一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途
阅读：250发布：2020-07-16
专利汇可以提供一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种兼容免疫 荧光 分析的细胞化学 染色 方法及其用途。本发明还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织来源 肿瘤 细胞的方法，其中采用兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法。本发明所述鉴定方法可从少量人体外周血样本分离出的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。，下面是一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途专利的具体信息内容。
1.一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，其特征在于与常 规苏木素染色相比，所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素 -伊红染色方法中苏木素浓度的40％-50％，同时，染色时间是现有苏木 素伊红染色方法时间的50％-67％
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法采用组成为 1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙二醇、 2％冰醋酸的苏木素染液对样本染色40秒-1分钟。
3.一种有核细胞的化学染色方法，其适于对细胞进行进一步的细 胞免疫荧光分析，包括步骤：
1)将细胞用40微升组成为137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4， 2mM KH2PO4，pH7.4的1×PBS溶液重悬后均匀滴加在载玻片上，室温 放置至溶液刚刚挥发时为止；
2)95％乙醇固定15分钟；
3)蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2分钟；
4)用权利要求1所述方法染色1分钟；
5)自来水浸泡约10分钟，洗去多余染液后再用蒸馏水洗涤一遍；
6)95％乙醇脱水5秒钟后再以0.5％伊红染液染色4分钟；
7)70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％乙醇 再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5分钟， 用中性树胶封片。
4.权利要求1或3所述的方法，其中所述有核细胞选自胚胎时期 内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和肿瘤细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞选自来自于如下类型上 皮来源肿瘤的细胞：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、 阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、 睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌，以及体外 培养的细胞系COS-7细胞、CHO细胞、NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa 细胞。
6.一种从人体外周血样本分离出的有核细胞中鉴定上皮组织来源 肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
1)细胞滴片制备及染色：针对有核细胞样本经细胞滴片、固定后 进行权利要求1所述的兼容免疫荧光分析的细胞化学染色；
2)细胞形态学分析：经光学显微镜镜检，判定属于典型上皮组织 来源肿瘤细胞的个数；对无法判定的可疑细胞，记录细胞所在位置；
3)细胞表面标志分析：对步骤2)中获得的可疑细胞进行免疫荧光 染色，判定其中属于上皮组织来源肿瘤细胞的个数，对无法判定的可疑 细胞，记录细胞所在位置。
7.权利要求6所述的方法，其中还包括：
4)染色体倍体分析：根据所测样本的肿瘤类型，采用选自1～3个 针对所述上皮组织来源肿瘤之特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染 色体计数探针，经荧光基团标记后，与步骤3)中的可疑细胞DNA原位 杂交，荧光显微镜下观察步骤3)中所述可疑细胞的特异染色体拷贝数， 判定属于上皮组织来源肿瘤细胞的个数；
8.权利要求6所述的方法，其中所述兼容免疫荧光分析的细胞化学 染色与常规苏木素染色相比，所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现 有苏木素-伊红染色方法中苏木素浓度的40％-50％，同时，染色时间与 现有苏木素-伊红染色方法相比也缩短了50％-67％
9.权利要求8所述的方法，其特征在于所述兼容免疫荧光分析的 细胞化学染色采用组成为1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素、50mM硫酸铝、 1mM碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸的苏木素染液对样本染色40秒- 1分钟。
10.权利要求6所述的方法，其特征在于步骤3)所述细胞表面标 志分析采用量子点标记抗体，对获自步骤2)中待鉴定的可疑细胞进行 免疫荧光染色。
11.权利要求10所述的方法，其中采用用量子点分别标记两种所 述上皮来源肿瘤代表性的抗上皮细胞表面抗原和抗肿瘤相关抗原抗体 以及一种抗白细胞表面抗原抗体。
12.权利要求6所述的方法，其中所述上皮组织来源肿瘤细胞的来 源选自唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、 肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、阴道癌、宫 颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、 肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌。
技术领域
本发明涉及一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用 途。本发明还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞 的方法，其中采用兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法。本发明所 述鉴定方法可从少量人体外周血样本分离出的有核细胞中简单、快捷、 准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。
背景技术
目前常用的细胞化学染色技术的主要方法包括：瑞氏染色、姬姆 匹染色、瑞氏-姬姆萨复合染色、巴氏染色和苏木素伊红染色，相关染 色技术概述如下：
瑞氏染色：瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性， 后者为酸性，细胞核染色质与强碱性的组蛋白、精蛋白等，形成核蛋 白，这种强碱物质与瑞氏酸性染料伊红有亲和力，故染成红色；但核 蛋白中还有少量的弱酸性蛋白和氨基酸，它又与瑞氏染料中的美蓝起 作用，只因其量太少，而不显蓝色，故细胞核呈紫红色。
姬姆萨染色：染料主要为伊红、美蓝两种成分，染色原理与瑞氏 染色相同。
瑞氏-姬姆萨复合染色：由于上述两种染色原理基本相同，混合染 色法的优点是，瑞氏染液对胞浆着色好，姬姆萨染液则对核着色好， 两法合并，可以兼得两者的优点。因此在细胞学的检查中，常用两者 进行复合染色。
巴氏染色：巴氏阴道及痰液等脱落细胞学检查的一种主要染色方 法。苏木素对细胞核着色，其他染料可与细胞浆中不同的化学成分结 合而使其着色。涂片经巴氏染色后，细胞核结构清晰，分色明显，透 明度好，胞浆着色艳丽。缺点是试剂种类很多，染色手续繁杂，时间 长，不宜涂厚片等。
苏木素伊红染色：原理与巴氏染色法基本相同。适合黏液及细胞 较多，较厚的涂片和切片观察组织层次。
以上几种细胞化学的染色方法大都强调对细胞核的染色，一旦对 细胞进行染色，将无法进行后续的细胞免疫荧光和染色体倍体分析。
为克服现有细胞染色技术的上述缺陷，本发明人采用了一种能够 适于进一步进行免疫荧光分析的细胞化学染色方法，即兼容免疫荧光 分析的细胞化学染色方法。所述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方 法，是一种改进的苏木素细胞染色方法在采用苏木素对细胞核的染色 同时，不影响后续的细胞表面标志物的免疫荧光分析和染色体倍体的 DNA原位杂交分析，适用于多种细胞类型的染色，包括胚胎时期内胚 层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞，尤其适用于针对人 类血液样本中存在的上皮组织来源肿瘤细胞多种不同来源肿瘤细胞的 检测。
尸检发现人类血液中存在上皮组织来源肿瘤细胞的现象已近百 年，根据其特性又称之为血液稀有细胞、肿瘤微小转移病灶、循环肿 瘤细胞和循环上皮细胞等。
通常，血液中可能出现的上皮组织来源的肿瘤细胞涉及覆盖于身 体表面和衬贴在有腔器官腔面的被覆上皮(如，皮肤、消化管、呼吸 系统及泌尿系统)和具有分泌功能的腺上皮(如，肝脏、胰腺、甲状 腺、肾上腺)来源的实体肿瘤。
