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树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞

阅读：60发布：2020-12-21

专利汇可以提供树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了特异于树突状细胞、并能够有效地 治疗 和/或诊断各种 疾病 的 抗原 结合 片段 。本发明也提供了其应用方法，用于筛选其它的这类抗原结合片段，以及由此获得的产物。，下面是树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞专利的具体信息内容。

1、一种组合物，其包含分离的特异于树突状细胞(DCs)亚类的抗原 结合片段，其中所述亚类被命名为AC144、AD5-13A11、AD5-17F6、 AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或AD5-8E7的抗体特异性识别。
2、权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AC144或者是由 其衍生的。
3、据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-1311或 者是由其衍生的。
4、根据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-4B8或者 是由其衍生的。
5、根据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-17F6 或者是由其衍生的。
6、根据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-5E8或 者是由其衍生的。
7、根据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-14H12 或者是由其衍生的。
8、据权利要求1的组合物，其中所述抗原结合片段是AD5-8E7或者 是由其衍生的。
9、一种组合物，其包含特异于命名为BDCA-2(SEQ ID NO：2)的 抗原的一个表位的抗原结合片段。
10、一种组合物，其包含特异于命名为BDCA-3的抗原的一个表位的 抗原结合片段。
11、根据权利要求10所述的组合物，其中BDCA-3是100kD的蛋白 质。
12、基本上分离或浓缩的细胞群或亚群，其被根据权利要求1-11中任 意一项所述的组合物特异性识别。
13、基本上被分离或浓缩的DC群或亚群，其是通过鉴定细胞表面上 的神经纤毛旦白-1而分离的。
14、根据权利要求13所述的DC群或亚群，其中与特异于BDCA-4 的抗体发生交叉反应的抗原结合片段识别所述的神经纤毛旦白-1。
15、根据权利要求1-11中任意一项所述的组合物，其中所述抗原结合 片段选自：全抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、F(ab’)2、单链V区 片段(scFv)、融合多肽、aptomer、糖类以及凝集素。
16、根据权利要求15的组合物，其中所述抗原结合片段是人源的。
17、根据权利要求16的组合物，其中噬菌体展示文库编码所述抗原结 合片段。
18、根据权利要求15的组合物，其中所述抗原结合片段基本上是由 scFv构成的。
19、根据权利要求15的组合物，其中融合多肽包括被融合到化学功能 组分上的抗原结合片段。
20、根据权利要求19的组合物，其中所述组分选自：信号肽、增强 免疫反应性的试剂、抗原、促进与固相载体偶联的试剂、生物应答修饰剂、 免疫毒素、毒素、可检测的标记物、顺磁标记物以及药物。
21、据权利要求20的组合物，其中促进与固相载体偶联的试剂选自 生物素和亲和素。
22、据权利要求20的组合物，其中生物应答修饰剂是细胞因子或趋 化因子。
23、根据权利要求20的组合物，其中细胞因子/趋化因子选自：IL-1、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、干扰素、TNF-α、IL-10和TGF-β。
24、根据权利要求20的组合物，其中毒素选自：蓖麻毒蛋白、放射 性核素、商陆抗病毒蛋白、假单胞杆菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白 A链、霉菌核糖体灭活蛋白和磷脂酶类。
25、根据权利要求20的组合物，其中可检测标记物选自：放射性同 位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物、生物发光化合物、酶、 底物、辅因子和抑制剂。
26、根据权利要求1-25中任意一项所述的组合物，其进一步包含生 理上可接受的赋形剂。
27、一种细胞群或亚群，其中基本上所有的细胞都表达BDCA-1、 BDCA-2和BDCA-3的至少之一，或基本上所有的细胞都在基于BDCA-1、 BDCA-2和BDCA-3中的至少之一的表达基础上而被分离、浓缩或计数。
28、根据权利要求27的组合物，其中至少80％的细胞为BDCA-1+。
29、根据权利要求27的组合物，其中至少90％的细胞是BDCA-1+。
30、根据权利要求27的组合物，其中至少95％的细胞为BDCA-1+。
31、根据权利要求27的组合物，其中至少80％的细胞为BDCA-2+。
32、根据权利要求27的组合物，其中至少90％的细胞为BDCA-2+。
33、根据权利要求27的组合物，其中至少95％的细胞为BDCA-2+。
34、根据权利要求27的组合物，其中至少80％的细胞为BDCA-3+。
35、根据权利要求27的组合物，其中至少90％的细胞为BDCA-3+。
36、根据权利要求27的组合物，其中至少95％的细胞为BDCA-3+。
37、一种树突状细胞群或亚群，其中基本上所有的细胞都表达 BDCA-4，或基本上所有的细胞都在表达BDCA-4的基础上被分离、浓缩 或计数。
38、根据权利要求37的组合物，其中至少80％的细胞为BDCA-4+。
39、根据权利要求37的组合物，其中至少90％的细胞为BDCA-4+。
40、根据权利要求37的组合物，其中至少95％的细胞为BDCA-4+。
41、权利要求12-14和29-40中任意一项所述的树突状细胞，其中细 胞基本上为活化的。
42、一种组合物，其包含权利要求12-14和28-41中任意一项所述的 细胞和生理可接受的赋形剂。
43、根据权利要求42的组合物，其进一步包含至少一种抗原或抗原 肽(T细胞表位)。
44、根据权利要求43的组合物，其中抗原被承载到细胞内。
45、根据权利要求43的组合物，其中抗原在含有细胞的溶液中。
46、根据权利要求43的组合物，其中抗原被呈递到细胞表面。
47、根据权利要求43的组合物，其中细胞已被处理，以调节胞质钙 浓度(至少是瞬时的)。
48、根据权利要求47的组合物，其中抗原由外源衍生的基因或 mRNA表达。
49、根据权利要求48的细胞，其中用特异于BDCA-2的抗原结合片 段对细胞进行预处理。
50、根据权利要求49的组合物，其中抗原选自：肿瘤细胞抗原、病 毒抗原、细菌抗原、寄生虫衍生的抗原、自身抗原和/或抗原肽(T细胞表 位)。
51、根据权利要求50的组合物，其中在组合物施与受试对象之后， 细胞和抗原的浓度可在受试对象体内有效引发免疫应答。
52、根据权利要求51的组合物，其中免疫应答是导向抗肿瘤、病毒、 细菌、寄生虫和真菌的。
53、根据权利要求52的组合物，其中抗原是人肿瘤抗原，并选自：星 形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、间胶质瘤、室管膜细胞瘤、 成神经管细胞瘤、原始神经外胚层瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、 胰管腺癌、小和大的细胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细 胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、及其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内 皮肉瘤、肝细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、横纹肌肉瘤、结 肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、 髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆囊癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、 维尔姆斯瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、 成血管细胞瘤、声神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜 细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、以及重链 病、乳腺癌(例如管和小叶腺癌)、子宫颈的鳞状腺癌、子宫和卵巢上皮 癌、前列腺腺癌、膀胱的过渡鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴癌(结的和扩 散的)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉 瘤。
54、根据权利要求49的组合物，其中抗原是耐受原。
55、根据权利要求54的组合物，其中耐受原为自身免疫疾病特异的。
56、根据权利要求49的组合物，其中自身免疫疾病选自：类风湿性 关节炎、青少年类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、类风湿性脊椎炎、强 直性脊柱炎、眼干燥综合征、肺出血肾炎综合征、瑞特综合征、硬皮病、 脉管炎、多肌炎和皮肤肌炎。
57、根据权利要求55的组合物，其中耐受原为器官移殖特异的。
58、根据权利要求56的组合物，其中器官移殖选自：心脏、肺、肝、 骨髓、干细胞、肾、皮肤。
59、一种用于获得包含富集DCs的细胞的组合物的方法，该方法包 括将人细胞混合物分离为一个组分，其中该组分中至少80％的细胞是 BDCA-1+。
60、根据权利要求59的方法，其中至少90％的细胞是BDCA-1+。
61、根据权利要求59的方法，其中至少95％的细胞是BDCA-1+。
62、一种用于获得包含为富集DCs的细胞的组合物的方法，该方法 包括将人细胞混合物分离为一个组分，其中该组分中至少80％的细胞是 BDCA-2+。
63、根据权利要求62的方法，其中至少90％的细胞是BDCA-2+。
64、根据权利要求62的方法，其中至少95％的细胞是BDCA-2+。
65、一种用于获得包含富集DCs的细胞的组合物的方法，该方法包 括将人细胞混合物分离为一个组分，其中该组分中至少80％的细胞是 BDCA-3+。
66、根据权利要求65的方法，其中至少90％的细胞是BDCA-3+。
67、根据权利要求65的方法，其中至少95％的细胞是BDCA-3+。
68、一种用于获得包含富集DCs的细胞的组合物的方法，该方法包 括将人细胞混合物分离为一个组分，其中该组分中至少80％的细胞是 BDCA-4+。
69、根据权利要求68的方法，其中至少90％的细胞是BDCA-4+。
70、根据权利要求68的方法，其中至少95％的细胞是BDCA-4+。
71、一种用于分离基本上纯的细胞群的方法，包括：
a)获得人细胞混合物；
b)从由特异于命名为BDCA-2的抗原的抗原结合片段所特异性识别 的混合物中将细胞基本上分离出来。
72、根据权利要求71的方法，其中抗原结合片段是AC144、 AD5-13A11或AD5-4B8或者是由其衍生的。
73、一种用于分离基本上纯的细胞群的方法，包括以下步骤：
a)获得人细胞混合物；以及
b)从由特异于命名为BDCA-3的抗原的抗原结合片段所特异性识别 的混合物中将细胞基本上分离出来。
74、根据权利要求73的方法，其中抗原结合片段是AD5-5E8或 AD5-14H12或者是由其衍生的。
75、一种用于分离基本上纯的DCs群的方法，包括以下步骤：
c)获得人细胞混合物；以及
d)从由特异于命名为BDCA-4的抗原的抗原结合片段所特异性识别 的混合物中将细胞基本上分离出来。
76、根据权利要求75的方法，其中抗原结合片段是AD5-17F6或者 是由其衍生的。
77、根据权利要求63-76中任意一项所述的方法，其中细胞源选自： 胎儿骨髓、新生儿骨髓、成人骨髓、胎儿肝脏、外周血和脐带血、白细胞 分离复置术、活化的新鲜血液、经培养的细胞、扁桃体、脾、淋巴结、皮 肤、气道上皮、肺、肝、肠、淋巴集结和鼻。
78、根据权利要求77的方法，其中外周血是被动员的。
79、根据权利要求77的方法，其中动员是通过用选自fLt3-配体和 G-CSF的组合物进行预处理而实施的。
80、根据权利要求77的方法，其中动员是通过用：选自诱导内源性 I型干扰素、IL-12和IL-4的方法的组合物进行预处理而实施的。
81、一种用于计数细胞的方法，包括以下步骤：a)获得细胞混合物； 以及b)用抗原结合片段标记细胞，其中所述抗原结合片段特异于选自 BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一种或多种抗原。
82、根据权利要求81的方法，其中抗原是BDCA-1。
83、根据权利要求81的方法，其中抗原是BDCA-2。
84、根据权利要求81的方法，其中抗原是BDCA-3。
85、根据权利要求81的方法，其中抗原是BDCA-4。
86、一种调节DCs的免疫能力的方法，包括以下步骤：分离基本上 纯的DCs群或亚群；以及调节DCs的胞质钙浓度(至少是瞬时的)。
87、根据权利要求86的方法，其中DCs的调节导致优先诱导对抗原 的Th1应答的树突状细胞的产生。
88、根据权利要求87的方法，其中抗原是变应原、病毒抗原、细菌 抗原、肿瘤抗原、寄生虫抗原和真菌抗原。
89、根据权利要求86的方法，其中DCs的调节导致优先诱导对抗原 的Th2应答的树突状细胞的产生。
90、根据权利要求89的方法，其中抗原选自：寄生虫、自身抗原、 细菌和病毒。
91、根据权利要求86的方法，其中DCs的调节导致优先诱导对抗原 的Th3/Th-R应答的树突状细胞的产生。
92、根据权利要求91的方法，其中抗原选自：寄生虫、自身抗原、 细菌、变应原和病毒。
93、一种用于筛选在测试剂中存在药效剂的的方法，包括以下步骤： 用抗原结合片段分离或检测或计数基本上纯的细胞群或亚群，其中所述抗 原结合片段特异于选自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任 一种或多种抗原；用测试剂筛分细胞；监测细胞对测试剂的应答；将细胞 对测试剂的应答与细胞对所暴露的对照剂的应答进行比较；以及确定测试 剂是否调节所分离、检测、计数细胞的任何一种免疫学特性。
