技术领域
[0001] 本
发明属于医学技术领域，尤其涉及一种用于治疗哮喘肾气虚证药物、动物模型及构建使用方法。
背景技术
[0002] 支气管哮喘(Bronchial asthma，简称哮喘)是全球最常见的慢性
疾病之一，在西方国家约有高达10％的成人和30％的儿童受此影响。全世界目前约有3亿哮喘患者，患病率以每年1％左右的速度递增，严重影响患者的日常生活和工作，给家庭和社会带来沉重负担，因此对哮喘进行深入研究成为当今全球性的重要课题。
[0003] 支气管哮喘作为一种异质性疾病，发病机制复杂多样。近年来调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的发现，修正了传统的Thl/Th2失衡引起哮喘免疫应答的致病理论，揭示Treg与Th之间复杂关系是探索哮喘发病机制和治疗方法的关键环节之一。鉴于糖皮质
激素治疗哮喘的有效性和安全性等问题，探索中西医
联合治疗哮喘的方法有望获得更增效低毒的治疗手段。
[0004] 支气管哮喘发病中功能失调的T淋巴细胞亚群
[0005] 支气管哮喘作为一种异质性疾病，发病机制复杂多样，目前认为与外周免疫耐受机制存在
缺陷有关，T淋巴细胞在哮喘免疫应答中发挥着核心作用。
[0006] 传统理论认为辅助性T淋巴细胞亚群(Th)功能失调，即Thl/Th2失衡——Th2型优势应答，是支气管哮喘病理过程形成的始动因素和维持因素。近年来发现Th1/Th2细胞失衡机制并不能完全阐明哮喘的发生，调节性T细胞(Treg)和Th17的发现修正了上述观念，认为Treg与Th17可能参与了哮喘的发病
进程。Th17关键分泌因子IL-17在哮喘患者
肺组织、痰液、肺泡灌洗液和血清中均增高，且和气道高
反应性呈正相关。过敏性哮喘
患儿痰液Treg低于正常儿童；CD4+CD25+Treg可以抑制哮喘模型动物气道嗜酸粒细胞的增多，减轻气道
炎症。Treg是
机体对T细胞活化的一种
负反馈调节机制，它既能影响Thl细胞，也能作用于Th2细胞，还与Thl7细胞之间存在复杂的相互关系，揭示Treg和Th之间复杂关系是探索哮喘发病机制的关键环节之一，因此近年来成为研究的热点。
[0007] 中医对哮喘病认识很早，《内经》中虽无哮病，但有“喘鸣”的记载，此与哮喘相似。中医学认为：“肺为气之主，肾为气之根”、“咳嗽在肺，其根在肾”，正是由于肺气虚弱，卫外不固，或自身抵抗
力下降，引发哮喘。脏腑虚损，精气不足，迁延累及于肾。虚则肺不主气，肾不纳气，呼吸摄纳无权而发喘息。所以，哮喘是正虚邪实、虚实夹杂的复杂病证。元代朱丹溪首创“哮喘”病名，提出著名的“未发以扶正气为主，既发以攻邪气为急”的治疗原则，一直被后世作为治疗哮喘的指导方针。根据多年临床经验在七味都气丸的
基础上，运用益肾喘宁汤(熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、苦参、天浆壳、牡丹皮、茯苓、五味子、沉香片、旋覆花、黛蛤散、生黄芪)，以补肺肾治本，兼以化痰、行气、活血，配合西药治疗哮喘，取得较好疗效，减少了患者对激素等的使用，加强了对哮喘的疗效，体现了中医“审证求因，治病求本”的理论，是有效治疗哮喘的根本所在。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种用于治疗哮喘肾气虚证药物、动物模型及构建使用方法，旨在解决目前缺少中西医联合治疗哮喘药物，及验证该药物在增效低毒的治疗手段的方法和使用方法的问题。
[0009] 本发明是这样实现的,一种用于治疗哮喘肾气虚证的药物，所述用于治疗哮喘肾气虚证的药物的中药组分由熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、苦参、天浆壳、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黄芪各15g组成；西药采用必可
酮气雾剂，每揿50μg，200揿/瓶。
[0010] 本发明另一目的在于提供一种用于验证用于治疗哮喘肾气虚证的药物疗效的哮喘肾气虚证动物模型的构建方法，该哮喘肾气虚证动物模型的构建方法为：清洁级雄性Wistar大鼠540只，体重200～250g。动物随机分为正常对照组，哮喘模型对照组，肾气虚哮喘模型组，西药组，中药组，中西药联合组；
[0011] 哮喘造模：除正常对照组外，各组大鼠采用卵清蛋白致敏法进行哮喘造模；
[0012] 肾气虚造模：除正常对照组、哮喘模型对照组外，各组大鼠复合肾气虚证造模。
[0013] 进一步，所述哮喘造模方法为：实验第1天，用含有卵清蛋白1mg、氢
氧化
铝凝胶10mg及灭活百日咳杆菌
疫苗5×108个的
混合液1ml注入
腹腔内，令其致敏。正常组以生理盐
水腹腔内注射，2周后备用；第15天开始，将上述造模大鼠置于65cm×45cm×45cm大小的玻璃罩内，以1％的卵清蛋白超声雾化吸入30min，激发哮喘，日1次，连续激发直至处死；正常对照组用生理盐水替代雾化吸入。
[0014] 进一步，所述肾气虚造模：除正常对照组、哮喘模型对照组外，各组大鼠复合肾气虚证造模，具体方法：①实验第1天开始，每日上午于同一时间置一安静房间进行惊恐刺激，每次10min，即放送有猫叫声的磁带，同时用梅花针叩击大鼠20次/min，模拟猫抓拿攻击大鼠的情景，同时振动鼠笼；②每日下午将动物负重游泳：于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10％的保险丝，放入水深50cm、水温20℃的水槽中游泳，以力竭为度——大鼠鼻尖没入水面10s。日1次，共14天，即激发前一天。
