50mM tris缓冲液洗涤3X，并且用水洗涤1次。弃去洗涤物，并且使最终沉淀重悬浮到水内且冻干。将冻干沉淀提取到500mL DMSO内，并且用0.2％氨水稀释至1L。这个1L样品针对包含0.1％氨的19L 10％乙醇透析。透析用仅0.1％氨水在室温继续5小时的总时间。
1.4L样品用0.1％氨稀释至2L，并且应用于2.5 X 25cm PLRP-S HPLC柱（Polymer Labs，Amherst，MA），用0.1％氨水平衡。洗脱用包含0.1％氨的乙腈。Aβ1-40在10 - 30％B梯度的过程中在200分钟期间洗脱。使合并的材料冻干。MALDI分析用于证实材料的特性和纯度。材料纯化为AβMet-1-40，N15标记的。少量甲硫氨酸亚砜在样品中在+16质量单位处存在。138 mg在这个单次运行中作为肽的铵盐纯化。反向序列Aβ40-1（>99％纯）购自Sigma Chemical Co.（St. Louis，MO，USA）。Aβ肽（0.01或0.1 mg）紧在每次fMRI-CBV实验前分开溶解于新鲜的磷酸缓冲盐水（0.1 mL；PBS）中。对于初始研究，小鼠随机指定到
5个处理组内：PBS对照，Aβ1-40（0.01或0.1 mg/小鼠）或Aβ40-1（0.01或0.1 mg/小鼠），每个组中具有5只动物。

[0397] 10.3. 抗体制剂在Abbott Laboratories合成阴性IgG对照抗体和抗RAGE抗体11E6（两者都>99％
纯）。

[0398] 10.4. 使用fMRI的 CBV测量所有fMRI实验都在具有20 G/cm 磁场梯度垫圈（gradient insert）（Biospec Bruker，Billerica，MA）的7.0 T/21 cm水平磁体上执行。动物首先用美托咪定（meditomidine）（1 mg/kg，i.p.；Pfizer Animal Health，Exton，Pennsylvania，USA）+ 氯胺酮（75 mg/kg，i.p.；Fort Dodge Animal Health，Iowa，USA）麻醉，并且随后置于双重线圈小动物限制器（Insight Neuroimaging Systems，LLC，Worcester，MA）中，其包含用于发射的体积线圈（volume coil）和用于接受的表面线圈（surface coil）。经由力转换器连续监控呼吸率和波形。监控直肠温度且经由反馈调节的循环水垫将其维持在37 ± 1℃。所有成像在光照阶段过程中执行。线圈间电磁相互作用被主动去耦。使用快速自旋-回波快速采集弛豫增强（RARE）脉冲序列（fast spin-echo rapid acquisition relaxation enhanced (RARE) pulse sequence）获得解剖学图像，其中TR = 3 s、有效TE = 100 ms、矩阵= 256 x 256、FOV = 2.56 cm x 2.56 cm、9个1.0-mm切片和4个平均值。梯度回波单次激发回波-平面成像（gradient echo single-shot echo-planar imaging）（EPI）用于fMRI-CBV图像采集，其中TR = 2 s、TE = 13 ms、矩阵= 64 x 64、FOV = 2.56 cm x 2.56 cm、且给出平面内分辨率= 400 µm x 400 µm。10 mg Fe/kg超小型超顺磁氧化铁（USPIO）造影剂（SH U555C，Schering AG，德国）2分钟静脉内施用到18分钟图像采集内。可溶性Aβ和PBS使用注射器泵在造影剂后6分钟经由尾静脉施用（0.1 mL/分钟进行1分钟），并且随后在后续10分钟时间段期间检测CBV中的改变。在成像研究开始前3小时，对照IgG1抗体或11E6 ip施用于在其本来笼（home cage）中的小鼠。