94、根据权利要求93的方法，其中细胞特性选自：抗原呈递、细胞 因子的产生、对细胞因子的应答、对Th1应答的诱导和抑制、对Th2应答 的诱导和抑制、对诱导耐受的Th3/Th-R应答能力的诱导和抑制、对抗原 特异性应答的诱导、T细胞无反应性的诱导、至少瞬时动员胞内钙的佐剂 活性和能力。
95、一种调节树突状细胞的免疫学特性的方法，其包括改变胞质钙浓 度(至少是瞬时的)或者改变动员胞内钙的能力。
96、根据权利要求95的方法，其中调节选自体内、体外和离体调节。
97、根据权利要求96的方法，其中调节是通过I型干扰素进行的。
98、根据权利要求96的方法，其中调节是通过抗原结合片段与抗原 的特异性结合而进行的，或是通过抑制配体与一种BDCA的结合而进行的， 其中所述抗原选自：BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。
99、根据权利要求96的方法，其中调节是通过触发BDCAs或抑制 其触发进行的。
100、一种治疗生理疾病的方法，包括给需要该治疗的受试者施用有 效量的由权利要求1-88中任意一项所得到的DC。
101、根据权利要求100的方法，其中生理疾病是病毒感染。
102、根据权利要求101的方法，其中病毒感染选自：肝炎、HIV、 流感、鼻病毒、疱疹病毒、慢病毒属、CMV和麻疹。
103、根据权利要求100的方法，其中生理疾病是自身免疫疾病。
104、根据权利要求103的方法，其中自身免疫疾病选自：SLE、多 发性硬化、关节炎、硬皮病和牛皮癣。
105、根据权利要求100的方法，其中生理疾病是变态反应。
106、根据权利要求105的方法，其中变态反应选自：变态反应、荨 麻疹和过敏性休克。
107、根据权利要求106的方法，其中变态反应是哮喘。
108、根据权利要求100的方法，其中生理疾病是癌症。
109、根据权利要求108的方法，其中癌症选自：星形细胞瘤、纤维肉 瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、间胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、 原始神经外胚层瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰管腺癌、小和 大的细胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺 泡癌、上皮腺角化癌、及其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝 细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底 细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、 支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯 瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管 细胞瘤、声神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、 白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、以及重链病、乳腺 癌(例如管和小叶腺癌)、子宫颈的鳞状腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列 腺腺角化癌、膀胱的过渡鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴癌(结的和扩散的) 浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
110、一种调节树突状细胞细胞因子生成的方法，包括以下步骤：用 抗原结合片段分离基本上纯的树突状细胞群或亚群，其中所述抗原结合片 段特异于选自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的任一种或多种 抗原；以及用调节树突状细胞细胞因子生成的试剂处理细胞。
111、一种调节体内树突状细胞细胞因子生成的方法，其包括给所需 该调节的受试者施用有效量的调节树突状细胞细胞因子生成的试剂。
112、一种产生抗原特异性T细胞免疫应答和/或体液免疫应答的方 法，其包括给需要产生应答的受试者施用有效量的基本上纯的载有抗原并 用抗原结合片段分离的树突状细胞群或亚群，其中所述抗原结合片段特异 于选自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一种或多种抗原， 其中细胞被调节，从而诱导选自Th-1、Th-2和Th-3/Th-R的应答。
113、根据权利要求112的方法，其中抗原是通过转染、装入mRNA 和细胞融合而荷载的。
114、一种产生抗原特异性T细胞免疫应答或体液免疫应答的方法， 包括：给需要产生应答的受试者施用有效量的基本上纯的载有抗原并用抗 原结合片段分离的树突状细胞群或亚群，其中所述抗原结合片段特异于选 自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一种或多种抗原，其 中细胞被调节，从而诱导选自Th-1、Th-2和Th-3/Th-R的应答。
115、通过在重组宿主细胞内表达并从总的重组宿主细胞成分中纯化 出所表达的多肽而制备的多肽，其中所述多肽包含大约5个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
116、一种包括纯化多肽的组合物，其中所述多肽包括大约5个来自 SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
117、根据权利要求116的组合物，其中所述多肽包含BDCA-2胞外 结构域。
118、一种包含5-50个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基的纯化 多肽。
119、一种包含与不是SEQ ID NO：2的多肽氨基酸序列相连的多肽 氨基酸序列的融合蛋白质，其中所述氨基酸序列包括大约5个来自SEQ ID NO：2的氨基酸残基。
120、权利要求119的重组多肽，其包含大约15个来自SEQ ID NO： 2的连续氨基酸残基。
121、权利要求120的重组多肽，其包含大约30个来自SEQ ID NO： 2的连续氨基酸残基。
122、权利要求120的重组多肽，其包含大约50个来自SEQ ID NO： 2的连续氨基酸残基。
123、权利要求122的组合物，其中多肽包含大约15个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
124、权利要求123的组合物，其中多肽包含大约30个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
125、包含BDCA-2的至少一种剪接变体的多肽。
126、根据权利要求125的多肽，其中剪接变体包含外显子1-6。
127、根据权利要求126的多肽，其中剪接变体包含外显子1、3、4、 5和6。
128、根据权利要求126的多肽，其中剪接变体包含外显子1、2、4、 5和6。
129、根据权利要求126的多肽，其中剪接变体包含外显子1、2、3、 5和6。
130、编码BDCA-2或其片段的多核苷酸或其互补序列。
131、根据权利要求130的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2的至少5 个氨基酸残基。
132、根据权利要求131的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2的至少 15个氨基酸残基。
133、根据权利要求131的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2的至少 30个氨基酸残基。
134、根据权利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的序列。
135、根据权利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的至少 15个连续核苷酸。
136、根据权利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的至少 75个连续核苷酸。
137、根据权利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的至少 150个连续核苷酸。
138、编码BDCA-2的至少一种剪接变体的多核苷酸。
139、根据权利要求138的多核苷酸，其中剪接变体包含外显子1-6。
140、根据权利要求138的多核苷酸，其中剪接变体包含外显子1、3、 4、5和6。
141、根据权利要求138的多核苷酸，其中剪接变体包含外显子1、2、 4、5和6。
142、根据权利要求138的组合物，其中剪接变体包含外显子1、2、3、 5和6。
143、权利要求130-142中任意一项的多核苷酸，其功能性连接到启 动子上。
144、权利要求130-142中任意一项的多核苷酸，其中启动子是重组 启动子。
145、权利要求130-142中任意一项的多核苷酸，其中多核苷酸被包 含在重组载体中。
146、包含权利要求130-142中任意一项的多核苷酸的重组宿主细胞。
147、权利要求130-142中任意一项的多核苷酸或其互补序列，其中 在严紧的杂交条件下，编码SEQ ID NO：2或其片段的区域可与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交。
148、一种抑制BDCA与其特异性配体相互作用的方法，其包括使包 含BDCA及其配体的组合物与有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4 与配体相互作用的试剂接触。
149、根据权利要求148的方法，其中通过使包含DC和T细胞的组 合物与有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4与T细胞相互作用的 试剂接触而抑制DC和T细胞间的相互作用。
150、根据权利要求149的方法，其中试剂是特异于BDCA-2、BDCA-3 或BDCA-4的抗原结合片段。
151、根据权利要求150的方法，其中试剂为体内或体外施用。
152、一种治疗炎症的方法，其包括给所需治疗的受试者施用减轻受 试者炎症的有效量的试剂，其中所述试剂可抑制BDCA-2、BDCA-3或 BDCA-4与T细胞的相互作用。
153、一种抑制细胞表达BDCA-2的方法，其包含在细胞内表达反义 BDCA-2。
154、包含权利要求130-142中任意一项的多核苷酸的转基因动物。

说明书全文

技术领域

本发明涉及树突状细胞(DCs)亚群特异性的抗体及其衍生物。本发 明还提供了组合物及其使用方法，包括DCs及其亚群的分离和纯化以及抗 体或配体介导的免疫治疗方法。本发明还提供了基本上分离的DC亚群。 本发明提供的组合物的使用方法包括基于DC的免疫治疗方法、多种疾病 的鉴定以及体内用例如flt3-配体进行DC数量上的扩增。

发明背景

树突状细胞(DCs)(有效的抗原呈递细胞(APCs))的造血发育 是明显不同的，并且可以遵循几条前体途径，其中一些途径与单核细胞紧 密相连。DCs可由淋巴样前体衍生(Thomas等人(1993)免疫学杂志J. Immunol.150：821-834)。在胸腺中类似于在血液中，可存在有三种不同 的DCs亚类：1)浆细胞样的CD4+CD11c-DCs；2)CD4+CD11c+DCs； 以及3)交错突DCs。业已提出胸腺DCs和T细胞来自于共同干细胞 (Thomas等人(1996)干细胞(Stem Cell)14：196-206)。
近来通过体外用细胞因子培养祖代已产生了大量的DCs，以用于潜在 的临床用途。业已采纳不同的策略，将抗原引入树突状细胞内，以便在共 刺激的情况下，抗原可被更有效地呈递给T细胞。同样已经表明，树突状 细胞能够影响T细胞对抗原的应答。该应答是遵循体液或全身途径。
T细胞不能应答未加工的蛋白，相反，它们需要辅助细胞以肽表位来 呈递抗原，其中所述肽表位与MHC分子结合而呈现在细胞表面。在细胞 胞质内内源性产生的抗原通常以I类途径呈递，且刺激细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的反应，而外源性蛋白质在MHC II类区内被加工，且诱导辅助 (CD4)T细胞的应答。对原初T细胞的刺激需要存在共刺激分子，其中 共刺激分子作为初次免疫激活中的第二信号。APCs(例如B细胞和巨噬 细胞)一般不能诱导初次应答。相反，树突状细胞从共刺激分子、粘附分 子和MHC I类和II类分子的组成型不可调型表达来挖掘潜能，其中所述 共刺激分子、粘附分子和MHC I类和II类分子对引发有效的细胞免疫是 必须的。综述参见Avigan(1999)血液评论Blood Rev.)13：51-64。
DCs是引发初次免疫应答和耐受性发育所必需的APC。DCs表达对原 初T细胞群刺激所必需的MHC。DCs的造血发育是明显不同的，并且可 遵循几条前体途径，而其中一些途径是与单核细胞紧密相连的(参见 Avigan(1999)血液评论13：51-64)。不同DC亚类具有不同的发育途径。 这个新兴概念是，一种DC亚类具有可在诱导对自身抗原的耐受性中发挥 作用的调节功能(Austyn(1998)血液学最新观点Curr.Opin.Hematol. 5：3-15)。相反，DCs或其亚类也可参与诱导对自身蛋白质的免疫应答。 人们认为，某些自身免疫应答是由于微环境组织损伤导致局部DC的激活， 然后与T细胞相互作用，从而引发免疫应答(Ibrahim等人(1995)今日免 疫学(Immunol.Today)16：181-186)。