动态监测血液中上皮组织来源肿瘤细胞的数量和变化，间接了解 肿瘤治疗疗效与进展，具有重要的科学意义和广泛的临床应用前景。 对血液中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和数量统计，能够间接了解肿瘤 尤其是实体肿瘤的进展与治疗疗效。例如，监测乳腺癌患者外周血样 本中上皮组织来源肿瘤细胞数目可以间接判断患者预后。通常认为， 转移乳腺癌患者7.5ml外周血具有≥5个肿瘤细胞者较7.5ml外周血 ＜5个肿瘤细胞者的无进展生存期和总体生存期大为缩短[1]。
研究表明，进入血液的上皮组织来源肿瘤细胞主要有三种存在形 式：①以完整细胞形式存在并处于静止增殖状态；②在各种剪切力 作用下细胞膜破裂以裸核形式存在，继而逐步凋亡；③以完整细胞形 式存在，在特定条件下进入活跃增殖状态并锚定于靶器官的毛细血管。
检测外周血样本上皮组织来源肿瘤细胞的技术一般要求具有微 创、实时、快捷、受试者易于接受等特点，主要涉及获得与富集血液 中非血细胞来源的有核细胞，并从中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞等两 个步骤。具体的，目前有多种方法可以有效的分离和富集血液中非血 细胞来源的有核细胞，其中以免疫磁珠富集技术应用最为广泛；而鉴 定上皮组织来源肿瘤细胞，目前主要采用抗上皮细胞表面抗原联合抗 肿瘤相关抗原的免疫荧光染色法，例如分别用红、绿荧光素标记抗上 皮细胞抗原(EpCAM和cytokeratins 8，18，和/或19)、抗白细胞 表面抗原(CD45)和抗肿瘤相关抗原(CA19-9、CEA、HER2/neu、粘蛋 白、β-hCG、甲胎蛋白、PSA和PSMA等)染色，继而用DAPI染料对 细胞核DNA复染等联合判定[2-3]。
针对通过免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的 有核细胞样本，由于缺少肿瘤特异标记物，所鉴定的细胞往往存在一 定比例的假阳性(如来自针刺部位进入血液的表皮细胞也表达角蛋白 抗原)和假阴性(大约30％上皮组织来源的肿瘤细胞不表达上皮细胞 抗原EpCAM，约25％的肝细胞肝癌不表达肝癌相关抗原甲胎蛋白等)； 用于免疫荧光分析的抗体通常用特定波长的荧光素标记，当荧光素被 特定光源持续激发后容易淬灭(即光漂白作用)，给显微镜下读片和 细胞计数等分析带来不便。同时，肿瘤细胞在免疫系统和外周血中特 定剪切作用下，以及体外分析的操作过程中，会发生细胞膜破裂，形 成细胞裸核。
采用针对肿瘤细胞胞膜和胞浆的上皮组织来源肿瘤细胞之抗原分 析的现有技术，均无法辨认呈前所述三种形式的进入血液的全部上皮 组织来源肿瘤细胞，产生假阴性结果。另外，上皮组织来源肿瘤细胞 离开所在器官进入血液循环失去了所在器官原有的组织学关系，不易 通过形态学鉴别。因此，用现有技术鉴定血液中上皮组织来源的肿瘤 细胞，尤其是裸核肿瘤细胞十分困难，迫切需要一种对血液中各种形 式上皮组织来源肿瘤细胞全面、准确的鉴别方法。
针对目前鉴定血液中上皮组织来源肿瘤细胞技术的上述缺陷，本 发明人基于细胞形态学分析、细胞表面标志分析和染色体倍体分析， 采用所述兼容免疫荧光细胞染色方法，成功建立了能够从人体外周血 样本的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定包括裸核细胞在内的呈三 种形式的全部上皮组织来源肿瘤细胞的方法。
目前，多数临床肿瘤治疗中存在治疗过度或治疗不足的问题，利 用本发明提出的针对外周血样本中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和定量 方法，结合相关临床指征和生理生化分析，可以间接用于实时监测肿 瘤进展，评价疗效，预测预后，从而建立肿瘤患者个体化的治疗方案， 提高患者生存率。
瑞氏染色：瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性， 后者为酸性，细胞核染色质与强碱性的组蛋白、精蛋白等，形成核蛋 白，这种强碱物质与瑞氏酸性染料伊红有亲和力，故染成红色；但核 蛋白中还有少量的弱酸性蛋白和氨基酸，它又与瑞氏染料中的美蓝起 作用，只因其量太少，而不显蓝色，故细胞核呈紫红色。
姬姆萨染色：染料主要为伊红、美蓝两种成分，染色原理与瑞氏 染色相同。
瑞氏-姬姆萨复合染色：由于上述两种染色原理基本相同，混合染 色法的优点是，瑞氏染液对胞浆着色好，姬姆萨染液则对核着色好， 两法合并，可以兼得两者的优点。因此在细胞学的检查中，常用两者 进行复合染色。
巴氏染色：巴氏阴道及痰液等脱落细胞学检查的一种主要染色方 法。苏木素对细胞核着色，其他染料可与细胞浆中不同的化学成分结 合而使其着色。涂片经巴氏染色后，细胞核结构清晰，分色明显，透 明度好，胞浆着色艳丽。缺点是试剂种类很多，染色手续繁杂，时间 长，不宜涂厚片等。
苏木素伊红染色：原理与巴氏染色法基本相同。适合黏液及细胞 较多，较厚的涂片和切片观察组织层次。
以上几种细胞化学的染色方法大都强调对细胞核的染色，一旦对 细胞进行染色，将无法进行后续的细胞免疫荧光和染色体倍体分析。
为克服现有细胞染色技术的上述缺陷，本发明人采用了一种能够 适于进一步进行免疫荧光分析的细胞化学染色方法，即兼容免疫荧光 分析的细胞化学染色方法。所述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方 法，是一种改进的苏木素细胞染色方法在采用苏木素对细胞核的染色 同时，不影响后续的细胞表面标志物的免疫荧光分析和染色体倍体的 DNA原位杂交分析，适用于多种细胞类型的染色，包括胚胎时期内胚 层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞，尤其适用于针对人 类血液样本中存在的上皮组织来源肿瘤细胞多种不同来源肿瘤细胞的 检测。
尸检发现人类血液中存在上皮组织来源肿瘤细胞的现象已近百 年，根据其特性又称之为血液稀有细胞、肿瘤微小转移病灶、循环肿 瘤细胞和循环上皮细胞等。
通常，血液中可能出现的上皮组织来源的肿瘤细胞涉及覆盖于身 体表面和衬贴在有腔器官腔面的被覆上皮(如，皮肤、消化管、呼吸 系统及泌尿系统)和具有分泌功能的腺上皮(如，肝脏、胰腺、甲状 腺、肾上腺)来源的实体肿瘤。
动态监测血液中上皮组织来源肿瘤细胞的数量和变化，间接了解 肿瘤治疗疗效与进展，具有重要的科学意义和广泛的临床应用前景。 对血液中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和数量统计，能够间接了解肿瘤 尤其是实体肿瘤的进展与治疗疗效。例如，监测乳腺癌患者外周血样 本中上皮组织来源肿瘤细胞数目可以间接判断患者预后。通常认为， 转移乳腺癌患者7.5ml外周血具有≥5个肿瘤细胞者较7.5ml外周血 ＜5个肿瘤细胞者的无进展生存期和总体生存期大为缩短[1]。
研究表明，进入血液的上皮组织来源肿瘤细胞主要有三种存在形 式：①以完整细胞形式存在并处于静止增殖状态；②在各种剪切力 作用下细胞膜破裂以裸核形式存在，继而逐步凋亡；③以完整细胞形 式存在，在特定条件下进入活跃增殖状态并锚定于靶器官的毛细血管。
检测外周血样本上皮组织来源肿瘤细胞的技术一般要求具有微 创、实时、快捷、受试者易于接受等特点，主要涉及获得与富集血液 中非血细胞来源的有核细胞，并从中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞等两 个步骤。具体的，目前有多种方法可以有效的分离和富集血液中非血 细胞来源的有核细胞，其中以免疫磁珠富集技术应用最为广泛；而鉴 定上皮组织来源肿瘤细胞，目前主要采用抗上皮细胞表面抗原联合抗 肿瘤相关抗原的免疫荧光染色法，例如分别用红、绿荧光素标记抗上 皮细胞抗原(EpCAM和cytokeratins 8，18，和/或19)、抗白细胞 表面抗原(CD45)和抗肿瘤相关抗原(CA19-9、CEA、HER2/neu、粘蛋 白、β-hCG、甲胎蛋白、PSA和PSMA等)染色，继而用DAPI染料对 细胞核DNA复染等联合判定[2-3]。
针对通过免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的 有核细胞样本，由于缺少肿瘤特异标记物，所鉴定的细胞往往存在一 定比例的假阳性(如来自针刺部位进入血液的表皮细胞也表达角蛋白 抗原)和假阴性(大约30％上皮组织来源的肿瘤细胞不表达上皮细胞 抗原EpCAM，约25％的肝细胞肝癌不表达肝癌相关抗原甲胎蛋白等)； 用于免疫荧光分析的抗体通常用特定波长的荧光素标记，当荧光素被 特定光源持续激发后容易淬灭(即光漂白作用)，给显微镜下读片和 细胞计数等分析带来不便。同时，肿瘤细胞在免疫系统和外周血中特 定剪切作用下，以及体外分析的操作过程中，会发生细胞膜破裂，形 成细胞裸核。
采用针对肿瘤细胞胞膜和胞浆的上皮组织来源肿瘤细胞之抗原分 析的现有技术，均无法辨认呈前所述三种形式的进入血液的全部上皮 组织来源肿瘤细胞，产生假阴性结果。另外，上皮组织来源肿瘤细胞 离开所在器官进入血液循环失去了所在器官原有的组织学关系，不易 通过形态学鉴别。因此，用现有技术鉴定血液中上皮组织来源的肿瘤 细胞，尤其是裸核肿瘤细胞十分困难，迫切需要一种对血液中各种形 式上皮组织来源肿瘤细胞全面、准确的鉴别方法。
针对目前鉴定血液中上皮组织来源肿瘤细胞技术的上述缺陷，本 发明人基于细胞形态学分析、细胞表面标志分析和染色体倍体分析， 采用所述兼容免疫荧光细胞染色方法，成功建立了能够从人体外周血 样本的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定包括裸核细胞在内的呈三 种形式的全部上皮组织来源肿瘤细胞的方法。
