新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法
及应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原的制备及其在检测新型鸭呼肠孤病毒病
抗体中的应用。技术背景
[0002] 鸭出血性
坏死性
肝炎是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起的各种品种鸭的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病。不同品种鸭均易感，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，以5～10日龄居多，病程5～7d，发病率5％～20％、死亡率2％～15％。该痛在我国南方
水禽饲养区广泛流行，疫区有逐年扩大的趋势，给水禽养殖业造成一定的经济损失。 [0003] NDRV的代表株为NP03分离株，其S3基因的序列特征在于：根据DNAStar5.0
软件包中MegAlign基因序列比较分析软件的Clustal W
算法，所述的NDRVNP03分离株S3基因(GenBank登录号：GQ888710)与番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)89330株S3基因(GenBank登录号：AJ243881)、禽呼肠孤病毒(Avain reovirus，ARV)176株S3基因(GenBank登录号：AF059720)编码区核苷酸序列及其推导的
氨基酸序列分别为68.0％，
66.1％；70.4％，69.3％。
[0004] 目前，除了血清中和试验可用于检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体外，尚无其它检测方法，虽然中和试验是抗体检测的经典方法，特异性好，但操作烦琐，不适于兽医临床及
基层应用。另外，利用NDRV全病毒作为诊断抗原时，会与抗番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)的血清样品产生非特异性交叉反应。利用原核表达系统表达外源蛋白是一种简便和高效的方法。原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能够用于
病毒感染抗体的检测。研究表明，新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白即属于此类蛋白，因此应用基因工程σB蛋白作为抗原，能够建立检测方法用以
鉴别NDRV、MDRV全病毒感染的血清抗体，这将为应用基因工程
疫苗预防和控制NDRV提供重要的技术
支撑。 发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原的制备及其在检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体中的应用；
[0006] 本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0007] 新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原，该重组原核表达抗原为His前导肽与S3基因编码σB蛋白的融合蛋白；
[0008] 该新型鸭呼肠孤病毒σB重组蛋白抗原的制备方法是：
[0009] a、设计扩增NDRV NP03分离株S3基因的特异性引物：
[0010] b、NDRV NP03分离株培养及RNA提取：
[0011] c、NDRV NP03分离株S3基因的RT-PCR：
[0012] d、原核表达载体pET-30a-C(+)-NP03-σB的构建：
[0013] e、NDRV σB蛋白的诱导表达
[0014] f、重组蛋白的纯化
[0015] g、重组σB蛋白纯化后的复性
[0016] h、纯化后重组σB蛋白含量的测定
[0017] i、重组σB蛋白活性的Western-blot检测
[0018] 将上述重组蛋白应用在间接ELISA检测鸭血清抗NDRV抗体。
[0019] 本发明以新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)RNA为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得NDRV S3基因编码区核苷酸全序列，并定向亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-30a-C(+)融合表达载体，转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTAAgarose纯化，包涵体复性，获得表达的NDRVσB重组蛋白抗原。该蛋白的表达形式是融合蛋白(His-σB)，分子量约为44kU；经免疫印迹(Western-blot)检测表明该蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。本发明提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体时无散毒危险、