DCs引发T细胞应答的能力正被用于DC癌症疫苗中(Hart等人(1999) 血液学研究(Sem.Hematol.)36：21-25)。例如，体外用肿瘤衍生的肽或 旦白质脉冲CD34+细胞或单核细胞，产生DCs，然后回输到病人体内，用 作癌症特异的T细胞诱导中的APCs(Brugger等人(1999)纽约科学院纪事 (Ann.N.Y.Acad.Sci.)872：363-371)。动物模型已经证实，DC肿瘤疫 苗使T细胞的无反应性逆转并导致接下来的肿瘤排斥(Avigan(1999)；还 参见Tarte等人(1999)白血病(Leukemia)13：653-663；Colaco(1999)今日 分子医学(Molec.Med.Today)5：14-17；Timmerman等人(1999)医学年鉴 (Ann.Rev.Med.)50：507-529；Hart等人(1999)血液学研究36：21-25； Thurnher等人(1998)国际泌尿科学(Urol.Int.)61：67-71；以及Hermans 等人(1998)新西兰医学杂志(N.Z.Med.J.)111：111-113)。一种方法业 已通过服用flt-配体来增加体内的DCs。这对VEGF诱导的DC抑制具有 补偿作用(Ohm等人(1999)免疫学杂志163：3260-3268)。业已提出将DCs 用作接种和重组疫苗中的佐剂(Fernandez等人(1998)Cyto.Cell.Mol. Ther.4：53-65；以及Gilboa等人(1998)癌免疫和免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)46：82-87)。还已经提出将DC用于增强干细胞 移殖后的免疫性(Brugger等人(1999)纽约科学院纪事363-371)。DCs 在免疫学中起许多潜在的作用。例如，DCs与人免疫缺陷病毒(HIV)的 感染有关(Zoeteweij等人(1998)生的医学科学杂志(J.Biomed.Sci.) 5：253-259)。还业已提出，DCs适用于HIV治疗(Weissman等人(1997) 临床微生物学评论(Clin.Microbiol.Rev.)10：358-367)。
与DCs有关的其它免疫功能诸如对Th1或Th2应答、自身免疫反应 和变态反应的不同诱导(Rissoan等人(1999)科学(Science)283：1183-1186； Hermans等人(1998)新泽西医学杂志111：111-113；以及De Palma等人 (1999)免疫学杂志162：1982-1987)。
在SLE病人体内发现循环IFN-α和IFN-α诱导因子的水平升高(类 似于抗-DNA抗体与DNA的复合物)，并且这些因子与疾病的活动度有关。 而且，用IFN-α治疗非自身免疫紊乱的病人经常会产生自身抗体并偶尔会 产生SLE。Ronnblom等人的几篇论文(Ronnblom等人(1999)临床和实验 微生物学(Clin.Exp.Immunol.)115：196-202；(1999)免疫学杂志 163：6306-6313；以及(2000)免疫学杂志165：3519-3526)表明，由病人衍 生的IFN-α诱导因子诱导来自健康供体的PBMC分泌IFN-α，并且它们选 择性激活天然IFN-A产生细胞(NIPC＝浆细胞样DC)。
对血液中的DC的研究业因为DC细胞的稀少及DC特异性细胞表面 标记的相对缺少而受阻碍。用于DC分离的方法为基于一段短的培养期之 后成熟的变化(像低浮力密度的获得)或者基于DC激活/成熟抗原(CD83、 CMRF-44以及CMRF-56)的表达(Young等人(1988)细胞免疫(Cell Immunol.)111：167；Van Voorhis等人(1982)实验医学杂志(J.Exp.Med.) 155：1172；Zhou等人(1995)免疫学杂志154：3821-3835；Fearnley等人 (1997)血液89：3708-3716；Mannering等人(1988)J.Immunol.Met. 219：69-83；Hock等人(1999)Tiss.Antigens 53：320-334；以及Hock等人免 疫学(Immunol.)83：573-581)。
功能CD1a+DCs一般是由单核细胞以及CD34+造血祖细用离体法产生 的(Bender等人(1996)J.Immunol.Met.196：121-135；Pickl等人(1996)免 疫学杂志157：3850-3859；Romani等人(1994)实验医学杂志180：83-93； Sallusto等人(1994)实验医学杂志179：1109-1118；Caux等人(1992)自然 (Nature)360：258-261；Mackensen等人(1995)血液86：2699-2707； Szabolcs等人(1995)免疫学杂志154：5851-5861；Herbst等人(1996)血液 88：2541-2548；de Wynter等人(1998)干细胞16：387-396；Strunk等人(1996) 血液87：1292-1302；US专利号6,010,905以及6,004,807)。还不知道体外 由单核细胞以及造血祖细胞产生的DCs是否保留或者得到体内DCs的所 有特性。
另外，产生特异于人DC的mAb的一些尝试都失败了，而只产生了与 DC和其它白细胞均表达的抗原相结合的mAb。人DC与其它血细胞一样 拥有大量的免疫原性细胞表面结构(包括HLA分子、CD18、CD29、CD31、 CD43、CD44、CD45、CD54以及CD58)。对所注射的DC，这些抗原将 支配免疫应答到这样的水平，在该水平，特异于DC特异性抗原的B细胞 根本不存在或者在能够与骨髓瘤细胞融合的B细胞中只存在少数。
许多研究者业已试图通过以下措施来解决这个难题：即，给成年小鼠 注射非DC和环磷酰胺，以便消除特异于共享抗原的B细胞；或者给新生 小鼠注射非DC，以便耐受特异于共享抗原的B细胞(O’Doherty等人(1993) 实验医学生物学进展(Adv.Exp.Med.Biol.)329：165-172；以及Yamaguchi 等人(1995)J.Immunol.Met.181：115-124)。
称为CMRF44的mAb业已被用来监测干细胞移殖病人体内的DCs (Fearnley等人(1999)血液93：728-736)。有人提出，这些CMRF44+细 胞适合用来引发、维持和指导免疫应答(Fearnley等人(1997))。常用细 胞表面标记的组合体来最经常地分离DCs。例如，US专利号5,972,627将 “富集人造血树状祖细胞的造血细胞”描述成具有“至少80％表达CD34、 CD45RA以及CD10，但没有CD19、CD2、CD3、CD4、CD8、CD20、 CD14、CD15、CD16、CD56和血型糖蛋白”。
从血液中分离DCs依赖于大量的免疫表型标准，诸如白细胞谱系(lin) 特异抗原(例如CD3、CD14、CD19和CD56)系列的缺乏以及HLA-DR、 CD4或CD33的存在(Romani等人(1996)J.Immunol.Met.196：137-151； Thomas等人(1993)免疫学杂志150：821-834；Thomas等人(1994)免疫学杂 志153：4016-4028；O’Doherty等人(1994)免疫学82：487-493；O’Doherty 等人(1993)实验医学杂志178：1067-1076；Nijman等人(1995)实验医学杂志 182：163-174；Ferbas等人(1994)免疫学条志152：4649-4662；Heufler等人 (1996)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26：659-668；Ito等人(1999)免疫 学杂志163：1409-1419；Cella等人(1999)自然医学(Nature Med.) 5：919-923；Robinson等人(1999)欧洲免疫学杂志29：2769-2778；Olweus等 人(1997)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 94：12551-12556；Robert等人(1999)实验医学杂志189：627-636以及 Kohrgruber等人(1999)免疫学杂志163：3250-3259)。
通过分析从未培养血中分离的DC，显示出血液DC不是均一的细胞 群而是至少两个群体的混合物(Thomas等人(1994)；O’Doherty等人(1994)； Ito等人(1999)；Cella等人(1999)；Robinson等人(1999)；Olweus等人(1997)； Kohrgruber等人(1999)；Strobl等人(1998)免疫学杂志161：740-748以及 Rissoan等人(1999)科学283：1183-1186)。第一种血液DC亚群是拥有浆 细胞样形态学和有效的T细胞刺激功能的CD123亮CD11c-DC。第二种血 液DC亚群是CD123暗CD11c亮，它在外表上是单核细胞样的，并且表达 CD45RO，而且甚至在没有任何外源细胞因子培养时也能自动发育成典型 的成熟CDs。浆细胞样的CD123亮CD11c-DC显示出一些特性例如前-T细 胞受体α链的表达，这些特性表明它们来自淋巴样的前体(Strobl等人 (1998)；Rissoan等人(1999)以及Bruno等人(1997)实验医学杂志 185：875-884)。CD123暗CD11c亮DC显示出髓样DCs的所有标准 (O’Doherty等人(1994)以及Ito等人(1999).Robinson等人(1999)； Kohrgruber等人(1999)以及Strobl等人(1998))。已经在淋巴组织的T 细胞富集区检测到了的类似浆细胞样CD123亮CD11c-DC的DCs，并且由 于这些细胞的形态学和表型，最初被错误地称为浆细胞样T细胞或者浆细 胞样单核细胞(Grouard等人(1997)实验医学杂志185：1101-1111；Lennert 等人(1975)柳叶刀(Lancet)1：1031-1032；Lennert等人(1984)在白细胞类 型专用单克隆抗体检测人白细胞分化抗层(in Leukocyte Typing).(Human Leukocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies.) Bernard等人编辑.Springer-Verlag，Berlin；以及Facchetti等人(1998)美 国病理学杂志(Am.J.Pathol.)133：15)。在生发中心的暗区和亮区业已 发现类似CD123暗CD11c亮的血液DC的DCs(Grouard(1996)自然 384：364-367)。
剪接变体
据估计，被表达基因的总数在40,000到大于150,000的范围内。这 个数目并没有准确反映被编码的蛋白质的数目，这是由于在许多情况下， 由这些基因产生了多于一个来自mRNAs(转录体)的剪接变体。评估还 可以改变，也许在人体内可产生多达500,000个不同的mRNAs。据估计， 至少30％的人类基因具有若干剪接变体(Mironov等人(1999)基因组研究 (Genome Research)9：1288-1293)。一些人相信这些数目是保守的。 类似数目据信在小鼠和大鼠体内也存在，并且在较低级的生物体内也存在 其它剪接(例如黄猩猩果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans))。由不同剪接变体翻译成的蛋白质可具有明 显不同的功能(正如日益增多的研究论文所显示的)。在不同的组织、不 同的发育阶段和不同的疾病状态中可表达不同的剪接变体。
C-型凝集素
C-型凝集素是一族糖蛋白，这些糖蛋白在其糖类识别结构域(CRD) 显示出氨基酸序列的相似性并以Ca2+依赖的方式结合到所选择的糖类上。 C-型凝集素业已被分成四亚类(Vasta等人1994；以及Spiess 1990)。第 一组包括II型膜整合蛋白(例如脱唾液酸糖蛋白受体、巨噬细胞半乳糖特 异的凝集素、N-乙酰葡糖胺(GlcNac)特异的凝集素)以及CD23(FcεRII)。 这一组中的许多成员都表现出对半乳糖/岩藻糖、半乳糖胺/GalNac或 GlcNac残基的特异性。第二组包括软骨以及成纤维细胞粘蛋白的核心蛋 白。第三组包括所谓的“胶原凝集素”例如血清甘露糖结合蛋白、肺表面 活性剂蛋白SP-A以及胶固素。第四组包括某些公知为LEC-CAMs的粘附 分子(例如Mel-14、GMP-140和ELAM-1)。
已知C-型凝集素可用作凝集素、调理素、补体激活剂以及细胞相关的 识别分子(Vasta等人1994；Spiess 1990；以及Kery 1991)。例如，巨噬 细胞甘露糖受体可起清除剂的作用(Shepherd等人，1990)，并且介导致 病有机体(包括卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)(Ezekowita等人，1991) 和白色念珠菌(Candida albicans)(Ezekowitz等人(1990))的摄取。血清 甘露糖结合蛋白模拟Clq通过经典途径激活补体的能力。该凝集素的基因 突变易导致严重的复发感染、腹泻并且不能茁壮成长(Reid等人1994)。 这样，C-型凝集素显示出具有生物意义的多样功能。
C-型凝集素的“天然”配体并不一定是糖类组成成分。例如，现在公 知，CD23(FCεRII)以不依赖于糖类的方式来识别IgE，而正如通过其与 Gal-Gal-Nac(Kijimoto-Ochiai等人1994)的结合以及通过其CDR序列所 验证的，CD23(FCεRII)属于C-型凝集素族；IgE的酶促去糖基化形式 以及在大肠杆菌(E.Coli)中产生的重组(非糖基化的)IgE均可结合CD23 (Vercelli等人1989)。因此，一些C-型凝集素识别它们的天然配体中的 多肽序列。
在DCs表面上已经鉴定出若干C-型凝集素。首先，Jiang等人克隆了 被NLDC-145 mAb所识别的蛋白质，其中所述NLDC-145 mAb是最广泛 使用的针对鼠DC的mAb之一(Jiang等人1995)。该蛋白质(现在称 作DEC-205)发现是C-型凝集素家族的一个新成员，其含有10个不同的 CRD。其次，Sallusto等人报道，人DC表达巨噬细胞甘露糖受体(MMR)， 这些受体还含有多个CRD(Sallusto等人，1995)。基于以下观察，业已提 出这些受体可介导由DC进行的糖基化分子的胞吞作用：a)抗DEC-205 的多克隆兔抗体不仅结合到DC表面的DEC-205上，而且其次还被内化； b)这些DC有效激活了可与兔IgG反应的T细胞系；以及c)用甘露聚糖 (甘露糖受体竞争剂)可有效封闭由DC导致的FITC-葡聚糖的内化(Jiang 等人1995；以及Sallusto等人1995)。关于细胞类型特异性，现在已知 胸腺、肠道和肺内的B细胞以及上皮细胞以较低水平表达DEC-205 (Witmer-Pack等人1995；以及Inaba等人1995)，而巨噬细胞甚至还 更充足地表达MMR(Stahl 1992)。在DC表面还发现了其它C-型凝集素， 包括DCIR、MDL-1、NURPIA、Dectin-2、CLEC-1、CLEC-2、Langerin 以及DC-标志物。
变态反应
变应性应答(包括那些变应性哮喘和变应性鼻炎)的特征在于早期应 答，它出现在变应原暴露的几秒到几分钟内，并且其特征在于嗜伊红性粒 细胞浸润至变应原暴露位点。具体地说，在变应性应答的早期，Th2-型淋 巴细胞的激活刺激了抗原特异性IgE抗体的产生，而后者又引发肥大细胞 和嗜碱性粒细胞释放组胺和其它炎症介质。在后期应答中，由CD4+Th2 细胞产生的IL-4和IL-5的量升高。这些细胞因子对募集嗜伊红性粒细胞 至变应原暴露位点时似乎起到重要作用，在该位点处导致组织损伤和功能 紊乱。