目前，多数临床肿瘤治疗中存在治疗过度或治疗不足的问题，利 用本发明提出的针对外周血样本中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和定量 方法，结合相关临床指征和生理生化分析，可以间接用于实时监测肿 瘤进展，评价疗效，预测预后，从而建立肿瘤患者个体化的治疗方案， 提高患者生存率。
发明内容
为克服现有细胞染色技术的诸多缺陷，本发明人建立了一种能够 适于进一步进行免疫荧光分析的细胞化学染色方法，即兼容免疫荧光 分析的细胞化学染色方法。
在本发明中，所述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，是一 种改进的苏木素细胞染色方法，其中与常规苏木素染色相比，所采用 的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红染色方法中苏木素 浓度的40％-50％，同时，染色时间与现有苏木素伊红染色方法相比也 缩短了50％-67％。
采用上述改进的苏木素细胞染色方法，能够减少苏木素对细胞核 的染色，有益于后续的细胞表面标志物的免疫荧光分析和染色体倍体 的DNA原位杂交分析，而不影响细胞形态学的分析。
具体的，在本发明的实施方案中，所述方法具体采用组成为如下 的苏木素染液[1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素粉剂、50mM硫酸铝、1mM 碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对样品染色40秒至1分钟。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：
1、将经富集的有核细胞样本用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl， 2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均匀滴加 在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
2、95％乙醇固定15分钟；
3、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
4、选择浓度为1.3mg/ml-1.6mg/ml的苏木素染液[苏木素粉剂 (北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9043)、50mM硫酸铝、 1mM碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对样品染色40秒至1分钟；
5、自来水浸泡约10分钟，洗去多余染液后再用蒸馏水洗涤一遍；
6、95％乙醇脱水5秒钟后再以0.5％伊红染液(北京中杉金桥生 物技术有限公司，货号：ZLI-9046)染色4分钟；
7、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
根据兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法的特点，本领域普通 技术人员容易知晓，所述染色方法适于对如下类型的细胞进行染色， 而不影响对所述细胞类型进一步进行免疫荧光分析，合适的细胞类型 包括胚胎时期内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和 肿瘤细胞，尤其适合针对来自于如下类型上皮来源肿瘤的细胞的染色， 包括但不限于：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴 癌、阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前 列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌， 以及实验室常规采用的体外培养细胞系：COS-7细胞、CHO细胞、 NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞等。
本发明的另一方面涉及一种针对人体外周血样本分离出的血液中 非血细胞来源的有核细胞，简单、快捷、准确地鉴定其中包括裸核细 胞在内的全部上皮组织来源肿瘤细胞的有效鉴别方法，其中，采用了 本发明所述的兼容免疫荧光染色方法。
在本发明中，所述鉴别方法适于检测通过常规阳性和阴性富集技 术，例如免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的有核 细胞。所述方法包括如下步骤：
1)细胞滴片制备及染色：针对采用例如免疫磁珠富集技术分离和 富集获得的血液有核细胞，其中含部分白细胞和可疑上皮组织来源肿 瘤细胞，经细胞滴片、固定后行本发明所述兼容免疫荧光分析的细胞 化学染色；
2)细胞形态学分析：经普通光学显微镜镜检，判定属于典型上皮 组织来源肿瘤细胞的个数(n1)；对无法判定的可疑细胞，记录细胞 所在位置；
3)细胞表面标志分析：例如通过选自如下的细胞表面标志：抗上 皮细胞标志(EpCAM和cytokeratins 8，18，和/或19)、肿瘤相关 抗原(CA19-9、CEA、HER2/neu、粘蛋白、β-hCG、甲胎蛋白、PSA和 PSMA等)和抗白细胞表面抗原(CD45)进行进一步免疫荧光染色，观 察步骤2)中获得的可疑细胞，并判定其属于上皮组织来源肿瘤细胞 的个数(n2)，对无法判定的可疑细胞，记录细胞所在位置；
4)染色体倍体分析：根据所测样本的肿瘤类型，选择一组(1～3 个)特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染色体计数探针，经荧光基 团标记后，与步骤3)中的可疑细胞DNA原位杂交，荧光显微镜下观 察步骤3)中所述可疑细胞的特异染色体拷贝数，判定属于上皮组织 来源肿瘤细胞的个数(n3)；
5)将上述步骤2)-4)中判定的上皮组织来源肿瘤细胞个数相 加得到所述样本中的上皮组织来源肿瘤细胞总数(N)，即N＝n1+n2+n3。
在本发明中，本领域技术人员知晓，所述免疫磁珠富集技术为血 液细胞分析中的常规技术，包含阳性富集和阴性富集两种策略。其中， 阳性富集策略的内容主要包括：收集抗凝的全血，红细胞裂解液或淋 巴细胞分离液去除血液中的红细胞，用抗上皮标记的抗体 (anti-EpCAM)偶联磁珠富集上皮来源的肿瘤细胞，然后进行肿瘤细 胞的鉴定。分离和收集的有核细胞的主要成分为上皮来源的肿瘤细胞、 少量白细胞、少量的表皮细胞。使用的阳性选择富集试剂盒例如有美 国Immunicon Corporation(免疫公司)的CellSearch循环肿瘤细 胞富集试剂盒(货号7900003)。
阴性富集策略的内容主要包括：收集抗凝的全血，红细胞裂解液 或淋巴细胞分离液去除血液中的红细胞，用抗白细胞表面抗原的抗体 (anti-CD45)偶联磁珠去除白细胞，阴性富集的有核细胞进行进一步 的鉴定。分离和收集的有核细胞的主要成分为肿瘤细胞、少量白细胞、 少量的表皮细胞和血液中未知的稀有细胞。采用所述磁珠富集技术的 产品例如有德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801)，所 述方法的具体操作步骤详见该市售的试剂盒中随附的说明书。
在本发明中，所述鉴定方法中涉及的细胞滴片和固定技术，均为 本领域普通技术人员周知的方法，具体内容请参见《细胞实验指南》 (科学出版社，2003年7月12日出版)。
在本发明所述鉴别方法中，所采用的兼容免疫荧光分析的细胞化 学染色方法，是一种改进的苏木素细胞染色方法，其中与常规苏木素 染色相比，所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红 染色方法中苏木素浓度的40％-50％，同时，染色时间与现有苏木素伊 红染色方法相比也缩短了50％-67％。采用上述改进的苏木素细胞染色 方法，能够减少苏木素对细胞核的染色，有益于后续的细胞表面标志 物的免疫荧光分析和染色体倍体的DNA原位杂交分析，而不影响细胞 形态学的分析。
具体的，在本发明的实施方案中，所述兼容免疫荧光染色方法方 法具体采用组成为如下的苏木素染液[1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素 粉剂、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对上述样 本染色40秒至1分钟。
本发明中，鉴定包括裸核细胞在内的上皮组织来源肿瘤细胞的有 效方法步骤2)中，经上述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色后，需 要在普通光学显微镜下，依据选自本领域常用的判定肿瘤细胞的组织 病理学公认标准，对染色细胞做形态学分析，具体标准(1)-(4)包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；
(2)核质比大于0.8；
(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染色， 核仁大或多个核仁等任何一项改变；
(4)有时可见符合条件(1)～(3)的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的 细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞。