[0399] 10.5. fMRI数据分析使用Analysis of Functional NeuroImages（AFNI）软件包（Cox R W，Comput Biomed Res 29:162-173，1996）执行数据分析。为了鉴定时间依赖性相对CBV改变，基于关系（Mandeville等人，1999）由时程原始数据计算rCBV（t），
其中s（t）是在Aβ或PBS输注后的信号强度， S0（t）是在Aβ或PBS输注前的基
线信号，并且Spre是在造影剂施用前的平均信号强度。时程rCBV改变以线性函数去掉趋势（detrended），以解释造影剂从血液中的消除（Cox，1996）。

[0400] 随后，关于每只小鼠中的每个体元（Voxel）的rCBV信号拟合至反映药物动力学的非线性微分指数模型（nonlinear differential exponential model）（Eq.2）（Luo等人，2004），其中t0是应答的时间延迟，k是倍增系数，α1是消除速率，并且α2是吸收速率。

[0401] 与参数t0、k、α1和α2拟合的初始值分别是0-45秒、-500-500、0-0.15和0.15 -0.5，这基于已知Aβ动力学（Shiiki等人，J Neurosci 24:9632-9637，2004）。使用AFNI基于模型拟合的最大限度显著性自动测定关于t0、k、α1和α2的最终值。随后在Bonferroni校正后以p < 0.05测定活化的rCBV体元。

[0402] 图8中所示的结果指示Aβ1-40以剂量依赖性和区域特异性方式降低CBV（用0.01 mg图8a和用0.1 mg图8b）。当小鼠用高剂量处理（图8b）时，与Aβ1-40的更低剂量（图8a）相比较，降低的CBV的程度明显更大，尽管影响相似脑区域（例如额皮质、尾状核（caudate）、丘脑、海马）。与Aβ1-40的剂量依赖性作用形成对比，当在相同剂量下测试时（用0.01 mg图8c和用0.1 mg图8d），反向肽Aβ40-1不显著影响CBV，并且所观察到的CBV中任何降低的程度与PBS处理的对照组（PBS，图8e）无明显不同。在12分钟时程中，通过Aβ1-40诱导的CBV中的降低幅度，其对于跨越几个脑区域的受累体元素范围为10-20 ％，在施用后5分钟内一致地达到最大值，对于研究的持续时间保持降低（在图8f中显示了关于海马的代表性数据），并且对于Aβ1-40的2种剂量是相似的。这些数据与使用侵袭性激光多普勒流量测定法（flowmetry）技术（未显示）的另外研究一致。

[0403] 为了使用fMRI测试11E6对CBV的作用，首先评价对照IgG1抗体的预施用作用。如预期的，在成像开始前3小时IgG1抗体的预施用不阻断用Aβ1-40（用0.01 mg 图9a）攻击的作用。相比之下，在成像开始前3小时给予的0.1 mg/小鼠剂量的11E6完全阻断正
常由用Aβ1-40（用0.1 mg 图9b）攻击引发的CBV中的降低。类似地，CBV幅度中的降低也通过用抗RAGE抗体11E6的预处理取消，但不由对照抗体取消（图9c）。这些数据证实抗体
11E6在阿尔茨海默氏病相关动物模型中的体内功能活性。

[0404] 实施例11：CDR嫁接的抗体的构建通过应用本领域众所周知的标准方法，将单克隆抗体11E6的VH和VL链的CDR序列（参
见上表4）嫁接到不同不同人重和轻链受体序列内。基于与本发明的单克隆抗体11E6的VH和VL序列的序列VH和VL比对，选择下述已知人序列：
a）VH7-4.1和VH1-2以及连接序列hJH6用于构建重链受体序列（根据上表2）；
b）1-12/L5和3-15/L2以及hJK2用于构建轻链受体序列（根据上表3）。

[0405] 通过将11E6的相应VH和VL CDRs嫁接到所述受体序列内，制备下述CDR嫁接的、人源化的、修饰的VH和VL序列（还参见上表5）：VH 11E6.1-GL、VH 11E6.2-GL、VL
11E6.1-GL和VL 11E6.2-GL。

[0406] 实施例12：CDR嫁接的抗体中的构架回复突变的构建为了生成人源化抗体构架突变，使用本领域众所周知的方法，使用可变结构域的从头
合成和/或诱变引物和PCR，将突变引入CDR嫁接的抗体内。如下对于CDR-嫁接的每一个构建回复突变和其他突变的不同组合。