目前，对变应性紊乱的抗原免疫治疗方法包括在称作脱敏治疗的方法 中皮下注射少量但却是逐渐增大的抗原量。抗原免疫治疗方法现在只能达 到减轻病情的目的但却不能达到治疗目的(Weber(1997)美国医学会杂志 (JAMA)278：1881-1887；Stevens(1998)比利时临床学报(Acta Clinica Beligica)53：66-72：以及加拿大过敏反应和临床免疫学学会(Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology)(1995)加拿大医学协会杂志 (Can.Med.Assoc.J.)152：1413-1419)。
开始接受这种治疗的许多病人不能完成所规定的方案，并且如果超过 一个星期不进行注射，病人就必须再重新开始整个治疗方案。业已鉴定了 许多抗原并通过重组方式产生了它们(参见Baldo等人(1989)变态反应 (Allergy)44：81-97；Baldo(1991)免疫学最新观点(Curr.Opin.Immunol.) 3：841-850；Blaser(1994) Ther.Umsch 51：19-23；以及Valenta等人(1996) 实验医学生物学进展409：185-196)。
抗原免疫治疗方法存在诱导潜在致死的IgE介导的过敏反应的危险， 但不实施细胞因子介导的变应性后期应答。这种治疗方法已被描述成“具 有导致灾难的可能性”(Weber(1997))。抗原免疫治疗方法的另一个重 大问题是，副反应特别是过敏反应的危险显蓍减少了抗原剂量，其中所述 抗原剂量为每次施用的量及一段时间所施用的量。于是，传统的变态反应 的免疫治疗方法是延长的，并因此而费时、不便利并且昂贵。
另一种治疗IgE相关的紊乱(例如变态反应)的方法包括服用抑制组 胺释放的化合物。许多此类药物是当作非处方药物来购得的。其它药物包 括抗IgE结合抗体。然而，这种方法的不足之处是，它只能掩蔽症状，而 不能达到永久治愈或者保护的目的。
发明简述
本发明涉及富含DCs及其亚类的造血细胞群的富集方法。本发明还提 供了从其得到的富含细胞和细胞群的合物。还提供了制备遗传修饰DCs的 方法。还提供了遗传修饰DCs的组合物。还包括这些细胞的使用方法。还 提供了特异的BDCA-2和BDCA-3抗原结合片段以及由此识别的抗原。
本发明包括由抗体AC144、AD5-1311、AD5-20E5、AD5-17F6、 AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或AD5-8E7特异识别的DCs亚类特异 性抗原结合片段。本发明包括特异于抗原BDCA-2(SEQ ID NO：2)表位 的抗原结合片段。本发明包括特异于抗原BDCA-3的表位的抗原结合片段。
本发明包括基本上被分离或被浓缩的DC群或亚群，这些DC群或亚 群被本发明的抗原结合片段特异性识别。这些抗原结合片段可以是AC144、 AD5-1311、AD5-20E5、AD5-17F6、AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或 AD5-8E7中的任一个，或BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4的特 异性抗原结合片段中的任一个。识别神经纤毛蛋白-1的抗原结合片段也识 别BDCA-4并且在本文中是适用的。
本发明还包括DCs群或者亚群，其中基本上所有的细胞都表达或者基 于对BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的至少之一的表达而分 离、浓缩或计数。这些细胞可悬浮在任一生理可接受的赋形剂中。优选的 是，该赋形剂为药理学可接受的。
本发明还包括获得富集DCs的造血细胞组合物的方法，该方法包括使 人造血细胞的混合物分离成一个组分，而在该组分中至少80％的细胞为 BDCA-1+。
本发明还包括获得富集DCs的造血细胞组合物的方法，该方法包括使 人造血细胞的混合物分离成一个组分，而在该组分中至少80％的细胞为 BDCA-2+。
本发明还包括获得富集DCs的造血细胞组合物的方法，该方法包括使 人造血细胞的混合物分离成一个组分，而在该组分中至少80％的细胞为 BDCA-3+。
本发明还包括获得富集DCs的造血细胞组合物的方法，该方法包括使 人造血细胞的混合物分离成一个组分，而在该组分中至少80％的细胞为 BDCA-4+。
本发明还包括分离出基本上纯的DCs亚类的方法，该方法包括以下步 骤：a)得到人造血细胞混合物；以及b)基本上将细胞从混合物中分离出 来，其中所述细胞特异性地被称为BDCA-2的抗原特异性抗原结合片段识 别。
本发明还包括分离出基本上纯的DCs亚类的方法，该方法包括以下步 骤：a)得到人造血细胞混合物；以及b)基本上将细胞从混合物中分离出 来，其中所述细胞特异性地被称为BDCA-3的抗原特异性抗原结合片段识 别。
本发明还包括分离出基本上纯的DCs亚类的方法，该方法包括以下步 骤：a)得到人造血细胞混合物；以及b)基本上将细胞从混合物中分离出 来，其中所述细胞特异性地被称为BDCA-4的抗原特异性抗原结合片段识 别。
本发明还包括DCs的计数方法，包括以下步骤：a)获得细胞混合物； 以及b)用抗原结合片段标记细胞，而抗原结合片段特异于抗原BDCA-1、 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一个或多个。
本发明还包括调节DCs的免疫能力的方法，该方法包括：分离出基本 上纯的DCs群或者亚群；以及调节DCs的钙动员。
本发明还包括用于筛选受试剂，得到药学有效试剂的方法，该方法包 括：用抗原结合片段分离出基本上纯的DCs群或者亚群，该抗原结合片段 特异于抗原BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一个或多 个；用受试试剂筛分所分离的细胞；监测细胞对受试试剂的应答；将细胞 对受试试剂的应答与暴露于对照剂的细胞进行比较；以及确定受试试剂是 否调节所分离细胞的任一免疫特性。
本发明还包括通过改变DC动员钙的能力来调节DCs的免疫特性的方 法。
本发明还包括最好是在生理上可接受的赋形剂中的免疫原的和免疫调 节的DCs组合物。
本发明还包括治疗生理条件的方法，该方法包括给需要接受治疗的受 试者施用有效量的免疫原的或免疫调节的DCs组合物。
本发明还包括制备DC细胞因子的方法，该方法包括：用抗原结合片 段分离基本上纯的DCs群或者亚群，该抗原结合片段特异于BDCA-1、 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一个或多个；以及将细胞因子从 细胞或者细胞产物或上清液中分离出来。
本发明还包括调节DC细胞因子产量的方法，该方法包括：用抗原结 合片段分离基本上纯的DCs群或者亚群，该抗原结合片段特异于BDCA-1、 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一个或多个；以及用调节DC细 胞因子产量的试剂处理细胞。
本发明还包括体内调节DC细胞因子产量的方法，该方法包括给需要 接受调节的受试者施用有效量的调节DC细胞因子产量的试剂。
本发明还包括产生特异于抗原的抗体的方法，该方法包括给所需受试 者施用有效量的基本上纯的载有抗原DCs群或者亚群，并且用抗原结合片 段进行分离，该抗原结合片段特异于BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和 BDCA-4中的任何一个或多个，其中DCs被调节，以便诱导Th2应答。
本发明还包括产生特异于抗原的T细胞或体液免疫应答的方法，该方 法包括给所需受试者施用有效量的基本上纯的载有抗原的DCs群或者亚 群，并且用抗原结合片段进行分离，该抗原结合片段特异于BDCA-1、 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一个或多个，其中细胞被调节以 便诱导Th1应答。
本发明还包括如下制备的多肽：首先于重组宿主细胞中表达多肽，然 后将被表达的多肽从总的重组宿主细胞成分中纯化出来，其中所述多肽含 有约5个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
本发明还包括纯化的多肽及其组合物，其中所述多肽含有约5个来自 SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
本发明还包括连接到不是SEQ ID NO：2的多肽氨基酸序列上的多肽 氨基酸序列的融合蛋白质，其中所述氨基酸序列含有约5个来自SEQ ID NO：2的连续氨基酸残基。
本发明还包括含有BDCA-2的至少一个剪接变体的多肽。
本发明还包括多核苷酸或其互补序列，它们编码BDCA-2其剪接变体 或片段的至少5个连续氨基酸残基。
本发明还包括含有多肽或其互补系列的重组宿主细胞，所述多核苷酸 或互补序列编码BDCA-2、其剪接变体或片段的至少5个连续氨基酸残基。
本发明还包括抑制DC与T细胞的相互作用的方法，该方法包括使含 有DC和T细胞的组合物与有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4 与T细胞相互作用的试剂接触。
本发明还包括治疗炎症的方法，该方法包括给所需受试者施用一定量 的试剂，该试剂可有效抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4与T细胞的相 互作用，从而减轻受试者体内的炎症。
本发明还包括通过在细胞内表达BDCA-2反义多核苷酸而抑制细胞内 的BDCA-2表达的方法。
本发明还包括含有多核苷酸或其互补系列的转基因动物，所述多核苷 酸或其互补序列编码BDCA-2、其剪接变体或片段的至少5个连续氨基酸 残基。
附图简述
图1是来自用菲可帕克密度梯度离心技术分离的外周血单核细胞 (PBMC)的流血细胞计数分析的点绘图。在图1中，示出了PBMC上的 BDCA-2、BDCA-3和CD1c(BDCA-1)的表达。
图1A表示分别用FITC结合的抗BDCA-2 mAb(AC144)、抗BDCA-3 mAb(AD5-5E8)和抗CD1c mAb(AD5-8E7)以及PE结合的抗TCRαβ 异源二聚体、CD14、CD19和CD56的mAb对PBMC染色。数字表示各 自象限中的细胞百分数。碘化丙锭的荧光和光散射信号可用于选通活细胞。
图1B示出了(a)PBMC，(b)选通的BDCA-2+细胞，(c)选通的 BDCA-3+细胞以及(d)选通的CD1c+细胞的散射曲线。
图2表示在三种不同的血液DC亚类上表达了BDCA-2、BDCA-3、 BDCA-4和CD1c(BDCA-1)。通过耗竭CD3、CD11b和CD16阳性细胞、 随后富集CD4阳性细胞而将血液DC从PBMC中分离出来。利用光散射 特性(上-左点绘图)和抗-HLA-DR-Cy5染色与抗-Lin-FITC(抗-TCRαβ、 CD14、CD19和CD56)染色对比(上-中点绘图)可证实血液DC的纯度。 注意，只有极少数lin+细胞存在。血液DC上BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 和CD1c的表达特征是，用PE结合的以及FITC结合的抗CD11c、CD123 和自身抗原的mAb进行一系列的双色染色。注意，BDCA-2、BDCA-3、 BDCA-4和CD1c每一个都专门仅仅表达在三个不同血液DC亚类之一上。 按照用CD123-PE和CD11c-FITC对血液DC进行的染色(上-左点绘图) 来定义这些亚类：CD11c-CD123亮血液DC；CD11c亮CD123暗血液DC； 以及CD11c暗CD123-血液DC。
图3绘出了PBMC上BDCA-4的表达。示出的是用FITC结合的抗 BDCA-2的mAb(AC144)和PE结合的抗BDCA4的mAb(AD5-17F6) 给PBMC进行双色染色。注意，检测到一些单一阳性(BDCA-2+BDCA-4-) 和(BDCA-2-BDCA-4+)PBMC。
图4示出了纯化的血液DC在存在IL-3的时，培养不同时间后 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的表达。纯化的血液DC在存在r1L-3存 在时，培养0小时、1小时、3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、 24小时、36小时和48小时，然后进行流式细胞计数，分析CD11c、BDCA-3、 BDCA-2和BDCA-4的表达。(A)直方图示表示分别用PE结合的抗 -BDCA-2mAb(AC144)和抗-BDCA-4mAb(AD5-17F6)(粗线)以及 PE结合的同种型匹配的对照mAb(淡线)给通选CD11c-和CD11c+血液 DC进行染色。点绘图示出了用CD11c-PE与抗-BDCA-3(AD5-5E8)生 物素/链亲和素-APC对血液DC进行染色的对比。(B)曲线图示出了抗 -BDCA-2-PE、抗-BDCA-4-PE以及抗-BDCA-3生物素/链亲和素-APC分 别对CD11c-(▲)和CD11c+(■)DC进行染色而得到的平均荧光强度 (MFI)值。对于BDCA-2和BDCA-4，通过分别从用AC144和AD5-17F6 得到的值中减去用同种型对照mAb得到的值而计算出MFI值。对于 BDCA-3，通过从用AD5-5E8得到的值中减去无任何染色mAb(自发荧光) 而得到的值而计算出MFI值。
图5示出了所有六个外显子均被表达的一种BDCA-2同工型的氨基酸 序列(SEQ ID NO：2)。
图6表示BDCA-1特异的mAb AD5-8E7阻断CD1c mAb M241与 MOLT-4细胞的结合。MOLT-4细胞与饱和量的AD5-8E7 mAb(粗线) 或者同位素对照mAb(淡线)一起预温育，然后用PE结合的CD1c mAb (M241)进行染色。
图7示出了在Mo-DC和来自CD34+细胞的DC(CD34-DC)上 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的表达。通过分别用CD14和CID34 mAb 结合的微珠直接进行磁标记而免疫磁性纯化CD14+单核细胞以及CD34+ 造血祖细胞。在rGM-CSF和rIL-4存在时，对纯化的单核细胞培养7小 时，并且在rflt3-配体、rTGF-β1、rTNF-α、rSCF和rGM-CSF的存在下， 对纯化的CD34-DC培养11小时。培养期之后，用CD1a-FITC、 CD1c-PE(AD5-8E7)、抗-BDCA-2-PE(AC114)、抗-BDCA-3-PE(AD5-5E8) 和抗-BDCA-4-PE(AD5-17F6)给细胞染色。直方图分别示出了(A)Mo-DC 和(B)CD34-DC(粗线)的染色。淡线表示用同种型对照mAb进行的染 色。除了最左面的直方图外(CD1a染色)，在(B)中示出了通选的CD1a+ 细胞。
