利用光学生物盘系统基于细胞核形态学的白血细胞类型的识别和定量
阅读：57发布：2020-05-25
专利汇可以提供利用光学生物盘系统基于细胞核形态学的白血细胞类型的识别和定量专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 通常涉及 生物 检定和诊断检定，具体说来，涉及利用一种光学生物盘系统对细胞成像的方法和设备。更具体地说，但不限制下文参照最佳实施方式所说明的具体实施方式，本发明涉及利用吸收预定 波长 的电磁 辐射 的 染色 剂结合光学生物盘基于白血细胞的细胞核的形态学识别并定量白血细胞的方法。，下面是利用光学生物盘系统基于细胞核形态学的白血细胞类型的识别和定量专利的具体信息内容。
1.一种采用光学盘和盘驱动器执行测定的方法，所述方法包括以 下步骤：
在盘中的室中的盘表面上提供细胞样本，该室包括至少一个带有 俘获剂的俘获区；
将盘载入光学读出器中；
旋转光学盘；
将电磁辐射入射束指向俘获区；
检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束；
将所检测的电磁辐射束转换为输出信号；和
分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类 型相关的信息。
2.一种接收样本的光学盘和驱动系统，该系统包括：
包括衬底、平行于衬底的盖和在所述盖与包含俘获区的衬底之间 限定的室的盘；
在衬底上的俘获区处的俘获层，第一俘获区具有第一细胞俘获剂 而第二俘获区具有第二细胞俘获剂；
将光指向盘的俘获区处的光源；
检测从盘俘获区反射或透射的光并提供信号的检测器；和
使用该信号区分被俘获细胞核并计数被结合至俘获分子的试样 中的项目的处理器。
3.一种采用光学盘和盘驱动器执行白细胞计数的方法，所述方法 包括以下步骤：
在第一试管中提供血样，第一试管包含分离梯度；
以足以将血样分离为层的时间和速度旋转第一试管；
从被分离血样中分离白细胞层；
再悬浮白细胞层从而形成白细胞悬浮液；
在光学盘表面上提供白细胞悬浮液的样本，该表面包括至少一个 带有至少一种俘获剂的俘获区；
将光学盘载入光学读出器中；
旋转光学盘；
将电磁辐射入射束指向俘获区；
检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束；
将所检测的电磁辐射束转换为输出信号；和
分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞核的形态相 关的信息。
4.如权利要求3的方法，还包括以下步骤：
将白细胞样本导入俘获剂的附近；
在俘获剂存在的情况下培育细胞；
允许细胞具体地结合至俘获剂；
使用在电磁辐射束的波长处或附近吸收的染料对细胞核染色。
5.如权利要求4的方法，还包括分析特定类型的被俘获细胞的数 量从而确定样本中的所述特定细胞类型的浓度的步骤。
6.如权利要求5的方法，其中分析被俘获细胞核的形态的所述步 骤包括检测从盘反射和透射的光的水平的变化。
7.如权利要求6的方法，还包括使用图像识别以通过细胞核形态 区分细胞类型从而计数特定细胞类型的细胞数量的步骤。
8.如权利要求7的方法，其中图像识别区分一种类型的白细胞核 与另一类型的白细胞核。
9.如权利要求8的方法，其中图像识别包括使用用于细胞染色的 染料。
10.如权利要求9的方法，其中所述染料被从由活体染料、荧光 染料、红外和近红外染料构成的组中选择。
11.如权利要求10的方法，其中所述活体染料被从由Leishman 氏染料、吖啶橙或Zynostain构成的组中选择。
12.如权利要求3的方法，其中旋转光学盘的所述步骤包括以足 够的速度旋转足够的时间周期，以使细胞具有与所述至少一种俘获剂 结合的机会。
13.如权利要求12的方法，其中旋转光学盘的所述步骤还包括以 足够的速度旋转足够的时间周期，以使未结合细胞被从俘获区移开。
14.如权利要求13的方法，其中旋转光学盘的所述步骤以单一速 度来完成。
15.如权利要求3的方法，还包括计数各俘获区中的被俘获细胞 并提供包括细胞计数的输出的步骤。
16.如权利要求15的方法，其中输出包括CD4细胞和CD8细胞 计数，和CD4与CD8细胞的比率。
17.一种被用于按照权利要求3至16的任一项的所述方法执行分 组标示计数的光学生物盘。
18.一种制造利用细胞核形态区分细胞类型执行鉴别白细胞的计 数的光学分析盘的方法，所述方法包括以下步骤：
提供衬底；
使用活性层涂覆所述衬底；
在所述活性层上提供交联剂从而产生一个或更多俘获区；
允许所述交联剂结合至活性层；
从俘获区去除过量交联剂；和
将盖部分固定至所述活性层以形成适于接收细胞悬浮液和对被 俘获细胞核染色的染料溶液的通道。
19.一种分析试样中的白细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
将多个白细胞载入光学生物盘中；
通过使用具有特定细胞表面标记特性的俘获剂俘获指定目标区 中的所述白细胞；
使用染料对俘获白细胞的细胞核染色；
将入射光束指向被俘获白细胞；
允许所述入射光束与被俘获白细胞的被染色细胞核相互作用从 而形成携带与细胞核的形态有关的信息的返回光束；
检测所述返回光束；
将所述被检测返回光束转换为输出信号；和
分析所述输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的细胞核 形态相关的信息。
20.如权利要求19的方法，其中所述染料被从由活性、活性细胞 核、细胞核、DNA、染色体、荧光、红外、近红外、UV、和可见光 染料构成的组中选择。
21.如权利要求19的方法，还包括计数特定类型的被俘获白细胞 的数量的步骤。
22.如权利要求21的方法，其中所述特定类型的白细胞包括中性 白细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜曙红白细胞、和嗜碱白细胞。
23.一种被用于执行如权利要求19至22的任一项的所述方法的白 细胞分析的光学生物盘。
24.一种采用光学盘及盘驱动器执行分析的方法，所述方法包括 以下步骤：
在盘表面上提供细胞试样；
将盘载入光学读出器中；
旋转光学盘；
将电磁辐射入射束指向俘获区；
检测在与盘和盘表面上的细胞试样相互作用之后所形成的电磁 辐射束；
将所检测的电磁辐射束转换为输出信号；和
分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类 型相关的信息。
25.如权利要求24的方法，还包括使用吸收预定波长的光的染料 染色细胞试样的步骤。
26.如权利要求25的方法，其中所述预定波长等于和接近电磁辐 射束的波长。
27.如权利要求25的方法，其中所述染料吸收红外光谱范围内的 光。
28.如权利要求25的方法，其中所述染料为近红外吸收染料。
29.如权利要求25的方法，其中所述染料吸收紫外线光谱范围内 的光。
30.如权利要求25的方法，其中所述染料吸收可见光谱范围内的 光。
31.如权利要求26至30的任一项的方法，其中所述电磁辐射束的 波长在所述染料吸收率波长的10nm范围内。
32.如权利要求27或28的方法，其中所述染料从由LI-COR IRDye38、TO-PRO-5碘化物、IR-780碘化物、激光Pro IR、dd-007、 Zynostain、艾杜酞菁绿、铜酞菁、3，3’-二乙基噻三羰花青碘化物 (DTTCI)、3，3’-二乙基噁三羰花青碘化物(DOTCI)、3，3’-二乙 基噻二羰花青碘化物(DTDCI)、和3，3’-二乙基噁二羰花青碘化物 (DODCI)构成的组中选择。
33.如权利要求25的方法，其中所述染料标记盘表面上的细胞试 样的预定分隔部分。
34.如权利要求33的方法，其中所述预定分隔部分包括细胞核、 核仁、核膜、高尔基体、内质网、线粒体、液泡、过氧物酶体、微管、 中心粒、核糖体、细胞膜和细胞壁。
35.如权利要求24的方法，其中通过涂片细胞试样从而在盘表面 上产生细胞单层来执行在盘表面上提供细胞试样的所述步骤。
36.如权利要求18的方法，其中所述交联剂与细胞表面上的低聚 糖结合。
37.如权利要求36的方法，其中所述交联剂是外源凝集素。
38.一种使用按照权利要求18、36或37的任一项制成的盘的方法； 所述使用方法包括以下步骤：
沉积包含白细胞的试样至通道中；
允许所述白细胞结合至所述俘获区内的所述交联剂；
从俘获区去除未结合细胞；
将盘载入光学读出器；
将电磁辐射入射束指向俘获区；
检测在与盘及盘表面上的细胞试样相互作用之后所形成的电磁 辐射束；
将所检测的电磁辐射束转换为输出信号；和
分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类 型相关的信息。
39.如权利要求38的方法，还包括使用吸收预定波长的光的染料 染色细胞试样的步骤。
40.如权利要求39的方法，其中所述预定波长等于和接近电磁辐 射束的波长。
相关专利申请的交叉引用
本申请是2001年11月20日提交序列号为09/988,728的美国专 利申请的部分连续。
本申请也要求对以下申请的优先权：2001年9月7日提交的序列 号为60/318,026；2001年9月11日提交的序列号为60/322,040；2001 年9月12日提交的序列号为60/322,863；2001年9月14日提交的序 列号为60/322,527；2001年10月3日提交的序列号为60/326,800；2002 年1月31日提交的序列号为60/353,300；2002年2月5日提交的序列 号为60/355,644；2002年2月19日提交的序列号为60/358,479；和2002 年3月12日提交的序列号为60/363,949的美国临时申请。这些申请的 全部内容以引用方式结合在本文中。
技术领域
本发明通常涉及生物检定和诊断检定，具体说来，涉及成像 (imaging)生物试样中的血细胞分析物的方法和设备。更具体地说，但 不限制下文参照最佳实施方式所说明的具体实施方式，本发明涉及利 用吸收预定波长的电磁辐射的染色剂(stain)结合光学生物盘基于白细 胞的细胞核的形态学识别并定量白细胞的方法。本发明可以结合以下 通常已知的共同待审批(co-pending)专利申请所公开的任何盘、检定和 系统被有利地采用：2001年7月3日提交的序列号为60/302,757的题 为“选择并检测包括诱导帮助剂/毒素抑制剂细胞的淋巴细胞的临床诊 断光学生物盘和相关方法”(Clinical Diagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection And Detection Of Lymphocytes Including Helper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells)的美国临时申 请；2001年7月17日提交的序列号为60/306,035的题为“包括免疫表 型的细胞分离和定型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月17日提交的序列号 为60/305,993的题为“免疫表型的俘获层部件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping)的美 国临时申请；2001年7月19日提交的序列号为60/306,592的题为“成 像血细胞、血载寄生虫和病原体和其它生物物质的方法以及相关光学 生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood Cells，Blood-borne Parasites and Pathogens，and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；和 2001年7月23日提交的序列号为60/307,263的题为“包括免疫表型的 细胞分离和定型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping) 的美国临时申请。所有这些申请通过引用结合在本文中。
背景技术
血细胞计数筛查(blood count screening)是一种常规临床检验，用 于正常和几种包括急性病或慢性病、受伤、已知amemia氏病 (amemia’s)、寄生虫病、脊髓病、白血病和使用肌肉抑制 (myolosuppressive)药物治疗的过程中的情况下。也作为保证外科手 术、输血的基线的常规检验或者作为某种条件的诊断或治疗的工具。 血细胞计数被用在诊断、治疗和后续病人跟踪过程中以确定病人的健 康状况。通过血细胞计数本身不能确定某人是否有淋巴瘤或其它疾病。 但是，这些值可以确定是否一切正常和是否需要进一步检验。
许多研究和诊断条件需要从细胞混合物中分离并分析特定细胞。 具体说来，源可以是血液、脊髓液、骨髓、肿瘤匀浆、淋巴组织等。 需要血液、脊髓液、骨髓、肿瘤组织、淋巴等的常规筛查以保证外科 手术、输血的基线，或者作为诊断、治疗的工具以确定病人的健康状 况。
血细胞计数也被用在诊断、治疗和后续病人跟踪过程中以确定病 人的健康状况。全血细胞计数(CBC)是一组包括血红蛋白、血球容量、 平均血球血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin)、平均血球血红蛋 白浓度、平均血球体积(mean corpuscular volume)、血小板计数、和 白细胞计数的检验。血细胞计数是每立方毫米全血的红细胞和白细胞 的计数。
白细胞计数(WBC，白细胞)是标准血样中的白细胞的总数。 在正常健康人中，通常WBC计数为每微升(μl)4000至10800个细胞。 锻炼、压力和疾病等因素可以影响该数值。高WBC可能指示感染、 白血病、或者组织损伤。当WBC数低于每微升1000细胞时有增加的 感染风险。
对于收集除从白细胞计数本身可获得的信息之外的信息而言，白 细胞鉴别检验(leukocyte differential testing)是必不可少的。白鉴别细 胞计数被用于评估新可疑感染和发烧(即使CBC正常)、与异常情况 相关的可疑疾病，异常情况包括异常白细胞数、可疑白血病、和其它 例如嗜曙红白细胞增多、单核细胞增多或嗜碱白细胞增多的异常情况。 可以在存在严重的白细胞减少症(例如药物治疗的并发症(secondary)) 的情况下执行白细胞或白细胞分类重复检验。在治疗过程中，例如在 化学疗法或放射疗法过程中，对确定是否治疗除癌细胞之外还消耗健 康血细胞而言，血细胞计数非常重要。由于化学疗法影响血细胞的制 造，因此检查血液中的各种细胞的数量很重要。
可以通过计算机化细胞计数设备确定鉴别白细胞数。这种设备确 定五种主要的白细胞的总数和百分比。在正常个体中，主要有中性白 细胞(50-60％)，其次是淋巴细胞(20-40％)，然后是单核细胞(2-9 ％)，和少量嗜曙红白细胞(1-4％)以及嗜碱白细胞(0.5-1％)。
由于反应或肿瘤反应可造成的增加的白细胞或者由于消耗或破 坏或骨髓移植可造成的减少的白细胞，WBC鉴别计数通常异常。可 以通过鉴别白细胞计数确定象中性白细胞减少(中性白细胞损失)、淋 巴细胞减少(淋巴细胞损失)、血小板增多(血小板耗尽，可能威胁生 命)。具体地在影响血细胞制造的化学疗法和放射疗法治疗过程中，鉴 别计数也给出血细胞计数的总图。
在淋巴细胞的分类中还有进一步的项目细胞。举例说来，淋巴细 胞可以大致被分为分别负责细胞促成性免疫(Cell-mediated immunity)和体液免疫的T细胞(胸腺衍生淋巴细胞)(thymus-derived lymphocytes)和B细胞(囊等价淋巴细胞)(bursal-equivalent lymphocytes)。虽然形态特征已经被用于分类白细胞，但是以及证明 形态本身不足以区分淋巴细胞项目的许多功能性。为了区分具有多种 功能的淋巴细胞，已经开发了多种技术，包括通过红细胞形成玫瑰花 结(resetting)分析、免疫荧光显微镜法(immuno-fluorescence microscopy)、酶组织化学以及最近的针对单一细胞表面标志的单克隆 抗体。
T细胞通常进一步被通过一种或两种例如CD4和CD8的主要细 胞表面抗原的存在而区分。CD4+型细胞指帮助剂T细胞并且涉及抗 体促成性免疫。这些T细胞结合至由B细胞递呈的抗原，并导致分泌 抗原材料的抗体的克隆浆细胞的产生。CD4+T细胞对细胞促成性免疫 而言也是必不可少的。应该理解CD4+T细胞结合至由例如巨噬细胞 和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APC)所递呈的抗原，并释放吸引其 它免疫系统至该区域的淋巴细胞活素。结果是炎症，和试图隔开并破 坏抗原材料的细胞及分子的集聚。
CD8+型T细胞指细胞毒素或杀伤细胞T细胞。这种T细胞分泌 破坏它们结合至的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为 CD8+T细胞在被感染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前 破坏被感染细胞。
CD4+和CD8+T细胞以及CD4+/CD8+T细胞的比率的计算对评 价有免疫受损(immune-compromised)疾病的病人的免疫健康状况很 有用。例如，人体免疫缺损病毒(HIV)是一种具有高CD4细胞表面 抗原亲和力的反向病毒，并且因此CD4+T细胞是该病毒的有效目标。 获得性免疫缺损综合症(AIDS)提供CD4+T细胞在免疫中的重要性 的清晰的不幸示例。随着该病的进展，CD4+T细胞的数量下降至它的 约每微升1000的正常范围以下，同时破坏被感染CD4+T细胞和/或被 感染CD4+细胞的病人的CD8+T细胞经历凋亡或细胞自杀。因此， CD4+比CD8+T细胞的比率可以被用作预后性指示。美国公众卫生署 建议每3-6个月监测所有被感染人的CD4+水平。
除了CD4和CD8，还有许多可以被用于确定淋巴细胞的项目的 其它细胞表面抗原(例如，CD3、CD16、CD19、CD45和CD56)。 通过抗体技术检测这些细胞表面抗原的能力已经为诊断病理学添加新 的维度，并且许多技术可用于研究血淋巴组织(hematolymphoid)的免 疫表型(例如，AIDS、白血病和淋巴瘤)。例如放射免疫测定(RIA)、 酶免疫鉴定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)之类的传统的微免疫测定 法(microimmunoassay)分别使用一种同位素、酶或荧光物质以检测 相应的与之特定反应的抗体或抗原存在或是不存在。
标准血样中的血小板数通常为每微升(μl)133,000至333,000个 血小板。血小板数过量被称作血小板增多。上述正常血小板数可以归 因于反应性反应或骨髓故障。反应性反应通常是由出血、感染、瘤形 成和骨髓增生异常(myeloproliferative disorder)导致的。骨髓故障通常 涉及被称作全血细胞减少症(pancytopenia)的血细胞的损失。另一方 面，减少的血小板数归因于免疫血小板减少症。如果血小板数低于 30,000发生血小板减少症，该病导致异常出血。血小板数低于5000 则认为危及生命。
通过市场上可买到的测量血红蛋白水平、血球容量、总白细胞和 红细胞数的手工和电子仪器完成CBC。变量可以包括血小板计数、白 鉴别细胞计数和细胞指数。血液分析仪为完全自动化，并且对于例如 CSF、胸膜液、腹水(ascetic fluid)、心包液等体液和误吸胃内容物 (gastric aspiration)中的细胞类型、细胞计数的结果很精确。
与现有的方法和系统相比，我们开发了一种成像并分析细胞及其 成分的简单、小型化、超灵敏、廉价的系统。这种系统使用光学生物 盘、相关检测部件、以及信息和信号处理方法和软件。
许多研究和诊断条件需要从细胞混合物中分离并分析特定细胞。 具体说来，源可以是血液、脊髓液、骨髓、肿瘤匀浆、淋巴组织等。 需要血液、脊髓液、骨髓、肿瘤组织、淋巴等的常规筛查以保证外科 手术、输血的基线，或者作为诊断、治疗的工具以确定病人的健康状 况。
血细胞计数也被用在诊断、治疗和后续病人跟踪过程中以确定病 人的健康状况。全血细胞计数(CBC)是一组包括血红蛋白、血球容量、 平均血球血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin)、平均血球血红蛋 白浓度、平均血球体积(mean corpuscular volume)、血小板计数、和 白细胞计数的检验。血细胞计数是每立方毫米全血的红细胞和白细胞 的计数。
白细胞计数(WBC，白细胞)是标准血样中的白细胞的总数。 在正常健康人中，通常WBC计数为每微升(μl)4000至10800个细胞。 锻炼、压力和疾病等因素可以影响该数值。高WBC可能指示感染、 白血病、或者组织损伤。当WBC数低于每微升1000细胞时有增加的 感染风险。
对于收集除从白细胞计数本身可获得的信息之外的信息而言，白 细胞鉴别检验(leukocyte differential testing)是必不可少的。白鉴别细 胞计数被用于评估新可疑感染和发烧(即使CBC正常)、与异常情况 相关的可疑疾病，异常情况包括异常白细胞数、可疑白血病、和其它 例如嗜曙红白细胞增多、单核细胞增多或嗜碱白细胞增多的异常情况。 可以在存在严重的白细胞减少症(例如药物治疗的并发症(secondary)) 的情况下执行白细胞或白细胞分类重复检验。在治疗过程中，例如在 化学疗法或放射疗法过程中，对确定是否治疗除癌细胞之外还消耗健 康血细胞而言，血细胞计数非常重要。由于化学疗法影响血细胞的制 造，因此检查血液中的各种细胞的数量很重要。
可以通过计算机化细胞计数设备确定鉴别白细胞数。这种设备确 定五种主要的白细胞的总数和百分比。在正常个体中，主要有中性白 细胞(50-60％)，其次是淋巴细胞(20-40％)，然后是单核细胞(2-9 ％)，和少量嗜曙红白细胞(1-4％)以及嗜碱白细胞(0.5-1％)。
由于反应或肿瘤反应可造成的增加的白细胞或者由于消耗或破 坏或骨髓移植可造成的减少的白细胞，WBC鉴别计数通常异常。可 以通过鉴别白细胞计数确定象中性白细胞减少(中性白细胞损失)、淋 巴细胞减少(淋巴细胞损失)、血小板增多(血小板耗尽，可能威胁生 命)。具体地在影响血细胞制造的化学疗法和放射疗法治疗过程中，鉴 别计数也给出血细胞计数的总图。
在淋巴细胞的分类中还有进一步的项目细胞。举例说来，淋巴细 胞可以大致被分为分别负责细胞促成性免疫(Cell-mediated immunity)和体液免疫的T细胞(胸腺衍生淋巴细胞)(thymus-derived lymphocytes)和B细胞(囊等价淋巴细胞)(bursal-equivalent lymphocytes)。虽然形态特征已经被用于分类白细胞，但是以及证明 形态本身不足以区分淋巴细胞项目的许多功能性。为了区分具有多种 功能的淋巴细胞，已经开发了多种技术，包括通过红细胞形成玫瑰花 结(resetting)分析、免疫荧光显微镜法(immuno-fluorescence microscopy)、酶组织化学以及最近的针对单一细胞表面标志的单克隆 抗体。
T细胞通常进一步被通过一种或两种例如CD4和CD8的主要细 胞表面抗原的存在而区分。CD4+型细胞指帮助剂T细胞并且涉及抗 体促成性免疫。这些T细胞结合至由B细胞递呈的抗原，并导致分泌 抗原材料的抗体的克隆浆细胞的产生。CD4+T细胞对细胞促成性免疫 而言也是必不可少的。应该理解CD4+T细胞结合至由例如巨噬细胞 和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APC)所递呈的抗原，并释放吸引其 它免疫系统至该区域的淋巴细胞活素。结果是炎症，和试图隔开并破 坏抗原材料的细胞及分子的集聚。
CD8+型T细胞指细胞毒素或杀伤细胞T细胞。这种T细胞分泌 破坏它们结合至的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为 CD8+T细胞在被感染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前 破坏被感染细胞。
CD4+和CD8+T细胞以及CD4+/CD8+T细胞的比率的计算对评 价有免疫受损(immune-compromised)疾病的病人的免疫健康状况很 有用。例如，人体免疫缺损病毒(HIV)是一种具有高CD4细胞表面 抗原亲和力的反向病毒，并且因此CD4+T细胞是该病毒的有效目标。 获得性免疫缺损综合症(AIDS)提供CD4+T细胞在免疫中的重要性 的清晰的不幸示例。随着该病的进展，CD4+T细胞的数量下降至它的 约每微升1000的正常范围以下，同时破坏被感染CD4+T细胞和/或被 感染CD4+细胞的病人的CD8+T细胞经历凋亡或细胞自杀。因此， CD4+比CD8+T细胞的比率可以被用作预后性指示。美国公众卫生署 建议每3-6个月监测所有被感染人的CD4+水平。
除了CD4和CD8，还有许多可以被用于确定淋巴细胞的项目的 其它细胞表面抗原(例如，CD3、CD16、CD19、CD45和CD56)。 通过抗体技术检测这些细胞表面抗原的能力已经为诊断病理学添加新 的维度，并且许多技术可用于研究血淋巴组织(hematolymphoid)的免 疫表型(例如，AIDS、白血病和淋巴瘤)。例如放射免疫测定(RIA)、 酶免疫鉴定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)之类的传统的微免疫测定 法(microimmunoassay)分别使用一种同位素、酶或荧光物质以检测 相应的与之特定反应的抗体或抗原存在或是不存在。
标准血样中的血小板数通常为每微升(μl)133,000至333,000个 血小板。血小板数过量被称作血小板增多。上述正常血小板数可以归 因于反应性反应或骨髓故障。反应性反应通常是由出血、感染、瘤形 成和骨髓增生异常(myeloproliferative disorder)导致的。骨髓故障通常 涉及被称作全血细胞减少症(pancytopenia)的血细胞的损失。另一方 面，减少的血小板数归因于免疫血小板减少症。如果血小板数低于 30,000发生血小板减少症，该病导致异常出血。血小板数低于5000 则认为危及生命。
通过市场上可买到的测量血红蛋白水平、血球容量、总白细胞和 红细胞数的手工和电子仪器完成CBC。变量可以包括血小板计数、白 鉴别细胞计数和细胞指数。血液分析仪为完全自动化，并且对于例如 CSF、胸膜液、腹水(ascetic fluid)、心包液等体液和误吸胃内容物 (gastric aspiration)中的细胞类型、细胞计数的结果很精确。
与现有的方法和系统相比，我们开发了一种成像并分析细胞及其 成分的简单、小型化、超灵敏、廉价的系统。这种系统使用光学生物 盘、相关检测部件、以及信息和信号处理方法和软件。
发明内容
本发明被设计为成像、识别和定量未染色/未标记、或染色/有标 记细胞。此外在本发明的优选实施方式中，细胞被利用包括红外染料 和荧光染料的对细胞核染色的染料染色，以增强细胞质与细胞核之间 的对比从而辅助它的识别。这也有助于试样中的正常和异常细胞的附 加信息和细节的可视化。与利用光学生物盘细胞成像相关的详细说明 被公开在2001年1月11日提交的序列号为60/260,761的题为“检测光 学盘部件的表面上的调查特征的方法和设备”(Methods and Apparatus for Detecting Investigational Features on a Surface of an Optical Disc Assembly)的美国临时申请；2001年1月18日提交的序 列号为60/262,532的题为“Disklab诊断平台”(Disk Diagnostic Platform)的美国临时申请；2001年2月20日提交的序列号为 60/270,095的题为“获得在光学盘部件的表面上所检测的调查特征的 信号签名的信号处理设备和方法”(Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signature of Investigational Features Detected on a surface of an Optical Disc Assembly)的美国临时申请； 和2001年5月18日提交的序列号为60/292,108的题为“获得在光学盘 部件的表面上所检测的调查特征的信号签名的信号处理设备和方法” (Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly)的美国临时申请。所有的这些申请的全部内 容通过引用结合在本文中。
本实验基于生物盘上和位于盘中的特定通道中的光学成像细胞 的原则。本测定可以在包括具有被固定至固相的特定俘获剂(capture agent)的流动室的生物盘中执行。
在光学生物盘上实施的鉴别细胞计数检验通过使用染料增强的 细胞的光散射性质识别血液或其它体液中的各种细胞。这种成像技术 利用光学生物盘也有助于血载(blood-borne)寄生虫和病原体的识别。 这些方法包括利用顶检测器、底检测器联合包括硬件计数器的事件计 数器或细胞计数器软件的CD型读出器中的微观分析或细胞检测。举 例说来，被用于细胞成像和计数的光学盘系统的有关细节被公开在通 常指定的2001年10月24日提交的序列号为60/335,123、2002年1 月28日提交的序列号为60/352,649、2002年1月30日提交的序列号 为60/353,739、2002年2月7日提交的序列号为60/355,09、2002年2 月14日提交的序列号为60/357,235的共同受让的待审批美国临时申请 中；所用这些专利申请均题为“生物驱动的分区检测器及相关方法” (Segmented Area Detector for BioDrive and Methods Relating Thereto)。所用这些申请的全部内容通过引用结合在本文中。
以一种即时、成本有效和技术相关的方法提供实施对例如血液、 脑脊髓液、唾液、结肠液(colonocytes)、或其它生物源之类的试样的 分析的改进的方法和设备。具体说来，有更容易、更有效的方法定量 各种类型的白细胞、或其它细胞类型、寄生虫、病原体和生物物质的 需求。本发明响应这种需求。此外，本发明涉及成像血细胞，执行鉴 别白细胞计数，和相关的处理方法和软件。
本发明的一方面是提供联合光学分析盘执行测定以检测并计数 细胞的方法和设备。本发明的另一方面是提供联合光学分析盘执行测 定以检测淋巴细胞的方法和设备。
如本发明的另一方面，提供一种方法，该方法包括在盘表面中或 上提供试样，该盘具有通过光学读出器可读的被编码信息。该信息可 以被用于控制读出器相对于盘的扫描。
本检测或测定可以两种方法被执行。第一种方法基于位于光学生 物盘上的特定通道中的血细胞的光学成像的原理。约5至20微升的全 血被注入盘上的特定设计的通道中。使用识别各种白细胞项目并产生 白鉴别细胞计数的细胞识别软件分析图像。第二种方法基于利用与特 定细胞相对的细胞特异抗体的特定细胞俘获。举例说来，在本方法的 一种具体实施方式中，抗体被对准淋巴细胞(CD2、CD19)、单核细胞 (CD14)、和嗜曙红白细胞(CD15)。这些白细胞项目特异抗体被装配/ 固定至包括流动室的生物盘内的固体表面。在另一实施方式中，俘获 抗体被对准具有感兴趣的特定表面标志的其它细胞。例如CD3、CD4、 CD8和CD45。
盘被载入光学读出器，并且来自辐射源的电磁辐射的入射束被指 向该盘。通过沿中心轴旋转盘并通过沿该轴线的径向移动入射束，该 电磁辐射束被扫描过该盘。被传送通过盘或从盘反射的一束电磁辐射 被检测并分析以提取该试样的信息特征。
本发明的实施方式也包括带有衬底的盘和被彼此隔开的盖以形 成室。一种材料试样，例如带有细胞的血液，被提供在该室中。当盘 被旋转时，试样移动通过俘获区。该俘获区包括带有抗体和结合至抗 原的其它特定结合配对的俘获层，抗原是感兴趣的细胞类型上的细胞 表面标志，例如CD4和CD8。最好一种检测可被用于成像血样中的 CD4和CD8以及其它抗原。如本发明的另一方面，提供盘读出器， 用以检测至俘获区所位于的观察窗的光线、并检测被传送和反射光以 识别并计数被俘获细胞。这些CD4和CD8计数，以及它们之间的比 率对监测例如AIDS之类的状况很有用。
试样最好被提供至盘内的室。单个室最好具有多个俘获区，每个 俘获区可以具有一个或更多抗体。在一种实施方式中，单个室具有多 个俘获区，各俘获区带有不同类型的抗体，并且可以具有起到控制区 作用的俘获区。这些俘获区可以被沿盘的一个或更多半径排列。检测 方法包括检测特征中的转变，或图形化观察窗并使用图像识别软件计 数被俘获细胞。计数可以是直接的，例如计数所要求的细胞；或者间 接的，例如计数所要求和非所要求细胞的集合，计数非所要求细胞， 并减去以获得所要求细胞的计数。俘获区可以具有一层或更多层抗体。
当细胞试样被提供至盘时，盘可以被以一个或更多步骤旋转以移 动细胞至俘获区，然后使非结合细胞运动离开俘获区。可以通过其它 方法处理该试样，例如，使用被用于检测的光源培育(incubation) 或加热。微射流技术可以被用于添加染色剂或试样的盘上处理可能所 需的其它液体。本处理最好被指定在信息存储区中的盘上的被编码信 息中。被存储信息可以被有利地采用以导致驱动器和读出器以所需速 度旋转所需时间，带有其它中间步骤，例如培育。
微技术在临床诊断中特别有用，以识别细胞类型、寄生虫、病原 体和其它生物物质。本发明利用微技术执行光学生物盘上的全血中的 分类白细胞计数。此外，本发明涉及成像血细胞、执行分类白细胞计 数、和相关处理方法及软件。
如本发明的另一检测或测定可以至少两种方法被执行。第一种方 法基于位于光学生物盘上的特定通道中的血细胞的光学成像的原理。 约5至20微升的全血被注入盘上的特定设计的通道中。使用识别各种 白细胞项目并产生白鉴别细胞计数的细胞识别软件分析图像。第二种 方法基于利用与特定细胞相对的细胞特异抗体的特定细胞俘获。举例 说来，在本具体实施方式中，抗体被对准淋巴细胞(CD2、CD19)、单 核细胞(CD14)、和嗜曙红白细胞(CD15)。这些白细胞项目特异抗体 被装配/固定至包括流动室的生物盘内的固体表面。
一种生物盘驱动部件被用来旋转生物盘、读并处理存储在盘上的 被编码信息、并分析生物盘的流动室中的细胞俘获区。生物盘驱动器 拥有旋转生物盘的电动机、控制盘的旋转速度的控制器、处理盘的返 回信号的处理器、和分析被处理信号的分析仪。该旋转速度可变并且 可以同时关于速度、旋转时间和旋转方向被紧密控制。生物盘也可以 被用于在流动室和目标区中的试验材料被驱动器的读光束询问和被分 析仪分析之前、之中或之后写信息至生物盘。生物盘可以包括被编码 信息，以控制盘的旋转，提供与将被执行的免疫型测定的类型相对应 的处理信息，并在与生物驱动器相联系的监视器上显示结果。
通常细胞鉴别计数规程(protocols)，具体说来白细胞鉴别计数规 程被采用CD、CD-R、或DVD格式、这些格式的修改版和其它格式。 驱动器的读或询问光束检测分析试样中的各种细胞并产生可以使用细 胞鉴别计数软件分析的图像。
显微镜法或复杂细胞计数对执行这些乏味和费力的细胞计数测 定而言必不可少。本方法使用光学生物盘和相关部件。产生分析室中 自由的各种白细胞子类或被特异抗体方法俘获的白细胞子类的光学图 像，并通过由它们的散射性质识别血液或其它体液中的各种细胞成分 的细胞识别软件程序分析图像。在入射束与感兴趣试样之间的光/物质 相互作用之后，检测回光。处理所检测的回光信号以提供可辨别信号 签名或数字ID。虽然现有技术通常需要准备例如细胞染色、RBC消 除、或其它费力的规程，本方法的实施方式不需要任何试样预处理。 这些方法包括使用顶检测器、底检测器、事件计数器或细胞计数器的 CD型或光学盘读出器中的显微分析或细胞检测。
如本发明的一方面，可以采用细胞核、染色体、活体、红外、和 荧光染料增强细胞质与细胞核之间的对比。在本发明的一种优选实施 方式中，IRDye38(LI-COR Inc.，Lincoln，NE)、IR-780碘化物 (Sigma-Aldrich)、Streptavidin Laser Pro和TO-PRO-5碘化物 (Molecular Probes，Eugene，OR)、和dd-007红外染料被用于标记细 胞核。该染色方法有助于基于细胞核的形状显示并识别各种细胞类型。 有关使用光学生物盘成像细胞的详细说明被在2001年5月22日提交 的题为“光学生物盘的盘驱动部件”的第60/293,093号美国临时申请中 公开，该申请通过引用结合在本文中。
以下段落提供如本发明被指向生物盘制造的具体优选实施方式 的基本方法步骤的总结。
盘制备：金反射盘或透射盘被使用气枪清洁以去除灰尘颗粒。利 用旋涂装置，使用异丙醇冲洗该盘两次。2％的聚苯乙烯被旋涂在盘上 以给定非常厚的全涂层。
化学沉积：一种实施方式包括的三步沉积规程：抗生蛋白链菌素， 培育30分钟；生物素基化的原发抗体培育60分钟；和继发俘获抗体 培育30分钟。所有这些步骤在潮湿室中于室温下利用沉积之间的严格 的冲洗和干燥步骤被完成。
简言之，1μl的密度为1mg/ml的磷酸盐缓冲盐水中的抗生蛋白 链菌素被涂在各窗上并培育30分钟。过量的抗生蛋白链菌素被利用蒸 馏水冲洗掉并且盘被烘干。通过组合等量的生物素基化的lgG(PBS 中125μg/ml)和醛活化葡聚糖(200μg/ml)，制备生物素基化的lgG 葡聚糖(lg-G-dextran)合成物。在各俘获窗口中葡聚糖-醛生物素基 化的lgG合成物被涂在抗生蛋白链菌素上并在制冷机中培育60分钟或 整夜。过量的试剂被冲洗掉并且盘被旋干。通过将俘获抗体涂在生物 盘槽上的指定位置上，产生特定的条码俘获图像。对鉴别计数而言， 举例说来，抗中性白细胞(CD128或其它)、抗淋巴细胞(CD2、CD19、 CD56及其它)、抗嗜曙红白细胞(CD15)、抗单核细胞(CD14)、抗 嗜碱白细胞(CD63)、和抗血小板(CD32和CD151)的抗体被涂在 各槽的指定位置处。下表1列出俘获层部件的俘获图案的变化的示例。 在制冷机中培育30分钟或整夜。使用25μm、50μm、或100μm(50μm 通道需要25μm时所需的试样体积的两倍)直、U形或其它通道格式 的通道和保护层盘(用于与顶检测器使用)或反射层盘(用于与底检 测器使用)装配盘。
表1
俘获层组件和变化 窗口 1 2 3 4 5 6 第一层 (活性 层) 聚苯乙 烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 第二层 抗生蛋白链菌 素 抗生蛋白 链菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白 链菌素 继发抗体 B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCH O 原发抗体 参考点 (referen ce dot) 淋巴细胞特异 抗体 中性白细 胞特异抗 体 嗜曙红白细 胞特异抗体 嗜碱白细胞 特异抗体 单核细胞 特异抗体
盘泄漏检查和阻断不必要细胞的非特异结合：由于分析血液，一 种生物危险性材料，作为本发明的质量控制制造方面的一部分，检查 盘的泄漏以确保在盘与原位试样自旋过程中没有室泄漏。最好使用 StabilGuard、一种商业可用阻断剂填充各通道，并阻断一小时。盘被 以5000rpm旋转5分钟并检测泄漏和盘稳定性。在检测泄漏之后，盘 被放在真空室中24小时。真空处理之后，使用PBS缓冲剂填充的室 或空室被放置在真空袋中并储存在制冷机中直至使用。
从全血中分离白细胞层：通过以2800rpm离心处理离心管中的 去纤维蛋白静脉血25分钟制备白细胞层。使用细吸管小心去除上清血 浆。然后用吸管吸取下面的包含白细胞和血小板的白细胞层。不做离 心处理的情况下从血液中获得白细胞层的另一方法是使用例如凝血因 子、葡聚糖、阿拉伯树胶、水溶性聚蔗糖(Ficoll)、或纤维素甲醚之 类的沉淀增强剂允许血液沉淀。Boyum氏(Boyum’S)试剂(纤维素 甲醚和甲泛影钠)特别适合用于获得无任何红细胞污染的白细胞制备。 另外，淋巴细胞可以通过正或负选择、或溶解方法被从全血中分离。
对基础技术(base technology)的盘说明的分析：白细胞鉴别计数 检测的一种优选实施方式包括三独立部件，(1)包括化学物质的基盘， (2)通道层，和(3)盖盘。
最好被在PBS中稀释的白细胞层或全血，被注入盘室，室的入 口和出口被使用胶带密封，并且盘最好在室温下被培育所需时间。对 第一种方法而言，使用带有顶和底检测器的光学驱动器的标准780nm 激光扫描盘上的给定区域(例如，面积为1平方毫米)。举例说来，由 专利受让人开发并公开在2002年3月12日提交的题为“包含白细胞的 细胞鉴别计数的方法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”的 第60/363,949号美国临时申请和2002年8月21日提交的题为“包括执 行细胞鉴别计数的相关设备和软件的细胞鉴别计数方法”的第 60/404,921号美国临时专利中的相关细胞识别软件根据最好等于1平 方毫米的被俘获图像，自动给出鉴别计数。对第二种方法而言，举例 说来，使用标准780nm激光扫描盘以成像可以包括淋巴细胞、中性白 细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红白细胞、单核细胞和血小板的俘获区。由 专利受让人开发的细胞识别软件自动执行以下程序：(a)离心盘以旋 转分离过量的非结合细胞，(b)成像特定区域和特定俘获区，和(c) 数据处理，数据处理包括计数在各俘获区中的具体被俘获细胞和得出 白细胞的不同子类的数量。
在处理步骤中，识别软件沿各俘获区读数并对所遇到的细胞标 记。在处理各俘获区的数据之后，该软件显示每微升体积区域的血液 中的淋巴细胞、中性白细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红白细胞、单核细胞 和血小板的数量。从将盘插入光学驱动器到显示感兴趣结果的整个过 程需要大约10-15分钟。
与本发明联系的相关公开内容也被发布在2001年7月23日提交 的序列号为60/307,262的题为“免疫表型的俘获层部件和光学生物盘” (Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列 号为60/307,264的题为“成像血细胞、血载寄生虫和病原体和其它生物 物质的方法以及相关光学生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood Cells Blood-Borne Parasites and Pathogens，and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列号为 60/307,562的题为“包含光学成像并定量评价包括淋巴细胞的血细胞 的射流电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical ImagIng and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；和2001年7月24日 提交的序列号为60/307,487的题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方 法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Blo-Disc for Performing Same)的美国临时申请中，所有这些申请通 过引用结合在本文中。
