本发明提供了一套新颖独特的整合方法包括去除血浆蛋白,红 细胞裂解,加入免疫微球或免疫材料以去除白细胞,加入基于独特 的细胞分离介质而成的密度离心以从生物体液标本中分离循环稀 有细力包。由浓缩与富集构成的本方法能够快速i也乂人生物体液标本,如外周血中,富集循环稀有细胞,且回收率高。富集的细胞具有可 用于影像学分析的很好的细胞形态。同时,病人标本中的大部分白 细胞亦可被高效回收以应用于其它研究分析,例如基因谱的研究。 在本项发明中,任何特殊器材如细胞分离管或磁
铁均不需要。
本发明中,从人或动物收集的所述生物体液标本包括但并不局
限于以下来源:外周循环血,脐带血,尿液,精液,骨髓,
羊水, 脊髓及胸腔积液,腹水,痰液,处理过并/或匀浆化的人或动物组织, i咅养的人或动物细月包。
所述免疫孩i球由特异性识别白细胞标示物的抗体与微5求表面 进行共价或^一共价偶联而形成,所述微球的表面可经过或没有经过 化学处理以适于与
蛋白质相偶联,所述樣i球的直径介于10纳米-100 孩史米,即lOnm-100 pm,所述孩史3求包含或部分包含寸壬何一种下列成 份:
二氧化硅(silica), 右旋糖普 (dextran), 琼月旨糖(sepharose, agarose),或交联葡聚糖(sephadex)。用于制备所述免疫微球的微球 为》兹'1"生或非》兹寸生。
在本发明中,用于制备免疫樣"求的抗体特异性地识别下述4旦不 局限于这些白细胞表面标示物:CD3, CD31, CD34, CD45, CD50, CD69, CD84,或CD102等。制备免疫微^求过程中,或是识别这些 CD分子中的任意一种的抗体,或是识别这些CD分子中任意两种 或两种以上的抗体的组合与任何适宜偶联的固体表面进行共^介或 非共《介偶
耳关,例如直径介于IO纟内米到100樣吏米(10nm-100 jim)的》兹 性或非磁性微球。
本发明中,所述
免疫吸附剂是将任何经过或没有经过化学处理 的适宜结合蛋白的固体表面如石圭^皮璃片(silicon glass slide)与配体 (ligand)或特异的单克隆或多克隆抗体包括抗白细胞表面标示物如 CD45的抗体进行共价或非共价偶联而制备而成。本发明中,所述独特的细月包分离介质在20°C
温度下比重范围 介于1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3),这一特定范围内
述细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种或两种以上的
试剂 成 <分:聚乙烯p比p各火克包净皮的月交质二氧4匕石圭(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica); 多聚外唐 (polysucrose)力口;乏影酉交4内(sodium diatrizoate)或其衍生物;由蔗4唐和表氯醇《且成的非离子聚->物 (nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin); 或任何 一种含^f唐的溶液,如右旋糖苷或蔗^f唐(sucrose);石典化小分子4匕合物
(如甲泛影酰胺(metrizamide));或4壬意蛋白溶液,所述细月包分 离介质的比重可用4壬4可渗透压介于280-320mOsm/kg H20, pH 6.8-7.8的緩沖液在20。C温度下调制在1.07256-1.07638克/毫升
(gr/ml or gr/cm3)范围内。所述免疫微球的比重高于所述细胞分离 介质的比重。基于所述细胞分离介质的离心在普通商品化的离心管 内进行。
本发明的用于从生物体液中富集稀有纟田月包的方法还包括,将通 过基于所述细胞分离介质的离心得到的沉积细胞以上的所有上清 液全部收集。
