发明领域

本发明主要涉及分子遗传学和遗传疾病的诊断领域。更具体地说，本发明涉 及大规模确定疾病基因型的方法，和用于相同目的的诊断试验和试剂盒。

相关技术描述

已经证明，三核苷酸CAG、CTG、CGG或GAA等重复序列的扩张是造成 严重神经疾病的主要原因1。其中，CAG重复扩张与包括亨廷顿舞蹈病 (Huntington disease)2、脊髓延髓肌肉萎缩3、1型小脑脊髓共济失调(SCAl)4、2 型小脑脊髓共济失调(SCA2)5-7、3型小脑脊髓共济失调/神经系统亚速尔病 (Machado-Joseph)病(SCA3/MJD)8和dentatorubral-pallidoluysian萎缩/Haw-River 综合征9在内的一组神经变性性疾病有关。所有这些疾病都是进行性疾病，会导 致中枢神经系统内神经元的变性。在各自基因内的CAG重复在人群中表现出长 度上的多态性，一般不超过40次重复。在受影响个体内被扩张的等位基因包含 36至121次重复10。

比起在具有CGG、CTG和GAA扩张的疾病中常见的成百上千次的重复， CAG重复扩张要小得多11-14。扩张的CAG等位基因在种系和体细胞组织中都表 现出不同程度的不稳定性15-16。代与代之间CAG重复数大小的变化通常倾向于 进一步扩张，如果是父系传递尤其如此，这为预测提供了分子基础。上述疾病中 CAG重复序列的阵列位于所涉及基因的编码区，并且被翻译成蛋白质产物中的聚 谷胺酰胺段17。已经提出了这样的假设：聚谷胺酰胺段扩张使得蛋白质产物获得 一种显性遗传功能。基于CAG重复扩张所致的疾病具有相对一致的特征，有人 提出：具有类似临床特症的其它神经变性性疾病也可能具有CAG重复扩张。事 实上，Trottier和他的同事所进行的研究证明，抗聚谷胺酰胺段的抗体能够检测 出SCA2或7型脊髓小脑共济失调(SCA7)患者组织内的异常大蛋白质，这提示， 造成SCA2和SCA7的突变是聚谷胺酰胺段的扩张18。

现有技术的缺点在于缺乏有效手段来为遗传性疾病作大规模基因型鉴定，并 缺乏诊断此类疾病的诊断试验和试剂盒。本发明满足了这一长期的需要和技术上 的要求。

发明概述

在人α1A电压依赖性钙通道亚基内鉴定到多形性CAG重复。为了证明是这种 CAG重复造成了遗传性进行性共济失调，对大量不相关的对照和共济失调患者进 行了基因型的确定。8位迟发共济失调无关患者的等位基因内的重复数(21-27)大 于475名非共济失调患者的重复数(4-16)。对受影响个体家族内CAG重复长度的 分析显示：每个患者的CAG扩张(长度)都随表型的不同而不同。已经鉴定到了人 α1A钙通道亚基的6种异型。此CAG重复位于开放读码框内，而且据估计在3种 异型中编码了谷胺酰胺。所以，极可能是人α1A钙通道中的小的谷胺酰胺扩张引 起了新分类的常染色体显性脊髓小脑共济失调，SCA6。

本发明目的之一是提供一种方法筛选出具有患三核苷酸重复序列不稳定性 所致疾病危险性个体，该方法包括如下步骤：使用一个或多个寡核苷酸引物进行 聚合酶链反应来扩增个体样品中的基因组DNA三核苷酸重复序列；用限制性酶 切割扩增后的基因组DNA三核苷酸重复序列；电泳分离所述的限制性切割的扩 增基因组DNA三核苷酸重复序列，形成样品电泳图；标记探针，所述的探针能 够检测出所述样品中的扩增基因组DNA三核苷酸重复序列；将所述的限制性切 割的扩增基因组DNA三核苷酸重复序列样品与第一份所述的标记探针杂交，杂 交条件允许产生所述样品基因组DNA三核苷酸重复序列的样品杂交图；使用一 个或多个寡核苷酸引物通过聚合酶链反应来扩增对照基因组DNA三核苷酸重复 序列，其中所述的对照基因组DNA三核苷酸重复序列来自非疾病来源；用限制 性酶切割所述的对照基因组DNA三核苷酸重复序列；电泳分离所述的限制性切 割过的对照基因组DNA三核苷酸重复序列，形成对照电泳图；将所述的限制性 切割的对照基因组DNA三核苷酸重复序列与第二份所述探针在杂交条件下结 合，形成所述基因组DNA三核苷酸重复序列的对照杂交图；将所述样品基因组 DNA三核苷酸重复序列的样品杂交图与所述对照基因组DNA三核苷酸重复序列 的对照杂交图作比较；以及确定被测个体是否可能具有患三核苷酸重复序列不稳 定性所致疾病的危险，如果所述样品基因组DNA三核苷酸重复序列大于所述的 对照基因组DNA三核苷酸重复序列，所述个体可能具有患三核苷酸重复序列不 稳定性所致疾病的危险。

本发明的另一目的是提供一种鉴定基因的方法，其中因三核苷酸重复序列的 不稳定性而产生了致病等位基因，该方法包括如下步骤：用具有三碱基重复的寡 核苷酸筛选文库；鉴定具有所述三碱基重复的克隆；对鉴定出的克隆进行测序， 确定所述三碱基重复两侧的核苷酸序列；合成与所述三碱基重复两侧核苷酸序列 互补的引物；从患病和非患病个体获取大采样，分离出其中的DNA；用所述引 物扩增所述的分离DNA产生扩增的三碱基重复区；确定大采样中每个个体的三 碱基重复区内三碱基重复的数量；确定是否患病个体的三碱基重复扩张出现频率 相对高而在非患病个体中则没有或出现频率很低，如果患病个体的三碱基重复扩 张出现频率相对高而在非患病个体中则没有或出现频率很低，则很可能是三核苷 酸重复序列的不稳定性造成了致病等位基因。

出于公开的目的，给出本发明当前优选实施方式的说明之后，本发明的其它 内容、特征和优点将由此变得显而易见。

附图简述

为了达到和更具体地理解上述本发明的特征、优点和目的，对本发明更具体 的说明需要参照某些实施方式，这些方式显示在附图中。这些附图构成说明书的 一部分。但是要注意的是，附图显示的是本发明的优选实施方式，所以不能认为 本发明限于附图的范围内。

图1显示人α1A电压依赖性钙通道的各种异型。图1A显示，所有不同异型 是在至少2个互不相干的cDNA克隆中见到的。 代表94碱基对的核苷 酸变异， 代表36碱基对的缺失。GGCAG插入部位用水平条图表示， 谷胺酰胺段(聚Q)的位置用 表示。因这些变异引起的氨基酸改变显示在 图2中。只有具有GGCAG插入的异型才有延长的开放读码框。图1B显示人Ca2+ 通道异型BI-1和BI-1(GGCAG)的终止密码子两侧的序列。顶上和底下的字母表 示由此序列编码的相应氨基酸。终止密码子以TAN核苷酸表示。核苷酸“N” 是一个“G”核苷酸，具有一个继“A”峰之后的减小的“G”峰，这是Applied Biosystem的染料终止测序化学中FS Taq酶的特征之一。在对负链测序时确认， 这的确是一个“G”核苷酸。TAG的互补序列CTA加有下划线。

图2显示的是兔(BI-1)和人α1A电压依赖性钙通道之间的序列比较。这不完整 的人cDNA序列由两各3.6kb的重叠克隆合并而成，代表了最大的推定开放读码 框。完全相同的氨基酸用“-”表示，对齐排列中空挡用“.”表示。人和兔BI- 1的cDNA具有90％至94％的同一性，这取决于异型。因为还没有确定全长人α1A 电压依赖性钙通道，所以将兔BI-1序列的氨基酸链编号作为参考(GenBank中的 OCCBI-1)。在兔BI-1异型(编号：X57476)中假设性插入GGCAG核苷酸将其推 定肽读码框延长至237个氨基酸，其中兔的终止密码子与人的位于完全相同的位 置。在此推定读码框内，人和兔cDNA序列内从氨基酸2328位开始的谷胺酰胺 重复加有下划线。如果没有以上插入，兔和人的BI-1异型的推定读码框终止在 “*”表示的氨基酸2273(因为为对齐引入了2处空挡，所以在此列为2275)位。 与V1、V2、V3变异和GGCAG插入相应的异型中不同的氨基酸加了方框。V3 异型具有截短的3’区，带有聚A+段。各个异型的序列已经在GenBank进行了保 藏(保藏号：U79663、U79664、U79665、U79666、U79667和U79668)。

图3显示对人α1A电压依赖性Ca2+通道表达的Norther分析。杂交是以S- 5cDNA为探针进行的。在脑mRNA中有一条独特的8.5kb的条带，具有该探针特 有的成片条带模式(smear pattern)，用β-肌动蛋白探针则检测不到。脑mRNA的成 片条带可能反映了与各种不同拼接形式或某些降解物的交叉杂交。

图4显示在小脑共济失调家族中用CAG重复(序列)两侧的S-5-F1和S-5R1 引物产生的PCR扩增产物的分析。图4A显示在INSCA亲族的4名患者(I.2，II.3， II.5和II.7)含有27次重复的扩张等位基因，元症状家族成员则没有。图4B显示， 在MS2SCA亲族的全部5名患者(II.1，II.2，II.3，III.1和III.2)中都发现有CAG重 复22次的扩张等位基因。图4C显示，在MDSCA亲族有临床共济失调的两个兄 弟(II.1和II.3)和其一个姐妹(II.2)中含有23次CAG重复的大小异常的等位基因， 但II.1的无症状的女儿则没有。图4D显示的是SISCA家族，其中相隔5次减数 分裂的两名患者(IV.1和III.7)在其较大的等位基因上具有同样多的22次CAG重 复。在家谱中查找这一等位基因表明他们患病的祖先(III.5，II.2，II.4和I.2)很可能 具有该扩张等位基因。