[0015] 本发明另一目的在于提供一种利用哮喘肾气虚证动物模型的构建方法建立的动物模型。
[0016] 本发明另一目的在于提供一种利用哮喘肾气虚证动物模型的构建方法建立的动物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0017]
给药及处理：西药组、中药组和中西药联合组大鼠于实验第15天开始给药；日给药剂量为：西药组给必可酮50μg/只；中药组给中药2.0g/kg；中西药组给相应中药2.0g/kg、必可酮50μg/；正常对照组、哮喘模型组、肾虚哮喘模型组给生理盐水灌胃；各组大鼠分别干预15天处理，称体重，眼球取血；肾气虚哮喘模型组进行四诊计量化指标进行气虚程度评判；
[0018] 症状、体征观察：观察各组大鼠食量、皮毛、体重、活动量、悬尾抵抗力、游泳时间、双肺表现；
[0019] 血清检测：检测甲状腺素(T4)、皮质醇(Cor)、睾酮(T)水平。
[0020] 病理学观察：取部分肺组织行苏木精--伊红(HE)
染色观察。
[0021]
支气管肺泡灌洗液(BALF)检测白细胞分类和计数：并采用EL ISA法检测BALF离心后上清液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ、TGF-β等的含量。
[0022] 肺组织检测：取出肺脏组织的1/3,采用逆转录－
聚合酶链反应(RT-PCR)测定法检测肺组织中T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表达水平；用免疫印迹法(Western blot)检测肺组织T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表达水平。取出另外肺组织的1/3，用于miRNA相关检测；
[0023] 脾组织检测：分离脾脏中单个核细胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分别加Th1、Th2、Th17和Treg细胞的特异性
抗体IL-4、IFN-γ、IL-17A和Foxp3。孵育后重悬、上机检测。
[0024] microRNA微阵列基因检测：大鼠处死，肺脏被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作。用MirVana microRNAisolation kit按照
说明书收集总RNA。取适量RNA溶液，经紫外分光光度计定量测定RNA样品OD260和OD280值，计算RNA浓度。1％琼脂糖
电泳观察总RNA，取2-5μg用Microcon centrifugal filter微离心过滤柱过滤，得到
片段小于300个核苷酸的小RNA。应用Poly(A)聚合酶将小RNA的3’端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的
荧光标记。完成μParafloTM microRNA微阵列基因表达实验和分析：通过微
循环泵杂交仪器在μParafloTM微
流体芯片上过夜，使用含
甲酸胺SSPE缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光
扫描仪采集杂交图象，Array--Pro
软件对杂交图像进行数字化转换、
数据处理和分析。计算两组检测到
信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点。大鼠微阵列芯片包括目前报道的所有454个microRNA，包含
数据库中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互补链；芯片上的检测探针均进行9个重复，实验进行2次。
[0025] 实时荧光定量PCR检测：用MirVana microRNAisolation kit按照说明书收集总RNA，计算RNA浓度。特异逆转录引物从Taqman MicroRNAAssays获得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit将RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测，反应结束后用ABI Prism7900软件分析结果。PCR实验进行3次，用比较
阈值循环方法分析数据，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数，并分析基因相对表达量。
[0026]
生物信息学预测：应用miRanda、TargetScan和PicTar 3个生物信息学靶基因预测软件，对microRNA芯片结果中挑选出来的microRNA的靶基因做出预测；
[0027] 统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。
[0028] 进一步，microRNA芯片的数据分析方法：
[0029] 使用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值；
