本发明涉及对照细胞和生产用于免疫检测的该细胞的方法。尤其是，本发明 涉及具有至少一种特定细胞类型的种群或数量的保藏非传染性对照细胞，所述特 定细胞类型种群或数量是患病哺乳动物血液或组织样品中所述细胞种群或数量的 指示特征，与正常血液或组织样品的其数量相比，所述疾病可导致上述细胞数量 改变。具体地说，非传染性对照细胞通过减少或扩增在正常血液中发现的反映特 定的疾病状态的一种或多种细胞类型，从正常、非传染性、非疾病变化的血液中 产生的。然后将这种减少或扩增的正常血液样品保藏，例如，冻干，以便延长其 保存期，随后将其用于临床和免疫分析方法中。

对照细胞是准确无误的临床和免疫检测中所必需的。需要对照细胞来确保测 试设备和测试方法的可靠性和准确性，并保证在不同的时间和不同的实验室的可 重复性。管理这些检测的美国州和联邦法规通常要求使用多级对照以证实设备在 一定值内性能运行正常。免疫检测中，新鲜的正常细胞为这种设备检测的标准对 照细胞。为了免除获得和保持新鲜细胞所需的费用和开支，已评估了各种保藏新 鲜细胞的方法。例如，US.5,059,518(’518专利)描述了使用 冻干的正常哺乳动物细胞作对照细胞。

也曾经采用异常血细胞样品作为对照细胞来证实疾病的存在并确定其阶段， 但是已将它们的使用限制在从患者抽取的新鲜或鲜冻样品。因此这些样品的供应 受到内在的限制。再者，由于许多这样的血样与传染性疾病有关，由于健康和社 会以及有时技术上的原因，这些血样不能大规范生产和销售，并且这些血样需要 特别的处理方法。

本发明描述通过使用经修饰的正常对照细胞样品作为上述异常对照细胞的替 代物而反映人血中存在于表现出特定疾病的人血液中的一种或多种特定细胞类型 的种群或数量。

本发明提供反映表现出疾病的，以及血液中存在的细胞类型、数量或生理化 学性质上有改变的哺乳动物血样中特定细胞种群的对照细胞，以及生产与保藏这 些对照细胞的方法。对照细胞反映以下两个方面的血细胞种群的异常现状；(1) 由于疾病的存在而使特定类型细胞在数量上的增加或减少，增加或减少的量与正 常血样中这些细胞的数量有关；或(2)存在在正常血样中不应发现的细胞，这 些细胞在大小、形状或其它物理特性上有差异，或具有未在正常细胞发现的分子 和/或抗原位点。第一种类型的对照细胞通过减少正常存在于血液中的特定细胞 的血样至正常水平以下或通过添加这些细胞至存在于血液中的正常水平之上来制 备，且随后保藏该样品。第二种类型的对照细胞通过将不是正常存在于血液中的 细胞加到正常血样中并随后保藏该样品。

图1(a)-(d)表示正常血样的流动血细胞计数分析，其中白细胞已与 PE(藻红蛋白)标记的抗CD-19单克隆抗体和FITC(异硫氰酸荧光素) 标记的抗CD-10单克隆抗体结合。