[0407] 对于重链VH 11E6.1-GL，下述Vernier和VH/VL界面残基中的一个或多个如下进行回复突变：V2→I和/或Y95→F。

[0408] 对于重链VH 11E6.2-GL，下述Vernier和VH/VL界面残基中的一个或多个如下进行回复突变：V2→I、V68→F、M70→F、R72→L、Y95→F。

[0409] 对于轻链VL 11E6.1-GL，下述Vernier和VH/VL界面残基中的一个或多个如下进行回复突变：A43→S、Y49→F、Y87→F。

[0410] 对于轻链VL 11E6.2-GL，下述Vernier和VH/VL界面残基中的一个或多个如下进行回复突变：A43→S、Y49→F、I58→V、Y87→F。

[0411] 另外突变包括下述：对于重链
VH 11E6.1-GL、Q1→E，并且对于
VH 11E6.2-GL、Q1→E、I76→T、R85→S、D89→E；
对于轻链
VL 11E6.1-GL、V11→L，和
VL 11E6.2-GL、V13→L、E70→D。

[0412] 实施例13：重组人源化抗 RAGE抗体的构建和表达将包含含构架回复突变的重和轻链的pHybE表达载体共转染到293-6E细胞内，以瞬时
产生全长人源化抗体。通过可变结构域的从头合成和/或使用诱变引物和PCR以及本领域众所周知的方法，如根据实施例11制备的，将突变引入CDR嫁接的抗体序列内。人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列公开于表8中。

[0413] 表8：人源化抗体的表达具体地，对于重链：
VH h11E6.1、VH h11E6.2、VH h11E6.3和VH h11E6.4包含VH 11E6.1-GL，具有Q1→E
突变。

[0414] VH h11E6.5、VH h11E6.6、VH h11E6.7和VH h11E6.8包含VH 11E6.1-GL，具有Q1→E突变以及下述Vernier和VH/VL界面残基回复突变：V2→I和Y95→F。

[0415] VH h11E6.9、VH h11E6.10、VH h11E6.11和VH h11E6.12包含VH 11E6.2-GL，具有Q1→E、I76→T、R85→S和D89→E突变。

[0416] VH h11E6.13、VH h11E6.14、VH h11E6.15和VH h11E6.16包含VH 11E6.2-GL，具有Q1→E、I76→T、R85→S、D89→E突变以及下述Vernier和VH/VL界面残基回复突变：V2→I、V68→F、M70→F、R72→L和Y95→F。

[0417] 对于轻链：VL h11E6.1、VL h11E6.5、VL h11E6.9和VL h11E6.13包含VL 11E6.1-GL 具有V11→L
突变。

[0418] VL h11E6.2、VL h11E6.6、VL h11E6.10和VL h11E6.14包含VL 11E6.1-GL 具有V11→L突变以及下述Vernier和VH/VL界面残基回复突变：A43→S、Y49→F和Y87→F。

[0419] VL h11E6.3、VL h11E6.7、VL h11E6.11和VL h11E6.15包含VL 11E6.2-GL，具有V13→L和E70→D突变。

[0420] VL h11E6.4、VL h11E6.8、VL h11E6.12和VL h11E6.16包含VL 11E6.2-GL，具有V13→L和E70→D突变以及下述Vernier和VH/VL界面残基回复突变：A43→S、Y49→F、I58→V和V87→F。

[0421] 实施例14：使用竞争 ELISA表征人源化 11E6抗体ELISA板（Costar 3369）在4℃用50 μl/孔在0.2 M碳酸钠-碳酸氢盐缓冲液，pH
9.4中的2μg/ml hRAGE（1-331）包被过夜，用洗涤缓冲液（含0.1％Tween 20的PBS）洗涤，并且用200 μl/孔在PBS中的2％脱脂乳粉在室温封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，一式两份加入在50 μl/孔ELISA缓冲液中的生物素化m11E6（0.3 μg/ml终浓度）和未标记的竞争者测试抗体的混合物，所述测试抗体从81 μg/ml终浓度开始，并且连续稀释3倍）。使板在室温温育1小时并且用洗涤缓冲液洗涤后，使用100 μl/孔在ELISA缓冲液中1:10,000稀释的HRP缀合的链霉抗生物素蛋白（Fitzgerald）检测结合的抗体。在室温温育1小时并且用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100 μl/孔TMB微冲液（Buffer）（Zymed）执行显色。在室温温育15分钟后，通过加入50 μl/孔1N盐酸终止显色。读取在490 nm下的吸光度。表9显示使用计算机软件GraphPad Prism（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）获得的人源化11E6抗体的IC50值。