本发明的详细说明

本发明涉及一种筛选出具有患三核苷酸重复序列不稳定性所致疾病危险的 个体的方法，该方法包括如下步骤：使用一个或多个寡核苷酸引物进行聚合酶链 反应来扩增待测个体样品中的基因组DNA三核苷酸重复序列；标记探针，所述 的探针能够在样品中检测出所述扩增的基因组DNA三核苷酸重复序列；将所述 的扩增基因组DNA三核苷酸重复序列样品与第一份所述的标记探针杂交，杂交 条件允许产生所述样品基因组DNA三核苷酸重复序列的样品杂交图；使用一个 或多个寡核苷酸引物通过聚合酶链反应来扩增对照基因组DNA三核苷酸重复序 列，其中所述的对照基因组DNA三核苷酸重复序列来自非疾病来源；将所述的 限制性切割的对照基因组DNA三核苷酸重复序列与第二份所述探针在杂交条件 下结合，形成所述基因组DNA三核苷酸重复序列的对照杂交图；将所述的样品 基因组DNA三核苷酸重复序列的发杂交图与所述对照基因组DNA三核苷酸重复 序列的对照杂交图作比较；以及确定被测个体是否可能具有患三核苷酸重复序列 不稳定性所致疾病的危险，如果所述样品基因组DNA三核苷酸重复序列大于所 述的对照DNA基因组三核苷酸重复序列，所述个体可能具有患三核苷酸重复序 列不稳定性所致疾病的危险。

本发明的另一目的是提供一种鉴定基因的方法，其中包括三核苷酸重复序列 不稳定性而产生的致病等位基因，该方法包括如下步骤：用具有三碱基重复的寡 核苷酸筛选文库；鉴定具有所述三碱基重复的克隆；对鉴定出的克隆进行测序， 确定所述三碱基重复两侧的核苷酸序列；合成与所述三碱基重复两侧核苷酸序列 互补的引物；从患病和非患病个体获取大采样，分离出其中的DNA；用所述引 物扩增所述的分离DNA产生扩增的三碱基重复区；确定大采样中每个个体的三 碱基重复区内三碱基重复的数量；确定是否患病个体的三碱基重复扩张出现频率 相对高而在非患病个体中则没有或出现频率很低，如果患病个体的三碱基重复扩 张出现频率相对高而在非患病个体中则没有或出现频率很低，则很可能是三核苷 酸重复序列的不稳定性造成了致病等位基因。

根据本发明，可能用到的有常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术， 这些都是本领域的技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见：Maniatis， Fritsch & Sambrook，“分子克隆：实验室手册”(1982)；“DNA克隆：操作方法” 卷I和卷II(D.N.Glover编，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编，1984)；“核 酸杂交”(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1985)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney 编，1986)；“固定化细胞和酶”(IRL Press，(1986))；B.Perbal，“分子克隆操作 指南”(1984)。

所以，本文中出现的下述术语定义如下：

“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其它DNA片段可以与 之附着结合，由此使得所结合的片段得以复制。如果载体能被接受的哺乳动物所 耐受，则称该载体是“药学上可接受的”。如果所用的给药量有生理学意义，则 称给予了“治疗有效量”的药物。如果药物导致服药哺乳动物生理学改变，则该 药物有生理学意义。例如，在治疗逆转录病毒感染时，某化合物降低了感染的程 度或感染造成的生理损伤的程度，则认为该化合物具有治疗效果。

“DNA分子”指单链或双螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸 腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，不限定它特定 的三级结构。所以，除双链DNA之外，该术语还包括线性DNA分子(例如限制 性片段)、病毒、质粒和染色体。在本文论述结构时，根据常规，只沿非翻译DNA 链5’到3’的方向给出序列(即合序列的链与mRNA相同)。

DNA“编码序列”是一段双链DNA序列，当置于合适的调控序列控制下， 在体内经转录和翻译生成多肽。编码序列的边界由5’(氨基)末端的一个起始密码 子和3’(羧基)末端的一个翻译终止密码子确定。编码序列可以包括(但不限于)原 核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核生物(例如哺乳动物)DNA的基因 组DNA序列，甚至包括合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常 位于编码序列的3’。

术语“寡核苷酸”，当用于本文所指本发明的探针时，定义为包含两个或更 多个，最好三个以上核糖核苷酸的分子。它的确切大小取决于许多因素，这些因 素又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。

术语“引物”，在本文指天然存在于纯化的限制性消化产物中的或合成产生 的一种寡核苷酸，在置于一定条件下它能够起引发合成的位点作用，在所述条件 下，即，在核苷酸和诸如DNA聚合酶之类诱导剂存在下，在合适的温度和pH下， 它诱导合成了与核酸链互补的引物延伸产物。引物可以是单链的也可以是双链 的，而且必需足够长，以便在诱导剂存在下引发合成所需的延伸产物。引物的确 切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，用于诊断， 根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含15-25个或更多个核苷酸，虽然也 可能含有较少的核苷酸。

术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”在本文指细菌的酶，它们每个都 能在特定的核苷酸序列处或其邻近切断双链DNA。

这类研究中最常用的标记是放射性元素、酶、经紫外光照射会发荧光的化学 物质以及其它物质。许多荧光物质是已知的，可以用作标记。它们包括例如荧光 素、罗丹明、碱性槐黄(auramine)、Texas红、AMCA蓝和荧光(Lucifer)黄。一种 特殊的检测物质是抗兔抗体，它在山羊体内制备并通过异硫氰酸与荧光素偶联。

给出以下实施例的目的是说明本发明的各种实施方式，而不是以任何方式对 本发明范围作限定。

实施例1

分离S-5cDNA

用放射性标记的寡核苷酸探针(GCT)7筛选初级人脑cDNA文库，由此分离出 S-5cDNA。采用Guber & Hoffman的方法学44，用购自Clontech(Palo Alto，CA) 的mRNA，以寡聚d(T)引发人脑cDNA的合成。为了克隆到1ZAP II载体内，用 Not I限制接头来构建cDNA文库。该文库接种平板培养在Luria肉汤琼脂板上， 密度为1000空斑/150mm。总共筛选了150,000个初级克隆。在55℃，用标准水 性杂交溶液进行了与放射性标记的寡核苷酸探针(GCT)7的杂交45。对滤膜进行3 次30分钟的洗涤，每次都在55℃、2X SSC和0.1％SDS中进行。纯化杂交的克 隆用于回收质粒。用AutoGen 740仪分离质粒DNA，并用ABI试剂盒和ABI-373A 测序仪方案测序。为了确认有三联体重复序列的存在而进行了cDNA的测序。S-5 cDNA是用此方法得到的387个独特重组cDNA中的一个。以S-5 cDNA为探针 分离了α1A钙通道的其它克隆。除上述人脑cDNA文库之外，还对来自 Strategene(La Jolla，CA)的带有Eco RI克隆位点的商品化人胎脑cDNA文库进行 了筛选，由该文库中鉴定到的克隆被用来重构从Not I位点至聚(A)段的3’区。

实施例2

PCR分析

用以下引物测定了α1A钙通道内CAG长度的多形性程度：S-5-F1(5’- CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC-3’)(SEQ ID NO：1)和S-5-R1(5’- TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG-3’)(SEQ ID NO：2)，但也可以使用以α1A 钙通道基因序列为基础的其它合适引物。每一次反应，用0.05单位聚核苷酸激 酶，用1mCi[γ-32P]ATP对5pmol的各个引物进行30分钟的未端标记。每次PCR 分析包括20ng基因组DNA，混合以5pmol的各个放射性标记的S-5-F1和S-5- R1引物，总体积为25ml，含有0.25单位的Taq聚合酶、125μM dNTP、10mM Tris pH8.9、2.5mM MgCl2、30mM KCl和3.5％(v/v)甘油。样品在95℃变性3 分钟，然后进行28轮循环：变性(94℃，25秒)、退火(68℃，30秒)和延伸(72 ℃，2分钟)。在反应物中加入15ml甲酰胺上样染料，混合物在95℃变性20分 钟。取7ml在6％聚丙烯酰胺/8M脲凝胶上走电泳。通过迁移情况与M13测序级 梯的比较来确定等位基因的大小。使用的对照DNA包括CEPH家族的65份样品； 分子及人类遗传部门各同事提供的125份无关对照；患糖尿病同胞兄弟姐妹的160 份样品；41例散发性乳房癌；Parkinson指数病例42份；肌张力障碍指数病例 24份和散发性早老痴呆(Alzheimer)病18份。

实施例3

Northern分析

包含多种人组织的聚A+RNA的Northern印迹(试剂)购自Clonetech。用 Pharmacia的随机标记试剂盒，用[α-32P]dCTP放射性标记200ng的S-5 cDNA插 人物。根据Clonetech推荐的方案，探针在65℃杂交过夜。滤膜68℃每次30分 钟洗涤3次，在0.1X SSC、0.1％SDS中进行，然后爆光X光胶片。68℃，以 0.5X SSC和0.1％SDS低严谨度洗涤在不同组织中产生了较多的条带，这提示与 其它钙通道基因发生了交叉反应。

实施例4

连接分析

对基因型资料的检查显示，在CAG重复数量增加和共济失调表型之间存在 清晰的联系。在133名共济失调患者中，8名具有长度超过20的重复，而对照 的重复长度都不超过16。用比较共济失调病例和对照中扩张存在情况的2×2 表，对上述联系进行统计学评价。用Fisher精确试验确定有明显程度(的差异)。