以下段落提供如本发明的某种具体优选实施方式的盘说明的主 要元素的总结。
跟踪设计：在本发明的一种优选实施方式中，盘是一种涂有 300nm金的前摆动部件(forward Wobble Set)FDL21：13707或 FDL21：1207。在此反射盘上，通过光刻技术蚀刻出尺寸为2×1mm的 椭圆形数据窗口。“U”形通道被用于产生高度为25μm的室。大约需 要7μl的试样填充包括入口和出口的整个室。最好可以使用一种4窗 口/4通道格式。但是在透射盘上，没有蚀刻数据窗口，并且整个盘可 用。
粘合剂和结合：在一种优选实施方式，包括本“U”形射流电路的 粘合剂和通道层被由Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661制成。 或者，直通道被用于产生该室。
盖盘：完全反射性的具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm 等距处的试样入口的透明盘(clear disc)，被用于本盘部件的一种具体 实施方式中。
数据俘获和处理：利用专利受让人的细胞识别软件，使用该软件 以最好X4的速度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
软件：本发明还包括处理方法和相关细胞识别及成像软件。该软 件被指向执行并显示细胞计数和细胞鉴别计数。本软件可以存储在光 学生物盘栅、光学盘驱动读数设备中、或仅被安全服务器的光学读出 器可访问。该服务器可以计算网络被实施，例如局域网(LAN)、广 域网(WAN)、或通过互联网在指定条件下可用。这种分布方法被公 开在通常指定的2000年11月8日提交的序列号为60/246,824的题为 “分析生物样本和利用特殊制备的生物光学盘、光学盘驱动器和互联网 连接处理相关医疗信息的交互方法和系统”(Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc， Optical Disk Drive，and Interent Connections)的美国临时申请和2001 年11月7日提交的序列号为09/986,078的题为“分析生物样本并处理 相关信息的交互系统及其使用”(Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof)的相关美国专利申请中，这两个申请通过引用结合在本文中。
材料：用于实施本文所公开的不同优选实施方式的材料包括前摆 动金金属化光致抗蚀剂盘、透射性金金属化盘、吸管和喷嘴(tip)、 旋涂器、离心机、转位式转子(swing-out rotor)、带有例如柠檬酸钠或 乙二胺四乙酸(EDTA)之类的抗凝血剂的VacutainerTM CPT管、潮湿 室、盘压(disc press)、粘合剂、盖盘、透明盖盘胶带或等价物、真 空装置、黄喷嘴(yellow tip)和真空室。
试剂：执行如本发明的某种方法的细胞计数中所采用的试剂包括 磷酸盐缓冲盐水、异丙醇、蒸馏水和StabilGuard。
本发明的一个目的是克服已知技术中的限制。本发明的另一目的 是采用已知的光学盘系统执行光学生物盘上的全血中的白细胞鉴别计 数。本发明的另一目的是成像血细胞并执行白细胞鉴别计数。
本发明有关的技术方面也在以下申请中做出说明：2001年7月 24日提交的序列号为60/307,489的题为“包含执行细胞计数的微射流 电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell counts)的美国临时申请；2001年7月 25日提交的序列号为60/307,825的题为“使用包括肝素、血浆、和聚 赖氨酸等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异结合的方法” (Methods for Reduing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请；2001年7月25日提交的序列号为 60/307,762的题为“使用阻断剂减少光学生物盘上的细胞非特异结合 的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Biding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents)的美国临时申请；2001 年7月25日提交的序列号为60/307,764的题为“使用聚乙烯醇减少射 流室中的气泡的方法和在光学生物盘中获得相同效果的相关技术” (Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年7月27日提交的序列号 为60/308,214的题为“光学分析盘部件内的危险生物材料的容器的密 封方法”(Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies)的美国临时申请； 和2001年7月27日提交的序列号为60/308,197的题为“使用光学生物 盘平台计算帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的定性和定量比率 的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请，所有这些申请的全部内 容通过引用结合在本文中。
本发明还指向使用吸收预定波长的入射光的染料对细胞核染色， 并使用光学盘系统成像这些细胞以根据这些细胞核的形态识别并定量 试样中的各种细胞类型。
更具体地说，本发明涉及一种采用光学盘和盘驱动器执行测定的 方法。本方法包括以下步骤：(1)在盘中的室中的盘表面上提供细胞 试样，该室包括至少一个带有俘获剂的俘获区，(2)将盘载入光学读 出器中，(3)旋转光学盘，(4)将电磁辐射入射束指向俘获区，(5) 检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，(6)将所检 测光束转换为输出信号，和(7)分析该输出信号以提取与在俘获区处 所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。
如本发明的另一方面，提供一种接收试样的光学盘和驱动系统。 该系统为包括衬底、平行于衬底的盖和在盖与包含俘获区的衬底之间 限定的室的盘。俘获层被定位在衬底上的俘获区处。第一俘获区具有 第一细胞俘获剂而第二俘获区具有第二细胞俘获剂。本系统还包括将 光指向盘的俘获区处的光源、检测从盘俘获区反射和透射的光并提供 信号的检测器、和使用该信号区分被俘获细胞核并计数被结合至俘获 分子的试样中的项目的处理器。
按照本发明的另一方面，提供一种采用光学盘和盘驱动器执行白 细胞计数的方法。这种具体方法包括以下步骤：(1)在第一试管中提供血 样，第一试管包含一种分离梯度，(2)以足以将血样分离为层的时间 和速度旋转第一试管，和(3)从被分离血样中分离白细胞层。本具体 方法以以下步骤继续：(4)再悬浮白细胞层从而形成白细胞悬浮液， (5)在光学盘表面上提供白细胞悬浮液的试样，表面包括至少一个带 有至少一种俘获剂的俘获区，(6)将光学盘载入光学读出器中，和(7) 旋转光学盘。然后本方法继续以下步骤：(8)将电磁辐射入射束指向 俘获区，(9)检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束， (10)将所检测光束转换为输出信号，和(11)分析该输出信号以提 取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。在一种具体 实施方式中，本方法可以包括以下附加步骤：将白细胞试样导入俘获 剂的附近，在俘获剂存在的情况下培育细胞，允许细胞特别结合至俘 获剂，和使用在电磁辐射束的波长处或附近吸收的染料对细胞核染色。
在上述具体实施方式中，本发明还包括分析特定类型的被俘获细 胞的数量从而确定试样中的特定细胞类型的浓度的步骤。在本方法中 分析被俘获细胞核的形态的步骤可以包括检测从盘反射和透射的光的 水平的变化。本方法也包括使用图像识别以通过细胞核形态以例如从 另一类型的白细胞核区分一种细胞核而区分细胞类型从而计数特定细 胞类型的细胞数量的步骤。用于细胞染色的染料可以被用于增强图像 识别。这些染料可以包括活体染料、荧光染料、红外和近红外染料。 活体染料可以是Leishman氏染料、吖啶橙或Zynostain。此外，旋转 光学盘的步骤可以包括以足够的速度旋转盘足够的时间周期以使细胞 具有与至少一俘获剂结合的机会。此旋转步骤还包括以足够的速度旋 转盘足够的时间周期以使未结合细胞被从俘获区移开。本步骤可以单 速度或多速度被完成。本具体方法也可以包括计数各俘获区中的被俘 获细胞并提供包括细胞计数的输出的步骤。
按照本发明的另一方面，提供制造根据细胞核形态区分细胞类型 执行白细胞鉴别计数的光学分析盘的另一方法。本方法包括以下步骤： 提供衬底，使用活性层涂覆衬底，在该活性层上提供交联剂从而产生 一个或更多俘获区，允许交联剂结合至活性层，从俘获区去除过量交 联剂，和将盖部分固定至活性层以形成适于接收细胞悬浮液和染色被 俘获细胞核的染料溶液的通道。本方法中所用的交联剂可以与细胞表 面上的低聚糖(oligossacharides)结合。该交联剂可以是外源凝集素。
如本发明的另一方面，提供一种使用如上述方法所制成的盘的方 法。使用预制盘的本具体方法包括以下步骤：沉积包含白细胞的试样 至通道中，允许白细胞结合至俘获区内的交联剂，从俘获区去除未结 合细胞，和将盘载入光学读出器。使用预制盘的本方法还包括以下步 骤：将电磁辐射入射束指向俘获区，检测在与盘及盘表面上的细胞试 样相互作用之后所形成的电磁辐射束，将所检测光束转换为输出信号， 和分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类型相 关的信息。本方法还涉及使用吸收预定波长的光的染料染色细胞试样 的步骤，其中预定波长等于和接近电磁辐射束的波长。
如本发明的另一方面，也公开分析试样中的白细胞的另一方法。 本方法涉及以下步骤：(1)将多个白细胞载入光学生物盘中，(2)通过 使用具有特定细胞表面标记特性的俘获剂俘获指定目标区中的白细 胞，(3)使用染料染色被俘获白细胞的细胞核，(4)将入射束指向被 俘获白细胞，和(5)允许入射束与被俘获白细胞的被染色细胞核相互 作用从而形成携带与细胞核的形态有关的信息的返回光束。本方法还 涉及以下步骤：(6)检测返回光束，(7)将所检测返回光束转换为输 出信号，和(8)分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的 细胞核形态相关的信息。本发明中所用的染料可以包括活性、活性细 胞核、细胞核、DNA、染色体、荧光、红外、近红外、UV、和可见 光染料。本具体方法也包括计数特定类型的被俘获白细胞的数量的步 骤，其中特定类型的白细胞包括中性白细胞、单核细胞、淋巴细胞、 嗜曙红白细胞、和嗜碱白细胞。本方法也涉及被用于执行如本方法的 白细胞分析的光学生物盘的使用。
如本发明的另一方面，提供一种执行采用光学盘及盘驱动器的分 析的方法，本方法包括以下步骤：在盘表面上提供细胞试样，将盘载 入光学读出器中，旋转光学盘，将电磁辐射入射束指向俘获区，检测 在与盘和盘表面上的细胞试样相互作用之后所形成的电磁辐射束，将 所检测光束转换为输出信号；和分析该输出信号以提取与在俘获区处 所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。本方法还包括使用吸收预定 波长的光的染料染色细胞试样的步骤，其中预定波长等于和接近电磁 辐射束的波长并且染料吸收红外光谱范围内的光。染料可以吸收近红 外、红外(IR)、紫外线(UV)、和可见光谱(VIS)范围的光。此外， 电磁辐射束的波长可以在染料吸收波长的10nm范围内。用于染色细 胞的染料可以包括，例如LI-COR IRDye38、TO-PRO-5碘化物、IR-780 碘化物、激光Pro IR、dd-007、Zynostain、艾杜酞菁绿(idocyanine green)、铜酞菁、3，3’-二乙基噻三羰花青(diethylthiatricarbocyanine) 碘化物(DTTCI)、3，3’-二乙基噁三羰花青(diethyloxatricarbocyanine) 碘化物(DOTCI)、3，3’-二乙基噻二羰花青 (diethylthiadicarbocyanine)碘化物(DTDCI)、和3，3’-二乙基噁二羰 花青(diethyloxadicarbocyanine)碘化物(DODCI)。这些染料可以被设 定为盘表面上的细胞试样的特定标记预定分隔部分(compartment)，包 括但不限于细胞核、核仁、核膜、高尔基体、内质网、线粒体、液泡、 过氧物酶体、微管、中心粒、核糖体、细胞膜和细胞壁。此外，可以 通过涂片细胞试样从而在盘表面上产生细胞单层执行提供盘表面上的 细胞试样的步骤。
上述方法和设备可以具有一个或更多优点，这些优点包括但不限 于不需要有经验的技术员执行试验的情况下简单快速盘上处理、小样 本量、使用廉价材料、和使用已知光学盘格式及驱动器制造。通过参 照以下联系附图及技术实施例的详细说明，将更好地理解这些及其它 特征和优点。
本实验基于生物盘上和位于盘中的特定通道中的光学成像细胞 的原则。本测定可以在包括具有被固定至固相的特定俘获剂(capture agent)的流动室的生物盘中执行。
在光学生物盘上实施的鉴别细胞计数检验通过使用染料增强的 细胞的光散射性质识别血液或其它体液中的各种细胞。这种成像技术 利用光学生物盘也有助于血载(blood-borne)寄生虫和病原体的识别。 这些方法包括利用顶检测器、底检测器联合包括硬件计数器的事件计 数器或细胞计数器软件的CD型读出器中的微观分析或细胞检测。举 例说来，被用于细胞成像和计数的光学盘系统的有关细节被公开在通 常指定的2001年10月24日提交的序列号为60/335,123、2002年1 月28日提交的序列号为60/352,649、2002年1月30日提交的序列号 为60/353,739、2002年2月7日提交的序列号为60/355,09、2002年2 月14日提交的序列号为60/357,235的共同受让的待审批美国临时申请 中；所用这些专利申请均题为“生物驱动的分区检测器及相关方法” (Segmented Area Detector for BioDrive and Methods Relating Thereto)。所用这些申请的全部内容通过引用结合在本文中。
以一种即时、成本有效和技术相关的方法提供实施对例如血液、 脑脊髓液、唾液、结肠液(colonocytes)、或其它生物源之类的试样的 分析的改进的方法和设备。具体说来，有更容易、更有效的方法定量 各种类型的白细胞、或其它细胞类型、寄生虫、病原体和生物物质的 需求。本发明响应这种需求。此外，本发明涉及成像血细胞，执行鉴 别白细胞计数，和相关的处理方法和软件。
本发明的一方面是提供联合光学分析盘执行测定以检测并计数 细胞的方法和设备。本发明的另一方面是提供联合光学分析盘执行测 定以检测淋巴细胞的方法和设备。
如本发明的另一方面，提供一种方法，该方法包括在盘表面中或 上提供试样，该盘具有通过光学读出器可读的被编码信息。该信息可 以被用于控制读出器相对于盘的扫描。
本检测或测定可以两种方法被执行。第一种方法基于位于光学生 物盘上的特定通道中的血细胞的光学成像的原理。约5至20微升的全 血被注入盘上的特定设计的通道中。使用识别各种白细胞项目并产生 白鉴别细胞计数的细胞识别软件分析图像。第二种方法基于利用与特 定细胞相对的细胞特异抗体的特定细胞俘获。举例说来，在本方法的 一种具体实施方式中，抗体被对准淋巴细胞(CD2、CD19)、单核细胞 (CD14)、和嗜曙红白细胞(CD15)。这些白细胞项目特异抗体被装配/ 固定至包括流动室的生物盘内的固体表面。在另一实施方式中，俘获 抗体被对准具有感兴趣的特定表面标志的其它细胞。例如CD3、CD4、 CD8和CD45。
盘被载入光学读出器，并且来自辐射源的电磁辐射的入射束被指 向该盘。通过沿中心轴旋转盘并通过沿该轴线的径向移动入射束，该 电磁辐射束被扫描过该盘。被传送通过盘或从盘反射的一束电磁辐射 被检测并分析以提取该试样的信息特征。
本发明的实施方式也包括带有衬底的盘和被彼此隔开的盖以形 成室。一种材料试样，例如带有细胞的血液，被提供在该室中。当盘 被旋转时，试样移动通过俘获区。该俘获区包括带有抗体和结合至抗 原的其它特定结合配对的俘获层，抗原是感兴趣的细胞类型上的细胞 表面标志，例如CD4和CD8。最好一种检测可被用于成像血样中的 CD4和CD8以及其它抗原。如本发明的另一方面，提供盘读出器， 用以检测至俘获区所位于的观察窗的光线、并检测被传送和反射光以 识别并计数被俘获细胞。这些CD4和CD8计数，以及它们之间的比 率对监测例如AIDS之类的状况很有用。
试样最好被提供至盘内的室。单个室最好具有多个俘获区，每个 俘获区可以具有一个或更多抗体。在一种实施方式中，单个室具有多 个俘获区，各俘获区带有不同类型的抗体，并且可以具有起到控制区 作用的俘获区。这些俘获区可以被沿盘的一个或更多半径排列。检测 方法包括检测特征中的转变，或图形化观察窗并使用图像识别软件计 数被俘获细胞。计数可以是直接的，例如计数所要求的细胞；或者间 接的，例如计数所要求和非所要求细胞的集合，计数非所要求细胞， 并减去以获得所要求细胞的计数。俘获区可以具有一层或更多层抗体。
当细胞试样被提供至盘时，盘可以被以一个或更多步骤旋转以移 动细胞至俘获区，然后使非结合细胞运动离开俘获区。可以通过其它 方法处理该试样，例如，使用被用于检测的光源培育(incubation) 或加热。微射流技术可以被用于添加染色剂或试样的盘上处理可能所 需的其它液体。本处理最好被指定在信息存储区中的盘上的被编码信 息中。被存储信息可以被有利地采用以导致驱动器和读出器以所需速 度旋转所需时间，带有其它中间步骤，例如培育。
微技术在临床诊断中特别有用，以识别细胞类型、寄生虫、病原 体和其它生物物质。本发明利用微技术执行光学生物盘上的全血中的 分类白细胞计数。此外，本发明涉及成像血细胞、执行分类白细胞计 数、和相关处理方法及软件。
如本发明的另一检测或测定可以至少两种方法被执行。第一种方 法基于位于光学生物盘上的特定通道中的血细胞的光学成像的原理。 约5至20微升的全血被注入盘上的特定设计的通道中。使用识别各种 白细胞项目并产生白鉴别细胞计数的细胞识别软件分析图像。第二种 方法基于利用与特定细胞相对的细胞特异抗体的特定细胞俘获。举例 说来，在本具体实施方式中，抗体被对准淋巴细胞(CD2、CD19)、单 核细胞(CD14)、和嗜曙红白细胞(CD15)。这些白细胞项目特异抗体 被装配/固定至包括流动室的生物盘内的固体表面。
一种生物盘驱动部件被用来旋转生物盘、读并处理存储在盘上的 被编码信息、并分析生物盘的流动室中的细胞俘获区。生物盘驱动器 拥有旋转生物盘的电动机、控制盘的旋转速度的控制器、处理盘的返 回信号的处理器、和分析被处理信号的分析仪。该旋转速度可变并且 可以同时关于速度、旋转时间和旋转方向被紧密控制。生物盘也可以 被用于在流动室和目标区中的试验材料被驱动器的读光束询问和被分 析仪分析之前、之中或之后写信息至生物盘。生物盘可以包括被编码 信息，以控制盘的旋转，提供与将被执行的免疫型测定的类型相对应 的处理信息，并在与生物驱动器相联系的监视器上显示结果。
通常细胞鉴别计数规程(protocols)，具体说来白细胞鉴别计数规 程被采用CD、CD-R、或DVD格式、这些格式的修改版和其它格式。 驱动器的读或询问光束检测分析试样中的各种细胞并产生可以使用细 胞鉴别计数软件分析的图像。
显微镜法或复杂细胞计数对执行这些乏味和费力的细胞计数测 定而言必不可少。本方法使用光学生物盘和相关部件。产生分析室中 自由的各种白细胞子类或被特异抗体方法俘获的白细胞子类的光学图 像，并通过由它们的散射性质识别血液或其它体液中的各种细胞成分 的细胞识别软件程序分析图像。在入射束与感兴趣试样之间的光/物质 相互作用之后，检测回光。处理所检测的回光信号以提供可辨别信号 签名或数字ID。虽然现有技术通常需要准备例如细胞染色、RBC消 除、或其它费力的规程，本方法的实施方式不需要任何试样预处理。 这些方法包括使用顶检测器、底检测器、事件计数器或细胞计数器的 CD型或光学盘读出器中的显微分析或细胞检测。
如本发明的一方面，可以采用细胞核、染色体、活体、红外、和 荧光染料增强细胞质与细胞核之间的对比。在本发明的一种优选实施 方式中，IRDye38(LI-COR Inc.，Lincoln，NE)、IR-780碘化物 (Sigma-Aldrich)、Streptavidin Laser Pro和TO-PRO-5碘化物 (Molecular Probes，Eugene，OR)、和dd-007红外染料被用于标记细 胞核。该染色方法有助于基于细胞核的形状显示并识别各种细胞类型。 有关使用光学生物盘成像细胞的详细说明被在2001年5月22日提交 的题为“光学生物盘的盘驱动部件”的第60/293,093号美国临时申请中 公开，该申请通过引用结合在本文中。
以下段落提供如本发明被指向生物盘制造的具体优选实施方式 的基本方法步骤的总结。
盘制备：金反射盘或透射盘被使用气枪清洁以去除灰尘颗粒。利 用旋涂装置，使用异丙醇冲洗该盘两次。2％的聚苯乙烯被旋涂在盘上 以给定非常厚的全涂层。
化学沉积：一种实施方式包括的三步沉积规程：抗生蛋白链菌素， 培育30分钟；生物素基化的原发抗体培育60分钟；和继发俘获抗体 培育30分钟。所有这些步骤在潮湿室中于室温下利用沉积之间的严格 的冲洗和干燥步骤被完成。
简言之，1μl的密度为1mg/ml的磷酸盐缓冲盐水中的抗生蛋白 链菌素被涂在各窗上并培育30分钟。过量的抗生蛋白链菌素被利用蒸 馏水冲洗掉并且盘被烘干。通过组合等量的生物素基化的lgG(PBS 中125μg/ml)和醛活化葡聚糖(200μg/ml)，制备生物素基化的lgG 葡聚糖(lg-G-dextran)合成物。在各俘获窗口中葡聚糖-醛生物素基 化的lgG合成物被涂在抗生蛋白链菌素上并在制冷机中培育60分钟或 整夜。过量的试剂被冲洗掉并且盘被旋干。通过将俘获抗体涂在生物 盘槽上的指定位置上，产生特定的条码俘获图像。对鉴别计数而言， 举例说来，抗中性白细胞(CD128或其它)、抗淋巴细胞(CD2、CD19、 CD56及其它)、抗嗜曙红白细胞(CD15)、抗单核细胞(CD14)、抗 嗜碱白细胞(CD63)、和抗血小板(CD32和CD151)的抗体被涂在 各槽的指定位置处。下表1列出俘获层部件的俘获图案的变化的示例。 在制冷机中培育30分钟或整夜。使用25μm、50μm、或100μm(50μm 通道需要25μm时所需的试样体积的两倍)直、U形或其它通道格式 的通道和保护层盘(用于与顶检测器使用)或反射层盘(用于与底检 测器使用)装配盘。
表1
俘获层组件和变化 窗口 1 2 3 4 5 6 第一层 (活性 层) 聚苯乙 烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚苯乙烯 第二层 抗生蛋白链菌 素 抗生蛋白 链菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白 链菌素 继发抗体 B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCH O 原发抗体 参考点 (referen ce dot) 淋巴细胞特异 抗体 中性白细 胞特异抗 体 嗜曙红白细 胞特异抗体 嗜碱白细胞 特异抗体 单核细胞 特异抗体
盘泄漏检查和阻断不必要细胞的非特异结合：由于分析血液，一 种生物危险性材料，作为本发明的质量控制制造方面的一部分，检查 盘的泄漏以确保在盘与原位试样自旋过程中没有室泄漏。最好使用 StabilGuard、一种商业可用阻断剂填充各通道，并阻断一小时。盘被 以5000rpm旋转5分钟并检测泄漏和盘稳定性。在检测泄漏之后，盘 被放在真空室中24小时。真空处理之后，使用PBS缓冲剂填充的室 或空室被放置在真空袋中并储存在制冷机中直至使用。
从全血中分离白细胞层：通过以2800rpm离心处理离心管中的 去纤维蛋白静脉血25分钟制备白细胞层。使用细吸管小心去除上清血 浆。然后用吸管吸取下面的包含白细胞和血小板的白细胞层。不做离 心处理的情况下从血液中获得白细胞层的另一方法是使用例如凝血因 子、葡聚糖、阿拉伯树胶、水溶性聚蔗糖(Ficoll)、或纤维素甲醚之 类的沉淀增强剂允许血液沉淀。Boyum氏(Boyum’S)试剂(纤维素 甲醚和甲泛影钠)特别适合用于获得无任何红细胞污染的白细胞制备。 另外，淋巴细胞可以通过正或负选择、或溶解方法被从全血中分离。
对基础技术(base technology)的盘说明的分析：白细胞鉴别计数 检测的一种优选实施方式包括三独立部件，(1)包括化学物质的基盘， (2)通道层，和(3)盖盘。
最好被在PBS中稀释的白细胞层或全血，被注入盘室，室的入 口和出口被使用胶带密封，并且盘最好在室温下被培育所需时间。对 第一种方法而言，使用带有顶和底检测器的光学驱动器的标准780nm 激光扫描盘上的给定区域(例如，面积为1平方毫米)。举例说来，由 专利受让人开发并公开在2002年3月12日提交的题为“包含白细胞的 细胞鉴别计数的方法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”的 第60/363,949号美国临时申请和2002年8月21日提交的题为“包括执 行细胞鉴别计数的相关设备和软件的细胞鉴别计数方法”的第 60/404,921号美国临时专利中的相关细胞识别软件根据最好等于1平 方毫米的被俘获图像，自动给出鉴别计数。对第二种方法而言，举例 说来，使用标准780nm激光扫描盘以成像可以包括淋巴细胞、中性白 细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红白细胞、单核细胞和血小板的俘获区。由 专利受让人开发的细胞识别软件自动执行以下程序：(a)离心盘以旋 转分离过量的非结合细胞，(b)成像特定区域和特定俘获区，和(c) 数据处理，数据处理包括计数在各俘获区中的具体被俘获细胞和得出 白细胞的不同子类的数量。
在处理步骤中，识别软件沿各俘获区读数并对所遇到的细胞标 记。在处理各俘获区的数据之后，该软件显示每微升体积区域的血液 中的淋巴细胞、中性白细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红白细胞、单核细胞 和血小板的数量。从将盘插入光学驱动器到显示感兴趣结果的整个过 程需要大约10-15分钟。
与本发明联系的相关公开内容也被发布在2001年7月23日提交 的序列号为60/307,262的题为“免疫表型的俘获层部件和光学生物盘” (Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列 号为60/307,264的题为“成像血细胞、血载寄生虫和病原体和其它生物 物质的方法以及相关光学生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood Cells Blood-Borne Parasites and Pathogens，and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；2001年7月23日提交的序列号为 60/307,562的题为“包含光学成像并定量评价包括淋巴细胞的血细胞 的射流电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical ImagIng and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；和2001年7月24日 提交的序列号为60/307,487的题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方 法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Blo-Disc for Performing Same)的美国临时申请中，所有这些申请通 过引用结合在本文中。
以下段落提供如本发明的某种具体优选实施方式的盘说明的主 要元素的总结。
跟踪设计：在本发明的一种优选实施方式中，盘是一种涂有 300nm金的前摆动部件(forward Wobble Set)FDL21：13707或 FDL21：1207。在此反射盘上，通过光刻技术蚀刻出尺寸为2×1mm的 椭圆形数据窗口。“U”形通道被用于产生高度为25μm的室。大约需 要7μl的试样填充包括入口和出口的整个室。最好可以使用一种4窗 口/4通道格式。但是在透射盘上，没有蚀刻数据窗口，并且整个盘可 用。
粘合剂和结合：在一种优选实施方式，包括本“U”形射流电路的 粘合剂和通道层被由Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661制成。 或者，直通道被用于产生该室。
盖盘：完全反射性的具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm 等距处的试样入口的透明盘(clear disc)，被用于本盘部件的一种具体 实施方式中。
数据俘获和处理：利用专利受让人的细胞识别软件，使用该软件 以最好X4的速度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
软件：本发明还包括处理方法和相关细胞识别及成像软件。该软 件被指向执行并显示细胞计数和细胞鉴别计数。本软件可以存储在光 学生物盘栅、光学盘驱动读数设备中、或仅被安全服务器的光学读出 器可访问。该服务器可以计算网络被实施，例如局域网(LAN)、广 域网(WAN)、或通过互联网在指定条件下可用。这种分布方法被公 开在通常指定的2000年11月8日提交的序列号为60/246,824的题为 “分析生物样本和利用特殊制备的生物光学盘、光学盘驱动器和互联网 连接处理相关医疗信息的交互方法和系统”(Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc， Optical Disk Drive，and Interent Connections)的美国临时申请和2001 年11月7日提交的序列号为09/986,078的题为“分析生物样本并处理 相关信息的交互系统及其使用”(Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof)的相关美国专利申请中，这两个申请通过引用结合在本文中。
材料：用于实施本文所公开的不同优选实施方式的材料包括前摆 动金金属化光致抗蚀剂盘、透射性金金属化盘、吸管和喷嘴(tip)、 旋涂器、离心机、转位式转子(swing-out rotor)、带有例如柠檬酸钠或 乙二胺四乙酸(EDTA)之类的抗凝血剂的VacutainerTM CPT管、潮湿 室、盘压(disc press)、粘合剂、盖盘、透明盖盘胶带或等价物、真 空装置、黄喷嘴(yellow tip)和真空室。
试剂：执行如本发明的某种方法的细胞计数中所采用的试剂包括 磷酸盐缓冲盐水、异丙醇、蒸馏水和StabilGuard。
本发明的一个目的是克服已知技术中的限制。本发明的另一目的 是采用已知的光学盘系统执行光学生物盘上的全血中的白细胞鉴别计 数。本发明的另一目的是成像血细胞并执行白细胞鉴别计数。
本发明有关的技术方面也在以下申请中做出说明：2001年7月 24日提交的序列号为60/307,489的题为“包含执行细胞计数的微射流 电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell counts)的美国临时申请；2001年7月 25日提交的序列号为60/307,825的题为“使用包括肝素、血浆、和聚 赖氨酸等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异结合的方法” (Methods for Reduing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请；2001年7月25日提交的序列号为 60/307,762的题为“使用阻断剂减少光学生物盘上的细胞非特异结合 的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Biding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents)的美国临时申请；2001 年7月25日提交的序列号为60/307,764的题为“使用聚乙烯醇减少射 流室中的气泡的方法和在光学生物盘中获得相同效果的相关技术” (Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年7月27日提交的序列号 为60/308,214的题为“光学分析盘部件内的危险生物材料的容器的密 封方法”(Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies)的美国临时申请； 和2001年7月27日提交的序列号为60/308,197的题为“使用光学生物 盘平台计算帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的定性和定量比率 的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请，所有这些申请的全部内 容通过引用结合在本文中。
本发明还指向使用吸收预定波长的入射光的染料对细胞核染色， 并使用光学盘系统成像这些细胞以根据这些细胞核的形态识别并定量 试样中的各种细胞类型。
更具体地说，本发明涉及一种采用光学盘和盘驱动器执行测定的 方法。本方法包括以下步骤：(1)在盘中的室中的盘表面上提供细胞 试样，该室包括至少一个带有俘获剂的俘获区，(2)将盘载入光学读 出器中，(3)旋转光学盘，(4)将电磁辐射入射束指向俘获区，(5) 检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，(6)将所检 测光束转换为输出信号，和(7)分析该输出信号以提取与在俘获区处 所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。
如本发明的另一方面，提供一种接收试样的光学盘和驱动系统。 该系统为包括衬底、平行于衬底的盖和在盖与包含俘获区的衬底之间 限定的室的盘。俘获层被定位在衬底上的俘获区处。第一俘获区具有 第一细胞俘获剂而第二俘获区具有第二细胞俘获剂。本系统还包括将 光指向盘的俘获区处的光源、检测从盘俘获区反射和透射的光并提供 信号的检测器、和使用该信号区分被俘获细胞核并计数被结合至俘获 分子的试样中的项目的处理器。
按照本发明的另一方面，提供一种采用光学盘和盘驱动器执行白 细胞计数的方法。这种具体方法包括以下步骤：(1)在第一试管中提供血 样，第一试管包含一种分离梯度，(2)以足以将血样分离为层的时间 和速度旋转第一试管，和(3)从被分离血样中分离白细胞层。本具体 方法以以下步骤继续：(4)再悬浮白细胞层从而形成白细胞悬浮液， (5)在光学盘表面上提供白细胞悬浮液的试样，表面包括至少一个带 有至少一种俘获剂的俘获区，(6)将光学盘载入光学读出器中，和(7) 旋转光学盘。然后本方法继续以下步骤：(8)将电磁辐射入射束指向 俘获区，(9)检测在与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束， (10)将所检测光束转换为输出信号，和(11)分析该输出信号以提 取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。在一种具体 实施方式中，本方法可以包括以下附加步骤：将白细胞试样导入俘获 剂的附近，在俘获剂存在的情况下培育细胞，允许细胞特别结合至俘 获剂，和使用在电磁辐射束的波长处或附近吸收的染料对细胞核染色。
在上述具体实施方式中，本发明还包括分析特定类型的被俘获细 胞的数量从而确定试样中的特定细胞类型的浓度的步骤。在本方法中 分析被俘获细胞核的形态的步骤可以包括检测从盘反射和透射的光的 水平的变化。本方法也包括使用图像识别以通过细胞核形态以例如从 另一类型的白细胞核区分一种细胞核而区分细胞类型从而计数特定细 胞类型的细胞数量的步骤。用于细胞染色的染料可以被用于增强图像 识别。这些染料可以包括活体染料、荧光染料、红外和近红外染料。 活体染料可以是Leishman氏染料、吖啶橙或Zynostain。此外，旋转 光学盘的步骤可以包括以足够的速度旋转盘足够的时间周期以使细胞 具有与至少一俘获剂结合的机会。此旋转步骤还包括以足够的速度旋 转盘足够的时间周期以使未结合细胞被从俘获区移开。本步骤可以单 速度或多速度被完成。本具体方法也可以包括计数各俘获区中的被俘 获细胞并提供包括细胞计数的输出的步骤。
按照本发明的另一方面，提供制造根据细胞核形态区分细胞类型 执行白细胞鉴别计数的光学分析盘的另一方法。本方法包括以下步骤： 提供衬底，使用活性层涂覆衬底，在该活性层上提供交联剂从而产生 一个或更多俘获区，允许交联剂结合至活性层，从俘获区去除过量交 联剂，和将盖部分固定至活性层以形成适于接收细胞悬浮液和染色被 俘获细胞核的染料溶液的通道。本方法中所用的交联剂可以与细胞表 面上的低聚糖(oligossacharides)结合。该交联剂可以是外源凝集素。
如本发明的另一方面，提供一种使用如上述方法所制成的盘的方 法。使用预制盘的本具体方法包括以下步骤：沉积包含白细胞的试样 至通道中，允许白细胞结合至俘获区内的交联剂，从俘获区去除未结 合细胞，和将盘载入光学读出器。使用预制盘的本方法还包括以下步 骤：将电磁辐射入射束指向俘获区，检测在与盘及盘表面上的细胞试 样相互作用之后所形成的电磁辐射束，将所检测光束转换为输出信号， 和分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量和类型相 关的信息。本方法还涉及使用吸收预定波长的光的染料染色细胞试样 的步骤，其中预定波长等于和接近电磁辐射束的波长。
如本发明的另一方面，也公开分析试样中的白细胞的另一方法。 本方法涉及以下步骤：(1)将多个白细胞载入光学生物盘中，(2)通过 使用具有特定细胞表面标记特性的俘获剂俘获指定目标区中的白细 胞，(3)使用染料染色被俘获白细胞的细胞核，(4)将入射束指向被 俘获白细胞，和(5)允许入射束与被俘获白细胞的被染色细胞核相互 作用从而形成携带与细胞核的形态有关的信息的返回光束。本方法还 涉及以下步骤：(6)检测返回光束，(7)将所检测返回光束转换为输 出信号，和(8)分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的 细胞核形态相关的信息。本发明中所用的染料可以包括活性、活性细 胞核、细胞核、DNA、染色体、荧光、红外、近红外、UV、和可见 光染料。本具体方法也包括计数特定类型的被俘获白细胞的数量的步 骤，其中特定类型的白细胞包括中性白细胞、单核细胞、淋巴细胞、 嗜曙红白细胞、和嗜碱白细胞。本方法也涉及被用于执行如本方法的 白细胞分析的光学生物盘的使用。
如本发明的另一方面，提供一种执行采用光学盘及盘驱动器的分 析的方法，本方法包括以下步骤：在盘表面上提供细胞试样，将盘载 入光学读出器中，旋转光学盘，将电磁辐射入射束指向俘获区，检测 在与盘和盘表面上的细胞试样相互作用之后所形成的电磁辐射束，将 所检测光束转换为输出信号；和分析该输出信号以提取与在俘获区处 所俘获的细胞的数量和类型相关的信息。本方法还包括使用吸收预定 波长的光的染料染色细胞试样的步骤，其中预定波长等于和接近电磁 辐射束的波长并且染料吸收红外光谱范围内的光。染料可以吸收近红 外、红外(IR)、紫外线(UV)、和可见光谱(VIS)范围的光。此外， 电磁辐射束的波长可以在染料吸收波长的10nm范围内。用于染色细 胞的染料可以包括，例如LI-COR IRDye38、TO-PRO-5碘化物、IR-780 碘化物、激光Pro IR、dd-007、Zynostain、艾杜酞菁绿(idocyanine green)、铜酞菁、3，3’-二乙基噻三羰花青(diethylthiatricarbocyanine) 碘化物(DTTCI)、3，3’-二乙基噁三羰花青(diethyloxatricarbocyanine) 碘化物(DOTCI)、3，3’-二乙基噻二羰花青 (diethylthiadicarbocyanine)碘化物(DTDCI)、和3，3’-二乙基噁二羰 花青(diethyloxadicarbocyanine)碘化物(DODCI)。这些染料可以被设 定为盘表面上的细胞试样的特定标记预定分隔部分(compartment)，包 括但不限于细胞核、核仁、核膜、高尔基体、内质网、线粒体、液泡、 过氧物酶体、微管、中心粒、核糖体、细胞膜和细胞壁。此外，可以 通过涂片细胞试样从而在盘表面上产生细胞单层执行提供盘表面上的 细胞试样的步骤。
上述方法和设备可以具有一个或更多优点，这些优点包括但不限 于不需要有经验的技术员执行试验的情况下简单快速盘上处理、小样 本量、使用廉价材料、和使用已知光学盘格式及驱动器制造。通过参 照以下联系附图及技术实施例的详细说明，将更好地理解这些及其它 特征和优点。
附图说明
本发明的其它目的以及致力于这些目的的附加特征和由此产生 的优点将从下面的本发明的优选实施方式的详细说明中清楚，优选实 施方式在附图中表示，图中相同标号表示相同部件，其中：
图1图示如本发明的生物盘系统；
图2是连同本发明所使用的反射性生物盘的分解透视图；
图3是图2所示的盘的顶视图；
图4是图2所示的带有表示盘的不同层的切掉部分的盘的透视 图；
图5是连同本发明所使用的透射性生物盘的分解透视图；
图6的透视图表示图5所示的带有表示盘的半反射层的功能方面 的切掉部分的盘；
图7的图表表示金薄膜的厚度与透射之间的关系；