在步骤2)中，对于部分符合上述标准，但难以断定良恶性的可 疑细胞被判定为“可疑细胞”并记录细胞所在位置(其中可疑细胞包 括不典型肿瘤细胞；胞膜破裂、胞浆部分或完全丢失的肿瘤细胞；裸 核细胞等)，需要进一步加以分析。这是因为，经过兼容免疫荧光分 析的细胞化学染色方法染色后，细胞核呈淡紫蓝色，多数细胞质及非 细胞成分呈淡粉色。此时，可通过细胞大小和形态学特征判断其良恶 性来源。但是，①对不典型的肿瘤细胞或部分胞膜破裂、胞浆丢失的 肿瘤细胞较难分辨；②对占血液白细胞总数的3-8％的单核细胞(尤 其是胞膜破裂的大单核裸核细胞)与肿瘤细胞(尤其是裸核肿瘤细胞) 往往很难区分。
为了进一步分析鉴别其中包括裸核细胞在内的上皮组织来源肿瘤 细胞，在本发明所述鉴别方法步骤3)中，进一步采用例如量子点标 记免疫荧光染色(QD-IF)，进行细胞表面标志分析。
量子点(quantum dot，QD)材料是由半导体物质组成的类圆形荧 光纳米颗粒，直径2-8纳米。根据尺寸不同，可以产生多种颜色的光。 经激发光照射后，不同大小量子点材料可产生不同颜色的荧光。与常 规荧光素相比，量子点标记抗体用于免疫荧光分析具有高灵敏性、高 效性、荧光信号强、特异性好，特别是光漂白时间大为延长等诸多优 势。利用量子点很强的抵抗光漂白特性(是普通有机染料的几千倍)， 可以长时间对比可见光和荧光下肿瘤细胞形态，准确判断和计数[4]。
在本发明所述鉴别方法步骤3)中，用能产生不同颜色荧光的量 子点标记抗上皮细胞表面抗原(如cytokeratins，EpCAM)、抗白细 胞表面抗原(如CD45)和抗肿瘤相关抗原抗体。
具体的，例如，以Invitrogen公司生产的量子点抗体标记试剂盒 将能激发绿色荧光量子点标记试剂盒(货号：Q22041MP)、激发桔黄 色荧光量子点标记试剂盒(货号：Q22011MP)、激发红色荧光量子点 标记试剂盒(货号：Q22021MP)分别标记抗上皮细胞表面抗原(如 cytokeratins，EpCAM)、抗白细胞表面抗原(如CD45)和抗肿瘤相 关抗原的抗体。用上述经标记的抗体，对本发明所述鉴定方法之步骤 2)中标记为“可疑细胞”的细胞进行免疫荧光染色，继而用DNA荧光 染料DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察细胞形态，即量子点标记免 疫荧光分析(QD-IF)。
在本发明上述鉴定方法步骤3)中，为进行细胞表面标志分析， 可以利用荧光显微镜，依据选自本领域常用的诸多判定上皮组织来源 肿瘤细胞的公认标准加以完成，具体标准(5)-(9)包括：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；
(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(如cytokeratins 8+，18+或 cytokeratin 19+，EpCAM+)；
(7)抗白细胞表面抗原阴性(如CD45-)；
(8)抗肿瘤相关性抗原阳性(如CA19-9+，CEA+)；
(9)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色 部位基本重合[5-6]。
符合上述标准(5)～(9)的经量子点标记免疫荧光染色之步骤2)中 的“可疑细胞”被进一步判定为上皮组织来源肿瘤细胞，并计数。
根据上述判定标准仍然难以判定为上皮组织来源肿瘤细胞的可疑 细胞，其通常为肿瘤裸核细胞，难以与血液中的大单核细胞区分。将 这类细胞判定为本发明所述鉴定方法之步骤3)中的“可疑细胞”； 并记录细胞所在位置，进入步骤4)分析。
依据上述标准，如果所测样品中存在难以与血液中的大单核细胞 区分的肿瘤裸核细胞，即：“可疑细胞”，则需要对所述样品中的可 疑细胞通过本发明所述鉴定方法中的步骤4)染色体倍体分析进一步 加以鉴别。
具体的，本领域普通技术人员知晓，可以根据待测样本中涉及的 肿瘤细胞类型，设计所述步骤4)所采用的探针。具体的，通常采用 的探针为一组(1～3个)特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染色体 计数探针(Chromosome enumerating probe，CEP)。该类型探针可 购自于Vysis公司。对于采用2～3个探针组合的情形，要求待测肿瘤 细胞中至少有两个探针标记的染色体具有非二倍体性，对于采用单探 针的情形，要求待测肿瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数≥3。
例如，对于获自胰腺癌患者的样品，本领域普通技术人员知晓， 分别选择第7号、8号和20号染色体的计数探针。采用本领域公知的 方法，例如用商购试剂盒“CEP DNA FISH探针”(Vysis公司产品) 提供的荧光基团标记所述探针后，依据公知方法[7]与步骤3)中的可疑 细胞进行DNA原位杂交。然后在荧光显微镜下观察步骤3)中判定为 可疑细胞的特异染色体拷贝数。
在本发明中，对于待测样本来自不同类型的肿瘤患者的情形，本 领域普通技术人员知晓如何选择或设计用于染色体倍体分析的相应的 计数探针(如可选择Vysis公司的CEP)。
适于本发明所述鉴定方法加以鉴定的肿瘤细胞之来源包括但不限 于：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、 肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、阴道癌、 宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸 癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌。
本领域公知，恶性肿瘤细胞的一个显著特点就是染色体的非二倍 体性。有关染色体倍体的研究发现第1、8、17号染色体在乳腺癌中具 有高频扩增和重组现象[7]，90％的胰腺癌细胞系具有染色体20q的高 频扩增(28/31)[8]。
因此根据如下判别标准加以判定：
(10)对于采用2～3个探针组合的情形，待测肿瘤细胞中至少有两 个探针标记的染色体具有非二倍体性，对于采用单探针的情形，待测 肿瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数≥3。
符合上述标准(10)的可疑细胞则即被判定为上皮组织来源肿瘤细 胞并计数。将步骤4)中认定之可疑细胞数与步骤2)、步骤3)中所 认定的可疑细胞计数相加，即得呈三种形式的外周血上皮组织来源肿 瘤细胞总数(包括典型肿瘤细胞、不典型肿瘤细胞、胞膜破裂、部分 或完全胞浆丢失细胞等上皮组织来源肿瘤细胞)。
本发明采用兼容荧光免疫染色技术，建立了基于细胞形态学、细 胞表面标志和染色体倍体等三步分析的上皮组织来源肿瘤细胞鉴别方 法，不但可以鉴定外周血上皮组织来源肿瘤细胞，得到定性信息；还 可以通过计数阳性细胞数获得肿瘤细胞的定量信息。
附图说明
图1.本发明的所述鉴别方法的技术路线示意图
如图所示，经常规阳性/阴性富集技术，例如免疫磁珠富集技术分 离和富集的细胞滴片后，采用兼容荧光细胞染色技术，首先进行细胞 形态学分析，符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞 并计数(n1)。
对于难以断定良恶性的可疑细胞，记下细胞位置并进入步骤3)。 经细胞表面标志分析，进一步将符合标准(5)～(9)的细胞判定为上皮组 织来源肿瘤细胞并计数(n2)。
对仍然难以断定良恶性的可疑细胞，记下细胞位置并进入步骤 4)。选取1-3个针对特异肿瘤突变热点的染色体计数探针做染色体倍 体原位杂交分析，计数可疑细胞染色体拷贝数，将符合标准(10)的细胞 判定为上皮组织来源的肿瘤细胞并计数(n3)。
上述各步骤所得阳性细胞数目之和即为该病例外周血中上皮组织 来源肿瘤细胞数。
图2.本发明细胞形态学分析发现的肿瘤细胞
如图所示，部分上皮组织来源肿瘤细胞。细胞直径大于10微米， 裸核直径大于8微米；核质比大于0.8；细胞核形状不规则；细胞核 染色深且不均一；细胞核内颗粒或点状染色；可见成簇细胞群等。
图3.胰腺癌细胞表面量子点免疫荧光分析结果
如图所示，CK-19主要分布于细胞的胞浆。在相同曝光时间下， 量子点(QD)标记的抗-CK19抗体免疫荧光信号强度显著高于普通荧 光素标记抗体的免疫荧光信号强度。
图4.胰腺癌细胞表面量子点标记CK18、CA19-9抗体免疫荧光结 果
如图所示，免疫磁珠技术阴性富集的上皮组织来源肿瘤细胞经量 子点标记的CK18、CA19-9抗体双染色结果。DAPI核染色阳性(蓝色)； 细胞核较大；CK18染色阳性(红色)；CK19染色阳性(绿色)；以上 两种抗体染色模式部分重叠。
图5.胰腺癌细胞特异8号染色体倍体分析
如图所示，选取8号染色体的计数探针对细胞杂交结果，镜下可 见三倍体和多倍体细胞(亮点数即为8号染色体拷贝数)。
在本发明中，所述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，是一 种改进的苏木素细胞染色方法，其中与常规苏木素染色相比，所采用 的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红染色方法中苏木素 浓度的40％-50％，同时，染色时间与现有苏木素伊红染色方法相比也 缩短了50％-67％。
采用上述改进的苏木素细胞染色方法，能够减少苏木素对细胞核 的染色，有益于后续的细胞表面标志物的免疫荧光分析和染色体倍体 的DNA原位杂交分析，而不影响细胞形态学的分析。
具体的，在本发明的实施方案中，所述方法具体采用组成为如下 的苏木素染液[1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素粉剂、50mM硫酸铝、1mM 碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对样品染色40秒至1分钟。
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：