[0422] 表9：在竞争ELISA中人源化11E6抗体的IC50值实施例15：测定关于抗 RAGE mAb与 RAGE相互作用的结合常数
Biacore 2000和Biacore T100仪器用于测量抗RAGE mAb结合动力学。用于mAb亲
和力分析的测定形式是经由固定化的抗Fc抗体的基于Fc的捕获。采用标准胺偶联规程，以经由伯胺使Fc特异性IgG固定化到CM5传感器芯片（Biacore）的羧甲基（CM）葡聚糖表面。对于小鼠抗RAGE mAbs的研究，抗小鼠Fc（Biacore，抗小鼠，BR-1005-14）用作固定化的捕获试剂，并且对于人源化抗RAGE mAbs的研究，抗人Fc（Pierce 31125）用作固定化的捕获试剂。对Biacore 2000和Biacore T100可用的自动化规程用于在传感器芯片的所有
4个流动池中固定化8000-10000RU捕获试剂。简言之，通过新鲜制备的1:1 50mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）:200mM 3-（N,N-二甲氨基）丙基-N-乙基碳二亚胺（EDC）激活CM-葡聚糖表面。随后将抗Fc IgG捕获试剂（在10mM乙酸钠中20ug/ml，pH4.5）应用于表面，随后为表面灭活和用1M乙醇胺（pH 8.5）封闭残留反应位点。

[0423] 所采用的运行缓冲液是PBS-P [1X PBS（Sigma P3813），pH 7.4，0.005％P20表面活性剂（Biacore）]用于人源化抗体。每次实验循环由下述步骤组成：1）抗RAGE mAbs在流动池2、3或4中捕获至50-200RU水平（依赖于抗原）。所有测量都针对不具有捕获的抗RAGE mAb的流动池1进行基准化。2）抗原注射经过所有4个流动池，以80ul/分钟240ul。在抗原注射后，以80ul/分钟监控解离600秒。3）用低pH甘氨酸再生抗Fc捕获表面。对于动力学测定，抗原注射是随机化一式两份的30nM – 0.12nM（对于sRAGE [RAGE（1-331）]的3倍稀释系列，和仅缓冲液。

[0424] 使用Biacore评价软件或Scrubber 2.0软件（BioLogic Software）处理数据。简言之，通过首先扣除来自参考池的信号，并且其次通过扣除来自仅缓冲液注射的信号，使数据双重基准化。关于RAGE注射系列的双重基准化的数据随后全局拟合至1:1（Langmuir）结合模型，这包括传质项，以测定结合动力学速率常数ka和 kd，以及亲和力KD（ka = kon；kd = koff）表10：Biacore数据
KD值对于所有3种mAbs是两位数字的pM，并且就其结合动力学而言看起来在3种mAbs
之间不存在显著差异。在并存的实验中，原始小鼠11E6 mAb用这种抗原（人sRAGE 1-331，V#400）进行评价，并且也是两位数字的pM KD。

[0425] 原始小鼠11E6 mAb先前报告为290pM。然而，这些早期实验使用不同缓冲系统（Biacore缓冲液HBS-EP+：10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％P20）。缓冲液选择当然可以影响动力学。