稳定性好，灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的原核表达抗原及其制备方法。应用该表达蛋白为包被抗原的间接酶联
免疫吸附试验(ELISA)可检测鸭血清中的抗NDRV抗体。
[0020] 本发明的优点：①由于该检测抗原是NDRV重组原核表达的σB蛋白，并非全病毒，因此应用该抗原进行检测时绝无散毒危险。②可用于鉴别NDRV、 MDRV全病毒感染的血清抗体。③作为间接ELISA抗原检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体，其检测敏感性高，特异性强，无交叉反应。④生产工艺先进、性能稳定、生产成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。
附图说明
[0021] 图1是pET-30a-C(+)-NP03-σB表达载体构建图，
[0022] (NP03-S3代表插入到载体pET-30a-C(+)中的NDRV NP03分离株S3基因)。 [0023] 图2是NDRV NP03分离株S3基因RT-PCR扩增产物及重组质粒PCR鉴定结果图；(其中1：NDRV NP03株S3基因RT-PCR扩增产物；2：NDRV NP03株S3基因重组表达质粒PCR鉴定结果；M：DNA marker DL2000)。
[0024] 图3是pET-30a-C(+)-NP03-σB原核表达质粒双酶切鉴定结果图； [0025] (其中1. pET-30a-C(+)-NP03-σB原核表达质粒双酶切鉴定；
[0026] 2.DNA MarkerDL10000)。
[0027] 图4是pET-30a-C(+)-NP03-σB原核表达质粒IPTG诱导表达SDS-PAGE分析结果。(其中1代表没有加入诱导剂IPTG所取的样品。2代表加入诱导剂IPTG后8小时所取样品。M.蛋白Marker)。
[0028] 图5 pET-30a-C(+)-NP03-σB重组蛋白免疫印迹结果。
[0029] (蛋白印迹所用的一抗为NDRV多克隆阳性番鸭血清，二抗为HRP标记的兔抗鸭IgG多克隆抗体。HRP的显色底物为DAB。)
具体实施方式
[0030] 以下结合具体
实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。 [0031] 1、设计扩增NDRV NP03分离株S3基因的特异性引物：
[0032] NDRV-NP03-S3F(上游引物)：5’-TGCAAGGATCCATGGAGGTGCGTGTGCC-3’ [0033] NDRV-NP03-S3R(下游引物)：5’-ACCCAGGTCGACTTACCACCTAC-3’ [0034] 2、NDRV NP03分离株培养及RNA提取
[0035] 取NDRV NP03分离株种毒经尿囊腔途径接种于12日龄非免疫番鸭胚，37℃温箱孵育，收集48h-72h之间番鸭胚尿囊液，离心后取上清备用。NDR VRNA提取按Trizol
试剂盒
说明书进行；提取的RNA用于RT-PCR。
[0036] 3、NDRV NP03分离株S3基因的RT-PCR
[0037] (1)NDRV NP03的反转录
[0038] 在PCR反应管中分别加入7μL已制备的RNA，加入1μLNDRV-NP03-S3下游引物(20pmol)，70℃热吸附10min，
冰浴10min，继续加入5×First Standing Buffer4μL，10mM dNTPs 2μL，0.5μL反转录酶(M-MLV)5u(单位)/μL， 0.25μLRNA酶
抑制剂(40u)，用无RNA酶水调至总体积20uL，瞬时离心混匀。反应程序：30℃10min，37℃60min，99℃5min。 [0039] (2)NDRV NP03 S3基因的PCR
[0040] PCR反应体系(50μL体系)：以制备好的cDNA 2μL作
模版，加入相应的上、下游引物(20pmol)各1μL， 2.5mM dNTPs4μL， 10×Buffer 5μL，rTaq1μL，灭菌水36μL，反应体系50μL。在PCR扩增仪内进行扩增，扩增条件为95℃5min，94℃1min，53℃1min，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min结束。
[0041] 4、原核表达载体pET-30a-C(+)-NP03-σB的构建
[0042] (1)PCR产物经纯化试剂盒回收目的
片段，利用T-A克隆直接连接于pMD18-T载体，连接产物转化E.coil JM109感受态细胞，挑取单克隆，进行PCR鉴定。
