一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法
专利汇可以提供一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种脐带血单个核细胞参与的免疫增强型CAPRI细胞制备方法，具体包括如下制备步骤：(1)获取与患者同血型的脐带血，分离并纯化脐带血单个核细胞；(2)获取患者外周血，分离并纯化 外周血单个核细胞 (PBMC)；(3)脐带血 血浆 制备血清；(4)患者PBMC和脐带血单个核细胞链式激活；(5)CAPRI细胞扩大增殖；(6)CAPRI细胞分次 收获 。本发明采用双蛋白包被培养瓶技术及分次收获方法，提高了CAPRI细胞数目以及 肿瘤 杀伤能 力 。本发明所提供的CAPRI细胞培养技术解决了 现有技术 中由于患者自身状况较差或者寻找不到半合子供体等因素导致的CAPRI细胞培养无法采集到患者足够外周血的问题。，下面是一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法专利的具体信息内容。
1.一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法，具体步骤包括：(1)获取与受试者同血型的脐带血，分离并纯化脐带血单个核细胞(PBMC)；(2)获取受试者外周血，分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(3)脐带血血清制备；(4)受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养；(5)CAPRI细胞扩大增殖；(6) CAPRI细胞分次收获。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脐带血PBMC的分离纯化步骤为：采集脐带血约100 ml 左右，分装至两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，收集上清血浆约60ml，并在每支离心管中分别加入20-35ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml 密度为1.075±0.001g/ml Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500 rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层富含造血干细胞层，然后继续用生理盐水1800-2000 rpm离心5-10 min洗涤两次，弃去上清，即获得脐带血单个核细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于：所述从受试者外周血分离并纯化PBMC的步骤为：抽取受试者外周血50-100 ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并将外周血分装至两支50ml离心管中，2000-2500 rpm离心20-30min，弃上清，并在每支离心管中分别加入10-25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有6-8ml 密度为1.077± 0.001g/ml Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500 rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层单个核细胞层，然后继续用生理盐水1600-
1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述脐带血血清制备步骤为：
将从脐带血分离的血浆分装两支50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞和血小板，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述受试者外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞链式激活共培养步骤为：将抗CD3单克隆抗体和RetroNectin包被于
75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗1次，再用无血清培养基冲洗1次，然后取受试者外周血PBMC，使其重悬于24ml无血清细胞培养液RPMI 1640中，混匀分装到2个预先包被抗CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，2.5-3.5h后加入浓度为800-1200U/ml重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)、800-1200U/ml重组人干扰素-γ (rhIFN-γ)、150-300U/ml重组人白细胞介素-18 (rhIL-18)，继续培养
2.5-3.5小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养48小时。
6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于：所述用于包被细胞培养瓶的PBS缓冲液中抗CD3单克隆抗体的浓度为1μg/ml，RetroNectin的浓度为12.5ug/ml。
7.如权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞扩大增殖步骤为：收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，生理盐水洗涤一次，去上清，每支50ml离心管中加入25ml无血清培养液重悬细胞，细胞计数后，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入800-1200U/ml rhIL-2、800-1200U/ml rhIFN-γ、150-300U/ml rhIL-18，将细胞悬液分装于75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为400-600U/ml rhIL-2、800-1200U/ml rhIFN-γ、150-
300U/ml rhIL-18。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞分次收获步骤为：CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；将收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，1800-2000rpm离心5-10min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，1600-1800rpm离心5-10min，生理盐水洗涤两次，弃去上清后加入15-
25ml生理盐水，并加入2-3ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液；第六天收获培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；第七天收获培养悬液的1/2，余1/2继续扩大培养；第八天收获全部培养悬液。
一种免疫增强型CAPRI细胞制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
图3：受试者来源PMBC与脐带血单个核细胞共培养3h后10×20倍镜下图
图4：CAPRI细胞扩增后24h后10×20倍镜下图
图5：CAPRI细胞扩增后48h后10×20倍镜下图
图6：CAPRI细胞扩增后72h后10×20倍镜下图
图7：传统方法制备的CAPRI细胞免疫表型的流式细胞分析图
图8：本发明方法制备的CAPRI细胞免疫表型的流式细胞分析图
具体实施方式
2000rpm离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；向已吸取上清血浆的50ml离心管中每支加30ml生理盐水，小心混匀；取12支15ml离心管，每支加入7ml 医用级人淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入分离液液面上，每支离心管加8ml左右混合液；以2500转/分离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：生理盐水层，第二层：为环状乳白色单个核细胞层，第三层：为透明医用级分离液层，第四层：为粒细胞和红细胞层。用
