专利汇可以提供血液测试鉴别爱滋病使用的保藏非传染性对照细胞专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 描述从正常的、非传染的、非病变的血液中,通过减少或扩增一种或多种发现于正常血中反映特定 疾病 状态的细胞类型,制备非传染性对照细胞。将由此生产的对照细胞保藏并在此之后重建用于免疫检测。,下面是血液测试鉴别爱滋病使用的保藏非传染性对照细胞专利的具体信息内容。
1、反映患爱滋病的人类患者血样中CD4细胞的 对照细胞,所述爱滋病在发作时,与正常血样相比,存 在于所述血样中的CD4细胞数量上减少,所述的对照 细胞包含从正常血样中获得的正常白细胞种群,只是其 中的CD4细胞的量已减少至低于正常白细胞样品中存 在的CD4细胞量。
2、根据权利要求1的对照细胞,其中所述的细胞 进一步通过在等渗海藻糖溶液中冻干而保藏。
3、根据权利要求1或2所述的对照细胞,其中所 述细胞能通过去离子水或蒸馏水重配成用于免疫测定的 生物学对照物。
4、根据权利要求1或2的对照细胞,其中所述细 胞适合于替代在细胞流动细胞计数分析中作为标准物的 新鲜异常细胞。
5、根据权利要求1或2的对照细胞,其中所述的 细胞从正常人外周血细胞中得到。
6、一种制备反映患爱滋病的人类患者血样中CD 4细胞的保藏对照细胞的方法,所述爱滋病在发作时, 与正常血样相比,存在于所述血样中的CD4细胞数量 上减少,所述的方法包括:
(a)去除正常血样中的红细胞,或者将正常血样 中的红细胞溶胞并洗涤样品中剩余的细胞以除去溶胞碎 片;
(b)将余下的细胞悬浮于保藏溶液中;
(c)将步骤(b)的细胞分成两部分,其中一部 分保留,另一部分进行如下操作:
(d)(i)通过吸附到可剥离的底物上的抗CD4 细胞的单克隆抗体,从该非保留细胞中耗竭反映爱滋病 的CD4细胞,并且
(ii)步骤(d)(i)的耗竭的样品与
(1)不同量的步骤(c)中保留的细胞混合, 得到不同程度地减少了所述CD4细胞的样品;或
(2)根据步骤(a)和(b)处理的不 同的正常血样混合,得到不同程度地减少了所述CD4 细胞的样品;
(e)保藏步骤(d)中制备的细胞。
对照细胞是准确无误的临床和免疫检测中所必需的。 需要对照细胞来确保测试设备和测试方法的可靠性和准 确性,并保证在不同的时间和不同的实验室的可重复性。 管理这些检测的美国州和联邦法规通常要求使用多级对 照以证实设备在一定值内性能运行正常。免疫检测中, 新鲜的正常细胞为这种设备检测的标准对照细胞。为了 免除获得和保持新鲜细胞所需的费用和开支,已评估了 各种保藏新鲜细胞的方法。例如,US,5,059, 518(’518专利)描述了使用冻干的正常哺乳动 物细胞作对照细胞。
也曾经采用异常血细胞样品作为对照细胞来证实疾 病的存在并确定其阶段,但是已将它们的使用限制在从 患者抽取的新鲜或鲜冻样品。因此这些样品的供应受到 内在的限制。再者,由于许多这样的血样与传染性疾病 有关,由于健康和社会以及有时技术上的原因,这些血 样不能大规范生产和销售,并且这些血样需要特别的处 理方法。
本发明描述通过使用经修饰的正常对照细胞样品作 为上述异常对照细胞的替代物而反映人血中存在于表现 出特定疾病的人血液中的一种或多种特定细胞类型的种 群或数量。
本发明提供反映表现出疾病的,以及血液中存在的 细胞类型、数量或生理化学性质上有改变的哺乳动物血 样中特定细胞种群的对照细胞,以及生产与保藏这些对 照细胞的方法。对照细胞反映以下两个方面的血细胞种 群的异常现状;(1)由于疾病的存在而使特定类型细 胞在数量上的增加或减少,增加或减少的量与正常血样 中这些细胞的数量有关;或(2)存在在正常血样中不 应发现的细胞,这些细胞在大小、形状或其它物理特性 上有差异,或具有未在正常细胞发现的分子和/或抗原 位点。第一种类型的对照细胞通过减少正常存在于血液 中的特定细胞的血样至正常水平以下或通过添加这些细 胞至存在于血液中的正常水平之上来制备,且随后保藏 该样品。第二种类型的对照细胞通过将不是正常存在于 血液中的细胞加到正常血样中并随后保藏该样品。
图1(a)-(d)表示正常血样的流动血细胞计 数分析,其中白细胞已与PE(藻红蛋白)标记的抗C D-19单克隆抗体和FITC(异硫氰酸荧光素)标 记的抗CD-10单克隆抗体结合。
图2(a)-(d)表示含有添加的CD10阳性 细胞的正常血样的流动血细胞计数分析。
图3(a)-(d)表示患有普通急性淋巴白血病 患者血样的流动血细胞计数分析。
图4(a)-(d)表示正常血样的淋巴细胞流动 血细胞计数分析。
图5(a)-(d)表示AIDS患者血样淋巴细 胞的细胞计数分析。
图6(a)-(d)表示按本发明已减少了CD4 细胞的淋巴细胞的细胞计数分析。