图8是图5所示的盘的顶视图；
图9是图5所示的带有表示盘的包括图6所示的半反射型层的不 同层的切掉部分的盘的透视图；
图10的透视图及框图更详细地表示图1的系统；
图11为垂直于图2、3和4所示的反射光学生物盘的半径所取的 局部横截面图，表示形成其中的流动通道；
图12为垂直于图5、8和9所示的透射光学生物盘的半径所取的 局部横截面图，表示形成其中的流动通道和顶检测器；
图13为图2、3和4所示的反射光学生物盘的局部纵截面图，表 示形成其中的摆动槽；
图14为图5、8和9所示的透射光学生物盘的局部纵截面图，表 示形成其中的摆动槽和顶检测器；
图15与图11类似，表示反射盘的总厚度及其初始折射性质；
图16与图12类似，表示透射盘的总厚度及其初始折射性质；
图17A的流程图表示使用本发明的方法分析血样；
图17B表示抗体至白细胞的固定以用于图17A所示的盘；
图18A表示抗生蛋白链菌素；
图18B表示生物素；
图18C表示构成抗生蛋白链菌素和生物素的交联系统；
图18D表示继发抗体；
图18E表示生物素基化的继发抗体；
图18F表示原发抗体；
图18G表示生物素基化的原发抗体；
图18H图示表示四CD4表面抗原的CD4+细胞；
图18I图示表示四CD8表面抗原的CD8+细胞；
图18J表示被结合至醛活化葡聚糖的继发抗体；
图18K表示图18J的截面图；
图19A和19B表示本发明的第一实施方式中通过被交联系统结 合至衬底的原发抗体的细胞俘获；
图19C和19D表示本发明的第一实施方式中通过被直接结合至 衬底的原发抗体的细胞俘获；
图20A-20I的截面侧视图表示利用如本发明的交联系统沉积俘获 剂至反射生物盘的俘获区上的一种方法的第一实施方式；
图21是图20A-20I所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图22表示被用于以透射盘格式实施的图20A-20I的俘获化学；
图23A和23B表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被通过交联系统结合至衬底；
图23C和23D表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被直接结合至衬底；
图24A-24L的截面侧视图表示利用原发俘获抗体和继发俘获抗 体以及如本发明的交联系统沉积俘获剂至反射生物盘的俘获区上的一 种方法的第二实施方式；
图25是图24A-24L所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图26表示被用于以透射盘格式实施的图24A-24L的俘获化学；
图27A和27B表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被通过DCHO结合至衬底；
图27C和27D表示在本发明的第二实施方式中通过被一串 DCHO直接结合至衬底的原发抗体的细胞俘获；
图28A的流程图表示抗体DCHO合成物的制备
图28B-28J的截面侧视图表示利用原发抗体和继发抗体以及一串 DCHO沉积俘获剂至反射生物盘的俘获区上的一种方法的第二实施 方式；
图29是图28B-28J所示的反射盘不使用继发抗体的情况下的另 一实施方式；
图30表示被用于以透射盘格式实施的图28B-28J的俘获化学；
图31A为光学生物盘的顶视图，表示四射流电路，各射流电路具 有特定细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区；
图31B-31C表示在本发明的第三实施方式中通过被交联系统结 合至衬底的继发抗体的原发抗体细胞合成物的俘获；
图31D-31E表示在本发明的第三实施方式中通过被直接结合至 衬底的继发抗体的原发抗体细胞合成物的俘获；
图32A-32I的截面侧视图表示利用交联系统沉积俘获剂至反射生 物盘的俘获区上的一种方法的第三实施方式；
图33是图32A-32I所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图34表示被用于以透射盘格式实施的图32A-32I的俘获化学；
图35A为光学生物盘的顶视图，表示四射流电路，各射流电路具 有不同细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区；
图35B、35C和35D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 交联系统的血样分析方法的第一实施方式；
图36是图35B、35C和35D所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图37表示被用于以透射盘格式实施的图35B、35C和35D的俘 获化学；
图38A、38B和38C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发俘获抗体和继发俘获抗体以及交联系统的血样分析方法的第二实 施方式；
图39是图38A、38B和38C所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图40表示被用于以透射盘格式实施的图38A、38B和38C的俘 获化学；
图41A、41B和41C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发抗体和继发抗体以及一串DCHO的血样分析方法的第三实施方 式；
图42是图41A、41B和41C所示的反射盘不使用继发抗体的情 况下的另一实施方式；
图43表示被用于以透射盘格式实施的图41A、41B和41C的俘 获化学；
图44A的流程图表示原发抗体细胞合成物的制备；
图44B、44C和44D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发俘获抗体和继发俘获抗体以及交联系统的血样分析方法的第四实 施方式；
图45是图44B、44C和44D所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图46表示被用于以透射盘格式实施的图44B、44C和44D的俘 获化学；
图47示意如本发明的一种实施方式的具有表示条形码技术的室 的光学盘；
图48A表示如本发明的一种实施方式使用条形码格式从测定中 所获得的结果；
图48B表示CD4、CD8、和控制区的相应显微镜和盘图像；
图49表示相应的显微镜和盘图像的更大视图，以说明从本发明 的方法和设备中可获得的结果；
图50和51表示使用如本发明的一种实施方式的图像识别；
图52表示如本发明的一种实施方式的从条形码所期望输出的屏 幕截图；
图53表示如本发明的一种实施方式的从被俘获细胞转为可用输 出的方法；
图54表示抽样模拟信号向相应的以一维阵列存储的数字信号的 转变；
图55表示带有被放大的细节视图的指示部分的光盘，表示被相 对于生物盘的道定位的被俘获白细胞，在与入射束相互作用后获得含 信号光束；
图56A表示被相对于如本发明的光学生物盘的道定位的白细胞；
图56B表示如本发明的从图56A的白细胞衍生的一系列签名轨 迹；
图57表示图57A、57B、57C和57D之间的关系；
图57A、57B、57C和57D当被放在一起时，形成表示从图56B 的签名轨迹至被以一维阵列存储的数字信号的转变，并且被合并为数 据输入的两维阵列；
图58的逻辑流程图表示如与本发明相关的处理方法和计算算法 的数据评价的主要步骤；
图59表示红细胞和包括多种类型的白细胞的白细胞和它们的独 特解剖特征；
图60表示使用光盘读出器收集的利用红外染料染色的白细胞的 图像；
图61为图60所示的某些白细胞的放大图像。
图1图示如本发明的生物盘系统；
图2是连同本发明所使用的反射性生物盘的分解透视图；
图3是图2所示的盘的顶视图；
图4是图2所示的带有表示盘的不同层的切掉部分的盘的透视 图；
图5是连同本发明所使用的透射性生物盘的分解透视图；
图6的透视图表示图5所示的带有表示盘的半反射层的功能方面 的切掉部分的盘；
图7的图表表示金薄膜的厚度与透射之间的关系；
图8是图5所示的盘的顶视图；
图9是图5所示的带有表示盘的包括图6所示的半反射型层的不 同层的切掉部分的盘的透视图；
图10的透视图及框图更详细地表示图1的系统；
图11为垂直于图2、3和4所示的反射光学生物盘的半径所取的 局部横截面图，表示形成其中的流动通道；
图12为垂直于图5、8和9所示的透射光学生物盘的半径所取的 局部横截面图，表示形成其中的流动通道和顶检测器；
图13为图2、3和4所示的反射光学生物盘的局部纵截面图，表 示形成其中的摆动槽；
图14为图5、8和9所示的透射光学生物盘的局部纵截面图，表 示形成其中的摆动槽和顶检测器；
图15与图11类似，表示反射盘的总厚度及其初始折射性质；
图16与图12类似，表示透射盘的总厚度及其初始折射性质；
图17A的流程图表示使用本发明的方法分析血样；
图17B表示抗体至白细胞的固定以用于图17A所示的盘；
图18A表示抗生蛋白链菌素；
图18B表示生物素；
图18C表示构成抗生蛋白链菌素和生物素的交联系统；
图18D表示继发抗体；
图18E表示生物素基化的继发抗体；
图18F表示原发抗体；
图18G表示生物素基化的原发抗体；
图18H图示表示四CD4表面抗原的CD4+细胞；
图18I图示表示四CD8表面抗原的CD8+细胞；
图18J表示被结合至醛活化葡聚糖的继发抗体；
图18K表示图18J的截面图；
图19A和19B表示本发明的第一实施方式中通过被交联系统结 合至衬底的原发抗体的细胞俘获；
图19C和19D表示本发明的第一实施方式中通过被直接结合至 衬底的原发抗体的细胞俘获；
图20A-20I的截面侧视图表示利用如本发明的交联系统沉积俘获 剂至反射生物盘的俘获区上的一种方法的第一实施方式；
图21是图20A-20I所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图22表示被用于以透射盘格式实施的图20A-20I的俘获化学；
图23A和23B表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被通过交联系统结合至衬底；
图23C和23D表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被直接结合至衬底；
图24A-24L的截面侧视图表示利用原发俘获抗体和继发俘获抗 体以及如本发明的交联系统沉积俘获剂至反射生物盘的俘获区上的一 种方法的第二实施方式；
图25是图24A-24L所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图26表示被用于以透射盘格式实施的图24A-24L的俘获化学；
图27A和27B表示通过被结合至继发抗体的原发抗体的细胞俘 获，在本发明的第二实施方式中继发抗体被通过DCHO结合至衬底；
图27C和27D表示在本发明的第二实施方式中通过被一串 DCHO直接结合至衬底的原发抗体的细胞俘获；
图28A的流程图表示抗体DCHO合成物的制备
图28B-28J的截面侧视图表示利用原发抗体和继发抗体以及一串 DCHO沉积俘获剂至反射生物盘的俘获区上的一种方法的第二实施 方式；
图29是图28B-28J所示的反射盘不使用继发抗体的情况下的另 一实施方式；
图30表示被用于以透射盘格式实施的图28B-28J的俘获化学；
图31A为光学生物盘的顶视图，表示四射流电路，各射流电路具 有特定细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区；
图31B-31C表示在本发明的第三实施方式中通过被交联系统结 合至衬底的继发抗体的原发抗体细胞合成物的俘获；
图31D-31E表示在本发明的第三实施方式中通过被直接结合至 衬底的继发抗体的原发抗体细胞合成物的俘获；
图32A-32I的截面侧视图表示利用交联系统沉积俘获剂至反射生 物盘的俘获区上的一种方法的第三实施方式；
图33是图32A-32I所示的反射盘不使用交联系统的情况下的另 一实施方式；
图34表示被用于以透射盘格式实施的图32A-32I的俘获化学；
图35A为光学生物盘的顶视图，表示四射流电路，各射流电路具 有不同细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区；
图35B、35C和35D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 交联系统的血样分析方法的第一实施方式；
图36是图35B、35C和35D所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图37表示被用于以透射盘格式实施的图35B、35C和35D的俘 获化学；
图38A、38B和38C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发俘获抗体和继发俘获抗体以及交联系统的血样分析方法的第二实 施方式；
图39是图38A、38B和38C所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图40表示被用于以透射盘格式实施的图38A、38B和38C的俘 获化学；
图41A、41B和41C为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发抗体和继发抗体以及一串DCHO的血样分析方法的第三实施方 式；
图42是图41A、41B和41C所示的反射盘不使用继发抗体的情 况下的另一实施方式；
图43表示被用于以透射盘格式实施的图41A、41B和41C的俘 获化学；
图44A的流程图表示原发抗体细胞合成物的制备；
图44B、44C和44D为反射光学生物盘的截面侧视图，表示使用 原发俘获抗体和继发俘获抗体以及交联系统的血样分析方法的第四实 施方式；
图45是图44B、44C和44D所示的反射盘不使用交联系统的情 况下的另一实施方式；
图46表示被用于以透射盘格式实施的图44B、44C和44D的俘 获化学；
图47示意如本发明的一种实施方式的具有表示条形码技术的室 的光学盘；
图48A表示如本发明的一种实施方式使用条形码格式从测定中 所获得的结果；
图48B表示CD4、CD8、和控制区的相应显微镜和盘图像；
图49表示相应的显微镜和盘图像的更大视图，以说明从本发明 的方法和设备中可获得的结果；
图50和51表示使用如本发明的一种实施方式的图像识别；
图52表示如本发明的一种实施方式的从条形码所期望输出的屏 幕截图；
图53表示如本发明的一种实施方式的从被俘获细胞转为可用输 出的方法；
图54表示抽样模拟信号向相应的以一维阵列存储的数字信号的 转变；
图55表示带有被放大的细节视图的指示部分的光盘，表示被相 对于生物盘的道定位的被俘获白细胞，在与入射束相互作用后获得含 信号光束；
图56A表示被相对于如本发明的光学生物盘的道定位的白细胞；
图56B表示如本发明的从图56A的白细胞衍生的一系列签名轨 迹；
图57表示图57A、57B、57C和57D之间的关系；
图57A、57B、57C和57D当被放在一起时，形成表示从图56B 的签名轨迹至被以一维阵列存储的数字信号的转变，并且被合并为数 据输入的两维阵列；
图58的逻辑流程图表示如与本发明相关的处理方法和计算算法 的数据评价的主要步骤；
图59表示红细胞和包括多种类型的白细胞的白细胞和它们的独 特解剖特征；
图60表示使用光盘读出器收集的利用红外染料染色的白细胞的 图像；
图61为图60所示的某些白细胞的放大图像。
具体实施方式
本发明涉及盘驱动系统、光学生物盘、细胞测定和相关的细胞计 数方法、图像处理技术、和相关软件。下文更详细地说明本发明的各 方面。
本发明与盘驱动系统、光学生物盘、细胞测定和相关的细胞计数 方法、图像处理技术、和相关软件有关的方面也表现在2001年11月 13日提交序列号为60/338,679的题为“包括免疫表型的细胞分离和定 型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing including Immunophenotyping)的美国临时 申请；2001年11月14日提交序列号为60/332,001的题为“免疫表型的 俘获层部件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年11月30 日提交序列号为60/334,131的题为“使用光学生物盘平台计算帮助剂/ 诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2002年1月17日提交序列号为 60/349,392的题为“使用全血和相关的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋 巴细胞的RBC筛分规程评价”(RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的美国临时申请；2002年1月18 日提交序列号为60/349,449的题为“使用全血和相关的帮助剂/诱导剂 抑制剂/毒素T淋巴细胞的RBC溶解规程评价”(RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/lnducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Dlsc)的美国临时申 请；2002年1月31日提交题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方法和 执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的第60/353,300号美国临时专利；2002年2月5日 提交题为“在包括等径分析区的光学生物盘上执行的分组标示测定” (Cluster Designation Assays Performed on Optical Blo-Disc Including Equi-Radial Analysis Zones)的第60/355,644号美国临时专 利；2002年2月19日提交题为“在包括等径分析区的光学生物盘上执 行的分组标示测定和相关系统及方法”(Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-Disc Including Equl-Radial Analysis Zones and Related Systems and Methods)的第60/358,479号美国临时专 利；2002年3月12日提交题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方法和 执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的第60/363,949号美国临时专利；；和2002年8月 21日提交题为“包含相关设备和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的 白细胞的细胞鉴别计数方法”(Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same)的 第60/404,921号美国临时专利，所有这些申请被结合在本文的参考文 献中。
驱动系统和相关盘
图1为如本发明的本文公开的执行细胞计数和细胞鉴别计数的光 学生物盘110的透视图。本光学生物盘110被连同光学盘驱动器112 和显示器114显示。与这种类型的盘驱动器和盘分析系统被公开在通 常已知的2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动器系统 和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs)的 第10/008,156号共同待审批美国专利申请和2002年1月10日提交题 为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中， 这两个专利申请通过参考结合在本文中。
图2是光学生物盘110的一种实施方式的主要结构部件的分解透 视图。图2为可以被用于本发明的一种反射区光学生物盘110(下文 称为“反射性盘”)的示例。主要结构部件包括盖部分116、粘合部件 或通道层118、和衬底120。盖部分116包括一个或更多入口部分122 和一个或更多出气口124。盖部分116可以被由聚碳酸脂形成，并且 当从图2的透射方向看时最好在它的底部上涂有反射性表面146(图 4)。在优选实施方式中，触发标记或标志126被包括在反射性层142 的表面上(图4)。如图10所示，触发标志126可以在编码有传送数 据至处理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性 区域的所有三层中包括透明窗，这反过来与询问或入射束152的操作 功能相互作用，图6和10。
图2所示的第二部件为一种具有射流电路128或形成其中的U通 道的粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形 成如图所示的形状，形成射流电路128。每个射流电路128包括流动 通道130和回流通道132。图2所示的一些射流电路128包括混合室 134。表示两种不同类型的混合室134。第一是相对于流动通道130被 对称形成的对称混合室136。第二是位移混合室138。位移混合室138 被形成于所示流动通道130的一侧。
图2所示的第三部件为包括目标或俘获区140的衬底120。衬底 120最好被由聚碳酸脂制成，并具有图4所示被沉积在它的顶部上的 反射性层142。通过以所示形状或其它任何所需形状去除反射性层142 形成目标区140。此外，目标区140可以通过掩蔽技术被形成，该掩 蔽技术包括在应用反射性层142之前掩蔽目标区140区域。反射性层 142可以由一种例如铝或金的金属被形成。
图3为图2所示的光学生物盘110的顶视图，在以透明显示的盖 部分116上具有反射性层142以展示位于盘内的射流电路128、目标 区140和触发标记126。
图4为如本发明的一种实施方式的发射区型光学生物盘110的放 大透视图。本图包括一部分它的各种层，切掉以表示各主要层、衬底、 涂层、或膜的部分截面图。图4表示涂有反射性层142的衬底120。 活性层144被应用于反射性层142上。在优选实施方式中，活性层144 可以由聚苯乙烯形成。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改 性玻璃、或例如聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以 使用水凝胶。此外，如本实施方式所示，塑料粘合部件118被应用于 活性层144之上。塑料粘合部件118的被暴露部分表示产生射流电路 128的切掉或被压制U形。本生物盘的这种发射区实施方式中的最终 主要结构层为盖部分116。盖部分116包括它的底部上的反射性表面 146。反射性表面146可以由一种例如铝或金之类的金属被制成。
现在参照图5，表示如本发明透射型光学生物盘110的主要结构 部件的分解透视图。透射型光学生物盘110的主要结构部件同样包括 盖部分116、粘合或通道部件118、和衬底120层。盖部分116包括一 个或更多入口部分122和一个或更多出气口124。盖部分116可以被 由聚碳酸脂形成。可选的触发标记126被包括在薄半反射性层143的 表面上，如图6和9所示。触发标志126可以在编码有传送数据至处 理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性区域的 所有三层中包括透明窗，如图10所示，这反过来与询问光束152的操 作功能相互作用，图6和10。
图5所示的第二部件为具有射流电路128或形成其中的U通道的 粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形成如 图所示的形状，形成射流电路128。每个射流电路128包括流动通道 130和回流通道132。图5所示的一些射流电路128包括混合室134。 表示两种不同类型的混合室134。第一是相对于流动通道130被对称 形成的对称混合室136。第二是位移混合室138。位移混合室138被形 成于所示流动通道130的一侧。
图5所示的第三部件为包括目标或俘获区140的衬底120。衬底 120最好被由聚碳酸脂制成，并具有图4所示被沉积在它的顶部上的 半反射性层143。与图5和图6所示的盘110的衬底120相联系的半 反射性层143与图2、3和4所示的盘110的衬底120上的反射性层 142相比要薄得多。较薄的半反射性层143允许询问光束152沿图6 和12所示的透射盘的结构层的一些透射。该薄半反射性层143可以由 一种例如铝或金的金属被形成。
图6为图5所示的光学生物盘110的透射实施方式的衬底120和 半反射性层143的放大透视图。薄半反射性层143可以由一种例如铝 或金之类的金属被制成。在优选实施方式中，图5和6所示的透射盘 的薄半反射性层143的厚度大约为100-300埃并不超过400埃。该较 薄半反射性层143允许一部分入射或询问光束152透过并通过半反射 性层143以被图10和12所示的顶检测器158检测，而一些光被沿入 射光路反射或返回。如下文所示，表2表示金薄膜相对于膜的厚度的 反射和透射性质。厚度大于800埃的金薄膜层完全反射。而光线沿金 薄膜透射的临界密度大约为400埃。
除表2外，图7的图表提供基于金的厚度的薄半反射性层143的 反射和透射性质的相反关系。图7所示的图表中所使用的反射和透射 性数值为绝对值。
表2
金薄膜反射和透射(绝对值) 厚度(埃) 厚度(nm) 反射比 透射比 0 0 0.0505 0.9495 50 5 0.1683 0.7709 100 10 0.3981 0.5169 150 15 0.5873 0.3264 200 20 0.7142 0.2057 250 25 0.7959 0.1314 300 30 0.8488 0.0851 350 35 0.8836 0.0557 400 40 0.9067 0.0368 450 45 0.9222 0.0244 500 50 0.9328 0.0163 550 55 0.9399 0.0109 600 60 0.9448 0.0073 650 65 0.9482 0.0049 700 70 0.9505 0.0033 750 75 0.9520 0.0022 800 80 0.9531 0.0015
接下来参照图8，图8表示图5和6所示的透射型光学生物盘110 的顶视图，具有展示位于盘内的射流通道、触发标记126和目标区140 的透明的盖部分116。
图9为如本发明的透射盘实施方式的光学生物盘110的放大透视 图。所示的盘110具有一部分它的各种层，切掉以表示各主要层、衬 底、涂层、或膜的部分截面图。图9表示具有透明盖部分116、衬底 120上的薄半反射性层143、和触发标志126的透射盘格式。在本实施 方式中，触发标志126包括被放置在盘的顶部的不透明材料。此外， 触发标志126可以由被刻蚀在盘的薄反射性层143上的透明、非反射 性窗口，或者任何吸收或不反射来自图10所示的触发检测器160的信 号的标志形成。图9也表示，通过以指定形状或其它任何所需形状标 记指定区域形成目标区140。指示目标区140的标记可以被做在衬底 120的薄半反射性层143上或衬底120的底部上(盘下)。此外，可以 通过一种包括掩蔽除目标区140之外的整个薄半反射性层143的掩蔽 技术形成目标区140。在这种实施方式中，目标区140可以通过丝网 印印墨至薄半反射性层143上被产生。在图5、8和9所示的透射盘格 式中，可以替代地通过盘上的地址信息编码定义目标区140。在这种 实施方式中，目标区140不包括物理可识别边界。
继续参照图9，表示活性层144被应用于薄半反射性层143上。 在优选实施方式中，活性层144为厚度为10至200μm的2％聚苯乙 烯层。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改性玻璃、或例如 聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以使用水凝胶。如 本实施方式所示，塑料粘合部件118被应用于活性层144之上。塑料 粘合部件118的被暴露部分表示产生射流电路128的切掉或被压制U 形。
本生物盘110的这种透射实施方式中的最终主要结构层为包括入 口122和出气口124的透明、非反射性盖部分116。
现在参照图10，以透视图和框图表示光学部件148、产生入射或 询问光束152的光源150、返回光束154和透射光束156。在图4所示 的反射性生物盘的情况下，返回光束154被从光学生物盘110的盖部 分116的反射性表面146反射。在本光学生物盘110的这种反射实施 方式中，通过底检测器157检测返回光束154并分析信号码元的存在。 另一方面，在透射性生物盘格状中，通过顶检测器158检测透射光束 156并也分析信号码元的促在。在透射实施方式中，光检测器可以被 用作顶检测器158。
图10也表示包括盘上的触发标记126和触发检测器160的硬件 触发装置。该硬件触发装置被用于反射性生物盘(图4)和透射性生 物盘(图9)中。触发装置允许检测器166仅当询问光束152在相应 的目标区140上时收集数据。此外，在透射性生物盘系统中，也可以 使用软件触发器。软件触发器使用底检测器发信号给处理器166以当 入射束152击中相应的目标区140的边缘时就收集数据。图10还表示 驱动电机162和控制光学生物盘110的旋转的控制器164。图10也表 示被以处理返回光束154和透射光束156的替代方式实施的处理器 166和分析仪168。
如图11所示，表示如本发明的光学生物盘110的反射盘实施方 式的局部横截面图。图11表示衬底120和反射层142。如上所述，反 射层142可以被由例如铝、金或其它适当反射性材料制成。在这种实 施方式中，衬底120的顶面为光滑的。图11也表示被应用于反射层 142之上的活性层144。同样如图11所示，通过在所需位置去除反射 层142的区域或部分，或者通过在应用反射层142之前掩蔽所需区域， 形成目标区140。还是如图11所示，塑料粘合部件118被应用于活性 层144之上。图11也表示盖部分116和与之联系的反射性表面146。 因此当盖部分116被应用于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118时， 形成流动通道130。如图11的箭头所示，入射束152的光路初始地被 从盘110的下部指向衬底120。入射束然后聚集在最接近反射层142 的点上。由于这种聚集发生在一部分反射层142不存在的目标区140 中，入射束沿光路继续通过活性层144并进入流动通道130。入射束 152然后继续向上横穿过流动通道最终入射至反射性表面146上。此 时，入射束152被沿入射光路返回或反射回并因此形成返回光束154。
图12为如本发明的光学生物盘110的透射实施方式的局部横截 面图。图12表示带有透明盖部分116和衬底120的薄半反射层143 的透射盘格式。图12也表示被应用于薄半反射性层143之上的活性层 144。在优选实施方式中，透射盘具有由一种例如铝或金之类的金属制 成的厚度大约为100-300埃并不超过400埃的薄半反射性层143。这 种薄半反射性层143允许一部分来自图10所示的光源150的入射或询 问光束152穿透并向上通过盘以被顶检测器158检测，而一些光被沿 与入射束相同的光路但以相反方向被反射。在这种方式中，返回或被 反射光束154被从半反射性层143反射。因此，在这种方式中，返回 光束154不进入流动通道130。如连同图13和14更详细说明的那样， 反射光或返回光束154可以被用于跟踪被形成在半反射性层143中或 上的预录制信息道的入射束152。在图12所示的盘实施方式中，可以 或可以不存在物理限定的目标区140。目标区140可以通过在衬底120 上的薄半反射性层143上直接标记被产生。可以使用丝网印制或任何 等价方法形成这些标记。在没有物理标记被用于定义目标区的替代实 施方式中(例如，当使用编码软件寻址时)，流动通道130实际上可以 被采用为执行调查特征的检测的受限目标区。
图13为沿如本发明的生物盘110的反射盘实施方式的信道所取 的横截面图。本图为沿半径和盘的流动通道横向所取。图13包括衬底 120和反射层142。在这种实施方式中，衬底120包括一系列槽170。 槽170处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸的形式。槽170被实施以 使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170跟踪。这种类型的槽170被 称作“摆动槽”。具有波动或波状侧壁的底部形成槽170，而升高或提 高部分在螺旋方向分离相邻的槽170。在这种实施方式中，如图所示， 被应用于槽170之上的反射层142实质上共形。图13也表示被应用于 反射层142之上的活性层144。如图13所示，通过在所需位置去除反 射层142的区域或部分，或者通过在应用反射层142之前掩蔽所需区 域，形成目标区140。还是如图13所示，塑料粘合部件118被应用于 活性层144之上。图13也表示盖部分116和与之联系的反射性表面 146。因此当盖部分116被应用于包括所需切掉形状的塑料粘合部件 118时，形成流动通道130。
图14为沿如例如图12所述的本发明的生物盘110的透射盘实施 方式的信道所取的横截面图。本图为沿半径和盘的流动通道横向所取。 图14表示衬底120和薄半反射层143。该薄半反射性层143允许来自 光源150的入射或询问光束152穿透并通过盘以被顶检测器158检测， 而一些光被以返回光束154的形式反射返回。该薄半反射性层143的 厚度通过盘读出器保持循迹能力所需的反射光的最小数量而被确定。 在这种实施方式中，与图13所述相似，衬底120包括一系列槽170。 在这种实施方式中槽170也最好处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸 的形式。槽170被实施以使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170跟 踪。图14也表示被应用于薄半反射性层143之上的活性层144。还是 如图14所示，塑料粘合部件118被应用于活性层144之上。图14也 表示没有反射性表面146的盖部分116。因此，当盖部分116被应用 于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118时，形成流动通道130，并 且一部分入射束152被允许实质上无反射地通过。
图15与图11类似，表示反射盘的总厚度及其初始折射性质。图 16与图12类似，表示透射盘的总厚度及其初始折射性质。图15中未 显示槽170，因为沿槽170切截面。图15和16表示本实施方式中位 于垂直于槽170的位置的窄流动通道130的存在。图13、14、15和 16表示相应的反射性或透射性盘的总厚度。在这些图中，入射束152 被表示为初始与具有改变入射束的光路的折射性质的衬底120相互作 用，表示为提供光束152在反射层142或薄半反射性层143上聚集。
细胞测定
可以使用本发明的方法实施一种普通均匀固相细胞俘获测定，以 快速确定血样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞总体的绝对数和 CD4+/CD8+淋巴细胞的比率。在被结合入生物盘的小流动通道中运行 的该检测，确定被从全血分离的7-15μl的单核细胞(MNC)中的俘获 区上的特定抗体所俘获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+、CD19+和 CD45+细胞的数量。该检测基于盘上的具体位置上的局部细胞俘获的 原理。根据具体血细胞表面抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，通过俘 获化学物的局部应用，在盘上产生几个特定细胞俘获区。当使用MNC 血(10,000-30,000细胞/微升)充满25-100微升的室时，表示CD4、 CD8、CD2、CD3、CD19和CD45抗原的细胞被在盘内的俘获区中 俘获。也被结合入俘获区的是受限负控制区。
图17A的流程图表示血样的分析。在步骤1，血液(4-8ml)和 例如EDTA、酸性柠檬酸盐葡萄糖(ACD)、或肝素之类的抗凝血剂被 直接收集入4或8ml的Becton Dickinson CPT VacutainerTM中。在本 发明的另一实施方式的等价步骤中，3ml的抗凝血剂中的血被叠加入 包含例如Histopaque1077之类的分离梯度(separation gradient)176 的试管172中。在任何情况下，血样174最好被在收集的两小时内使 用。叠加有血样174的包含分离梯度176试管172被在带有水平转子 和转位式桶的生物危害离心室中以400×g室温下离心30分钟。离心 后，血浆层178被去除(步骤2)，在单核细胞(MNC)部分180上 留下约2mm的血浆。MNC层180被收集并使用磷酸缓冲盐(PBS) 冲洗。通过以250×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸以去除任何 剩余血小板。上清液被去除并且通过轻敲试管MNC丸180被在PBS 中再悬浮。根据生物盘110的流动通道130的高度，最终丸180被再 悬浮(步骤3)至10,000-30,000细胞/微升的细胞计数。
使用7微升的MNC悬浮液充满生物盘110的流动通道130，并 使用胶带或其它适当的密封部件密封室的入口122和出气口124(图3 和8)(步骤4)。生物盘110被在室温下培育15分钟，然后在光学驱动 器112中使用780nm的激光扫描以成像俘获区(步骤5)。应该理解 如果使用一种透射性生物盘110，光学驱动器112可选地包括顶检测 器158(图10)以成像俘获区。最后软件被编码在盘上以指示驱动器 自动执行以下任务：(a)在一个或更多阶段中离心盘以分离过量的未结 合细胞；(b)在显示监视器114上成像具体的俘获窗口；和(c)处理数据。 数据处理包括但不限于计数各俘获区中的具体被俘获细胞和得出 CD4+/CD8+比率或者程序待确定的任何比率。通过本发明的其它实施 方式可以容易地提供其它所需比率。
还是如图17A所示，本发明涉及一种使用光学盘和盘驱动器系统 执行鉴别计数的方法。该方法包括以下步骤：在包含分离梯度的第一 试管中提供血样，以足以将血样分离为层的时间和速度旋转第一试管， 再悬浮包含T细胞的MNC层以形成MNC悬浮液，在包括至少一包 含至少一种俘获剂的俘获区的盘表面上提供MNC悬浮液试样，将盘 载入光学读出器，旋转盘，将电磁辐射的入射束指向俘获区，检测在 与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，将所检测光束转换 为输出信号，和分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的 数量相关的信息。在本方法的一种实施方式中，光学盘被构造带有反 射层以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被反射。在本方法的另一 实施方式中，光学盘被构造以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被 通过光学盘透射。
在分析/处理步骤过程中，软件沿各俘获区图像读并当它与这些 细胞图像相遇时标记细胞图像。举例说来，在计数被俘获CD4+和CD8+ 细胞的数量之后，软件计算CD4+/CD8+比率，并显示每微升全血的 CD4+、CD8+、CD3+和CD45+俘获区中的细胞的绝对数以及 CD4+/CD8+比率。从将盘插入光学驱动器到获得这些绝对数和比率整 个过程需要12分钟。
在一种实施方式中，盘是一种涂有作为被编码信息层的300nm 金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1207 CD-R盘。在反射盘上， 通过已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×1mm的椭圆形观察窗。 在透射盘的某些设计中，没有蚀刻单独的观察窗，并且整个盘可用。 在一种具体实施方式中，粘合层为Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661。盖为具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm等距处的 试样入口的透明盘。利用CD4+/CD8+计数软件使用该软件以4X的速 度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
参照图17B，在本发明的一种实施方式中，聚苯乙烯118厚层被 形成在衬底120之上并且(可选地)与抗生蛋白链菌素182分层。细 胞俘获抗体通过生物素被固定至抗生蛋白链菌素182。这些抗体可包 括被固定至涂在抗生蛋白链菌素上的葡聚糖活化醛的生物素基化的抗 体以为俘获抗体产生足够数量的结合位置。这产生可以具体形成与白 细胞(WBC)的强结合的强俘获化学。
图18A、18B、18C图示在本发明的一种实施方式中所使用的交 联系统。应该理解交联系统涉及一种或更多交联剂、或共轭物，以将 一个或更多大分子片断与另一个交联。交联可以是两大分子片断之间 的共价或非共价相互作用，通常当两大分子自由基结合时被形成。获 得交联的化学改性或共扼方法涉及一官能团与另一官能团的反应，导 致键的形成。带有反应性或选择反应性官能团的生物共扼剂的产生形 成目标分子的简单和可复制交联或标记的基础(Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press，San Diego，CA发布的“生物共扼技术” (Bioconjugate Techniques))。