[0030] 相同的探针取中值合并，保留在所有样品中均>＝30.0的探针，对全部芯片进行中值标准化，筛选差异表达探针；
[0031] 使用Fold change和P-value筛选两组样品间的差异表达miRNA；
[0032] 使用Fold change筛选两个样品间的差异表达miRNAs；
[0033] 最后，对差异表达miRNAs进行聚类并绘制聚类图。
[0034] 使用Fold change和P-value筛选两组样品间的差异表达miRNA中两组样品间有重复；使用Fold change筛选两个样品间的差异表达miRNAs中两个样品间没有重复。
[0035] 本发明另一目的在于提供一种Th1、Th2、Th17、Treg测定方法，所述Th1、Th2、Th17、Treg测定方法为：
[0036] 采用流式细胞仪测定脾组织中的Th1、Th2、Th17、Treg的含量，对各用药组Th1/Th2和Th17/Treg均值统计学分析。
[0037] 本发明前期建立肾气虚哮喘病证结合大鼠模型，并观察到益肾喘宁汤联合糖皮质激素可通过调节转录因子的表达来纠正Th1/Th2失衡，本发明在前期工作基础上，以T细胞亚群(Th1、Th2、Th17、Treg)的特异性转录因子、关键细胞因子和微小RNA为指标，证明肾气虚哮喘发病与Treg/Th平衡的内在机制，揭示中药复方治疗哮喘可能存在的多靶点多层次的网络式调控机制。
[0038] 本发明通过筛选、预测肾气虚哮喘模型组与哮喘模型对照组肺部差异化表达miRs和靶因子及其相互关系，揭示了分子水平上肾气虚证本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
[0039] 目前尚未见在哮喘发病分析中对Th1、Th2、Th17、Treg进行多
角度通盘考虑。因此本发明从Treg/Th失衡分析了哮喘发病机制。
[0040] 模型上：成功的哮喘动物模型对哮喘病因及发病机理研究中有十分重要的意义。在中医理论指导下建立了接近临床症候的肾气虚哮喘病证结合模型，比目前单纯哮喘模型更符合中医理论，也更利于在肾气虚哮喘模型上探索方证相对的益肾喘宁汤治疗哮喘的机理；
[0041] 探索方法上：microRNA广泛参与靶mRNA的沉默调控，并且是多靶点多层次网络式调控，常在生长发育和疾病过程中呈现
时空式表达。适合对中医证型的研究。本发明应用miR技术对肾气虚证本质的科学内涵作一些有益的探索，为多种疾病的诊断和治疗提供新的思路。
附图说明
[0042] 图1是本发明
实施例提供的哮喘肾气虚证动物模型的构建方法
流程图。
[0043] 图2是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果正常组图。
[0044] 图3是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果哮喘模型组图。
[0045] 图4是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果肾气虚哮喘模型组图。
[0046] 图5是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果中西药组图。
[0047] 图6是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果西药组图。
[0048] 图7是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果中药组图。
具体实施方式
[0049] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0051] 一种用于治疗哮喘肾气虚证的药物，所述用于治疗哮喘肾气虚证的药物的中药组分由熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、苦参、天浆壳、牡丹皮、茯苓各12g、五味子5g、沉香片8g、旋覆花、黛蛤散、生黄芪各15g组成；西药采用必可酮气雾剂，每揿50μg，200揿/瓶。
[0052] 本发明另一目的在于提供一种用于验证用于治疗哮喘肾气虚证的药物疗效的哮喘肾气虚证动物模型的构建方法，如图1所示，该哮喘肾气虚证动物模型的构建方法为：
[0053] S101：清洁级雄性Wistar大鼠540只，体重200～250g，动物随机分为正常对照组，哮喘模型对照组，肾气虚哮喘模型组，西药组，中药组，中西药联合组；
[0054] S102：哮喘造模：除正常对照组外，各组大鼠采用卵清蛋白致敏法进行哮喘造模；
[0055] S103：肾气虚造模：除正常对照组、哮喘模型对照组外，各组大鼠复合肾气虚证造模。
[0056] 进一步，所述哮喘造模方法为：实验第1天，用含有卵清蛋白1mg、氢氧化铝凝胶8
10mg及灭活百日咳杆菌疫苗5×10个的混合液1ml注入腹腔内，令其致敏。正常组以生理盐水腹腔内注射，2周后备用；第15天开始，将上述造模大鼠置于65cm×45cm×45cm大小的玻璃罩内，以1％的卵清蛋白超声雾化吸入30min，激发哮喘，日1次，连续激发直至处死；正常对照组用生理盐水替代雾化吸入。
