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含胰岛素的长效制剂

阅读：122发布：2020-05-12

专利汇可以提供含胰岛素的长效制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物技术和医药领域，具体涉及尤其用于治疗糖尿病的含胰岛素的制剂。本发明的制剂包含胰岛素和流体动力学直径大于4.5+/‑0.5纳米的药理学上可接受的聚合物的混合物。对于所述聚合物，可以最佳地使用至少一种分子量为20‑70kDa的聚合物，该聚合物选自葡聚糖、聚乙二醇和白蛋白。对于所述制剂的组合物中使用的胰岛素制剂，可以使用以商业制剂形式使用的人重组胰岛素及其遗传工程类似物。实验表明，使用前述聚合物在无需使用修饰胰岛素分子的化学或遗传工程方法的情况下提供了具有延长的效应的胰岛素制剂。该方法不是特异性的，因此可应用于广泛范围的治疗性蛋白质。，下面是含胰岛素的长效制剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种长效胰岛素制剂，其包含胰岛素，和提供长期效应并具有大于4.5+/-0.5纳米的流体动力学直径的医药级水溶性聚合物。
2.根据权利要求1所述的长效胰岛素制剂，其特征在于所述提供长期效应的医药级水溶性聚合物具有20-70kDa的分子量，并且为葡聚糖或聚乙二醇或白蛋白。
3.根据权利要求1所述的长效胰岛素制剂，其特征在于所述提供长期效应的聚合物的浓度为5-10重量％。
4.根据权利要求1所述的长效胰岛素制剂，其特征在于所述胰岛素为重组人胰岛素。
5.根据权利要求1所述的长效胰岛素制剂，其特征在于所述胰岛素为重组人胰岛素类似物。
6.根据权利要求1所述的长效胰岛素制剂，其特征在于其包含重组人胰岛素、锌和精蛋白的复合物。

说明书全文

含胰岛素的长效制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和医药领域，即涉及尤其用于糖尿病治疗的含胰岛素的可注射制剂。

背景技术

[0002] 目前，用于治疗糖尿病(diabetes mellitus)(通常也称为“糖尿病(diabetes)”)的药物是世界市场上最重要的药物产品。在2012年，仅胰岛素制剂的销售额就达208亿美元，并且预计在2018年将达到325亿美元。在2013年，全球有3.82亿人患有糖尿病，并且根据许多预测，到2030年糖尿病人数将增加至5.92亿。

[0003] 糖尿病是由唯一的降糖激素——胰岛素的绝对或相对缺乏引起的代谢障碍，并且糖尿病的主要症状是高血糖。因此，1型糖尿病患者的胰腺中合成胰岛素的β细胞损失，或2型糖尿病患者中存在胰岛素抵抗和β细胞的缓慢损失。糖尿病还与多种慢性并发症相关，这些并发症包括微血管疾病如视网膜病变、肾病和神经病，以及大血管疾病如心脏病发作和中风。[RU2358738,2009]。

[0004] 对于糖尿病的治疗，除了胰岛素之外，还可使用降血糖药，例如胰岛素促分泌剂、使组织对胰岛素作用敏感的药物(二甲双胍)以及用于阻止肠中的糖分解的α-葡萄糖苷酶的抑制剂[RU2358738,2009]。

[0005] 虽然应用这些降血糖药的可能性已通过临床实践得到证明，但它们的实际应用存在许多问题。因为糖尿病患者分泌胰岛素的能力显著降低，所以胰岛素分泌的有效刺激物逐渐减少并最终完全停止分泌，因此用于治疗糖尿病的主要药物仍然是胰岛素。(V.Sabetsky,J.Ekblom"Insulin:A new era for an old hormone",Pharmacological Research 61(2010),1-4)。