交联剂包括但不限于同双功能交联剂(homobifunctional linker)、异双功能交联剂(heterobifunctional linker)、和零长度交联 剂。同双功能交联剂为具有两相同功能性的反应活性部位的交联剂， 例如戊二醛。这些试剂通过与两分子上的相同的共群的共价反应可以 将一蛋白质结合至另一蛋白质。异双功能共扼剂包含两种可以结合至 蛋白质和其它大分子上的两不同功能目标的不同反应基。举例说来， 交联剂的一部分可以包含胺反应基，而另一部分可以包含硫氢反应基。 结果是将交联反应指向目标分子的被选部分的能力，因此获得对共扼 工程更好的控制。零长度交联剂通过形成不包含附加原子的键促成两 分子的共扼。因此，在没有中间连接剂或间隔物的情况下一分子的一 原子被共价固定至第二分子的一原子。关于交联剂的详细说明，本领 域的技术人员可以参考Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press， San Diego，CA发布的“生物共扼技术”(Bioconjugate Techniques))。 在本发明中，交联剂被结合至生物盘的表面以固定目标区内的俘获剂。 优选的交联剂系统为包含生物素-抗生蛋白链菌素的异双功能基，即 被结合至结合抗生蛋白衬底的生物素基化的俘获剂。图18A表示抗生 蛋白链菌素182。不受限制，抗生蛋白链菌素包括抗生蛋白、抗生蛋 白链菌素及其修改。如图所示，蛋白质包括四亚基，各亚基包含一生 物素(Hermanson)结合位置。抗生蛋白链菌素182可以通过各种化 学方法被结合至例如聚苯乙烯之类的塑料。理想地，抗生蛋白链菌素 182被固定至生物盘的活性层144(图4和图9)，实质上不可逆地结 合至生物素基化的敏感元件(例如抗体)。
图18B是生物素184的图示表示。生物素(或维生素H)是在每 个细胞内少量存在的自然发生增长因子。生物素与蛋白质抗生蛋白和 抗生蛋白链菌素的相互作用是已知的最强的非共价亲和力之一。生物 素分子184通过它的戊酸侧链可以直接被结合至蛋白质或者与其它有 机成分衍生(derivitized)以产生间隔壁(spacer arm)和多种反应基。 通过适当地选择生物素衍生物(Hermanson)胺、羟酸盐、硫氢和碳水 化合物基可以被具体作为生物素基化的目标。图18C表示包含与抗生 蛋白链菌素182相互作用的生物素184的交联系统。
本发明的具体实施方式利用俘获剂执行所述测定。应该理解俘获 剂指检测被分析物的任何大分子。本发明的俘获剂包括针对感兴趣的 一种被分析物优先选择、或具有选择性结合亲和力的大分子。俘获剂 包括，但不限于合成或生物制造核酸和合成和生物制造蛋白质。本发 明所可以采用的俘获剂的示例为，但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核 糖核酸(RNA)、低聚核苷酸、聚合酶链反应物、或这些核苷酸的组 合(嵌合体)、抗体(单克隆或多克隆)、细胞膜受体、和与具体抗原 定子(例如在病毒、细胞和其它材料上)的抗血清反应物、药物、肽、 辅因子、外源凝集素、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。优选地，本发 明的俘获剂为抗体。
抗体包括但不限于多克隆、单克隆和重组体产生抗体。本发明的 抗体可以在活体内或活体外被制造。抗体的制造方法为本领域的技术 人员所熟知。例如，见Peter Delves(Ed.)、John Wiley和Son Ltd 所著的编号为ISBN：0471970107(1997)的抗体制造：基本技术，该书 的全部内容通过引用结合在本文中。此外，可以从商业来源获得抗体， 例如Flanders Pleasant Hill路，NJ 07836的Research Diagnostics股 份有限公司。本发明的抗体不限于任何特定物种的抗体；例如人类、 老鼠、大鼠、和山羊的抗体都被本发明考虑。优选地，本发明的原发 抗体为在老鼠中所制造的反人(anti-human)抗体，本发明的继发抗 体为在山羊中所制造的反鼠抗体。
术语“抗体”也包括抗体的任何类或项目，作为任何或所用可以被 用于结合至细胞表面抗原的抗体类型。抗体在医疗诊断技术中的使用 为本领域的技术人员所熟知。例如，见Andrew J.T.George和Catherine E.Urch(Eds.)在Humana Press发表的ISBN：0896037983(2000)的 Diagnostic and Therapeutic Antibodies(Methods in Molecular Medicine)和Siegfried Matzku与Rolf A.Stahel(Eds.)在Harwood Academic Pub.发表的ISBN：9057023105(1999)的Antibodies in Diagnosis and Therapy：Technologies，Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series)，这些材料的全部内容通过引用结合在本 文中。
在本发明的至少一些实施方式中，多种俘获剂被用于检测感兴趣 的被分析物。图18D表示作为第二俘获剂186被用于本发明的方法中 的lgG类抗体。应该理解本发明的第二俘获剂包括但不限于具有对另 一俘获剂的亲和力的俘获剂，该俘获剂具有对感兴趣的被分析物的亲 和力。图18E表示被结合至生物素分子184第二俘获剂lgG186，下文 称为生物素基化的lgG。
图18F图示第一俘获剂188。应该理解本发明的第一俘获剂188 具有对感兴趣的被分析物的选择性亲和力。优选地，第一俘获剂为一 种具有对白细胞的亲和力的抗体。更具体地说，这些抗体被对准淋巴 细胞(CD2、CD19)、单核细胞(CD14)、嗜曙红白细胞(CD15)和 其它感兴趣的细胞表面标记物。图18G表示被结合至生物素分子184 的第一俘获剂188。除CD4和CD8之外，还有与许多其它细胞表面 抗原(例如CD3、CD16、CD19、CD45、CD56)相对的抗体，这些 抗体被用于识别淋巴细胞的项目。
图18H图示CD4+T细胞190。CD4+T细胞结合至通过例如巨噬 细胞和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APC)表示的特定抗原，并释 放吸引其它免疫系统至该区域的淋巴细胞活素。结果是炎症，和试图 隔开并破坏抗原材料的细胞及分子的集聚。应该理解CD4+T细胞具 有多个覆盖整个细胞表面的抗原192。但是，仅是为了示例的目的， 图18H表示具有四个抗原192的CD4+T细胞190。
图18I图示CD8+型T细胞194。这些T细胞分泌破坏它们结合 至的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为CD8+T细胞在被感 染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前破坏被感染细胞。应 该理解CD8+T细胞具有多个覆盖整个细胞表面的抗原196。但是，仅 是为了示例的目的，图18I表示具有四个抗原196的CD8+T细胞194。
图18J图示被结合至3维矩阵的醛活化葡聚糖(DCHO)198的 继发抗体186，从而形成DCHO抗体合成物199。葡聚糖主要是一种 由被糖苷键链接在一起的右旋葡萄糖的重复单位构成的线性多糖。作 为被广泛使用的交联剂，葡聚糖实质上为多价，这允许分子在沿聚合 物链(Hermanson)的多个位置被结合。仅是为了示例的目的，将如 图18K说明被结合至葡聚糖198的抗体186。
与本发明的细胞测定相关的方面也被公开在2001年7月27日提 交序列号为60/308,176的题为“使用光学生物盘平台表征包括白血病 血样的癌血细胞的定性和定量方法”(Ouantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年8月15日提交序列号为60/312,248的题为“使用光学 生物盘平台定性和定量表征包括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法” (Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年8月20日提交 序列号为60/313,514的题为“通过原发抗体与试样的位置外培育和随 后通过表面结合继发抗体的具体细胞俘获方法和包括该方法的光学生 物盘”(Methods for SpecifIc Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年8月20日提交序列号为60/313,715 的题为“使用全血和相关的光学生物盘的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T 淋巴细胞的RBC溶解规程评价”(RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/lnducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的美国临时申请；2001年8月 20日提交序列号为60/313,536的题为“使用全血和相关的光学生物盘 的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的RBC筛分规程评价”(RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的 美国临时申请；和2001年8月30日提交序列号为60/315,937的题为“包 括免疫表型的细胞分离和定型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including lmmunophenotyping)的美国临时申请，所有这些申请通过参考结合 在本文中。
实现I
图19A-19D图示在本发明的第一实现中的被分析物俘获。图19A 和19B表示通过生物素基化的原发抗体(图18G)的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194的俘获。抗体188通过交联剂抗生蛋白链菌素182 被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上。图19C和19D表 示本发明的同一实现中没有交联系统的另一实施方式。在这种实施方 式中，原发抗体188被直接固定至生物盘110的活性层144上。
图20A-20I的横截面图表示本发明第一实现的一种实施方式的构 造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘流动通道内的俘获剂 的反射盘的构造。参照图20A，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图20A表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂、 或者通过本领域的技术人员所知的其它方法被沉积在反射层142之上 以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后抗生蛋白链菌素182 被沉积在各俘获区140和141之上，盘110被在湿度室中室温下培育 30分钟(图20B)。盘110被冲洗以去除未结合抗生蛋白链菌素182， 并随后被旋干以从盘110的表面完全去除水分(图20C)。基准标记或 基准点202被沉积在第一俘获区141上，并且生物素基化的原发抗体 188被沉积在各连续俘获区140上(图20D和20E)。然后盘110被在 湿度室中室温下培育30分钟。使用PBS冲洗去除未结合抗体188， 并且盘110被旋干以去除表面水分(图20F)。粘合部件118被固定至 活性层144(图20G)。盖部分116(图2)可以被由聚碳酸脂形成并 且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116 被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。 阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有 效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性结合位置(图20H)。盘 110被在湿度室中室温下培育最好30分钟的预定时间，并且通过真空 完全去除剩余溶液(图20I)。
本发明的第一实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且未 生物素基化的原发抗体188(图18F)被直接沉积在各连续俘获区140 上的活性层144(图20A)上。然后盘110被在湿度室中室温下培育 最好30分钟(图20E)。使用PBS冲洗去除未结合抗体188，并且盘 110被旋干以去除表面水分(图20F)。粘合部件118被固定至活性层 144。盖部分116(图2)可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂 有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定至粘合 部件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。阻断剂204，例如 StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144 上的任何剩余非特异性结合位置(图20H)。盘110被在湿度室中室温 下培育30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图20I)。图21的 横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第一实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图20A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图20B-20H 所示。相应的粘合部件118被固定至活性层144。光学透明的盖部分 116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合部 件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。图22的横截面图表 示使用交联系统所完成的透射生物盘110。应该理解第一实现的第四 实施方式可以由本领域的技术人员构造。第四实施方式涉及不使用交 联系统固定生物盘110(图21和22)的流动通道内的俘获剂的透射盘 110的构造。
实现II
图23A-23D图示在本发明的第二实现中的被分析物俘获。图23A 和23B表示通过原发抗体188(图18F)的CD4+T细胞190和CD8+T 细胞194的俘获。原发抗体188被结合至通过交联剂抗生蛋白链菌素 182被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素基化的 继发抗体186(图18E)。图23C和23D表示本发明的同一实现中没 有交联系统的另一实施方式。在这种实施方式中，继发抗体186被直 接固定至生物盘110的活性层144上。
图24A-24L的横截面图表示本发明第二实现的一种实施方式的 构造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘110流动通道130 内的俘获剂的反射盘的构造。参照图24A，表示光学生物盘110的透 光衬底120、反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者 当沉积时被产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被 指向抗体将被固定至的俘获区140的位置。图24A表示5个这种俘获 区140，第一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它 被旋涂在反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。 然后抗生蛋白链菌素182被沉积在各俘获区140和141之上，并且盘 110被在湿度室中室温下培育约30分钟(图24B)。盘110被冲洗以去 除未结合抗生蛋白链菌素182，并随后被旋干以从盘110的表面完全 去除水分(图24C)。基准标记或基准点202被沉积在第一俘获区141 上，并且生物素基化的继发抗体186被沉积在各连续俘获区140上(图 24D和24E)。然后盘110被在湿度室中室温下培育最好30分钟(图 24E)。使用PBS冲洗去除未结合继发抗体186，并且盘110被旋干以 去除表面水分(图24F)。原发抗体188(图18F)随后被沉积在各俘 获区140上(图24G)。然后盘110被在湿度室中室温下培育约30分 钟(图24H)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并且盘110 被旋干以去除表面水分(图24I)。相应的粘合部件118被固定至活性 层144。盖部分116(图2)同样可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底 部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定 至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图24J)。阻断剂204， 例如StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性 层144上的任何剩余非特异性结合位置(图24K)。盘110被在湿度室 中室温下培育30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。
本发明的第二实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且未 生物素基化的继发抗体186(图18D)被直接沉积在各连续俘获区140 上的活性层144(图24A)上。然后盘110被在湿度室中室温下培育 30分钟(图24E)。使用PBS冲洗去除未结合继发抗体186，并且盘 110被旋干以去除表面水分(图24F)。原发抗体188(图18F)随后 被沉积在各俘获区140上(图24G)。然后盘110被在湿度室中室温下 培育30分钟(图24H)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并 且盘110被旋干以去除表面水分(图24I)。粘合部件118被固定至活 性层144。与前面的实施方式相同，本实施方式的盖部分116(图2) 可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射 性表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成 流动通道130(图24J)。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各 流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性 结合位置(图24K)。在这种实施方式中盘110被在湿度室中室温下培 育最好30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。图25的 横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第二实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图24A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的继发抗 体186、原发抗体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并 如图24B-24K所示。粘合部件118被以相似的方法固定至活性层144。 光学透明的盖部分116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被 整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图24J)。图 26的横截面图表示使用交联系统所完成的透射生物盘110。应该理解 第二实现的第四实施方式可以由本领域的技术人员构造。第四实施方 式涉及不使用交联系统固定生物盘110(图21和22)的流动通道内的 俘获剂的透射盘110的构造。
实现III
图27A-27D图示如本发明的第三实现的被分析物俘获。图27A 和27B表示通过原发抗体188(图18F)的CD4+T细胞190和CD8+T 细胞194的俘获。原发抗体188被结合至继发抗体186(图18D)，继 发抗体186被结合至一串DCHO 198以形成一种如图28A所示的 DCHO-抗体合成物199。DCHO-抗体合成物199可以包含一种或更多 通过DCHO198被交联的抗体。通过某些继发抗体186至生物盘110 (图4和9)的活性层144上的结合，该DCHO-抗体合成物199被固 定在活性层144上。图27C和27D表示本发明的同一实现中没有继发 抗体186的另一实施方式。在这种实施方式中，原发抗体188被直接 结合至DCHO以形成DCHO-抗体合成物199，DCHO-抗体合成物199 被固定至生物盘110的活性层144上。
图28A的流程图表示抗体-DCHO合成物的制备，而图28B-28J 的多图表示本发明第三实现的一种实施方式的构造。该第三实现的第 一实施方式涉及利用交联剂DCHO交联两种或更多交联剂的反射盘 的构造。图28A表示DCHO-抗体合成物199的制备。等浓度的DCHO 198和继发抗体186被混合并被允许结合，从而形成DCHO-抗体(继 发)合成物199。参照图28B，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图28B表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂在 反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后 DCHO-抗体(继发)合成物199被沉积在各俘获区140之上，并且在 这种具体实施方式中盘110被在湿度室中室温下培育30分钟(图 28C)。盘110被冲洗以去除未结合的DCHO-抗体(第二)合成物199， 并随后被旋干以从盘110的表面完全去除水分(图28D)。基准点202 被沉积在第一俘获区141上，并且原发抗体188被沉积在各连续俘获 区140上(图28E)。然后盘110被在湿度室中室温下培育30分钟(图 28F)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并且盘110被旋干以 去除表面水分(图28G)。粘合部件或通道层118被固定至活性层144。 与上述实施方式相同，通常图2所示的盖部分116可以被由聚碳酸脂 形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。在本 实施方式中，盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成 流动通道130，如图28H所示。阻断剂204，例如StabilGaurd，被 注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非 特异性结合位置。本步骤被显示在图28I中。在本实施方式中，盘110 被在湿度室中室温下培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶 液，如图28J所示。
如本发明的制造方面，图28A-28J也表示一种制造用于执行分组 标示计数的光学测定盘的方法。这种制造光学测定盘的方法包括以下 步骤：在试管中提供交联剂，添加俘获剂至该试管，允许交联剂与俘 获剂结合(形成一种合成物)，提供衬底，使用活性层涂覆衬底，沉积 该合成物至活性层上，和使用粘合部件固定盖部分至活性层。在这种 实施方式中，交联剂为醛活化葡聚糖。俘获剂用于与细胞表面抗原结 合。在另一实施方式中，俘获剂用于与具有对细胞表面抗原选择亲和 力的第一俘获剂结合。在优选实施方式中，细胞表面抗原被从抗原的 CD族中独立选择。在更优选的实施方式中，细胞表面抗原被从由 CD3、CD4、CD8、和CD45构成的组中独立选择。
本发明的第三实现的第二实施方式涉及不使用继发抗体固定生 物盘110的流动通道130内的第一俘获剂的反射盘110的构造。在这 种实施方式中，等浓度的DCHO 198和原发抗体188被混合并被允许 结合，从而形成图28A所示的DCHO-抗体(原发)合成物199。基准 标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且DCHO-抗体(原发) 合成物199被沉积在各连续俘获区140上的活性层144(图28C)上。 然后盘110被在湿度室中室温下培育最好30分钟，并使用PBS冲洗 去除DCHO-抗体(原发)合成物199。盘110被旋干以去除表面水分， 如图28D所示。粘合部件或通道层118相似地被固定至活性层144。 盖部分116可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4 所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而 在盘内形成流动通道130，如图28H所示。阻断剂204，例如 StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144 上的任何剩余非特异性结合位置(图28I)。该盘被在湿度室中室温下 培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液，如图28J所示。图 29的横截面图表示不使用继发抗体所完成的反射盘110。
本发明的第三实现的第三实施方式涉及使用交联剂DCHO固定 生物盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种 实施方式中，衬底120、没有观察窗200(图28B)的半反射性层143、 和活性层144如图5所示。DCHO-抗体(第二)合成物199、原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图28C-28I 所示。粘合部件或通道层118被固定至活性层144。光学透明的盖部 分116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合 部件118从而在盘110内形成流动通道130。图30的横截面图表示使 用DCHO-抗体(第二)合成物199和原发抗体188所完成的透射生物 盘110。应该理解第三实现的第四实施方式可以由本领域的技术人员 构造。第四实施方式涉及不使用继发抗体固定生物盘110(图29和30) 的流动通道内的第一俘获剂的透射盘110的构造。其它实施方式可能 涉及使用抗生蛋白链菌素182(图18A)和生物素184(图18B)固定 原发或继发抗体至生物盘110的活性层144。被固定的抗体(原发和 继发抗体)然后可以被与DCHO 198合成以增加生物盘110的流动通 道130内的俘获剂的浓度。
实现IV
图31A为光学生物盘110的顶视图，表示四射流电路128，各射 流电路具有特定细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区。如图所示， 各射流电路被指示为具有具体指向CD3、CD4、CD8和CD45的俘获 区140。可以采用任何其它所需图案或细胞表面抗原的组合，例如其 它的CD标记或细胞表面标记。在这种具体实现中，对各单独的射流 电路而言在各俘获区140中仅需要单独的公共俘获剂。图31A所示的 盘特别适合用于图31B-31E、44A-44D、45和46所示的细胞俘获化学 和方法。图31A所示的生物盘110可以为反射盘或透射盘。
现在参看图31B-31E，表示在本发明的第四实现中的被分析物俘 获。图31B和31C表示通过与原发抗体188(图18F)预先被结合以 形成原发抗体-细胞合成物的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的 继发抗体186的俘获。原发抗体188被结合至通过交联剂抗生蛋白链 菌素182被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素基 化的继发抗体186(图18E)。图31D和31E表示本发明的同一实现中 没有交联系统的另一实施方式。在这种实施方式中，继发抗体186被 直接固定至生物盘110的活性层144上。
图32A-32I的横截面图表示本发明第四实现的一种实施方式的构 造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘流动通道内的俘获剂 的反射盘的构造。参照图32A，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图32A表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂在 反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后抗生 蛋白链菌素182被沉积在各俘获区140和141之上，并且盘110被在 湿度室中室温下培育约30分钟，如图32B所示。盘110被冲洗以去 除未结合的抗生蛋白链菌素182，并随后被旋干以从盘110的表面完 全去除水分，如图32C所示。基准标记或基准点202被沉积在第一俘 获区141上，并且生物素基化的继发抗体186被沉积在各连续俘获区 140上，如图32D和32E所示。然后盘110被在湿度室中室温下培育 大约30分钟。该步骤如图32E所示。使用PBS冲洗去除未结合继发 抗体186，并且盘110被旋干以去除表面水分。该步骤如图32F所示。 粘合部件或通道层118相似地被应用于活性层144。相应的盖部分116 最好被由聚碳酸脂形成并且在底部上涂有最好如图4所示的反射性表 面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动 通道130，如图32G所示。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入 各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异 性结合位置，这一步骤显示在图32H中。盘110被在湿度室中室温下 培育最好30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液，如图32I所示。
本发明的第四实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且如 图18D所示的未生物素基化的继发抗体186被直接沉积在各连续俘获 区140上的活性层144上。然后盘110被在湿度室中室温下培育30 分钟。使用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并且盘110被旋干 以去除表面水分。粘合部件118被固定至活性层144。盖部分116可 以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性 表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流 动通道130。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各流动通道130 以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性结合位置。盘 110被在湿度室中室温下培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余 溶液。图33的横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第四实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图32A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图32B-32H 所示。粘合部件118被固定至活性层144。光学透明的盖部分116(图 5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合部件118从 而在盘内形成流动通道130(图32G)。图34的横截面图表示使用交 联系统所完成的透射生物盘110。应该理解第四实现的第四实施方式 可以由本领域的技术人员构造。第四实施方式涉及不使用交联系统固 定生物盘110(图33和34)的流动通道内的第二俘获剂的透射盘110 的构造。
分组标示计数-实现I
图35A为光学生物盘110的顶视图，表示四射流电路128，各射 流电路具有四不同具体细胞表面标记的几个俘获区140和一负控制 区。如图所示，各射流电路被指示为具有四个分别具体指向CD3、CD4、 CD8和CD45的俘获区140。可以采用任何其它所需图案或细胞表面 抗原的组合，例如其它的CD标记或细胞表面标记。在这种具体实现 中，不限制对各单独的射流电路而言在各俘获区140中必须仅有单独 的公共俘获剂。相反，在这种实现中，要求具有带有不同俘获剂的俘 获区。例如，这些俘获区可以被以具有至少2乘2矩阵的阵列格式被 排列。图35A所示的盘特别适合用于图35B-35D、36、37、38A-38C、 39、40、41A-41C、42和43所示的细胞俘获化学和方法。图35A所 示的生物盘110可以为反射盘或透射盘。
接下来参照图35B-35D，表示使用本发明的第一实现的生物盘的 净化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生 物盘110的流动通道130，如图35B所示。毛细管作用、使用外部应 用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心 或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接 触。如图35C所示，原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存 在的任何CD4+细胞190和CD8+细胞194。光学驱动电机162(图10) 旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图20I)。光学盘驱 动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+细胞190和CD8+细胞 194相互作用，如图35D所示，并且返回光束154被反射至检测器157 (图10)用于处理和分析。
图36表示与图35B-35D相同的试样的分析，使用本发明的第一 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图35B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 35C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图37表示与图35B-35D相同的试样的分析，使用本发明的第一 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图35B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 35C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并且透射 光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现II
现在参照图38A-38C，表示使用本发明的第二实现的生物盘的净 化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生物 盘110的流动通道130，如图38A所示。毛细管作用、使用外部应用 器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或 曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接触。 原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞 190和CD8+T细胞194。该步骤表示在图38B中。光学驱动电机162 (图10)旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图24L)。 光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194相互作用，如图38C所示，并且返回光束154被 反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图39表示与图38A-38C相同的试样的分析，使用本发明的第二 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图38A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 38B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被 俘获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且返 回光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图40表示与图38A-38C相同的试样的分析，使用本发明的第二 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图38A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 38B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被 俘获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且透 射光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现III
接下来参照图41A-41C，表示使用本发明的第三实现的生物盘的 净化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生 物盘110的流动通道130，如图41A所示。毛细管作用、使用外部应 用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心 或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接 触。原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存在的任何CD4+T 细胞190和CD8+T细胞194。该步骤表示在图41B中。光学驱动电机 162(图10)旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图28J)。 光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194相互作用，如图41C所示，并且返回光束154被 反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图42表示与图41A-41C相同的试样的分析，使用本发明的第三 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图41A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 41B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图28J)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图43表示与图41A-41C相同的试样的分析，使用本发明的第三 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图41A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图41B)。 光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的俘获区 140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的 CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且透射光束 156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现IV
现在参照图44A-44D，表示使用本发明的第四实现的生物盘的净 化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。图44A的流程图表示原发 抗体-T细胞合成物的制备。包含CD4+T细胞190和CD8+T细胞194 的MNC悬浮液被与原发抗体188混合，并允许结合，从而形成原发 抗体-T细胞合成物。如本领域的技术人员将清楚的那样，使用本实现 也可以标记带有不同表面标记的其它细胞。如图44B所示，使用原发 抗体-T细胞合成物充满生物盘110的流动通道130。毛细管作用、使 用外部应用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离 旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与被固定在 生物盘110的活化层144上的继发抗体188的接触。具有对原发抗体 -T细胞合成物的亲和力的继发抗体186俘获该合成物，如图44C所示。 光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合合成物的俘获区 140(图32I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的合 成物相互作用，如图44D所示，并且返回光束154被反射至检测器157 (图10)用于处理和分析。