1、将经富集的有核细胞样本用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl， 2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均匀滴加 在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
2、95％乙醇固定15分钟；
3、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
4、选择浓度为1.3mg/ml-1.6mg/ml的苏木素染液[苏木素粉剂 (北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9043)、50mM硫酸铝、 1mM碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对样品染色40秒至1分钟；
5、自来水浸泡约10分钟，洗去多余染液后再用蒸馏水洗涤一遍；
6、95％乙醇脱水5秒钟后再以0.5％伊红染液(北京中杉金桥生 物技术有限公司，货号：ZLI-9046)染色4分钟；
7、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
根据兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法的特点，本领域普通 技术人员容易知晓，所述染色方法适于对如下类型的细胞进行染色， 而不影响对所述细胞类型进一步进行免疫荧光分析，合适的细胞类型 包括胚胎时期内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和 肿瘤细胞，尤其适合针对来自于如下类型上皮来源肿瘤的细胞的染色， 包括但不限于：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴 癌、阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前 列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌， 以及实验室常规采用的体外培养细胞系：COS-7细胞、CHO细胞、 NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞等。
本发明的另一方面涉及一种针对人体外周血样本分离出的血液中 非血细胞来源的有核细胞，简单、快捷、准确地鉴定其中包括裸核细 胞在内的全部上皮组织来源肿瘤细胞的有效鉴别方法，其中，采用了 本发明所述的兼容免疫荧光染色方法。
在本发明中，所述鉴别方法适于检测通过常规阳性和阴性富集技 术，例如免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的有核 细胞。所述方法包括如下步骤：
1)细胞滴片制备及染色：针对采用例如免疫磁珠富集技术分离和 富集获得的血液有核细胞，其中含部分白细胞和可疑上皮组织来源肿 瘤细胞，经细胞滴片、固定后行本发明所述兼容免疫荧光分析的细胞 化学染色；
2)细胞形态学分析：经普通光学显微镜镜检，判定属于典型上皮 组织来源肿瘤细胞的个数(n1)；对无法判定的可疑细胞，记录细胞 所在位置；
3)细胞表面标志分析：例如通过选自如下的细胞表面标志：抗上 皮细胞标志(EpCAM和cytokeratins 8，18，和/或19)、肿瘤相关 抗原(CA19-9、CEA、HER2/neu、粘蛋白、β-hCG、甲胎蛋白、PSA和 PSMA等)和抗白细胞表面抗原(CD45)进行进一步免疫荧光染色，观 察步骤2)中获得的可疑细胞，并判定其属于上皮组织来源肿瘤细胞 的个数(n2)，对无法判定的可疑细胞，记录细胞所在位置；
4)染色体倍体分析：根据所测样本的肿瘤类型，选择一组(1～3 个)特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染色体计数探针，经荧光基 团标记后，与步骤3)中的可疑细胞DNA原位杂交，荧光显微镜下观 察步骤3)中所述可疑细胞的特异染色体拷贝数，判定属于上皮组织 来源肿瘤细胞的个数(n3)；
5)将上述步骤2)-4)中判定的上皮组织来源肿瘤细胞个数相 加得到所述样本中的上皮组织来源肿瘤细胞总数(N)，即N＝n1+n2+n3。
在本发明中，本领域技术人员知晓，所述免疫磁珠富集技术为血 液细胞分析中的常规技术，包含阳性富集和阴性富集两种策略。其中， 阳性富集策略的内容主要包括：收集抗凝的全血，红细胞裂解液或淋 巴细胞分离液去除血液中的红细胞，用抗上皮标记的抗体 (anti-EpCAM)偶联磁珠富集上皮来源的肿瘤细胞，然后进行肿瘤细 胞的鉴定。分离和收集的有核细胞的主要成分为上皮来源的肿瘤细胞、 少量白细胞、少量的表皮细胞。使用的阳性选择富集试剂盒例如有美 国Immunicon Corporation(免疫公司)的CellSearch循环肿瘤细 胞富集试剂盒(货号7900003)。
阴性富集策略的内容主要包括：收集抗凝的全血，红细胞裂解液 或淋巴细胞分离液去除血液中的红细胞，用抗白细胞表面抗原的抗体 (anti-CD45)偶联磁珠去除白细胞，阴性富集的有核细胞进行进一步 的鉴定。分离和收集的有核细胞的主要成分为肿瘤细胞、少量白细胞、 少量的表皮细胞和血液中未知的稀有细胞。采用所述磁珠富集技术的 产品例如有德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801)，所 述方法的具体操作步骤详见该市售的试剂盒中随附的说明书。
在本发明中，所述鉴定方法中涉及的细胞滴片和固定技术，均为 本领域普通技术人员周知的方法，具体内容请参见《细胞实验指南》 (科学出版社，2003年7月12日出版)。
在本发明所述鉴别方法中，所采用的兼容免疫荧光分析的细胞化 学染色方法，是一种改进的苏木素细胞染色方法，其中与常规苏木素 染色相比，所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红 染色方法中苏木素浓度的40％-50％，同时，染色时间与现有苏木素伊 红染色方法相比也缩短了50％-67％。采用上述改进的苏木素细胞染色 方法，能够减少苏木素对细胞核的染色，有益于后续的细胞表面标志 物的免疫荧光分析和染色体倍体的DNA原位杂交分析，而不影响细胞 形态学的分析。
具体的，在本发明的实施方案中，所述兼容免疫荧光染色方法方 法具体采用组成为如下的苏木素染液[1.3mg/ml-1.6mg/ml苏木素 粉剂、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙二醇、2％冰醋酸]对上述样 本染色40秒至1分钟。
本发明中，鉴定包括裸核细胞在内的上皮组织来源肿瘤细胞的有 效方法步骤2)中，经上述兼容免疫荧光分析的细胞化学染色后，需 要在普通光学显微镜下，依据选自本领域常用的判定肿瘤细胞的组织 病理学公认标准，对染色细胞做形态学分析，具体标准(1)-(4)包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；
(2)核质比大于0.8；
(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染色， 核仁大或多个核仁等任何一项改变；
(4)有时可见符合条件(1)～(3)的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的 细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞。
在步骤2)中，对于部分符合上述标准，但难以断定良恶性的可 疑细胞被判定为“可疑细胞”并记录细胞所在位置(其中可疑细胞包 括不典型肿瘤细胞；胞膜破裂、胞浆部分或完全丢失的肿瘤细胞；裸 核细胞等)，需要进一步加以分析。这是因为，经过兼容免疫荧光分 析的细胞化学染色方法染色后，细胞核呈淡紫蓝色，多数细胞质及非 细胞成分呈淡粉色。此时，可通过细胞大小和形态学特征判断其良恶 性来源。但是，①对不典型的肿瘤细胞或部分胞膜破裂、胞浆丢失的 肿瘤细胞较难分辨；②对占血液白细胞总数的3-8％的单核细胞(尤 其是胞膜破裂的大单核裸核细胞)与肿瘤细胞(尤其是裸核肿瘤细胞) 往往很难区分。
为了进一步分析鉴别其中包括裸核细胞在内的上皮组织来源肿瘤 细胞，在本发明所述鉴别方法步骤3)中，进一步采用例如量子点标 记免疫荧光染色(QD-IF)，进行细胞表面标志分析。
量子点(quantum dot，QD)材料是由半导体物质组成的类圆形荧 光纳米颗粒，直径2-8纳米。根据尺寸不同，可以产生多种颜色的光。 经激发光照射后，不同大小量子点材料可产生不同颜色的荧光。与常 规荧光素相比，量子点标记抗体用于免疫荧光分析具有高灵敏性、高 效性、荧光信号强、特异性好，特别是光漂白时间大为延长等诸多优 势。利用量子点很强的抵抗光漂白特性(是普通有机染料的几千倍)， 可以长时间对比可见光和荧光下肿瘤细胞形态，准确判断和计数[4]。
在本发明所述鉴别方法步骤3)中，用能产生不同颜色荧光的量 子点标记抗上皮细胞表面抗原(如cytokeratins，EpCAM)、抗白细 胞表面抗原(如CD45)和抗肿瘤相关抗原抗体。
具体的，例如，以Invitrogen公司生产的量子点抗体标记试剂盒 将能激发绿色荧光量子点标记试剂盒(货号：Q22041MP)、激发桔黄 色荧光量子点标记试剂盒(货号：Q22011MP)、激发红色荧光量子点 标记试剂盒(货号：Q22021MP)分别标记抗上皮细胞表面抗原(如 cytokeratins，EpCAM)、抗白细胞表面抗原(如CD45)和抗肿瘤相 关抗原的抗体。用上述经标记的抗体，对本发明所述鉴定方法之步骤 2)中标记为“可疑细胞”的细胞进行免疫荧光染色，继而用DNA荧光 染料DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察细胞形态，即量子点标记免 疫荧光分析(QD-IF)。