图2(a)-(d)表示含有添加的CD10阳性细胞的正常血样的流动血 细胞计数分析。

图3(a)-(d)表示患有普通急性淋巴白血病患者血样的流动血细胞计 数分析。

图4(a)-(d)表示正常白样的淋巴细胞流动血细胞计数分析。

图5(a)-(d)表示AIDS患者血样淋巴细胞的细胞计数分析。

图6(a)-(d)表示按本发明已减少了CD4细胞的淋巴细胞的细胞计 数分析。

图7图示当正常细胞样品用增加体积的减少了CD4细胞的样品稀释时，C D4细胞百分率的降低。

图8图示当正常细胞样品用增加体积的减少了CD4的样品稀释时，每立方 毫米样品体积中CD4细胞数量上的变化。

本文中采用的术语“异常对照细胞样品”是指细胞的种群或数量或者所有或 特定类型不同于正常血样的细胞样品；或存在着不存在于正常血样中的异常血样 细胞。例如，全部白细胞(白血细胞或WBC)总数的正常值为4,300至1 0,800每立方毫米。示差白细胞计数中各种细胞类型的正常值为：分节核中 性白细胞(segmented neutrophil)=34-75％，带 状核中性白细胞(band neutrophis)=0-8％，淋巴细胞= 12-50％；单核细胞=3-15％。嗜曙红细胞=0-5％和嗜碱性粒细胞 =0-3％(The Merck Manual,14th Ed.R.Be rkow,ed(Merck Sharp & Dohme,Rahway, New Jersey 1982),p2182)。异常血样中，这些值有所 不同。例如，(1)慢性粒细胞白血病患者的样品中，WBC数量可升至15, 000至500,000或更高(文献同上，p1142)；(2)血友病者会 患有轻微至严重的Ⅷ因子缺陷，该因子鉴别为一种抗原(文献同上，p1127 -1129)；和(3)普通急性淋巴母细胞白血病(CALL)患者的样品中， 细胞会含有不正常出现的CD10抗原，该抗原可由抗CD10单克隆抗体如J 5(Coulter Corporation,Hialeah,Flori da)特殊地鉴别。

术语“生理化学性质”包括细胞的抗原特性，不论这些特性是正常存在的还 是由于疾病导致未存在的。

本发明可由许多不同形式和与不同哺乳动物种类有关的实施方案来实现。虽 然本文描述的详细实施例涉及人及与AIDS和CALL关的分析，这些实施 例将被看作本发明原理的举证，而并非旨在将本发明的范围限定至这些特定的实 施方案。再者，虽然用来鉴别细胞类型的分子结构是人独有的且在其它哺乳动物 中一般是没有的，但本发明的实施不限于人对照细胞样品和制备该样品的方法。 例如可制备用于诊断猫白血病病毒或猿猴T细胞亲淋巴病毒1(STLV-1)， 以及其它对照细胞样品。

异常对照细胞通常与两种情况之一有关。首先，特定类型细胞种群或数量的 增加或降低。例如，从HIV(AIDS)感染的病人定期抽取的血样将显示C D4′阳性淋巴细胞随疾病发展而降低。其次，出现正常血样中未发现的细胞。 例如，普通急性淋巴母细胞白血病患者的外周血样中出现CD10阳性细胞[C ALL；K.A.Foon et al.,“Immunologic Cl assification of Leukemia and Lympho ma”,Blood 68:1-31(1986)]。通常用仪器，加上将特 异的单克隆抗体与特定细胞类型其上或其中的特异分子结构结合，完成有关各种 细胞种群血样的免疫分析。例如，通过将抗CD4单克隆抗体结合到CD4分子 的抗原位点上，鉴别CD4阳性淋巴细胞。可以在单一的细胞上鉴别几种不同分 子结构，以便鉴别特定的细胞类型或是与特定疾病有关的特定细胞类型。可以将 大类的(broad class)细胞增分成更小和更具体的亚型。为了从几 大类中区分一大类细胞并从选出的大类中进一步区分所选大类亚型，可将不同的 标记结合到不同的单克隆抗体上。例如，可以使用单独或组合的、含有分子、酶 和染料(特别是荧光染料)的放射成分作为这样的标记物。优选的是荧光染料， 且此染料的例子包括荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，异硫氰酸四甲基若 丹明(TRITC)，藻红蛋白(PE或RD)，藻红蛋白-得克萨其红结合物 和别藻蓝蛋白等等。

降低特异细胞的数量对于对照细胞来说是重要的，通常，制备此对照细胞的 方法包括：采集正常的、白血球富集的、抗凝固的血样；将其中的红细胞(RB Cs)溶胞并洗涤样品以去除溶胞碎片或由任何其它适宜的方法，例如US4, 752,863中描述的方法除去红细胞，使用与可剥离底物诸如玻璃、陶瓷或 聚合物珠，优选磁珠结合的单克隆抗体从样品中去除特异细胞类型；并将去除的 细胞重新加至可以表示疾病发展的不同阶段的特定水平。然后将样品长期保藏， 例如，根据US5,059,518中描述的方法冻干样品(其方法引入本文中 作为参考)，或通过其它适合的细胞保藏技术。除了那些特异的与疾病相关的其 数目已增加或降低的细胞，或已加入那些特异的与疾病有关的细胞之外，由此生 产的对照细胞显示正常的白血球细胞谱。

给出以下实施例是作说明之用，而不应看作限定本发明。

HIV患者的血液中表现出CD4(T4)细胞的含量降低。由于CD4细 胞在抵抗许多直接导致AIDS患者死亡的继发性疾病中起着重要作用，进行C D4数量测定可以指示HIV感染的程度和患者避免继发性感染的能力。由于患 者的血样分析是绝对必要的，因此人们希望用于分析的对照细胞是非传染性的， 这样便可将任何疾病的偶然传播降至最低限度。 实施例1制备用作AIDS对照细胞的CD4减少的正常血细胞