图44A-44D也表示本发明的方法的另一主要方面。联系图17A， 提供执行分组标示计数的另一方法。本方法包括以下步骤：(1)在包含 分离梯度的试管中提供血样，(2)以足以将血样分离为层的时间和速 度旋转试管，(3)再悬浮包含T细胞的MNC层以形成MNC悬浮液， (4)添加原发抗体至该MNC悬浮液以形成原发抗体-T细胞合成物， (5)在包括至少一个带有至少一种俘获剂的俘获区的光学盘表面上提 供原发抗体-T细胞合成物的试样，(6)将光学盘载入光学读出器中， (7)将电磁辐射入射束指向俘获区，(8)检测在与盘的俘获区相互作 用之后所形成的电磁辐射束，(9)将所检测光束转换为输出信号，和 (10)分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量相关 的信息。在本方法的一种实施方式中，光学盘被构造为具有反射层以 使被指向俘获区并不击中细胞的光被反射。在本方法的另一实施方式 中，光学盘被构造以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被通过光学 盘透射。
图45表示与图44A-44D相同的试样的分析，使用本发明的第四 实现的第二实施方式。使用原发抗体-T细胞合成物充满生物盘110的 流动通道130(图44B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、 和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上 的力)作用于试样上以获得与被固定在生物盘110的活化层144上的 继发抗体188的接触。具有对原发抗体-T细胞合成物的亲和力的继发 抗体186俘获该合成物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该 盘，这清除未结合合成物的俘获区140(图32I)。光学盘驱动器112 (图1)的入射束152与被俘获的合成物相互作用(图44D)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图46表示与图44A-44D相同的试样的分析，使用本发明的第四 实现的第三实施方式。使用原发抗体-T细胞合成物充满生物盘110的 流动通道130(图44B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、 和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上 的力)作用于试样上以获得与被固定在生物盘110的活化层144上的 继发抗体188的接触。具有对原发抗体-T细胞合成物的亲和力的继发 抗体186俘获该合成物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该 盘，这清除未结合合成物的俘获区140(图32I)。光学盘驱动器112 (图1)的入射束152与被俘获的合成物相互作用(图44D)，并且透射 光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
本领域的技术人员将根据这些教义理解，在不偏离本发明的领域 的精神的情况下，可以组合本发明的方法的一种或多种实现的一种或 多种实施方式。
细胞检测和相关软件
现在参照图47，表示包括用以保持试样的射流电路128的光学生 物盘110。图47也表示被放大的射流电路47，以表示不同的俘获或目 标区140和包括基准标记和基准点202的目标区141。在这种具体实 施方式中，采用5个俘获区140，各俘获区被分别用于俘获CD4+细胞、 CD8+细胞、CD3+细胞、CD45+细胞和作为负控制的肌红蛋白。
图48A为从不同的实施方式所获得的图像，该实施方式包括6 个俘获区140，各俘获区分别被用于俘获CD45+细胞、CD15+细胞、 CD4+细胞、CD8+细胞、CD15+细胞的第二俘获区和CD45+细胞的第 二俘获区。在这种实施方式中，两CD45和CD15俘获区可以被用作 确认控制和检查以检验俘获效率和所期望的计数结果符合。图48A也 表示一系列带有CD4、CD8和控制的放大视图的细胞表面抗原。如本 文所述，该图像为与背场(background field)相反表示的许多细胞。 图48B表示来自相比如本发明的生物盘衍生图像的实际显微镜图像的 控制、CD4和CD8俘获区的局部放大图。图49表示实际显微镜图像 和相应的如本发明的生物盘图像的更详细的另一对比。如图48B和49 所示，本发明人已经发现相比从显微镜可获得的图像的等质量和分辨 率的生物盘图像。因此这些图像证明使用本发明的设备和方法可以使 得单个细胞相对背景可见。检测调查特征的方法被更详细地说明在通 常指定的分别在2001年2月2日和2001年5月18日提交序列号为 60/270,095和60/292,108的题各为“获得在光学盘部件的表面上所检测 的调查特征的信号签名的信号处理设备和方法”(Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly)的美国临时申请，和通常所指的2002年1月10日提交题 为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中， 所有这些申请被结合入参考文献中。
这些细胞可以通过多种不同方法的一种被检测，例如，使用边缘 检测硬件或软件检测并计数透射或反射光的水平中的足够大的变化， 并且因此计数转变和细胞。下文更详细说明的另一方法，使用图像和 图案识别软件识别与背景相对的细胞。图像识别可以区分WBC和 RBC，并且也可以区分中性白细胞、单核细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红 白细胞、粒性白细胞和淋巴细胞。
带有数量级为1.6微米左右的信道的光学盘可以被用于成像盘上 的细胞或聚集体。例如，白细胞将通常具有至少5和最多12信道的直 径，因此可以获得白细胞的图像。
为了获得这种图像，可以使用图2、3和4所示的类型的透射盘 (虽然反射盘将可操作)，和图10所示的包括触发传感器160和顶检 测器158的类型的盘驱动器。触发检测器158检测透射盘中的触发标 记126并提供信号至计算机，当标记被检测时数据计算机将收集和/ 或处理数据。当光源穿过观察窗中的信道时，获得所接收到透射光的 图像。在这种情况下顶检测器可以为单检测器，或者在径向和/或周向 定位的一排多个检测器部件。举例说来，这种检测器和检测方法被说 明在通常指定的2000年11月9日提交题为“生物光学盘的光学盘驱动 器”(Optical Disc Drive For Bio-Optical Disc)的第60/247,465号美国 临时申请；2001年5月22日提交题为“光学生物盘的盘驱动部件” (Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs)的第60/293,093号美 国临时申请；和2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动 器系统和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discss)的第10/008,156号美国专利申请中，这些申请的全部内容 通过引用结合在本文中。
在获得例如图48A、48B和49的图像之后，可以使用设计为识 别所需特征的图像识别软件进一步处理该图像数据。更需要的是图像 识别软件不仅具有区分细胞与背景的能力，而且具有区分一种类型的 细胞与其它类型细胞的能力。
现在参照图50，表示从包括红细胞和白细胞的调查数据中所衍生 出的图像。如图放大图所示，这些白细胞和红细胞具有清楚的独特特 征，因此可以被从背景中检测出并且使用图像识别也可以被互相区分。 此外，如在下文联系图59、60和61所说明的那样，通过染色这些细 胞的细胞核，也有可能区分白细胞各自的类型，包括淋巴细胞、单核 细胞、中性白细胞、嗜曙红白细胞、粒性白细胞和嗜碱白细胞。
图51表示带有许多细胞的样品场(sample field)，各细胞带有指 示被认为是细胞的各物体的加号。在已经为每个区和任何数量的要求 区检测细胞数量之后，所产生的细胞计数数据可以被在单个屏幕中显 示，该屏幕提供一种容易观察的表示，例如图52所示。如图52所示， 以柱状图的形式提供具体的细胞计数，以说明细胞的相对数。在 CD4/CD8分析的情况下，系统也可以产生CD4/CD8比率以及任何其 它所需的数学计算和对比。图53提供本过程的不同视图，表示图像场 中的细胞被转换为CD4计数、CD8计数和比率，带有指示比率处于 正常范围的输出。
本发明有关细胞检测和相关处理方法的方面也被公开在2001年 8月31日提交序列号为60/316,273的题为“免疫表型的俘获层部件和 光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for immunophenotyping)的美国临时申请；2001年9月7日提交序列号为 60/318,026的题为“成像血细胞、血载寄生虫和病原体和其它生物物质 的方法以及相关光学生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood cells，Blood-Borne Parasites and Pathogens，and Other Biological Matter Including Related OptIcal Bio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；2001年9月14日提交序列号为 60/322,527的题为“包含执行细胞计数的微射流电路的光学分析盘” (Optical Analysis Discs including Microfiuidic Circuits for Performing Cell Counts)的美国临时申请；2001年9月11日提交序 列号为60/322,040的题为“包含光学成像并定量评价包括淋巴细胞的 血细胞的射流电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；2001年9月 12日提交序列号为60/322,863的题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的 方法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的美国临时申请；和2001年9月17 日提交序列号为60/322,793的题为“使用包括肝素、血浆、和聚赖氨酸 等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异结合的方法” (Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请被结合在本文的参考 文献中。
细胞鉴别计数方法和相关软件
这里更详细地说明使用光学盘数据的白细胞计数的多种方法和 相关算法。这些方法和相关算法并不限于计数白细胞，而是可以被容 易地应用于执行任何类型的细胞物质的计数，这些细胞物质包括但不 限于红细胞、白细胞、珠(beads)和任何其它产生类似的可以通过光学 读出器可以被检测的光学签名的生物和非生物物体。
为了说明的目的，以下如参照图54-58所说明的与本发明相关的 方法和算法的说明被指向白细胞计数。使用某些修改，这些方法和算 法可以被应用于计数其它类型的细胞、或大小与白细胞类似的物体。 细胞计数方法和算法的数据评价方面这里通常被说明以为本发明的方 法和设备提供相关背景。俘获并处理光学生物盘的调查数据的方法和 算法通常具有广泛的适用性并且已经在通常指定的被结合入参考文献 的2001年5月16日提交题为“光学生物盘部件中的分析结果的透射象 素的可变抽样控制和相关设备”(Variable Sampling Control For Rendering Pixelatlon of Analysis Results In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto)的第60/291,233号美国临 时专利和上述被结合的题为“包括执行细胞鉴别计数的相关设备和软 件的细胞鉴别计数方法”(Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus And Software For Performing Same)的 第60/404,921号美国临时专利中被更详细地公开。在下面的说明中， 提供带有简单解释的本方法和算法的基本方案。如图10所示，生物检 测使用的信息有关属性被从光学生物盘110以一束已经通过与试样的 相互作用被修改或调制的电磁辐射的形式被提取。在联系图2、3、4、 11、13和15所述的反射性光学生物盘的情况下，返回光束154携带 有关生物试样的信息。如上所述，实质上仅当入射束在流动通道130 或目标区140内并因此与试样接触时，这种有关生物试样的信息才被 包含在返回光束中。在生物盘110的反射实施方式中，返回光束154 也可以携带被编码在反射层142中或上或者被编码在图13和14所示 的摆动槽170中的信息。如本领域的技术人员所清楚的那样，仅当相 应的入射束与反射层142接触时，预记录信息被包含在带有目标区的 反射盘的返回光束154中。当入射束152处于信息承载反射层142被 去除或者不存在的区域中时，这种信息不被包含在返回光束154中。 在联系图5、6、8、9、12、14和16所述的透射性光学生物盘的情况 下，透射光束156携带有关生物试样的信息。
继续参照图10，无论从反射盘的返回光束154或透射盘的透射光 束156所获得的有关生物试样的信息，被指向处理器166用于信号处 理。该处理涉及由底检测器157(反射盘)或顶检测器158(透射盘) 所检测到的模拟信号向不连续数字形式的转换。
接下来参照图54，信号转换涉及以固定时间间隔212抽样模拟信 号210，并编码相应的信号瞬时模拟振幅214为不连续的二进制整数 216。抽样在某起始时间218开始并在某终止时间220结束。与模拟向 数字转换过程相联系的两公值为抽样频率和位深(bit depth)。抽样频 率，也称为抽样速率，为每单位时间所取的样本的数量。较高的抽样 频率获得连续样本之间较小的时间间隔212，这导致数字信号222相 比原始模拟信号210的较高的保真度。位深是用于编码模拟信号210 的抽样振幅214的各样本点中所用的位的数量。位深越大，二进制整 数216将越接近原始模拟振幅214。在本实施方式中，在位深为每样 本12位的情况下抽样速率为8Mh，允许整数抽样范围为0至4095(0 至(2n-1)，其中n为位深。在其它实施方式中这种组合可以改变以适 应特定的精度要求。以示例而不是限制的方式，在涉及计数通常小于 细胞的珠的方法的实施方式中，可能要求增加抽样频率。然后所抽样 数据被送至处理器166用以模拟至数字转换。
在模拟向数字转换过程中，沿激光光路的各连续样本点224被作 为一维阵列226连续地存储在盘上或存储器中。各连续信道提供独立 的一维阵列，这产生类似于图像的两维阵列228(图57A)。
图55的透视图表示带有被放大的细节视图的指示部分的本发明 的光学生物盘110，表示被相对于光学生物盘的道232定位的被俘获 白细胞230。如图所示，入射束152与白细胞230的相互作用获得含 信号光束，或者以反射盘的返回光束154或透射盘的透射光束156的 形式，该光束被检测器157或158检测。
图56A为表示相对于图55所示的光学生物盘110的信道232定 位的被俘获白细胞230的另一图示。如图55和56A所示，白细胞230 覆盖大约四个信道A、B、C和D。图56B表示由图55和图56A的白 细胞210所衍生的一系列签名轨迹。如图56B所示，检测系统提供相 对于信道A、B、C和D的四个模拟信号A、B、C和D。如图56B进 一步所示，各模拟信号A、B、C和D携带有关白细胞230的特定信 息。因此如图所示，白细胞230上的扫描获得可以被检测和处理的入 射束的独特扰动。模拟签名轨迹(信号)210随后被指向处理器166 用以转换为如图57A和57C所示的模拟数字信号222，如下文更详细 所述的那样。
图57表示图57A、57B、57C和57D之间的关系。图57A、57B、 57C和57D表示从图56B的签名轨迹至数字信号222的转变，该数字 信号被以一维阵列226存储并且被合并为两维阵列228用以数据输入 244。
现在具体参照图57A，表示来自图55和56A所示的光学生物盘 的信道A和B的抽样模拟信号210。随后处理器166编码相应的模拟 信号210的瞬时模拟振幅214为不连续二进制整数216(见图54)。所 产生的系列数据点为类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
接下来参照图57B，来自信道A和B(图57A)的数字信号222 被作为独立的一维存储器阵列226存储。各连续信道提供相应的一维 阵列，该阵列当与前面的一维阵列结合时，获得类似于图像的两维阵 列228。该数字数据随后被作为代表在样本区中特定点处的返回光束 154或透射光束156(图55)的相对密度的样本点224(图54)的两 维阵列228存储在存储器中或盘上。该两维阵列随后被以图57B所示 的原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。然后被存 储在图像文件240中数据被提取242至存储器并被用作至图10所示的 分析仪168的数据输入244。
图57C表示来自图55和56A所示的光学生物盘的信道C和D 的抽样模拟信号210。随后处理器166编码相应的模拟信号210的瞬 时模拟振幅214为不连续二进制整数216(图54)。所产生的系列数据 点为类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
现在参照图57D，来自信道C和D的数字信号222被作为独立 的一维存储器阵列226存储。各连续信道提供相应的一维阵列，该阵 列当与前面的一维阵列结合时，获得类似于图像的两维阵列228。如 上所述，该数字数据随后被作为代表在样本区中特定点处的返回光束 154或透射光束156(图55)的相对密度的样本点224(图54)的两 维阵列228存储在存储器中或盘上。该两维阵列随后被以图57B所示 的原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。如上所述， 然后被存储在图像文件240中数据被提取242至存储器并被用作至图 10所示的分析仪168的数据输入244。
本发明的计算和处理算法被存储在分析仪168(图10)中并被应 用于输入数据244以产生可以被显示在显示监视器114(图10)上的 有用输出结果262(图58)。现在参照图58，表示如本发明的处理方 法和计算算法的数据评价的主要步骤的逻辑流程图。本处理方法的第 一主要步骤涉及输入数据244的接收。如上所述，数据评价以范围为 0至4096的整数阵列开始。
接下来的主要步骤246为选择用于计数的盘区域。一旦该区域被 限定，目标变为实际计数该被限定区域内所包含的所有白细胞。步骤 246的实施根据盘的构造和用户的选择而定。以示例而不是限制的方 式，本发明的实施方式使用带有例如图2和5所示的目标区140的窗 口的盘，软件识别该窗口并剪切它的一部分用于分析和计数。在一种 优选实施方式中，例如图2所示，目标区或窗口具有在两端带有半圆 形部分的1×2mm矩形的形状。在这种实施方式中，软件在相应窗口 内截取1×2mm的标准矩形区域。在本实施方式的一方面，读出器可 以取几个连续样本值与几个不同窗口中的细胞数量比较。
在使用无窗口的透射盘的本发明的实施方式中，如图5、6、8和 9所示，步骤246可以两种不同方法的一种被执行。或者通过在固定 坐标情况下定位它相对于一点的中心，或者通过发现为暗染料点的基 准标记202(见例如图24L、25和26)，选择标准矩形的位置。在采 用基准标记202的情况下，具有所需对比度的染料被相对于两组细胞 沉积在盘上的特定位置141(例如图20E)。然后光学盘读出器被指向 滑至一组细胞的中心，并且标准矩形随后被围绕被选择组居中。
至于上述关于步骤246的用户选择，用户通过使用鼠标选择或者 其它方式的直接相互作用，可以指定细胞计数所需的样本区形状，例 如矩形区。在本软件的本实施方式中，这涉及使用鼠标单击并拖动矩 形覆盖显示在监视器114上的光学生物盘衍生图像的所需部分。不管 评价区域选择方法如何，在随后的步骤248中相应的矩形区域被评价 用以计数。
图58中的第三主要步骤为步骤248，该步骤指向背景照明均匀 化。该过程纠正由某些硬件配置所导致的可能的背景不均匀波动。背 景照明均匀化补偿各样本点的密度水平以上总背景、或者不是细胞的 图像部分接近带有任意背景值Vbackground的平面。而Vbackground可以多 种方式被决定，例如取标准矩形样本区上的平均值，在本实施方式中， 该值被设定为2000。在所选择矩形样本区的各点P处的值V被使用 数字(Vbackground+(V-P的相邻点上的平均值))替换，并如果必要的话 被舍位以适应数值的实际可能范围，在本发明的优选实施方式中该范 围为0至4095。选择相邻点的尺寸以充分大于细胞的尺寸并充分小于 标准矩形的尺寸。
图58的流程图的下一步骤为标准化(normalization)步骤250。在 执行标准化步骤250中，使用标准矩形样本区中的数据执行线性转换 以使平均值变为2000，标准偏差为600。如果必要，该值被舍位以适 合0至4096的范围。本步骤250，以及背景照明均匀化步骤248，使 得软件对硬件修改和调整更不敏感。以示例并不是限制的方式，在例 如顶检测器158(图55)的检测电路中所获得的信号，可以在不明显 影响所产生细胞计数的情况下改变。
如图58所示，接下来执行过滤步骤252。对标准矩形中的各点P， 计算尺寸小于步骤248所述、具有足够不同于Vbackground的值的P的相 邻点的数量。所计算的点应该接近图像中细胞的尺寸。如果该数量足 够大，P处的值保持不变；否则它被指定为Vbackground。执行该过滤操 作以去除噪音，并且在优选情况下仅细胞保持在图像中而背景均匀地 等于Vbackground。
如图58所示，可以执行可选步骤254，该步骤被指向去除有害部 分。诸如划痕、气泡、沾污和其它类似不规则体的缺陷可以通过过滤 步骤252。这些缺陷可以或者直接地或者通过影响图像柱状图中的总 分布导致细胞计数错误。通常地，这些缺陷的尺寸相比细胞足够大， 并可以在如下的步骤254中被去除。首先，形成与被选定区域相同尺 寸的二进制图像。如果原始图像的相应点处的值等于Vbackground，二进 制图像中的A被定义为白，否则为黑。接下来，提取黑点的被连接部 分。然后，随后的腐蚀和膨胀被应用于调整该部分的视图。并且最终， 去除大于定义阀值的部分。在本可选步骤的一种实施方式中，通过指 定原始图像中的相应样本点具有值Vbackground，从原始图像中去除该部 分。确定那些部分构成可计数量标而那些将被去除的阀值为用户定义 值。该阀值也可以根据正在被计数的调查特征即白细胞、红细胞或者 其它生物物质而变。在可选步骤254之后，最好重复步骤248、250 和252。
图58所示的下一主要步骤为步骤256，该步骤涉及通过亮中心计 数细胞。计数步骤256由几个子步骤构成。第一子步骤包括执行卷积 (convolution)。在该卷积子步骤，形成被称作卷积图像的辅助阵列。 点P处的被卷积图像的值为在P的圆形相邻点中过滤之后的图像的集 成结果。更精确地，对一种具体实施方式，被集成的函数为当v大于 2000时等于v-2000而当v小于或等于2000时等于0的函数。在计数 步骤256中被执行的下一子步骤为在尺寸约为1个细胞的半径周边发 现被卷积图像的局部最大值。接着，避免在互相紧邻点内复制带有相 同值的局部最大值。在计数步骤256的最后子步骤中，剩余的局部最 大值被宣布为标记细胞。
在某些硬件设置中，一些细胞在无亮中心的情况下可以出现。在 这种情况下，仅有暗边可见，以下的两可选步骤258和260可用。
步骤258涉及从图像去除被发现细胞。在步骤258，围绕各被发 现细胞的中心的圆形区域被使用值2000填充以使带有亮中心和暗边 的细胞不会被发现两次。
步骤260涉及通过暗边计数附加细胞。在步骤258之后对图像进 行两次转换。在本步骤的第一子步骤，子步骤(a)中，使用(2000-v) 替换各点的值v，并且如果该结果为负它被使用零替换。在子步骤(b) 中，所产生的图像随后被使用内径R1且外径R2的环卷积。R1和R2 分别为细胞的最小和最大期望半径，随后，在子步骤(d)，该环被移动 致左、右、上和下。在子步骤(c)，四位移的结果被合计。这种转换之 后，暗边细胞的图像看起来象四瓣花。最后在子步骤(d)，子步骤(c) 中所获得的函数的最大值在某种意义上被发现为计数步骤256中所采 用的值。它们被宣布为在步骤256中被遗漏的标记细胞。
计数步骤256之后，或者在当可选被采用的计数步骤260之后， 图58所示的最后主要步骤为结果输出步骤262。在标准矩形中被发现 的细胞数量被显示在图1和5所示的监视器114上，并且各被识别细 胞被使用红十字标示在被显示光学生物盘衍生图像上。
参照图59，表示红细胞或红血球和白细胞或白血球。白细胞分为 两主要组。第一组为颗粒白细胞。它们由红骨髓产生，在细胞质中具 有显著的颗粒，并具有叶形细胞核。三种颗粒白细胞(也称为多形核 白细胞、多形核白细胞或PMNS)为中性白细胞(直径10-12μm)、嗜 曙红白细胞(直径10-12μm)和嗜碱白细胞(直径8-10μm)。中性白 细胞的核具有被非常细的链连接的2至6叶。随着细胞成长叶的宽度 增加。当常用染料被应用于细胞时，在细胞质中发现均匀分布的染有 淡紫色的颗粒。嗜曙红白细胞包含也为双叶的细胞核，叶被细链或厚 峡(isthmus)连接。细胞质被使用未覆盖或遮蔽细胞核的大均匀尺寸 的颗粒填满。使用常用染料将颗粒染色为红橙。嗜碱白细胞的核也为 双叶或不规则形状，常为字母S状。细胞质颗粒为圆形，可变尺寸， 染蓝黑色，并通常遮蔽细胞核。
第二主要白细胞组为无基粒白细胞。它们由淋巴和骨髓组织(红 骨髓)产生，并且在光显微镜下不可以看到细胞质颗粒，这归功于它 们的小尺寸和差染色性质。两种无基粒白细胞为淋巴细胞(直径 7-15μm)和单核细胞(直径14-19μm)。淋巴细胞的核为圆形，或微 锯齿形(indented)。细胞质形成围绕细胞核的环。单核细胞的核通常 为锯齿形或肾形，如图59、60和61所示。
如本发明，可以使用具有预定吸收范围的染料染色某预定细胞分 隔部分。该细胞分隔部分可以包括细胞核、核仁、核膜、高尔基体(golgi apparatus)、内质网、线粒体、液胞、过氧物酶体、微管、中心粒、 核糖体、细胞膜和细胞壁。预定波长可包括UV、可见、和IR吸收范 围。被用于增强不同细胞分隔部分之间的对比并允许分类和定量各种 细胞的这些染料可以包括活体染料、红外染料、近红外染料和荧光染 料，染料为示例。例如，当细胞核被染色时，根据它们的核的形态和 数量可以识别并定量各种白细胞类型。被用于检测细胞和被染色分隔 部分的入射或询问光束最好具有所使用染料的最大吸收波长的10nm 内的波长。与细胞检测、计数和图像识别相关的细节被公开在共同待 审批、通常指定的2002年2月13日提交第60/356,982号、2002年4 月11日提交第60/372,007号、2002年9月4日提交第60/xxx,xxx号 题均为“生物盘和生物驱动分析仪系统以及相关方法”(Bio-Disc and Bio-Drive Analyser System Including Methods Relating Thereto)的美 国临时申请；2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动器 系统和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs)的第10/008,156号美国专利申请；和2002年1月10日提 交题为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中。 所有这些专利申请通过参考结合在本文中。
如本发明的一种优选实施方式，包括例如NN382、IRDye38、 IRDye40、IRDye41、IRDye78、IRDye700、和IRDye800的LI-COR IRDye(LI-COR Bioscience，Inc.，Lincoln，NE)，TO-PRO-5碘化物， IR-780碘化物，激光Pro IR Dyes(Molecular Probes，Eugene， OR)，dd-007，Zynostain(Zynocyte，Univ.of Glasgow，U.K.)，艾杜酞菁绿、 铜酞菁、3，3’-二乙基噻三羰花青碘化物(DTTCI)、3，3’-二乙基噁 三羰花青碘化物(DOTCI)、3，3’-二乙基噻二羰花青碘化物(DTDCI)、 和3，3’-二乙基噁二羰花青碘化物(DODCI)的红外吸收染料被用于 标记细胞核，以改进样本中细胞的核的图像。该染色过程有助于样本 中正常和异常细胞的附加信息和细节的可视化。其它染料可以被用于 染色细胞的各部分。可以被用于本发明的其它染料的示例被说明和列 举在Milwaukee，WI的Aldrich Chemical Inc.的Floyd J.Green发表的 “The Sigma-Aldrich Handbook of Stains，Dyes，dan Indicators”；New York，NY的Masaru Matsuoka(Ed.)在Plenum Press上发表的“Topics in Applied Chemistry：Infrared Absorbing Dyes”；和Patonay，G，和 Antonie，M.D.在1991年3月15日的Analytical Chemistry第6期第 63卷发表的“Near-infrared Fluorogenic Labels：New Approach to an Old Problem”中。所用这些资料都通过参考结合在本文中。
在本发明的另一优选实施方式中，染色过程涉及包括Zynostain 的活体核染色，以增加细胞核与周围细胞质的对比度和改进图像质量 并辅助识别各种白细胞类型。
接下来参照图60，表示使用本发明的光学生物盘系统所收集的利 用dd-007红外染料染色的白细胞的图像。如图所示，细胞核被染色并 且对来自光学盘读出器的入射束不透光。细胞核的不透光是由dd-007 染料对入射束的吸收导致的。如图所示，根据它们细胞核的形态可以 容易地识别样本中的各种细胞类型。图61表示图60中被识别细胞的 放大图。
试验详述
虽然已经参照附图详细说明本发明，下文给出本发明的进一步示 例的某些示例。
实例1
图17A的流程图表示样本的制备、生物盘的使用和图52和53 中更详细表示的结果的提供。例如方法步骤的单个时间周期、旋转速 率和其它细节的以下实例的细节比上文参照图17A、52和53所说明 的细节要更具体。但是，本实例的基本步骤类似于上述步骤。
A.包括衬底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，使用气枪清洗反射盘和透射盘衬底120(分别见图 2和图5)以去除灰尘颗粒。利用旋涂器使用异丙醇冲洗该盘两次。2 ％的聚苯乙烯被旋涂在盘上以给定非常厚的全涂层。
然后化学物被沉积。一种实施方式包括培育的三步沉积规程：抗 生蛋白链菌素，培育30分钟；生物素基化的原发抗体培育60分钟； 和继发俘获抗体培育30分钟。原发抗体可以在第一物种(例如羊)中 对抗第二物种(例如老鼠)的一种免疫球蛋白(例如lgG、lgG、lgM) 而被培养。继发俘获抗体在第二物种中对抗特定细胞表面抗原(例如 CD4、CD8)被培养。这些步骤在潮湿室中于室温下利用沉积之间的 冲洗和干燥步骤被完成。
1μl的比率为1mg/ml的磷酸盐缓冲盐水中的抗生蛋白链菌素被 涂在各窗上并培育30分钟。过量的抗生蛋白链菌素被利用蒸馏水冲洗 掉并且盘被烘干。等量的生物素基化的抗鼠lgG(PBS中125μg/ml) 和醛活化葡聚糖(200μg/ml)被组合。醛活化葡聚糖(DCHO)-生物素 基化的抗鼠lgG合成物被涂在各俘获窗口中抗生蛋白链菌素上并在制 冷机中培育60分钟或整夜。过量的试剂被冲洗掉并且盘被旋干。
如图47所示，可以有许多用于不同检验的径向观察窗，例如CD4 (窗口2)、CD8(窗口3)、CD3(窗口4)、和CD45(窗口5)，和负 控制(窗口6)，使用对抗人类细胞表面抗原的鼠lgG抗体。该被制备 的衬底在制冷机中培育30分钟或整夜。
化学沉积的图案被提供在以下表3中。
表3 窗口 1-2 3-4 5-6 7-8 第一层 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 继发抗体 B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO 原发抗体 小鼠抗人 CD4 小鼠抗人 CD8 小鼠抗人 CD3 小鼠抗人 CD45
B.盘装配
使用可以是例如25μm、50μm、或100μm厚的粘合层(图2和5 的通道层118)装配盘，带有被标记出部分，例如U形或“e-rad”通道， 以产生流动通道，和透明盖部分116(图5，用于带有顶检测器的透射 盘)或位于俘获区上的带有反射层142的盖部分116盘(图2，用于 带有底检测器的反射盘)。
在一种实施方式中，盘是一种涂有作为被编码信息层的300nm 金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1207 CD-R盘。在反射盘上， 通过已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×16mm的椭圆形观察 窗。在透射盘的某些设计中，没有蚀刻单独的观察窗，并且整个盘可 用。在这种具体实例中，通道层由Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661形成。盖为具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm等距 处的试样入口的透明盘。利用CD4/CD8计数软件使用该软件以4X的 速度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
C.盘泄漏检查
由于分析血液，可以首先检查盘的泄漏以确保在盘与原位试样自 旋过程中没有室泄漏。使用一种阻断剂，例如StabilGuard和 PBS-Tween，填充各通道。阻断至少一小时。盘被以5000rpm旋转5 分钟并检测泄漏和检查盘稳定性。在检测泄漏之后，盘被放在真空室 中24小时。真空处理24小时之后，盘被放置在真空袋中并储存在制 冷机中直至使用。
D.样本收集、制备和应用于盘
以下部分涉及图17A通常所示的样本处理步骤。通过密度梯度离 心方法提纯单核细胞(MNC)，例如使用Becton Dickinson CPT Vacutainer。血液(4-8ml)被直接收集入4或8ml的包含CPT Vacutainer的EDTA中。试管172被在带有水平转子和转位式桶的生 物危害离心室中以1500至1800×g室温下离心25分钟。血液最好在 收集两小时内被使用。离心后，覆盖单核细胞部分的血浆被去除，在 MNC层上留下约2mm的血浆。MNC被收集并使用PBS冲洗。通过 以300×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸。上清液被去除并且通 过轻敲试管包含MNC的丸被在PBS中再悬浮。在室温下一次以上以 300×g冲洗10分钟以去除血小板。最终丸被再悬浮至10,000细胞/ 微升的细胞计数。体积为18微升的MNC被导入一个或更多分析室或 通道，在盘静态情况下室温下培育15分钟。通道被密封。然后使用盘 驱动器以3000rpm的转速旋转盘3至4分钟。最好使用软件以速度4× 和抽样速率26.7MHz扫描和读该盘。
如果血样不能立即被处理，通过小心反转CPT管几次，第一离 心之后的单核细胞可以被在血浆中再悬浮，并在室温下被存储达到24 小时。在24小时内，血浆中的细胞可以如上所述被收集和冲洗。
E.CD4/CD8测定格式
本实例的测定为一种普通均匀固相细胞俘获测定，以快速确定血 样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞总体的绝对数和CD4+/CD8+淋巴 细胞的比率。在被结合入CD-ROM的小室中运行的该检测，确定被 从全血分离的7μl的单核细胞(MNC)中的俘获区上的特定抗体所俘 获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+和CD45+细胞的数量。该检测 基于盘上的具体位置上的局部细胞俘获的原理。根据具体血细胞表面 抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，通过俘获化学物的局部应用，在盘 上产生几个特定细胞俘获区。当使用MNC血(30,000细胞/微升)充 满室时，表示CD4、CD8、CD2、CD3和CD45抗原的细胞被在盘上 的俘获区中俘获。也被结合入条形码的是受限负控制区。
F.盘上分析
在上述步骤D中制备的MNC细胞(PBS中18微升)，被注入盘 室中，并密封室的入口和出口。该盘被在室温下培育15分钟，然后在 带有顶检测器的光学驱动器中使用780nm的激光扫描以成像如上所 述的俘获区。
软件被编码在盘上以指示驱动器自动执行以下任务：(a)在一个或 更多阶段中离心盘以分离过量的未结合细胞，(b)成像具体的俘获窗 口，和(c)处理数据，数据处理包括计数各俘获区中的具体被俘获细胞 和得出CD4/CD8比率(或者程序待确定的任何比率)。
在处理步骤过程中，软件沿各俘获区图像读并当它与这些细胞相 遇时标记细胞。举例说来，在计算CD4+和CD8+细胞的数量之后，软 件计算CD4+/CD8+比率，并显示每微升全血的CD4+、CD8+、CD3+ 和CD45+俘获区中的细胞的绝对数以及CD4+/CD8+比率。从将盘插 入光学驱动器到获得这些绝对数和比率整个过程需要12分钟。
G.所使用试剂
抗生蛋白链菌素(Sigma，cat.# S-4762)：添加去离子水以制作 5mg/ml的溶液，等分量并储存在-30℃下。为了使用，添加三羟甲基 氨基甲烷缓冲液使最终浓度为1mg/ml。
正控制：CD45(Sigma，Lot#038H4892，cat#C7556)。储存在 2-8℃下。
继发俘获抗体：蒸馏水中制造的1.5mg/ml生物素基化的抗鼠lgG (在羊中培养，Vector实验室，lot#L0602，Catalog#BA-9200)储 备液。在0.1M PBS中制造125μg/ml的b-lgG溶液。储存在2-8℃下。 可以被保持在-30℃用以长期储存。
醛活化葡聚糖(Pierce，lot#97111761，cat#1856167)。PBS中 5mg/ml储备液，储存在2-8℃下。
原发俘获抗体：CD4(DAKO，cat#M0716)、CD8(DAKO， cat#M0707)、CD2(DAKO，cat#M720)、CD45(DAKO，cat#M0701)、 CD14(DAKO，cat#M825)、和CD3(DAKO，cat#M7193)。储存在 2-8℃下。
负控制：小鼠lgG1(DAKO，cat#X0931)。储存在2-8℃下。
磷酸缓冲盐(PBS)，PH7.4(Life Technologies/GIBCO BRL，cat.#10010-023)或等价物。储存在室温下
异丙醇，90-100％
H.RBC溶解规程
氯化铵溶解缓冲液
1×氯化铵溶解缓冲液储备应该被储存在2-8℃下。它包括0.155M NH4Cl、10mMKHCO3和0.1mM二钠EDTA；Ph7.3至7.4。储存在2-8℃ 下。在使用之前达到室温。
程序
1.为每100μl的血添加2ml的溶解缓冲液。(最好在生物危害通风 厨(hood)中执行本程序。)
2.室温下涡动并培育15分钟。
3.以500×g室温下离心血液5分钟，使用生物危害通风厨中的 离心。
4.去除上清液并使用2％的PBS中的FCS或FBS冲洗细胞。离 心细胞。
5.计算WBC的总量并使得WBC的最终浓度为10,000细胞/微升 用以样本注入。
实例2
单核细胞分离程序
使用Becton和Dickinson Vacutainer CPT(BD catalog #362760 4ml，#362761 8ml)细胞制备试管与柠檬酸钠。在生物危害通风厨中 遵循所有生物危害预防措施执行程序。步骤如下：
1.将血直接收集入4或8ml包含CPT Vacutainer的EDTA中。 如果血样已经在抗凝血剂中，首先倒出Vacutainer中的EDTA并随后 将6-8ml的血样倒入CPT试管中。
2.在带有水平转子和转位式桶的生物危害离心室中以1500至 1800×g室温下离心试管25分钟。为了最好的结果，血液应该在收集 两小时内被离心。但是，长于2小时的血液应该在MNC数量减少和 RBC杂质增加的情况下被离心。
3.离心后，去除血浆在MNC层上留下约2mm的血浆。收集并传 送发白的单核细胞层进入15ml的锥形离心管。
4.添加10-15ml的PBS至MNC层，通过反转离心管几次小心混 合细胞。
5.通过在生物危害离心室中室温下以200×g离心10分钟冲洗细 胞。
6.去除上清液。通过轻敲试管再悬浮细胞。
7.在10ml PBS中冲洗一次以上。室温下以200-300×g离心10 分钟以去除血小板。
8.去除上清液并在50μl PBS中再悬浮细胞丸。
9.计算血样中的细胞计数。运行CBC或将2μl的细胞稀释为18μl 的锥虫蓝，小心混合并使用血细胞计数器计数细胞。将血样制备为用 以分析的最终10,000细胞/微升的细胞计数。
10.如果细胞不能立即被处理，通过小心反转CPT管几次，第一 离心(上述步骤2)之后在被分离的血浆中再悬浮单核细胞，并在室 温下被存储达到24小时。在24小时内，收集血浆中的细胞并继续如 上所述的冲洗。
每微升的总细胞计数＝25小平方(small squares)中的细胞数量× (乘)100。
实例3
使用Histopaque-1077从全血中分离MNC