图7图示当正常细胞样品用增加体积的减少了CD 4细胞的样品稀释时,CD4细胞百分率的降低。
图8图示当正常细胞样品用增加体积的减少了CD4细 胞的样品稀释时,每立方毫米样品体积中CD4细胞数量 上的变化。
本文中采用的术语“异常对照细胞样品”是指细胞 的种群或数量或者所有或特定类型不同于正常血样的细 胞样品;或存在着不存在于正常血样中的异常血样细胞。 例如,全部白细胞(白血细胞或WBC)总数的正常值 为4,300至10,800每立方毫米。示差白细胞 计数中各种细胞类型的正常值为:分节核中性白细胞( segmented neutrophil)=34 -75%,带状核中性白细胞(band neutr ophis)=0-8%,淋巴细胞=12-50%; 单核细胞=3-15%。嗜曙红细胞=0-5%和嗜碱 性粒细胞=0-3%(The Merck Manu al,14th Ed.R.Berkow,ed(M erck Sharp & Dohme,Rahwa y,New Jersey 1982),p2182) 。异常血样中,这些值有所不同。例如,(1)慢性粒 细胞白血病患者的样品中,WBC数量可升至15,0 00至500,000或更高(文献同上,p1142) ;(2)血友病者会患有轻微至严重的VIII因子缺陷,该 因子鉴别为一种抗原(文献同上,p1127-112 9);和(3)普通急性淋巴母细胞白血病(CALL) 患者的样品中,细胞会含有不正常出现的CD10抗原, 该抗原可由抗CD10单克隆抗体如J5(Coult er Corporation,Hialeah,F lorida)特殊地鉴别。
术语“生理化学性质”包括细胞的抗原特性,不论 这些特性是正常存在的还是由于疾病导致未存在的。
本发明可由许多不同形式和与不同哺乳动物种类有 关的实施方案来实现。虽然本文描述的详细实施例涉及 人及与AIDS和CALL有关的分析,这些实施例将 被看作本发明原理的举证,而并非旨在将本发明的范围 限定至这些特定的实施方案。再者,虽然用来鉴别细胞 类型的分子结构是人独有的且在其它哺乳动物中一般是 没有的,但本发明的实施不限于人对照细胞样品和制备 该样品的方法。例如可制备用于诊断猫白血病病毒或猿 猴T细胞亲淋巴病毒1(STLV-1),以及其它对 照细胞样品。
异常对照细胞通常与两种情况之一有关。首先,特 定类型细胞种群或数量的增加或降低。例如,从HIV (AIDS)感染的病人定期抽取的血样将显示CD4 阳性淋巴细胞随疾病发展而降低。其次,出现正常血样 中未发现的细胞。例如,普通急性淋巴母细胞白血病患 者的外周血样中出现CD10阳性细胞[CALL;K .A.Foon et al.,“Immunolo gic Classification of Le ukemia and Lymphoma”,Blo od 68:1-31(1986)]。通常用仪器, 加上将特异的单克隆抗体与特定细胞类型其上或其中的 特异分子结构结合,完成有关各种细胞种群血样的免疫 分析。例如,通过将抗CD4单克隆抗体结合到CD4 分子的抗原位点上,鉴别CD4阳性淋巴细胞。可以在 单一的细胞上鉴别几种不同分子结构,以便鉴别特定的 细胞类型或是与特定疾病有关的特定细胞类型。可以将 大类的(broad class)细胞增分成更小和 更具体的亚型。为了从几大类中区分一大类细胞并从选 出的大类中进一步区分所选大类亚型,可将不同的标记 结合到不同的单克隆抗体上。例如,可以使用单独或组 合的、含有分子、酶和染料(特别是荧光染料)的放射 成分作为这样的标记物。优选的是荧光染料,且此染料 的例子包括荧光素,异硫氰酸荧光素(FITC),异 硫氰酸四甲基若丹明(TRITC),藻红蛋白(PE 或RD),藻红蛋白-得克萨其红结合物和别藻蓝蛋白, 等等。
降低特异细胞的数量对于对照细胞来说是重要的, 通常,制备此对照细胞的方法包括:采集正常的、白血 球富集的、抗凝固的血样;将其中的红细胞(RBCs) 溶胞并洗涤样品以去除溶胞碎片或由任何其它适宜的方 法,例如US4,752,863中描述的方法除去红 细胞,使用与可剥离底物诸如玻璃、陶瓷或聚合物珠, 优选磁珠结合的单克隆抗体从样品中去除特异细胞类型; 并将去除的细胞重新加至可以表示疾病发展的不同阶段 的特定水平。然后将样品长期保藏,例如,根据US5, 059,518中描述的方法冻干样品(其方法引入本 文中作为参考),或通过其它适合的细胞保藏技术。除 了那些特异的与疾病相关的其数目已增加或降低的细胞, 或已加入那些特异的与疾病有关的细胞之外,由此生产 的对照细胞显示正常的白血球细胞谱。
给出以下实施例是作说明之用,而不应看作限定本 发明。