本发明的用于从生物体液中富集稀有细胞的方法,其中,所述 裂解红细月包以去除红细胞的步4聚在所述加入免疫孩U求或免疫吸附 剂进4亍孵育的步骤之前、之后或者同时进行。如果本发明的方法不 包括加入红细胞裂解液进行红细胞裂解的步骤,则可以通过长时间 的离心来分离去除红细月包。
本发明方法富集的循环3希有细力包可以应用于以下方面:通过免 疫荧光或免疫组化加普通光学显樣i镜或可见光扫描仪对所述富集 的循环稀有细胞的计数;PCR;流式细胞仪4企测;基因表达谱分析; 蛋白表达谱分析;酶学测定;肿瘤病人体外
化疗药物的筛选;有关肿瘤病人化疗方案的制定与指导化疗的进行;对肿瘤病人体内的肿 瘤细胞使用化疗药物及/或一种或多种
治疗肿瘤抗体效果的评估;体 内或体外培养富集的稀有细胞;在富集的稀有细胞上鉴定及确认现 有的或新发现的肿瘤细胞表面或细胞内的标示物;富集的稀有细胞 应用于临床治疗;监测肿瘤病人的肿瘤复发;开发新的治疗肺瘤的 药物;作为肿瘤i貪断的辅助手l殳;健康人群体才全;以及基于循环内 皮细力包的有关心脏病的it断与治疗。
但来源于
荧光染料自身负电荷引起的与靶细胞的非特异结合这一 主要缺点却无可避免。此一缺点给人们在区分真
假阳性染色信号的 过程中带来了极大的困扰。本发明提供了 一整套优化过的新颖的基 于免疫组化的多色染色方法,从而能够克服免疫荧光带来的非特异
下或者基于显微镜原理的扫描仪下进行。此方法已被证明为一种高 特异性,快速,简单,低成本的技术手段,而且不再需要任何荧光 染料及昂贵的荧光显微镜。
本发明对富集的稀有细胞进行检测的方法还可以包括染色体 荧光原位杂交。
所述双色染色是指对所述稀有细胞的标示物如一种或多种
角 蛋白,以及白细月包的标示物如CD45分别进4亍染色,所述稀有细月包 和所述白细胞被染成不同的
颜色;所述三色染色是指在所述双色染 色的
基础上对所述稀有纟田月包的细胞核进行另外一种颜色的染色,或 对所述稀有细力包的其他标示物进4于第三种颜色的染色,所述染色包 括将特异性识别所述稀有细胞标示物的一抗单克隆或多克隆抗体
以及特异性识别所述白细胞的一抗单克隆或多克隆抗体与所述富 集的稀有细胞进行孵育。所述特异性识别所述稀有细月包标示物的 一 抗单克隆或多克隆 抗体以及所述特异性识别所述白细月包标示物的 一抗单克隆或多克 隆抗体分别与不同的小分子相共价偶联,所述小分子选自包括以下
物质的《且:罗丹明(rhodamine),生物素(biotin ),异羟基洋i也黄 戒(digoxigenin ) , Alexa Fluor系歹0分子,FITC,及Texas Red, <旦 不限于这些物质。
在本发明的某些具体实施方式中,可识别角蛋白8, 18, 19或 广"i普角蛋白中4壬意一种或任意两种或两种以上的一抗单克隆或多 克隆抗体被用于识别从具有上皮来源的任何实体肿瘤脱落入血的 循环肿瘤细胞。另外一林可识别白细胞表面标志CD45的单克隆或 多克隆抗体用于白细胞染色以区分假阳性。
所述染色包括加入可特异性识别所述小分子的与不同的酶相 偶联的二抗单克隆或多克隆抗体。所述偶联的酶是过氧化物酶,或 石咸性
磷酸酶,所述石威性磷酸酶被用于4企测所富集的稀有细胞。
可以在
载玻片上或在溶液中对用本发明的方法富集的稀有细 胞进行染色。
在本发明的一些具体实施方式中,将抗所述稀有细胞的标示物 与抗白细力包的标示物的 一抗抗体4安任意顺序与所述富集的稀有细 胞一起进行孵育,或将两种抗体制备成
混合液同时与所述富集的稀 有细胞进4于孵育。
本发明中,所述稀有细胞或其它细胞既可直接—皮共价或非共价 偶耳关于任意适宜固体表面的抗体所捕获,也可通过本发明的富集方 法所富集。组化的染色及可见光下的观察,所述免疫荧光用于4全测富集的循环 稀有细胞,而所述基于免疫组化的染色则用于白细胞染色。