[0043] (2)以PCR鉴定正确的阳性克隆再进行PCR扩增，PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化后，经BamHI、SalI双酶切，回收目的片段并亚克隆于表达质粒pET-30a-C(+)的BamH I和Sal I酶切位点之间，构建重组表达质粒pET-30a-C(+)-NP03-σB，转化感受态宿主菌JM109，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
[0044] 5、NDRV σB蛋白的诱导表达
[0045] 将鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆接种于5mL(含100ug/mL卡那霉素)的LB培养基中，37℃170r/min培养过夜。取0.5mL接种于5mL LB培养基中，37℃220r/min培养至OD6000.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmoL/L，在37℃下培养8h，收集菌体，以6000g离心2min，去上清液，将沉淀用PBS洗涤1次，再以6000g离心2min，去上清液，1mLPBS重悬，超声裂解，4℃12000g离心30min，分别取一定量的上清以及用PBS重悬的沉淀，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀后，于沸水中煮沸5min，做为SDS-PAGE
电泳上样样品。以诱导含空质粒pET-30a-C(+)的BL21(DE)3作对照。
[0046] 采用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考
马斯亮兰
染色，观 察结果。结果在含有pET-30a-C(+)-NP03-σB质粒的大肠杆菌经诱导后表达了约44kU的融合蛋白，而对照细菌没有相应的条带。薄层扫描分析，该蛋白可占菌体蛋白总量的35-40％。 [0047] 6、重组蛋白的纯化
[0048] (1)待纯化样品的制备：
[0049] 按已经优化的表达条件，表达NDRV NP03分离株重组σB蛋白菌液1000ml，
收获菌液4℃，以8000rpm/min，离心20min，菌体沉淀用TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)洗涤3次，沉淀用TE溶液重悬起来；
[0050] 裂解菌体获取包涵体沉淀：对菌体进行
超声波破碎，超声处理必须于冰浴条件下进行。超声条件：800W，工作10S，间隔10S，重复一定次数，以4℃，10000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为包涵体；
[0051] 包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：获得的不溶性包涵体用包涵体洗涤液(20mM Tris-HCl[pH8.0]，5mM EDTA，2M尿素)洗涤2次，将该包涵体沉淀溶解于含8M尿素Tris-HCl缓冲液，置于冰上2h，然后4℃过夜，以12000rpm，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，经0.45μm孔径小
过滤器过滤，-80℃冻存备用； [0052] (2)重组σB蛋白的亲合层析纯化：
[0053] ①用25ml新鲜配制的预冷结合缓冲液(20mM Tris-HCl[pH7.9]，10mM咪唑，0.5M NaCl，8M尿素)冲洗并平衡His镍柱；
[0054] ②10ml可溶性包涵体蛋白溶液(再经0.22μm过滤孔径小过滤器过滤)重悬平衡后的His蛋白纯化介质，置于50ml洁净离心管中，室温充分感作30min，然后重新上柱，弃掉流出液，流速为10倍柱体积/小时(柱体积，即
树脂纯化柱的体积，2ml，以下均同)； [0055] ③使用15倍柱体积的结合缓冲液(含8M尿素)冲洗柱子，收集流穿峰； [0056] ④使用3倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl[pH7.9]，0.5M咪唑，0.5M NaCl，8M尿素)洗脱，收集洗脱峰，按500μl量分装于洁净Eppendorf管内。 [0057] ⑤纯化柱的再生与保存：依次使用8倍体积的结合缓冲液和5倍柱体积的自备去离子水洗涤后，用3倍柱体积的自备20％
乙醇平衡(乙醇要将介质浸沉)， 4℃保存。 [0058] 7、重组σB蛋白纯化后的复性
[0059] 将纯化好的表达蛋白(含8M尿素)装入按常规方法处理好的
透析袋(截留分子量：14000Da)后，置于TGE
透析液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/LEDTA，50mmol/LNacl，10％甘油，1％甘氨酸，pH 8.0)中，4℃条件下反复透析，8小时换一次透析液，换液三次。透析后用
蔗糖粉末
覆盖于透析袋表面对蛋白溶液进行浓缩，浓缩至原体积的1/4。将所得复性纯化蛋白-80℃冻存备用。
[0060] 8、纯化后重组σB蛋白含量的测定