用单倍型分析来显示扩张和疾病是一起传递的。为了模拟单个基因座同时具 有表型(共济失调)和多形性(扩张)的情况，使用了两个基因座(一个是疾病基因 座，一个是多形性基因座)，它们被完全连接，并处于完全连接失衡中。假设133 例都患有某种显性遗传的共济失调，由此计算出单倍型的频率。所以，每例应当 有一处致病突变。这些突变中的8个(约6％)是由CAG重复扩张引起的；其它94％ 是由其它突变或者是该基因内的非扩张性突变，或者是其它基因内的突变引起 的。计算单倍型频率所需的其它信息是位于未知基因座的显性共济失调的种群频 率。该频率的估计值越高，lod分值越低。将1/500的保守性数值用于该分析， 得出基因频率为1/1000。所以，4种单倍型的频率为：0.999(非共济失调-非扩 张)，0.0(非共济失调-扩张)，0.00094(共济失调-非扩张)和0.00006(共济失调-扩 张)。用以上单倍型频率来计算4个共济失调家族中的lod分值，使用的是 FASTLINK 3.0P版软件程序。设定了所有患者的病情和基因型，没有患病的个体 和没有确定基因型的个体表示为病情未知的或者是基因型未知的。

为了鉴定因CAG重复扩张造成的疾病，用多形性CAG重复和迟发性神经变 性性疾病患者的DNA样品进行了大规模的基因定型调查。本发明报道，兔α1A电 压依赖性钙通道BI-1基因的人类似物包含一个多形性CAG重复序列，在一部分 确诊的常染色体显性小脑共济失调患者中，该序列被扩张。以上结果表明，预计 的编码人α1A电压依赖性Ca2+通道基因中聚谷胺酰胺的CAG重复的扩张是一种小 脑共济失调的明显原因。

实施例5

人α1A钙通道亚基内的CAG重复

为了鉴定含有三核苷酸重复序列的基因，以(GCT)7重复寡核苷酸为探针筛选 了未扩增的人脑cDNA文库。这次筛选鉴定出387个cDNA克隆，根据序列分析 确定它们是相互独立的。这些克隆中重复序列的大小为4至21。在这次筛选中 分离到了对应于dentatorubral-pallidoluysian萎缩/Haw-River9和Machado-Joseph 病8基因的部分cDNA克隆。这次筛选中没有分离到对应于SCA1、SCA2和 Hunington病基因的cDNA克隆，很可能是因为这些基因中的CAG重复位于大转 录产物的5’区，并且所筛选的cDNA文库因为是用寡聚d(T)引发产生的而偏好 3’cDNA末端。

第一个被彻底检查的克隆是S-5 cDNA，它含有13次CAG重复。该1.2kb cDNA的推定肽序列与兔α1A电压依赖性Ca2+通道(又称P/Q型Ca2+通道)的BI-1 异型具有90％的氨基酸一致性，这表明：S-5克隆是人类似物的部分cDNA19。 推定的人肽序列与大鼠脑α1ACa2+通道亚基也有90％的一致性20。过去曾报道，对 应于兔BI-1氨基酸722-1036的部分人cDNA序列与兔和大鼠的α1ACa2+通道亚基 分别具有92％和82％一致性21。本发明的cDNA包含了编码序列，该序列对应于 从氨基酸1325位开始的兔蛋白的羧基末端区。该序列信息表明，分离的cDNA 编码钙通道的人α1A亚基。

使用Corriel的2#体细胞杂交绘图，通过序列标记位点(STS)绘图将α1ACa2+ 通道定位于人19号染色体。Diriong等22曾经报道用部分cDNA克隆作图显示 α1ACa2+通道亚基位于人19p13染色体。该基因座的基因符号是CACNL1A422。 Margolis等23报道了CACNL1A4基因的部分人cDNA(对应于兔BI-1核苷酸6487 至7165位)，并作图显示它位于19号染色体。最近，Ophoff及其同事公开了一 份描述人CACNL1A4基因全长序列的报告24。

在家兔中，已经鉴定到了两种α1A钙通道亚基的异型(BI-1和BI-2)19。这两 异型的相互差异在于羧基末端序列，BI-2多151个氨基酸。据信，以上异型是 423个核苷酸插入-缺失的结果。BI-1中的这423个核苷酸引入了一个终止密码 子，所以产生了较短的2273氨基酸异型。在兔脑中，已经发现了α1ACa2+通道基 因的至少4种不同剪接形式的异型，但其中只有一种异型的序列被报道过20。

兔与人序列间的比较显示，CAG重复是保守性的，位于兔α1ACa2+通道BI- 1和S-5 cDNA的推定的3’非翻译区中。本发明发现兔BI-1异型和人S-5克隆的 3’非翻译区之间具有高度的一致性(700多核苷酸内84％一致)，提出了这样的可能 性：可能出现其它剪接变体，并且某些可能包含一个开放读码框，CAG重复在 其中被翻译。为了检验这一可能性，再次用S-5 cDNA作探针对初级人cDNA文 库和购得的胎脑cDNA文库进行了筛选。总共又分离到了17个克隆，对这些克 隆进行了仔细的序列分析，鉴定到几个羧基区不同剪接的人α1ACa2+通道异型(图 1A)。具体地说，这些cDNA中的5个在S-5 cDNA的TAG终止密码子前插入了 一段5碱基对(GGCAG)(图1B)。具有该5碱基对插入物的克隆其推定的开放读码 框被延长，在人基因中多了239个氨基酸。将该5碱基对序列假设性插入兔BI-1 钙通道的第2273位氨基酸使得推定读码框延长了237个氨基酸，而且高度保持 了与人序列的肽类似性(80％一致性)，证实了兔脑中这一异型的存在(见图2)。在 该BI-1(GGCAG)异型中，CAG重复编码人和兔α1A钙通道基因中起始于第2328 位氨基酸的聚谷胺酰胺。

在其它克隆中还观察到了人α1ACa2+通道基因的其它异型。为了确认它们都 不是克隆操作的结果，对每一种异型至少分离了两个互不相干的克隆并进行了测 序。总共发现6种变体，其中包括与兔BI-1展开完全相同的变体，称为人BI-1。 称为BI-1(V1)的变体在核苷酸水平上与BI-1有94个碱基对序列的差异，但它们 在氨基酸水平上是类似的。在家兔中也描述过这种变体19。本发明分离得到的 BI-1(V1)异型与Ophoff等推定的肽序列有99.8％的一致性24。有三处氨基酸差 异：第1460位(Ala变为Gly)，第1605位(Ala变为Val)和第1618位(Ala变为Val)。 在分析的几个克隆中，推定序列中这些位置上的氨基酸都是相同的，而且与兔和 大鼠的α1ACa2+通道亚基推定氨基酸相同。观察到BI-1和BI-1(V1)异型与GGCAG 插入物结合在一起(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。其它剪接变体包括BI-1(V2)- GGCAG(SEQ ID NO：5)，它缺失了36个核苷酸，另一变体BI-1(V2，V3)具有截短 的3’区(图1A)。这些鉴定到的克隆具有这些变体的不同组合，但是在非变异片段 内的两侧序列是相同的，由此排除了克隆操作因素。

与存在多种异型相一致的是，高严谨条件下与S-5 cDNA杂交进行的Northern 分析只显示一条8.5kb的条带，与脑中主要的mRNA上下的成片条带相重叠(图 3)。在低严谨条件下杂交，在所有组织中可以观察到许多其它条带，这提示发生 了与其它型钙通道的交叉杂交(没显示资料)。来自人脑文库的所有这些克隆大小 介于1.2至3.1kb，只代表了人α1ACa2+通道亚基的羧基区。单一人mRNA来源衍 生的各个成人脑的cDNA中包含11或13次的CAG重复，这提示因同源染色体 对转录而使得多形性CAG等位基因再现。

实施例6

对扩张的CAG重复进行大规模基因型鉴定调查研究

通过对共济失调患者进行的大规模基因型鉴定调查研究考证了在人α1ACa2+ 通道亚基中鉴定出与正常长度多形性不同的长度异常的CAG重复序列的可能 性。该技术的基础是：如果是三核苷酸扩张造成了SCA6，那么应观察到CAG 扩张在患者中的出现频率相对较高，而在非疾病等位基因中则没有或出现频率很 低。

对普通人群中475名无关性非共济失调个体的DNA样品和已知患有进行性 小脑共济失调的无关指数病例的133份DNA样品进行了分析。使用一对放射性 标记的、人α1ACa2+通道亚基CAG重复序列两侧的合成寡核苷酸引物对每份样品 的CAG重复区进行扩增，并通过凝胶电泳测定了CAG重复区的大小。将共济失 调组样品的重复大小与从普通人群的DNA获得的大小进行比较。

表1显示了CAG重复大小在133例小脑共济失调指数患者的α1ACa2+通道亚 基基因中的分布情况，和在475份非共济失调样品的α1ACa2+通道亚基基因中的分 布情况。对照和患者人群的种族背景包括高加索人、非裔美洲人、西班牙人和亚 裔。来自普通人群的个体展示了10种等位基因，包含4至16个CAG重复单元， 杂和性为7l％。在小脑共济失调患者中，CAG重复的数量大小在7至27之间， 杂和性为74％。从等位基因的大小分布可以看出，133例共济失调指数病例中8 名无关患者(6％)具有较大的等位基因，至少有21个CAG重复单元。虽然此种扩 张相对较小，但在非共济失调对照的475名个体中没有观察到，由此说明这绝不 可能是长度正常的多形性(用Fisher精确度试验计算的P＜10-5)。

