一种含两性霉素B的长效制剂
专利汇可以提供一种含两性霉素B的长效制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种包含微油滴于 水 性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量两性霉素B药理活性物质，所述微油滴通过“胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚”(PEG－(CH2)n－胆甾醇)将两性霉素B稳定在油滴中，可以制成稳定的乳液和冻干乳剂，制成的乳剂与上市产品相比具有明显的缓释效果。，下面是一种含两性霉素B的长效制剂专利的具体信息内容。
1、一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量药理活性 物质，所述微油滴通过胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(PEG-(CH2)n- 胆甾醇，其中n为整数，大小为2-10)将药理活性物质稳定在油滴中，碳链长度为2-10， 小分二醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、任二醇、 癸二醇中的一种，通过化学反应以醚键与胆甾醇和聚乙二醇相连，聚乙二醇选自分子量 为200、300、400、600和1000中的一种，PEG-(CH2)n-胆甾醇用量以重量计为0.01％-5％。
2、根据权利要求1中的乳液，所述乳液中可以加入冻干支持剂制成冻干乳，冻干支持 剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、 葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优 选二糖类，所述的用量以重量计为1％-40％。
3、根据权利要求1-3中的乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两性霉素B在乳液中 的用量以重量计为0.01％-0.5％。
4、根据权利要求1-4中的乳液，其中包括至少一种可注射的油、表面活性剂和稳定剂， 其中：
a)可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其 混合物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、 花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自 中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、 长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用 量以重量计为1％-20％。
b)表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、 solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺 (PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂， 优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量 以重量计为0.5％-10％。
c)稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、 油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0.1％-20％。
5、据权利要求1—2中的乳液，其特征在于进一步包含抗氧化剂α-生育酚及其衍生物 (如：α—生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟 基甲苯(BHT)中的一种或几种。
6、根据权利要求1—2中的乳液其特征在于还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐 中的一种，还可以含有PH值调节剂如：盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一 种。
7、根据权利要求1中的乳液，其中两性霉素B通过研磨溶解在油性载体中，两性霉素 B和油性载体在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径≤1um。
8、根据权利要求1-8中的乳液，其制备方法如下：
a)将两性霉素B和PEG-(CH2)n-胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表 面活性剂、稳定剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～ 90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。
b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳 化至乳滴平均粒径≤1微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。
9、根据权利要求1-8中的冻干乳，其制备方法如下：
a)将两性霉素B和PEG-(CH2)n-胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表 面活性剂、稳定剂、冻干支持剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水 两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。
b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳 化至乳滴平均粒径≤1微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。
技术领域
本发明涉及一种含胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(简称PGC)的两性霉 素B的稳定的长效制剂。
背景技术
两性霉素B可与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物 质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长。通常临 床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受范围的高限时则 对真菌起杀菌作用。适用于下列真菌感染的治疗：隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠 菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪 霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。 由于两性霉素B的明显毒性，故本品主要用于诊断已确立的深部真菌感染(如获培养或组织 学检查阳性则更佳)，且病情危重呈进行性发展者。对临床真菌感染征象不明显，仅皮肤或 血清试验阳性的患者不宜选用.
市售的可溶性两性霉素B含45％两性霉素B，35％脱氧胆酸钠和20％磷酸氢钠，已经上市 的产品中为可溶性两性霉素B与去氧胆酸加适量磷酸盐缓冲剂制成的无菌冻干粉针。检索 到与本发明相关的专利申请号为：02155190.1发明名称：两性霉素B脂质体及制备方法， 介绍了一种两性霉素B脂质体的制备方法，市售注射剂LD50约为2.5mg/kg，该专利中LD50 约为5.0mg/kg，我们研究对比发现，用本发明制备的两性霉素B长效制剂，LD50约为15.0 mg/kg，分别是上市普通制剂的6倍，两性霉素B脂质体的3倍，具有更好的安全性，非常 具有开发价值。
两性霉素B已经成为临床深度真菌感染危重病人不可缺少的治疗药物，增效减毒是制 剂研究的要点。
发明内容
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两 性霉素B在乳液中的用量以重量计为0.01％-0.5％；乳液中包括至少一种可注射的油、表面 活性剂和稳定剂，其中：
a)可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合 物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生 油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘 油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中 链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用量以重量计 为1％-20％。
b)表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、 solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷 脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000—磷脂酰乙醇胺 (PEG2000-DSPE)、聚乙二醇1000—磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂， 优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188；所述表面活性剂的用量以 重量计为0.5％-10％。