在本发明的某个具体实施方式中,识别角蛋白的一抗抗体被标
记上荧光分子,而抗CD45的一抗则被标记上小分子以用于过氧化 物酶催化的基于免疫组化的可见光颜色反应。
本发明独特的富集与染色两种方法的结合可以才及大地促进才企 测血中稀有细胞如循环肺瘤细胞的普及应用。该新颖独特的富集与 染色方法已净皮i正明成本^f氐,且能快速高效及高特异性地富集并定量 才企测血中的稀有细月包。
本发明还涉及一种对富集的稀有细胞进行检测的方法,包括进 行染色体荧光原位杂交,以及利用荧光或普通
光学显微镜或基于显 樣史镜原理的扫描仪进行观察鉴定。
本发明的目的还在于一种用于乂人生物体液中富集稀有细力包的
试剂盒,包括红细胞裂解液,免疫微球或者免疫吸附剂,独特的细 胞分离介质。该试剂盒还包括
说明书,用于说明试剂盒的使用。
本发明还涉及一种用于检测富集的稀有细胞的试剂盒,包括特 异性识别所述稀有细力包标示物的共^f介偶4关了小分子的一抗单克隆 或多克隆抗体,可识别所述小分子的偶联了酶的二抗单克隆或多克 隆4元体以及所述酶的相应底物。该试剂盒还可以包4舌免疫焚光染剩-标记的抗体。该试剂盒还可以包括用于染色体荧光原位杂交的探针 及试剂。该试剂盒还包括说明书,用于说明试剂盒的使用。
本发明还涉及 一 种用于从生物体液样本中富集循环稀有细胞 的自动化系统,包括用于自动去除血浆蛋白的离心^L,用于自动加入红细胞裂解液的装置,用于自动加入免疫孩i球或免疫吸附剂的装 置,用于自动加入一种细胞分离介质的装置,密度离心装置以及自 动收集上清的装置。
本发明还涉及一种对富集的稀有细胞进行检测的自动化系统, 包括基于免疫组化的双色或多色染色的装置,普通光学显微镜或基
于显孩i镜原理的自动扫描装置。所述染色装置包括自动加样器,孵 育器和自动清洗装置。
名词解释
稀有细胞:其在采集的体液样本内的所有有核细胞中的占有比 例小于0.1%。它们包括循环肺瘤细胞,循环内皮细胞,肺瘤干细胞, 千细力包,及某些免疫细"包等。
循环稀有细胞:循环稀有细胞是指存在于体液中的稀有细胞。
生物体'液4示本:其为从人或动物体中收集的液体,它们包括4旦 并不局限于以下来源:外周循环血,脐带血,尿液,精液,骨髓, 羊水,脊髓及胸腔积液,腹水,痰液,处理过的人或动物组织,培 养的人或动物细月包。
红细胞裂解(hemolysis):在低渗条件下裂解红细胞。
免疫组化(IHC):通过偶联于抗体上的酶与底物的反应显现光 学显微镜下可观察到的颜色。
免疫焚光:将抗体标i己荧光分子
附图说明
图1是将
乳腺癌病人外周血中的循环肿瘤细胞经本发明方法富集后, 再经本发明的基于免疫组化的方法进行三色染色后获得的图像。
图2是用染色体荧光原位杂交方法检测循环肿瘤细胞得到的图像。 具体实施方式
本发明首次将四种互不关联的单一实验手段(即去除血浆蛋 白,裂解红细胞,抗体包被的免疫微球及基于特殊细胞分离介质的 密度离心)进行了改进与优化组合从而提供了一套新颖独特的可快 速高效地从外周血或其它体液样本中富集循环稀有细胞的方法。富 集后的循环稀有细胞不需经免疫荧光染色,而是用本发明中由免疫 组化优化衍生而成的技术进行双色或多色染色,并可借助普通光学 显微镜或扫描仪完成对染色的稀有细胞的观察,
图像采集与分析处 理。其中稀有细胞包括循环肺瘤细胞,循环内皮细胞,肺瘤干细胞,
干细胞,及某些免疫细胞,其中所述循环肿瘤细胞来自于具有或不 具有上皮来源的任何实体瘤,如黑色素瘤。
1.用于富集血中循环稀有细胞包括循环肿瘤细胞及循环内皮 细胞的方法与试剂
分离任意所需的稀有细胞。体液标本包括但并不局限于以下来源: 外周循环血,脐带学,尿液,精液,骨髓,羊水,脊髓及胸腔积液, 腹水,痰液,处理过的人或动物组织,培养的人或动物细月包。