  表1：共济失调染色体和非共济失调染色体上CAG重复单元数量的比较   CAG重复单元的数量   非共济失调对照   染色体数量   共济失调指数对照   染色体数量   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   …   27   21   0   4   65   2   0   0   398   150   264   39   6   1   0   0   0   0   0   0   0   …   0   0   0   0   27   2   0   0   91   57   73   7   1   0   0   0   0   0   1   5   1   …   1

用S-5引物扩增了这8例指数病例的基因组DNA，并进行了亚克隆和测序。 由序列分析得到的CAG重复单元数与α1ACa2+通道亚基中纯CAG重复单元数量 的增加相一致。这些扩张的等位基因中不同的CAG重复单元数量的争论反对存 在一个罕见的建立者等位基因(founder allele)。在共济失调患者人群中发现有扩张 的异常等位基因而在普通人群中则没有，这与以下可能性是一致的：即这些扩张 的等位基因代表了所分析的部分共济失调患者中的突变基础。

大规模基因型鉴定的方法能够有效鉴定出α1ACa2+通道亚基基因中的CAG扩 张。所以，这一概念可以用来查找与三联体重复疾病表征相关的其它突变类型。 主要说来即假设三核苷酸重复的扩张与某些等位基因有关，这些等位基因高频地 出现在疾病表型中，而在非疾病表型中则没有或出现频率很低。所以，大规模的 基因型鉴定不同于包括定位克隆法在内的用于鉴定其它人类疾病基因的方法。在 定位克隆法中，在分离候选疾病基因之前必须建立与特定染色体区间的基因连 锁。定位克隆被用来鉴定Huntington病、脊髓延髓肌肉萎缩、1型脊髓小脑共济 失调、2型脊髓小脑共济失调、3型脊髓小脑共济失调/Machado-Joseph病的基 因，和与Fragile X及强直性肌肉萎缩有关的基因。

本发明方法也不同于诊断人疾病的随机候选基因法，后者在鉴定基因时没用 系统性方法。随机候选基因法被用来鉴定dentatorubral-pallidoluysian萎缩/Haw- River综合征基因。本发明策略是以以下观察为基础的：疾病基因中的三联体重 复序列具有长度上的多形性，这使得它们适合用大规模基因定型调查研究。大规 模基因定型方法鉴定的是与非患病人群相比患病个体内大小异常的等位基因。基 于这一概念的策略不需要象定位克隆中第一步所做的那样要先建立家族谱系中 的特定遗传联系(连锁)。本发明的大规模基因型鉴定法是一种直接的基因-疾病状 态的方法。

本发明的另一目的是提供一种鉴定基因的方法，在该基因中因为三核苷酸重 复序列的不稳定性而产生了致病等位基因，该方法包括如下步骤：用含有三联体 碱基重复的寡核苷酸筛选文库；鉴定含有所述三碱基重复的克隆；对鉴定到的克 隆进行测序以确定所述三碱基重复两侧的核苷酸序列；合成与三碱基重复两侧的 核苷酸序列互补的引物；分离个体大样品的DNA，这些个体包括患病和非患病 个体；用所述引物扩增分离到的DNA，产生扩增的三碱基重复区；测定大样品 中各个体所述三碱基重复区内的三碱基重复数；确定是否三碱基重复扩张以相对 高频出现于疾病患者但在非患病个体内则没有或出现频率很低，如果三碱基重复 扩张以相对高频出现于疾病患者但在非患病个体内则没有或出现频率很低，那么 很可能是三核苷酸重复序列的不稳定性造成了致病等位基因。

实施例7

共济失调患者中扩张等位基因的遗传

对4例指数病例家族中其它患者进行了临床评价，并对可能获得的DNA进 行基因型分析。在征得同意后，有21名家族成员参加了这项研究。21人中有14 人具有共济失调的临床证据。在每个上述家族中，共济失调以常染色体显性方式 遗传，发病年龄在28至50岁之间。

用S-5引物对家族成员进行的基因型分析证明，每个家族中扩张的等位基因 随疾病表型不同而异。例如，图4A显示来自INSCA亲族的4名患者中具有27 次重复的扩张等位基因，而其包括一个远亲(资料未显示)在内的无症状家族成员 中则没有。在该家族中，发病年龄在28至31岁之间，3名无症状个体已经41 岁或以上。图4B显示在MS2SCA家族的5名患者中都发现了22次重复的扩张等 位基因。在MDSCA家族中(图4C)，在临床表现出共济失调的两兄弟(II.1和II.3) 和一个姐妹(II.2)中有23次CAG重复的大小异常的等位基因，但在II.1的无症状 女儿中则没有。在SISCA家族中，(见图4D)，相隔5次减数分裂的两名患者(IV.1 和III.7)在各自较大的等位基因上含有相同数量的22次CAG重复。在整个家谱中 查找该等位基因表明，他们的患病祖先(III.5，II.2，II.4和I.2)很可能带有此扩张等 位基因。在这些家族中扩张的等位基因随疾病而异是十分明显的，如同用 FASTLINK计算机程序3.0P版(见上文)26，27对患者的基因定型数据进行分析 时，重组频率为0时累积单倍型的lod评分值为5.08所证实的那样。表2归纳了 各家族的lod评分值。总之，以下有统计学意义的发现，即扩张的等位基因仅见 于确诊的小脑共济失调患者而不见于475名非共济失调对照者中，以及这些扩张 的等位基因与疾病之间的确切关联性证明，α1A电压依赖性Ca2+通道亚基内的聚 谷胺酰胺扩张是迟发型显性遗传性共济失调的病因。   表2：单倍型分析得出的Lod评分值   家族   Theta＝0时的Lod评分值   INSCA   MDSCA   MS2SCA   SISCA   1.20   0.90   1.49   1.49   总计   5.08

实施例8

CAG重复扩张患者中的临床发现和病理学发现

上述家族中患者的临床特征十分相似，主要包括轻度但缓慢的进行性四肢和 走步的小脑共济失调、构语障碍、眼球震颤，和轻度震动性和本体感受的知觉丧 失。这种疾病非常不易被察觉，大多数患者最初并没有意识到已经患病，而是主 述在快转弯或做急速运动时感到暂时性失平衡和“晕眩”。通常在出现这种初期 感觉之后数年，患者意识到他们产生了永久性的平衡和协调困难。这种疾病通常 会在20至30年中不断发展，导致无法行走而使得患者只能坐轮椅。在少数老年 患者中发现的咳嗽提示该疾病已涉及到脑干，该疾病已经导致MDSCA和 MS2SCA家族中数名成员的死亡。当重复数为22至23时MDSCA、SISCA和 MS2SCA家族的成员40多岁时，症状逐步发展；但是在扩张的等位基因含有27 次重复的INSCA家族中，全部患者都在28和31岁之间发病。患者脑部核磁共振 造影显示分离的小脑萎缩。对两名SISCA家族病死者的详细神经病理学研究显示 明显的小脑萎缩和很轻微的脑干萎缩28。显微镜检显示小脑浦肯野(Purkinje)细胞 严重减少，粒细胞和齿状核神经元中度减少，和下橄榄体内神经元的轻微至中度 减少。

遗传性小脑共济失调是一种临床上和遗传学上的异源性神经疾病，它与小脑 及其传人和传出连接的功能障碍有关。迄今，已经作图在人染色体6、12、14、 16、11和3上确定了6种常染色体显性脊髓小脑共济失调(SCAs)，它们的基因 座分别称为SCA1、SCA2、SCA3、SCA4、SCA5和SCA710。许多显性遗传 性进行性共济失调家族的基因的位置图仍然是未知的。在4个家族中作图确定了 α1ACa2+通道亚基位于人染色体19p13，并且鉴定到该通道内的CAG重复扩张是 突变机制，由此明确了个人染色体19p13上的一个新SCA基因座，称为SCA6。

过去，标语SCA6曾被用来说明已知基因座上没有的显性遗传SCA(基因) 29， 30。该术语现已改成专指确定位于染色体19p13上的显性遗传共济失调的SCA6 基因座(HGM命名委员会)。遗传性阵发性小脑共济失调(HPCA)或发作性共济失 调(EA)也被确定位于19p13区31-32。另一发作性疾病，家族性偏瘫性偏头痛 (FHM)33，也被定位在19p13上，该区域曾被指定为HPCA/EA基因所在。HPCA 或EA患者一般患有发作性共济失调，在发作的间隔期表现为协调明显正常。这 令人联想到共济失调变成永久性之前数年患者只说发作时才感到不稳定。对 HPCA/EA进行的神经学检查发现的唯一持续性异常是在所有患者中都发现存在 着眼球震颤。脑部造影研究显示，有些HPCA/EA患者发生小脑萎缩31。有意思 的是，在几个FHM家族中，患病成员表现出退化性小脑萎缩，这通常与共济失 调、眼球震颤和其它类似于HPCA/EA中所见的小脑前庭视觉异常相关34。这两 种疾病表现型上的重叠导致了这样的假设：由于其症状的阵发性质，HPCA/EA 和FHM是等位基因性疾病，它们可能是铁通道基因中某突变造成的32，34。