c)稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、油酸 乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0.1％-20％。
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，进一步包含抗氧化剂α-生育酚及 其衍生物(如：α—生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、二 丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种；还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐中的一种， 还可以含有PH值调节剂如：盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中两性霉素B和PGC通过研磨 溶解在油性组分中，两性霉素B和油性组分在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均 粒径≤1um，其制备方法如下：
a)将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂溶于 适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅拌制成初乳剂， 调节PH值5.0～7.0。
b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化 至乳滴平均粒径≤1微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。
本发明冻干乳其制备方法如下：
a)将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂、冻 干支持剂溶于适量水中，于50～90℃高速搅拌制成水相，油水两相混合于50～90℃高速搅 拌制成初乳剂，调节PH值5.0～7.0。
b)取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化 至乳滴平均粒径≤1微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。
冻干条件如下：于零下40—50℃预冻3—6h，升温至零下30—零下10℃，真空减压除 去大部分水分，再升温至0℃，继续真空减压除去水分，继续升温除去水分，得干燥的冻干 乳剂。
本发明制备的乳剂可以用于静脉给药、肌肉给药或局部给药。
具体实施例
实施例一
两性霉素B0.01％～1.0％、PEG300-(CH2)4-胆甾醇0.01％～2.0％、生育酚0.1％～1.0％、 磷脂1.0％～6.0％、泊洛沙姆1881.0％～6.0％、植物油1％～10％、油酸1.0％～6.0％，甘油2 ％—6％，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B25mg、加入生育酚0.6g、PEG300-(CH2)4-胆甾醇0.2g、10g注射用 大豆油、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.0g、泊洛沙姆1882.0g、甘油 3g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50 ℃～80℃高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0～7.0， 转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既 得。
注：整个生产过程需要充氮气保护。
实施例二
两性霉素B0.01％～1.0％、PEG400-(CH2)4-胆甾醇0.01％～2.0％、α-生育酚琥珀酸酯 0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、去胆酸钠0.1％～1.0％、植物油1％～10％、油酸1.0％～6.0％， 麦芽糖10g、蔗糖10g，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B200mg、PEGG600-(CH2)6-胆甾醇0.4g、α-生育酚琥珀酸酯0.6g、加 入3g中链油、加入3g大豆油和0.3g油酸充分研磨制成油相；称取大豆卵磷脂2.0g、去胆 酸钠0.2g、麦芽糖10g、蔗糖10g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散， 制成水相；油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂，取初乳剂，注射用水定容 至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微 米，除菌过滤，充氮气灌装，低温冷冻干燥既得。
注：整个生产过程需要充氮气保护。
实施例三
两性霉素B0.01％～1.0％、PEG300-(CH2)4-胆甾醇0.01％～2.0％、PEG2000-DSPE0.01％～ 1.0％、生育酚0.1％～1.0％、磷脂1.0％～6.0％、泊洛沙姆1881.0％～6.0％、植物油1％～10％、 中油酸1.0％～6.0％，甘油2％—6％，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B100mg、加入生育酚0.6g、PEG300-(CH2)4-胆甾醇0.2g、注射用大 豆油3g、中链油3g、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.2g、泊洛沙姆188 2.4g、PEG2000-DSPE0.1g、甘油3.6g，加入处方量的水于50℃～80℃高速搅拌使充分分散， 制成水相；油水两相混合，于50℃～80℃高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容 至处方量，调节PH值为5.0～7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径≤1微 米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既得。
注：整个生产过程需要充氮气保护。
实施例四(血管刺激性试验)
试验药物：本发明两性霉素B乳剂，北京金方华医药科技有限公司提供，两性霉素B 注射液组，自制，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成5％溶液。
试验动物：健康家兔，体重2.1～2.3kg。
试验方法：取健康家兔10只，雌雄各半，按体重及性别分为0.9％氯化钠注射液对照组 和两性霉素B剂组以及两性霉素B注射液对照药组，每组2只，两性霉素B乳剂组和两性 霉素B注射液组于家兔左耳耳缘按临床给药浓度静脉滴注10ml/kg，滴注速度1ml/分，每 日1次，连续7日。对照组同法静脉滴注0.9％氯化钠注射液。除每次给药时及给药后观察 给药局部表现外，于末次静脉滴注后剪下药侧耳廓，常规固定后，在距静脉滴注入针近心 端1cm处，每隔1cm切取0.5cm宽标本，共取3块标本。切片染色，进行镜下病理观察， 结果见下表：
表1：血管刺激性试验
项目 兔耳廓血管扩张 红肿 有无炎细胞浸润 0.9％氯化钠注射液对照组 - - - 两性霉素B注射液 ++ ++ + 两性霉素B乳剂(实施例1) - - - 两性霉素B冻干乳剂(实施例2) - - - 两性霉素B乳剂(实施例3) - - -
备注：“++”严重、“+”少许、“-”无
前后粒径无显著变化。
实施例五(小鼠急性毒性试验)
取清洁级小鼠40只，分成四组，尾静脉注射，观察动物发应情况，连续观察七天，记 录动物毒性发应情况和死亡动物分布，计算出LD50值，统计结果如下：
表3：小鼠尾静脉注射LD50值
实施例1 实施例2 实施例3 市售产品 LD50值 15.20mg/kg 15.20mg/kg 17.00mg/kg 2.45mg/kg
结果表明：本发明两性霉素B冻干乳剂毒性较上市产品分别提高了5—7倍，具有市场 开发价值。
实施例六(家兔药动力学比较)
试验药物：本发明两性霉素B乳剂(按实施例三制备)，两性霉素B注射液组，市售 制剂，试验时用0.9％氯化钠注射液配制成5％溶液。
试验动物：健康家兔，体重2.1～2.3kg。
试验方法：将6只家兔禁食过夜后，随机分为两组，分别交叉从耳缘静脉注射两性霉 素B或市售制剂，给药剂量为1mg/kg。于给药后即刻0.25、0.5、1、2、3、5、8、12、16、 24h、36h从耳缘静脉采取血样2～3ml，置肝素抗凝管中，3000r/min离心10min后分离血 浆，按“血浆样品的处理与测定”处理分析。
试验结果：由血药浓度的数据可知：在0～36h范围内，两性霉素B乳剂的血药浓度均 高于相应时间市售制剂的血药浓度。两性霉素B乳剂给药后体内血药浓度峰值Cmax为 8.517mg/l，在给药后3h降至4.262mg/l，然后缓慢地下降，在给药后24h内，两性霉素 B乳剂的平均血药浓度在8.517～1.221mg/l范围内，在给药后24-36h内，两性霉素B乳 剂的平均血药浓度在1.221～0.251mg/l范围内，而市售制剂给药后，24h内的浓度在 2.558～0.009mg/l范围内，只有在0～12h内，血药浓度为2.408～0.290mg/l才能高于有 效抑菌浓度(0.250mg/l)，可见两性霉素B乳剂体在体内的抗菌作用要比市售制剂持久， 其抗菌疗效也会更优于市售注射剂。
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