[0061] 采用紫外线吸收法定量
蛋白质。将待检样品适当稀释后，同时以BioPhotometer分光光度计(Eppendorf)Bradford法测定该蛋白质与考马斯亮兰G250结合反应后，产生的有色化合物吸收峰595nm处的OD值，同时用考马斯亮兰G250作为空白对照，显示蛋白含量。NDRV-σB/His纯化蛋白的
质量浓度为≥1.0mg/ml。
[0062] 9、重组σB蛋白活性的Western-blot检测
[0063] 将复性纯化好的重组σB蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至
硝酸纤维素膜(NC)上，用含有3％(w/v)BSA的TBS(pH＝8.0)4℃孵育过夜封闭NC膜；用TTBS在摇床温和震荡洗3次，每次间隔10min，再加入用含有1％(w/v)BSA稀释(1∶100)的NDRV多克隆番鸭血清，室温摇床温和作用90min；TTBS在摇床温和震荡洗3次，再加入用含有1％(w/v)BSA稀释(1∶1500)的HRP标记的兔抗鸭IgG二抗，室温摇床温和作用60min；TTBS在摇床温和震荡洗3次，吸静余液，置于DAB显色液中显色，结果在约44kU处观察到了特异性的反应条带。
[0064] 10、重组σB蛋白在间接ELISA方法中的应用
[0065] 将复性纯化好的重组σB蛋白用pH9.6的
碳酸盐包被缓冲液稀释后包被酶标反应板，浓度1μg/mL，每孔50μL，4℃过夜；次日取出ELISA反应板，用洗液(含有0.5％TWEEN-20的pH7.4的PBS)洗涤三次，每次3min，抛干；用含1％BSA的PBST封闭，每孔180μL，置于37℃孵育1h；同法洗三次；将待检血清(NDRV阳性血清、MDRV阳性血清与非免疫健康番鸭阴性血清)分别用含 1％BSA的PBST作1∶40稀释后加入孔中，置于37℃孵育1h后，同法洗涤三次；加辣根过
氧化物(HRP)标记的山羊抗鸭IgG二抗，以1∶500稀释，每孔50μL，加入各孔，置于37℃孵育1h；同法冲洗三次；然后加入用20ml去离子水溶解的FAST OPD显色，每孔50μL，置于37℃10-15min；最后每孔加入25μL的2M
硫酸终止反应；酶标检测仪读数在490nm
波长下读取各孔的光
密度值，P/N≥2时判定为NDRV抗体阳性。结果重组表达的σB蛋白仅与待检NDRV阳性血清反应，而与MDRV阳性血清、非免疫番鸭阴性血清均不发生交叉反应。
[0066] SEQ ID NO.1的信息：
[0067] (a)NDRV S3序列特征：
[0069] 类型：核酸
[0070] 链型：单链
[0071] 拓扑结构：线性
[0072] (b)分子类型：cDNA
[0073] (c)最初来源：新型鸭呼肠孤病毒
[0074] (d)序列描述：SEQ ID NO 1：
[0075] SEQ ID NO.1
[0076] GCTTTTTGAGTCCTCAGCGTGCAAGCCGCAATGGAGGTGCGTGTGCCAAACTTTCACTCCTTTATTGAGGGTATTACTACTAGTTACTTGCGGTCTCCTGCTTGCTGGAATTCGAAGACGTTATGGGATATTGAAGAGTTTCACACACCTGACGTTATCAGGGTCGGCAACGCTTACTGTTGCACTCAGTGCTGTGGTGTTCTGTACTATGGTGCCCCTCCCTCTGATGGTAACTGTTTTCCACATCACAAGTGTCATCAACAGCAATATCGTACTGAGACTCCGCTCATGAGATATATTAAGGTGGGTCGCACTACAGAGCAACTACTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATGTCATTGCAGATTACTATGATGAGGCGAGTAAGCGACCTCAGGATATCGCTGAAACTGAGTCAATCGCACCATTTGATATCGTAACCAGGACTGAATCTATTCGCAGTGACCGTGCCGTTGACCCGGAGTTCTGGACTTATCCGTTGGAGAGACGAGGATACGACGCGCGACATGAGATTGCTAGAGCGGGTTGGAAGATGATAGATGCTTCATCGCGAAGTCACACTCTTCCTGACTGTCTGGTGTCAAATATGCTCCATACTAGGCATGTCTTCAGCCAAATGTTAACCACGACAACCATCTATGATGTCGCTGTCACGGGTAAAGCTGTTAAATTCAGCCCGATGTTAGTAACCATGCCAACTCGAGGAGATGGTGCTGTGGCTCTGTCAAGAGGTAACTTGGATCATGATGTCGAGGACTGTTGGATGAATGGTTTTGCATTCTCCCCTATCATCGGCGGTGTTGGCATCACTGGTCAATTTGAGCGTGGTTCCTACCATAATTTTGGACACCCCATGGTTGGGAGTGGTAAGAAAGCTTCTCACTACCGCAATTTGTTCATGGAGTCCTGGCGTGGATGGTCAAAGTCG TGCTTTACATGTGCTGCAGGATGGAGCCCGCCGAGTGCGAATCTAGGCTGCGAGGCCATGCCAGAACTATGTTCGGACGTTCTCTTCCGGATATCTGTGACTTCGAGGAGACTACCCACGTTGGCCAGTCGTCCGCGCCATTAAAGAAGGCCACGAAATTGTCCTTCCTGGAGTGTAGGTGGTAAGCACCTCTGGGTCAAAATGCACATAGGCTCCCACCTATGTGACGGTTAGCGGGACTCGCCTATTCATC
