[0001] 本发明涉及SACS基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的核酸、分离的多肽、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法、筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统以及用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。

[0002] 遗传性痉挛性共济失调（spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay type，SACS）是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，以进行性小脑功能障碍，伴反射亢进痉挛状态的锥体束征及伴肌萎缩的感觉运动性周围神经病为临床表现。SACS病多在1-5岁发病，最初临床表现为行走能力较同龄儿童推迟，步态不稳和频繁跌倒，在发病早中期，构音障碍和痉挛性截瘫是其主要的临床表现，随着病情的发展，下肢的周围神经病变逐渐明显，锥体束征逐渐被日益严重的周围神经病变所掩盖，在疾病的后期常可看到远端肌萎缩、弓形足和槌状趾，而下肢的病理征甚至会被这些症状所掩盖，部分患者可伴发有轻度的智力发育障碍或精神行为异常。病情进展相对缓慢，在发病30-40年后，多数患者需要做轮椅。头颅MRI可显示小脑蚓部萎缩，神经电图和神经活检显示严重的轴性神经病变伴随轻度的脱髓鞘，感觉神经纤维往往较运动神经纤维损伤严重，肌肉活检常可看到组织总线粒体DNA的缺失。

[0003] 现阶段，寻找致病基因对疾病诊断或治疗意义重大。目前已知SACS为痉挛性共济失调病的致病相关基因，且已发现多个致病基因位点，但仍存在着相当一部分未知致病基因位点。

[0004] 因而，目前对痉挛性共济失调病的研究仍有待深入。

[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法。

[0006] 本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了痉挛性共济失调病的致病基因上的新突变。

[0007] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有c.1229delT突变，或者c.5840C>G突变。根据本发明的实施例，发明人确定了SACS基因突变体，这些新突变体与痉挛性共济失调病的发病密切相关，从而通过检测这些新突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病。

[0008] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，该分离的多肽具有p.Leu410X突变，或者p.Pro1947Arg突变。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病。

[0009] 根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，是所述生物样品易感痉挛性共济失调病的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。

[0010] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，判断所述生物样品是否易感痉挛性共济失调病。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。

[0011] 根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测SACS基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述SACS基因突变体具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。

[0012] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.5840C>G突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种SACS基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。

[0013] 根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。

[0014] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明

[0015] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0016] 图1：显示了根据本发明一个实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

[0017] A为根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统的示意图，

[0018] B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

[0019] C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

[0020] 图2：显示了根据本发明一个实施例的SACS患者家系的家系图谱；

[0021] 图3：显示了根据本发明一个实施例，图2所示SACS患者家系内的两名患者及其父母的SACS基因c.1229delT突变位点的Sanger测序验证峰图；

[0022] 图4：显示了根据本发明一个实施例，图2所示SACS患者家系内的两名及其父母的SACS基因c.5840C>G突变位点的Sanger测序验证峰图；

[0023] 图5：显示了图2所示SACS患者家系中患者1小脑萎缩的头部磁共振诊断图。

[0024] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0025] SACS基因突变体

[0026] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有c.1229delT突变，或者c.5840C>G突变。需要说明的是，本发明的分离的核酸编码SACS突变体，也可以称为“编码SACS突变体的核酸”，即该核酸可以理解为与编码SACS突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与SACS的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码SACS突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了SACS基因的新突变体，这些突变体与痉挛性共济失调病的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否同时存在，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否同时存在，可以有效地预测生物体是否易感痉挛性共济失调病。

[0027] 对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

[0028] 这些编码SACS突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法，确定的痉挛性共济失调病的致病基因上的新突变，并且在现有技术中并未见到SACS基因上的c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变与痉挛性共济失调病相关的报道。