最近，Ophoff等报道了FHM家族中人α1ACa2+通道亚基基因内的4处错义突 变，和两个EA家族中两种打乱同一基因读码框的突变24。这些结果和本发明证 明：FHM、HPCA/EA和进行性SCA6是等位基因性疾病。突变的特征(SCA6中 的CAG重复扩张还是HPCA/EA中的蛋白质截短)影响着疾病的临床进程。SCA6 中发现永久性和进行性小脑和脑干功能障碍，而在HPCA/EA中发现轻微的、间 歇性小脑功能障碍。这表明谷胺酰胺扩张以触发进行性神经元减少的方式影响通 道功能。这可能通过改变神经递质的释放或引起胞内Ca2+水平异常造成细胞死亡21，35 。此时，这些突变每种的致病效果，不论是发作性神经功能障碍或永久性 和进行性疾病还不能确定，只能有待于转基因小鼠模型核神经生理学研究的结 果。虽然不排除SCA6家族中CACNL1A4基因内的其它突变，在8个独立的共济 失调家族中发现的扩张与疾病表型之间的明显关联性(P＜10-5)以及4个家族(没有 代间不稳定性)中发现的扩张的等位基因上重复数不同，有力的明这是致病突 变。重要的还要注意到，Ophoff及其同事在接受基因型鉴定的50名正常个体中 没有发现任何扩张的等位基因。

虽然象其它显性遗传性进行性共济失调一样，证实SCA6中的突变机制与被 翻译的CAG重复的扩张有关，但是还不清楚致病机理是否相似。SCA6中的突 变与造成SCA1、SCA2、SCA3、HD、DRPLA和SBMA的那些突变之间有 两个关键性差异。首先，SCA6中扩张的等位基因(21至27次重复)明显比其它神 经变性性疾病中所见的扩张等位基因(36至121次重复)要小，并且正好落在许多 非患病个体的其它基因座上观察到的聚谷胺酰胺段正常范围内。其次，CAG重 复扩张发生在基因的编码区，已知该区对于正常浦肯野细胞的功能和存活具有重 要意义19，25。由此提出了这样的可能性，即CAG扩张通过直接干扰α1A钙通道 的正常功能来发挥其致病作用。

电压依赖性钙通道介导钙进入神经元和其它可兴奋细胞，并在包括膜兴奋 性、神经递质释放和基因表达等的各种神经元功能中起着重要作用36。钙通道是 多亚基复合物，其通道活性主要由孔形成性a1亚基介导，然而包括b、a2/d和g 在内的其它亚基作为辅助蛋白调节着通道的活性36-38。编码6个a1基因的cDNA 已经被克隆，并被命名为α1A、B、C、D、E和S39。本发明说明的人基因与 兔和大鼠的α1A异型最相似19，20。确定位置在染色体19上与过去确定编码α1A 异型的人序列位于染色体19p13是一致的22-24。联合电生理学特性与药理学特 性明确表明了在哺乳动物外周神经元和中枢神经元中有4种主要类型的高阈值钙 通道40。它们被命名为L、N、P和Q，P型通道是浦肯野细胞内的主要钙通 道，Q型通道是小脑粒细胞内的重要钙电流通道25，38。已经证明克隆的α1A异 型产生P和/或Q性钙电流通道38，40。鉴定到的其它异型可能有助于解释对P/Q 型钙通道电流观察到的某些功能性差异。α1A通道的药理学特性和电生理学特 性，以及它在大鼠小脑中的大量表达强调了它对于浦肯野细胞钙的进入和自身稳 定的重要性25，41。

最近，用定位克隆法鉴定到了α1A电压依赖性亚基基因的小鼠类似物，该方 法的目的是鉴定脚步蹒跚小鼠(tg)和倾斜失衡小鼠(tgla)中突变的基因，两种小鼠 都表现出癫痫和小脑共济失调42。该基因座圈定位于8号染色体，与人19p13同 线性的一个区域中。tg突变，即第1802位由C变成T，引起非保守性脯氨酸被 亮氨酸取代，该位置非常靠近第二跨膜区胞外节段内保守的有孔-衬里区。该突变 导致隐性神经疾病，伴有共济失调、运动型和失神型癫痫。

tgla突变是单个G到A的改变，位于C末端胞内区内一内含子5’末端的剪接 供方共有序列内。用RT-PCR测得，该突变产生两种剪接异常的mRNA：由于没 能剪除该内含子而产生了一个较大的片段，和由于遗漏一个外显子而产生一个较 小片段。据估计两种转录产物都移动了读码框并产生了异常蛋白。带有剪接突变 的纯合rgla小鼠与tg小鼠相比患有更深的共济失调和小脑变性。

小鼠α1ACa2+通道内的突变与小脑共济失调和浦肯野细胞及粒细胞变性有 关，这一发现支持了这样的假设，即该通道对于小脑内正常的浦肯野细胞和粒细 胞的正常功能是至关重要的。小鼠内两种突变的隐性性质和据估计tgla突变产生 异常蛋白这一事实提示：这些突变通过功能的丧失而导致共济失调表型。tgla小 鼠内的突变改变了通道的羧基末端，正好位于人基因中推定的谷胺酰胺段位置的 上游。这些资料提出了一些有趣的问题，这些问题是关于人α1ACa2+通道异型内少 量谷胺酰胺扩张造成小脑变性和共济失调的机制。该疾病的此种显性特征提出三 种可能性：(1)因单倍型缺乏引起的功能丧失，(2)因扩张引起的显性负作用，或(3) 如在其它CAG重复扩张导致的疾病中所提出的那样，获得了一种新的功能。在 具有杂合突变的tg小鼠和tgla小鼠内缺乏共济失调表型的争论反对功能丧失的假 设。但是，该模型还不能被排除，除非用精确的定量方法确认小鼠内的两种突变 都真的造成α1ACa2+通道功能的丧失，而且杂合小鼠既不表现出共济失调也不表现 出浦肯野细胞变性。因为有些患者的共济失调具有暂时性和温和性，所以极难确 认小鼠轻微和暂时性共济失调表型。激发显性负机制的一个模型与人家族内的遗 传方式相适合，而且与目前从tg小鼠获得的资料相合。该模型中，谷胺酰胺段的 少量小扩张通过影响可能通道与同线性蛋白的结合或阻止其与其它已知调节通 道活性的辅助性通道蛋白结合来干扰通道的正常功能。因为根据电生理学数据43 和tg小鼠获得的资料，现在已知α1ACa2+通道对于浦肯野细胞的正常功能十分重 要，所以很难证明谷胺酰胺扩张使该蛋白获得了新功能。谷胺酰胺扩张很可能导 致通道功能异常，包括组成型激活的可能性。各种模型的最终证据将有待于产生 缺乏α1ACa2+通道基因的小鼠和产生在SCA6疾病范围内表达带有CAG扩张的等 位基因的小鼠。

SCA6中基因型/表型之间的关联提示，因为与重复大小在22至23次范围内 的其它家族(40至50岁)相比，带有27次重复的家族中每个成员发病年龄明显不 同(28至31岁)，故此种扩张是非常有害的。虽然目前的取样量还太小，不足以就 基因型/表型之间的关联得出肯定的结论，但是有意思的是发现比SCA6轻微得多 的HPCA/EA患者是否可能具有更小的扩张。此外，确定α1ACa2+通道内的不同突 变是否导致SCA6将是十分重要的。CAG重复在SCA6中是稳定的，没有可测得 的镶嵌性或几代人之间等位基因大小的改变。这并不奇怪，因为许多其它基因座 上大小类似的CAG重复已被证明是以稳定方式遗传的。但是，普通人群中此种 重复的大小和不同SCA6家族中扩张的等位基因的不同大小提示，此基因座的确 存在一定程度的不稳定性，而且这种不稳定性造成的突变性扩张发生在疾病等位 基因范围内。

总之，本发明证明人浦肯野细胞型Ca2+通道α1A亚基内相对较小的聚谷胺酰 胺扩张造成了浦肯野细胞变性和小脑共济失调。该发现的直接含意为临床和生物 学的。相对较小的CAG重复的扩张能够导致蛋白功能异常，这一发现就这类重 复的作用提出了一个新的观点，而且提出需要对各种重复就其可能的致病作用进 行仔细评价。最后，人钙通道内聚谷胺酰胺段的扩张使我们得以了解神经变性的 机理，因为它们关系到钙的自身稳定，并且在其它谷胺酰胺介导的神经变性过程 中此类机理可能起作用。

                          发明背景

联邦基金说明

本发明的产生部分使用了获自国防部的资金。所以，联邦政府对本发明有一 定的权利。

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42.Fletcher，C.F.等.突变跛脚小鼠不发生癫痫与钙通道缺陷有关。Cell 87，607-617(1996).

43.Mintz，I.M.用蜘蛛毒素omega-Aga-IIIA阻断大鼠中枢神经元内的Ca通道。J.Neurosci.14，2844-2853(1994).

44.Gubler，U.，& Hoffman.，B.J.一种产生cDNA文库的简单而有效的方 法。Gene 25，263-269(1983).

45.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.& Maniatis，T.(1989)分子克隆。实验室手 册。(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989).