[0057] 进一步，所述肾气虚造模：除正常对照组、哮喘模型对照组外，各组大鼠复合肾气虚证造模，具体方法：①实验第1天开始，每日上午于同一时间置一安静房间进行惊恐刺激，每次10min，即放送有猫叫声的磁带，同时用梅花针叩击大鼠20次/min，模拟猫抓拿攻击大鼠的情景，同时振动鼠笼；②每日下午将动物负重游泳：于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10％的保险丝，放入水深50cm、水温20℃的水槽中游泳，以力竭为度——大鼠鼻尖没入水面10s。日1次，共14天，即激发前一天。
[0058] 本发明另一目的在于提供一种利用哮喘肾气虚证动物模型的构建方法建立的动物模型。
[0059] 本发明另一目的在于提供一种利用哮喘肾气虚证动物模型的构建方法建立的动物模型的使用方法，所述使用方法包括：
[0060] 给药及处理：西药组、中药组和中西药联合组大鼠于实验第15天开始给药；日给药剂量为：西药组给必可酮50μg/只；中药组给中药2.0g/kg；中西药组给相应中药2.0g/kg、必可酮50μg/；正常对照组、哮喘模型组、肾虚哮喘模型组给生理盐水灌胃；各组大鼠分别干预15天处理，称体重，眼球取血；肾气虚哮喘模型组进行四诊计量化指标进行气虚程度评判；
[0061] 症状、体征观察：观察各组大鼠食量、皮毛、体重、活动量、悬尾抵抗力、游泳时间、双肺表现；
[0062] 指标检测：四诊计量化所观察的指标及气虚判定：用电脑播放旷场录像，记录各个动物水平跨格数和前肢离地站立次数。用YLS-13A型大、小鼠抓力测定仪检测抓力。气虚程度＝各动物水平移动实测值/正常组均数×0.3+各动物直立次数/正常组均数×0.2+各动物抓力实测值/正常组均数×0.5。辨证标准：与正常组比较，大于1.25为气盛，小于0.75为气虚。
[0063] 血清检测：检测甲状腺素(T4)、皮质醇(Cor)、睾酮(T)水平。
[0064] 病理学观察：取部分肺组织行苏木精--伊红(HE)染色观察。
[0065] 支气管肺泡灌洗液(BALF)检测白细胞分类和计数：并采用EL ISA法检测BALF离心后上清液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ、TGF-β等的含量。
[0066] 肺组织检测：取出肺脏组织的1/3,采用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)测定法检测肺组织中T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、IL-6、TGF-β等因子mRNA的表达水平；用免疫印迹法(Western blot)检测肺组织T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3、IL-6、TGF-β蛋白的表达水平。取出另外肺组织的1/3，用于miRNA相关检测；
[0067] 脾组织检测：分离脾脏中单个核细胞，固定，染FITC-CD4，然后破膜，分别加Th1、Th2、Th17和Treg细胞的特异性抗体IL-4、IFN-γ、IL-17A和Foxp3。孵育后重悬、上机检测。
[0068] microRNA微阵列基因检测：大鼠处死，肺脏被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作。用MirVana microRNAisolation kit按照说明书收集总RNA。取适量RNA溶液，经紫外分光光度计定量测定RNA样品OD260和OD280值，计算RNA浓度。1％琼脂糖电泳观察总RNA，取2-5μg用Microcon centrifugal filter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个核苷酸的小RNA。应用Poly(A)聚合酶将小RNA的3’端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧
光标记。完成μParafloTM microRNA微阵列基因表达实验和分析：通过微
循环泵杂交仪器在μParafloTM微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺SSPE缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，Array--Pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析。计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点。大鼠微阵列芯片包括目前报道的所有454个microRNA，包含数据库中所有的成熟microRNA和部分成熟microRNA的互补链；芯片上的检测探针均进行9个重复，实验进行2次。
[0069] 实时荧光定量PCR检测：用MirVana microRNAisolation kit按照说明书收集总RNA，计算RNA浓度。特异逆转录引物从Taqman MicroRNAAssays获得，并用Taqman MicroRNAReverseTranscription Kit将RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测，反应结束后用ABI Prism7900软件分析结果。PCR实验进行3次，用比较阈值循环方法分析数据，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数，并分析基因相对表达量。