1ml的Histopaque-1077被放置在15ml的离心管中并且1ml的 全血被小心地层叠在Histopaque-1077上面。然后以400×g室温下离 心。使用牧场吸管(pasture pipette)小心吸出合成物并且半透明界面被 传送至离心管。然后10ml的PBS被添加至离心管。然后溶液被以250 ×g离心10分钟。上清液被轻轻倒出并且细胞丸被在10ml PBS中再 悬浮并以250×g旋转10分钟。然后通过在10ml PBS中再悬浮并以 250×g旋转再次冲洗细胞。最终的细胞丸被在0.5ml的PBS中再悬浮。
实例4
盘制备和化学沉积(使用抗生蛋白链菌素)
A.包括衬底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，使用气枪清洗透射盘衬底以去除灰尘。然后该盘被 安装在旋涂器中并使用异丙醇的稳定流冲洗两次。接下来，带有被溶 解在310ml甲苯和65ml异丙醇中的2％聚苯乙烯的聚苯乙烯溶液被均 匀涂在盘上。
对于抗生蛋白链菌素沉积而言，抗生蛋白链菌素储备液被稀释为 PBS中1mg/ml。使用手工定位(pin)沉积，大约1μl的抗生蛋白链菌素 被沉积在盘上的各俘获区中。盘被在湿度室中培育30分钟。然后过量 的未结合抗生蛋白链菌素被利用D.I.水冲洗掉并且盘被旋干。
对于继发抗体沉积而言，醛活化葡聚糖的新鲜溶液(PBS中 200μg/ml)被与等量的Vector lgG(PBS中125μg/ml)组合。使用手 工定位沉积，大约1μl的lgG+DCHO合成物被沉积在盘上的各俘获区 中。盘被在湿度室中培育60分钟。过量的抗体被利用D.I.水冲洗掉并 且盘被旋干。
对于原发抗体沉积而言，DAKO CD4被稀释为PBS中50μg/ml， DAKO CD8被稀释为PBS中25μg/ml，而DAKO CD45被稀释为PBS 中145μg/ml。使用手工定位应用器，在被结合继发抗体上部沉积大约 1μl的各原发抗体。然后盘被在湿度室中培育30分钟。过量的未结合 抗体通过使用PBS冲洗俘获区被去除并且盘被旋干。
B.盘装配
所用的盖盘为带有被固定至盘的Fraylock粘合通道层的透明盘。 被标记入粘合剂的是产生射流电路的4个U形通道。盖被放置在透射 盘衬底上以使流动通道覆盖俘获区。接着，为了将盘固定在一起，它 们被通过盘压8次。
C.盘泄漏检查、阻断
使用StableGuard填充各通道并培育一小时。在培育过程中，盘 被在旋涂器中以5000rpm旋转5分钟。在旋转之后，盘通道被检查泄 漏。接下来，StableGuard被吸出通道，并且盘被放置在真空室中在 真空下整夜。第二天早晨，盘被放置在真空袋中并储存在4℃下。
实例5
血涂片的制备
从包含RBC、大量WBC和血小板的白细胞层中取5μl血。细胞 被放置在中央盖片的一端，将另一盖片的一端放在血滴上用以沿边缘 扩散血液并随后均匀地滑过，细胞被固定在100％乙醇中并风干。
实例6
使用Zynostain染色细胞
A.从白细胞层中取25μl的血细胞，并通过使用1％的乙醇、1％ 的TritoX 100(50μl/5ml Po4缓冲液)和使用37℃的培育温度，使用 25μl的活体染料Zynostain染色，在10、20和30分钟取出样本。然 后细胞被涂在玻璃盖片上。盖片被固定至光学生物盘并且然后使用光 学生物盘系统取细胞的图像。
B.从白细胞层取血细胞并与Zynostain以1∶3和1∶6的细胞比染 料比率混合，并培育5、10和30分钟。然后制作玻璃盖片上的涂片。 盖片被固定至光学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图 像。我们发现1∶6的细胞与染料比率和30分钟的培育表现良好的细胞 染色。
C.取5μl的全血并与20μl的白血病培养细胞和120μl的Zynostain 混合，并培育30分钟。然后制作玻璃盖片上的涂片。盖片被固定至光 学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图像。
实例7
使用To-Pro-5-碘化物荧光染料染色淋巴细胞培养细胞(KG1a)
培养细胞被以800rpm离心5分钟。上清液被去除并且细胞丸被 在Ph7.4的PBS中再悬浮。然后10μl的TP-Pro-5-碘化物和100μl的 细胞悬浮液被混合。然后在使用To-Pro-5-碘化物培育5、10、30分钟 后在荧光显微镜下观察细胞。
实例8
使用LI-COR IRDye38染色KG1a细胞
在Ph7.4的PBS中冲洗KG1a培养细胞两次(以800rpm旋转2 ×10分钟)。被冲洗后的细胞在DI水中的4％IRDye38中培育30分 钟。然后在玻璃盖片上涂片。盖片被固定至光学生物盘并且然后使用 光学生物盘系统取细胞的图像。
实例9
使用IRDye38和dd-007染色KG1a细胞
分离KG1a细胞，以800rpm旋转培养细胞5分钟，轻轻倒出上 清液并在Ph7.4的PBS中冲洗细胞2×10分钟。被冲洗后的细胞被分 为两等份，并与或者DI水中的4％IRDye38或者TritonX-PBS7.4中 的dd-007混合各30分钟。然后细胞被涂在玻璃盖片上。盖片被固定 至光学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图像。使用 dd-007染料的本实验的结果表示在图60和61中。
结束声明
本文所公开的涉及设备、方法和过程的本发明的方面也被说明在 2001年9月20日提交序列号为60/323,682的题为“使用阻断剂减少光 学生物盘上的细胞非特异结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents)的美国临时申请；2001年9月24日提交序列号为60/324,336 的题为“使用聚乙烯醇减少射流室中的气泡的方法和在光学生物盘中 获得相同效果的相关技术”(Methods for Reducing Bubbles ih Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年10月 3日提交序列号为60/326,800的题为“光学分析盘部件内的危险生物材 料的容器的密封方法”(Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies)的美国临时申请；2001年10月10日提交序列号为 60/3028,246的题为“使用光学生物盘平台计算帮助剂/诱导剂抑制剂/ 毒素T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/ Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年10月19日提交序列号为60/386,072的题为“使用光 学生物盘平台表征包括白血病血样的癌血细胞的定性和定量方法” (Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年10月19日提交 序列号为60/386,073的题为“使用光学生物盘平台定性和定量表征包 括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法”(Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年10月26日提交序列号为60/386,071的题为“通过原 发抗体与试样的位置外培育和随后通过表面结合继发抗体的具体细胞 俘获方法和包括该方法的光学生物盘”(Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年11月7 日提交序列号为60/344,977的题为“包括免疫表型的细胞分离和定型 的定量及定性方法”(Quantitative and Oualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping)的美国临时申 请；和2001年11月9日提交序列号为60/349,975的题为“使用包括肝 素、血浆、和聚赖氨酸等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异 结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin， Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请通过参考 结合在本文中。
所有专利、临时申请、专利申请、和本说明书提到其它的出版物 被全部结合入本文的参考文献中。
尽管本发明已经被参照某些优选实施方式详细说明，应该理解本 发明不限于这些精确实施方式。相反，根据说明实施本发明的目前最 佳方式的本光学生物公开，本领域的技术人员将明白在不偏离本发明 的精神和领域的情况下的许多修改和变化。因此，本发明的领域被下 面的权利要求书指示，而不是前面的说明。在权利要求书的等价物的 意思和范围内的所用改变、修改和变化将被认为是在这些领域内的。
此外，仅是使用常规试验，本领域的技术人员将认识或者能够确 定这里所述的本发明的具体实施方式的许多等价物。这些等价物也被 确定为被下面的权利要求包括。
本发明与盘驱动系统、光学生物盘、细胞测定和相关的细胞计数 方法、图像处理技术、和相关软件有关的方面也表现在2001年11月 13日提交序列号为60/338,679的题为“包括免疫表型的细胞分离和定 型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing including Immunophenotyping)的美国临时 申请；2001年11月14日提交序列号为60/332,001的题为“免疫表型的 俘获层部件和光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping)的美国临时申请；2001年11月30 日提交序列号为60/334,131的题为“使用光学生物盘平台计算帮助剂/ 诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2002年1月17日提交序列号为 60/349,392的题为“使用全血和相关的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋 巴细胞的RBC筛分规程评价”(RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的美国临时申请；2002年1月18 日提交序列号为60/349,449的题为“使用全血和相关的帮助剂/诱导剂 抑制剂/毒素T淋巴细胞的RBC溶解规程评价”(RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/lnducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Dlsc)的美国临时申 请；2002年1月31日提交题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方法和 执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的第60/353,300号美国临时专利；2002年2月5日 提交题为“在包括等径分析区的光学生物盘上执行的分组标示测定” (Cluster Designation Assays Performed on Optical Blo-Disc Including Equi-Radial Analysis Zones)的第60/355,644号美国临时专 利；2002年2月19日提交题为“在包括等径分析区的光学生物盘上执 行的分组标示测定和相关系统及方法”(Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-Disc Including Equl-Radial Analysis Zones and Related Systems and Methods)的第60/358,479号美国临时专 利；2002年3月12日提交题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的方法和 执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的第60/363,949号美国临时专利；；和2002年8月 21日提交题为“包含相关设备和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的 白细胞的细胞鉴别计数方法”(Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same)的 第60/404,921号美国临时专利，所有这些申请被结合在本文的参考文 献中。
驱动系统和相关盘
图1为如本发明的本文公开的执行细胞计数和细胞鉴别计数的光 学生物盘110的透视图。本光学生物盘110被连同光学盘驱动器112 和显示器114显示。与这种类型的盘驱动器和盘分析系统被公开在通 常已知的2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动器系统 和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs)的 第10/008,156号共同待审批美国专利申请和2002年1月10日提交题 为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中， 这两个专利申请通过参考结合在本文中。
图2是光学生物盘110的一种实施方式的主要结构部件的分解透 视图。图2为可以被用于本发明的一种反射区光学生物盘110(下文 称为“反射性盘”)的示例。主要结构部件包括盖部分116、粘合部件 或通道层118、和衬底120。盖部分116包括一个或更多入口部分122 和一个或更多出气口124。盖部分116可以被由聚碳酸脂形成，并且 当从图2的透射方向看时最好在它的底部上涂有反射性表面146(图 4)。在优选实施方式中，触发标记或标志126被包括在反射性层142 的表面上(图4)。如图10所示，触发标志126可以在编码有传送数 据至处理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性 区域的所有三层中包括透明窗，这反过来与询问或入射束152的操作 功能相互作用，图6和10。
图2所示的第二部件为一种具有射流电路128或形成其中的U通 道的粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形 成如图所示的形状，形成射流电路128。每个射流电路128包括流动 通道130和回流通道132。图2所示的一些射流电路128包括混合室 134。表示两种不同类型的混合室134。第一是相对于流动通道130被 对称形成的对称混合室136。第二是位移混合室138。位移混合室138 被形成于所示流动通道130的一侧。
图2所示的第三部件为包括目标或俘获区140的衬底120。衬底 120最好被由聚碳酸脂制成，并具有图4所示被沉积在它的顶部上的 反射性层142。通过以所示形状或其它任何所需形状去除反射性层142 形成目标区140。此外，目标区140可以通过掩蔽技术被形成，该掩 蔽技术包括在应用反射性层142之前掩蔽目标区140区域。反射性层 142可以由一种例如铝或金的金属被形成。
图3为图2所示的光学生物盘110的顶视图，在以透明显示的盖 部分116上具有反射性层142以展示位于盘内的射流电路128、目标 区140和触发标记126。
图4为如本发明的一种实施方式的发射区型光学生物盘110的放 大透视图。本图包括一部分它的各种层，切掉以表示各主要层、衬底、 涂层、或膜的部分截面图。图4表示涂有反射性层142的衬底120。 活性层144被应用于反射性层142上。在优选实施方式中，活性层144 可以由聚苯乙烯形成。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改 性玻璃、或例如聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以 使用水凝胶。此外，如本实施方式所示，塑料粘合部件118被应用于 活性层144之上。塑料粘合部件118的被暴露部分表示产生射流电路 128的切掉或被压制U形。本生物盘的这种发射区实施方式中的最终 主要结构层为盖部分116。盖部分116包括它的底部上的反射性表面 146。反射性表面146可以由一种例如铝或金之类的金属被制成。
现在参照图5，表示如本发明透射型光学生物盘110的主要结构 部件的分解透视图。透射型光学生物盘110的主要结构部件同样包括 盖部分116、粘合或通道部件118、和衬底120层。盖部分116包括一 个或更多入口部分122和一个或更多出气口124。盖部分116可以被 由聚碳酸脂形成。可选的触发标记126被包括在薄半反射性层143的 表面上，如图6和9所示。触发标志126可以在编码有传送数据至处 理器166的信息的生物盘、不透明区域、或反射性或半反射性区域的 所有三层中包括透明窗，如图10所示，这反过来与询问光束152的操 作功能相互作用，图6和10。
图5所示的第二部件为具有射流电路128或形成其中的U通道的 粘合部件或通道层118。通过压制或切削膜以去除塑料薄膜并形成如 图所示的形状，形成射流电路128。每个射流电路128包括流动通道 130和回流通道132。图5所示的一些射流电路128包括混合室134。 表示两种不同类型的混合室134。第一是相对于流动通道130被对称 形成的对称混合室136。第二是位移混合室138。位移混合室138被形 成于所示流动通道130的一侧。
图5所示的第三部件为包括目标或俘获区140的衬底120。衬底 120最好被由聚碳酸脂制成，并具有图4所示被沉积在它的顶部上的 半反射性层143。与图5和图6所示的盘110的衬底120相联系的半 反射性层143与图2、3和4所示的盘110的衬底120上的反射性层 142相比要薄得多。较薄的半反射性层143允许询问光束152沿图6 和12所示的透射盘的结构层的一些透射。该薄半反射性层143可以由 一种例如铝或金的金属被形成。
图6为图5所示的光学生物盘110的透射实施方式的衬底120和 半反射性层143的放大透视图。薄半反射性层143可以由一种例如铝 或金之类的金属被制成。在优选实施方式中，图5和6所示的透射盘 的薄半反射性层143的厚度大约为100-300埃并不超过400埃。该较 薄半反射性层143允许一部分入射或询问光束152透过并通过半反射 性层143以被图10和12所示的顶检测器158检测，而一些光被沿入 射光路反射或返回。如下文所示，表2表示金薄膜相对于膜的厚度的 反射和透射性质。厚度大于800埃的金薄膜层完全反射。而光线沿金 薄膜透射的临界密度大约为400埃。
除表2外，图7的图表提供基于金的厚度的薄半反射性层143的 反射和透射性质的相反关系。图7所示的图表中所使用的反射和透射 性数值为绝对值。
表2
金薄膜反射和透射(绝对值) 厚度(埃) 厚度(nm) 反射比 透射比 0 0 0.0505 0.9495 50 5 0.1683 0.7709 100 10 0.3981 0.5169 150 15 0.5873 0.3264 200 20 0.7142 0.2057 250 25 0.7959 0.1314 300 30 0.8488 0.0851 350 35 0.8836 0.0557 400 40 0.9067 0.0368 450 45 0.9222 0.0244 500 50 0.9328 0.0163 550 55 0.9399 0.0109 600 60 0.9448 0.0073 650 65 0.9482 0.0049 700 70 0.9505 0.0033 750 75 0.9520 0.0022 800 80 0.9531 0.0015
接下来参照图8，图8表示图5和6所示的透射型光学生物盘110 的顶视图，具有展示位于盘内的射流通道、触发标记126和目标区140 的透明的盖部分116。
图9为如本发明的透射盘实施方式的光学生物盘110的放大透视 图。所示的盘110具有一部分它的各种层，切掉以表示各主要层、衬 底、涂层、或膜的部分截面图。图9表示具有透明盖部分116、衬底 120上的薄半反射性层143、和触发标志126的透射盘格式。在本实施 方式中，触发标志126包括被放置在盘的顶部的不透明材料。此外， 触发标志126可以由被刻蚀在盘的薄反射性层143上的透明、非反射 性窗口，或者任何吸收或不反射来自图10所示的触发检测器160的信 号的标志形成。图9也表示，通过以指定形状或其它任何所需形状标 记指定区域形成目标区140。指示目标区140的标记可以被做在衬底 120的薄半反射性层143上或衬底120的底部上(盘下)。此外，可以 通过一种包括掩蔽除目标区140之外的整个薄半反射性层143的掩蔽 技术形成目标区140。在这种实施方式中，目标区140可以通过丝网 印印墨至薄半反射性层143上被产生。在图5、8和9所示的透射盘格 式中，可以替代地通过盘上的地址信息编码定义目标区140。在这种 实施方式中，目标区140不包括物理可识别边界。
继续参照图9，表示活性层144被应用于薄半反射性层143上。 在优选实施方式中，活性层144为厚度为10至200μm的2％聚苯乙 烯层。此外，可以使用聚碳酸脂、金、活性玻璃、改性玻璃、或例如 聚苯乙烯共马来酐之类的改性聚苯乙烯。此外，可以使用水凝胶。如 本实施方式所示，塑料粘合部件118被应用于活性层144之上。塑料 粘合部件118的被暴露部分表示产生射流电路128的切掉或被压制U 形。
本生物盘110的这种透射实施方式中的最终主要结构层为包括入 口122和出气口124的透明、非反射性盖部分116。
现在参照图10，以透视图和框图表示光学部件148、产生入射或 询问光束152的光源150、返回光束154和透射光束156。在图4所示 的反射性生物盘的情况下，返回光束154被从光学生物盘110的盖部 分116的反射性表面146反射。在本光学生物盘110的这种反射实施 方式中，通过底检测器157检测返回光束154并分析信号码元的存在。 另一方面，在透射性生物盘格状中，通过顶检测器158检测透射光束 156并也分析信号码元的促在。在透射实施方式中，光检测器可以被 用作顶检测器158。
图10也表示包括盘上的触发标记126和触发检测器160的硬件 触发装置。该硬件触发装置被用于反射性生物盘(图4)和透射性生 物盘(图9)中。触发装置允许检测器166仅当询问光束152在相应 的目标区140上时收集数据。此外，在透射性生物盘系统中，也可以 使用软件触发器。软件触发器使用底检测器发信号给处理器166以当 入射束152击中相应的目标区140的边缘时就收集数据。图10还表示 驱动电机162和控制光学生物盘110的旋转的控制器164。图10也表 示被以处理返回光束154和透射光束156的替代方式实施的处理器 166和分析仪168。
如图11所示，表示如本发明的光学生物盘110的反射盘实施方 式的局部横截面图。图11表示衬底120和反射层142。如上所述，反 射层142可以被由例如铝、金或其它适当反射性材料制成。在这种实 施方式中，衬底120的顶面为光滑的。图11也表示被应用于反射层 142之上的活性层144。同样如图11所示，通过在所需位置去除反射 层142的区域或部分，或者通过在应用反射层142之前掩蔽所需区域， 形成目标区140。还是如图11所示，塑料粘合部件118被应用于活性 层144之上。图11也表示盖部分116和与之联系的反射性表面146。 因此当盖部分116被应用于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118时， 形成流动通道130。如图11的箭头所示，入射束152的光路初始地被 从盘110的下部指向衬底120。入射束然后聚集在最接近反射层142 的点上。由于这种聚集发生在一部分反射层142不存在的目标区140 中，入射束沿光路继续通过活性层144并进入流动通道130。入射束 152然后继续向上横穿过流动通道最终入射至反射性表面146上。此 时，入射束152被沿入射光路返回或反射回并因此形成返回光束154。
图12为如本发明的光学生物盘110的透射实施方式的局部横截 面图。图12表示带有透明盖部分116和衬底120的薄半反射层143 的透射盘格式。图12也表示被应用于薄半反射性层143之上的活性层 144。在优选实施方式中，透射盘具有由一种例如铝或金之类的金属制 成的厚度大约为100-300埃并不超过400埃的薄半反射性层143。这 种薄半反射性层143允许一部分来自图10所示的光源150的入射或询 问光束152穿透并向上通过盘以被顶检测器158检测，而一些光被沿 与入射束相同的光路但以相反方向被反射。在这种方式中，返回或被 反射光束154被从半反射性层143反射。因此，在这种方式中，返回 光束154不进入流动通道130。如连同图13和14更详细说明的那样， 反射光或返回光束154可以被用于跟踪被形成在半反射性层143中或 上的预录制信息道的入射束152。在图12所示的盘实施方式中，可以 或可以不存在物理限定的目标区140。目标区140可以通过在衬底120 上的薄半反射性层143上直接标记被产生。可以使用丝网印制或任何 等价方法形成这些标记。在没有物理标记被用于定义目标区的替代实 施方式中(例如，当使用编码软件寻址时)，流动通道130实际上可以 被采用为执行调查特征的检测的受限目标区。
图13为沿如本发明的生物盘110的反射盘实施方式的信道所取 的横截面图。本图为沿半径和盘的流动通道横向所取。图13包括衬底 120和反射层142。在这种实施方式中，衬底120包括一系列槽170。 槽170处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸的形式。槽170被实施以 使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170跟踪。这种类型的槽170被 称作“摆动槽”。具有波动或波状侧壁的底部形成槽170，而升高或提 高部分在螺旋方向分离相邻的槽170。在这种实施方式中，如图所示， 被应用于槽170之上的反射层142实质上共形。图13也表示被应用于 反射层142之上的活性层144。如图13所示，通过在所需位置去除反 射层142的区域或部分，或者通过在应用反射层142之前掩蔽所需区 域，形成目标区140。还是如图13所示，塑料粘合部件118被应用于 活性层144之上。图13也表示盖部分116和与之联系的反射性表面 146。因此当盖部分116被应用于包括所需切掉形状的塑料粘合部件 118时，形成流动通道130。
图14为沿如例如图12所述的本发明的生物盘110的透射盘实施 方式的信道所取的横截面图。本图为沿半径和盘的流动通道横向所取。 图14表示衬底120和薄半反射层143。该薄半反射性层143允许来自 光源150的入射或询问光束152穿透并通过盘以被顶检测器158检测， 而一些光被以返回光束154的形式反射返回。该薄半反射性层143的 厚度通过盘读出器保持循迹能力所需的反射光的最小数量而被确定。 在这种实施方式中，与图13所述相似，衬底120包括一系列槽170。 在这种实施方式中槽170也最好处于从靠近盘的中心向外缘螺旋延伸 的形式。槽170被实施以使询问光束152可以沿盘上的螺旋槽170跟 踪。图14也表示被应用于薄半反射性层143之上的活性层144。还是 如图14所示，塑料粘合部件118被应用于活性层144之上。图14也 表示没有反射性表面146的盖部分116。因此，当盖部分116被应用 于包括所需切掉形状的塑料粘合部件118时，形成流动通道130，并 且一部分入射束152被允许实质上无反射地通过。
图15与图11类似，表示反射盘的总厚度及其初始折射性质。图 16与图12类似，表示透射盘的总厚度及其初始折射性质。图15中未 显示槽170，因为沿槽170切截面。图15和16表示本实施方式中位 于垂直于槽170的位置的窄流动通道130的存在。图13、14、15和 16表示相应的反射性或透射性盘的总厚度。在这些图中，入射束152 被表示为初始与具有改变入射束的光路的折射性质的衬底120相互作 用，表示为提供光束152在反射层142或薄半反射性层143上聚集。
细胞测定
可以使用本发明的方法实施一种普通均匀固相细胞俘获测定，以 快速确定血样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞总体的绝对数和 CD4+/CD8+淋巴细胞的比率。在被结合入生物盘的小流动通道中运行 的该检测，确定被从全血分离的7-15μl的单核细胞(MNC)中的俘获 区上的特定抗体所俘获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+、CD19+和 CD45+细胞的数量。该检测基于盘上的具体位置上的局部细胞俘获的 原理。根据具体血细胞表面抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，通过俘 获化学物的局部应用，在盘上产生几个特定细胞俘获区。当使用MNC 血(10,000-30,000细胞/微升)充满25-100微升的室时，表示CD4、 CD8、CD2、CD3、CD19和CD45抗原的细胞被在盘内的俘获区中 俘获。也被结合入俘获区的是受限负控制区。
图17A的流程图表示血样的分析。在步骤1，血液(4-8ml)和 例如EDTA、酸性柠檬酸盐葡萄糖(ACD)、或肝素之类的抗凝血剂被 直接收集入4或8ml的Becton Dickinson CPT VacutainerTM中。在本 发明的另一实施方式的等价步骤中，3ml的抗凝血剂中的血被叠加入 包含例如Histopaque1077之类的分离梯度(separation gradient)176 的试管172中。在任何情况下，血样174最好被在收集的两小时内使 用。叠加有血样174的包含分离梯度176试管172被在带有水平转子 和转位式桶的生物危害离心室中以400×g室温下离心30分钟。离心 后，血浆层178被去除(步骤2)，在单核细胞(MNC)部分180上 留下约2mm的血浆。MNC层180被收集并使用磷酸缓冲盐(PBS) 冲洗。通过以250×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸以去除任何 剩余血小板。上清液被去除并且通过轻敲试管MNC丸180被在PBS 中再悬浮。根据生物盘110的流动通道130的高度，最终丸180被再 悬浮(步骤3)至10,000-30,000细胞/微升的细胞计数。
使用7微升的MNC悬浮液充满生物盘110的流动通道130，并 使用胶带或其它适当的密封部件密封室的入口122和出气口124(图3 和8)(步骤4)。生物盘110被在室温下培育15分钟，然后在光学驱动 器112中使用780nm的激光扫描以成像俘获区(步骤5)。应该理解 如果使用一种透射性生物盘110，光学驱动器112可选地包括顶检测 器158(图10)以成像俘获区。最后软件被编码在盘上以指示驱动器 自动执行以下任务：(a)在一个或更多阶段中离心盘以分离过量的未结 合细胞；(b)在显示监视器114上成像具体的俘获窗口；和(c)处理数据。 数据处理包括但不限于计数各俘获区中的具体被俘获细胞和得出 CD4+/CD8+比率或者程序待确定的任何比率。通过本发明的其它实施 方式可以容易地提供其它所需比率。
还是如图17A所示，本发明涉及一种使用光学盘和盘驱动器系统 执行鉴别计数的方法。该方法包括以下步骤：在包含分离梯度的第一 试管中提供血样，以足以将血样分离为层的时间和速度旋转第一试管， 再悬浮包含T细胞的MNC层以形成MNC悬浮液，在包括至少一包 含至少一种俘获剂的俘获区的盘表面上提供MNC悬浮液试样，将盘 载入光学读出器，旋转盘，将电磁辐射的入射束指向俘获区，检测在 与盘的俘获区相互作用之后所形成的电磁辐射束，将所检测光束转换 为输出信号，和分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的 数量相关的信息。在本方法的一种实施方式中，光学盘被构造带有反 射层以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被反射。在本方法的另一 实施方式中，光学盘被构造以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被 通过光学盘透射。
在分析/处理步骤过程中，软件沿各俘获区图像读并当它与这些 细胞图像相遇时标记细胞图像。举例说来，在计数被俘获CD4+和CD8+ 细胞的数量之后，软件计算CD4+/CD8+比率，并显示每微升全血的 CD4+、CD8+、CD3+和CD45+俘获区中的细胞的绝对数以及 CD4+/CD8+比率。从将盘插入光学驱动器到获得这些绝对数和比率整 个过程需要12分钟。
在一种实施方式中，盘是一种涂有作为被编码信息层的300nm 金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1207 CD-R盘。在反射盘上， 通过已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×1mm的椭圆形观察窗。 在透射盘的某些设计中，没有蚀刻单独的观察窗，并且整个盘可用。 在一种具体实施方式中，粘合层为Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661。盖为具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm等距处的 试样入口的透明盘。利用CD4+/CD8+计数软件使用该软件以4X的速 度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
参照图17B，在本发明的一种实施方式中，聚苯乙烯118厚层被 形成在衬底120之上并且(可选地)与抗生蛋白链菌素182分层。细 胞俘获抗体通过生物素被固定至抗生蛋白链菌素182。这些抗体可包 括被固定至涂在抗生蛋白链菌素上的葡聚糖活化醛的生物素基化的抗 体以为俘获抗体产生足够数量的结合位置。这产生可以具体形成与白 细胞(WBC)的强结合的强俘获化学。
图18A、18B、18C图示在本发明的一种实施方式中所使用的交 联系统。应该理解交联系统涉及一种或更多交联剂、或共轭物，以将 一个或更多大分子片断与另一个交联。交联可以是两大分子片断之间 的共价或非共价相互作用，通常当两大分子自由基结合时被形成。获 得交联的化学改性或共扼方法涉及一官能团与另一官能团的反应，导 致键的形成。带有反应性或选择反应性官能团的生物共扼剂的产生形 成目标分子的简单和可复制交联或标记的基础(Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press，San Diego，CA发布的“生物共扼技术” (Bioconjugate Techniques))。
交联剂包括但不限于同双功能交联剂(homobifunctional linker)、异双功能交联剂(heterobifunctional linker)、和零长度交联 剂。同双功能交联剂为具有两相同功能性的反应活性部位的交联剂， 例如戊二醛。这些试剂通过与两分子上的相同的共群的共价反应可以 将一蛋白质结合至另一蛋白质。异双功能共扼剂包含两种可以结合至 蛋白质和其它大分子上的两不同功能目标的不同反应基。举例说来， 交联剂的一部分可以包含胺反应基，而另一部分可以包含硫氢反应基。 结果是将交联反应指向目标分子的被选部分的能力，因此获得对共扼 工程更好的控制。零长度交联剂通过形成不包含附加原子的键促成两 分子的共扼。因此，在没有中间连接剂或间隔物的情况下一分子的一 原子被共价固定至第二分子的一原子。关于交联剂的详细说明，本领 域的技术人员可以参考Greg T.Hermanson 1996年在Academic Press， San Diego，CA发布的“生物共扼技术”(Bioconjugate Techniques))。 在本发明中，交联剂被结合至生物盘的表面以固定目标区内的俘获剂。 优选的交联剂系统为包含生物素-抗生蛋白链菌素的异双功能基，即 被结合至结合抗生蛋白衬底的生物素基化的俘获剂。图18A表示抗生 蛋白链菌素182。不受限制，抗生蛋白链菌素包括抗生蛋白、抗生蛋 白链菌素及其修改。如图所示，蛋白质包括四亚基，各亚基包含一生 物素(Hermanson)结合位置。抗生蛋白链菌素182可以通过各种化 学方法被结合至例如聚苯乙烯之类的塑料。理想地，抗生蛋白链菌素 182被固定至生物盘的活性层144(图4和图9)，实质上不可逆地结 合至生物素基化的敏感元件(例如抗体)。
图18B是生物素184的图示表示。生物素(或维生素H)是在每 个细胞内少量存在的自然发生增长因子。生物素与蛋白质抗生蛋白和 抗生蛋白链菌素的相互作用是已知的最强的非共价亲和力之一。生物 素分子184通过它的戊酸侧链可以直接被结合至蛋白质或者与其它有 机成分衍生(derivitized)以产生间隔壁(spacer arm)和多种反应基。 通过适当地选择生物素衍生物(Hermanson)胺、羟酸盐、硫氢和碳水 化合物基可以被具体作为生物素基化的目标。图18C表示包含与抗生 蛋白链菌素182相互作用的生物素184的交联系统。
本发明的具体实施方式利用俘获剂执行所述测定。应该理解俘获 剂指检测被分析物的任何大分子。本发明的俘获剂包括针对感兴趣的 一种被分析物优先选择、或具有选择性结合亲和力的大分子。俘获剂 包括，但不限于合成或生物制造核酸和合成和生物制造蛋白质。本发 明所可以采用的俘获剂的示例为，但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核 糖核酸(RNA)、低聚核苷酸、聚合酶链反应物、或这些核苷酸的组 合(嵌合体)、抗体(单克隆或多克隆)、细胞膜受体、和与具体抗原 定子(例如在病毒、细胞和其它材料上)的抗血清反应物、药物、肽、 辅因子、外源凝集素、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。优选地，本发 明的俘获剂为抗体。
抗体包括但不限于多克隆、单克隆和重组体产生抗体。本发明的 抗体可以在活体内或活体外被制造。抗体的制造方法为本领域的技术 人员所熟知。例如，见Peter Delves(Ed.)、John Wiley和Son Ltd 所著的编号为ISBN：0471970107(1997)的抗体制造：基本技术，该书 的全部内容通过引用结合在本文中。此外，可以从商业来源获得抗体， 例如Flanders Pleasant Hill路，NJ 07836的Research Diagnostics股 份有限公司。本发明的抗体不限于任何特定物种的抗体；例如人类、 老鼠、大鼠、和山羊的抗体都被本发明考虑。优选地，本发明的原发 抗体为在老鼠中所制造的反人(anti-human)抗体，本发明的继发抗 体为在山羊中所制造的反鼠抗体。
术语“抗体”也包括抗体的任何类或项目，作为任何或所用可以被 用于结合至细胞表面抗原的抗体类型。抗体在医疗诊断技术中的使用 为本领域的技术人员所熟知。例如，见Andrew J.T.George和Catherine E.Urch(Eds.)在Humana Press发表的ISBN：0896037983(2000)的 Diagnostic and Therapeutic Antibodies(Methods in Molecular Medicine)和Siegfried Matzku与Rolf A.Stahel(Eds.)在Harwood Academic Pub.发表的ISBN：9057023105(1999)的Antibodies in Diagnosis and Therapy：Technologies，Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series)，这些材料的全部内容通过引用结合在本 文中。
在本发明的至少一些实施方式中，多种俘获剂被用于检测感兴趣 的被分析物。图18D表示作为第二俘获剂186被用于本发明的方法中 的lgG类抗体。应该理解本发明的第二俘获剂包括但不限于具有对另 一俘获剂的亲和力的俘获剂，该俘获剂具有对感兴趣的被分析物的亲 和力。图18E表示被结合至生物素分子184第二俘获剂lgG186，下文 称为生物素基化的lgG。
图18F图示第一俘获剂188。应该理解本发明的第一俘获剂188 具有对感兴趣的被分析物的选择性亲和力。优选地，第一俘获剂为一 种具有对白细胞的亲和力的抗体。更具体地说，这些抗体被对准淋巴 细胞(CD2、CD19)、单核细胞(CD14)、嗜曙红白细胞(CD15)和 其它感兴趣的细胞表面标记物。图18G表示被结合至生物素分子184 的第一俘获剂188。除CD4和CD8之外，还有与许多其它细胞表面 抗原(例如CD3、CD16、CD19、CD45、CD56)相对的抗体，这些 抗体被用于识别淋巴细胞的项目。
图18H图示CD4+T细胞190。CD4+T细胞结合至通过例如巨噬 细胞和树状细胞之类的抗原递呈细胞(APC)表示的特定抗原，并释 放吸引其它免疫系统至该区域的淋巴细胞活素。结果是炎症，和试图 隔开并破坏抗原材料的细胞及分子的集聚。应该理解CD4+T细胞具 有多个覆盖整个细胞表面的抗原192。但是，仅是为了示例的目的， 图18H表示具有四个抗原192的CD4+T细胞190。
图18I图示CD8+型T细胞194。这些T细胞分泌破坏它们结合 至的细胞的分子。这对抵抗病毒感染很重要，因为CD8+T细胞在被感 染细胞释放能够感染其它细胞的新一组病毒之前破坏被感染细胞。应 该理解CD8+T细胞具有多个覆盖整个细胞表面的抗原196。但是，仅 是为了示例的目的，图18I表示具有四个抗原196的CD8+T细胞194。
图18J图示被结合至3维矩阵的醛活化葡聚糖(DCHO)198的 继发抗体186，从而形成DCHO抗体合成物199。葡聚糖主要是一种 由被糖苷键链接在一起的右旋葡萄糖的重复单位构成的线性多糖。作 为被广泛使用的交联剂，葡聚糖实质上为多价，这允许分子在沿聚合 物链(Hermanson)的多个位置被结合。仅是为了示例的目的，将如 图18K说明被结合至葡聚糖198的抗体186。