[0426] 实施例16：在老年 Tg2576小鼠中的体内脑血管血容量（CBV）研究16.1. 动物
阿尔茨海默氏病的Tg2576小鼠模型（Hsiao等人.,1996）在仓鼠朊病毒蛋白质（PrP）
启动子的控制下以高水平表达APP的Swedish突变（APPK670N,M671L）。充分确定这个突变引起分泌的Ab42和Ab40中的伴随增加。随着Tg2576小鼠变老，出现类似于在阿尔茨海默氏病中可见的那些的斑。此外，Tg2576小鼠发展年龄依赖性行为缺陷，如通过Y迷宫、T迷宫和Morris水迷宫测试评估的（Hsiao等人（1996）Correlative memory deficits，Ab elevation，and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274:99 –102.）
16.2 抗体制剂
在Abbott Laboratories合成阴性IgG对照抗体和抗RAGE抗体11E6（两者都>99％
纯）。

[0427] 16.3. 使用fMRI的 CBV测量fMRI-CBV实验在具有20 G/cm磁场梯度垫圈（Biospec Bruker，Billerica，MA）的7.0 T/21 cm水平磁体上执行。老年Tg2576小鼠（19-20个月大）首先用美托咪定（1 mg/kg，i.p.；Pfizer Animal Health，Exton，Pennsylvania，USA）+ 氯胺酮（75 mg/kg，i.p.；Fort Dodge Animal Health，Iowa，USA）麻醉，并且随后置于双重线圈小动物限制器（Insight Neuroimaging Systems，LLC，Worcester，MA）中，其包含用于发射的体积线圈和用于接受的表面线圈。经由力转换器连续监控呼吸率和波形。监控直肠温度且经由反馈调节的循环水垫将其维持在37 ± 1℃。所有成像在光照阶段过程中执行。线圈间电磁相互作用被主动去耦。使用快速自旋-回波快速采集弛豫增强（RARE）脉冲序列获得解剖学图像，其中TR =
3 s、有效TE = 100 ms、矩阵= 256 x 256、FOV = 2.56 cm x 2.56 cm、9个1.0-mm切片和
4个平均值。梯度回波单次激发回波-平面成像（EPI）用于fMRI-CBV图像采集，其中TR =
2 s、TE = 13 ms、矩阵= 64 x 64、FOV = 2.56 cm x 2.56 cm、且给出平面内分辨率= 400 µm x 400 µm。10 mg Fe/kg超小型超顺磁氧化铁（USPIO）造影剂（SH U555C，Schering AG，德国）2分钟静脉内施用到18分钟图像采集内。小鼠11E6或非特异性小鼠IgG1（对照抗体）使用注射器泵在造影剂后6分钟经由尾静脉施用（0.1 mL/分钟进行1分钟），并且随后在后续10分钟时间段期间检测CBV中的改变。

[0428] 16.4 fMRI数据分析使用Analysis of Functional NeuroImages（AFNI）软件包（Cox，1996）执行数据分析。为了鉴定时间依赖性相对CBV改变，基于关系（Mandeville等人，1999）由时程原始数据计算rCBV（t），
其中s（t）是在Aβ或PBS输注后的信号强度， S0（t）是在Aβ或PBS输注前的基线
信号，并且Spre是在造影剂施用前的平均信号强度。时程rCBV改变以线性函数去掉趋势，以解释造影剂从血液中的消除（Cox，1996）。

[0429] 随后，关于每只小鼠中的每个体元的rCBV信号拟合至反映药物动力学的非线性微分指数模型（Eq.2）（Luo等人，2004），其中t0是应答的时间延迟，k是倍增系数，α1是消除速率，并且α2是吸收速率。

[0430] 使用AFNI基于模型拟合的最大限度显著性自动测定关于t0、k、α1和α2的最终值。随后在Bonferroni校正后以p < 0.05测定活化的rCBV体元。记录具有CBV增加的全脑激活的体元。因为未变换的数据不与ANOVA假定一致，所以采用Box-Cox变换，以确保足够的正常性和变异同质性。在fMRI-CBV模型中在19个月大的TG2576小鼠中，11E6作用与IgG1比较在统计学上显著（p<0.05）。