[0006] 胰岛素最早在1921年由McLeod实验室的Banting和Best在加拿大从狗的胰腺中分离得到。研究表明，人胰岛素分子由两条氨基酸链组成；A链包含21个氨基酸，B链包含30个氨基酸。这两条链由两个二硫键相互连接，第三个二硫键连接A链的两个远端氨基酸。在水溶液中，胰岛素分子具有表现其生物活性所需的球状结构。生产胰岛素的方法最初基于来自牛和猪的胰腺的提取物。然而，它们的氨基酸组成与人胰岛素不同，牛胰岛素有两个位置不同而猪胰岛素有一个位置不同，这导致患者出现不良副作用，如变态反应。由于70年代遗传工程的进步，已通过产生重组DNA而开发出获得蛋白质药物的技术，胰岛素主要通过细菌或酵母细胞生产。在80年代，开始了高质量的重组人胰岛素的生产，而以此为基础开发药物的主要问题在于产生具有最佳药代动力学(PK)的产物。

[0007] 通常，对糖尿病患者的治疗包括使用具有快速(短期)和长期(持久)效应的胰岛素的组合。短效胰岛素会随着与膳食相关的血糖升高而迅速达到活性峰值，并在血糖降低时活性终止，与此相反，长效胰岛素会随时间在膳食之间提供一定的血糖水平。

[0008] 目前，可商购获得的“速效”胰岛素为“Lispro”(其中B链残基的氨基酸序列中，脯氨酸与赖氨酸倒位-B28-B29)、“Glulysin”(LysB3，GluB29人胰岛素)和“Aspart”(AspB28人胰岛素)(在其分子中，B链的位置B28处的脯氨酸残基被天冬氨酸残基替代)。对人胰岛素分子的这类修饰使人胰岛素分子聚集的倾向降低，并促进激素在注射部位的吸收[Setter SM,Corbett CF,Campbell RK,White JR Ann.Pharmacother.,2000；v.34,p.1423-1431]。这导致药物作用的起始时间显著缩短，增大了药物在血液中的最大可达浓度，并导致更快地恢复至基线激素水平。[Simpson KL,Spenser CM.Drugs,1999,v.57,r.759-765]。

[0009] 已经表明，在位置B1-B6处的至少一个氨基酸被赖氨酸或精氨酸替代的胰岛素类似物表现出延长的作用[WO 92/00321，ER0368187]。这组药物中最有效的是甘精胰岛素(Glargine，Sanofi-Aventis)，其允许氨基酸的置换以使蛋白质的等电点移向中性pH。当在皮肤下施用时，pH 4的甘精胰岛素注射溶液缓慢形成微沉淀物，该微沉淀物缓慢溶解并在24小时内提供“时间-浓度”曲线的平直分布。甘精胰岛素出现于2000年，并在过去10年中占据长效胰岛素市场的主导地位。

[0010] Novo-Nordisk公司开发了德谷胰岛素(insulin degludec)(Tresiba U100，Tresiba U200)，其为一种经由连接体用C16 脂肪酸修饰的胰岛素类似物。德谷胰岛素在皮下给药后形成缓慢溶解的可溶性多聚体，并且这导致超长效作用。该制剂在欧洲和日本注册，但FDA(美国食品和药品管理局)拒绝了丹麦制药公司Novo Nordisk在美国注册抗糖尿病药Tresiba(德谷胰岛素)和Ryzodeg(德谷胰岛素/门冬胰岛素)，称其具有不利的安全性问题。[FDA Rejects Novo Nordisk's Insulin Degludec http://www.medscape.com/viewarticle/779,077]。Eli Lilly目前生产两种长效胰岛素制剂，其基于通过PEG化修饰的赖脯胰岛素或为精蛋白(de protamine)悬浮液的形式[Caparrotta TM,Evans M.,《PEGylated insulin Lispro,(LY2605541)-a new basal insulin analogues Diabetes ObesMetab.2014年5月；16(5):388-95)；Diabetes Dario Giugliano,Katherine Esposito《Efficacy and Safety of Insulin Lispro Protamine Suspension as Basal Supplementation in Patients With Type 2》,Advances in Endocrinology and Metabolism.2012；3(3):99-108]。