本说明书中提到的专利或出版物代表了本发明所属领域内熟练技术人员的 水平。本发明对这些专利和出版物进行了相同程度的引用，对每篇出版物都做了 具体单独的说明，以纳为参考。

本领域熟练技术人员很容易理解的是：本发明经改进将很适合实施本发明的 目标并获得所述的结果和利益。本发明实施例以及本文所述的方法、过程、处理、 分子和具体化合物代表了目前优选的实施方式，它们是举例性质的，并不是为了 限定本发明的范围。对本发明熟练技术人员来说，其中的改变和其它用途是显而 易见的，这些都属于本发明范围之内，正如后文权利要求书所限定的范围内。

                                序列表

(1)一般信息：

  (i)申请人：Lee，Cheng-Chi

  (ii)发明名称：大规模鉴定疾病基因型的方法和6型脊髓小脑共济失调的诊 断试验。

  (iii)序列数量：5

  (iv)通信地址：

    (A)收件人：James F.Weiler

    (B)街道：One Riverway，Suite 1560

    (C)城市：Houston

    (D)州：Texas

    (E)国家：USA

    (F)邮编：77056

  (v)计算机可读形式：

    (A)记录介质类型：磁盘，3.5英寸，1.44Mb容量

    (B)计算机：IBM PC兼容型

    (C)操作系统：Windows 95

    (D)软件：MS Word 97

  (vi)本申请信息：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

    (C)分类：536

  (vii)在先申请信息：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

  (viii)律师/代理人信息：

    (A)姓名：James F.Weiler，律师

    (B)登记号：16,040

    (C)参考/案卷号：D-5968

  (ix)电讯信息：

    (A)电话：(713)626-8646

    (B)电传：(713)963-5889

(2)SEQ ID NO：1的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：25

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：

    (A)说明：其它核酸

  (iii)假定：非

  (iv)反义：非

  (ix)特征：

    (A)名称/代码：S-5-F1

    (D)其它信息：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO.：1

CACGTGTCCT ATTCCCCTGT GATCC                                     25

(3)I SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：25

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：

    (A)说明：其它核酸

  (iii)假定：非

  (iv)反义：非

  (ix)特征：

    (A)名称/代码：S-5-R1

    (D)其它信息：寡核苷酸

  (xi)序列描述：SEQ ID NO.：2

TGGGTACCTC CGAGGGCCGC TGGTG                                    25

(4)SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：3632

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：

    (A)说明：cDNA

  (iii)假定：非

  (iv)反义：非

  (vi)最初来源：

    (A)物种：人

    (F)组织类型：脑

  (vii)中间来源：

    (A)文库：原始人脑cDNA

    (B)克隆：BI-1-GGCAG

  (viii)基因组中的位置：

    (A)染色体/片段：19p13

  (xi)序列描述：SEQ ID NO.：3

GAATTCTTCC ACTCGACTTC ATAGTGGTCA GTGGGGCCCT GGTAGCCTTT GCCTTCACTG  60

GCAATAGCAA AGGAAAAGAC ATCAACACGA TTAAATCCCT CCGAGTCCTC CGGGTGCTAC  120

GACCTCTTAA AACCATCAAG CGGCTGCCAA AGCTCAAGGC TGTGTTTGAC TGTGTGGTGA  180

ACTCACTTAA AAACGTCTTC AACATCCTCA TCGTCTACAT GCTATTCATG TTCATCTTCG  240

CCGTGGTGGC TGTGCAGCTC TTCAAGGGGA AATTCTTCCA CTGCACTGAC GAGTCCAAAG  300

AGTTTGAGAA AGATTGTCGA GGCAAATACC TCCTCTACGA GAAGAATGAG GTGAAGGCGC  360

GAGACCGGGA GTGGAAGAAG TATGAATTCC ATTACGACAA TGTGCTGTGG GCTCTGCTGA  420

CCCTCTTCAC CGTGTCCACG GGAGAAGGCT GGCCACAGGT CCTCAAGCAT TCGGTGGACG  480

CCACCTTTGA GAACCAGGGC CCCAGCCCCG GGTACCGCAT GGAGATGTCC ATTTTCTACG  540

TCGTCTACTT TGTGGTGTTC CCCTTCTTCT TTGTCAATAT CTTTGTGGCC TTGATCATCA  600

TCACCTTCCA GGAGCAAGGG GACAAGATGA TGGAGGAATA CAGCCTGGAG AAAAATGAGA  660

GGGCCTGCAT TGATTTCGCC ATCAGCGCCA AGCCGCTGAC CCGACACATG CCGCAGAACA  720

AGCAGAGCTT CCAGTACCGC ATGTGGCAGT TCGTGGTGTC TCCGCCTTTC GAGTACACGA  780

TCATGGCCAT GATCGCCCTC AACACCATCG TGCTTATGAT GAAGTTCTAT GGGGCTTCTG  840

TTGCTTATGA AAATGCCCTG CGGGTGTTCA ACATCGTCTT CACCTCCCTC TTCTCTCTGG  900

AATGTGTGCT GAAAGTCATG GCTTTTGGGA TTCTGAATTA TTTCCGCGAT GCCTGGAACA  960

TCTTCGACTT TGTGACTGTT CTGGGCAGCA TCACCGATAT CCTCGTGACT GAGTTTGGGA  1020

ATAACTTCAT CAACCTGAGC TTTCTCCGCC TCTTCCGAGC TGCCCGGCTC ATCAAACTTC  1080

TCCGTCAGGG TTACACCATC CGCATTCTTC TCTGGACCTT TGTGCAGTCC TTCAAGGCCC  1140

TGCCTTATGT CTGTCTGCTG ATCGCCATGC TCTTCTTCAT CTATGCCATC ATTGGGATGC  1200

AGGTGTTTGG TAACATTGGC ATCGACGTGG AGGACGAGGA CAGTGATGAA GATGAGTTCC  1260

AAATCACTGA GCACAATAAC TTCCGGACCT TCTTCCAGGC CCTCATGCTT CTCTTCCGGA  1320

GTGCCACCGG GGAAGCTTGG CACAACATCA TGCTTTCCTG CCTCAGCGGG AAACCGTGTG  1380

ATAAGAACTC TGGCATCCTG ACTCGAGAGT GTGGCAATGA ATTTGCTTAT TTTTACTTTG  1440

TTTCCTTCAT CTTCCTCTGC TCGTTTCTGA TGCTGAATCT CTTTGTCGCC GTCATCATGG  1500

ACAACTTTGA GTACCTCACC CGAGACTCCT CCATCCTGGG CCCCCACCAC CTGGATGAGT  1560

ACGTGCGTGT CTGGGCCGAG TATGACCCCG CAGCTTGGGG CCGCATGCCT TACCTGGACA  1620

TGTATCAGAT GCTGAGACAC ATGTCTCCGC CCCTGGGTCT GGGGAAGAAG TGTCCGGCCA  1680

GAGTGGCTTA CAAGCGGCTT CTGCGGATGG ACCTGCCCGT CGCAGATGAC AACACCGTCC  1740

ACTTCAATTC CACCCTCATG GCTCTGATCC GCACAGCCCT GGACATCAAG ATTGCCAAGG  1800

GAGGAGCCGA CAAACAGCAG ATGGACGCTG AGCTGCGGAA GGAGATGATG GCGATTTGGC  1860

CCAATCTGTC CCAGAAGACG CTAGACCTGC TGGTCACACC TCACAAGTCC ACGGACCTCA  1920

CCGTGGGGAA GATCTACGCA GCCATGATGA TCATGGAGTA CTACCGGCAG AGCAAGGCCA  1980

AGAAGCTGCA GGCCATGCGC GAGGAGCAGG ACCGGACACC CCTCATGTTC CAGCGCATGG  2040

AGCCCCCGTC CCCAACGCAG GAAGGGGGAC CTGGCCAGAA CGCCCTCCCC TCCACCCAGC  2100

TGGACCCAGG AGGAGCCCTG ATGGCTCACG AAAGCGGCCT CAAGGAGAGC CCGTCCTGGG  2160

TGACCCAGCG TGCCCAGGAG ATGTTCCAGA AGACGGGCAC ATGGAGTCCG GAACAAGGCC  2220

CCCCTACCGA CATGCCCAAC AGCCAGCCTA ACTCTCAGTC CGTGGAGATG CGAGAGATGG  2280

GCAGAGATGG CTACTCCGAC AGCGAGCACT ACCTCCCCAT GGAAGGCCAG GGCCGGGCTG  2340

CCTCCATGCC CCGCCTCCCT GCAGAGAACC AGAGGAGAAG GGGCCGGCCA CGTGGGAATA  2400

ACCTCAGTAC CATCTCAGAC ACCAGCCCCA TGAAGCGTTC AGCCTCCGTG CTGGGCCCCA  2460

AGGCCCGACG CCTGGACGAT TACTCGCTGG AGCGGGTCCC GCCCGAGGAG AACCAGCGGC  2520

ACCACCAGCG GCGCCGCGAC CGCAGCCACC GCGCCTCTGA GCGCTCCCTG GGCCGCTACA  2580

CCGATGTGGA CACAGGCTTG GGGACAGACC TGAGCATGAC CACCCAATCC GGGGACCTGC  2640

CGTCGAAGGA GCGGGACCAG GAGCGGGGCC GGCCCAAGGA TCGGAAGCAT CGACAGCACC  2700

ACCACCACCA CCACCACCAC CACCATCCCC CGCCCCCCGA CAAGGACCGC TATGCCCAGG  2760

AACGGCCGGA CCACGGCCGG GCACGGGCTC GGGACCAGCG CTGGTCCCGC TCGCCCAGCG  2820

AGGGCCGAGA GCACATGGCG CACCGGCAGG GCAGTAGTTC CGTAAGTGGA AGCCCAGCCC  2880

CCTCAACATC TGGTACCAGC ACTCCGCGGC GGGGCCGCCG CCAGCTCCCC CAGACCCCCT  2940

CCACCCCCCG GCCACACGTG TCCTATTCCC CTGTGATCCG TAAGGCCGGC GGCTCGGGGC  3000

CCCC6CAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GGCGGTGGCC AGGCCGGGCC  3060