[0431] 结果显示于附图10中。我们的数据延伸了Deane（Deane等人，2003）的结果，其显示靶向RAGE内的多种表位的多克隆抗RAGE抗体可以增强APP转基因小鼠中的脑血液灌注。我们的数据首次显示靶向RAGE内的C2-结构域的单克隆抗体11E6增加APP转基因小鼠中的脑血液灌注。这种作用可能通过高水平Aβ与RAGE的竞争结合介导。高水平的Aβ存在于脑和血浆中，这是由于人APP的超表达。用11E6治疗AD患者可以因此增加这些患者中的脑灌注，从而潜在导致神经元功能的改善。同时患者的治疗可以通过跟踪治疗过程中的脑血流量潜在进行监控。

[0432] 实施例17：通过抗体 11E6保护海马神经元免于 Aβ诱导的发动蛋白切割17.1. 海马神经元的培养
根据文献（Goslin和Banker.（1991）Rat Hippocampal Neurons in Low-Density
Culture. In：Banker G 和 Goslin K（编辑）. Culturing Nerve Cells，MIT Press，Cambridge）制备大鼠海马神经元，伴随轻微修饰。简言之，切开19天大的胚胎大鼠的海马并且与脑膜分离。通过组织的胰蛋白酶消化（0,1％胰蛋白酶 / 17-20分钟 / 37℃），随后
5
为用火琢的巴氏滴管研磨，获得海马神经元。海马神经元以0.2-1.0 x 10细胞的密度铺TM
平板到聚-D-赖氨酸包被的6孔或24孔板（Biocoat 板；BD Biosciences，Heidelberg，德国）内，其中使用0,5-3ml无血清培养基（Neurobasal培养基，B27补料，2mM L-谷氨酰胺；
1％青霉素-链霉素；Invitrogen，Karlsruhe，德国）。细胞在37℃、5％CO2下培养至少21天，并且每周更换三分之一培养基一次。

[0433] 17.2. Aß诱导的发动蛋白切割Aß根据文献（Kelly，B. L.和Ferreira，A.（2006）J Biol Chem 281（38），28079-28089；
Kelly，B. L.，Vassar，R.和Ferreira，A.（2005）J Biol Chem 280（36），31746-31753）进行聚集，伴随轻微修饰。简言之，Aß1-40（American Peptide，Sunnyvale，Ca）以0,1mg/ml溶解于无血清培养基中，并且在37℃温育4天。抗RAGE单克隆抗体11E6、针对KLH（来自大锁孔帽贝（Megathura crenulata）的匙孔血蓝蛋白，Abbott）的IgG1同种型单克隆对照抗体或PBS与聚集的Aβ在25℃在恒定搅拌下在225µl-1ml终体积中温育1小时。将
混合物加入培养基中，从而导致分别5µM Aß（作为单体计算）和2µM抗体的终浓度。每种处理一式三份地执行，并且包括不添加Aβ或抗体的孔作为进一步对照。细胞培养另外24小时，并且在用于蛋白质印迹加工前通过光学显微镜术短暂检查。用Aβ处理在温育时间段过程中不诱导明显的神经元死亡。

[0434] 17.3. 蛋白质印迹、发动蛋白切割的定量和统计学分析取出培养基，并且细胞用PBS洗涤1次。通过加入包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物
（Roche，Mannheim，德国）的冷缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5 ；150mM NaCl ；1％NP-40 ；
1％Triton X-100 ；2mM EDTA）使细胞溶解（lyzed）。刮取细胞并且使匀浆物在13000g在
4℃离心5分钟。取出上清液，并且通过Bradford法使用商业试剂盒（Bio-Rad，München，德国）测定总蛋白质浓度。使蛋白质在装载缓冲液（Bio-Rad，München，德国）内稀释至1µg/µl，并且煮沸5分钟。25µg每种样品在4-20％SDS-PAGE（Invitrogen，Karlsruhe，德国）上运行，并且使用iBlot系统（Invitrogen，Karlsruhe，德国）转移到硝化纤维素膜上。可替代地，细胞在96孔板上直接溶解，用装载缓冲液稀释，并且将1/4 - 1/5蛋白质装载到SDS-PAGE上。膜用1x阻断试剂（Roche，Mannheim，德国）在室温阻断1-2小时，并且随后与针对发动蛋白I的第一抗体（PA-1-660；1:1000稀释；Affinity BioReagents，Golden，Co）在4℃温育过夜。随后，将辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（山羊抗兔IgG，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）在室温应用于印迹1小时，并且使用增强的化学发光（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate；Pierce，Rockford，Il）进行检测。
通过VersaDoc系统（Bio-Rad，München，德国）显现免疫印迹信号，并且使用Quantity One软件（Bio-Rad，München，德国）定量完整发动蛋白I（～100 kDa）的信号。对于标准化，印迹在37℃剥离（Restore Western Blot Stripping Buffer；Pierce，Rockford，Il）30分钟，在PBS中洗涤，并且用针对ßIII微管蛋白（TuJ-I，1:1000稀释，Abcam，Cambridge，MA）的第一抗体和第二抗体（驴抗小鼠IgG，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）再次探测。
未用Aβ处理的细胞的标准化发动蛋白I表达的平均值设为100％。通过One-Way ANOVA
TM
（Kruskal-Wallis检验），随后为Dunn氏检验（GraphPad Prism ；GraphPad Software，San Diego，Ca），就统计学显著性分析3次单独实验的百分比数据。