在本发明上述鉴定方法步骤3)中，为进行细胞表面标志分析， 可以利用荧光显微镜，依据选自本领域常用的诸多判定上皮组织来源 肿瘤细胞的公认标准加以完成，具体标准(5)-(9)包括：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；
(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(如cytokeratins 8+，18+或 cytokeratin 19+，EpCAM+)；
(7)抗白细胞表面抗原阴性(如CD45-)；
(8)抗肿瘤相关性抗原阳性(如CA19-9+，CEA+)；
(9)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色 部位基本重合[5-6]。
符合上述标准(5)～(9)的经量子点标记免疫荧光染色之步骤2)中 的“可疑细胞”被进一步判定为上皮组织来源肿瘤细胞，并计数。
根据上述判定标准仍然难以判定为上皮组织来源肿瘤细胞的可疑 细胞，其通常为肿瘤裸核细胞，难以与血液中的大单核细胞区分。将 这类细胞判定为本发明所述鉴定方法之步骤3)中的“可疑细胞”； 并记录细胞所在位置，进入步骤4)分析。
依据上述标准，如果所测样品中存在难以与血液中的大单核细胞 区分的肿瘤裸核细胞，即：“可疑细胞”，则需要对所述样品中的可 疑细胞通过本发明所述鉴定方法中的步骤4)染色体倍体分析进一步 加以鉴别。
具体的，本领域普通技术人员知晓，可以根据待测样本中涉及的 肿瘤细胞类型，设计所述步骤4)所采用的探针。具体的，通常采用 的探针为一组(1～3个)特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染色体 计数探针(Chromosome enumerating probe，CEP)。该类型探针可 购自于Vysis公司。对于采用2～3个探针组合的情形，要求待测肿瘤 细胞中至少有两个探针标记的染色体具有非二倍体性，对于采用单探 针的情形，要求待测肿瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数≥3。
例如，对于获自胰腺癌患者的样品，本领域普通技术人员知晓， 分别选择第7号、8号和20号染色体的计数探针。采用本领域公知的 方法，例如用商购试剂盒“CEP DNA FISH探针”(Vysis公司产品) 提供的荧光基团标记所述探针后，依据公知方法[7]与步骤3)中的可疑 细胞进行DNA原位杂交。然后在荧光显微镜下观察步骤3)中判定为 可疑细胞的特异染色体拷贝数。
在本发明中，对于待测样本来自不同类型的肿瘤患者的情形，本 领域普通技术人员知晓如何选择或设计用于染色体倍体分析的相应的 计数探针(如可选择Vysis公司的CEP)。
适于本发明所述鉴定方法加以鉴定的肿瘤细胞之来源包括但不限 于：唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、 肝癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、阴道癌、 宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸 癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌。
本领域公知，恶性肿瘤细胞的一个显著特点就是染色体的非二倍 体性。有关染色体倍体的研究发现第1、8、17号染色体在乳腺癌中具 有高频扩增和重组现象[7]，90％的胰腺癌细胞系具有染色体20q的高 频扩增(28/31)[8]。
因此根据如下判别标准加以判定：
(10)对于采用2～3个探针组合的情形，待测肿瘤细胞中至少有两 个探针标记的染色体具有非二倍体性，对于采用单探针的情形，待测 肿瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数≥3。
符合上述标准(10)的可疑细胞则即被判定为上皮组织来源肿瘤细 胞并计数。将步骤4)中认定之可疑细胞数与步骤2)、步骤3)中所 认定的可疑细胞计数相加，即得呈三种形式的外周血上皮组织来源肿 瘤细胞总数(包括典型肿瘤细胞、不典型肿瘤细胞、胞膜破裂、部分 或完全胞浆丢失细胞等上皮组织来源肿瘤细胞)。
本发明采用兼容荧光免疫染色技术，建立了基于细胞形态学、细 胞表面标志和染色体倍体等三步分析的上皮组织来源肿瘤细胞鉴别方 法，不但可以鉴定外周血上皮组织来源肿瘤细胞，得到定性信息；还 可以通过计数阳性细胞数获得肿瘤细胞的定量信息。
附图说明
图1.本发明的所述鉴别方法的技术路线示意图
如图所示，经常规阳性/阴性富集技术，例如免疫磁珠富集技术分 离和富集的细胞滴片后，采用兼容荧光细胞染色技术，首先进行细胞 形态学分析，符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞 并计数(n1)。
对于难以断定良恶性的可疑细胞，记下细胞位置并进入步骤3)。 经细胞表面标志分析，进一步将符合标准(5)～(9)的细胞判定为上皮组 织来源肿瘤细胞并计数(n2)。
对仍然难以断定良恶性的可疑细胞，记下细胞位置并进入步骤 4)。选取1-3个针对特异肿瘤突变热点的染色体计数探针做染色体倍 体原位杂交分析，计数可疑细胞染色体拷贝数，将符合标准(10)的细胞 判定为上皮组织来源的肿瘤细胞并计数(n3)。
上述各步骤所得阳性细胞数目之和即为该病例外周血中上皮组织 来源肿瘤细胞数。
图2.本发明细胞形态学分析发现的肿瘤细胞
如图所示，部分上皮组织来源肿瘤细胞。细胞直径大于10微米， 裸核直径大于8微米；核质比大于0.8；细胞核形状不规则；细胞核 染色深且不均一；细胞核内颗粒或点状染色；可见成簇细胞群等。
图3.胰腺癌细胞表面量子点免疫荧光分析结果
如图所示，CK-19主要分布于细胞的胞浆。在相同曝光时间下， 量子点(QD)标记的抗-CK19抗体免疫荧光信号强度显著高于普通荧 光素标记抗体的免疫荧光信号强度。
图4.胰腺癌细胞表面量子点标记CK18、CA19-9抗体免疫荧光结 果
如图所示，免疫磁珠技术阴性富集的上皮组织来源肿瘤细胞经量 子点标记的CK18、CA19-9抗体双染色结果。DAPI核染色阳性(蓝色)； 细胞核较大；CK18染色阳性(红色)；CK19染色阳性(绿色)；以上 两种抗体染色模式部分重叠。
图5.胰腺癌细胞特异8号染色体倍体分析
如图所示，选取8号染色体的计数探针对细胞杂交结果，镜下可 见三倍体和多倍体细胞(亮点数即为8号染色体拷贝数)。
具体实施方式
以下以获自胰腺癌患者外周血的样本为例，举例说明通过本发明 所述方法成功鉴别所述样本中包括裸核细胞在内之呈三种形式的上皮 组织来源肿瘤细胞总数。
实施例一针对获自肺癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的细 胞化学染色
1、对获自肺癌患者(编号：ZB0717)的外周血7.5毫升进行阴性 富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.3mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色1分钟；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录5个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(29.3， 96.2)，(24.8，91.5)，(21.5，90.6)，(30.8，89.5)，(26.5， 88.6)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CA19-9、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的5个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或 细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例二针对获自乳腺癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的 细胞化学染色
1、对获自乳腺癌患者(编号：ZB0715)的外周血7.5毫升进行阴 性富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801)按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分 离和富集的非血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.5mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色50秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录4个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(26.3， 97.2)，(25.3，95.7)，(23.9，91.2)，(29.1，89.2)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CK19、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的3个阳性细胞是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或 细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例三、针对获自食管癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的 细胞化学染色