[0070] 生物信息学预测：应用miRanda、TargetScan和PicTar 3个生物信息学靶基因预测软件，对microRNA芯片结果中挑选出来的microRNA的靶基因做出预测；
[0071] 统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。
[0072] microRNA芯片的数据分析方法：
[0073] 使用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值；
[0074] 相同的探针取中值合并，保留在所有样品中均>＝30.0的探针，对全部芯片进行中值标准化，筛选差异表达探针；
[0075] 使用Fold change和P-value筛选两组样品间(有重复)的差异表达miRNA；
[0076] 使用Fold change筛选两个样品间(没有重复)的差异表达miRNAs；
[0077] 最后，对差异表达miRNAs进行聚类并绘制聚类图。
[0078] 本发明前期建立肾气虚哮喘病证结合大鼠模型，并观察到益肾喘宁汤联合糖皮质激素可通过调节转录因子的表达来纠正Th1/Th2失衡，本发明在前期工作基础上，以T细胞亚群(Th1、Th2、Th17、Treg)的特异性转录因子、关键细胞因子和微小RNA为指标，证明肾气虚哮喘发病与Treg/Th平衡的内在机制，揭示中药复方治疗哮喘可能存在的多靶点多层次的网络式调控机制。
[0079] 本发明通过筛选、预测肾气虚哮喘模型组与哮喘模型对照组肺部差异化表达miRs和靶因子及其相互关系，揭示了分子水平上肾气虚证本质的部分科学内涵。证明了证候的宏观表型与微观生物分子之间的复杂关系。
[0080] 本发明理论上：近年来发现Th1/Th2细胞失衡机制并不能完全阐明哮喘的发生，自从发现Treg和Th17后，提示Treg/Th17细胞失衡可能在其中扮演了重要角色，但目前尚未见在哮喘发病研究中对Th1、Th2、Th17、Treg进行多角度通盘考虑。因此本发明从Treg/Th失衡探讨了哮喘发病机制；
[0081] 模型上：成功的哮喘动物模型对哮喘病因及发病机理研究中有十分重要的意义。在中医理论指导下建立了接近临床症候的肾气虚哮喘病证结合模型，比目前单纯哮喘模型更符合中医理论，也更利于在肾气虚哮喘模型上探索方证相对的益肾喘宁汤治疗哮喘的机理；
[0082] 探索方法上：microRNA广泛参与靶mRNA的沉默调控，并且是多靶点多层次[0083] 网络式调控，常在生长发育和疾病过程中呈现时空式表达。适合对中医证型的发明。本发明应用miR技术对肾气虚证本质的科学内涵作一些有益的探索，为多种疾病的诊断和治疗提供新的思路。
[0084] 本发明提供一种Th1、Th2、Th17、Treg测定方法，所述Th1、Th2、Th17、Treg测定方法为：
[0085] 采用流式细胞仪测定脾组织中的Th1、Th2、Th17、Treg的含量，对各用药组Th1/Th2和Th17/Treg均值统计学分析。
[0086] 下面结合具体分析对本发明进一步说明。
[0087] 一、筛选micRNA的结果
[0088] 1.哮喘模型组、肾哮组、正常组之间的miRNA筛查结果
[0089] 1.1哮喘组与正常组比较，Fold chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value[0090] 小于0.05的micRNA有13项，见下表1，3个上调，10个下调，其中rno-miR-370-3p下调达7倍以上。
[0091] 表1哮喘组与正常组比较
[0092] Name Fold change P-value
[0093] rno-miR-450a-5p 3.672907474 0.030700678
[0094] rno-miR-181c-5p 3.180354232 0.008559343
[0095] rno-let-7a-1-3p/rno-let-7c-2-3p 3.263503027 0.018867658
[0096] rno-miR-291a-5p 0.253366323 0.001651507
[0097] rno-miR-652-5p 0.276631295 0.002304921
[0098] rno-miR-370-3p 0.129882271 0.029640336
[0099] rno-miR-292-5p 0.302037645 0.007247725
[0100] rno-miR-465-3p 0.278758669 0.008775467
[0101] rno-miR-667-3p 0.276021935 0.045812777
[0102] rno-miR-331-5p 0.276273909 0.006955694
[0103] rno-miR-487b-5p 0.319087445 0.039504933
[0104] rno-miR-2985 0.223001768 0.000262881
[0105] rno-miR-3573-3p 0.292860106 0.037137704
[0106] 1.2肾哮组与正常组比较，Fold chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05的micRNA有2项，见下表2，2个上调，其中rno-miR-450a-5p与哮喘组相似，均上调。