图8表示对抗-BDCA-2 mAb标记的BDCA-2+细胞的培养导致快速的 mAb内化。于4℃用FITC结合的抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)标 记PBMC.在所指示的时间段于37℃下进行温育，然后在4℃用PE结合 的兔抗-小鼠IgG1 mAb(X56)和Cy5-结合的CD123 mAb(AC145，IgG2a) 染色。示出的是通选的BDCA-2+CD123+细胞的抗-BDCA-2-FITC(■)和 兔抗-小鼠IgG1 mAb-PE(▲)染色的MFI值。
图9表示免疫磁性纯化的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的 形态学。通过用PE结合的一级mAb(AD5-8E7、AC144和AD5-5E8)和 抗-PE mAb结合的微珠直接进行磁标记，然后用MACS富集被标记细胞， 可以从PBMC中分离出CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+细胞。这些点绘图 表示在磁富集CD1c+(上部点绘图)、BDCA-2+(中部点绘图)和BDCA-3 +(下部点绘图)之前(左边的点绘图)和之后(右边的点绘图)，分别用 HLA-DR-FITC和PE结合的mAb给PBMC染色。右侧的这三个图表示 细胞离心之后，被分离的CD1c+(上图)、BDCA-2+(中图)和BDCA-3 +(下图)的May Grunwald/吉姆萨染色。注意，在富含CD1c+细胞的图 中可看到小淋巴细胞。这些是CD1c+B细胞。
图10表示培养后CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+上的MHCII类、CD83 和共刺激分子的上调。所纯化的CD1c+(A)、BDCA-2+(C)和BDCA-3 +(B)分别在培养基(CD1c+和BDCA-3+BDC)中培养1天或者在含Ril-3 和在CD32-转染的L细胞(BDCA-2+DC)上的抗-CD40 mAb的培养中培 养两天。单核细胞于含rGM-CSF和rIL-4的培养基中培养7天，可产生 “未成熟的”Mo-DC(D)。将未成熟的Mo-DC于含TNFα的培养基中 再培养3天，可产生“成熟的”Mo-DC(E)。直方图表示分别用CD1a-FITC、 CD80-PE、CD83-PE、CD86-PE和HLA-DR-PE染色的细胞(粗线)。淡 线表示用同种型和荧光发色团配对的对照mAb染色的细胞。
图11表示与纯化的CD3+T细胞相比，新鲜分离的CD1c+、BDCA-2 +和BDCA-3+血液DC的胞吞能力。所分离的CD1c+DC(◆)、BDCA-2 +BDC(▲)、BDCA-3+DC(■)和CD3+T细胞(*)于37℃在含1mg/ml Lucifer Yellow(LY)的培养基中温育0.1 5、45和75分钟，用冰冷的 PBS/EDTA/BSA洗涤三次，然后利用流式细胞计数方法进行分析。示出的 是在减去于4℃无LY时温育之后得到的MFI值之后的LY荧光的MFI 值。
图12绘出了BDCA-2的cDNA序列(seq id no 1)。
图13表示仅用抗-BDCA-2 mAb(A)和/或抗-BDCA-2加交联的二级 mAb(B、D、E)，可诱导免疫磁性纯化的BDCA-2+BDCA-4+血液DC(A、 B)和BDCA-2转染的U937细胞(D)胞内的Ca2+动员，但是却不能在非 转染的U937细胞(E)中做到这一点。用抗-BDCA-4 mAb和交联的二级 mAb将BDCA-4连接至免疫磁性纯化的BDCA-2+BDCA-4+BDC上不诱导 胞内Ca2+动员。示出的是Indo-1-荧光(Y-轴)针对时间(X-轴，1024值 对应于204,80秒)的依赖于Ca2+的504nm/525nm之比。A是BDCA-2+ BDCA-4+血液DC、抗-BDCA-2(AC144，IgG1)。B是BDCA-2+BDCA-4 +血液DC、抗-BDCA-2(AC144，IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。C 是BDCA-2+BDCA-4+血液DC、抗-BDCA-4(AD5-17F6，IgG1)加兔 抗-小鼠IgG1(X56)。D是BDCA-2转染的U937细胞、抗-BDCA-2(AC144， ‘IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。E是未转染的U937细胞、抗-BDCA-2 (AC144，‘IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。
图14表示将BDCA-2而不是BDCA-4与特异性mAb连接，随后用二 级交联mAb抑制I型干扰素的分泌，其中所述I型干优素是由来自血液或 扁桃体的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC对流感病毒株PR8的刺激反应 而分泌的。在以下物质的存在下，来自新鲜分离的血液(A)或扁桃体(B) 的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC被培养24小时：只存在IL-3(对照)； IL-3、抗-BDCA-2 mAb和兔抗-小鼠IgG1 mAb(AC144+RamG1)；IL-3、 抗-BDCA-2 mAb、兔抗-鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(AC144+RamG1 +FLU)；IL-3和流感病毒株PR8(FLU)；IL-3、抗-细胞角蛋白mAb、 兔抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(CK13+RamG1+FLU)；IL-3、 抗-BDCA-4 mAb、兔抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(17F6+RamG1 +FLU)。参照标准的I型干扰素(U/ml)曲线，用生物分析法测定培养 上清液中的所分泌的I型干扰素(U/ml)。
图15表示利用所分离的表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC，将 抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)呈递给特异于小鼠IgG1的T细胞克隆。 与抗-ILT-3mAb(ZM3.8，IgG1，▲)和抗-细胞角蛋白mAb(CK3-11D5， IgG1，●)相比，BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC能够更有效地将抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1，■)呈递给T细胞。
图16示出了BDCA-2和BDCA-4在扁桃体浆细胞样CD123+DC上的 表达。
图17表示用抗-BDCA-4mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))将神经 纤毛旦白-1(GenBank登记号003873)从神经纤毛旦白-1-转染的PEA细 胞(NP)而不是未转染的PAE细胞(P)的细胞裂解物中免疫沉淀出来。 用BDCA-4特异的mAb AD5-17F6(ML)或神经纤毛旦白-1特异的mAb(来 自麻省波士顿儿童医院Shay Soker(Shay Soker，Children’s Hospital， Boston，MA(S)))通过SDS-PAGE和Western印迹来分析所沉淀的蛋白 质。
图18表示将BDCA-2而不是BDCA-4与特异性mAb连接，随后用二 级交联mAb抑制IFN-X的分泌，其中所述IFN-X是由来自血液或扁桃体 的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC响应poly I：C的刺激反应而分泌的。来 自血液的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC与10μg/ml的AC144 mAb(2 和4)或小鼠IgG1 mAb(CF6B，抗-TPO，1和3)在37℃下培养30分 钟。
图19表示来自CLONTECH的人多组织cDNA系列的分析(泳道1： 心脏；泳道2：脑；泳道3：胎盘；泳道4：肺；泳道5：肝；泳道6：骨 骼肌；泳道7：肾；泳道8：胰腺；泳道9：脾；泳道10：胸腺；泳道11： 睾丸；泳道12：卵巢；泳道13：小肠；泳道14：淋巴结；泳道15：骨髓； 泳道16：胎儿肝脏；泳道17：扁桃体)，以及对血液白细胞的不同群体所 制备的cDNAs的分析(泳道18：T细胞；泳道19：B细胞；泳道20：NK 细胞；泳道21：单核细胞；泳道22：CD11亮CD123低BDC；泳道23：用 于BDCA-2 cDNA的CD11c-CD123亮浆细胞样DC)。对照为G3PDH。
图20示出了BDCA-2转录本的剪接变体。利用表达分析中所用的 BDCA-2的特异性引物、通过RT-PCR来分析剪接变体。将所扩增片段克 隆到质粒载体上并测序。
图21示出了Dectin-2转录本的剪接变体。
图22表示BDCA-2和小鼠Dectin-2的mRNA序列对比，示出了所扣 除的内含子的精确部位。在图23中，*代表在所有对比序列中的相同保守 残基，：代表保守取代，·代表半保守取代，阴影部分表示保守的糖识 别结构域(CRD)，斜体表示推定的跨膜结构域。下列符号着重指出在C 型凝集素间CRD中的强烈保守残基：     H 疏水的     A 脂肪族的     C 半胱氨酸     G 甘氨酸     E 谷氨酸     W 色氨酸     Δ 芳香氨基酸     + 糖类的钙依赖性结合中所涉及的残基   +P++ 确定糖结合特异性的区域
图23示出了人BDCA-2、人DCIR和小鼠Dectin-2的氨基酸序列对比。
图24示出了用BDCA-3特异的mAb AD5-14H12(IgG1)从表面生物 素化的HD-MY-Z细胞的细胞裂解物中免疫沉淀出的BDCA-3。为控制特 异性，使用了CD19特异的mAb SJ25-C1(IgG1)。利用链亲和素-过氧化物 酶通过SDS-PAGE(4-12％)和Western印迹来分析所沉淀的蛋白质。注 意，BDCA-3特异的mAb AD5-14H12从HD-MY-Z细胞中特异性免疫沉 淀出大约100kD的细胞表面蛋白质。于是，BDCA-3具有100kD的表观分 子量。
发明详述
本发明涉及富集富含DCs及其亚类的细胞群的方法。本发明还提供了 由该方法获得的富含DCs和细胞群的组合物。还提供了用于修饰细胞的方 法及组合物。还提供了修饰细胞(包括遗传修饰细胞)的组合物。还提供 了这些修饰和未修饰细胞的使用方法。还提供了抗原结合片段以及被其识 别的抗原。
此处所描述的是针对免疫磁性纯化的CD4+lin-DC的新mAb系列，该 系列可鉴定三种DC抗原：BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。BDCA-2和 BDCA-3是新的。对于BDCA-4，虽然以前没有将其描述成DC特异的抗 原，但是该抗原已经被鉴定为神经纤毛旦白-1，即脑衰蛋白/semaphorin家 族的一种介导神经细胞导向的受体，(He等人(1997)细胞(Cell) 90：739-751)。
在未培养的人血液中，BDCA-2和BDCA-4被严格限定为浆细胞样的 CD123亮CD11c-DC所表达，而BDCA-3被限定为一小群CD123-CD11c暗 DC所表达。该BDCA-3+DC群与经典的CD123暗CD11c亮DC一样享有许 多免疫表型特性，但是却不象CD123暗CD11c亮DC，该BDCA-3+DC缺乏 对CD1c(BDCA-1)、CD2和若干Fc受体的表达。
未纯化的DCs来源可以是本领域内公知的任何一种来源，例如骨髓、 胎儿、新生儿或成人或其他造血细胞来源(诸如胎儿的肝脏、外周血或者 脐带血、扁桃体、淋巴结、鼻粘膜、脾、皮肤、气道上皮、肺、肝内脏、 集合淋巴小结等)。还可从培养细胞中分离出DCs(诸如由祖细胞衍生的 DCs)。可用多种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可最早除去非DCs。 mAbs尤其可用于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记物，用于 阳性和阴性选择。
如果需要的话，可用相对粗略的阴性细胞分选法来最早除去大比例的 终末分化细胞。例如，开始时可用磁珠分离法来除去大量的无关细胞。在 分离DCs之前将除去至少约80％、通常是至少约70％的总量细胞。优选 地，利用阳性选择将DC直接从细胞源中分离出来。
用于分离的方法包括(但不限于)：密度梯度离心；形成玫瑰花结； 与调节细胞密度的微粒的偶联；利用抗体包被的磁珠或者抗体包被的铁液 (nonoporticles)进行的磁分离；亲和色谱；与mAb结合的细胞毒试剂或 用于与mAb连接的细胞毒试剂(包括但不限于补体和细胞毒素)；以及 用附着在固相基质(例如板)上的抗体进行的淘选，以及淘析或者任何其 他便利的技术。
提供准确分离和分析的技术包括(但不限于)磁珠分离和流式细胞术， 其中流式细胞术可具有不同的复杂程度例如各种颜色通道、低角度以及钝 角光散射检测通道、阻抗通道等等。
通过采用与死细胞相关的染料例如碘化丙啶(PI)，可针对死细胞来 选择细胞。优选的是，将细胞收集在含2％血清(例如胎牛血清(FCS)) 或人血清白蛋白(HSA)的培养基，或任一其他合适的最好是无菌等渗的 培养基。对于生理指征，优选HAS。细胞的遗传修饰可以在其维持过程中 的任何时候通过以下方式获得：用重组DNA构建体转导基本上均一的细 胞组成、用RNA转染、细胞融合、负载抗原以及本领域公知和/或本文所 描述的多种方法。
对于细胞的修饰，可采用逆转录病毒载体，但也可使用任一其他适宜 的载体、递送系统或者细胞修饰法。这些包括：例如腺病毒、腺相关病毒、 人工染色体(由酵母衍生的)以及由抗原源(例如肿瘤)衍生的RNA。这 种遗传修饰即便有，也不用是永久的，因为成熟的DCs的寿命是有限的。 遗传方法可用来表达外源(肿瘤的、病毒的、寄生物等的)抗原或者DCs 中的自身抗原，以便诱导免疫性或耐受性。也可用自杀基因控制修饰的寿 命，以限定治疗(类似于采用T细胞)。
转导方法包括本领域内公知的任何方法，它包括(但不限于)：诸如 用由Bregni等人描述的方法(Bregni等人(1992)血液80：1418-1422)直 接将细胞与生产者细胞共培养，或者诸如用由Xu等人描述的方法(Xu等 人(1994)实验血液学(Exp.Hemant.)22：223-230；以及Hughes等人(1992) 临床研究杂志(J.Clin.Invest.)89：1817)，将细胞与单独的病毒上清液 一起培养，或与含有或不含有合适生长因子和聚阳离子的病毒上清液一起 培养。