[0011] 遗传工程胰岛素类似物的缺点是它们仅部分符合人胰岛素的结构。

[0012] 正在进行的旨在实现人胰岛素作用延长的研究可以分为两个主要方向：经化学和/或遗传工程技术导致胰岛素分子的修饰以获得延长效应，以及在不改变胰岛素分子的情况下使用物理和化学方法。

[0013] 胰岛素的化学修饰(PEG化和用脂肪酸酰化)在作用延长中的应用最明显地表现在TransCon技术的开发上，该技术允许胰岛素从皮下储库(depot)中持续释放。

[0014] Sanofi-Aventis在2007年提交了专利申请[US20120183616,2013]，该专利申请涉及通过经由连接体将PEG化的胰岛素添加至可生物降解的水凝胶来对胰岛素分子进行化学修饰的技术(TransCon连接体和水凝胶胰岛素)。已在大鼠实验中证明了胰岛素从皮下储库中持续释放两周。然而，应当注意，不可避免的胰岛素大剂量使用和在注射胰岛素(特别是以悬浮液的形式)位置的延长停留充满了大颗粒悬浮液被巨噬细胞吸收的可能性，这可能导致并发症和无法选择最佳给药方案。此外，持续时间增加超过一天导致需要在滴定和严格依从给药方案方面对患者进行培训。

[0015] 延长胰岛素作用的物理化学方法利用胰岛素分子在生理pH下带负电荷的事实。因此，有希望获得胰岛素与有机聚阳离子和二价金属阳离子的复合物，以减缓具有非常快速吸收的胰岛素单体的形成。这组药物在市场上的代表为Protafan、NPH、Lente、Semilente、Insulong、Aktrafan。与作为透明溶液的甘精胰岛素不同，这些药剂为悬浮液，并且产生准确给药的问题。

[0016] 这些药物的主要缺点是不能获得曲线的平直(无峰)药代动力学分布，这导致在较高剂量下的低血糖事件的增加。这组药物的作用持续时间与其胰岛素剂量成比例。峰值效应发生在约6-8小时内。

[0017] 与请求保护的发明最接近的是由作者早期开发的制剂(US7544656,2009)，其中长效胰岛素制剂是胰岛素与高度多孔、生物相容且可生物降解的微球的混合物。用注射器将微球在胰岛素水溶液中的悬浮液皮下或肌内注射至实验动物(兔和小鼠)以形成储库。由于胰岛素分子必须穿过微球的高度多孔结构移动，因此胰岛素从储库中的释放显著减慢。所得制剂的较大缺点是悬浮液的粘度相对较高，因此须使用大直径针头进行注射，并且微球的生物降解非常缓慢(数月)。

[0018] 作者要解决的问题是使用特殊组分开发长效胰岛素制剂，该制剂提供从天然胰岛素、胰岛素类似物及其生物类似物(包括其物理和/或化学修饰形式)的储库中的缓慢持续释放。

发明内容

[0019] 作者探索了使用由Starling于1896年发现的效应的可能性。在用狗进行的实验中，Starling证明了等渗生理溶液(生理盐水)的注射导致腿部静脉中血液的稀释，而引入血清代替盐水并未引起该稀释效应。Starling用以下事实解释了该结果：血清含有保留水的组分，并且该组分具有防止其通过毛细血管吸收到血液中的大小[Starling E.H.On the absorption of fluids from the connective tissue spaces.J Physiol 1896；19:312-326]。此外，血浆高分子量蛋白质(主要是白蛋白)中存在的胶体渗透压(COP)影响血液中的水分保持。作者提出，施用以在血浆与注射部位处的组织液之间提供COP平衡的浓度含有生物相容性聚合物的可注射制剂可以显著减慢胰岛素分子从皮下储库中的输出，并延缓其被吸收到循环中。