在本发明的某些具体实施方式中,血液#^欠集于4壬意一种商品 4匕的
采血管中(如BD, New Jersey, USA; Cyto-Chex, Iowa, USA)。这些采血管含有任何一种下述抗凝剂:枸橼酸
葡萄糖(ACD),乙二 胺四乙酸(EDTA),肝素(heparin)等。标本应在72小时之内进 行处理。
在本发明的其它某些具体实施方式中,本方法将去除血浆蛋 白,裂解红细胞,加入抗体包被的免疫磁珠,及基于特殊细月包分离 介质的密度离心进行了组合优化从而可有效地去除血浆蛋白,红细 胞和白细胞。作为替代手段,富集手段也可简化为由两个步骤组成, 即免疫微球加红细胞裂解;或免疫微球加基于特殊细胞分离介质的 密度离心。不同于其它常规的用密度离心法分离细胞后只能费时费 力且非精确地收集不同比重的分界相溶液,本发明中沉积细胞以上 的所有上清液全部纟皮4欠集。
在本发明的实施方式中,免疫微球的制备是将单克隆或多克隆 抗体与任何经过或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面
(例如直径介于10 nm-lOO iLim的孩O求)进^f亍共《介或非共《介偶耳关。 这些樣0求包含或部分包含任4可一种下列成<分:二氧4匕石圭(silica),右 i走津唐香(dextran),琼月旨jf唐(sepharose, agarose),或交联葡聚并唐 (sephadex)。这些樣U求可以是》兹性的,也可为非》兹性的。
在本发明的某些实施方式中,免疫微球可由免疫吸附剂所替 代。免疫吸附剂的制备是将特异的单克隆或多克隆抗体与任何经过 或没有经过化学处理的适宜结合蛋白的固体表面进4亍共^f介或非共 价偶联,如硅玻璃片(silicon glass slide).
在本发明的一些实施方式中,用于密度离心的特殊细胞分离介 质具有特定范围的比重,即1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3),在此比重范围内的细胞分离介质可用于分离所需的细胞。 本项发明中的细胞分离介质包含下列任何一种或任意两种以上的 i式剂成^f分:聚乙火希p比p各》克包净皮的月交质二氧4匕石圭(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica); 多聚才唐(polysucrose)力口泛"f》酸4内或其书f生 4勿;由嚴并唐和表氯醇纟且成的非离子
聚合物(nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin); ^f壬"f可一种含4唐的〉容液,:i口 右旋糖普或
蔗糖(sucrose);碘化小分子化合物(如曱泛影酰胺 (metrizamide));和/或任意蛋白溶液。细月包分离介质的比重可用 4壬4可渗透压介于280-320 mOsm/kg H20, pH 6.8-7.8的乡爰冲液调制而 成。
免疫微球的比重高于细胞分离介质的比重。 在本发明的实施方法中,血浆蛋白可用离心方法去除。
密度离心相结合以快速高效地去除红细胞。
本发明中首次使用免疫微球与基于特殊细胞分离介质的密度 离心相结合以快速高效地去除白细胞。作为替代手l殳,本发明中的 去除白细胞亦可简化为只 <吏用免疫樣"求或免疫吸附剂。
在本发明的具体实施方式中,用于制备免疫微球或免疫吸附剂 的抗体既可以是特异'l"生地识别4壬意下述白细胞表面标示物的 一 种 抗体,或是识别任意两种或两种以上下述白细胞表面标示物的抗 体:CD3, CD31, CD34, CD45, CD50, CD69, CD84,或CD102等。