[0029] 野生型SACS基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

[0030]ATGGAGACCAAGGAGAACAGGTGGGTCCCGGTGACCGTGCTCCCCGGCTGCGTGGGCTGCAGGACCGTCGCGGCGCTGGCGTCCTGGACCGTGCGCGATGTGAAGGAACGTATCTTCGCGGAGACTGGCTTCCCGGTGTCGGAGCAGCGGCTGTGGCGCGGCGGCCGCGAGTTATCTGACTGGATCAAGATTGGAGATCTGACTTCCAAAAATTGTCATCTTTTTGTAAACCTTCAATCAAAAGGCTTAAAAGGGGGAGGTCGATTTGGTCAGACAACGCCACCACTTGTTGATTTTCTCAAGGACATTTTGAGAAGATATCCAGAAGGAGGACAGATTCTTAAGGAATTAATTCAGAATGCAGAAGATGCTGGGGCGACAGAAGTTAAATTTTTATATGATGAAACTCAATACGGAACAGAGACTCTTTGGTCAAAAGATATGGCGCCATATCAGGGGCCAGCTCTCTATGTGTACAACAACGCGGTTTTCACCCCAGAGGACTGGCACGGCATTCAAGAAATAGCAAGAAGCAGGAAAAAGGATGATCCTCTGAAGGTCGGAAGATTTGGAATTGGGTTTAATTCTGTCTATCATATAACAGATGTTCCTTGTATCTTTAGTGGTGACCAAATCGGGATGCTAGATCCTCATCAAACACTTTTTGGCCCACATGAATCAGGCCAATGTTGGAATCTCAAAGATGACAGCAAAGAAATTAGTGAACTTTCAGACCAGTTTGCACCATTTGTTGGCATTTTTGGAAGCACCAAGGAAACATTTATAAACGGCAATTTTCCAGGAACATTTTTCCGTTTCCCTCTTCGCCTACAACCTTCACAACTTAGTAGTAACCTCTACAATAAGCAGAAGGTTCTTGAGTTGTTTGAGTCTTTTAGGGCAGATGCAGACACAGTGCTGCTCTTTCTGAAAAGTGTGCAGGATGTTTCCTTATATGTCCGAGAGGCTGACGGAACAGAGAAACTGGTGTTTAGAGTGACTTCGAGTGAGAGTAAGGCACTGAAACATGAGCGGCCGAATTCTATAAAGATTCTGGGAACTGCTATAAGTAACTATTGTAAAAAGACTCCAAGCAATAACATCACCTGTGTAACATATCACGTAAATATTGTTTTAGAAGAGGAGAGTACTAAGGATGCACAGAAAACATCTTGGTTGGTGTGTAACAGTGTGGGTGGGCGAGGGATCAGTAGTAAGCTTGACTCTTAGCTGATGAACTGAAATTTGTCCCAATCATTGGAATAGCCATGCCTTTATCAAGCAGAGATGATGAAGCAAAAGGAGCAACGTCTGATTTCTCAGGAAAAGCATTTTGTTTCCTTCCTTTACCACCTGGTGAGGAAAGCAGCACAGGCCTCCCAGTTCACATCAGTGGGTTCTTTGGCCTTACTGATAACCGCAGGAGCATAAAATGGAGAGAGCTGGACCAGTGGAGAGACCCGGCAGCCTTATGGAATGAGTTTCTTGTCATGAATGTTGTCCCCAAAGCTTATGCTACTCTGATCTTAGATTCAATAAAACGTCTGGAGATGGAAAAGAGCTCTGATTTCCCCTTGTCAGTTGATGTTATCTATAAGCTTTGGCCGGAGGCGAGCAAAGTCAAGGTGCACTGGCAACCGGTGTTAGAGCCTCTATTCAGCGAGCTGTTGCAGAATGCAGTGATTTATTCAATTAGCTGTGACTGGGTCAGGTTGGAGCAGGTGTACTTCTCAGAACTTGATGAAAATTTAGAATACACAAAAACTGTGCTCAACTACCTCCAGAGCTCAGGGAAGCAGATTGCCAAGGTACCAGGGAATGTGGATGCTGCTGTTCAGCTCACAGCTGCCTCTGGCACAACACCTGTGAGGAAGGTGACGCCCGCGTGGGTGCGGCAGGTGCTGCGGAAGTGTGCACACCTGGGCTGTGCTGAAGAAAAGCTTCACCTTCTAGAATTTGTGCTTTCTGACCAAGCCTACAGTGAGCTGCTTGGGCTGGAGCTGCTCCCTTTACAAAATGGCAATTTTGTCCCCTTCTCCTCATCTGTATCAGACCAAGATGTCATTTATATTACCTCAGCAGAATATCCAAGGTCCCTTTTCCCAAGTCTTGAAGGAAGATTTATTTTGGATAACTTGAAACCTCACCTTGTGGCTGCTTTAAAGGAAGCTGCCCAAACCCGAGGAAGACCATGTACTCAGCTGCAGCTTCTAAATCCAGAACGATTTGCACGTCTTATCAAGGAAGTAATGAATACATTCTGGCCTGGCAGAGAATTGATTGTTCAATGGTATCCATTTGATGAAAACAGAAATCACCCATCTGTTTCATGGCTTAAGATGGTTTGGAAAAATCTTTATATACATTTTTCAGAGGATTTGACTTTATTTGATGAGATGCCACTTATCCCCAGAACTATACTAGAGGAAGGTCAGACATGTGTGGAACTCATTAGACTCAGGATTCCATCGTTAGTCATTTTAGACGATGAATCTGAAGCACAGCTTCCAGAATTTTTAGCAGACATTGTACAAAAACTTGGAGGGTTTGTCCTTAAAAAATTAGATGCATCTATACAACATCCGCTTATTAAAAAATATATTCATTCACCATTACCAAGTGCTGTTTTGCAGATAATGGAGAAGATGCCATTGCAGAAATTGTGTAATCAAATAACTTCGCTACTTCCAACACACAAAGATGCCCTGAGGAAGTTCTTGGCTAGTTTAACCGATAGCAGTGAGAAAGAGAAAAGAATTATTCAAGAATTGGCAATATTCAAGCGCATTAACCATTCTTCTGATCAGGGAATTTCCTCTTATACAAAATTGAAAGGTTGTAAAGTCTTACACCATACTGCCAAACTCCCAGCAGATCTGCGACTTTCTATTTCAGTAATAGACAGTAGTGATGAAGCTACTATTCGTCTGGCAAACATGTTGAAAATAGAACAGTTAAAGACCACTAGCTGCTTAAAGCTTGTTTTAAAAGATATTGAAAATGCATTTTATTCACATGAAGAGGTAACACAGCTTATGTTATGGGTCCTTGAGAATCTATCTTCTCTTAAAAATGAGAATCCAAATGTGCTTGAGTGGTTAACACCATTAAAATTCATCCAGATATCACAGGAACAGATGGTATCAGCTGGTGAACTCTTTGACCCTGATATAGAAGTACTAAAGGATCTCTTTTGTAATGAAGAAGGAACCTATTTCCCACCCTCAGTTTTTACCTCACCAGATATTCTTCACTCCTTAAGACAGATTGGTTTAAAAAACGAAGCCAGTCTCAAAGAAAAGGATGTTGTGCAAGTGGCAAAAAAAATTGAAGCCTTACAGGTCGGTGCTTGTCCTGATCAAGATGTTCTTCTGAAGAAAGCCAAAACCCTCTTACTGGTTTTAAATAAGAATCACACACTGTTGCAATCATCTGAAGGAAAGATGACATTGAAGAAAATAAAATGGGTTCCAGCCTGCAAGGAAAGGCCTCCAAATTATCCAGGCTCTTTGGTCTGGAAAGGAGATCTCTGTAATCTCTGTGCACCACCAGATATGTGTGATGTAGGCCATGCAATTCTCATTGGCTCCTCACTTCCTCTTGTTGAAAGTATCCATGTAAACCTGGAAAAAGCATTAGGGATCTTCACAAAACCTAGCCTTAGTGCTGTCTTAAAACACTTTAAAATTGTTGTTGATTGGTATTCTTCAAAAACCTTTAGTGATGAAGACTACTATCAATTCCAGCATATTTTGCTTGAGATTTACGGATTCATGCATGATCATCTAAATGAAGGGAAAGATTCTTTTAGAGCCTTAAAATTTCCATGGGTTTGGACTGGCAAAAAGTTTTGTCCACTTGCCCAGGCTGTGATTAAACCAATCCATGATCTTGACCTTCAGCCTTATTTGCATAATGTACCTAAAACCATGGCAAAATTCCACCAACTATTTAAGGTCTGTGGTTCAATAGAGGAGTTGACATCAGATCATATTTCCATGGTTATTCAGAAGATATATCTCAAAAGTGACCAAGATCTCAGTGAACAAGAAAGCAAACAAAATCTTCATCTTATGTTGAATATTATCAGATGGCTGTATAGCAATCAGATTCCAGCAAGCCCCAACACACCAGTTCCTATACATCATAGCAAAAATCCTTCTAAACTTATCATGAAGCCAATTCACGAATGCTGTTATTGTGACATTAAAGTTGATGACCTTAATGACTTACTTGAAGATTCTGTGGAACCAATCATTTTGGTGCATGAGGACATACCCATGAAAACTGCAGAATGGCTAAAAGTTCCATGCCTTAGTACAAGACTGATAAATCCTGAAAACATGGGATTTGAGCAGTCAGGACAAAGAGAGCCACTTACTGTAAGAATTAAAAATATTCTGGAAGAATACCCTTCAGTGTCAGATATTTTTAAAGAACTACTTCAAAACGCTGATGATGCAAATGCAACAGAATGCAGTTTCTTGATTGATATGAGAAGAAATATGGACATAAGAGAGAATCTCCTAGACCCAGGGATGGCAGCTTGTCATGGACCTGCTTTGTGGTCATTCAACAATTCTCAATTCTCAGATTCAGATTTTGTGAACATAACTAGGTTAGGAGAATCTTTAAAAAGGGGAGAAGTTGACAAAGTTGGAAAATTTGGTCTTGGATTTAATTCTGTGTACCATATCACTGACATTCCCATCATTATGAGTCGGGAATTCATGATAATGTTCGATCCAAACATAAATCATATCAGTAAACACATTAAAGACAAATCCAATCCTGGGATCAAAATTAATTGGAGTAAACAACAGAAAAGACTTAGAAAATTTCCTAATCAGTTCAAACCATTTATAGATGTATTTGGCTGTCAGTTACCTTTGACTGTAGAAGCACCTTACAGCTATAATGGAACCCTTTTCCGACTGTCCTTTAGAACTCAACAGGAAGCAAAAGTGAGTGAAGTTAGTAGTACGTGCTACAAT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GCTTTGAACAAAATCTGTTCCAAAGACAGTGCATTTGTTCCTTTGTTGTCATGTCACACAGCAAATATAGAGAGCCCCACAAGCATCTTGAAGGCTCTACATTATATGGTCCAAACTTCAACATTTAGAGCAGAAAAATTAGTAGAAAATGATTTTGAGGCACTTTTGATGTATTTCAACTGCAATTTGAATCATTTGATGTCCCAAGATGATATAAAAATTCTAAAGTCACTTCCGTGCTATAAATCCATCAGTGGCCGCTATGTAAGCATTGGAAAATTTGGAACATGCTACGTACTTACAAAAAGTATCCCTTCAGCTGAAGTGGAGAAATGGACACAGTCATCATCATCTGCATTTCTTGAAGAAAAAATACACTTAAAAGAACTATATGAGGTGATTGGTTGTGTACCTGTAGATGATCTTGAGGTATATTTGAAACACCTCTTACCAAAAATTGAAAATCTCTCTTATGATGCAAAATTAGAGCACTTGATCTACCTTAAGAATAGATTATCAAGTGCTGAGGAATTATCAGAGATTAAGGAACAACTTTTTGAAAAACTGGAAAGTTTATTGATAATCCATGATGCTAACAGTAGACTAAAGCAAGCAAAGCATTTCTATGATAGAACTGTGAGAGTTTTTGAAGTTATGCTTCCTGAAAAATTGTTTATTCCTAATGATTTCTTTAAGAAATTGGAACAACTTATAAAACCCAAAAATCATGTTACATTTATGACATCCTGGGTGGAATTCTTAAGAAATATTGGACTAAAATACATACTTTCTCAGCAGCAGTTGTTACAGTTTGCTAAGGAAATCAGTGTGAGGGCTAATACAGAAAACTGGTCCAAAGAAACATTGCAAAATACAGTTGATATCCTTCTGCATCATATATTCCAAGAACGAATGGATTTGTTATCTGGAAATTTTCTGAAAGAACTATCTTTAATACCATTCTTATGTCCTGAGCGGGCCCCCGCGGAATTCATTAGATTTCATCCTCAATATCAAGAGGTAAATGGAACACTTCCTCTTATAAAGTTCAATGGAGCACAGGTAAATCCAAAATTCAAGCAATGTGATGTACTCCAGCTGTTATGGACATCCTGCCCTATTCTTCCAGAGAAAGCTACACCCTTAAGCATTAAAGAACAAGAAGGTAGTGACCTTGGTCCACAAGAACAGCTTGAACAAGTTTTAAATATGCTTAATGTTAACCTGGATCCTCCTCTTGATAAGGTAATCAATAACTGCAGAAACATATGCAACATAACGACGTTGGATGAAGAAATGGTAAAAACTAGAGCAAAAGTCTTAAGGAGCATATATGAATTCCTCAGTGCAGAAAAAAGGGAATTTCGTTTTCAGTTGCGAGGGGTTGCTTTTGTGATGGTAGAAGATGGTTGGAAACTTCTGAAGCCTGAGGAGGTAGTCATAAACCTAGAATATGAATCTGATTTTAAACCTTATTTGTACAAGCTACCTTTAGAACTTGGCACATTTCACCAGTTGTTCAAACACTTAGGTACTGAAGATATTATTTCAACTAAGCAATATGTTGAAGTGTTGAGCCGCATATTTAAAAATTCTGAGGGCAAACAATTAGATCCTAATGAAATGCGTACAGTTAAGAGAGTAGTTTCTGGTCTGTTCAGGAGTCTACAGAATGATTCAGTCAAGGTGAGGAGTGATCTCGAGAATGTACGAGACCTTGCGCTTTACCTCCCAAGCCAGGATGGTAGATTGGTAAAGTCAAGCATCTTAGTGTTTGACGATGCGCCACATTATAAAAGTAGAATCCAGGGGAATATTGGTGTGCAAATGTTAGTTGATCTCAGCCAGTGCTACTTAGGGAAAGACCATGGATTTCACACTAAGTTGATAATGCTCTTTCCTCAAAAACTTAGACCTCGATTATTGAGCAGTATACTTGAAGAACAATTAGATGAAGAGACTCCCAAAGTTTGTCAGTTTGGAGCGTTGTGTTCTCTTCAAGGAAGATTGCAGTTACTCTTGTCTTCTGAACAGTTCATTACAGGACTGATTAGAATTATGAAGCATGAAAATGATAATGCTTTTCTGGCCAATGAAGAAAAAGCCATAAGACTTTGCAAAGCCCTAAGAGAAGGATTGAAAGTATCCTGCTTTGAAAAGCTTCAAACAACATTAAGAGTTAAAGGTTTTAATCCTATTCCCCACAGCAGAAGTGAAACTTTTGCTTTTTTGAAGCGATTTGGTAATGCAGTCATCTTGCTCTACATTCAACATTCAGACAGTAAAGACATTAATTTCCTGTTAGCATTGGCAATGACTCTTAAATCAGCAACTGACAATTTGATTTCTGACACTTCATATTTAATTGCTATGCTAGGATGCAATGATATTTACAGGATTGGTGAGAAACTTGACAGTTTAGGAGTGAAATATGACTCTTCGGAGCCATCAAAACTGGAACTTCCAATGCCTGGCACACCAATTCCTGCTGAAATTCATTACACTCTGCTTATGGACCCAATGAATGTTTTTTACCCGGGAGAATATGTTGGGTACCTTGTTGATGCTGAAGGTGGTGATATCTATGGATCATACCAGCCAACATACACATATGCAATTATTGTACAAGAAGTTGAAAGAGAAGATGCTGACAATTCTAGTTTTCTAGGAAAGATATATCAGATAGATATTGGTTATAGTGAATATAAAATAGTTAGCTCTCTTGATCTGTATAAGTTTTCAAGACCTGAGGAAAGCTCTCAAAGCAGGGACAGTGCTCCTTCTACACCAACCAGCCCCACTGAGTTCCTCACCCCTGGCCTGAGAAGCATTCCTCCTCTTTTCTCTGGTAGAGAGAGCCACAAGACTTCTTCCAAACATCAGTCCCCCAAAAAGCTTAAGGTTAATTCTTTACCAGAAATCTTAAAAGAAGTGACATCTGTGGTGGAGCAAGCATGGAAGCTTCCAGAATCGGAACGAAAAAAGATTATTAGGCGGTTGTATTTGAAATGGCATCCTGACAAAAATCCAGAGAACCATGACATTGCCAATGAAGTTTTTAAACATTTGCAGAATGAAATCAACAGATTAGAAAAACAGGCTTTTCTAGATCAAAATGCAGACAGGGCCTCCAGACGAACATTTTCAACCTCAGCATCCCGATTTCAGTCAGACAAATACTCATTTCAGAGATTCTATACTTCATGGAATCAAGAAGCAACGAGCCATAAATCTGAAAGACAGCAACAGAACAAAGAAAAATGCCCCCCTTCAGCCGGACAGACTTACTCTCAAAGGTTCTTTGTTCCTCCCACTTTCAAGTCGGTTGGCAATCCAGTGGAAGCACGCAGATGGCTAAGACAAGCCAGAGCAAACTTCTCAGCTGCCAGGAATGACCTTCATAAAAATGCCAATGAGTGGGTGTGCTTTAAATGTTACCTTTCTACCAAGTTAGCTTTGATTGCAGCTGACTATGCTGTGAGGGGAAAGTCTGATAAAGATGTAAAACCAACTGCACTTGCTCAGAAAATAGAGGAATATAGTCAGCAACTTGAAGGACTGACAAATGATGTTCACACATTGGAAGCTTATGGTGTAGACAGTTTAAAAACAAGATACCCTGATTTGCTTCCCTTTCCTCAGATCCCAAATGACAGGTTCACTTCTGAGGTTGCTATGAGGGTGATGGAATGTACTGCCTGTATCATAATAAAACTTGAAAATTTTATGCAACAAAAAGTGTGA（SEQ ID NO：1），