与本发明的细胞测定相关的方面也被公开在2001年7月27日提 交序列号为60/308,176的题为“使用光学生物盘平台表征包括白血病 血样的癌血细胞的定性和定量方法”(Ouantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年8月15日提交序列号为60/312,248的题为“使用光学 生物盘平台定性和定量表征包括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法” (Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年8月20日提交 序列号为60/313,514的题为“通过原发抗体与试样的位置外培育和随 后通过表面结合继发抗体的具体细胞俘获方法和包括该方法的光学生 物盘”(Methods for SpecifIc Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年8月20日提交序列号为60/313,715 的题为“使用全血和相关的光学生物盘的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T 淋巴细胞的RBC溶解规程评价”(RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/lnducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的美国临时申请；2001年8月 20日提交序列号为60/313,536的题为“使用全血和相关的光学生物盘 的帮助剂/诱导剂抑制剂/毒素T淋巴细胞的RBC筛分规程评价”(RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc)的 美国临时申请；和2001年8月30日提交序列号为60/315,937的题为“包 括免疫表型的细胞分离和定型的定量及定性方法”(Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including lmmunophenotyping)的美国临时申请，所有这些申请通过参考结合 在本文中。
实现I
图19A-19D图示在本发明的第一实现中的被分析物俘获。图19A 和19B表示通过生物素基化的原发抗体(图18G)的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194的俘获。抗体188通过交联剂抗生蛋白链菌素182 被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上。图19C和19D表 示本发明的同一实现中没有交联系统的另一实施方式。在这种实施方 式中，原发抗体188被直接固定至生物盘110的活性层144上。
图20A-20I的横截面图表示本发明第一实现的一种实施方式的构 造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘流动通道内的俘获剂 的反射盘的构造。参照图20A，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图20A表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂、 或者通过本领域的技术人员所知的其它方法被沉积在反射层142之上 以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后抗生蛋白链菌素182 被沉积在各俘获区140和141之上，盘110被在湿度室中室温下培育 30分钟(图20B)。盘110被冲洗以去除未结合抗生蛋白链菌素182， 并随后被旋干以从盘110的表面完全去除水分(图20C)。基准标记或 基准点202被沉积在第一俘获区141上，并且生物素基化的原发抗体 188被沉积在各连续俘获区140上(图20D和20E)。然后盘110被在 湿度室中室温下培育30分钟。使用PBS冲洗去除未结合抗体188， 并且盘110被旋干以去除表面水分(图20F)。粘合部件118被固定至 活性层144(图20G)。盖部分116(图2)可以被由聚碳酸脂形成并 且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116 被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。 阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有 效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性结合位置(图20H)。盘 110被在湿度室中室温下培育最好30分钟的预定时间，并且通过真空 完全去除剩余溶液(图20I)。
本发明的第一实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且未 生物素基化的原发抗体188(图18F)被直接沉积在各连续俘获区140 上的活性层144(图20A)上。然后盘110被在湿度室中室温下培育 最好30分钟(图20E)。使用PBS冲洗去除未结合抗体188，并且盘 110被旋干以去除表面水分(图20F)。粘合部件118被固定至活性层 144。盖部分116(图2)可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂 有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定至粘合 部件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。阻断剂204，例如 StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144 上的任何剩余非特异性结合位置(图20H)。盘110被在湿度室中室温 下培育30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图20I)。图21的 横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第一实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图20A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图20B-20H 所示。相应的粘合部件118被固定至活性层144。光学透明的盖部分 116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合部 件118从而在盘内形成流动通道130(图20G)。图22的横截面图表 示使用交联系统所完成的透射生物盘110。应该理解第一实现的第四 实施方式可以由本领域的技术人员构造。第四实施方式涉及不使用交 联系统固定生物盘110(图21和22)的流动通道内的俘获剂的透射盘 110的构造。
实现II
图23A-23D图示在本发明的第二实现中的被分析物俘获。图23A 和23B表示通过原发抗体188(图18F)的CD4+T细胞190和CD8+T 细胞194的俘获。原发抗体188被结合至通过交联剂抗生蛋白链菌素 182被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素基化的 继发抗体186(图18E)。图23C和23D表示本发明的同一实现中没 有交联系统的另一实施方式。在这种实施方式中，继发抗体186被直 接固定至生物盘110的活性层144上。
图24A-24L的横截面图表示本发明第二实现的一种实施方式的 构造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘110流动通道130 内的俘获剂的反射盘的构造。参照图24A，表示光学生物盘110的透 光衬底120、反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者 当沉积时被产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被 指向抗体将被固定至的俘获区140的位置。图24A表示5个这种俘获 区140，第一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它 被旋涂在反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。 然后抗生蛋白链菌素182被沉积在各俘获区140和141之上，并且盘 110被在湿度室中室温下培育约30分钟(图24B)。盘110被冲洗以去 除未结合抗生蛋白链菌素182，并随后被旋干以从盘110的表面完全 去除水分(图24C)。基准标记或基准点202被沉积在第一俘获区141 上，并且生物素基化的继发抗体186被沉积在各连续俘获区140上(图 24D和24E)。然后盘110被在湿度室中室温下培育最好30分钟(图 24E)。使用PBS冲洗去除未结合继发抗体186，并且盘110被旋干以 去除表面水分(图24F)。原发抗体188(图18F)随后被沉积在各俘 获区140上(图24G)。然后盘110被在湿度室中室温下培育约30分 钟(图24H)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并且盘110 被旋干以去除表面水分(图24I)。相应的粘合部件118被固定至活性 层144。盖部分116(图2)同样可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底 部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定 至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图24J)。阻断剂204， 例如StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性 层144上的任何剩余非特异性结合位置(图24K)。盘110被在湿度室 中室温下培育30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。
本发明的第二实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且未 生物素基化的继发抗体186(图18D)被直接沉积在各连续俘获区140 上的活性层144(图24A)上。然后盘110被在湿度室中室温下培育 30分钟(图24E)。使用PBS冲洗去除未结合继发抗体186，并且盘 110被旋干以去除表面水分(图24F)。原发抗体188(图18F)随后 被沉积在各俘获区140上(图24G)。然后盘110被在湿度室中室温下 培育30分钟(图24H)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并 且盘110被旋干以去除表面水分(图24I)。粘合部件118被固定至活 性层144。与前面的实施方式相同，本实施方式的盖部分116(图2) 可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射 性表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成 流动通道130(图24J)。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各 流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性 结合位置(图24K)。在这种实施方式中盘110被在湿度室中室温下培 育最好30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液(图24L)。图25的 横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第二实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图24A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的继发抗 体186、原发抗体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并 如图24B-24K所示。粘合部件118被以相似的方法固定至活性层144。 光学透明的盖部分116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被 整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动通道130(图24J)。图 26的横截面图表示使用交联系统所完成的透射生物盘110。应该理解 第二实现的第四实施方式可以由本领域的技术人员构造。第四实施方 式涉及不使用交联系统固定生物盘110(图21和22)的流动通道内的 俘获剂的透射盘110的构造。
实现III
图27A-27D图示如本发明的第三实现的被分析物俘获。图27A 和27B表示通过原发抗体188(图18F)的CD4+T细胞190和CD8+T 细胞194的俘获。原发抗体188被结合至继发抗体186(图18D)，继 发抗体186被结合至一串DCHO 198以形成一种如图28A所示的 DCHO-抗体合成物199。DCHO-抗体合成物199可以包含一种或更多 通过DCHO198被交联的抗体。通过某些继发抗体186至生物盘110 (图4和9)的活性层144上的结合，该DCHO-抗体合成物199被固 定在活性层144上。图27C和27D表示本发明的同一实现中没有继发 抗体186的另一实施方式。在这种实施方式中，原发抗体188被直接 结合至DCHO以形成DCHO-抗体合成物199，DCHO-抗体合成物199 被固定至生物盘110的活性层144上。
图28A的流程图表示抗体-DCHO合成物的制备，而图28B-28J 的多图表示本发明第三实现的一种实施方式的构造。该第三实现的第 一实施方式涉及利用交联剂DCHO交联两种或更多交联剂的反射盘 的构造。图28A表示DCHO-抗体合成物199的制备。等浓度的DCHO 198和继发抗体186被混合并被允许结合，从而形成DCHO-抗体(继 发)合成物199。参照图28B，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图28B表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂在 反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后 DCHO-抗体(继发)合成物199被沉积在各俘获区140之上，并且在 这种具体实施方式中盘110被在湿度室中室温下培育30分钟(图 28C)。盘110被冲洗以去除未结合的DCHO-抗体(第二)合成物199， 并随后被旋干以从盘110的表面完全去除水分(图28D)。基准点202 被沉积在第一俘获区141上，并且原发抗体188被沉积在各连续俘获 区140上(图28E)。然后盘110被在湿度室中室温下培育30分钟(图 28F)。使用PBS冲洗去除未结合原发抗体188，并且盘110被旋干以 去除表面水分(图28G)。粘合部件或通道层118被固定至活性层144。 与上述实施方式相同，通常图2所示的盖部分116可以被由聚碳酸脂 形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性表面146。在本 实施方式中，盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成 流动通道130，如图28H所示。阻断剂204，例如StabilGaurd，被 注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非 特异性结合位置。本步骤被显示在图28I中。在本实施方式中，盘110 被在湿度室中室温下培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶 液，如图28J所示。
如本发明的制造方面，图28A-28J也表示一种制造用于执行分组 标示计数的光学测定盘的方法。这种制造光学测定盘的方法包括以下 步骤：在试管中提供交联剂，添加俘获剂至该试管，允许交联剂与俘 获剂结合(形成一种合成物)，提供衬底，使用活性层涂覆衬底，沉积 该合成物至活性层上，和使用粘合部件固定盖部分至活性层。在这种 实施方式中，交联剂为醛活化葡聚糖。俘获剂用于与细胞表面抗原结 合。在另一实施方式中，俘获剂用于与具有对细胞表面抗原选择亲和 力的第一俘获剂结合。在优选实施方式中，细胞表面抗原被从抗原的 CD族中独立选择。在更优选的实施方式中，细胞表面抗原被从由 CD3、CD4、CD8、和CD45构成的组中独立选择。
本发明的第三实现的第二实施方式涉及不使用继发抗体固定生 物盘110的流动通道130内的第一俘获剂的反射盘110的构造。在这 种实施方式中，等浓度的DCHO 198和原发抗体188被混合并被允许 结合，从而形成图28A所示的DCHO-抗体(原发)合成物199。基准 标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且DCHO-抗体(原发) 合成物199被沉积在各连续俘获区140上的活性层144(图28C)上。 然后盘110被在湿度室中室温下培育最好30分钟，并使用PBS冲洗 去除DCHO-抗体(原发)合成物199。盘110被旋干以去除表面水分， 如图28D所示。粘合部件或通道层118相似地被固定至活性层144。 盖部分116可以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4 所示的反射性表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而 在盘内形成流动通道130，如图28H所示。阻断剂204，例如 StabilGaurd，被注入各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144 上的任何剩余非特异性结合位置(图28I)。该盘被在湿度室中室温下 培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液，如图28J所示。图 29的横截面图表示不使用继发抗体所完成的反射盘110。
本发明的第三实现的第三实施方式涉及使用交联剂DCHO固定 生物盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种 实施方式中，衬底120、没有观察窗200(图28B)的半反射性层143、 和活性层144如图5所示。DCHO-抗体(第二)合成物199、原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图28C-28I 所示。粘合部件或通道层118被固定至活性层144。光学透明的盖部 分116(图5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合 部件118从而在盘110内形成流动通道130。图30的横截面图表示使 用DCHO-抗体(第二)合成物199和原发抗体188所完成的透射生物 盘110。应该理解第三实现的第四实施方式可以由本领域的技术人员 构造。第四实施方式涉及不使用继发抗体固定生物盘110(图29和30) 的流动通道内的第一俘获剂的透射盘110的构造。其它实施方式可能 涉及使用抗生蛋白链菌素182(图18A)和生物素184(图18B)固定 原发或继发抗体至生物盘110的活性层144。被固定的抗体(原发和 继发抗体)然后可以被与DCHO 198合成以增加生物盘110的流动通 道130内的俘获剂的浓度。
实现IV
图31A为光学生物盘110的顶视图，表示四射流电路128，各射 流电路具有特定细胞表面标记的几个俘获区和一负控制区。如图所示， 各射流电路被指示为具有具体指向CD3、CD4、CD8和CD45的俘获 区140。可以采用任何其它所需图案或细胞表面抗原的组合，例如其 它的CD标记或细胞表面标记。在这种具体实现中，对各单独的射流 电路而言在各俘获区140中仅需要单独的公共俘获剂。图31A所示的 盘特别适合用于图31B-31E、44A-44D、45和46所示的细胞俘获化学 和方法。图31A所示的生物盘110可以为反射盘或透射盘。
现在参看图31B-31E，表示在本发明的第四实现中的被分析物俘 获。图31B和31C表示通过与原发抗体188(图18F)预先被结合以 形成原发抗体-细胞合成物的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194的 继发抗体186的俘获。原发抗体188被结合至通过交联剂抗生蛋白链 菌素182被固定在生物盘110(图4和9)的活性层144上的生物素基 化的继发抗体186(图18E)。图31D和31E表示本发明的同一实现中 没有交联系统的另一实施方式。在这种实施方式中，继发抗体186被 直接固定至生物盘110的活性层144上。
图32A-32I的横截面图表示本发明第四实现的一种实施方式的构 造。第一实施方式涉及利用交联系统固定生物盘流动通道内的俘获剂 的反射盘的构造。参照图32A，表示光学生物盘110的透光衬底120、 反射层142和活性层144。部分反射层142被去除(或者当沉积时被 产生开口)以制造观察窗200，通过观察窗200光可以被指向抗体将 被固定至的俘获区140的位置。图32A表示5个这种俘获区140，第 一个被指示为俘获区141。活性层144最好为聚苯乙烯，它被旋涂在 反射层142之上以形成厚度约为40至300微米的光滑表面。然后抗生 蛋白链菌素182被沉积在各俘获区140和141之上，并且盘110被在 湿度室中室温下培育约30分钟，如图32B所示。盘110被冲洗以去 除未结合的抗生蛋白链菌素182，并随后被旋干以从盘110的表面完 全去除水分，如图32C所示。基准标记或基准点202被沉积在第一俘 获区141上，并且生物素基化的继发抗体186被沉积在各连续俘获区 140上，如图32D和32E所示。然后盘110被在湿度室中室温下培育 大约30分钟。该步骤如图32E所示。使用PBS冲洗去除未结合继发 抗体186，并且盘110被旋干以去除表面水分。该步骤如图32F所示。 粘合部件或通道层118相似地被应用于活性层144。相应的盖部分116 最好被由聚碳酸脂形成并且在底部上涂有最好如图4所示的反射性表 面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流动 通道130，如图32G所示。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入 各流动通道130以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异 性结合位置，这一步骤显示在图32H中。盘110被在湿度室中室温下 培育最好30分钟，并且通过真空完全去除剩余溶液，如图32I所示。
本发明的第四实现的第二实施方式涉及不使用交联系统固定生 物盘110的流动通道130内的俘获剂的反射盘110的构造。在这种实 施方式中，基准标记或基准点202被沉积在第一窗口141上，并且如 图18D所示的未生物素基化的继发抗体186被直接沉积在各连续俘获 区140上的活性层144上。然后盘110被在湿度室中室温下培育30 分钟。使用PBS冲洗去除未结合的继发抗体186，并且盘110被旋干 以去除表面水分。粘合部件118被固定至活性层144。盖部分116可 以被由聚碳酸脂形成并且最好在底部上涂有最好如图4所示的反射性 表面146。盖部分116被整体固定至粘合部件118从而在盘内形成流 动通道130。阻断剂204，例如StabilGaurd，被注入各流动通道130 以迅速而有效地阻断活性层144上的任何剩余非特异性结合位置。盘 110被在湿度室中室温下培育约30分钟，并且通过真空完全去除剩余 溶液。图33的横截面图表示不使用交联系统所完成的反射盘110。
本发明的第四实现的第三实施方式涉及使用交联系统固定生物 盘110的流动通道130内的俘获剂的透射盘110的构造。在这种实施 方式中，衬底120、没有观察窗200(图32A)的半反射性层143、和 活性层144如图5所示。抗生蛋白链菌素182、生物素基化的原发抗 体188、基准点202和阻断剂204的沉积如上所述，并如图32B-32H 所示。粘合部件118被固定至活性层144。光学透明的盖部分116(图 5)可以被由聚碳酸脂形成。盖部分116被整体固定至粘合部件118从 而在盘内形成流动通道130(图32G)。图34的横截面图表示使用交 联系统所完成的透射生物盘110。应该理解第四实现的第四实施方式 可以由本领域的技术人员构造。第四实施方式涉及不使用交联系统固 定生物盘110(图33和34)的流动通道内的第二俘获剂的透射盘110 的构造。
分组标示计数-实现I
图35A为光学生物盘110的顶视图，表示四射流电路128，各射 流电路具有四不同具体细胞表面标记的几个俘获区140和一负控制 区。如图所示，各射流电路被指示为具有四个分别具体指向CD3、CD4、 CD8和CD45的俘获区140。可以采用任何其它所需图案或细胞表面 抗原的组合，例如其它的CD标记或细胞表面标记。在这种具体实现 中，不限制对各单独的射流电路而言在各俘获区140中必须仅有单独 的公共俘获剂。相反，在这种实现中，要求具有带有不同俘获剂的俘 获区。例如，这些俘获区可以被以具有至少2乘2矩阵的阵列格式被 排列。图35A所示的盘特别适合用于图35B-35D、36、37、38A-38C、 39、40、41A-41C、42和43所示的细胞俘获化学和方法。图35A所 示的生物盘110可以为反射盘或透射盘。
接下来参照图35B-35D，表示使用本发明的第一实现的生物盘的 净化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生 物盘110的流动通道130，如图35B所示。毛细管作用、使用外部应 用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心 或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接 触。如图35C所示，原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存 在的任何CD4+细胞190和CD8+细胞194。光学驱动电机162(图10) 旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图20I)。光学盘驱 动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+细胞190和CD8+细胞 194相互作用，如图35D所示，并且返回光束154被反射至检测器157 (图10)用于处理和分析。
图36表示与图35B-35D相同的试样的分析，使用本发明的第一 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图35B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 35C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图37表示与图35B-35D相同的试样的分析，使用本发明的第一 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图35B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 35C)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图20I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图35D)，并且透射 光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现II
现在参照图38A-38C，表示使用本发明的第二实现的生物盘的净 化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生物 盘110的流动通道130，如图38A所示。毛细管作用、使用外部应用 器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或 曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接触。 原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞 190和CD8+T细胞194。该步骤表示在图38B中。光学驱动电机162 (图10)旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图24L)。 光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194相互作用，如图38C所示，并且返回光束154被 反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图39表示与图38A-38C相同的试样的分析，使用本发明的第二 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图38A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 38B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被 俘获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且返 回光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图40表示与图38A-38C相同的试样的分析，使用本发明的第二 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图38A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 38B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被 俘获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图38C)，并且透 射光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现III
接下来参照图41A-41C，表示使用本发明的第三实现的生物盘的 净化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。使用MNC试样充满生 物盘110的流动通道130，如图41A所示。毛细管作用、使用外部应 用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心 或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与原发抗体188的接 触。原发抗体达到与试样接触，并随后俘获试样中存在的任何CD4+T 细胞190和CD8+T细胞194。该步骤表示在图41B中。光学驱动电机 162(图10)旋转该盘，这清除未结合的T细胞的俘获区140(图28J)。 光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的CD4+T细胞190 和CD8+T细胞194相互作用，如图41C所示，并且返回光束154被 反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图42表示与图41A-41C相同的试样的分析，使用本发明的第三 实现的第二实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图41A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并随后俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图 41B)。光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的 俘获区140(图28J)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘 获的CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图43表示与图41A-41C相同的试样的分析，使用本发明的第三 实现的第三实施方式。使用MNC试样充满生物盘110的流动通道 130(图41A)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、和/或离心 力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作 用于试样上以获得与原发抗体188的接触。原发抗体达到与试样接触， 并俘获试样中存在的任何CD4+T细胞190和CD8+T细胞194(图41B)。 光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合T细胞的俘获区 140(图24L)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的 CD4+T细胞190和CD8+T细胞194相互作用(图41C)，并且透射光束 156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
分组标示计数-实现IV
现在参照图44A-44D，表示使用本发明的第四实现的生物盘的净 化和冲洗后MNC试样(图17A)的分析。图44A的流程图表示原发 抗体-T细胞合成物的制备。包含CD4+T细胞190和CD8+T细胞194 的MNC悬浮液被与原发抗体188混合，并允许结合，从而形成原发 抗体-T细胞合成物。如本领域的技术人员将清楚的那样，使用本实现 也可以标记带有不同表面标记的其它细胞。如图44B所示，使用原发 抗体-T细胞合成物充满生物盘110的流动通道130。毛细管作用、使 用外部应用器被应用的压力、和/或离心力(即以曲线运动被指向远离 旋转中心或曲率或轴的物体上的力)作用于试样上以获得与被固定在 生物盘110的活化层144上的继发抗体188的接触。具有对原发抗体 -T细胞合成物的亲和力的继发抗体186俘获该合成物，如图44C所示。 光学驱动电机162(图10)旋转该盘，这清除未结合合成物的俘获区 140(图32I)。光学盘驱动器112(图1)的入射束152与被俘获的合 成物相互作用，如图44D所示，并且返回光束154被反射至检测器157 (图10)用于处理和分析。
图44A-44D也表示本发明的方法的另一主要方面。联系图17A， 提供执行分组标示计数的另一方法。本方法包括以下步骤：(1)在包含 分离梯度的试管中提供血样，(2)以足以将血样分离为层的时间和速 度旋转试管，(3)再悬浮包含T细胞的MNC层以形成MNC悬浮液， (4)添加原发抗体至该MNC悬浮液以形成原发抗体-T细胞合成物， (5)在包括至少一个带有至少一种俘获剂的俘获区的光学盘表面上提 供原发抗体-T细胞合成物的试样，(6)将光学盘载入光学读出器中， (7)将电磁辐射入射束指向俘获区，(8)检测在与盘的俘获区相互作 用之后所形成的电磁辐射束，(9)将所检测光束转换为输出信号，和 (10)分析该输出信号以提取与在俘获区处所俘获的细胞的数量相关 的信息。在本方法的一种实施方式中，光学盘被构造为具有反射层以 使被指向俘获区并不击中细胞的光被反射。在本方法的另一实施方式 中，光学盘被构造以使被指向俘获区并且不击中细胞的光被通过光学 盘透射。
图45表示与图44A-44D相同的试样的分析，使用本发明的第四 实现的第二实施方式。使用原发抗体-T细胞合成物充满生物盘110的 流动通道130(图44B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、 和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上 的力)作用于试样上以获得与被固定在生物盘110的活化层144上的 继发抗体188的接触。具有对原发抗体-T细胞合成物的亲和力的继发 抗体186俘获该合成物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该 盘，这清除未结合合成物的俘获区140(图32I)。光学盘驱动器112 (图1)的入射束152与被俘获的合成物相互作用(图44D)，并且返回 光束154被反射至检测器157(图10)用于处理和分析。
图46表示与图44A-44D相同的试样的分析，使用本发明的第四 实现的第三实施方式。使用原发抗体-T细胞合成物充满生物盘110的 流动通道130(图44B)。毛细管作用、使用外部应用器被应用的压力、 和/或离心力(即以曲线运动被指向远离旋转中心或曲率或轴的物体上 的力)作用于试样上以获得与被固定在生物盘110的活化层144上的 继发抗体188的接触。具有对原发抗体-T细胞合成物的亲和力的继发 抗体186俘获该合成物(图44C)。光学驱动电机162(图10)旋转该 盘，这清除未结合合成物的俘获区140(图32I)。光学盘驱动器112 (图1)的入射束152与被俘获的合成物相互作用(图44D)，并且透射 光束156被传送至检测器157(图10)用于处理和分析。
本领域的技术人员将根据这些教义理解，在不偏离本发明的领域 的精神的情况下，可以组合本发明的方法的一种或多种实现的一种或 多种实施方式。
细胞检测和相关软件
现在参照图47，表示包括用以保持试样的射流电路128的光学生 物盘110。图47也表示被放大的射流电路47，以表示不同的俘获或目 标区140和包括基准标记和基准点202的目标区141。在这种具体实 施方式中，采用5个俘获区140，各俘获区被分别用于俘获CD4+细胞、 CD8+细胞、CD3+细胞、CD45+细胞和作为负控制的肌红蛋白。
图48A为从不同的实施方式所获得的图像，该实施方式包括6 个俘获区140，各俘获区分别被用于俘获CD45+细胞、CD15+细胞、 CD4+细胞、CD8+细胞、CD15+细胞的第二俘获区和CD45+细胞的第 二俘获区。在这种实施方式中，两CD45和CD15俘获区可以被用作 确认控制和检查以检验俘获效率和所期望的计数结果符合。图48A也 表示一系列带有CD4、CD8和控制的放大视图的细胞表面抗原。如本 文所述，该图像为与背场(background field)相反表示的许多细胞。 图48B表示来自相比如本发明的生物盘衍生图像的实际显微镜图像的 控制、CD4和CD8俘获区的局部放大图。图49表示实际显微镜图像 和相应的如本发明的生物盘图像的更详细的另一对比。如图48B和49 所示，本发明人已经发现相比从显微镜可获得的图像的等质量和分辨 率的生物盘图像。因此这些图像证明使用本发明的设备和方法可以使 得单个细胞相对背景可见。检测调查特征的方法被更详细地说明在通 常指定的分别在2001年2月2日和2001年5月18日提交序列号为 60/270,095和60/292,108的题各为“获得在光学盘部件的表面上所检测 的调查特征的信号签名的信号处理设备和方法”(Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly)的美国临时申请，和通常所指的2002年1月10日提交题 为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中， 所有这些申请被结合入参考文献中。
这些细胞可以通过多种不同方法的一种被检测，例如，使用边缘 检测硬件或软件检测并计数透射或反射光的水平中的足够大的变化， 并且因此计数转变和细胞。下文更详细说明的另一方法，使用图像和 图案识别软件识别与背景相对的细胞。图像识别可以区分WBC和 RBC，并且也可以区分中性白细胞、单核细胞、嗜碱白细胞、嗜曙红 白细胞、粒性白细胞和淋巴细胞。
带有数量级为1.6微米左右的信道的光学盘可以被用于成像盘上 的细胞或聚集体。例如，白细胞将通常具有至少5和最多12信道的直 径，因此可以获得白细胞的图像。
为了获得这种图像，可以使用图2、3和4所示的类型的透射盘 (虽然反射盘将可操作)，和图10所示的包括触发传感器160和顶检 测器158的类型的盘驱动器。触发检测器158检测透射盘中的触发标 记126并提供信号至计算机，当标记被检测时数据计算机将收集和/ 或处理数据。当光源穿过观察窗中的信道时，获得所接收到透射光的 图像。在这种情况下顶检测器可以为单检测器，或者在径向和/或周向 定位的一排多个检测器部件。举例说来，这种检测器和检测方法被说 明在通常指定的2000年11月9日提交题为“生物光学盘的光学盘驱动 器”(Optical Disc Drive For Bio-Optical Disc)的第60/247,465号美国 临时申请；2001年5月22日提交题为“光学生物盘的盘驱动部件” (Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs)的第60/293,093号美 国临时申请；和2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动 器系统和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discss)的第10/008,156号美国专利申请中，这些申请的全部内容 通过引用结合在本文中。
在获得例如图48A、48B和49的图像之后，可以使用设计为识 别所需特征的图像识别软件进一步处理该图像数据。更需要的是图像 识别软件不仅具有区分细胞与背景的能力，而且具有区分一种类型的 细胞与其它类型细胞的能力。
现在参照图50，表示从包括红细胞和白细胞的调查数据中所衍生 出的图像。如图放大图所示，这些白细胞和红细胞具有清楚的独特特 征，因此可以被从背景中检测出并且使用图像识别也可以被互相区分。 此外，如在下文联系图59、60和61所说明的那样，通过染色这些细 胞的细胞核，也有可能区分白细胞各自的类型，包括淋巴细胞、单核 细胞、中性白细胞、嗜曙红白细胞、粒性白细胞和嗜碱白细胞。