在本发明的具体实施方式中,红细胞与白细胞的去除可以以任 意适宜的顺序进行。它们既可同时去除,亦可红细胞或白细胞先被 去除。富集的循环稀有细胞可用于 一 系列后续分析,包括免疫荧光分
析,基于免疫组化的染色分析,PCR,体外或体内i咅养富集的循环 稀有细胞等。
2.检测富集的循环稀有细胞包括循环肿瘤细胞
目前所有发表的有关检测循环肿瘤细胞的方法都基于免疫荧 光染色。然而免疫荧光染色不可避免的主要缺点,即人们熟之为"鬼 影,,的非特异性染色却给人们在判断真假阳性细胞的过程中带来了 极大的困扰。本发明提供了一整套优化后的基于免疫组化的多色染
色方法。通过本发明试 -验手>a富集的循环《希有细月包经此方法染色 后,可极大地消除非特异染色。此染色方法与普通光学显微镜相结
在本发明的某一具体实施方式中,经本方法富集的^盾环^希有细
月包用2%多聚甲
醛(paraformaldehyde)固定。
在本发明的其它具体实施方式中,可识别角蛋白8, 18, 19或 广i普角蛋白中4壬意一种或4壬意两种或两种以上的一#元单克隆或多 克隆抗体^皮用于识别循环肿瘤细胞,这些血中的循环肿瘤细月包脱落 于具有上皮来源的任何实体瘤。另外一4朱可识别白细月包表面标志 CD45的单克隆或多克隆抗体净皮用于区分作i阳性。
在本发明的其它一些具体实施方式中,抗角蛋白或CD45的一 抗单克隆或多克隆抗体分别与下述任意一种小分子进4于共〗介偶耳关, 它们包括但不局限于:罗丹明(rhodamine),生物素(biotin),异 羟基洋;也黄戒(digoxigenin ) , Alexa Fluor系列分子,FITC,及Texas Red等。在本发明的其它具体实施方式中,可特异识别标记在一抗抗体 上的小分子的二抗单克隆或多克隆抗体分别与石威性磷酸酶,过氧化 物酶或其它酶相共价偶联。
在本发明的某个具体实施方式中,作为另外一种选^^的^^4戈方 法,免疫荧光可与经可见光识别的免疫组化法相结合。在此方法中, 识别角蛋白的一抗单克隆或多克隆抗体被标记上<壬<可颜色的荧光
分子,长口 Alexa Fluor系列,Quantum dot, FITC等,而4元CD45的一 抗^皮标记上上述小分子以用于过氧化物酶催化的免疫组化可见光
示物CD45的非特异染色。
自动染色装置包括自动加样装置,孵育装置和自动清洗装置。
实施例实施例l.从乳腺癌病AJf周血中富集循环肿瘤细胞
采集5 ml人外周血于含有
乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的采 血管中(BD, New Jersey, USA)。离心血样(700 x g, 10分4中)后, 可以4吏用吸液管或者自动吸液装置来吸除上清以去掉血浆蛋白。将 离心后得到的沉淀物重悬于30毫升红细胞裂解液(BD Pharmingen, California, USA)后,孵育20分钟。进行标本离心(700 x g, 10分钟) 以便分离出在上清液中的被裂解的红细胞碎片。去掉上清后,将沉 淀物(即沉积细胞)重悬于5毫升
磷酸盐緩沖液(pH7.4)。向其中 加入0.5毫升包^皮有抗白细月包表面
抗原例如CD45的单克隆4元体的 ^兹i朱后(Invitrogen, California, USA),室温孵育30分4中。将所有反应 液加到普通50毫升离心管内的5毫升细胞分离介质的顶层,离心 400 xg, 10分4中。jR集所有上清液。上清液离心900xg, 10分4中。 离心后得到的沉积细胞重悬于磷酸盐緩冲液后可做进一步分4斤。该实施例中的细胞分离介质是这样制备的:5.7%多聚糖 (polysucrose)与9%泛影酸钠(Sigma, Missouri, UDA)的混合物在高 ^T度凄t字密度4义(型号DMA 4500, Anton-Paar, Virginia, USA)于 20。C监测下,用PBS将其密度调至成1.07256-1.07638克/毫升 (gr/ml or gr/cm3)。