[0031] 其编码的的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

[0032]METKENRWVPVTVLPGCVGCRTVAALASWTVRDVKERIFAETGFPVSEQRLWRGGRELSDWIKIGDLTSKNCHLFVNLQSKGLKGGGRFGQTTPPLVDFLKDILRRYPEGGQILKELIQNAEDAGATEVKFLYDETQYGTETLWSKDMAPYQGPALYVYNNAVFTPEDWHGIQEIARSRKKDDPLKVGRFGIGFNSVYHITDVPCIFSGDQIGMLDPHQTLFGPHESGQCWNLKDDSKEISELSDQFAPFVGIFGSTKETFINGNFPGTFFRFPLRLQPSQLSSNLYNKQKVLELFESFRADADTVLLFLKSVQDVSLYVREADGTEKLVFRVTSSESKALKHERPNSIKILGTAISNYCKKTPSNNITCVTYHVNIVLEEESTKDAQKTSWLVCNSVGGRGISSKLDSLADELKFVPIIGIAMPLSSRDDEAKGATSDFSGKAFCFLPLPPGEESSTGLPVHISGFFGLTDNRRSIKWRELDQWRDPAALWNEFLVMNVVPKAYATLILDSIKRLEMEKSSDFPLSVDVIYKLWPEASKVKVHWQPVLEPLFSELLQNAVIYSISCDWVRLEQVYFSELDENLEYTKTVLNYLQSSGKQIAKVPGNVDAAVQLTAASGTTPVRKVTPAWVRQVLRKCAHLGCAEEKLHLLEFVLSDQAYSELLGLELLPLQNGNFVPFSSSVSDQDVIYITSAEYPRSLFPSLEGRFILDNLKPHLVAALKEAAQTRGRPCTQLQLLNPERFARLIKEVMNTFWPGRELIVQWYPFDENRNHPSVSWLKMVWKNLYIHFSEDLTLFDEMPLIPRTILEEGQTCVELIRLRIPSLVILDDESEAQLPEFLADIVQKLGGFVLKKLDASIQHPLIKKYIHSPLPSAVLQIMEKMPLQKLCNQITSLLPTHKDALRKFLASLTDSSEKEKRIIQELAIFKRINHSSDQGISSYTKLKGCKVLHHTAKLPADLRLSISVIDSSDEATIRLANMLKIEQLKTTSCLKLVLKDIENAFYSHEEVTQLMLWVLENLSSLKNENPNVLEWLTPLKFIQISQEQMVSAGELFDPDIEVLKDLFCNEEGTYFPPSVFTSPDILHSLRQIGLKNEASLKEKDVVQVAKKIEALQVGACPDQDVLLKKAKTLLLVLNKNHTLLQSSEGKMTLKKIKWVPACKERPPNYPGSLVWKGDLCNLCAPPDMCDVGHAILIGSSLPLVESIHVNLEKALGIFTKPSLSAVLKHFKIVVDWYSSKTFSDEDYYQFQHILLEIYGFMHDHLNEGKDSFRALKFPWVWTGKKFCPLAQAVIKPIHDLDLQPYLHNVPKTMAKFHQLFKVCGSIEELTSDHISMVIQKIYLKSDQDLSEQESKQNLHLMLNIIRWLYSNQIPASPNTPVPIHHSKNPSKLIMKPIHECCYCDIKVDDLNDLLEDSVEPIILVHEDIPMKTAEWLKVPCLSTRLINPENMGFEQSGQREPLTVRIKNILEEYPSVSDIFKELLQNADDANATECSFLIDMRRNMDIRENLLDPGMAACHGPALWSFNNSQFSDSDFVNITRLGESLKRGEVDKVGKFGLGFNSVYHITDIPIIMSREFMIMFDPNINHISKHIKDKSNPGIKINWSKQQKRLRKFPNQFKPFIDVFGCQLPLTVEAPYSYNGTLFRLSFRTQQEAKVSEVSSTCYNTADIYSLVDEFSLCGHRLIIFTQSVKSMYLKYLKIEETNPSLAQDTVIIKKKSCSSKALNTPVLSVLKEAAKLMKTCSSSNKKLPSDEPKSSCILQITVEEFHHVFRRIADLQSPLFRGPDDDPAALFEMAKSGQSKKPSDELSQKTVECTTWLLCTCMDTGEALKFSLSESGRRLGLVPCGAVGVQLSEIQDQKWTVKPHIGEVFCYLPLRIKTGLPVHINGCFAVTSNRKEIWKTDTKGRWNTTFMRHVIVKAYLQVLSVLRDLATSGELMDYTYYAVWPDPDLVHDDFSVICQGFYEDIAHGKGKELTKVFSDGSTWVSMKNVRFLDDSILKRRDVGSAAFKIFLKYLKKTGSKNLCAVELPSSVKLGFEEAGCKQILLENTFSEKQFFSEVFFPNIQEIEAELRDPLMIFVLNEKVDEFSGVLRVTPCIPCSLEGHPLVLPSRLIHPEGRVAKLFDIKDGRFPYGSTQDYLNPIILIKLVQLGMAKDDILWDDMLERAVSVAEINKSDHVAACLRSSILLSLIDEKLKIRDPRAKDFAAKYQTIRFLPFLTKPAGFSLDWKGNSFKPETMFAATDLYTAEHQDIVCLLQPILNENSHSFRGCGSVSLAVKEFLGLLKKPTVDLVINQLKEVAKSVDDGITLYQENITNACYKYLHEALMQNEITKMSIIDKLKPFSFILVENAYVDSEKVSFHLNFEAAPYLYQLPNKYKNNFRELFETVGVRQSCTVEDFALVLESIDQERGTKQITEENFQLCRRIISEGIWSLIREKKQEFCEKNYGKILLPDTNLMLLPAKSLCYNDCPWIKVKDTTVKYCHADIPREVAVKLGAVPKRHKALERYASNVCFTTLGTEFGQKEKLTSRIKSILNAYPSEKEMLKELLQNADDAKATEICFVFDPRQHPVDRIFDDKWAPLQGPALCVYNNQPFTEDDVRGIQNLGKGTKEGNPYKTGQYGIGFNSVYHITDCPSFISGNDILCIFDPHARYAPGATSISPGRMFRDLDADFRTQFSDVLDLYLGTHFKLDNCTMFRFPLRNAEMAKVSEISSVPASDRMVQNLLDKLRSDGAELLMFLNHMEKISICEIDKSTGALNVLYSVKGKITDGDRLKRKQFHASVIDSVTKKRQLKDIPVQQITYTMDTEDSEGNLTTWLICNRSGFSSMEKVSKSVISAHKNQDITLFPRGGVAACITHNYKKPHRAFCFLPLSLETGLPFHVNGHFALDSARRNLWRDDNGVGVRSDWNNSLMTALIAPAYVELLIQLKKRYFPGSDPTLSVLQNTPIHVVKDTLKKFLSFFPVNRLDLQPDLYCLVKALYNCIHEDMKRLLPVVRAPNIDGSDLHSAVIITWINMSTSNKTRPFFDNLLQDELQHLKNADYNITTRKTVAENVYRLKHLLLEIGFNLVYNCDETANLYHCLIDADIPVSYVTPADIRSFLMTFSSPDTNCHIGKLPCRLQQTNLKLFHSLKLLVDYCFKDAEENEIEVEGLPLLITLDSVLQTFDAKRPKFLTTYHELIPSRKDLFMNTLYLKYSNILLNCKVAKVFDISSFADLLSSVLPREYKTKSCTKWKDNFASESWLKNAWHFISESVSVKEDQEETKPTFDIVVDTLKDWALLPGTKFTVSANQLVVPEGDVLLPLSLMHIAVFPNAQSDKVFHALMKAGCIQLALNKICSKDSAFVPLLSCHTANIESPTSILKALHYMVQTSTFRAEKLVENDFEALLMYFNCNLNHLMSQDDIKILKSLPCYKSISGRYVSIGKFGTCYVLTKSIPSAEVEKWTQSSSSAFLEEKIHLKELYEVIGCVPVDDLEVYLKHLLPKIENLSYDAKLEHLIYLKNRLSSAEELSEIKEQLFEKLESLLIIHDANSRLKQAKHFYDRTVRVFEVMLPEKLFIPNDFFKKLEQLIKPKNHVTFMTSWVEFLRNIGLKYILSQQQLLQFAKEISVRANTENWSKETLQNTVDILLHHIFQERMDLLSGNFLKELSLIPFLCPERAPAEFIRFHPQYQEVNGTLPLIKFNGAQVNPKFKQCDVLQLLWTSCPILPEKATPLSIKEQEGSDLGPQEQLEQVLNMLNVNLDPPLDKVINNCRNICNITTLDEEMVKTRAKVLRSIYEFLSAEKREFRFQLRGVAFVMVEDGWKLLKPEEVVINLEYESDFKPYLYKLPLELGTFHQLFKHLGTEDIISTKQYVEVLSRIFKNSEGKQLDPNEMRTVKRVVSGLFRSLQNDSVKVRSDLENVRDLALYLPSQDGRLVKSSILVFDDAPHYKSRIQGNIGVQMLVDLSQCYLGKDHGFHTKLIMLFPQKLRPRLLSSILEEQLDEETPKVCQFGALCSLQGRLQLLLSSEQFITGLIRIMKHENDNAFLANEEKAIRLCKALREGLKVSCFEKLQTTLRVKGFNPIPHSRSETFAFLKRFGNAVILLYIQHSDSKDINFLLALAMTLKSATDNLISDTSYLIAMLGCNDIYRIGEKLDSLGVKYDSSEPSKLELPMPGTPIPAEIHYTLLMDPMNVFYPGEYVGYLVDAEGGDIYGSYQPTYTYAIIVQEVEREDADNSSFLGKIYQIDIGYSEYKIVSSLDLYKFSRPEESSQSRDSAPSTPTSPTEFLTPGLRSIPPLFSGRESHKTSSKHQSPKKLKVNSLPEILKEVTSVVEQAWKLPESERKKIIRRLYLKWHPDKNPENHDIANEVFKHLQNEINRLEKQAFLDQNADRASRRTFSTSASRFQSDKYSFQRFYTSWNQEATSHKSERQQQNKEKCPPSAGQTYSQRFFVPPTFKSVGNPVEARRWLRQARANFSAARNDLHKNANEWVCFKCYLSTKLALIAADYAVRGKSDKDVKPTALAQKIEEYSQQLEGLTNDVHTLEAYGVDSLKTRYPDLLPFPQIPNDRFTSEVAMRVMECTACIIIKLENFMQQKV（SEQ ID NO：2）。