[0435] 17.4. 抗RAGE抗体 11E6保护海马神经元免于 Aβ诱导的发动蛋白切割聚集的Aβ1-40近期已显示在海马神经元中诱导突触标记蛋白质发动蛋白I的切割
（Kelly等人，2005；Kelly & Ferreira，2006）。完全依照所公开的结果，我们观察到在海马神经元与聚集的Aβ温育24小时后，完整（～100kDa）发动蛋白I量中的明显降低，和～
90 kDa切割产物的伴随增加（图11，上图）。Aβ与抗RAGE抗体11E6的预温育将切割阻止至约70％。相比之下，RAGE-无关鼠IgG1同种型对照抗体不提供任何保护（图11，上图）。
一式三份样品的光密度扫描，针对对照蛋白质（ßIII微管蛋白）的量的标准化，以及3次独立实验的数据分析揭示所观察到的保护作用的统计学显著性（图11，下图；One-Way ANOVA；
p<0,05）。

[0436] 实施例18：抗体 11E6对球聚体诱导的突触传递阻抑的作用18.1. 测试A
器官型海马切片培养以Stoppini等人（Journal of Neuroscience Methods，37，
Issue 2，1991年4月，第173-182页"A simple method for organotypic cultures of nervous tissue" L. Stoppinia，P.-A. Buchsa和D. Muller）的修饰规程进行制备，并且在millicell-CM膜（Millipore，Billerica，USA）上在高钾培养基中培养3天，并且随后在补料的neurobasal A培养基中在液/气界面中在34℃/ 5％CO2培养。

[0437] 大鼠海马切片培养由9天大的Wistar大鼠制备，并且在体外在15-16天时使用。切片培养与下述任一种一起温育过夜
- 1 µM 1-42球聚体，
- 0.1 µM 11E6（RAGE mAb ML 39-11E6纯化#4194，样品#6116）+ 1 µM 1-42球聚
体
- 对照（球聚体超滤液 + SDS）
在共温育组中，抗体在球聚体前2小时应用于切片培养基。在界面记录室中在用人工
脑脊液的连续输注下执行记录。在用不同电压强度的双相脉冲刺激Schaffer侧支后，记录来自CA1区域的场兴奋性突触后电位。Schaffer侧支用双相脉冲（0.1 ms/相）刺激，其中使用0.5M双极钨电极（WPI；Saraosta USA），并且用填充aCSF的玻璃电极（0.7-1.1兆欧（Megaohm），GC150F-15，Harvard Apparatus，Hugstetten，德国）记录fEPSP幅度。使用功率CED 1401（Cambridge Electronic Design Ltd.，Cambridge，UK）使信号数字化，并且使用Signal 2.14（Cambridge Electronic Design Ltd.，Cambridge，UK）进行分析。

[0438] 结果显示于图12A中。球聚体应用强烈阻抑突触传递。0.1 µM 11E6的共应用完全逆转球聚体诱导的缺陷。因此，11E6可以逆转突触传递中球聚体诱导的缺陷。