[0020] 进行的实验已证明，与防止其通过组织中的毛细血管壁吸收至血液中的、流体动力学直径大于5+/-0.5纳米的药理学上可接受的聚合物组合的胰岛素溶液在动物和人类中皮下施用后提供了较强的延长效应。使用的优选聚合物是分子量为20-100kDa的生物相容性水溶性聚合物，例如，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和白蛋白。

[0021] 优选聚合物实际上是用于制备血浆-胶体溶液(CRC)和用于制备包括胰岛素在内的修饰蛋白质的聚合物[ADOCIA，US20120094902；Eli Lilly LY2605541]。

[0022] 工业适用性

[0023] 作为本发明制剂的组分，可以使用人重组胰岛素及其遗传工程对应物。可通过将含有胰岛素的成分或溶液或悬浮液混合而制备持续释放制剂。从胰岛素和聚合物的特定用途出发，通过实验选择所述成分的最佳比例，通常，聚合物含量为制剂总重量的5-10重量％。

[0024] 请求保护的制剂不含可能有害的组分，并且其制备不需要使用复杂的设备，这显著降低了新药上市和将其引入临床实践所需的成本和时间。

[0025] 通过以下实施例来说明请求保护的发明的本质和优点。

[0026] 实施例1

[0027] 将0.6g葡聚糖70kDa(Pharmacosmos,Denmark)溶解于9.4g胰岛素Astrapid制剂(100IU/ml，Novo Nordisk)中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2ml eppendorf管中。溶液的动态粘度为5.0mPa-s，胶体渗透压(COP)为58mm Hg。将所制备的6％溶液标记为AD70。

[0028] 将1.0g葡聚糖40kDa(Pharmacosmos,Denmark)溶解于9.0g胰岛素Astrapid(100IU/ml，Novo Nordisk)中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2ml eppendorf管中。溶液的动态粘度为7.0mPa-s，胶体渗透压(COP)为90mm Hg。将所制备的10％溶液标记为AD40。

[0029] 将0.8g聚乙二醇(PEG)20kDa(BioUltra,20,000,Sigma-Aldrich)溶解于9.2g胰岛素Astrapid(100IU/ml，Novo Nordisk)中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2mL eppendorf管中。溶液的动态粘度为11mPa-s，胶体渗透压(COP)为40mm Hg。将所制备的
8％溶液标记为AP20。

[0030] 将四只青紫蓝(Chinchilla)兔(体重3.5+/-0.2kg，雄性)标记为R1、R2、R3和R4，并加入所进行的实验。向兔子皮下注射0.05ml(4.6+/-0.1IU)的上述溶液，其中R1接受胰岛素Actrapid HM(对照)，R2-AD40，R3-AD70，R4-AP20。在向兔子施用15分钟和180分钟后，从耳静脉取1ml血液用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定人胰岛素。为避免严重的低血糖症，每15分钟用便携式血糖仪ContourTS(Bayer)测量兔子的血糖水平。如果葡萄糖浓度达到2.0mml/l，则向动物静脉内施用10ml 20％葡萄糖溶液并使其退出实验。所获得的实验数据在表1中示出。

[0031] 表1

[0032]

[0033] 所获得的结果可解释为证明了胰岛素对于所有实验样品从皮下施用部位的吸收与对照相比的显著延迟效应。该效应的机理可通过形成COP等于血浆COP的储库以及胰岛素单体、二聚体和六聚体的平衡浓度的变化来解释。

[0034] 实施例2

[0035] 将1.0g葡聚糖(葡聚糖40kDa，Pharmacosmos,Denmark)溶解于9.0g延长作用的胰岛素Humulin NPH(100IU/ml，Eli Lilly)中，并分配至无菌的2ml eppendorf管中(因为该胰岛素制剂为浆液，所以未通过0.22微米膜进行过滤)。动态粘度为7.0mPa-s，胶体渗透压为90mm Hg。将所制备的10％溶液标记为HD40。