GGGCGGCCAC CAGCGGCCCT CGGAGGTACC CAGGCCCCAC GGCCGAGCCT CTGGCCGGAG  3120

ATCGGCCGCC CACGGGGGGC CACAGCAGCG GCCGCTCGCC CAGGATGGAG AGGCGGGTCC  3180

CAGGCCCGGC CCGGAGCGAG TCCCCCAGGG CCTGTCGACA CGGCGGGGCC CGGTGGCCGG  3240

CATCTGGCCC GCACGTGTCC GAGGGGCCCC CGGGTCCCCG GCACCATGGC TACTACCGGG  3300

GCTCCGACTA CGACGAGGCC GATGGCCCGG GCAGCGGGGG CGGCGAGGAG GCCATGGCCG  3360

GGGCCTACGA CGCGCCACCC CCCGTACGAC ACGCGTCCTC GGGCGCCACC GGGCGCTCGC  3420

CCAGGACTCC CCGGGCCTCG GGCCCGGCCT GCGCCTCGCC TTCTCGGCAC GGCCGGCGAC  3480

TCCCCAACGG CTACTACCCG GCGCACGGAC TGGCCAGGCC CCGCGGGCCG GGCTCCAGGA  3540

AGGGCCTGCA CGAACCCTAC AGCGAGAGTG ACGATGATTG GTGCTAAGCC CGGGCGAGGG  3600

AATTCCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TT                                3632

(5)SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：3632

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：

    (A)说明：cDNA

  (iii)假定：非

  (iv)反义：非

  (vi)最初来源

    (A)物种：人

    (F)组织类型：脑

  (vii)中间来源：

    (A)文库：原始人脑cDNA

    (B)克隆：BI-1(VI)-GGCAG

  (viii)基因组中的位置：

    (A)染色体/片段：19p13

  (xi)序列描述：SEQ ID NO.：4

GAATTCTTCC ACTCGACTTC ATAGTGGTCA GTGGGGCCCT GGTAGCCTTT GCCTTCACTG  60

GCAATAGCAA AGGAAAAGAC ATCAACACGA TTAAATCCCT CCGAGTCCTC CGGGTGCTAC  120

GACCTCTTAA AACCATCAAG CGGCTGCCAA AGCTCAAGGC TGTGTTTGAC TGTGTGGTGA  180

ACTCACTTAA AAACGTCTTC AACATCCTCA TCGTCTACAT GCTATTCATG TTCATCTTCG  240

CCGTGGTGGC TGTGCAGCTC TTCAAGGGGA AATTCTTCCA CTGCACTGAC GAGTCCAAAG  300

AGTTTGAGAA AGATTGTCGA GGCAAATACC TCCTCTACGA GAAGAATGAG GTGAAGGCGC  360

GAGACCGGGA GTGGAAGAAG TATGAATTCC ATTACGACAA TGTGCTGTGG GCTCTGCTGA  420

CCCTCTTCAC CGTGTCCACG GGAGAAGGCT GGCCACAGGT CCTCAAGCAT TCGGTGGACG  480

CCACCTTTGA GAACCAGGGC CCCAGCCCCG GGTACCGCAT GGAGATGTCC ATTTTCTACG  540

TCGTCTACTT TGTGGTGTTC CCCTTCTTCT TTGTCAATAT CTTTGTGGCC TTGATCATCA  600

TCACCTTCCA GGAGCAAGGG GACAAGATGA TGGAGGAATA CAGCCTGGAG AAAAATGAGA  660

GGGCCTGCAT TGATTTCGCC ATCAGCGCCA AGCCGCTGAC CCGACACATG CCGCAGAACA  720

AGCAGAGCTT CCAGTACCGC ATGTGGCAGT TCGTGGTGTC TCCGCCTTTC GAGTACACGA  780

TCATGGCCAT GATCGCCCTC AACACCATCG TGCTTATGAT GAAGTTCTAT GGGGCTTCTG  840

TTGCTTATGA AAATGCCCTG CGGGTGTTCA ACATCGTCTT CACCTCCCTC TTCTCTCTGG  900

AATGTGTGCT GAAAGTCATG GCTTTTGGGA TTCTGAATTA TTTCCGCGAT GCCTGGAACA  960

TCTTCGACTT TGTGACTGTT CTGGGCAGCA TCACCGATAT CCTCGTGACT GAGTTTGGGA  1020

ATAACTTCAT CAACCTGAGC TTTCTCCGCC TCTTCCGAGC TGCCCGGCTC ATCAAACTTC  1080

TCCGTCAGGG TTACACCATC CGCATTCTTC TCTGGACCTT TGTGCAGTCC TTCAAGGCCC  1140

TGCCTTATGT CTGTCTGCTG ATCGCCATGC TCTTCTTCAT CTATGCCATC ATTGGGATGC  1200

AGGTGTTTGG TAACATTGGC ATCGACGTGG AGGACGAGGA CAGTGATGAA GATGAGTTCC  1260

AAATCACTGA GCACAATAAC TTCCGGACCT TCTTCCAGGC CCTCATGCTT CTCTTCCGGA  1320

GTGCCACCGG GGAAGCTTGG CACAACATCA TGCTTTCCTG CCTCAGCGGG AAACCGTGTG  1380

ATAAGAACTC TGGCATCCTG ACTCGAGAGT GTGGCAATGA ATTTGCTTAT TTTTACTTTG  1440

TTTCCTTCAT CTTCCTCTGC TCGTTTCTGA TGCTGAATCT CTTTGTCGCC GTCATCATGG  1500

ACAACTTTGA GTACCTCACC CGAGACTCCT CCATCCTGGG CCCCCACCAC CTGGATGAGT  1560

ACGTGCGTGT CTGGGCCGAG TATGACCCCG CAGCTTGCGG TCGGATTCAT TATAAGGATA  1620

TGTACAGTTT ATTACGAGTA ATATCTCCCC CTCTCGGCTT AGGCAAGAAA TGTCCTCATA  1680

GGGTTGCTTG CAAGCGGCTT CTGCGGATGG ACCTGCCCGT CGCAGATGAC AACACCGTCC  1740

ACTTCAATTC CACCCTCATG GCTCTGATCC GCACAGCCCT GGACATCAAG ATTGCCAAGG  1800

GAGGAGCCGA CAAACAGCAG ATGGACGCTG AGCTGCGGAA GGAGATGATG GCGATTTGGC  1860

CCAATCTGTC CCAGAAGACG CTAGACCTGC TGGTCACACC TCACAAGTCC ACGGACCTCA  1920

CCGTGGGGAA GATCTACGCA GCCATGATGA TCATGGAGTA CTACCGGCAG AGCAAGGCCA  1980

AGAAGCTGCA GGCCATGCGC GAGGAGCAGG ACCGGACACC CCTCATGTTC CAGCGCATGG  2040

AGCCCCCGTC CCCAACGCAG GAAGGGGGAC CTGGCCAGAA CGCCCTCCCC TCCACCCAGC  2100

TGGACCCAGG AGGAGCCCTG ATGGCTCACG AAAGCGGCCT CAAGGAGAGC CCGTCCTGGG  2160

TGACCCAGCG TGCCCAGGAG ATGTTCCAGA AGACGGGCAC ATGGAGTCCG GAACAAGGCC  2220

CCCCTACCGA CATGCCCAAC AGCCAGCCTA ACTCTCAGTC CGTGGAGATG CGAGAGATGG  2280

GCAGAGATGG CTACTCCGAC AGCGAGCACT ACCTCCCCAT GGAAGGCCAG GGCCGGGCTG  2340

CCTCCATGCC CCGCCTCCCT GCAGAGAACC AGAGGAGAAG GGGCCGGCCA CGTGGGAATA  2400

ACCTCAGTAC CATCTCAGAC ACCAGCCCCA TGAAGCGTTC AGCCTCCGTG CTGGGCCCCA  2460

AGGCCCGACG CCTGGACGAT TACTCGCTGG AGCGGGTCCC GCCCGAGGAG AACCAGCGGC  2520

ACCACCAGCG GCGCCGCGAC CGCAGCCACC GCGCCTCTGA GCGCTCCCTG GGCCGCTACA  2580

CCGATGTGGA CACAGGCTTG GGGACAGACC TGAGCATGAC CACCCAATCC GGGGACCTGC  2640

CGTCGAAGGA GCGGGACCAG GAGCGGGGCC GGCCCAAGGA TCGGAAGCAT CGACAGCACC  2700

ACCACCACCA CCACCACCAC CACCATCCCC CGCCCCCCGA CAAGGACCGC TATGCCCAGG  2760

AACGGCCGGA CCACGGCCGG GCACGGGCTC GGGACCAGCG CTGGTCCCGC TCGCCCAGCG  2820

AGGGCCGAGA GCACATGGCG CACCGGCAGG GCAGTAGTTC CGTAAGTGGA AGCCCAGCCC  2880

CCTCAACATC TGGTACCAGC ACTCCGCGGC GGGGCCGCCG CCAGCTCCCC CAGACCCCCT  2940

CCACCCCCCG GCCACACGTG TCCTATTCCC CTGTGATCCG TAAGGCCGGC GGCTCGGGGC  3000

CCCCGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGGC AGCGGTGGCC AGGCCGGGCC  3060

GGGCGGCCAC CAGCGGCCCT CGGAGGTACC CAGGCCCCAC GGCCGAGCCT CTGGCCGGAG  3120

ATCGGCCGCC CACGGGGGGC CACAGCAGCG GCCGCTCGCC CAGGATGGAG AGGCGGGTCC  3180

CAGGCCCGGC CCGGAGCGAG TCCCCCAGGG CCTGTCGACA CGGCGGGGCC CGGTGGCCGG  3240

CATCTGGCCC GCACGTGTCC GAGGGGCCCC CGGGTCCCCG GCACCATGGC TACTACCGGG  3300

GCTCCGACTA CGACGAGGCC GATGGCCCGG GCAGCGGGGG CGGCGAGGAG GCCATGGCCG  3360

GGGCCTACGA CGCGCCACCC CCCGTACGAC ACGCGTCCTC GGGCGCCACC GGGCGCTCGC  3420

CCAGGACTCC CCGGGCCTCG GGCCCGGCCT GCGCCTCGCC TTCTCGGCAC GGCCGGCGAC  3480

TCCCCAACGG CTACTACCCG GCGCACGGAC TGGCCAGGCC CCGCGGGCCG GGCTCCAGGA  3540

AGGGCCTGCA CGAACCCTAC AGCGAGAGTG ACGATGATTG GTGCTAAGCC CGGGCGAGGG  3600

AATTCCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TT                                3632