[0033] 其中，具有c.1229delT突变的SACS基因突变体编码的SACS突变蛋白（具有p.Leu410X突变）的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：

[0034]METKENRWVPVTVLPGCVGCRTVAALASWTVRDVKERIFAETGFPVSEQRLWRGGRELSDWIKIGDLTSKNCHLFVNLQSKGLKGGGRFGQTTPPLVDFLKDILRRYPEGGQILKELIQNAEDAGATEVKFLYDETQYGTETLWSKDMAPYQGPALYVYNNAVFTPEDWHGIQEIARSRKKDDPLKVGRFGIGFNSVYHITDVPCIFSGDQIGMLDPHQTLFGPHESGQCWNLKDDSKEISELSDQFAPFVGIFGSTKETFINGNFPGTFFRFPLRLQPSQLSSNLYNKQKVLELFESFRADADTVLLFLKSVQDVSLYVREADGTEKLVFRVTSSESKALKHERPNSIKILGTAISNYCKKTPSNNITCVTYHVNIVLEEESTKDAQKTSWLVCNSVGGRGISSKLDS（* SEQ ID NO：3）

[0035] 发明人发现的两种SACS基因突变体，其中之一与SEQ  ID  NO：1相比，具有c.1229delT突变，即相对于野生型SACS基因，该SACS基因突变体的cDNA中第1229位碱基T缺失，由此，其所编码的产物（具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列）与野生型SACS（SEQ ID NO：2）相比，具有p.Leu410X突变，即该突变是由于c.1229delT突变而引起的无义突变，导致第410位氨基酸密码子由TTA突变为终止密码子TAG，突变后的SACS蛋白具有409Aa，且由于第410位Leu密码子突变为终止密码子，翻译终止。需要说明的是，因为野生型SACS基因的cDNA序列中第1227-1229位碱基均为T，因而，本文中所使用的表达方式“c.1229delT突变”也可以表示为c.1227delT突变或c.1228delT突变，即“c.1229delT突变”可以表示相应的SACS基因突变体的cDNA中第1227位碱基T缺失，或第1228位碱基T缺失，或第1229位碱基T缺失。

[0036] 而另一种SACS基因突变体，其与SEQ ID NO：1相比，具有c.5840C>G突变，即相对于野生型SACS基因，该SACS基因突变体的cDNA中第5840位碱基C突变为G，由此，其所编码的产物与野生型SACS（SEQ ID NO：2）相比，具有p.Pro1947Arg的错义突变，即其第1947位氨基酸从Pro突变为Arg。