[0077] SEQ ID NO.2的信息：
[0078] (a)NDRV S3编码区序列特征：
[0079] 编码区长度：1104个碱基
[0080] 类型：核酸
[0081] 链型：单链
[0082] 拓扑结构：线性
[0083] (b)分子类型：cDNA
[0084] (c)最初来源：新型鸭呼肠孤病毒
[0085] (d)序列描述：SEQ ID NO.2：
[0086] SEQ ID NO.2
[0087] ATGGAGGTGCGTGTGCCAAACTTTCACTCCTTTATTGAGGGTATTACTACTAGTTACTTGCGGTCTCCTGCTTGCTGGAATTCGAAGACGTTATGGGATATTGAAGAGTTTCACACACCTGACGTTATCAGGGTCGGCAACGCTTACTGTTGCACTCAGTGCTGTGGTGTTCTGTACTATGGTGCCCCTCCCTCTGATGGTAACTGTTTTCCACATCACAAGTGTCATCAACAGCAATATCGTACTGAGACTCCGCTCATGAGATATATTAAGGTGGGTCGCACTACAGAGCAACTACTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATGTCATTGCAGATTACTATGATGAGGCGAGTAAGCGACCTCAGGATATCGCTGAAACTGAGTCAATCGCACCATTTGATATCGTAACCAGGACTGAATCTATTCGCAGTGACCGTGCCGTTGACCCGGAGTTCTGGACTTATCCGTTGGAGAGACGAGGATACGACGCGCGACATGAGATTGCTAGAGCGGGTTGGAAGATGATAGATGCTTCATCGCGAAGTCACACTCTTCCTGACTGTCTGGTGTCAAATATGCTCCATACTAGGCATGTCTTCAGCCAAATGTTAACCACGACAACCATCTATGATGTCGCTGTCACGGGTAAAGCTGTTAAATTCAGCCCGATGTTAGTAACCATGCCAACTCGAGGAGATGGTGCTGTGGCTCTGTCAAGAGGTAACTTGGATCATGATGTCGAGGACTGTTGGATGAATGGTTTTGCATTCTCCCCTATCATCGGCGGTGTTGGCATCACTGGTCAATTTGAGCGTGGTTCCTACCATAATTTTGGACACCCCATGGTTGGGAGTGGTAAGAAAGCTTCTCACTACCGCAATTTGTTCATGGAGTCCTGGCGTGGATGGTCAAAGTCGTGCTTTACATGTGCTGCAGGGATGGAGCCCGCGGAGTGCGAATCTAGGCTGCGAGGCCATGCCAGAACTATGTTCGGACGTTCTCTTCCGGATATCTGTGACTTCGAGGAGACTACCCACGTTGGCCAGTCGTCCGCGCCATTAAAGAAGGCCACGAAATTGTCCTTCCTGGAGTGTAGGTGGTAA
[0088] SEQ ID NO.3的信息：
[0089] (a)NDRVσB蛋白序列特征：
[0090] 长度：367个氨基酸
[0091] 类型：氨基酸
[0092] 拓扑结构：线性
[0093] (b)分子类型：多肽
[0094] (c)序列描述：SEQ ID NO.3：
[0095] SEQ ID NO.3
[0096] MEVRVPNFHSFIEGITTSYLRSPACWNSRTLWDIEEFHTPDVIRVGNAYCCTQCCGVLYYGAPPSDGNCFPHHKCHQQQYRTETPLMRYIKVGRTTEQLLDQYAVALHVIADYYDEASKRPQDIAETESIAPFDIVTRTESIRSDRAVDPEFWTYPLERRGYDARHEIARAGWKMIDASSRSHTLPDCLVSNMLHTRHVFSQMLTTTTIYDVAVTGKAVKFSPMLVTMPTRGDGAVALSRGNLDHDVEDCWMNGFAFSPIIGGVGITGQFERGSYHNFGHPMVGSGKKASHYRNLFMESWRGWSKSCFTCAAGMEPAECESRLRGHARTMFGRSLPDICDFEETTHVGQSSAPLKKATKLSFLECRW 。