实施例2.三色法染色从乳腺癌病"卜周血中富集的循环肿瘤
细胞
富集的循环肺瘤细胞置于载玻片上,用由磷酸盐緩冲液配制而 成的2%多聚甲醛(paraformaldehyde)室温固定2小时后,用石粦酸 盐IC冲液沖洗3遍。细月包与含生物素(Pierce, Illinois, USA)标i己的4元 角蛋白8+18+19单克隆抗体(Abcam, UK, 1 jug/ml)及罗丹明(Pierce, Illinois, USA)标记的抗CD45单克隆抗体(Abeam, UK, 1 pg/ml)混 合液(由磷酸盐緩沖液稀释而成)在室温孵育30分钟。载玻片用 磷酸盐緩沖液沖洗3遍后,与含石咸性磷酸酶标记的抗生物素单抗 (Sigma, Missouri, USA, 1吗/ml)及过氧化物酶(Pierce, Illinois, USA) 标记的抗罗丹明单抗(Abcam, UK, 1 )ag/ml)混合液(由石粦酸盐乡爰沖液 稀释而成)室温孵育30分钟。载玻片用磷酸盐緩冲液沖洗3遍后, 用Vector Laboraories (California, USA)出产的红色速染细月包核i式剂 盒,石成性磷酸酶及过氧化物酶底物试剂盒进行显色反应。染色结果 见附图。
参见附图1,通过本发明中的实验方法对乳腺癌病人外周血中 的循环肺瘤细胞进行富集后,再用基于免疫组化的三色染色法进行 染色。图中所示为普通光学显樣"竟下观察到的循环肿瘤细月包。大细 胞:乳腺癌细胞(tumor cell),其角蛋白染成蓝色,细胞核为粉红色; 小细胞:白细胞(WBC),其表面CD45被染成棕色。实施例3 .染色体荧光原位杂交法检测循环肿瘤细胞
将富集的肺瘤细胞作为标本置于载玻片上。染色后的标本用2 0毫克/毫升的RNA酶处理1小日于后,使用SSC緩冲液漂洗玻 片。标本用无水
乙醇脱水IO分钟后,加热到70。C持续5分钟变性。 标本再用无水乙醇脱水10分钟,并于45°C与纟笨针杂交孵育过4支。 标本用S S C》爰冲液洗涤后,用荧光显微4彭現察。该标本可以是经 实例2中的方法染色后的富集胂瘤细胞,进^f亍染色体荧光原^立杂交 的目的是进一步确定基于免疫组化的三色染色4企测肿瘤细月包的真 实性。为了便于快速诊断,标本亦可不经抗体染色,而直4妄进4亍染 色体荧光原位杂交。染色体荧光原位杂交的结果见附图2。细月包的 染色体显示为红色和绿色。从红色或绿色的H目可以判断是否染色 体发生变异,是否为肿瘤细胞。
实施例4 .检测循环肿瘤细胞应用于临床快速评估抗肿瘤化疗 药物的疗^U5Ut瘤Jj良的监测
目前临床上评估化疗药物的疗效的常用方法是每3个月为病人 做一次CT检查。如此长的时间间隔对与那些化疗效果不佳的病人 所造成的伤害是致命性的。而每1-2周进行的检测循环肿瘤细胞则 在化疗开始2-4周后即可为医生才是供准确的评估lt据。循环肿瘤细 胞数目的降低意味着化疗药物的有效性。反之,如果循环肿瘤细胞 数目没有明显的改变甚至增高,则意味着病人需接受不同的化疗药 物治疗。
肿瘤复发意p未着原发灶或转移灶的肿瘤又进入了活^夭期。此时 病人血中的循环肺瘤纟田月包数目会明显升高。对经过治疗后出院的肿 瘤病人进行长期的循环胂瘤细胞的
跟踪观察(一般为每3个月检查 一次),可以为早期判断肿瘤是否复发提供非常用力的证据。本领域的技术人员应当明了 ,上述优选实施例只是对本发明的 具体说明,并不构成对本发明的限制。根据需要可以对其进行多种 改进,组合,亚组合以及变换,所有的改进,组合,亚组合、变换 以及等效替换都落入在所附的
权利要求的范围内。