[0439] 18.2. 测试B大鼠海马切片培养由9天大的Wistar大鼠制备，并且在体外在16-18天时使用。切片
培养与下述任一种一起温育过夜
- 1 µM 1-42球聚体
- 0.1 µM IgG1 mAb H35C206（KLH）+ 1 µM 1-42球聚体
- 对照（SDS）
在以不同强度刺激Schaffer侧支后，执行（以人工脑脊液）来自CA1的记录。

[0440] 结果显示于图12B中。球聚体应用强烈阻抑突触传递。IgG1的共应用不逆转球聚体诱导的缺陷。因此，IgG1对照抗体以0.1 µM不逆转突触传递中球聚体诱导的缺陷。

[0441] 实施例19：抗体 11E6对 Tg2576小鼠额皮质中的淀粉状蛋白斑的作用的原位分析对于这些实验，使用14.5个月大的Tg2576小鼠（Hsiao等人，1996，Science；274（5284），99-102）。该小鼠超表达具有所谓的Swedish突变（K670N/M671L）的人APP，并且在约11月大时在脑实质中形成β淀粉状蛋白沉积。从12月大时开始，小鼠用500
µg 11E6（n=19）i.p.（腹膜内）或IgG1对照抗体（n=19）进行注射，每周一次，进行12周。在最后一次注射后，动物进行深度麻醉，并且用0.1 M磷酸缓冲盐水（PBS）经心脏（transcardially）灌注以冲洗血液。随后从颅骨中取出脑，并且纵向分开。一个脑半球进行骤冻（shock-frozen），另一个通过浸入4％低聚甲醛内固定。浸入-固定的半球通过浸泡在PBS中的30％蔗糖中进行冷冻保护，并且封固在冷冻切片机（microtome）上。将整个前脑切割成40 µm切片，这收集在PBS中，并且封固在Superfrost® Plus载玻片上（Menzel Glaeser，Braunschweig，德国），用于后续染色程序。用针对单体Aβ产生的小鼠单克隆抗体6G1执行含Aβ的淀粉状蛋白斑的染色（Barghorn等人，2005，J. Neurochem. On an automatic staining device（Ventana Discovery®，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany），依照下述规程：
- 在载玻片上的切片充分风干且转移至Ventana机器
- 使用由Ventana提供用于产色二氨基联苯胺（DAB）程序的自动化规程，其包含洗涤
和阻断步骤，并且使用由DAB MapTM Kit的染色；抗原提取（retrieval）以及初级和次级免疫组织化学通过实验者包括在自动化规程中：
- 在调节剂#2（基于柠檬酸盐（citrat）的缓冲液，pH 6.0）的存在下在95℃ 45分钟获得抗原提取
-在抗体稀释剂（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国）中与6G1（1:500）在37℃温育3小时
- 与生物素化的第二抗体驴抗小鼠IgG（1:500；Jackson ImmunoResearch，Newmarket，UK）在37℃温育30分钟
- 在自动化染色结束后，载玻片在正常水中洗涤，在分级乙醇中脱水，在XTRA-Solve®（J.T. Baker，Griesheim，德国）中澄清，并且用UltraKitt®（J.T. Baker，Griesheim，德国）盖玻片加盖。

[0442] 斑染色在新皮质的3个组织学切片中进行定量，其中使用ImagePro 5.0图像分析系统。实验者对处于分析中的小鼠处理不知情，并且测定下述参数：新皮质面积、由6G1阳性染色覆盖的面积和染色的斑数目。这些参数是可变的，并且不是正态分布的。因此，通过单侧（on-sided）Mann-Whitney U检验统计学上评价斑负荷的减少。Tg2576小鼠中Aβ沉积物染色的结果显示于图13中。

[0443] 褐色DAB沉积物的评价显示抗RAGE抗体使新皮质中的淀粉状蛋白斑数目和面积分别减少24.5％和26.8％（p<0.1）。斑数目和面积中的减少在额新皮质中最明显
（p<0.05）。

[0444] 如本文引用的文件引入作为参考。

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