[0036] 该实验包含被指定为R1、R2、R3、R4、R5、R6的六只青紫蓝兔(体重3.5+/-0.2kg，雄性)。

[0037] 向兔子R1、R2、R3皮下注射50μl(4.6+/-0.1IU)的Humulin NPH(对照)，并向兔子R4、R5、R6皮下注射50μl(4.6+/-0.1IU)的HD40。在向兔子施用后60和1440分钟，从耳静脉取1.0ml血液用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定人胰岛素。

[0038] 60分钟后，在兔子R1、R2、R3的血液中，人胰岛素含量为53+/-7μIU/ml，而R4、R5和R6的人胰岛素含量为31+/-11μIU/ml。1440分钟(一天)后，R1、R2、R3的血液完全不含人胰岛素，而在兔子R4、R5、R6的血液中，胰岛素含量处于14+/-5μIU/ml的水平。

[0039] 所获得的结果表明，HD40具有比Humulin NPH(对照)(作用时间为14-16小时)时间长得多的效应。

[0040] 实施例3

[0041] 将0.5g葡聚糖(葡聚糖70kDa，Pharmacosmos,Denmark)溶解于9.5g胰岛素NovoRapid(100IU/ml，Novo Nordisk)中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2ml eppendorf管中。溶液的动态粘度为5.0mPa-s，胶体渗透压为58mm Hg。将制备的溶液标记为ND70。

[0042] 将1.0g葡聚糖(葡聚糖40kDa，Pharmacosmos,Denmark)溶解于9.0g胰岛素NovoRapid中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2ml eppendorf管中。溶液的动态粘度为7.0mPa-s，胶体渗透压为90mm Hg。将制备的溶液标记为ND40。

[0043] 将1.0g PEG 20kDa(BioUltra,20,000,Sigma-Aldrich)溶解于9.0g胰岛素NovoRapid中，通过0.22微米的除菌膜过滤，并分配至无菌的2ml eppendorf管中。溶液的动态粘度为10mPa-s，胶体渗透压为40mm Hg。将制备的溶液标记为NR20。

[0044] 该实验包含被标记为R5、R6、R7和R8的四只青紫蓝兔(体重3.5kg，雄性)。向兔子皮下注射50μl(4.6+/-0.1IU)，其中R5注射胰岛素NovoRapid(对照)，R6注射ND40，R7注射ND70，而R8注射NP20。在向兔子施用后15分钟和180分钟，从耳静脉取1ml血液用于通过ELISA确定人胰岛素浓度。

[0045] 使用便携式血糖仪ContourTS(Bayer)测定血糖含量。如果含量低于2.0mmol/l，则向动物静脉内施用10ml 20％葡萄糖溶液并使其退出实验。

[0046] 实验数据在表2中示出。

[0047] 表2

[0048]

[0049] 所获得的结果可解释为确认了强延长效应。门冬胰岛素是通过重组技术获得的速效胰岛素类似物，其中在位置B28的氨基酸脯氨酸被天冬氨酸替代。这种替代的目的在于使通过锌六聚体而稳定的胰岛素类似物更快地解离成胰岛素类似物的二聚体和单体。

[0050] 对于针对人的进一步实验，选择了葡聚糖40kDa和葡聚糖70kDa。作出这种选择是为了在针对人的实验中确定MW和COP对延长效应的影响。

[0051] 实施例4

[0052] 用制备型HPLC从商业胰岛素Actrapid HM中分离纯胰岛素物质，并将该胰岛素物质溶解于PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)中直至达到100IU/ml无锌(Zn0)溶液。将0.6g葡聚糖70kDa溶解于所得溶液中并标记为D70Zn0，将1g葡聚糖40kDa溶解于9g该溶液中并标记为D40Zn0。