将正在表达抗原或已载有抗原的修饰细胞重新导入宿主，以呈递该抗 原，此后T细胞被激活、无反应或者缺失，并且是专门针对该抗原的。通 常，合适的抗原包括那些被病毒感染的细胞、或者癌细胞、细菌、酵母、 原生动物表达的抗原、自身抗原(耐受原)以及变应原所表达的抗原。更 具体地说，合适的抗原包括(但不限于)：病毒蛋白质、癌细胞的蛋白质、 组织特异的蛋白质或者耐受原蛋白质。T细胞的“诱导”包括诸如利用缺 失或变态反应使抗原特异的T细胞失活。失活尤其可用来分别在例如器官 移殖和自身免疫紊乱中建立或者重新建立耐受性。可用本领域内公知的任 一方法施用经修饰的DCs，这些方法包括(但不限于)：静脉施用、皮下 施用、结节内施用并直接到达胸腺。优选静脉施用(IV)。
通常，细胞免疫治疗方法包括从人类宿主中移出骨髓白细胞收获体或 者其他细胞源，然后将细胞从来源中分离出来。同时，如果宿主将进行造 血干细胞移殖，可处理宿主，使其天生的造血能力部分、基本上或者完全 被消除。在该期间可修饰被分离细胞，以便提供具有目的修饰的细胞。在 完全消除造血能力的情形下，还将需要增多干细胞。然后将细胞或修饰细 胞重新返回到宿主中，以便提供新的造血能力。细胞移出、宿主消除以及 干/祖细胞再生的方法在本领域内都是公知的。
可用任一生理上可接受的载体施用(通常为血管内的、结节内的和皮 下的施用)修饰细胞。通常施用至少1x105个细胞，优选的是1x106个细 胞或更多。可用注射、导管等方式施用这些细胞。如果需要的话，也可包 含因子，这些因子包括(但不限于)：白细胞介素(例如IL-2、IL-3、IL-4、 IL-12和flt-配体以及其他白细胞介素)、集落刺激因子(诸如G、M-和 GM-CSF)、干扰素(诸如γ-干扰素)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，它们是 指任何长度的氨基酸残基聚合物。该聚合物可是线性的或者分支的，它可 包括修饰的氨基酸残基或者氨基酸类似物，并且可被非氨基酸残基的化学 成分所间断。这些术语还包括被天然修饰或者被间插修饰的氨基酸聚合物； 这些方法包括(但不限于)：二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷 酸化或者其他任何操作或修饰方法(诸如与标记物或生物活性成分结合)。 除非另外指明或者暗示，否则术语“抗原结合片段”包括具有免疫特异性 的任何多肽单体或者聚合物，包括完整的抗体，以及较小或者较大的功能 等同的多肽(正如本文所描述的)。
1.抗原结合片段及其组合物
在本发明包括特异识别DCs的抗原结合片段。即，在DCs上可找到 这种抗原，从而识别该抗原的抗原结合片段优选地识别DCs或其亚类或者 与DCs或其亚类结合。或者，正如BDCA-4那样，在其他细胞类型中可找 到该抗原；但是在造血细胞内，该抗原主要存在于DCs上。
本发明还包括包含被分离的抗原结合片段的物质的组合物，其中所述 抗原结合片段可特异性结合到至少一种DC抗原上。优选的是，该抗原结 合片段为称为AC144、AD5-13A11、AD5-20E5、AD5-17F6、AD5-4B8、 AD5-5E8、AD5-14H12以及AD5-8E7的mAb，或者是由这些mAb衍生 的。表1示出了每种DC特异的mAb和该mAb同种型所识别的抗原和表 位。
                            表1   抗原   抗体 表 位   同   种   型 CD11c亮 CD123c低 DC CD11c低 CD123- DC CD11c- CD123亮 DC 其他 白细胞 CD1c   AD5-8E7  1A  IgG2    a     +     -     -  B细胞  亚类 BDCA-2   AC144  2A  IgG1     -     -     +    - BDCA-2   AD5-   13A11  2A  IgG2    a     -     -     +    - BDCA-2   AD5-5B8  2A  IgG1     -     -     +    - BDCA-3   AD5-5E8  3A  IgG1     -     +     -    - BDCA-3   AD5-   14H12  3B  IgG1     -     +     -    - BDCA-4   AD5-   17F6  4A  IgG1     -     -     +    -
在未培养的人血液中，BDCA-2和BDCA-4由CD123亮CDC11c-DC 群来表达。该DC群现在通称为浆细胞样DC。用BDCA-2或BDCA-4作 为浆细胞样DC的免疫磁性分离和/或流式细胞术鉴定的表面标记物，本文 以这些细胞的频率、免疫表型、形态学、胞吞能力以及成熟来表示的结果 与以前的报告完全一致，其中使用了大量的白细胞抗原。这清楚地表明， 这两种抗原都可用作未培养的人血液中浆细胞样DC的标记物。基于 BDCA-2和BDCA-4的表达，对扁桃体细胞的染色表明(图16)，外周淋 巴器官中的T细胞区域相关的浆细胞样DC还可与其他淋巴组织相关的 DC群(例如生发中心DC、交错突DC以及滤泡DC)区别开。
与BDCA-2不同，BDCA-4还在一些体外分化的DC群上表达：(1) 与BDCA-2相反，BDCA-4在Mo-DC和CD34-DC上都表达；(2)一旦 浆细胞样DC在培养时存在IL-3介导的成熟，那么其上BDCA-2的表达就 完全被下调了，而在所培养的浆细胞样DC上BDCA-4的表达实际上是上 调的；以及(3)与BDCA-2相反，BDCA-4由大部分所培养的CD11c+DC 在12小时之内表达，但是否只是较大的CD1c+CD11c亮群如此，还是较小 的CD1c-CD11C暗CD123-群也如此，还不是十分清楚。在未培养的人血液 中不存在BDCA-4+细胞，而存在浆细胞样DC，这一发现实际上指明，在 血液中不存在以上所提到的体外分化的BDCA-4+DC的对应细胞。
通过抗-BDCA-2 mAb而进行的BDCA-2的交联可诱导抗原-Ab复合 物的迅速内化。这类似于DC成熟后被下调的其他胞吞受体诸如Langerin (Valladeau等人(2000)免疫(Immunity)12：71-81)。因此，BDCA-2可 能是具有抗原捕获功能的受体。BDCA-2为C-型凝集素，可以在连接之后 被迅速内化(图8)，并且BDCA-2配体被加工和呈递给T细胞(图15)。 这样，与DEC-205类似，BDCA-2具有抗原摄入和将配体呈递至T细胞的 功能。
在未培养的人血液中，BDCA-3的表达被限制在一小群CD1c-CD11C暗 CD123-DC上。关于表型、形态学、胞吞能力以及成熟条件，该DC群与 CD1c+CD11C亮CD123暗DC群非常类似。然而，免疫表型分析除了显示 BDCA-3和CD1c的表达外，还显示了一些显著的区别：与CD1c+BDC相 反，BDCA-3+BDC不表达Fc受体CD32、CD64和EcoRI，并且它们也不 表达CD2。Fc受体表达的缺乏指明，BDCA-3+BDC不象CD1c+BDC，它 不具有Ig介导的抗原摄取能力(Fanger等人(1996)免疫学杂志 157：541-548；Fanger等人(1997)免疫学杂志158：3090-3098；以及Maurer 等人(1996)免疫学杂志157：607-616)。如本文所示，BDCA-3为100kD 蛋白质。
有证据表明，CD1c+CD11c亮DC与CD1c-CD11c暗DC相反，当前者 与GM-CSF、IL-4和TGF-β1一起培养时则具有获得朗格汉斯细胞特征 的能力(表达Lag抗原、E-钙粘着蛋白和Langerin，以及存在伯贝克颗粒)。 如果BDCA-3+DC和CD1c+DC代表相同细胞类型的成熟阶段，那么这也 许表明，BDCA-3+DC已经失去或者还没有获得分化成朗格汉斯细胞的能 力。
与本文所示的结果相反，Ito等人(1999)报道，CD1c+CD11c亮DC 不象CD1c-CD11c暗DC，前者表达CD1a。两种mAb BL-6和B-B5可用于 CD1a的染色，并且当将这两种mAb进行比较时确实可观察到染色强度的 差异(用B-B5染色可能更亮些)。如本文所示，用CD1a mAb BL-6和 HI149的最佳滴度染色DC明显为阴性，而用B-B5染色DC则为阳性。而 且，不象BL-6和HI149，B-B5能对血液中高比例的CD19+B细胞染色。 这样，B-B5的染色模式显然映射的是CD1c mAb而不是CD1a mAb，并 且实际上，CD1c mAb AD5-8E7抑制B-B5与MOLT-4细胞的结合。因此， 我们得出结论，B-B5识别CD1c且CD1c+DC不表达CD1a。
对CD1c+DC进行CD1c、CD2和CD14的染色揭示出，极小比例的 DC以不同程度表达CD14，并且在这些细胞上CD1c和CD2的表达水平 与CD14的表达水平成反比。该观察与线性分化模型一致，其中CD1c+CD2+ CD11c亮CD14-DC是CD14+CD1c-CD1c-CD2-单核细胞的子代，而不是这 两种细胞类型共同前体的子代。这个概念发现进一步被以下观察所支持： 相当比例的CD14+单核细胞已经表达非常低水平的CD2，并且当与 GM-CSF和IL-4一起培养时具有迅速分化为成熟DC的能力，其中所述成 熟DC具有典型的树突状形态学和强大的T细胞刺激功能(Crawford等人 (1999)免疫学杂志163：5920-5928)。
CD1c(BDCA-1)、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4 mAb的使用提供 了一种便利有效的方式，从而将DC群从PBMC、白细胞采集物材料、全 血、扁桃体等中迅速检测、计数和分离出来，而没有明显的功能干扰。这 对它们的进一步的功能和分子特征研究是非常有帮助的，并且对于阐明它 们之间的相互关系也是有用的。而且，易于将DC群分离为均一群体的能 力大大促进了它们的临床应用。抗原结合片段还可用于将DCs从组织，包 括非造血组织(包括但不限于气道上皮、皮肤、肠、肺和肝脏)和造血组 织(包括但不限于扁桃体、脾、淋巴结和胸腺)中检测、计数和/或分离出 来。
正如表达其抗原结合片段的其他细胞那样，分泌抗体的杂交瘤也包括 在本发明中。本发明还包括特异性识别BDCA-2或BDCA-3或BDCA-4 的任何抗原结合片段。如表1和本文所提供的实施例所示，可产生特异性 识别这些抗原的多种类型的mAbs。正如从本文所表示的结果中看到的， 抗原结合片段无需识别相同抗原上的相同表位。本发明包括所有此类抗原 结合片段及其组合物。
术语“抗原结合片段”包括优选地结合到DC或其亚群上的任何部分。 适宜的部分包括(但不限于)：作为结合到目标靶分子上的公知为aptomer 的寡核苷酸(Hermann和Pantel(2000)科学289：820-825)、糖类、凝集 素、Ig片段例如Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv(包括单体和聚合体形式)以 及被分离的H和L链。虽然亲合力和/或亲和力可被改变，但抗原结合片 段仍保留了完整IgG的特异性。
本文所描述的某些化合物、组合物和方法通常涉及抗体及其衍生物， 这些物质已经提供了本文的抗原决定蔟，并且可用标准的免疫化学技术按 常规制备。这些物质包括(但不限于)：诸如通过化学结合作用将抗原结 合片段与另一化合物偶联，或者通过与赋形剂或佐剂混合而缔合。特定的 结合配偶体及其制备方法在本文有所描述，也是本领域内公知的。
虽然还可用其他方法以及这些方法的组合来得到抗原结合片段(也包 括其“衍生物”)，但一般通过基因工程来制备它们。该分类包括(但不 限于)工程肽片段和融合肽。优选的化合物包括含有抗-DC CDRs的多肽 片段、含有细胞因子效应子成分的抗体融合蛋白质、含有佐剂或药物的抗 体融合蛋白质、含有肿瘤细胞衍生的抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫 抗原、酵母抗原、自身抗原或由它们衍生的抗原肽(T细胞表位)的抗体 融合蛋白质，以及单链V区蛋白质。如果抗原结合片段是从人类源分离出 来的，并且在其他细胞类型及其衍生物或者整个人类的染色体或其部分染 色体(例如具有编码VH、DH、JH、VL、JLL、CH、CL基因段的人类染色 体的小鼠)中直接使用或克隆和表达，那么这些抗原结合片段被认为是人 类来源的。
“融合多肽”是在不同部位包括邻接肽区域的多肽，其不是天然存在 的。这些区域通常存在于分别的蛋白质中并且被一起置于融合多肽中；它 们通常可存在于相同的蛋白质中但以一种新的重排方式被置于融合蛋白 中；或者以合成方式排列它们。例如，本发明包括由抗原结合片段的功能 部分和另一肽(例如毒素)组成的重组蛋白质(以及编码该蛋白质的多核 苷酸或其互补序列)。制备这些融合蛋白质的方法在本领域内是公知的并 且例如在WO93/07286中有所描述。
多肽的“功能等同的片段”虽然保留了上下文中所用的相关片段的至 少一个功能特性，但是可以与天然序列不同，它们可存在添加、删除或替 换。
抗原结合片段可用于改善与免疫紊乱有关的临床情况。本发明还包括 抗原结合片段的多肽衍生物以及在诊断、治疗和新试剂的产生中使用这些 组合物的方法。
本发明还包括与化学官能组分结合的抗原结合片段。通常该组分是能 够产生可检测信号的标记物。结合抗原结合片段的这些标记物可用于例如 检测系统中，诸如在多种组织、多种疾病、干细胞移殖以后和免疫毁损治 疗(例如化学疗法和放射)之后定量DCs，以及诸如在化学疗法或自身免 疫治疗之后使DCs成象。此类标记物在本领域内是公知的并且包括(但不 限于)放射性同位素、酶、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合 物、底物辅因子、抑制剂以及磁性颗粒。指导使用这些标记物的一些专利 诸如有：US专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437； 4,275,149；以及4,366,241。这些组分可通过二级试剂(例如第二抗体、蛋 白质A或生物素-亲和素复合物)而进行共价连接、重组连接或结合(共价 或非共价)。
其他功能组分包括(但不限于)：信号肽、增强免疫反应性的试剂、 促进和固相载体偶联的试剂、疫苗载体、生物应答修饰剂、顺磁标记物以 及药物。信号肽包括原核和真核的形式。增强免疫反应性的试剂包括(但 不限于)：细菌超抗原和佐剂。促进与固相载体偶联的试剂包括(但不限 于)：生物素、亲和素或其衍生物。免疫原载体包括(但不限于)任何生 理上可接受的缓冲剂。生物应答修饰剂包括(但不限于)：细胞因子，特 别是肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2、白细胞介素-4(IL-4)、GM-CSF、IL-10、 IL-12、TGF-β以及某些干扰素和趋化因子(MIP-3β、SDF-1、 Lymphotactin、DC-CK1、Eotaxins、IP-10、TARC、Rantes、MIP-1x、 MIP-1B、SLC、1-TAC、MIG、MDC、MCP-1、TCA-3、MCP-2、-3、 -1)(还参见US专利号5,750,119；以及WO专利公开号96/10411；98/34641； 98/23735；98/34642；97/10000；97/10001以及97/06821)。这些趋化因子可 用来吸引其他细胞例如T细胞。