图51表示带有许多细胞的样品场(sample field)，各细胞带有指 示被认为是细胞的各物体的加号。在已经为每个区和任何数量的要求 区检测细胞数量之后，所产生的细胞计数数据可以被在单个屏幕中显 示，该屏幕提供一种容易观察的表示，例如图52所示。如图52所示， 以柱状图的形式提供具体的细胞计数，以说明细胞的相对数。在 CD4/CD8分析的情况下，系统也可以产生CD4/CD8比率以及任何其 它所需的数学计算和对比。图53提供本过程的不同视图，表示图像场 中的细胞被转换为CD4计数、CD8计数和比率，带有指示比率处于 正常范围的输出。
本发明有关细胞检测和相关处理方法的方面也被公开在2001年 8月31日提交序列号为60/316,273的题为“免疫表型的俘获层部件和 光学生物盘”(Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for immunophenotyping)的美国临时申请；2001年9月7日提交序列号为 60/318,026的题为“成像血细胞、血载寄生虫和病原体和其它生物物质 的方法以及相关光学生物盘和驱动部件”(Methods for Imaging Blood cells，Blood-Borne Parasites and Pathogens，and Other Biological Matter Including Related OptIcal Bio-Discs and Drive Assemblies)的美国临时申请；2001年9月14日提交序列号为 60/322,527的题为“包含执行细胞计数的微射流电路的光学分析盘” (Optical Analysis Discs including Microfiuidic Circuits for Performing Cell Counts)的美国临时申请；2001年9月11日提交序 列号为60/322,040的题为“包含光学成像并定量评价包括淋巴细胞的 血细胞的射流电路的光学分析盘”(Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes)的美国临时申请；2001年9月 12日提交序列号为60/322,863的题为“包含白细胞的细胞鉴别计数的 方法和执行该细胞鉴别计数的光学生物盘的使用”(Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same)的美国临时申请；和2001年9月17 日提交序列号为60/322,793的题为“使用包括肝素、血浆、和聚赖氨酸 等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异结合的方法” (Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请被结合在本文的参考 文献中。
细胞鉴别计数方法和相关软件
这里更详细地说明使用光学盘数据的白细胞计数的多种方法和 相关算法。这些方法和相关算法并不限于计数白细胞，而是可以被容 易地应用于执行任何类型的细胞物质的计数，这些细胞物质包括但不 限于红细胞、白细胞、珠(beads)和任何其它产生类似的可以通过光学 读出器可以被检测的光学签名的生物和非生物物体。
为了说明的目的，以下如参照图54-58所说明的与本发明相关的 方法和算法的说明被指向白细胞计数。使用某些修改，这些方法和算 法可以被应用于计数其它类型的细胞、或大小与白细胞类似的物体。 细胞计数方法和算法的数据评价方面这里通常被说明以为本发明的方 法和设备提供相关背景。俘获并处理光学生物盘的调查数据的方法和 算法通常具有广泛的适用性并且已经在通常指定的被结合入参考文献 的2001年5月16日提交题为“光学生物盘部件中的分析结果的透射象 素的可变抽样控制和相关设备”(Variable Sampling Control For Rendering Pixelatlon of Analysis Results In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto)的第60/291,233号美国临 时专利和上述被结合的题为“包括执行细胞鉴别计数的相关设备和软 件的细胞鉴别计数方法”(Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus And Software For Performing Same)的 第60/404,921号美国临时专利中被更详细地公开。在下面的说明中， 提供带有简单解释的本方法和算法的基本方案。如图10所示，生物检 测使用的信息有关属性被从光学生物盘110以一束已经通过与试样的 相互作用被修改或调制的电磁辐射的形式被提取。在联系图2、3、4、 11、13和15所述的反射性光学生物盘的情况下，返回光束154携带 有关生物试样的信息。如上所述，实质上仅当入射束在流动通道130 或目标区140内并因此与试样接触时，这种有关生物试样的信息才被 包含在返回光束中。在生物盘110的反射实施方式中，返回光束154 也可以携带被编码在反射层142中或上或者被编码在图13和14所示 的摆动槽170中的信息。如本领域的技术人员所清楚的那样，仅当相 应的入射束与反射层142接触时，预记录信息被包含在带有目标区的 反射盘的返回光束154中。当入射束152处于信息承载反射层142被 去除或者不存在的区域中时，这种信息不被包含在返回光束154中。 在联系图5、6、8、9、12、14和16所述的透射性光学生物盘的情况 下，透射光束156携带有关生物试样的信息。
继续参照图10，无论从反射盘的返回光束154或透射盘的透射光 束156所获得的有关生物试样的信息，被指向处理器166用于信号处 理。该处理涉及由底检测器157(反射盘)或顶检测器158(透射盘) 所检测到的模拟信号向不连续数字形式的转换。
接下来参照图54，信号转换涉及以固定时间间隔212抽样模拟信 号210，并编码相应的信号瞬时模拟振幅214为不连续的二进制整数 216。抽样在某起始时间218开始并在某终止时间220结束。与模拟向 数字转换过程相联系的两公值为抽样频率和位深(bit depth)。抽样频 率，也称为抽样速率，为每单位时间所取的样本的数量。较高的抽样 频率获得连续样本之间较小的时间间隔212，这导致数字信号222相 比原始模拟信号210的较高的保真度。位深是用于编码模拟信号210 的抽样振幅214的各样本点中所用的位的数量。位深越大，二进制整 数216将越接近原始模拟振幅214。在本实施方式中，在位深为每样 本12位的情况下抽样速率为8Mh，允许整数抽样范围为0至4095(0 至(2n-1)，其中n为位深。在其它实施方式中这种组合可以改变以适 应特定的精度要求。以示例而不是限制的方式，在涉及计数通常小于 细胞的珠的方法的实施方式中，可能要求增加抽样频率。然后所抽样 数据被送至处理器166用以模拟至数字转换。
在模拟向数字转换过程中，沿激光光路的各连续样本点224被作 为一维阵列226连续地存储在盘上或存储器中。各连续信道提供独立 的一维阵列，这产生类似于图像的两维阵列228(图57A)。
图55的透视图表示带有被放大的细节视图的指示部分的本发明 的光学生物盘110，表示被相对于光学生物盘的道232定位的被俘获 白细胞230。如图所示，入射束152与白细胞230的相互作用获得含 信号光束，或者以反射盘的返回光束154或透射盘的透射光束156的 形式，该光束被检测器157或158检测。
图56A为表示相对于图55所示的光学生物盘110的信道232定 位的被俘获白细胞230的另一图示。如图55和56A所示，白细胞230 覆盖大约四个信道A、B、C和D。图56B表示由图55和图56A的白 细胞210所衍生的一系列签名轨迹。如图56B所示，检测系统提供相 对于信道A、B、C和D的四个模拟信号A、B、C和D。如图56B进 一步所示，各模拟信号A、B、C和D携带有关白细胞230的特定信 息。因此如图所示，白细胞230上的扫描获得可以被检测和处理的入 射束的独特扰动。模拟签名轨迹(信号)210随后被指向处理器166 用以转换为如图57A和57C所示的模拟数字信号222，如下文更详细 所述的那样。
图57表示图57A、57B、57C和57D之间的关系。图57A、57B、 57C和57D表示从图56B的签名轨迹至数字信号222的转变，该数字 信号被以一维阵列226存储并且被合并为两维阵列228用以数据输入 244。
现在具体参照图57A，表示来自图55和56A所示的光学生物盘 的信道A和B的抽样模拟信号210。随后处理器166编码相应的模拟 信号210的瞬时模拟振幅214为不连续二进制整数216(见图54)。所 产生的系列数据点为类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
接下来参照图57B，来自信道A和B(图57A)的数字信号222 被作为独立的一维存储器阵列226存储。各连续信道提供相应的一维 阵列，该阵列当与前面的一维阵列结合时，获得类似于图像的两维阵 列228。该数字数据随后被作为代表在样本区中特定点处的返回光束 154或透射光束156(图55)的相对密度的样本点224(图54)的两 维阵列228存储在存储器中或盘上。该两维阵列随后被以图57B所示 的原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。然后被存 储在图像文件240中数据被提取242至存储器并被用作至图10所示的 分析仪168的数据输入244。
图57C表示来自图55和56A所示的光学生物盘的信道C和D 的抽样模拟信号210。随后处理器166编码相应的模拟信号210的瞬 时模拟振幅214为不连续二进制整数216(图54)。所产生的系列数据 点为类似于抽样模拟信号210的数字信号222。
现在参照图57D，来自信道C和D的数字信号222被作为独立 的一维存储器阵列226存储。各连续信道提供相应的一维阵列，该阵 列当与前面的一维阵列结合时，获得类似于图像的两维阵列228。如 上所述，该数字数据随后被作为代表在样本区中特定点处的返回光束 154或透射光束156(图55)的相对密度的样本点224(图54)的两 维阵列228存储在存储器中或盘上。该两维阵列随后被以图57B所示 的原始文件或图像文件240的形式存储在存储器中或盘上。如上所述， 然后被存储在图像文件240中数据被提取242至存储器并被用作至图 10所示的分析仪168的数据输入244。
本发明的计算和处理算法被存储在分析仪168(图10)中并被应 用于输入数据244以产生可以被显示在显示监视器114(图10)上的 有用输出结果262(图58)。现在参照图58，表示如本发明的处理方 法和计算算法的数据评价的主要步骤的逻辑流程图。本处理方法的第 一主要步骤涉及输入数据244的接收。如上所述，数据评价以范围为 0至4096的整数阵列开始。
接下来的主要步骤246为选择用于计数的盘区域。一旦该区域被 限定，目标变为实际计数该被限定区域内所包含的所有白细胞。步骤 246的实施根据盘的构造和用户的选择而定。以示例而不是限制的方 式，本发明的实施方式使用带有例如图2和5所示的目标区140的窗 口的盘，软件识别该窗口并剪切它的一部分用于分析和计数。在一种 优选实施方式中，例如图2所示，目标区或窗口具有在两端带有半圆 形部分的1×2mm矩形的形状。在这种实施方式中，软件在相应窗口 内截取1×2mm的标准矩形区域。在本实施方式的一方面，读出器可 以取几个连续样本值与几个不同窗口中的细胞数量比较。
在使用无窗口的透射盘的本发明的实施方式中，如图5、6、8和 9所示，步骤246可以两种不同方法的一种被执行。或者通过在固定 坐标情况下定位它相对于一点的中心，或者通过发现为暗染料点的基 准标记202(见例如图24L、25和26)，选择标准矩形的位置。在采 用基准标记202的情况下，具有所需对比度的染料被相对于两组细胞 沉积在盘上的特定位置141(例如图20E)。然后光学盘读出器被指向 滑至一组细胞的中心，并且标准矩形随后被围绕被选择组居中。
至于上述关于步骤246的用户选择，用户通过使用鼠标选择或者 其它方式的直接相互作用，可以指定细胞计数所需的样本区形状，例 如矩形区。在本软件的本实施方式中，这涉及使用鼠标单击并拖动矩 形覆盖显示在监视器114上的光学生物盘衍生图像的所需部分。不管 评价区域选择方法如何，在随后的步骤248中相应的矩形区域被评价 用以计数。
图58中的第三主要步骤为步骤248，该步骤指向背景照明均匀 化。该过程纠正由某些硬件配置所导致的可能的背景不均匀波动。背 景照明均匀化补偿各样本点的密度水平以上总背景、或者不是细胞的 图像部分接近带有任意背景值Vbackground的平面。而Vbackground可以多 种方式被决定，例如取标准矩形样本区上的平均值，在本实施方式中， 该值被设定为2000。在所选择矩形样本区的各点P处的值V被使用 数字(Vbackground+(V-P的相邻点上的平均值))替换，并如果必要的话 被舍位以适应数值的实际可能范围，在本发明的优选实施方式中该范 围为0至4095。选择相邻点的尺寸以充分大于细胞的尺寸并充分小于 标准矩形的尺寸。
图58的流程图的下一步骤为标准化(normalization)步骤250。在 执行标准化步骤250中，使用标准矩形样本区中的数据执行线性转换 以使平均值变为2000，标准偏差为600。如果必要，该值被舍位以适 合0至4096的范围。本步骤250，以及背景照明均匀化步骤248，使 得软件对硬件修改和调整更不敏感。以示例并不是限制的方式，在例 如顶检测器158(图55)的检测电路中所获得的信号，可以在不明显 影响所产生细胞计数的情况下改变。
如图58所示，接下来执行过滤步骤252。对标准矩形中的各点P， 计算尺寸小于步骤248所述、具有足够不同于Vbackground的值的P的相 邻点的数量。所计算的点应该接近图像中细胞的尺寸。如果该数量足 够大，P处的值保持不变；否则它被指定为Vbackground。执行该过滤操 作以去除噪音，并且在优选情况下仅细胞保持在图像中而背景均匀地 等于Vbackground。
如图58所示，可以执行可选步骤254，该步骤被指向去除有害部 分。诸如划痕、气泡、沾污和其它类似不规则体的缺陷可以通过过滤 步骤252。这些缺陷可以或者直接地或者通过影响图像柱状图中的总 分布导致细胞计数错误。通常地，这些缺陷的尺寸相比细胞足够大， 并可以在如下的步骤254中被去除。首先，形成与被选定区域相同尺 寸的二进制图像。如果原始图像的相应点处的值等于Vbackground，二进 制图像中的A被定义为白，否则为黑。接下来，提取黑点的被连接部 分。然后，随后的腐蚀和膨胀被应用于调整该部分的视图。并且最终， 去除大于定义阀值的部分。在本可选步骤的一种实施方式中，通过指 定原始图像中的相应样本点具有值Vbackground，从原始图像中去除该部 分。确定那些部分构成可计数量标而那些将被去除的阀值为用户定义 值。该阀值也可以根据正在被计数的调查特征即白细胞、红细胞或者 其它生物物质而变。在可选步骤254之后，最好重复步骤248、250 和252。
图58所示的下一主要步骤为步骤256，该步骤涉及通过亮中心计 数细胞。计数步骤256由几个子步骤构成。第一子步骤包括执行卷积 (convolution)。在该卷积子步骤，形成被称作卷积图像的辅助阵列。 点P处的被卷积图像的值为在P的圆形相邻点中过滤之后的图像的集 成结果。更精确地，对一种具体实施方式，被集成的函数为当v大于 2000时等于v-2000而当v小于或等于2000时等于0的函数。在计数 步骤256中被执行的下一子步骤为在尺寸约为1个细胞的半径周边发 现被卷积图像的局部最大值。接着，避免在互相紧邻点内复制带有相 同值的局部最大值。在计数步骤256的最后子步骤中，剩余的局部最 大值被宣布为标记细胞。
在某些硬件设置中，一些细胞在无亮中心的情况下可以出现。在 这种情况下，仅有暗边可见，以下的两可选步骤258和260可用。
步骤258涉及从图像去除被发现细胞。在步骤258，围绕各被发 现细胞的中心的圆形区域被使用值2000填充以使带有亮中心和暗边 的细胞不会被发现两次。
步骤260涉及通过暗边计数附加细胞。在步骤258之后对图像进 行两次转换。在本步骤的第一子步骤，子步骤(a)中，使用(2000-v) 替换各点的值v，并且如果该结果为负它被使用零替换。在子步骤(b) 中，所产生的图像随后被使用内径R1且外径R2的环卷积。R1和R2 分别为细胞的最小和最大期望半径，随后，在子步骤(d)，该环被移动 致左、右、上和下。在子步骤(c)，四位移的结果被合计。这种转换之 后，暗边细胞的图像看起来象四瓣花。最后在子步骤(d)，子步骤(c) 中所获得的函数的最大值在某种意义上被发现为计数步骤256中所采 用的值。它们被宣布为在步骤256中被遗漏的标记细胞。
计数步骤256之后，或者在当可选被采用的计数步骤260之后， 图58所示的最后主要步骤为结果输出步骤262。在标准矩形中被发现 的细胞数量被显示在图1和5所示的监视器114上，并且各被识别细 胞被使用红十字标示在被显示光学生物盘衍生图像上。
参照图59，表示红细胞或红血球和白细胞或白血球。白细胞分为 两主要组。第一组为颗粒白细胞。它们由红骨髓产生，在细胞质中具 有显著的颗粒，并具有叶形细胞核。三种颗粒白细胞(也称为多形核 白细胞、多形核白细胞或PMNS)为中性白细胞(直径10-12μm)、嗜 曙红白细胞(直径10-12μm)和嗜碱白细胞(直径8-10μm)。中性白 细胞的核具有被非常细的链连接的2至6叶。随着细胞成长叶的宽度 增加。当常用染料被应用于细胞时，在细胞质中发现均匀分布的染有 淡紫色的颗粒。嗜曙红白细胞包含也为双叶的细胞核，叶被细链或厚 峡(isthmus)连接。细胞质被使用未覆盖或遮蔽细胞核的大均匀尺寸 的颗粒填满。使用常用染料将颗粒染色为红橙。嗜碱白细胞的核也为 双叶或不规则形状，常为字母S状。细胞质颗粒为圆形，可变尺寸， 染蓝黑色，并通常遮蔽细胞核。
第二主要白细胞组为无基粒白细胞。它们由淋巴和骨髓组织(红 骨髓)产生，并且在光显微镜下不可以看到细胞质颗粒，这归功于它 们的小尺寸和差染色性质。两种无基粒白细胞为淋巴细胞(直径 7-15μm)和单核细胞(直径14-19μm)。淋巴细胞的核为圆形，或微 锯齿形(indented)。细胞质形成围绕细胞核的环。单核细胞的核通常 为锯齿形或肾形，如图59、60和61所示。
如本发明，可以使用具有预定吸收范围的染料染色某预定细胞分 隔部分。该细胞分隔部分可以包括细胞核、核仁、核膜、高尔基体(golgi apparatus)、内质网、线粒体、液胞、过氧物酶体、微管、中心粒、 核糖体、细胞膜和细胞壁。预定波长可包括UV、可见、和IR吸收范 围。被用于增强不同细胞分隔部分之间的对比并允许分类和定量各种 细胞的这些染料可以包括活体染料、红外染料、近红外染料和荧光染 料，染料为示例。例如，当细胞核被染色时，根据它们的核的形态和 数量可以识别并定量各种白细胞类型。被用于检测细胞和被染色分隔 部分的入射或询问光束最好具有所使用染料的最大吸收波长的10nm 内的波长。与细胞检测、计数和图像识别相关的细节被公开在共同待 审批、通常指定的2002年2月13日提交第60/356,982号、2002年4 月11日提交第60/372,007号、2002年9月4日提交第60/xxx,xxx号 题均为“生物盘和生物驱动分析仪系统以及相关方法”(Bio-Disc and Bio-Drive Analyser System Including Methods Relating Thereto)的美 国临时申请；2001年11月9日提交题为“使用光学生物盘的盘驱动器 系统和方法”(Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs)的第10/008,156号美国专利申请；和2002年1月10日提 交题为“用以生物和医学成像的包括相关方法的光学盘分析系统” (Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging)的第10/043,688号美国专利申请中。 所有这些专利申请通过参考结合在本文中。
如本发明的一种优选实施方式，包括例如NN382、IRDye38、 IRDye40、IRDye41、IRDye78、IRDye700、和IRDye800的LI-COR IRDye(LI-COR Bioscience，Inc.，Lincoln，NE)，TO-PRO-5碘化物， IR-780碘化物，激光Pro IR Dyes(Molecular Probes，Eugene， OR)，dd-007，Zynostain(Zynocyte，Univ.of Glasgow，U.K.)，艾杜酞菁绿、 铜酞菁、3，3’-二乙基噻三羰花青碘化物(DTTCI)、3，3’-二乙基噁 三羰花青碘化物(DOTCI)、3，3’-二乙基噻二羰花青碘化物(DTDCI)、 和3，3’-二乙基噁二羰花青碘化物(DODCI)的红外吸收染料被用于 标记细胞核，以改进样本中细胞的核的图像。该染色过程有助于样本 中正常和异常细胞的附加信息和细节的可视化。其它染料可以被用于 染色细胞的各部分。可以被用于本发明的其它染料的示例被说明和列 举在Milwaukee，WI的Aldrich Chemical Inc.的Floyd J.Green发表的 “The Sigma-Aldrich Handbook of Stains，Dyes，dan Indicators”；New York，NY的Masaru Matsuoka(Ed.)在Plenum Press上发表的“Topics in Applied Chemistry：Infrared Absorbing Dyes”；和Patonay，G，和 Antonie，M.D.在1991年3月15日的Analytical Chemistry第6期第 63卷发表的“Near-infrared Fluorogenic Labels：New Approach to an Old Problem”中。所用这些资料都通过参考结合在本文中。
在本发明的另一优选实施方式中，染色过程涉及包括Zynostain 的活体核染色，以增加细胞核与周围细胞质的对比度和改进图像质量 并辅助识别各种白细胞类型。
接下来参照图60，表示使用本发明的光学生物盘系统所收集的利 用dd-007红外染料染色的白细胞的图像。如图所示，细胞核被染色并 且对来自光学盘读出器的入射束不透光。细胞核的不透光是由dd-007 染料对入射束的吸收导致的。如图所示，根据它们细胞核的形态可以 容易地识别样本中的各种细胞类型。图61表示图60中被识别细胞的 放大图。
试验详述
虽然已经参照附图详细说明本发明，下文给出本发明的进一步示 例的某些示例。
实例1
图17A的流程图表示样本的制备、生物盘的使用和图52和53 中更详细表示的结果的提供。例如方法步骤的单个时间周期、旋转速 率和其它细节的以下实例的细节比上文参照图17A、52和53所说明 的细节要更具体。但是，本实例的基本步骤类似于上述步骤。
A.包括衬底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，使用气枪清洗反射盘和透射盘衬底120(分别见图 2和图5)以去除灰尘颗粒。利用旋涂器使用异丙醇冲洗该盘两次。2 ％的聚苯乙烯被旋涂在盘上以给定非常厚的全涂层。
然后化学物被沉积。一种实施方式包括培育的三步沉积规程：抗 生蛋白链菌素，培育30分钟；生物素基化的原发抗体培育60分钟； 和继发俘获抗体培育30分钟。原发抗体可以在第一物种(例如羊)中 对抗第二物种(例如老鼠)的一种免疫球蛋白(例如lgG、lgG、lgM) 而被培养。继发俘获抗体在第二物种中对抗特定细胞表面抗原(例如 CD4、CD8)被培养。这些步骤在潮湿室中于室温下利用沉积之间的 冲洗和干燥步骤被完成。
1μl的比率为1mg/ml的磷酸盐缓冲盐水中的抗生蛋白链菌素被 涂在各窗上并培育30分钟。过量的抗生蛋白链菌素被利用蒸馏水冲洗 掉并且盘被烘干。等量的生物素基化的抗鼠lgG(PBS中125μg/ml) 和醛活化葡聚糖(200μg/ml)被组合。醛活化葡聚糖(DCHO)-生物素 基化的抗鼠lgG合成物被涂在各俘获窗口中抗生蛋白链菌素上并在制 冷机中培育60分钟或整夜。过量的试剂被冲洗掉并且盘被旋干。
如图47所示，可以有许多用于不同检验的径向观察窗，例如CD4 (窗口2)、CD8(窗口3)、CD3(窗口4)、和CD45(窗口5)，和负 控制(窗口6)，使用对抗人类细胞表面抗原的鼠lgG抗体。该被制备 的衬底在制冷机中培育30分钟或整夜。
化学沉积的图案被提供在以下表3中。
表3 窗口 1-2 3-4 5-6 7-8 第一层 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 抗生蛋白链 菌素 继发抗体 B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO B抗小鼠 lgG+DCHO 原发抗体 小鼠抗人 CD4 小鼠抗人 CD8 小鼠抗人 CD3 小鼠抗人 CD45
B.盘装配
使用可以是例如25μm、50μm、或100μm厚的粘合层(图2和5 的通道层118)装配盘，带有被标记出部分，例如U形或“e-rad”通道， 以产生流动通道，和透明盖部分116(图5，用于带有顶检测器的透射 盘)或位于俘获区上的带有反射层142的盖部分116盘(图2，用于 带有底检测器的反射盘)。
在一种实施方式中，盘是一种涂有作为被编码信息层的300nm 金的前摆动部件FDL21：13707或FDL21：1207 CD-R盘。在反射盘上， 通过已知的光刻技术从反射层蚀刻出尺寸为2×16mm的椭圆形观察 窗。在透射盘的某些设计中，没有蚀刻单独的观察窗，并且整个盘可 用。在这种具体实例中，通道层由Fralock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661形成。盖为具有48个直径为0.040英寸位于半径26mm等距 处的试样入口的透明盘。利用CD4/CD8计数软件使用该软件以4X的 速度和2.67MHz的取样速度扫描并读数据盘。
C.盘泄漏检查
由于分析血液，可以首先检查盘的泄漏以确保在盘与原位试样自 旋过程中没有室泄漏。使用一种阻断剂，例如StabilGuard和 PBS-Tween，填充各通道。阻断至少一小时。盘被以5000rpm旋转5 分钟并检测泄漏和检查盘稳定性。在检测泄漏之后，盘被放在真空室 中24小时。真空处理24小时之后，盘被放置在真空袋中并储存在制 冷机中直至使用。
D.样本收集、制备和应用于盘
以下部分涉及图17A通常所示的样本处理步骤。通过密度梯度离 心方法提纯单核细胞(MNC)，例如使用Becton Dickinson CPT Vacutainer。血液(4-8ml)被直接收集入4或8ml的包含CPT Vacutainer的EDTA中。试管172被在带有水平转子和转位式桶的生 物危害离心室中以1500至1800×g室温下离心25分钟。血液最好在 收集两小时内被使用。离心后，覆盖单核细胞部分的血浆被去除，在 MNC层上留下约2mm的血浆。MNC被收集并使用PBS冲洗。通过 以300×g在室温下离心10分钟将细胞压成丸。上清液被去除并且通 过轻敲试管包含MNC的丸被在PBS中再悬浮。在室温下一次以上以 300×g冲洗10分钟以去除血小板。最终丸被再悬浮至10,000细胞/ 微升的细胞计数。体积为18微升的MNC被导入一个或更多分析室或 通道，在盘静态情况下室温下培育15分钟。通道被密封。然后使用盘 驱动器以3000rpm的转速旋转盘3至4分钟。最好使用软件以速度4× 和抽样速率26.7MHz扫描和读该盘。
如果血样不能立即被处理，通过小心反转CPT管几次，第一离 心之后的单核细胞可以被在血浆中再悬浮，并在室温下被存储达到24 小时。在24小时内，血浆中的细胞可以如上所述被收集和冲洗。
E.CD4/CD8测定格式
本实例的测定为一种普通均匀固相细胞俘获测定，以快速确定血 样中的CD4+和CD8+T淋巴细胞总体的绝对数和CD4+/CD8+淋巴 细胞的比率。在被结合入CD-ROM的小室中运行的该检测，确定被 从全血分离的7μl的单核细胞(MNC)中的俘获区上的特定抗体所俘 获的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+和CD45+细胞的数量。该检测 基于盘上的具体位置上的局部细胞俘获的原理。根据具体血细胞表面 抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，通过俘获化学物的局部应用，在盘 上产生几个特定细胞俘获区。当使用MNC血(30,000细胞/微升)充 满室时，表示CD4、CD8、CD2、CD3和CD45抗原的细胞被在盘上 的俘获区中俘获。也被结合入条形码的是受限负控制区。
F.盘上分析
在上述步骤D中制备的MNC细胞(PBS中18微升)，被注入盘 室中，并密封室的入口和出口。该盘被在室温下培育15分钟，然后在 带有顶检测器的光学驱动器中使用780nm的激光扫描以成像如上所 述的俘获区。
软件被编码在盘上以指示驱动器自动执行以下任务：(a)在一个或 更多阶段中离心盘以分离过量的未结合细胞，(b)成像具体的俘获窗 口，和(c)处理数据，数据处理包括计数各俘获区中的具体被俘获细胞 和得出CD4/CD8比率(或者程序待确定的任何比率)。
在处理步骤过程中，软件沿各俘获区图像读并当它与这些细胞相 遇时标记细胞。举例说来，在计算CD4+和CD8+细胞的数量之后，软 件计算CD4+/CD8+比率，并显示每微升全血的CD4+、CD8+、CD3+ 和CD45+俘获区中的细胞的绝对数以及CD4+/CD8+比率。从将盘插 入光学驱动器到获得这些绝对数和比率整个过程需要12分钟。
G.所使用试剂
抗生蛋白链菌素(Sigma，cat.# S-4762)：添加去离子水以制作 5mg/ml的溶液，等分量并储存在-30℃下。为了使用，添加三羟甲基 氨基甲烷缓冲液使最终浓度为1mg/ml。
正控制：CD45(Sigma，Lot#038H4892，cat#C7556)。储存在 2-8℃下。
继发俘获抗体：蒸馏水中制造的1.5mg/ml生物素基化的抗鼠lgG (在羊中培养，Vector实验室，lot#L0602，Catalog#BA-9200)储 备液。在0.1M PBS中制造125μg/ml的b-lgG溶液。储存在2-8℃下。 可以被保持在-30℃用以长期储存。
醛活化葡聚糖(Pierce，lot#97111761，cat#1856167)。PBS中 5mg/ml储备液，储存在2-8℃下。
原发俘获抗体：CD4(DAKO，cat#M0716)、CD8(DAKO， cat#M0707)、CD2(DAKO，cat#M720)、CD45(DAKO，cat#M0701)、 CD14(DAKO，cat#M825)、和CD3(DAKO，cat#M7193)。储存在 2-8℃下。
负控制：小鼠lgG1(DAKO，cat#X0931)。储存在2-8℃下。
磷酸缓冲盐(PBS)，PH7.4(Life Technologies/GIBCO BRL，cat.#10010-023)或等价物。储存在室温下
异丙醇，90-100％
H.RBC溶解规程
氯化铵溶解缓冲液
1×氯化铵溶解缓冲液储备应该被储存在2-8℃下。它包括0.155M NH4Cl、10mMKHCO3和0.1mM二钠EDTA；Ph7.3至7.4。储存在2-8℃ 下。在使用之前达到室温。
程序
1.为每100μl的血添加2ml的溶解缓冲液。(最好在生物危害通风 厨(hood)中执行本程序。)
2.室温下涡动并培育15分钟。
3.以500×g室温下离心血液5分钟，使用生物危害通风厨中的 离心。
4.去除上清液并使用2％的PBS中的FCS或FBS冲洗细胞。离 心细胞。
5.计算WBC的总量并使得WBC的最终浓度为10,000细胞/微升 用以样本注入。
实例2
单核细胞分离程序
使用Becton和Dickinson Vacutainer CPT(BD catalog #362760 4ml，#362761 8ml)细胞制备试管与柠檬酸钠。在生物危害通风厨中 遵循所有生物危害预防措施执行程序。步骤如下：
1.将血直接收集入4或8ml包含CPT Vacutainer的EDTA中。 如果血样已经在抗凝血剂中，首先倒出Vacutainer中的EDTA并随后 将6-8ml的血样倒入CPT试管中。
2.在带有水平转子和转位式桶的生物危害离心室中以1500至 1800×g室温下离心试管25分钟。为了最好的结果，血液应该在收集 两小时内被离心。但是，长于2小时的血液应该在MNC数量减少和 RBC杂质增加的情况下被离心。
3.离心后，去除血浆在MNC层上留下约2mm的血浆。收集并传 送发白的单核细胞层进入15ml的锥形离心管。
4.添加10-15ml的PBS至MNC层，通过反转离心管几次小心混 合细胞。
5.通过在生物危害离心室中室温下以200×g离心10分钟冲洗细 胞。
6.去除上清液。通过轻敲试管再悬浮细胞。
7.在10ml PBS中冲洗一次以上。室温下以200-300×g离心10 分钟以去除血小板。
8.去除上清液并在50μl PBS中再悬浮细胞丸。
9.计算血样中的细胞计数。运行CBC或将2μl的细胞稀释为18μl 的锥虫蓝，小心混合并使用血细胞计数器计数细胞。将血样制备为用 以分析的最终10,000细胞/微升的细胞计数。
10.如果细胞不能立即被处理，通过小心反转CPT管几次，第一 离心(上述步骤2)之后在被分离的血浆中再悬浮单核细胞，并在室 温下被存储达到24小时。在24小时内，收集血浆中的细胞并继续如 上所述的冲洗。
每微升的总细胞计数＝25小平方(small squares)中的细胞数量× (乘)100。
实例3
使用Histopaque-1077从全血中分离MNC
1ml的Histopaque-1077被放置在15ml的离心管中并且1ml的 全血被小心地层叠在Histopaque-1077上面。然后以400×g室温下离 心。使用牧场吸管(pasture pipette)小心吸出合成物并且半透明界面被 传送至离心管。然后10ml的PBS被添加至离心管。然后溶液被以250 ×g离心10分钟。上清液被轻轻倒出并且细胞丸被在10ml PBS中再 悬浮并以250×g旋转10分钟。然后通过在10ml PBS中再悬浮并以 250×g旋转再次冲洗细胞。最终的细胞丸被在0.5ml的PBS中再悬浮。
实例4
盘制备和化学沉积(使用抗生蛋白链菌素)
A.包括衬底制备和化学沉积的盘制造
在本实例中，使用气枪清洗透射盘衬底以去除灰尘。然后该盘被 安装在旋涂器中并使用异丙醇的稳定流冲洗两次。接下来，带有被溶 解在310ml甲苯和65ml异丙醇中的2％聚苯乙烯的聚苯乙烯溶液被均 匀涂在盘上。
对于抗生蛋白链菌素沉积而言，抗生蛋白链菌素储备液被稀释为 PBS中1mg/ml。使用手工定位(pin)沉积，大约1μl的抗生蛋白链菌素 被沉积在盘上的各俘获区中。盘被在湿度室中培育30分钟。然后过量 的未结合抗生蛋白链菌素被利用D.I.水冲洗掉并且盘被旋干。
对于继发抗体沉积而言，醛活化葡聚糖的新鲜溶液(PBS中 200μg/ml)被与等量的Vector lgG(PBS中125μg/ml)组合。使用手 工定位沉积，大约1μl的lgG+DCHO合成物被沉积在盘上的各俘获区 中。盘被在湿度室中培育60分钟。过量的抗体被利用D.I.水冲洗掉并 且盘被旋干。
对于原发抗体沉积而言，DAKO CD4被稀释为PBS中50μg/ml， DAKO CD8被稀释为PBS中25μg/ml，而DAKO CD45被稀释为PBS 中145μg/ml。使用手工定位应用器，在被结合继发抗体上部沉积大约 1μl的各原发抗体。然后盘被在湿度室中培育30分钟。过量的未结合 抗体通过使用PBS冲洗俘获区被去除并且盘被旋干。
B.盘装配
所用的盖盘为带有被固定至盘的Fraylock粘合通道层的透明盘。 被标记入粘合剂的是产生射流电路的4个U形通道。盖被放置在透射 盘衬底上以使流动通道覆盖俘获区。接着，为了将盘固定在一起，它 们被通过盘压8次。
C.盘泄漏检查、阻断
使用StableGuard填充各通道并培育一小时。在培育过程中，盘 被在旋涂器中以5000rpm旋转5分钟。在旋转之后，盘通道被检查泄 漏。接下来，StableGuard被吸出通道，并且盘被放置在真空室中在 真空下整夜。第二天早晨，盘被放置在真空袋中并储存在4℃下。
实例5
血涂片的制备
从包含RBC、大量WBC和血小板的白细胞层中取5μl血。细胞 被放置在中央盖片的一端，将另一盖片的一端放在血滴上用以沿边缘 扩散血液并随后均匀地滑过，细胞被固定在100％乙醇中并风干。
实例6
使用Zynostain染色细胞
A.从白细胞层中取25μl的血细胞，并通过使用1％的乙醇、1％ 的TritoX 100(50μl/5ml Po4缓冲液)和使用37℃的培育温度，使用 25μl的活体染料Zynostain染色，在10、20和30分钟取出样本。然 后细胞被涂在玻璃盖片上。盖片被固定至光学生物盘并且然后使用光 学生物盘系统取细胞的图像。
B.从白细胞层取血细胞并与Zynostain以1∶3和1∶6的细胞比染 料比率混合，并培育5、10和30分钟。然后制作玻璃盖片上的涂片。 盖片被固定至光学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图 像。我们发现1∶6的细胞与染料比率和30分钟的培育表现良好的细胞 染色。
C.取5μl的全血并与20μl的白血病培养细胞和120μl的Zynostain 混合，并培育30分钟。然后制作玻璃盖片上的涂片。盖片被固定至光 学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图像。
实例7
使用To-Pro-5-碘化物荧光染料染色淋巴细胞培养细胞(KG1a)
培养细胞被以800rpm离心5分钟。上清液被去除并且细胞丸被 在Ph7.4的PBS中再悬浮。然后10μl的TP-Pro-5-碘化物和100μl的 细胞悬浮液被混合。然后在使用To-Pro-5-碘化物培育5、10、30分钟 后在荧光显微镜下观察细胞。
实例8
使用LI-COR IRDye38染色KG1a细胞
在Ph7.4的PBS中冲洗KG1a培养细胞两次(以800rpm旋转2 ×10分钟)。被冲洗后的细胞在DI水中的4％IRDye38中培育30分 钟。然后在玻璃盖片上涂片。盖片被固定至光学生物盘并且然后使用 光学生物盘系统取细胞的图像。
实例9
使用IRDye38和dd-007染色KG1a细胞
分离KG1a细胞，以800rpm旋转培养细胞5分钟，轻轻倒出上 清液并在Ph7.4的PBS中冲洗细胞2×10分钟。被冲洗后的细胞被分 为两等份，并与或者DI水中的4％IRDye38或者TritonX-PBS7.4中 的dd-007混合各30分钟。然后细胞被涂在玻璃盖片上。盖片被固定 至光学生物盘并且然后使用光学生物盘系统取细胞的图像。使用 dd-007染料的本实验的结果表示在图60和61中。
结束声明
本文所公开的涉及设备、方法和过程的本发明的方面也被说明在 2001年9月20日提交序列号为60/323,682的题为“使用阻断剂减少光 学生物盘上的细胞非特异结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents)的美国临时申请；2001年9月24日提交序列号为60/324,336 的题为“使用聚乙烯醇减少射流室中的气泡的方法和在光学生物盘中 获得相同效果的相关技术”(Methods for Reducing Bubbles ih Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs)的美国临时申请；2001年10月 3日提交序列号为60/326,800的题为“光学分析盘部件内的危险生物材 料的容器的密封方法”(Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies)的美国临时申请；2001年10月10日提交序列号为 60/3028,246的题为“使用光学生物盘平台计算帮助剂/诱导剂抑制剂/ 毒素T淋巴细胞的定性和定量比率的方法”(Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/ Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年10月19日提交序列号为60/386,072的题为“使用光 学生物盘平台表征包括白血病血样的癌血细胞的定性和定量方法” (Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临时申请；2001年10月19日提交 序列号为60/386,073的题为“使用光学生物盘平台定性和定量表征包 括淋巴瘤血样的癌血细胞的方法”(Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform)的美国临 时申请；2001年10月26日提交序列号为60/386,071的题为“通过原 发抗体与试样的位置外培育和随后通过表面结合继发抗体的具体细胞 俘获方法和包括该方法的光学生物盘”(Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc including Same)的美国临时申请；2001年11月7 日提交序列号为60/344,977的题为“包括免疫表型的细胞分离和定型 的定量及定性方法”(Quantitative and Oualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping)的美国临时申 请；和2001年11月9日提交序列号为60/349,975的题为“使用包括肝 素、血浆、和聚赖氨酸等的带电物质减少光学生物盘上的细胞非特异 结合的方法”(Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin， Plasma，or Poly-Lysine)的美国临时申请中，所有这些申请通过参考 结合在本文中。
所有专利、临时申请、专利申请、和本说明书提到其它的出版物 被全部结合入本文的参考文献中。
尽管本发明已经被参照某些优选实施方式详细说明，应该理解本 发明不限于这些精确实施方式。相反，根据说明实施本发明的目前最 佳方式的本光学生物公开，本领域的技术人员将明白在不偏离本发明 的精神和领域的情况下的许多修改和变化。因此，本发明的领域被下 面的权利要求书指示，而不是前面的说明。在权利要求书的等价物的 意思和范围内的所用改变、修改和变化将被认为是在这些领域内的。
此外，仅是使用常规试验，本领域的技术人员将认识或者能够确 定这里所述的本发明的具体实施方式的许多等价物。这些等价物也被 确定为被下面的权利要求包括。
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