[0053] 将0.1ml(约10IU)上述溶液皮下(股区域)注射至健康志愿者(BMI25，28.5G针)。用便携式血糖仪Contour TS(Bayer)每15分钟进行血糖控制。

[0054] 在采用D40Zn0的实验中，基线血糖(在没有食物摄入的情况下12小时后)为4.9mmol/l，而采用D70Zn0时基线血糖为5.0mmol/l。这两种制剂均在施用后约60分钟开始。
D40Zn0将3.8+/-0.5mmol/l的血糖水平维持10小时，而D70Zn0将4.0+/-0.6mmol/l的血糖水平维持8小时。应注意，这两种制剂的药效学(PD)曲线都是无峰的(平直的)。

[0055] 实施例5

[0056] 在实施例4的条件下，使用剂量15IU(0.15ml)的D40Zn0评价剂量对延长效应的幅度和持续时间的影响。研究了胰岛素的平行药效学、药代动力学评价，并且在临床实验室中测量C-肽。

[0057] 所述效应在60分钟内开始。葡萄糖维持在3.6+/-0.3mmol/l持续12小时，没有峰。药代动力学数据在表3中示出。

[0058] 表3

[0059]

[0060]

[0061] 药代动力学数据表明不存在峰值胰岛素，这完全符合药效学数据。值得注意的是，增加剂量并不导致葡萄糖水平的显著降低(无低血糖)，并且与10IU剂量相比，延长效应显著增加。

[0062] 实施例6

[0063] AD40制剂(参见实施例1)与Actrapid HM的差异仅在于临床葡聚糖40kDa的存在，该葡聚糖不与商业制剂的组分反应。本实验的目的在于将AD40在人体中的药代动力学和药效学与前两个实施例的结果进行比较。我们使用了AD40的两个剂量-10IU和15IU。

[0064] 10IU剂量的AD40制剂在施用后60分钟内显示作用开始，并将葡萄糖维持在3.3+/-0.3mmol/l水平持续14小时。药代动力学数据在表4中呈现。

[0065] 表4

[0066]时间(min) 0 60 135 240 360 540
胰岛素(μIU/ml) 4.8 13.0 13.5 11.4 10.4 7.6
С-肽(ng/ml) 1.54 0.18 0.28 0.14 0.11 0.09

[0067] 15U剂量在60分钟后开始作用并持续22小时，血糖维持在3.7+/-0.3mmol/l持续3小时并随后回到基线。药代动力学数据在表5中呈现。

[0068] 表5

[0069]时间(min) 0 60 120 240 480 720
胰岛素(μIU/ml) 6.2 13.9 13.5 13.4 13.6 9.9
С-肽(ng/ml) 1.32 1.13 0.70 0.49 0.10 0.05

[0070] 根据制造商(Novo Nordisk)的说明，该研究实验中使用的Actrapid HM是通过重组DNA技术生产的短效胰岛素。其在30min内开始作用，在1.5-2.5小时内达到胰岛素在血浆中的最大浓度(Cmax)，并且在施用后2.5-5小时之间达到最大作用。Actrapid的作用持续7-8小时。

[0071] 显然，AD40的药代动力学和药效学与胰岛素Actrapid HM的药代动力学和药效学差异显著。在向Actrapid中添加40kDa葡聚糖后，溶液变为具有90mm Hg的胶体渗透压(COP)，从而保持相对于低分子量组分等渗。这导致10IU剂量的作用延长一半，并导致15U AD40药物剂量的作用延长三倍，并且完全不存在胰岛素和葡萄糖的峰值浓度。

[0072] 如所进行的实验中所示，上述聚合物的使用在无需修饰人胰岛素分子的化学或遗传工程方法的情况下确保了胰岛素制剂的延长效应。由于该方法不是特异性的，因此其可以用于很多种治疗性蛋白质。

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