[0037] 本发明的发明人首次提出SACS基因的c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变导致患者出现痉挛性共济失调病的症状。

[0038] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，该分离的多肽具有p.Leu410X突变，或者p.Pro1947Arg突变。根据本发明的一些具体示例，具有p.Leu410X突变的多肽是由前述分离的编码具有c.1229delT突变的SACS突变体的核酸编码的，具有p.Pro1947Arg突变的多肽是由前述分离的编码具有c.5840C>G突变的SACS突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否同时表达上述多肽，可以有效地检测生物样品是否易感痉挛性共济失调病，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否同时存在，有效地预测生物体是否易感痉挛性共济失调病。

[0039] 筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法

[0040] 根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法可以包括以下步骤：

[0041] 首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品SACS基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中SACS是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含SACS编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的效率。

[0042] 接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。
另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集SACS外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用SACS基因外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集SACS外显子，从而能够进一步提高筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，SACS基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，SACS基因外显子特异性引物可以具有如SEQ ID NO：4-7所示的核苷酸序列，其中，针对c.1229delT突变，SACS基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列；针对c.5840C>G突变，SACS基因外显子特异性引物可以具有如SEQ ID NO：6-
7所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，通过采用SEQ ID NO：4-7所示的引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对SACS基因尤其是c.1229delT和c.5840C>G所在的外显子序列的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：4-7所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

[0043]

[0044] 关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina 公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361; Feb 2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb 2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

[0045] 需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应SACS基因的编码序列即可。

[0046] 最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，即该核酸样本的核酸序列表现为在两条染色体上分别具有前述的两种突变时，即指示生物样品易感痉挛性共济失调病。具体地，当获得的核酸样本是采用SACS基因外显子特异性引物扩增获得时，将该核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的序列相比对，如果在所得到的核酸序列中同时具有c.1229delT和c.5840C>G突变，则指示生物样品易感痉挛性共济失调病。当由此，通过根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。

[0047] 需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

[0048] 筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统和试剂盒

[0049] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法的系统。

[0050] 参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统1000包括：核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

[0051] 根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

[0052] 根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集SACS基因外显子，进一步提高筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有SACS基因外显子特异性引物，以便利用SACS基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，针对c.1229delT突变，SACS基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列；针对c.5840C>G突变，SACS基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

[0053] 根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易感痉挛性共济失调病。具体地，基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，判断生物样品是否易感痉挛性共济失调病。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，例如根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。

[0054] 由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。

[0055] 根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的试剂盒包括：适于检测SACS基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该SACS基因突变体具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测SACS基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测SACS编码基因的试剂，也可以是检测SACS突变体的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，该试剂为核酸探针或引物。由此，可以高效地筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品。

[0056] 需要说明的是，在本文前面筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

[0057] 此外，还需要说明的是，根据本发明实施例的筛选易感痉挛性共济失调病的生物样品的方法、系统以及试剂盒，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。

[0058] 构建体及重组细胞

[0059] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与SEQ ID NO：1相比具有c.1229delT突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1相比具有c.5840C>G突变的SACS基因突变体的核酸序列，或者同时包含上述两种SACS基因突变体的核酸序列。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。

[0060] 在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

[0061] 根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够有效表达构建体所携带的SACS基因突变体。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作痉挛性共济失调病相关研究的模型。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。

[0062] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

[0063] 实施例1全外显子组测序确定致病基因及突变位点

[0064] 1、样本收集：

[0065] 发明人收集到1个痉挛性共济失调病患者家系，在本文中有时也称为“SACS患者家系”。其中，图2显示了上述SACS患者家系的家系图谱。如图2所示，○表示正常女性；□表示正常男性；●表示女性患者；■表示男性患者；箭头所指为先证者。如图2所示，在该SACS患者家系中，痉挛性共济失调疾病呈常染色体隐性遗传。其中，两名患者均表现为幼儿期起病的早发性痉挛性共济失调，伴有言语含糊不清，视力下降，弓形足，手关节畸形，膀胱功能障碍等多个系统损伤的典型SACS症状，头部磁共振（Magnetic Resonance Imaging，MRI）显示小脑萎缩（见图5），被临床诊断为患有痉挛性共济失调病。

[0066] 发明人收集获得上述SACS患者家系中两名患者及其父母（家系内正常人）的外周血样本。

[0067] 2、全外显子组测序确定致病基因及突变位点

[0068] 发明人利用Agilent SureSelect Human All Exon Kit结合Solexa高通量测序技术，对上述SACS患者家系中的两名患者进行了全外显子组捕获测序，具体步骤如下：

[0069] 2.1样品制备

[0070] 分别取上述两名患者的外周血，采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg，备用。

[0071] 2.2文库构建及测序

[0072] 利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度最少为50×。

[0073] 2.3变异检测、注释及数据库比较

[0074] 利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：Li R,Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组UCSC NCBI37/hg19，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

[0075] 在得到测序结果之后，对非同义突变、剪接受体/供体位点突变、编码区插入和缺失突变这三类最有可能与病理相关的突变进行研究。结果，在患者1（II:1，女，39岁）的DNA样本中发现70130个单核苷酸多态性（SNPs）和1760处插入/缺失（Indels），在患者2（II:2，男，35岁）的DNA样本中发现61754单核苷酸多态性（SNPs）和1629处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz)，HapMap数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，千人基因组数据库(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中频率高的变异（变异MAF值高，通常为不致病的普通多态性），并利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到
57个杂合的可能具有致病意义的denovo SNP位点。

[0076] 进一步，发明人利用Sanger测序方法，在该SACS患者家系中（家系内患者及其表现正常的父母），对上述筛选获得的57个杂合的可能具有致病意义的denovo SNP位点进行验证，结果发现仅有1个SNP为真正的de novo SNP位点：c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变。其中，SACS基因的c.1229delT杂合突变，导致Sacsin蛋白（在本文中有时也简称为“SACS”）发生p.Leu410X无义突变，SACS基因的c.5840C>G杂合突变导致Sacsin蛋白发生p.Pro1947Arg的错义突变。而患者母亲携带c.1229delT杂合突变，患者父亲携带c.5840C>G杂合突变。即，序列与表型在该家系内表现为共分离，由此，可以初步判断该复合杂合位点为致病位点，上述复合杂合突变（c.1229delT和c.5840C>G）为SACS病的致病突变。