将若干ACD(柠檬酸葡萄糖)或CPD(柠檬酸，磷酸葡萄糖)抗凝固的、 白细胞富集的、正常血集合物在容器中合并，得到大量白细胞富集的血样。用0. 83％(重量比)的氯化铵溶液将样品中的红血球溶胞。溶胞后，用Hepes -盐水-牛血清白蛋白溶液(HSB)将白血细胞洗涤几次。然后将白血细胞从 最终洗涤液中分离出来并置于含有作为保藏介质的等渗10％海藻糖溶液容器中。 保留部分白血细胞备用。另外，通过例如由US4,752,563描述的那些 方法，以及其它方法，将抗CD4单克隆抗体如T4(Coulter Cor poration,Hialeah)结合到磁珠上。将抗CD4结合的磁珠加 到洗涤的白细胞样品中并混合30分钟。采用磁性装置例如手持磁分离器或市售 磁分离器将珠和结合于其上的细胞从容器中除去。将留在容器中的细胞离心分离， 去除上层的清液并将细胞重悬浮于等渗海藻糖溶液中，最好是作为保藏介质的等 渗10％海藻糖溶液。然后将CD4减少的样品与不同数量保留白细胞或来自其 它带已知数量CD4细胞的样品中的正常、无白细胞红血球混合，制备含不同数 量CD4细胞的样品。例如：

1级CD4细胞：等体积的保留白细胞和CD4减少的白细胞混合，得到在 原正常采集的血样中有50％CD4细胞的样品。

2级CD4细胞：三个体积的保留白细胞和一个体积CD4减少的白细胞混 合，得到在原采集的血样中有25％CD4细胞的样品。

3级CD4细胞：九个体积的保留白细胞和一个体积CD4减少的白细胞混 合，得到在原采集的血样中有10％CD4细胞的样品。

图7和8以图表示按所述方法制备的CD4对照细胞。图7描述当含正常C D4的样品用增加量的CD4减少的血稀释时，阳性细胞百分率的变化。图8描 述当稀释度增加时，每立方毫米CD4阳性细胞绝对数量的变化。

此外，采集其它的正常的ACD或CPD抗凝固的、富集白细胞血集合物， 将红血细胞溶胞且如本文前面所述的方法洗涤白细胞。采集样品中存在的CD4 细胞数量可由使用荧光标记的T4单克隆抗体的流动血白细胞计数法确定。然后 将该采集含CD4的样品的等分物与各种量的CD4减少的白细胞混合而制备具 有不同浓度的CD4细胞的对照细胞样品。 实施例2制备添加CD10(CALLA)的对照细胞

采集大量的正常ACD或PCD抗凝固的、富集白细胞的红血细胞集合物， 并用0.83％(重量比)的氯化铵溶液将红血细胞溶胞。溶胞后，用HSB洗 涤白细胞几次。然后将白细胞从最终洗涤液分离并置于含有作为保藏介质的等渗 10％海藻糖溶液的容器中。另外使用市售CALLA阳性细胞(一种美国典型 培养物保藏中心(ATCC)的CALLA样品)或其它来源的细胞制备培养的 CALLA(CD10阳性，普通急性淋巴母细胞白血病抗原)阳性细胞。在这 里使用的细胞来自ATCC，保藏号CRL1596。然后将培养的CD10+ 细胞以不同的量加入到各等份保藏溶液中的正常白细胞中。 实施例3冻干用作非传染疾病细胞对照的稳定正常细胞

将由实施例1和2所示描述的方法制备的对照细胞根据US5,059,5 18(其方法人本文作为参考)冻干。具体地，将悬浮在等渗10％海藻糖溶液 中的1、2或3级CD4对照细胞或CALLA对照细胞置于300μl冻干管 形瓶中，盖上管形瓶并冷却至4℃，然后搅拌以保证使细胞分布均匀，之后将管 形瓶置于约-70℃冰箱中至少一小时。冷冻完之后，立刻将管形瓶置于冻干器 中约15小时。15小时结束后将冻干的管形瓶从冻干器中移出并贮藏在温度为 2-8℃的冰箱中。此对照细胞可贮藏6个月或更长。向冻干管形瓶中加入去离 子水或蒸馏水至300μl体积可重配冻干细胞。为在流动血细胞计数器中进行 对照检测，将再悬浮的重配细胞染色，或作其它方式的标记，然后用标准流动血 细胞计数方法分析。也可在其它类型的测定或其它适合的诊断方法中使用再悬浮 细胞。

图1、2和3(a)-(d)将正常细胞(图1)与患者细胞(图3)以及 根据本发明方法制备的对照细胞(图2)相比。这些数字表明，使用对照细胞， 该检测手段能检测出可能存在于得病的患者血样中的异常CD10+和CD19 +细胞。