1、对获自食管癌患者(编号：M592)的外周血7.5毫升进行阴性 富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色40秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录3个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(28.3， 97.2)，(24.2，93.5)，(26.5，91.6)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CK19、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的3个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细 胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例四、获自胰腺癌患者外周血之样本的上皮组织来源肿瘤细 胞鉴别
步骤一、细胞滴片制备及兼容免疫荧光分析的细胞化学染色
1、对获自胰腺癌患者(编号：PC-026)的外周血7.5毫升进行阴 性富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801)按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分 离和富集的非血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色50秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
步骤二、细胞形态学分析
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞并计数(n1＝19)；同时，记录6个可疑细胞位于载物台上的坐标 位置，即(28.5，96.4)，(20.2，95.5)，(28.5，95)，(24.5， 93.7)，(24.5，92.6)，(22.5，92.5)。
步骤三、对上述步骤二中判定的可疑细胞进行细胞表面标志量子 点免疫荧光分析
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟，以破坏细胞膜蛋白，通透细胞便于抗体与目标蛋白 结合；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟，以减少抗体与非目的蛋白的非特 异性结合；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号 Q22011MP)和激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)分别 标记抗胰腺癌相关抗原抗体CA19-9(Merck公司产品，货号CA1003)、 抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司产品，货号2003607)和 抗上皮细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)。用100 微升量子点标记的CK18、CA19-9、CD45混合抗体(1∶100稀释)室温 孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据坐标位置，观察步骤二中判定为可疑细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(9)计数上皮组织来源肿瘤细胞(n2＝2)：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(cytokeratins 8，18+或 cytokeratin19+，EpCAM+)；(7)抗白细胞表面抗原阴性(CD45-)；(8) 抗肿瘤相关性抗原阳性(CA19-9+，CEA+)；(9)细胞核(蓝色)与相 应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
同时记录4个可疑细胞的位置，即(28.5，96.4)、(28.5，95)、 (24.5，93.7)、(24.5，92.6)。
步骤四、对上述步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍体分析
依据现有技术，对步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍体分析。 具体包括：
(一)染色体标记探针的选择
待测肿瘤细胞为获自胰腺癌患者细胞，在本发明中采用三个计数 探针的一组探针。具体的，分别选择第7号、8号和20号染色体的设 计计数探针：20号染色体计数探针(Vysis公司产品，货号32-130020)、 7号染色体计数探针(Vysis公司产品，货号32-131007)及8号染色 体计数探针(Vysis公司产品，货号32-132008)
(二)染色体倍体分析
20、将玻片置于二甲苯中5分钟后，去除盖玻片，换新鲜的二甲 苯洗涤载玻片5分钟；
21、载玻片于65C预热的1mol/L硫氰酸钠中孵育45分钟，以 去除苏木素与细胞核的染色，减少其对CEP与染色体结合的影响；
22、新鲜二甲苯洗涤两次，每次5分钟，玻片空气干燥15分钟；
23、玻片置于含95％乙醇的科普林氏染色缸中，分别用85％乙醇， 70％乙醇洗涤玻片，每次5分钟；
24、在2×SSC溶液(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，pH7.0)[含 0.1mg/ml RNAse A(北京赛百盛基因技术有限公司产品，货号GR1-25)] 中室温浸泡玻片40分钟后，在相同溶液中于37C孵育玻片10分钟， 以去除细胞的RNA，降低杂交背景；
25、在胃蛋白酶(Sigma公司产品，货号P 7000)工作液(0.05mg/ml， 溶于10mmol/L HCL)中于37C孵育13分钟，以增强组织的通透性 和核酸探针的穿透性，提高杂交信号强度；
26、用1×PBS溶液于室温下孵育5分钟后，在1％甲醛中室温固 定玻片5分钟；
27、玻片用1×PBS溶液于室温下洗5分钟后，依次在70％、85％、 100％的乙醇中脱水2分钟，室温干燥；
28、室温下将7微升2×SSC杂交液与1微升20号染色体计数探 针(Vysis公司产品，货号32-130020)、1微升7号染色体计数探针 (Vysis公司产品，货号32-131007)及1微升8号染色体计数探针 (Vysis公司产品，货号32-132008)混合，瞬间离心2-3秒，震荡重 悬后，再次短暂离心；
29、73℃水浴孵育5分钟，置于40-50℃的温箱中；
30、在玻片上标记杂交区域后，于73℃的变性液{含70％甲酰胺 (Amresco公司产品，货号0606)的2×SCC溶液}中浸泡5分钟；
31、玻片依次在70％、85％和100％的乙醇中各脱水5分钟；
32、凉干后玻片置于45-50℃温箱中至少2分钟；
33、于玻片上滴加10微升混合探针溶液后立即加盖盖玻片和封片 液；
34、将玻片移入预热的干燥盒中，于42℃孵箱中杂交至少30分 钟(但不超过60分钟)；
35、移去盖玻片，立即将玻片置于0.4×SSC/0.3％NP-40溶液(60mM NaCl，6mM柠檬酸钠，0.3％NP-40，pH7.0)中漂洗1-3次后，室温 孵育2分钟；
36、将玻片移入装有2×SSC/0.1％NP-40溶液(0.3M NaCl，30mM 柠檬酸钠，0.1％NP-40，pH7.0)的科普林染色缸中漂洗1-3次后， 室温放置5-60秒；
37、避光处风干后加入10微升DAPI(Sigma公司产品，货号 D9564)溶液复染；
38、荧光显微镜下根据坐标位置，根据判断标准(10)：对于采用2～ 3个探针组合的情形，待测肿瘤细胞中至少有两个探针标记的染色体 具有非二倍体性。
分别观察步骤三中判定为可疑细胞的特异染色体拷贝数。
位于坐标(28.5，95)处可疑细胞的7号(浅绿色)、8号(绿 色)和20号(桔黄色)染色体的拷贝数分别为2、3、3；位于坐标(24.5， 93.7)处可疑细胞的7、8和20号染色体的拷贝数分别为3、2、3。
因此，在步骤四，又检出上皮组织来源肿瘤细胞2个，即n3＝2。
将上述步骤一至步骤四中认定的上皮组织来源肿瘤细胞数目相加 (N＝n1+n2+n3)，得到各步骤检出上皮组织来源肿瘤细胞总计23个， 对应于每7.5毫升外周血23个上皮组织来源的肿瘤细胞。
参考文献
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[3]Fehm T，Solomayer EF，Meng S，et al.Methods for isolating circulating epithelial cells and criteria for their classification as carcinoma cells.Cytotherapy.2005， 7(2)：171-185.
[4]Smith AM，Dave S，Nie S，et al.Multicolor quantum dots for molecular diagnostics of cancer.Expert Rev Mol Diagn.2006， 6(2)：231-244.