“信号肽”或“前导序列”是一段短的氨基酸序列，它指导新合成的 蛋白质通过细胞膜(通常是真核细胞中的内质网(ER)，以及细菌的内膜 或细菌的内膜和外膜)。信号肽一般位于多肽的N-端，并且在多肽生物合 成与从细胞内分泌之间或穿过ER膜时被酶切去除。因此，信号肽不存在 于所分泌的蛋白质中而仅仅存在于蛋白质产生的过程中。
可通过重组方式制备免疫毒素(包括单链结合物)。多种免疫毒素的 制备在本领域内是公知的，并且这些方法例如在Thorpe等人(1982)，临床 医学中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine)，学术 出版社(Academic Press)，一书中的“Monoclonal Antibody-toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet，”168-190页；Vitatta(1987)科学 238：1098-1104；以及Winter and Milstein(1991)自然349：293-299)。合适 的毒素包括(但不限于)：蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、 假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A链、霉菌 毒素例如霉菌核糖体灭活蛋白(诸如白树素、局限曲菌素和磷脂酶酶类) (一般参见“嵌合毒素(Chimeric Toxins)，”Olsnes和Pihl，药物治疗 (Pharmac.Ther.)15：355-381(1981)；以及“用于肿瘤检测和治疗的单克 隆抗体(Monoloclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)，” eds.Baldwin和Byers，159-179页，224-266，学术出版社(1985))。
例如通过产生融合基因而重组制备化学功能组分，其中所述融合基因偏 码抗原结合片段和来自其它基因(如酶类)的功能区。在基因融合中，这 两个成分存在于同一基因内。另外，利用各种公知的化学工艺的任一种将 抗原结合片段化学键合到组分上。例如，当该组分是蛋白质时，该键合可 以借助同-或异-双官能交联衔接物(例如SPDP、SMCC、碳二亚胺戊二醛 等)。该组分可通过二级试剂进行共价连接或结合，所述二级试剂包括(但 不限于)：二级抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物。顺磁组分及其与抗 体的结合在本领域内是公知的(参见例如Miltenyi等人(1990)细胞计量术 (Cytometry)11：231-238)。
在此处，我们利用最近描述的对侧足垫免疫方法(Yin等人(1997)血 液90：5002-5012)解决了本领域内所描述的难题(O’Doherty等人(1993)； 以及Yamaguchi等人(1995))。该系统利用天然抗原特异的T细胞和B细 胞，这些细胞只要不遇到抗原就可在外周淋巴器官中不断地再循环，但是 一旦它们被抗原激活，就立即在外周淋巴器官内滞留一些天(如果不是几 个星期的话)(Picker等人(1992)免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.) 10：561-591；Butcher等人(1996)科学272：60-66；Bradley等人(1996)免疫 学最新观点(Curr.Opin.Immunol.)8：312：320；Watson等人(1998)细胞粘 附通讯(Cell.Adhes.Commun.)6：105-110；Kearney等人(1994)免疫 1：327-339；Jacob等人(1992)实验医学杂志176：679-687；Ridderstddd等 人(1998)免疫学杂志160：4688-4695；以及Tarlinton(1998)免疫学最新观 点10：245-251)。在本文所提供的例子中，小鼠的左足垫于第-3、0、4、7、 11和14天注射Bristol-8 B淋巴母细胞，而右足垫在第0、4、7、11和14 天注射DC。对共有抗原(例如HLA II类分子)具有特异性的天然B和T 细胞，在左腘淋巴结中于第-3和0天之间被Bristol-8细胞激活并随即滞留 在那儿，而对DC专有的抗原具有特异性的所有淋巴细胞应该在第0天后 仍可于右腘淋巴结中被激活。
这种免疫技术与用于快速分离大量DC的得力方法组合并允许制备一 系列识别三种新DC抗原(BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4)的mAb。在 制备其它DC特异的抗体时使用抗原可使更多传统的用于制造抗体的方法 具有更大的成功机会。
抗体的制备和分离方法在本领域内是公知的(参见例如，Harlow和 Lane(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York))。通 用的抗体纯化方法包括(但不限于)盐沉淀(例如用硫酸铵)；离子交换 色谱(例如，在中性pH下在阳离子或阴离子交换柱上运行并用离子强度 增大的阶段梯度进行洗脱)；凝胶过滤色谱(包括凝胶过滤HPLC)；以 及亲和树脂(如蛋白A、蛋白G、羟基磷灰石或抗-IgG)色谱。还可在含 有DCs或其抗原部分的亲和柱上纯化抗原结合片段。优选的是，先用蛋白 -A-CL-琼脂糖凝胶TM4B色谱、再用DEAE-琼脂糖凝胶TM4B离子交换柱 色谱来纯化片段。
本发明还包括杂交抗体，其中从第一种抗体得到一对H和L链，而从 第二种不同的抗体得到另一对H和L链。为了达到本发明的目的，一对L 和H链来自于抗-DC抗体。在一个例子中，每对L-H链结合到DC特异性 抗原的不同表位上。也可用人源化H或L链形成这样的杂交。本发明还包 括其他双特异抗体例如含有通过其恒定区而将两个独立的抗体共价相连所 得到的抗体。
本发明包括的其他抗原结合片段是H或L链已经被修饰从而可提供其 他性质的抗体。例如，氨基酸序列的变化可导致最终的多肽的免疫原性减 小。该变化的范围从改变一个或多个氨基酸残基到完全重新设计一个区域 例如C区结构域。通常的变化包括(但不限于)那些与补体固定有关的变 化、与膜受体的相互作用有关的变化以及其他效应子功能有关的变化。也 可设计重组抗体，以有助于物质(细胞因子)特异递送至细胞。本发明还 包括肽，在这些肽中已经以一定次序放置了多种非天然存在的Ig结构域生 成。
抗原结合片段的大小可仅仅是为了提供所需功能而需要的最小尺寸。 它随机地包括其他氨基酸序列，这对于抗原结合片段既可是天然的，也可 是来自异源(正如所期望的)。抗-DC抗原结合片段可以只含有来自抗体 V区序列的5个连串的氨基酸残基。还包括具有来自抗体L或H链V区 的7个氨基酸残基的多肽，其中氨基酸残基的数目更优选的是大约10个、 更优选的是大约15个、更优选的是大约25个、更优选的是大约50个、更 优选的是大约75个。甚优选的是，多肽包括整个抗体L或H链V区。
替换的范围从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计区域 例如V区。氨基酸残基替换如果存在的话，优选的是不会有害影响肽的折 叠或功能性质的保守替换。在功能上相关的氨基酸残基组中，可进行保守 取代的是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺； 天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/蛋氨酸；赖氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸 /酪氨酸/色氨酸。抗原结合片段可以是糖基化或非糖基化的，可以被翻译后 修饰(例如乙酰化和磷酸化)或者可以被合成修饰(例如连接标记基团)。
包括L链和H链两者的多肽衍生物可用单独的L和H链形成后组装 得到，或者利用这两条链的表达系统原位组装而形成。通过用包含分开的 L和H链的可转录区的质粒进行转染或者通过用具有每条链的质粒使同一 细胞共转染，可创立这样的表达系统。在第三种方法中，用具有H链编码 区的合适质粒转染入H链缺失的突变体。
按照供应商的说明书用荧光素标记的兔抗-小鼠IgG(H链特异的， DAKO Corporation，Carpinteria，CA)处理抗-DC抗体生成细胞，可以得 到H链缺失突变体。用流式细胞术对染色或未染色细胞群进行分析。将未 染色的细胞收集在无菌管中并通过有限稀释，以1个细胞/孔的数量置于96- 孔板中。然后用山羊抗-小鼠IgG(H链特异的)和山羊抗-小鼠κ通过ELISA 法，测定培养物上清液。具有κ-阳性、IgG-阴性表型的克隆至少亚克隆3 次，从而得到稳定的抗-DC(-H)突变体。从推定的H链缺失突变体中分离 mRNA，并测定L链V区cDNA的序列。用两组5’-和3’-引物进行VH的 mRNA反相PCR，并用于克隆抗-DC(-H)cDNA。H链缺失突变体用这些 引物产生检测不到的DNA条带。用合适的H链质粒转染细胞。
本发明所包括的另一抗原结合片段衍生物是一种抗体，在这种抗体内， H或L链的恒定区已经被修饰，从而提供了其他性质。例如，氨基酸序列 的变化可导致最终多肽的免疫原性被改变。这些变化范围从一个或多个氨 基酸到完全重新设计恒定区的结构域。这些变化估计会影响补体固定、与 膜受体的相互作用以及其它效应子功能。也可设计重组抗体，以利于将物 质(例如淋巴因子或由肿瘤、病毒、寄生虫、细菌或耐受原(自身抗原) 衍生的抗原或抗原肽)特异递送到细胞上。本发明还包括蛋白质，在这些 蛋白质中已经以一定次序放置了多种非天然存在的Ig结构域。
本发明还包括抗-DC抗体的单链V区片段(“scFv”)。通过用一段 短的连接肽连接L和/或H链的V区，可制备单链V区片段(Bird等人(1988) 科学242：423-426)。具有足够柔性和长度的任何肽都可用作scFv中的连 接子。通常选择几乎没有或没有免疫原性的连接子。连接肽的一个例子是 (GGGGS)3，它在一个V区的羰基端和另一个V区的氨基端之间桥连了 大约3.5nm。也可使用其他连接子序列，并且其可提供其他功能例如附着 到药物或固相载体上或者将物质(例如淋巴因子或者由肿瘤、病毒、寄生 虫或细菌或耐受原(自身抗原)衍生的抗原或抗原肽)特异递送到细胞上。
H或L链的全部或任何部分都可以任何组合来使用。一般整个V区被 包括在scFv内。例如，L链V区与H链V区连接。或者是，一部分L链 V区被连接到H链V区或其一部分上。还预计scFvs中的H链V区是来 自本文所描述的抗体，而L链V区是来自另一Ig。可以构建一种双相scFs， 其中一种成分是抗原结合片段，而另一种成分是不同的多肽例如T细胞表 位。
可以任何次序(例如VH-(连接子)-VL或VL-(连接子)-VH)来组 装scFvs。这两种构型在特定表达系统中的表达水平具有差异，其中这两个 形式之一是优选的。还可构建串联的scFvs，例如(X)-(连接子)-(X) -(连接子)-(X)，其中X是scFvs或具有其他多肽的组合体。在另一实 施方案中，单链抗体多肽没有连接子多肽或者仅仅有一段短的无柔性的连 接子。可能的构型是VL-VH和VH-VL。该键合太短以致于链内的VL和VL 之间不能发生相互作用，并且这些链在每一末端与VL/VH抗原结合位点形 成同源二聚体。这些分子可称作“双抗体”。
scFvs可以重组或合成的方法来制备。对于scFv的合成制备，可用自 动合成仪。对于scFv的重组制备，可将一种含有编码scFv的多核苷酸的 合适质粒导入合适的宿主细胞(既可是真核的诸如酵母、植物、昆虫或哺 乳动物细胞，也可是原核的诸如大肠杆菌(Escherichia coli))中，并且 用标准的蛋白质纯化技术来分离被表达的蛋白质。还可从噬菌体展示文库 获得scFvs。
用于制备scFvs的一种特别有用的系统是质粒pET-22b(+)(Novagen， Madison，WI)。大肠杆菌pET-22b(+)含有由6个连续的组氨酸残基组成的 镍离子结合结构域，它使表达的蛋白质可在合适的亲和树脂上纯化。合适 载体的另一个例子是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)。
基因表达的条件优选可确保scFv拥有最佳三级结构的条件。依据所用 的质粒(启动子活性)以及宿主细胞，需要调节制备速率。例如，使用较 弱的启动子或者在低温下进行表达，这都是在原核系统中制备正确折叠的 scFv所必需的优化；或者，它可用于在真核细胞中表达scFv。
本发明还包括抗原结合片段的聚合形式，其含有多个DC特异的抗原 结合片段。一个实施方案是任意结合到载体上的抗原结合片段的线性聚合 物。这些线性聚合物可包括单个抗原结合片段多肽的多个拷贝或者为不同 多肽的组合体，并且可具有串联多肽或者被其他氨基酸序列分开的多肽。
另一实施方案是多个抗原肽(MAPs)。MAPs具有一个小的免疫惰性 核心，该核心具有放射状分支的赖氨酸树突，在其上共价附着有许多抗原 结合片段多肽(参见例如，Posnett等人(1998)生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 263：1719-1725；以及Tam(1989)Met.Enz.168：7-15)。结果得到了一个大 型的高分子，该分子的抗原结合片段多肽与核心的摩尔比较高。MAPs是 有效的免疫原并且对于免疫分析是有用的抗原。用于创建MAPs的核心可 用标准的肽合成技术来制备或者从商业上得到(Quality Controlled Biochemicals，Inc.，Hopkinton，MA)。一般的核心基质是由三个水平的赖 氨酸和8个氨基酸残基组成。
本发明还包括针对本发明的DC特异的抗原结合片段的抗-独特型抗原 结合片段。这种抗-独特型可用本领域内公知的任何方法来制备。
癌症病人经常是免疫抑制的，并且对一些肿瘤相关抗原(TAA)是耐 受的。触发对这些TAA的活性免疫应答在癌症治疗中是一个重要的挑战。 用特定抗原进行的免疫可产生包括CTL应答(最好是强的CTL)应答的 免疫应答。如果肿瘤细胞被ADCC(抗体依赖的细胞的细胞毒性)杀死， 那么产生针对该抗原的抗体是有帮助的。本发明包括DCs的用途，其用于 通过本领域公知的方法诱导特异的免疫应答，其中所述DCs是用本发明的 抗原结合片段鉴定和分离的。这些免疫应答对任何抗原都是特异的，这些 抗原包括(但不限于)与癌症、传染性病毒、传染性细菌、传染性寄生虫、 传染性酵母以及自身免疫疾病(诱导耐受性)有关的那些抗原。分离适于 独特诱导这些应答的亚群的能力导致对比亚群混合物更有效的DCs的制 备。杂交细胞(例如DC/肿瘤细胞)也可用作癌症特异的治疗物质。本发 明还包括修饰细胞(包括但不限于，相对于它们的T辅助细胞极化能力 (Th1 v Th2 v Th3/rh-R)而被激活、体外成熟、被调理，以及相对于它 们的T细胞刺激或无反应或缺失能力而被调理)，这些细胞包括(但不限 于)遗传修饰的转染的细胞以及已经与适合抗原呈递或内化的肽或蛋白质 一起温育的细胞。亚群包括(但不限于)在一个谱系内的特定分化阶段以 及单独的分化谱系。
