专利汇可以提供以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供以CD4为靶点的 抗体 及CAR-T细胞的制备和应用,属于特异性抗体的制备方法,本发明中血清用40%、35%、33%的 硫酸 铵盐析三次(或20%的硫酸钠)粗提y-球蛋白,经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc 片段 ,离子层析采用QAE-Sephadex 纤维 素,能够 吸附 血清中多种 蛋白质 ,亲和层析将 抗原 交联到Sepharose4B,利用 生物 学分子间所具有的专一 亲和性 进行层析,能够去除血清中含有与抗体不相关的成份;佐剂配料采用Ag+NS,能增强 机体 免疫应答,同时也能改变机体免疫类型的物质;改变抗原的物理性状,延缓抗原的释放,增强巨噬细胞抗原处理,活化巨噬细胞,增强淋巴细胞的应答能 力 。,下面是以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用专利的具体信息内容。
1.以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用包括以CD4为靶点的特异性抗体和CAR-T细胞的制备和应用;
所述以CD4为靶点的特异性抗体包括下列步骤:
步骤1:鲜血采集,采用动脉采血法;
步骤2:抗原制备,将步骤一中采集的鲜血经无菌NS洗涤三次,去压积红细胞并配置成
2-5%;
步骤3:佐剂制备佐剂制备,配料采用Ag+NS,将Ag+NS放入试管内缓慢搅拌,然后滴入
10%的硫酸铝钾溶液,以NaOH校正PH至6.5,然后在离心机内进行离心,最后通过NS进行洗涤;
步骤4:血清制备,将鲜血置于常温室内,自然凝固,将血清提取出后,在56°的加热器皿内加热30min;用40%、35%、33%的硫酸铵盐析三次(或20%的硫酸钠)粗提y-球蛋白,此时y-球蛋白内会含有5%的其它蛋白,经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段;
步骤5:注射,抗原和佐剂可同时注射,或者佐剂先于抗原注射,抗原和血清采用皮下多点注射,一般注射点数为8-10点;佐剂的注射采用肌肉注射;首次和二次免疫注射时间要间隔20天,二次以后,每次注射间隔7-10天。
2.如权利要求1所述以CD4为靶点的抗体及CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述CAR-T细胞的制备和应用包括下列步骤:步骤一:白细胞分离及培养;步骤二:T细胞活化;步骤三:转染;步骤四:扩增;步骤五:回输。
3.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述步骤一:白细胞分离及培养,包括以下流程:(1)用PBS缓冲液按1:1稀释外周血,混匀;(2)稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中,具体操作方法:用10ml移液管吸取血样,伸至分离液液面上方0.5cm处,血样自然滑落铺至分离液面上,然后轻轻加入血样,不要冲破液面;(3)配平离心1200g,离心20min;(4)离心完成后,离心管出现明显分层由下至上:红细胞层,粒细胞层,Ficoll层,单个核细胞层和血浆层,吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之,小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中,PBS稀释,与细胞悬液体积比应大于1:3,混匀;(5)离心600g(1600r/min)5min,PBS重悬细胞混匀,取少量细胞计数;(6)离心300g(1200r/min)5min,上清液进行无菌检测;(7)细胞培养:恒温37℃,CO2浓度5%,相对饱和湿度95%,细胞培养基PH值7.2-7.4,根据细胞计数调密度2×106/ml加入培养瓶中,混匀放入C02培养箱培养2小时。
4.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述步骤二:T细胞活化,取出培养瓶,轻摇,使沉降于底部的悬浮细胞浮起,培养瓶倾斜30度角,移液管吸取培养基转入离心管中,少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集,混匀计数根据细胞计数调整细胞浓度1.2×106/ml接种培养瓶中,加CD3/CD28磁珠,按细胞与磁珠比例为1:3,加入IL-2
100U/ml,混匀放入C02培养箱培养。
5.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述步骤三:转染,细胞培养1天,调整细胞密度至0.6×106/ml,加入病毒(MOI为1-5)混匀放入C02培养箱培养,培养3天时,细胞计数补加培养基,IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养。
6.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述步骤四:扩增,细胞培养5天去磁珠,细胞混匀转离心管中,在磁力架上去除磁珠,细胞计数补加培养基,IL-2
100U/ml细胞密度调整至0.6×106/ml继续培养;定期观察细胞生长情况,主要观察其形态的变化,数目及增值情况,细胞碎片及杂质情况,每2-3天加液培养;根据细胞状态和临床治疗需要,培养9天时细胞数量达到要求,并检查无菌检测,内毒素检测,细胞活力,细胞表型等各项指标。
7.如权利要求2所述的CAR-T细胞的制备和应用,其特征在于:所述步骤五:回输,取出
300g细胞悬液,转入离心管中,(剩余细胞补加培养基继续培养)离心5min,除去上清培养液,加PBS缓冲液稀释混匀,300g离心5min,弃上清,PBS缓冲液300g/min离心5min,离心完成后取上清做无菌检测,用20ml生理盐水重悬细胞,100μm细胞滤网过滤,细胞过滤完成,转入
100ml盐水袋中,并加5%注射用人血白蛋白,采用静脉回输的方式输回患者的体内。
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