[0077] 实施例2Sanger法测序验证痉挛性共济失调病的致病突变

[0078] 分别对图2所示的SACS患者家系中的2名患者、2名家系内正常人（2名患者的表现正常的父母），以及500名家系外正常人的SACS基因进行检测，针对SACS基因的c.1229delT突变位点和c.5840C>G突变位点所在序列设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得上述突变的有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，是杂合突变还是纯合突变，以及序列与表型在家系内是否呈共分离来验证实施例1确定的SACS基因的复合杂合突变（c.1229delT和c.5840C>G）与痉挛性共济失调病之间的相关性。具体方法步骤如下：

[0079] 1、DNA提取

[0080] 分别采集上述SACS患者家系中2名患者及其表现正常的父母、以及500名家系外正常人的外周血，然后利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测量所提取DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微克，由此，获得各DNA样品，备用。

[0081] 2、引物设计及PCR反应

[0082] 首先，参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，设计得到具有SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列的针对c.1229delT突变位点的SACS基因外显子特异性引物，以及具有SEQ ID NO：6-7所示的核苷酸序列的针对c.5840C>G突变位点的SACS基因外显子特异性引物，具体见下表。

[0083] SACS基因外显子特异性引物

[0084]

[0085] 接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应。

[0086] 针对SACS基因的c.1229delT突变位点和SACS基因的c.5840C>G突变位点所在的外显子序列，按以下配比分别配制各基因组DNA样本的各PCR反应体系：

[0087]试剂 体积
2×GC缓冲液Ⅰ 5.0μl
dNTPs(10mM) 0.4μl
LA Taq酶(5U/μl) 0.1μl
两种上游引物(100ng/μl) 各0.2μl
两种下游引物(100ng/μl) 各0.2μl
gDNA模板(50ng/μl) 1.0μl
ddH2O 加至10.0μl

[0088] 然后，将配制获得各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应（不同的突变位点采用相同的反应条件）：

[0089]

[0090] 由此，获得上述SACS患者家系1中先证者及其表现正常的父母、SACS患者家系2中先证者及其表现正常的父母的PCR扩增产物。

[0091] 3、测序

[0092] 将步骤2中获得的获自SACS患者家系中患者及其表现正常的父母、以及500名家系外正常人的PCR扩增产物，进行DNA测序。其中，测序采用ABI3730型测序仪。

[0093] 基于测序结果，对上述各样本进行SACS基因编码序列比对。结果，发明人发现，该家系内的患者及家系内正常人（患者表现正常的父母）在c.1229delT和c.5840C>G突变出现共分离现象，两名患者均携带c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变，而表现正常的患者母亲仅携带c.1229delT杂合突变，患者父亲仅携带c.5840C>G杂合突变；500名家系外正常人均不携带c.1229delT突变和c.5840C>G突变。由此，进一步证明SACS基因的c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变是痉挛性共济失调病的致病突变。

[0094] 其中，图3显示了上述SACS患者家系内的两名患者及其父母的SACS基因c.1229delT突变位点的Sanger测序验证峰图，图4显示了上述SACS患者家系内的两名患者及其父母的SACS基因c.5840C>G突变位点的Sanger测序验证峰图。由图3和4可知，SACS患者家系中两名患者的SACS基因均同时具有c.1229delT和c.5840C>G突变，而其表现正常的父母则分别携带c.1229delT和c.5840C>G突变的一种。由此，表明SACS基因的c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变是痉挛性共济失调病的致病突变。

[0095] 需要说明的是，痉挛性共济失调（Charlevoix-Saguenay-Spastic Ataxia）致病基因SACS含有全长1.27KB的单个外显子，是迄今为止在脊椎动物中发现的最大的外显子，其编码11487bp的开放阅读框，于2000年首次被克隆。该外显子与其上游8个外显子共同参与编码sacsin蛋白。Sacsin蛋白包含2段亮氨酸拉链结构、3个螺旋结构及7个核定位标志。热休克域的存在提示Sacsin蛋白具有在分子伴侣介导的蛋白折叠方面的功能。SACS转录mRNA可表达于成纤维细胞、大脑、骨骼肌及胰腺中。Sacsin是一个共济失调相关蛋白，并且作为Hsp70分子伴侣设备的调节器与其他共济失调相关蛋白有关。有研究者发现Sacsin蛋白表达于小脑浦肯野细胞等大神经元中，还可作为神经母细胞瘤细胞线粒体的成分而存在。Sacsin中存在UBL和J结构域，提示泛素-蛋白酶系统与Hsp70可能结合为一个特殊的细胞成分从而发挥功能。用siRNA敲除SACS后并不影响野生型ataxin-1的细胞转染能力，但却加强了ataxin-1的毒性，提示Sacsin对于CAG-突变的ataxin-1有防护作用。

[0096] 综上，发明人进一步证明了SACS基因为痉挛性共济失调病的致病基因，SACS基因的c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变是痉挛性共济失调病的致病突变。

[0097] 实施例3检测试剂盒

[0098] 制备一检测试剂盒，其包含适于检测SACS基因突变体的引物（其中与SEQ ID NO：1相比，所述SACS基因突变体具有c.1229delT和c.5840C>G的复合杂合突变），以便用于筛选易患痉挛性共济失调病的生物样品，其中这些引物包括SEQ ID NO：4-7所示的SACS基因外显子特异性引物（见实施例1）。

[0099] 利用上述试剂盒筛选易患痉挛性共济失调病的生物样品的具体步骤为：按照实施例2中步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述外显子特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否同时具有c.1229delT和c.5840C>G突变，从而有效地检测待测者是否易患痉挛性共济失调病，进一步，能够从待测者中筛选出易患痉挛性共济失调病的生物样品。

[0100] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0101] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。