3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，2000转/分离心5分钟，弃去上清留沉淀重新悬起。重复洗涤2次既得所需外周血单个核细胞。将分离的一半单个核细胞用培养液（加10%自体血清）调整细胞浓度2×106/ml左右，加入到抗CD3单抗包被的培养瓶中。在37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养3小时后，调整IL-2浓度为
200单位/ml，继续培养3小时后加入另一半淋巴细胞，混匀后继续培养16小时，然后吸取收集培养的细胞，离心清洗两次后，悬浮培养在培养液中，调整IL-2浓度为200单位/ml，继续培养72小时后收获CAPRI细胞，手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值，CAPRI细胞数量3.53±0.27×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达，如图7所示。
0.001g/mlFicoll-Hypaque 淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入离心管液面上，以
2500rpm离心20分钟；用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，以2000rpm离心5分钟，弃去上清留沉淀用生理盐水重新悬起，重复洗涤2次既得所需患者外周血单个核细胞（PBMC）；将分离的患者PBMC用无血清培养液调整细胞浓度2×106左右，加入到CD3抗体(终浓度1ug/ml)和Retronectin-T100B(终浓度为12.5ug/ml)包被的细胞培养瓶中；在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养3小时后，加入浓度为1000U/ml重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)、1000U/ml重组人干扰素-γ (rhIFN-γ)、200U/ml重组人白细胞介素-18 (rhIL-18)，继续培养3小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基
24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养16小时。收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，
2000rpm离心5min洗涤一次，去上清，每支50ml离心管用25ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用加有10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×
1ml，然后加入1000U/ml rhIL-2、1000U/ml rhIFN-γ、200U/ml rhIL-18，将细胞悬液分装于175cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为500U/ml rhIL-2、500U/ml rhIFN-γ、
100U/ml rhIL-18。CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获为培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养。收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，2000rpm离心5min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清后加入15ml生理盐水，加
2ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液。
第六天收获为培养悬液的1/3，余2/3继续扩大培养；第七天收获为培养悬液的1/2，余1/2继续扩大培养；第八天收获全部培养悬液。四次收获前手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值。采用脐带血单个核细胞参与的CAPRI细胞培养总数为15.16±0.34×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达，如图8所示。
30ml生理盐水，小心混匀得混合液；取6支15ml离心管，每支加入7ml密度为1.077±0.001g/mlFicoll-Hypaque 淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入离心管液面上，以2500rpm离心20分钟；用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，2000rpm离心5分钟，弃去上清留沉淀用生理盐水重新悬起，重复洗涤2次既得所需患者外周血单个核细胞（PBMC）；将分离的患者PBMC用无血清培养液调整细胞浓度2×106左右，加入到CD3抗体(终浓度1ug/ml)和RetroNectin (终浓度为12.5ug/ml)包被的细胞培养瓶中；在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养3小时后，加入浓度为1000U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、1000U/ml重组人干扰素-γ（ rhIFN-γ）、200U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将脐带血来源的PBMC用无血清培养基24ml重悬，混匀后平均加到以上2个培养瓶中继续培养16小时。收集细胞悬液到两支50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，生理盐水冲洗两次后收集到上述两支50ml离心管中，2000rpm离心5min洗涤一次，去上清，每支50ml离心管用25ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用加有
10%脐带血血清的培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入1000U/ml rhIL-2、1000U/ml rhIFN-γ、200U/ml rhIL-18，将细胞悬液分装于175cm2的培养瓶，置于
37℃、5%浓度CO2培养箱中培养48小时，取样送质量控制检测后，倍量扩增，扩增所用无血清培养液细胞因子浓度为500U/ml rhIL-2、500U/ml rhIFN-γ、100U/ml rhIL-18。CAPRI细胞在培养第5天开始收获，首次收获为培养悬液的1/3，余2/3继续倍增换液培养。收获的细胞悬液收集到50ml离心管中，2000rpm离心5min，去上清，离心管底部CAPRI细胞用生理盐水重悬，2000rpm离心5min洗涤两次，弃去上清后加入15ml生理盐水，加2ml人血白蛋白，用吸管吹打充分后，用注射器抽注到100ml生理盐水中获得CAPRI细胞液。第六天收获为培养悬液的1/3，余2/3继续倍增换液培养；第七天收获为培养悬液的1/2，余1/2继续倍增换液培养；
第八天收获全部培养悬液。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| NK细胞培养基、培养方法及二者的应用 | 2020-05-17 | 615 |
| 从成人外周血中自动化分离免疫细胞并提取PRP的方法 | 2020-05-23 | 266 |
| 利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法 | 2020-05-16 | 197 |
| 人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型及其制备方法 | 2020-05-20 | 861 |
| 厌氧血液储存和病原体失活方法 | 2020-05-24 | 231 |
| 羟基苯并吡喃酮类化合物在制备治疗白血病药物中的应用 | 2020-05-14 | 778 |
| 葛根黄酮抗辐射抗疲劳耐缺氧和对心脏的保护作用 | 2020-05-26 | 95 |
| 血液测试鉴别疾病使用的保藏非传染性对照细胞 | 2020-05-25 | 822 |
| 对中性白细胞特异的单克隆抗体 | 2020-05-13 | 260 |
| 一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法 | 2020-05-20 | 346 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