HIV患者的血液中表现出CD4(T4)细胞的 含量降低。由于CD4细胞在抵抗许多直接导致AID S患者死亡的继发性疾病中起着重要作用,进行CD4 数量测定可以指示HIV感染的程度和患者避免继发性 感染的能力。由于患者的血样分析是绝对必要的,因此 人们希望用于分析的对照细胞是非传染性的,这样便可 将任何疾病的偶然传播降至最低限度。 实施例1 制备用作AIDS对照细胞的CD4减少的
正常血细胞
将若干ACD(柠檬酸葡萄糖)或CPD(柠檬酸, 磷酸葡萄糖)抗凝固的、白细胞富集的、正常血集合物 在容器中合并,得到大量白细胞富集的血样。用0.8 3%(重量比)的氯化铵溶液将样品中的红细胞溶胞。 溶胞后,用Hepes-盐水-牛血清白蛋白溶液(H SB)将白血细胞洗涤几次。然后将白血细胞从最终洗 涤液中分离出来并置于含有作为保藏介质的等渗10% 海藻糖溶液的容器中。保留部分白血细胞备用。另外, 通过例如由US4,752,563描述的那些方法,以 及其它方法,将抗CD4单克隆抗体如T4(Coul ter Corporation,Hialeah)结 合到磁珠上。将抗CD4结合的磁珠加到洗涤的白细胞 样品中并混合30分钟。采用磁性装置例如手持磁分离 器或市售磁分离器将珠和结合于其上的细胞从容器中除 去。将留在容器中的细胞离心分离,去除上层的清液并 将细胞重悬浮于等渗海藻糖溶液中,最好是作为保藏介 质的等渗10%海藻糖溶液。然后将CD4减少的样品 与不同量的保留白细胞或者来自其它带已知数量CD4 细胞的样品中的正常、无红细胞的白细胞混合,制备含 不同数量CD4细胞的样品。例如:
1级CD4细胞:等体积的保留白细胞和CD4减 少的白细胞混合,得到在原正常采集的血样中有50% CD4细胞的样品。
2级CD4细胞:三个体积的保留白细胞和一个体 积CD4减少的白细胞混合,得到在原采集的血样中有 25%CD4细胞的样品。
3级CD4细胞:九个体积的保留白细胞和一个体 积CD4减少的白细胞混合,得到在原采集的血样中有 10%CD4细胞的样品。
图7和8以图表示按所述方法制备的CD4对照细 胞。图7描述当含正常CD4的样品用增加量的CD4 减少的血稀释时,阳性细胞百分率的变化。图8描述当 稀释度增加时,每立方毫米CD4阳性细胞绝对数量的 变化。
此外,采集其它的正常的ACD或CPD抗凝固的、 富集白细胞血集合物,将红血细胞溶胞且如本文前面所 述的方法洗涤白细胞。采集样品中存在的CD4细胞数 量可由使用荧光标记的T4单克隆抗体的流动血白细胞 计数法确定。然后将该采集含CD4的样品的等分物与 各种量的CD4减少的白细胞混合而制备具有不同浓度 的CD4细胞的对照细胞样品。 实施例2 制备CD10(CALLA)扩增的对照细 胞
采集大量的正常ACD或PCD抗凝固的、富集白 细胞的红血细胞集合物,并用0.83%(重量比)的 氯化铵溶液将红血细胞溶胞。溶胞后,用HSB洗涤白 细胞几次。然后将白细胞从最终洗涤液分离并置于含有 等渗10%海藻糖溶液的容器中作为保藏介质。另外使 用市售CALLA阳性,一种美国典型培养物保藏中心 (ATCC)的CALLA样品、或其它来源的细胞, 制备培养的CALLA(CD10阳性,普通急性淋巴 母细胞白血病抗原)阳性细胞。在这里使用的细胞来自 ATCC,保藏号CRL1596。然后将培养的CD 10+细胞以不同的量加入到各等份保藏溶液中的正常 白细胞中。 实施例3 冻干用作非传染疾病细胞对照的稳定正常细 胞
将由实施例1和2所示描述的方法制备的对照细胞 根据US5,059,518(其方法入本文作为参考) 冻干。具体地,将悬浮在等渗10%海藻糖溶液中的1、 2或3级CD4对照细胞或CALLA对照细胞悬浮于 300μl冻干的管形瓶中等渗的10%海藻糖溶液中, 盖上管形瓶并冷却至4℃,然后搅拌以保证将管形瓶置 于约-70℃的冷冻器中至少一小时使细胞分布均匀。 冷冻完之后,立刻将管形瓶置于冻干器中约15小时。 15小时结束后将冻干的管形瓶从冻干器中移出并贮藏 在温度为2-8℃的冰箱中。此对照细胞可贮藏6个月 或更长。向冻干管形瓶中加入去离子水或蒸馏水至30 0μl体积可重建冻干细胞。为在流动血细胞计数器口 进行对照检测,将再悬浮的重建细胞染色,或作标记成 记号,然后用标准流动血细胞计数方法分析。也可在其 它类型的测定或其它适合的诊断方法中使用再悬浮细胞。
图1、2和3(a)-(d)将正常细胞(图1) 与患者细胞(图3)以及根据本发明方法制备的对照细 胞(图2)相比。这些数字表明,使用对照细胞,该检 测手段能检测出可能存在于得病的患者血样中的异常C D10+和CD19+细胞。
图4、5和6(a)-(d),表示该检测手段能 检测出在AIDS患者中能见到的少量的CD4+细胞。 图4中四边形1表示正常血样中出现的CD4+细胞。 图5中,四边形1表示AIDS患者中见到的减少的C D4+细胞数量。图6中四边形1表示该仪器能检测由 本发明减少的对照细胞表示的减少的CD4+。