(6)SEQ ID NO：5的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：3596

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：

    (A)说明：cDNA

  (iii)假定：非

  (iv)反义：非

  (vi)最初来源：

    (A)物种：人

    (F)组织类型：脑

  (vii)中间来源：

    (A)文库：原始人脑cDNA

    (B)克隆：BI-1(V2)-GGCAG

  (viii)基因组中的位置：

    (A)染色体/片段：19p13

  (ix)特征：

  (xi)序列描述：SEQ ID NO.：5

GAATTCTTCC ACTCGACTTC ATAGTGGTCA GTGGGGCCCT GGTAGCCTTT GCCTTCACTG  60

GCAATAGCAA AGGAAAAGAC ATCAACACGA TTAAATCCCT CCGAGTCCTC CGGGTGCTAC  120

GACCTCTTAA AACCATCAAG CGGCTGCCAA AGCTCAAGGC TGTGTTTGAC TGTGTGGTGA  180

ACTCACTTAA AAACGTCTTC AACATCCTCA TCGTCTACAT GCTATTCATG TTCATCTTCG  240

CCGTGGTGGC TGTGCAGCTC TTCAAGGGGA AATTCTTCCA CTGCACTGAC GAGTCCAAAG  300

AGTTTGAGAA AGATTGTCGA GGCAAATACC TCCTCTACGA GAAGAATGAG GTGAAGGCGC  360

GAGACCGGGA GTGGAAGAAG TATGAATTCC ATTACGACAA TGTGCTGTGG GCTCTGCTGA  420

CCCTCTTCAC CGTGTCCACG GGAGAAGGCT GGCCACAGGT CCTCAAGCAT TCGGTGGACG  480

CCACCTTTGA GAACCAGGGC CCCAGCCCCG GGTACCGCAT GGAGATGTCC ATTTTCTACG  540

TCGTCTACTT TGTGGTGTTC CCCTTCTTCT TTGTCAATAT CTTTGTGGCC TTGATCATCA  600

TCACCTTCCA GGAGCAAGGG GACAAGATGA TGGAGGAATA CAGCCTGGAG AAAAATGAGA  660

GGGCCTGCAT TGATTTCGCC ATCAGCGCCA AGCCGCTGAC CCGACACATG CCGCAGAACA  720

AGCAGAGCTT CCAGTACCGC ATGTGGCAGT TCGTGGTGTC TCCGCCTTTC GAGTACACGA  780

TCATGGCCAT GATCGCCCTC AACACCATCG TGCTTATGAT GAAGTTCTAT GGGGCTTCTG  840

TTGCTTATGA AAATGCCCTG CGGGTGTTCA ACATCGTCTT CACCTCCCTC TTCTCTCTGG  900

AATGTGTGCT GAAAGTCATG GCTTTTGGGA TTCTGAATTA TTTCCGCGAT GCCTGGAACA  960

TCTTCGACTT TGTGACTGTT CTGGGCAGCA TCACCGATAT CCTCGTGACT GAGTTTGGGA  1020

ATAACTTCAT CAACCTGAGC TTTCTCCGCC TCTTCCGAGC TGCCCGGCTC ATCAAACTTC  1080

TCCGTCAGGG TTACACCATC CGCATTCTTC TCTGGACCTT TGTGCAGTCC TTCAAGGCCC  1140

TGCCTTATGT CTGTCTGCTG ATCGCCATGC TCTTCTTCAT CTATGCCATC ATTGGGATGC  1200

AGGTGTTTGG TAACATTGGC ATCGACGTGG AGGACGAGGA CAGTGATGAA GATGAGTTCC  1260

AAATCACTGA GCACAATAAC TTCCGGACCT TCTTCCAGGC CCTCATGCTT CTCTTCCGGA  1320

GTGCCACCGG GGAAGCTTGG CACAACATCA TGCTTTCCTG CCTCAGCGGG AAACCGTGTG  1380

ATAAGAACTC TGGCATCCTG ACTCGAGAGT GTGGCAATGA ATTTGCTTAT TTTTACTTTG  1440

TTTCCTTCAT CTTCCTCTGC TCGTTTCTGA TGCTGAATCT CTTTGTCGCC GTCATCATGG  1500

ACAACTTTGA GTACCTCACC CGAGACTCCT CCATCCTGGG CCCCCACCAC CTGGATGAGT  1560

ACGTGCGTGT CTGGGCCGAG TATGACCCCG CAGCTTGGGG CCGCATGCCT TACCTGGACA  1620

TGTATCAGAT GCTGAGACAC ATGTCTCCGC CCCTGGGTCT GGGGAAGAAG TGTCCGGCCA  1680

GAGTGGCTTA CAAGCGGCTT CTGCGGATGG ACCTGCCCGT CGCAGATGAC AACACCGTCC  1740

ACTTCAATTC CACCCTCATG GCTCTGATCC GCACAGCCCT GGACATCAAG ATTGCCAAGG  1800

GAGGAGCCGA CAAACAGCAG ATGGACGCTG AGCTGCGGAA GGAGATGATG GCGATTTGGC  1860

CCAATCTGTC CCAGAAGACG CTAGACCTGC TGGTCACACC TCACAAGTCC ACGGACCTCA  1920

CCGTGGGGAA GATCTACGCA GCCATGATGA TCATGGAGTA CTACCGGCAG AGCAAGGCCA  1980

AGAAGCTGCA GGCCATGCGC GAGGAGCAGG ACCGGACACC CCTCATGTTC CAGCGCATGG  2040

AGCCCCCGTC CCCAACGCAG GAAGGGGGAC CTGGCCAGAA CGCCCTCCCC TCCACCCAGC  2100

TGGACCCAGG AGGAGCCCTG ATGGCTCACG AAAGCGGCCT CAAGGAGAGC CCGTCCTGGG  2160

TGACCCAGCG TGCCCAGGAG ATGTTCCAGA AGACGGGCAC ATGGAGTCCG GAACAAGGCC  2220

CCCCTACCGA CATGCCCAAC AGCCAGCCTA ACTCTCAGTC CGTGGAGATG CGAGAGATGG  2280

GCAGAGATGG CTACTCCGAC AGCGAGCACT ACCTCCCCAT GGAAGGCCAG GGCCGGGCTG  2340

CCTCCATGCC CCGCCTCCCT GCAGAGAACC AGACCATCTC AGACACCAGC CCCATGAAGC  2400

GTTCAGCCTC CGTGCTGGGC CCCAAGGCCC GACGCCTGGA CGATTACTCG CTGGAGCGGG  2460

TCCCGCCCGA GGAGAACCAG CGGCACCACC AGCGGCGCCG CGACCGCAGC CACCGCGCCT  2520

CTGAGCGCTC CCTGGGCCGC TACACCGATG TGGACACAGG CTTGGGGACA GACCTGAGCA  2580

TGACCACCCA ATCCGGGGAC CTGCCGTCGA AGGAGCGGGA CCAGGAGCGG GGCCGGCCCA  2640

AGGATCGGAA GCATCGACAG CACCACCACC ACCACCACCA CCACCACCAT CCCCCGCCCC  2700

CCGACAAGGA CCGCTATGCC CAGGAACGGC CGGACCACGG CCGGGCACGG GCTCGGGACC  2760

AGCGCTGGTC CCGCTCGCCC AGCGAGGGCC GAGAGCACAT GGCGCACCGG CAGGGCAGTA  2820

GTTCCGTAAG TGGAAGCCCA GCCCCCTCAA CATCTGGTAC CAGCACTCCG CGGCGGGGCC  2880

GCCGCCAGCT CCCCCAGACC CCCTCCACCC CCCGGCCACA CGTGTCCTAT TCCCCTGTGA  2940

TCCGTAAGGC CGGCGGCTCG GGGCCCCCGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC  3000

AGCAGGCGGT GGCCAGGCCG GGCCGGGCGG CCACCAGCGG CCCTCGGAGG TACCCAGGCC  3060

CCACGGCCGA GCCTCTGGCC GGAGATCGGC CGCCCACGGG GGGCCACAGC AGCGGCCGCT  3120

CGCCCAGGAT GGAGAGGCGG GTCCCAGGCC CGGCCCGGAG CGAGTCCCCC AGGGCCTGTC  3180

GACACGGCGG GGCCCGGTGG CCGGCATCTG GCCCGCACGT GTCCGAGGGG CCCCCGGGTC  3240

CCCGGCACCA TGGCTACTAC CGGGGCTCCG ACTACGACGA GGCCGATGGC CCGGGCAGCG  3300

GGGGCGGCGA GGAGGCCATG GCCGGGGCCT ACGACGCGCC ACCCCCCGTA CGACACGCGT  3360

CCTCGGGCGC CACCGGGCGC TCGCCCAGGA CTCCCCGGGC CTCGGGCCCG GCCTGCGCCT  3420

CGCCTTCTCG GCACGGCCGG CGACTCCCCA ACGGCTACTA CCCGGCGCAC GGACTGGCCA  3480

GGCCCCGCGG GCCGGGCTCC AGGAAGGGCC TGCACGAACC CTACAGCGAG AGTGACGATG  3540

ATTGGTGCTA AGCCCGGGCG AGGGAATTCC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTT      3596