图4、5和6(a)-(d)，表示该检测手段能检测出在AIDS患者中 能见到的少量的CD4+细胞。图4中四边形1表示正常血样中出现的CD4+ 细胞。图5中，四边形1表示AIDS患者中见到的减少的CD4+细胞数量。 图6中四边形1表示该仪器能检测由本发明减少的对照细胞表示的减少的CD4 +。

图4中的(b)、(c)、(d)分析数据分别如表Ⅰ、表Ⅱ、表Ⅲ所示：

                   表Ⅰ

最小    最大    计数    百分率    平均     SD    ％HPCV 1x   0       2      1562     44.6     0.0     0.2  y   7       63                       23.9    3.7    11.6 2x   3       63     124      3.5      24.0    9.0    10.6  y   7       63                       14.7    8.1    9.71 3x   0       2      689      19.7     0.0     0.2  y   0       6                        1.0     1.8 4x   3       63     1126     32.2     26.6    6.4    8.26  y   0       6                        0.8     1.6

                   表Ⅱ

最小  最大  计数  百分率  平均   SD    ％HPCV 1   20    255   1231   35.2  108.3  24.6  4.44

                  表Ⅲ 最小  最大  计数  百分率  平均   SD  ％HPCV 31    255   1654   47.3   95.5  17.1  9.66

图5中的(a)-(d)分析数据分别如表Ⅳ-表Ⅶ所示：

                表Ⅳ

 最小   最大   计数   百分率   平均   SD   ％HPCV 1x    1      1      0      0.0  y    7      7 2x    0      0      1      0.0  y    0      0 3x    13     13     3      0.0  y    16     16 4x    3      3      4      0.0  y    16     16

                表Ⅴ

最小   最大   计数   百分率   平均     SD    ％HPCV 1x 0.102   2.426  -245    4.9    0.192   0.140  y 2.103   1023.                 20.99   9.44    24.4 2x 2.428   1023.    2     0.0    5.359   0.386   12.2  y 2.103   1023.                 7.146   1.546   6.11 3x 0.102   2.426  1109    22.2   0.193   0.164  y 0.102   2.101                 0.149   0.085 4x 2.428   1023.  3643    72.9   21.07   10.48   24.9  y 0.102   2.101                 0.108   0.023

                表Ⅵ

 最小   最大   计数   百分率     平均   SD   ％HPCV 1x   575.8  1023.  3553   23.5     814.0  58.9  y   29     57                     42.8   1.8   3.74 2x   8.367  76.72  387    2.6      20.97  8.34  30.5  y   18     41                     28.1   5.5   19.2 3x   13.66  15.75  0      0.0  y   0      0 4x   0.102  0.118  1      0.0  y   0      0

                表Ⅶ

最小   最大    计数   百分率    平均   SD     ％HPCV 1x  0.102  2.101   -259   77.3    0.197  0.140  y  7.679   1023.                 22.39  6.72    28.0 2x  2.103   1023.   76    22.7    18.73  13.96   32.2  y  7.679   1023.                 18.73  6.01    29.1 3x  0.102   2.101   0     0.0  y  0.102   7.672 4x  2.103   1023.   0.    0.0  y  0.102   7.672

图6中的(b)-(d)分析数据如表Ⅷ-表Ⅹ所示：

                表Ⅷ

 最小   最大   计数   百分率     平均   SD   ％HPCV 1x    0      3     175     5.0     0.1    0.5  y    8      63                    24.9   7.5   3.49 2x    4      63    78      2.2     28.49  8.9   3.83  y    8      63                    12.1   6.8   7.33 3x    0      3     1150    33.0    0.1    0.5  y    0      7                     1.1    1.9 4x    4      63    2090    59.7    28.2   7.1   7.54  y    0      7                     1.1    2.0

                表Ⅸ

  最小   最大   计数   百分率   平均   SD   ％HPCV 1    26     255    2130    60.9    115.9  26.1  5.41

                表Ⅹ

  最小   最大   计数   百分率   平均   SD   ％HPCV 1     34     249    231     6.6     90.3   35.3

本申请是申请日为1993年9月14日、申请号为93117510.0、 申请人为库尔特公司、发明名称为“血液测试鉴别爱滋病使用的保藏非传染性对 照细胞”的中国专利申请的分案申请。

本申请与1991年10月22日申请的美国专利US5,059,518 相关。本申请和US,5,059,518归共同的受让人，Coulter Corporation,Hialeah,Florida所有。