图4中的(b)、(c)、(d)分析数据分别如 表I、表II、表III所示:
表I
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 0 2 1562 44.6 0.0 0.2 y 7 63 23.9 3.7 11.6 2x 3 63 124 3.5 24.0 9.0 10.6 y 7 63 14.7 8.1 9.71 3x 0 2 689 19.7 0.0 0.2 y 0 6 1.0 1.8 4x 3 63 1126 32.2 26.6 6.4 8.26 y 0 6 0.8 1.6
表II 最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1 20 255 1231 35.2 108.3 24.6 4.44
表III 最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 31 255 1654 47.3 95.5 17.1 9.66
图5中的(a)-(d)分析数据分别如表IV-表 VII所示:
表IV
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 1 1 0 0.0 y 7 7 2x 0 0 1 0.0 y 0 0 3x 13 13 3 0.0 y 16 16 4x 3 3 4 0.0 y 16 16
表V
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 0.102 2.426 -245 4.9 0.192 0.140 y 2.103 1023. 20.99 9.44 24.4 2x 2.428 1023. 2 0.0 5.359 0.386 12.2 y 2.103 1023. 7.146 1.546 6.11 3x 0.102 2.426 1109 22.2 0.193 0.164 y 0.102 2.101 0.149 0.085 4x 2.428 1023. 3643 72.9 21.07 10.48 24.9 y 0.102 2.101 0.108 0.023
表VI
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 575.8 1023. 3553 23.5 814.0 58.9 y 29 57 42.8 1.8 3.74 2x 8.367 76.72 387 2.6 20.97 8.34 30.5 y 18 41 28.1 5.5 19.2 3x 13.66 15.75 0 0.0 y 0 0 4x 0.102 0.118 1 0.0 y 0 0
表VIII
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 0.102 2.101 -259 77.3 0.197 0.140 y 7.679 1023. 22.39 6.72 28.0 2x 2.103 1023. 76 22.7 18.73 13.96 32.2 y 7.679 1023. 18.73 6.01 29.1 3x 0.102 2.101 0 0.0 y 0.102 7.672 4x 2.103 1023. 0. 0.0 y 0.102 7.672
图6中的(b)-(d)分析数据如表VIII-表X所 示:
表VIII
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1x 0 3 175 5.0 0.1 0.5 y 8 63 24.9 7.5 3.49 2x 4 63 78 2.2 28.49 8.9 3.83 y 8 63 12.1 6.8 7.33 3x 0 3 1150 33.0 0.1 0.5 y 0 7 1.1 1.9 4x 4 63 2090 59.7 28.2 7.1 7.54 y 0 7 1.1 2.0
表IX
最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1 26 255 2130 60.9 115.9 26.1 5.41
表X 最小 最大 计数 百分率 平均 SD HPCV 1 34 249 231 6.6 90.3 35.3
本申请与1991年10月22日申请的美国专利 US5,059,518相关。本申请和US,5,0 59,518归共同的受让人,Coulter Co rporation,Hialeah,Florid a所有。
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