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实施例一针对获自肺癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的细 胞化学染色
1、对获自肺癌患者(编号：ZB0717)的外周血7.5毫升进行阴性 富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.3mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色1分钟；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录5个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(29.3， 96.2)，(24.8，91.5)，(21.5，90.6)，(30.8，89.5)，(26.5， 88.6)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CA19-9、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的5个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或 细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例二针对获自乳腺癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的 细胞化学染色
1、对获自乳腺癌患者(编号：ZB0715)的外周血7.5毫升进行阴 性富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801)按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分 离和富集的非血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.5mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色50秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录4个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(26.3， 97.2)，(25.3，95.7)，(23.9，91.2)，(29.1，89.2)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CK19、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的3个阳性细胞是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或 细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例三、针对获自食管癌患者的样本进行兼容免疫荧光分析的 细胞化学染色
1、对获自食管癌患者(编号：M592)的外周血7.5毫升进行阴性 富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色40秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时，记录3个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(28.3， 97.2)，(24.2，93.5)，(26.5，91.6)。
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)、 激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)分别标记抗上皮 细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)、CK19(Merck 公司产品，货号IF15)抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司 产品，货号2003607)。用100微升量子点标记的CK18、CK19、CD45 混合抗体(1∶100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(8)，以上兼容免疫荧光的细胞染色方 法鉴定的3个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+)；(7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45-)；(8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细 胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
实施例四、获自胰腺癌患者外周血之样本的上皮组织来源肿瘤细 胞鉴别
步骤一、细胞滴片制备及兼容免疫荧光分析的细胞化学染色
1、对获自胰腺癌患者(编号：PC-026)的外周血7.5毫升进行阴 性富集。具体的，选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801)按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分 离和富集的非血源性有核细胞；
2、将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；
3、95％乙醇固定15分钟；
4、蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；
5、苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品，货号ZLI-9043)、50mM硫酸铝、1mM碘酸钠、25％乙 二醇、2％冰醋酸]染色50秒；
6、浸入自来水洗去多余的染色液约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍；
7、95％乙醇脱水5秒后，0.5％伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046)染色4分钟；
8、70％乙醇洗涤2次，95％乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95％ 乙醇再脱水2分钟，二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟，用中性树胶封片。
步骤二、细胞形态学分析
9、显微镜下观察细胞学形态，按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞。具体标准包括：
(1)细胞直径大于10微米或裸核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8；(3)细胞核形状不规则，染色深，染色不均一，呈颗粒或点状染 色，核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)～(3) 的成簇细胞群[3]。符合标准(1)～(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞并计数(n1＝19)；同时，记录6个可疑细胞位于载物台上的坐标 位置，即(28.5，96.4)，(20.2，95.5)，(28.5，95)，(24.5， 93.7)，(24.5，92.6)，(22.5，92.5)。
步骤三、对上述步骤二中判定的可疑细胞进行细胞表面标志量子 点免疫荧光分析
10、将经上述兼容免疫荧光分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， 去除盖玻片；
11、1×PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)洗涤载玻片3次，每次1分钟；
12、1×TBS溶液(30mM Tris，2.8mM KCl，137mM NaCl，pH7.4) 洗涤3次，每次1分钟；
13、玻片置于0.1％Triton X-100(溶于1×TBS溶液)溶液中， 室温作用5分钟，以破坏细胞膜蛋白，通透细胞便于抗体与目标蛋白 结合；
14、玻片于1×TBS涮洗3次后，再置于1×TBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；
15、玻片置于2％BSA(Sigma公司产品，货号A8022)(溶于1 ×TBS)溶液中，室温封闭30分钟，以减少抗体与非目的蛋白的非特 异性结合；
16、以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号 Q22011MP)和激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)分别 标记抗胰腺癌相关抗原抗体CA19-9(Merck公司产品，货号CA1003)、 抗白细胞表面抗原抗体CD45(Chemicon公司产品，货号2003607)和 抗上皮细胞表面抗原抗体CK18(Merck公司产品，货号IF14)。用100 微升量子点标记的CK18、CA19-9、CD45混合抗体(1∶100稀释)室温 孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤在暗盒内进行)；
17、以0.2％BSA(溶于1×TBS)溶液涮洗3次后，再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；
18、以1×TBS溶液洗涤1次后，用7微升DAPI(Sigma公司产品， 货号D9564)滴片，盖玻片封片；
19、荧光显微镜下根据坐标位置，观察步骤二中判定为可疑细胞 的细胞膜表面标志。
按照如下判定标准(5)～(9)计数上皮组织来源肿瘤细胞(n2＝2)：
(5)DAPI核染色阳性，细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(cytokeratins 8，18+或 cytokeratin19+，EpCAM+)；(7)抗白细胞表面抗原阴性(CD45-)；(8) 抗肿瘤相关性抗原阳性(CA19-9+，CEA+)；(9)细胞核(蓝色)与相 应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。
同时记录4个可疑细胞的位置，即(28.5，96.4)、(28.5，95)、 (24.5，93.7)、(24.5，92.6)。
步骤四、对上述步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍体分析
依据现有技术，对步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍体分析。 具体包括：
(一)染色体标记探针的选择
待测肿瘤细胞为获自胰腺癌患者细胞，在本发明中采用三个计数 探针的一组探针。具体的，分别选择第7号、8号和20号染色体的设 计计数探针：20号染色体计数探针(Vysis公司产品，货号32-130020)、 7号染色体计数探针(Vysis公司产品，货号32-131007)及8号染色 体计数探针(Vysis公司产品，货号32-132008)
(二)染色体倍体分析
20、将玻片置于二甲苯中5分钟后，去除盖玻片，换新鲜的二甲 苯洗涤载玻片5分钟；
21、载玻片于65C预热的1mol/L硫氰酸钠中孵育45分钟，以 去除苏木素与细胞核的染色，减少其对CEP与染色体结合的影响；
22、新鲜二甲苯洗涤两次，每次5分钟，玻片空气干燥15分钟；
23、玻片置于含95％乙醇的科普林氏染色缸中，分别用85％乙醇， 70％乙醇洗涤玻片，每次5分钟；
24、在2×SSC溶液(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，pH7.0)[含 0.1mg/ml RNAse A(北京赛百盛基因技术有限公司产品，货号GR1-25)] 中室温浸泡玻片40分钟后，在相同溶液中于37C孵育玻片10分钟， 以去除细胞的RNA，降低杂交背景；
25、在胃蛋白酶(Sigma公司产品，货号P 7000)工作液(0.05mg/ml， 溶于10mmol/L HCL)中于37C孵育13分钟，以增强组织的通透性 和核酸探针的穿透性，提高杂交信号强度；
26、用1×PBS溶液于室温下孵育5分钟后，在1％甲醛中室温固 定玻片5分钟；
27、玻片用1×PBS溶液于室温下洗5分钟后，依次在70％、85％、 100％的乙醇中脱水2分钟，室温干燥；
28、室温下将7微升2×SSC杂交液与1微升20号染色体计数探 针(Vysis公司产品，货号32-130020)、1微升7号染色体计数探针 (Vysis公司产品，货号32-131007)及1微升8号染色体计数探针 (Vysis公司产品，货号32-132008)混合，瞬间离心2-3秒，震荡重 悬后，再次短暂离心；
29、73℃水浴孵育5分钟，置于40-50℃的温箱中；
30、在玻片上标记杂交区域后，于73℃的变性液{含70％甲酰胺 (Amresco公司产品，货号0606)的2×SCC溶液}中浸泡5分钟；
31、玻片依次在70％、85％和100％的乙醇中各脱水5分钟；
32、凉干后玻片置于45-50℃温箱中至少2分钟；
33、于玻片上滴加10微升混合探针溶液后立即加盖盖玻片和封片 液；
34、将玻片移入预热的干燥盒中，于42℃孵箱中杂交至少30分 钟(但不超过60分钟)；
35、移去盖玻片，立即将玻片置于0.4×SSC/0.3％NP-40溶液(60mM NaCl，6mM柠檬酸钠，0.3％NP-40，pH7.0)中漂洗1-3次后，室温 孵育2分钟；
36、将玻片移入装有2×SSC/0.1％NP-40溶液(0.3M NaCl，30mM 柠檬酸钠，0.1％NP-40，pH7.0)的科普林染色缸中漂洗1-3次后， 室温放置5-60秒；
37、避光处风干后加入10微升DAPI(Sigma公司产品，货号 D9564)溶液复染；
38、荧光显微镜下根据坐标位置，根据判断标准(10)：对于采用2～ 3个探针组合的情形，待测肿瘤细胞中至少有两个探针标记的染色体 具有非二倍体性。
分别观察步骤三中判定为可疑细胞的特异染色体拷贝数。
位于坐标(28.5，95)处可疑细胞的7号(浅绿色)、8号(绿 色)和20号(桔黄色)染色体的拷贝数分别为2、3、3；位于坐标(24.5， 93.7)处可疑细胞的7、8和20号染色体的拷贝数分别为3、2、3。
因此，在步骤四，又检出上皮组织来源肿瘤细胞2个，即n3＝2。
将上述步骤一至步骤四中认定的上皮组织来源肿瘤细胞数目相加 (N＝n1+n2+n3)，得到各步骤检出上皮组织来源肿瘤细胞总计23个， 对应于每7.5毫升外周血23个上皮组织来源的肿瘤细胞。
参考文献
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