[0107] 表2肾哮组与正常组比较
[0108] Name Fold change P-value
[0109] rno-miR-27b-3p 2.195809383 0.013101224
[0110] rno-miR-450a-5p 3.339141265 0.012433015
[0111] 3.肾哮组与哮喘组比较，Fold chang大于3倍或小于0.33倍的micRNA有8项，见下表3，6个上调，2个下调，其中rno-miR-488-5p上调13倍以上，rno-miR-1-3p下调达28倍。
[0112] 表3肾哮组与哮喘组比较
[0113] Name Fold change P-value
[0114] rno-miR-3596d 3.372381099 0.329809835
[0115] rno-miR-653-3p 6.099956147 0.343530206
[0116] rno-miR-370-3p 3.732235481 0.403736101
[0117] rno-miR-3557-5p 4.210096767 0.307129158
[0118] rno-miR-344a-5p 3.646240471 0.292299088
[0119] rno-miR-488-5p 13.2511768 0.298227266
[0120] rno-miR-133a-3p 0.35730468 0.346101851
[0121] rno-miR-1-3p 0.035765059 0.367075199
[0122] 由于样本含量较少，肾哮组与哮喘组尽管P值均大于0.05，但生物学差异明显，可做进一步分析。
[0123] 2.西药组、中药组、中西药组之间miRNA筛查结果：
[0124] 2.1中药组与西药组比较，Fold chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05的micRNA中有23个上调，19个下调(略)，其中rno-miR-487b-3p高达300多倍，rno-miR-376b-3p高达60倍，还有7个miRNA差异表达高达10倍以上。
[0125] 2.2中西药组与西药组比较，Fold chang大于3倍或小于0.3倍，且P-value小于0.05的micRNA有3项，见表4，其中rno-miR-487b-3p上调达42倍。
[0126] 表4中西药组与西药组比较
[0127] Name Fold change P-value
[0128] rno-miR-487b-3p 41.99498626 0.000343931
[0129] rno-miR-450a-5p 0.19895338 0.000388542
[0130] rno-miR-181c-5p 0.186421241 0.001652361
[0131] 2.3中西药与中药比较，Fold chang大于3倍或小于0.33倍，且P-value小于0.05的micRNA有20项(略)，6项上调，12项下调，其中rno-miR-376b-3p下调达40倍，rno-miR-138-2-3p下调达10倍。
[0132] 3.由上可知，在此基础上，可进一步：
[0133] 3.1扩大样本含量，筛选肾哮组与哮喘组micRAN表达的差异；
[0134] 3.2验证：中药与西药在作用与哮喘和肾哮模型中micRNA表达的差异。
[0135] 3.3了解差异表达强的miRNA位点的功能。
[0136] 二、测定Th1、Th2、Th17、Treg
[0137] 采用流式细胞仪测定脾组织中的Th1、Th2、Th17、Treg的含量，从六个组Th1/Th2和Th17/Treg均值的柱状看出，趋势较为理想，但样本含量较少，各用药组之间尚未见统计学意义。下一步可继续扩大样本含量，重复上述实验。分组Th1/Th2(均数±标准差) Th17/Treg(均数±标准差)
[0138]
[0139] 三、模型中肺泡灌洗液各相关因子的ELISA检测结果：
[0140] 各组大鼠各指标水平比较
[0141]
[0142] 注：＊与正常组比较P<0.05，△与肾气虚哮喘模型组比较P<0.05。
[0143]
[0144] 注：＊与正常组比较P<0.05，△与肾气虚哮喘模型组比较P<0.05。
[0145] 各组大鼠肺组织HE染色结果：
[0146] 图2是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果正常组图；
[0147] 图3是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果哮喘模型组图；
[0148] 图4是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果肾气虚哮喘模型组图；
[0149] 图5是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果中西药组图；
[0150] 图6是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果西药组图；
[0151] 图7是本发明实施例提供的大鼠肺组织HE染色结果中药组图。
[0152] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