本发明还提供了DCs、其亚群及其混合物。用本领域内公知的任一分 离方法使用本文所提供的抗原结合片段来选择这些细胞。本发明还包括含 有所分离的细胞的组合物。这些组合物包括含有所分离的细胞的药物和治 疗组合物以及任何其他组合物。利用本文所描述的方法分离的Ds亚群优 选地基本上是均一的。即利用BDCA特异的抗原结合片段分离的细胞优选 大于约80％的细胞为BDCA+，更优选的是大于约90％的细胞为BDCA+， 最优选的是大于约95％的细胞为BDCA+。当然，细胞与其他DCs或者其 他造血细胞的后续组成都可减小BDCA+细胞的百分比，这些组成也包括在 本发明内。
同样，利用本文所描述的方法得到的DCs适用于本领域内公知的任何 治疗方法。本发明还包括为了实现这些方法而被改变的DCs。这些方法包 括(但不限于)：
a)治疗：利用所分离的DCs来诱导自身免疫疾病、变态反应、移植 物抗宿主病(GvHD)、同种移殖排斥中的特异性T细胞的耐受性(杀死 或无反应而不是刺激)。例如，可修饰特异于这些T细胞的DCs，以使经 修饰的DCs含有裂解、失活或者死亡诱导组分，从而例如可通过抗原标记 或遗传修饰(如通过CD95L转染)来特异性靶向不想要的免疫应答中所 涉及的T细胞。DC的T细胞特异性主要是由MHC I和II呈递合适的T 细胞表位(肽类)而引起的。具有耐受性诱导功能的特定DCs亚类可直接 施与病人。可利用修饰DCs来介导外周的耐受性，以便诱导T细胞的缺失 (杀死)、无反应性和抑制/调节；
b)免疫调节治疗：利用所分离的DCs来诱导特异性T细胞中的特定 的细胞因子表达分布。这对于影响Th1(用于特异性炎症免疫应答的细胞 因子)、Th2(用于特异性体液免疫应答的细胞因子)或Th3(用于特异 性免疫抑制的细胞因子)细胞因子的产生尤其有用。例如在变态反应和哮 喘中，Th1应答的诱导可减小或消除产生症状的Th2应答；
c)治疗：利用呈递抗原的DCs进行的治疗，其中所呈递的抗原包括 (但不限于)肿瘤抗原、病毒抗原和细胞抗原：
d)治疗：用足以调节免疫应答的DCs(呈递或不呈递抗原)和多种 辅因子的用量和条件下而进行的治疗，其中所述辅因子包括(但不限于)： 细胞因子、共刺激分子和效应子分子；以及
e)体外刺激T细胞，以便得到抗原特异的T细胞。
本文所描述的抗原结合片段还适用于许多治疗方法。这些方法包括(但 不限于)：
a)抗体模拟诸如自身免疫中所涉及的DCs的配体或配体介导的免疫 治疗，或者为了最佳及选择性摄取/转染而在体内使抗原或核酸(病毒、质 粒DNA、RNA等)靶向DCs。BDCA-2在该上下文中尤其有用，因为它 看来是具有抗原摄取和处理功能的分子；以及
b)免疫监测：例如对多种疾病中BDCA-2+、BDCA-3+和BDCA-4+ 的计数和鉴定以及在诸如用增殖诱导配体(如flt3-配体或G-CSF)进行动 员后对BDCA-2+、BDCA-3+和BDCA-4+进行计数和鉴定。
对宿主无害的任何载体都可用于DCs。合适的载体一般是大的且代谢 慢的大分子例如蛋白质类；多糖类(诸如胶乳功能化琼脂糖凝胶、琼脂糖、 纤维素、纤维素珠等)；聚合氨基酸残基类(诸如聚谷氨酸、聚赖氨酸等)； 氨基酸共聚物类；以及失活的病毒颗粒或减毒细菌(诸如沙门氏菌 (Salmonella))。
2.获得其他DC特异的抗原结合片段的方法
本发明包括获得DC特异的抗原结合片段的方法。
如下详述了制备新的DC特异的抗原结合片段的方法，其包括(但不 限于)：1)采用噬菌体展示技术，通过该技术、用PCR和特异于样本特 异的V区的寡核苷酸引物，使编码抗体库的cDNA由淋巴细胞或脾RNA 优选地被扩增；2)用抗原免疫哺乳动物并产生多克隆或mAbs；以及3)用 噬菌体展示而不用事先免疫，通过在噬菌体上展示很大且不同的V基因库 来制备抗体。(一般参见，Hoogenboom等人(1998)免疫技术 (Immunotechnol.)4：1-20)。优选的是，为了达到治疗目的，如果待用 的是非人抗原结合片段，那么可以利用本领域内公知的任何方法对这些片 段进行人源化。
可以采用Medez等人描述的方法(Medez等人(1997)自然遗传学 (Nature Genetics)18：410)。简要地说，将纯化抗原用来免疫转基因小 鼠，其中所述转基因小鼠的种系表型缺乏天然的鼠抗体库，取而代之的是 具有大多数的人抗体V基因。其次通过鼠B细胞制备人抗体。通过PCR 文库选择技术或经典的杂交瘤技术从B细胞中获得抗体基因。
另外，在用纯化的DC特异性抗原注射小鼠(例如BALB/c)之后可 从小鼠获得抗体。用标准的杂交瘤技术可产生mAbs(Maiti等人(1997) Biotechnol.Int.1：85-93(人杂交瘤)；以及Kohler和Milstein(1975)自然 256：495-497(小鼠杂交瘤))。接下来诸如利用Rosok等人描述的方法可对 鼠抗体人源化(Rosok等人(1996)生物化学杂志271：22611-22618；Baca等 人(1997)生物化学杂志272：10678-10684；Rader等人，美国国家科学院院 报95：8910-8915；以及Winter和Milstein(1991)自然349：293-299)。
还可以利用噬菌体展示技术来迅速产生抗DCs的人抗体。该技术可采 用Henderikx等人描述的方法(Henderikx等人(1998)癌研究(Cancer Res.)58：4324-32)。从含有不同单链抗体的大的天然噬菌体抗体/片段文 库中，通过分离那些结合到固定抗原或DCs上的抗体片段而选择噬菌体上 所展示的抗体片段。从种系V结构域构建的天然库或者从合成的在构架和 CDR区中存在许多突变(利用同源基因重配或易错PCR来靶向的突变) 的构架库中选择人抗体片段。通过筛选抗肿瘤细胞和正常细胞(如本文所 述)可鉴定与DCs发生特异性反应的抗原结合片段，以便鉴定DC特异的 抗原结合片段。
本发明还包括鉴定特异于DCs的抗原结合片段的方法，该方法包括： 首先产生一个适宜的噬菌体展示文库；其次分离DC特异的抗原；按照标 准的免疫化学技术用抗原筛分噬菌体展示文库，以便得到展示特异结合 DCs的抗原结合片段的噬菌体；或者通过筛分抗DCs和抗其他相关细胞(例 如APCs)并选择优选地结合DCs的噬菌体，从而对所得到的噬菌体展示 文库筛分DC特异的抗原结合片段。利用噬菌体展示技术产生抗原结合片 段的方法在本领域内是公知的(Hoogenboom等人(1998))。
通常用淋巴细胞(PBL)或脾RNA制备抗体片段库。用同源重配或 易错PCR进行的诱变增加了多样性。可以采用本领域内公知的任何方法。
用PCR可从免疫小鼠或人扩增抗体基因库，且可克隆并在细菌噬菌体 表面表达由此得到的scFv或Fab抗体片段。用PCR和特异于针对宿主动 物特异的V区的寡核苷酸引物，从淋巴细胞或脾RNA扩增抗体基因库。 还可以用噬菌体展示而不用事先免疫，通过在噬菌体上展示很大且不同的 V基因库来制备抗体。用PCR扩增可分离PBL内存在的天然V基因库， 并且可用PCR将VH和VL区随机剪接到一起。利用同源基因重配或易错 PCR可使突变靶向V结构域基因(Zhao等人(1998)自然生物技术(Nat. Biotechnol.)15：258；以及Hoogenboom等人(1998))。还可创建完全合成 的人类文库并用于对DC特异的抗体片段进行筛分。不管用何种方法来操 作噬菌体展示文库，每个得到的噬菌体都具有在其表面上展示的功能抗体 片段并在噬菌体基因组中含有编码该抗体片段的基因(参见例如， WO97/02342)。
用来将结合抗体从未结合的抗体中分出的亲和层析法已建立了一些时 候(Nissim等人(1994)EMBO J.13：692-698；以及Vaughan等人(1996)自然 生物技术14：309-314)。影响成功的关键参数是所产生的抗特定抗原的抗 体片段的数量和亲和力。直到最近，大且多样的文库的创建在某种程度上 仍然是困难的。以前由VH和VL RT-PCR产物来直接组装scFv库。RNA 的有效性以及PT-PCR的效率是可得到的V基因数量的限制因素。而且， 组装需要连接三个片段即VH和VL以及连接子区域(Marks等人(1991)分 子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-579)。
一种改进的文库构建方法是在分别的质粒载体中克隆VH和VL基因 库，以便为scFv的组装提供稳定的和无限的材料(Sheets等人(1998)美国 国家科学院院报95：6175-6162)。而且，编码连接子区域的DNA位于VL 文库的5’端，因此增大了效率。于是，只有两个(而不是三个)片段被连 接。
还可衍生或操纵抗-DC-抗原结合片段。例如，通过制备一系列短的， 连起来可跨越整个V区氨基酸序列的多肽，可筛分L和H链的V区免疫 原活性。用一系列长度为20或50个氨基酸残基的多肽，可考查每个V区 的有用的功能性质。也可对蛋白质序列进行计算机分析，以鉴定潜在的免 疫原多肽。然后合成并测试这些多肽。
本发明还包括将本文所述抗原结合片段以不同方式组合而得到的多种 适应型，以便产生具有所需性质的其他抗-DC抗原结合片段。例如，在 MAPs内可包括具有修饰残基的抗原结合片段。在另一例子中，将scFv与 细胞因子(例如IL-2)融合。所有这些组合物都包括在本发明中。
可用任何适宜的工艺(包括蛋白酶解、重组方法或化学合成)制备这 些抗原结合片段。这些方法在本领域内是公知的因此无需详细描述。蛋白 水解酶的例子包括(但不限于)：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、 木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、枯草蛋白酶、纤溶酶以及凝血酶。完整的抗原结 合片段与一种或多种蛋白酶同时或顺序温育。或者是，另外用二硫化物还 原剂处理完整的抗体。然后用本领域内公知的技术使肽彼此分离，这些技 术包括(但不限于)：凝胶过滤色谱、凝胶电泳以及反相HPLC。 还可通过利用本领域内公知的任何方法在适宜的表达系统内由编码肽的多 核苷酸进行表达，而制备抗-DC抗原结合片段。一般在合适的启动子的控 制下，将编码适当多肽的多核苷酸连接到表达载体上，并用于遗传上改变 预期的宿主细胞。可使用真核及原核宿主系统。然后将这些多肽从裂解细 胞分离或从培养基中分离出来并纯化到预期使用所需的程度。适用于本发 明的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 以及任何其它适当的宿主细胞。真核宿主细胞的例子包括(但不限于)： 酵母、禽、昆虫、植物以及动物细胞(例如COS7、HeLa以及CHO细胞)。
任选的是，可包括基质涂覆的通道或珠以及细胞共培养，以便增强产 生抗原结合片段的细胞的生长。为了生成大量的mAbs，获得腹水一般是 更便利的。得到腹水的方法一般包括将杂交瘤细胞注射到免疫天然的、组 织相容的或免疫耐受的哺乳动物(特别是小鼠)体内。为了制备腹水，可 以通过事先施用适宜的组合物(例如降植烷)来致敏哺乳动物。将腹水从 动物体内取出并处理，以分离抗体。
另外，可用本公开文本中提供的氨基酸序列数据以及其它信息、结合 蛋白质合成的标准方法来化学合成抗原结合片段。适当的方法是固相 Merrifield技术。自动肽合成仪为商业上可购得的，例如由Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)制造的那些设备。
获得抗-DC抗原结合片段的另一方法是用BDCA-2、BDCA-3和/或 BDCA-4免疫合适的宿主动物，随后实施用于制备和分离多克隆或mAb 的标准方法。利用本领域内公知的技术可以使如此制备的mAbs“人源化”。 于是，本发明包括人源化mAbs。
在“人源化”抗体中，至少部分序列已经从其初始形式被改变，从而 使其具有更类似于人的Ig。在一种版本中，H链和L链C区被人的序列所 取代。这是包括抗-DC V区及异源Ig(C)区的融合多肽。在另一种版本 中，CDR区包括抗-DC氨基酸序列，而V构架区也被转换为人的序列(参 见例如，EP0329400)。在第三种版本中，通过设计人和小鼠V区的共有 序列并转换CDRs外共有序列间不同的残基，可使V区人源化。
在制备人源化抗体时，构架残基的选择有助于保留高的结合亲和力。 原则上，来自任何人类抗体的构架序列可用作CDR接枝的模板；然而， 业已证实，这些构架内的直接CDR替换可导致抗原结合亲和力明显丧失 (Glaser等人(1992)免疫学杂志149：2606；Tempest等人(1992)生物技术 (Biotechnol.)9：266；以及Shalaby等人(1992)免疫学杂志17：217)。人 类抗体与原始的鼠抗体越同源，人类构架就越不可能将可减小亲和力的变 形引入鼠CDTs内。基于对抗体序列数据库所进行的序列同源性检索，虽 然人类抗体IC4提供了与muM4TS.22好的构架同源性，其它高度同源的 抗体也是合适的，特别是来自人类亚组I的κL链或者来自人类亚组III 的H链(Kabat等人(1987))。多种计算机程序(例如ENCAD)可为V 区预测理想的序列(Levitt等人(1983)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 168：595)。本发明于是包括具有不同V区的人类抗体。测定适当的V区 序列并使这些序列最佳，这在本领域技术人员的技术范围内。获得免疫原 性降低的抗体的方法在US专利号5,270,202和EP699,755中也有所描述。
在某些应用中，诸如当抗原结合片段或DCA在适宜的贮存介质(诸 如植物种子)中表达时，无需纯化就可贮存抗原结合片段(Fiedler等人(1995) 生物技术13：1090-1093)。对于大多数应用，一般优选的是，多肽至少部 分地被从其它细胞组分中纯化出来。优选的是，所纯化出来的肽至少约为 总蛋白质重量百分比的50％纯。更优选的是，该肽至少约为50-75％纯。 对于临床应用，优选的是，该肽至少约为80％纯。
如果给个体施用这些肽，那么肽的纯度优选地至少为80％，更优选地 至少为90％，甚优选地至少为95％，并且没有热原和其它污染物。在上下 文中，百分纯度是以制备物占总蛋白质内容物的重量百分比来计算的，并 不包含特意加入到组合物纯化过程中的成分。
本发明还包括检测、计数和/或鉴定生物样品中的DCs及其亚类的方 法以及测定体液中诸如可溶性BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4抗原和/或 DCs的方法。这些方法包括获得生物样品；然后在允许抗体-抗原结合的条 件下使样品与本文所述的抗原结合片段接触，并且如果存在结合的话，检 测抗体与样品的结合以及抗体与对照生物样品的结合进行比较。
例如通过对DC浓度或抗原浓度进行浓缩而适当制备生物样品之后， 在可使DCs或抗原与抗体之间形成复合物的条件下，使样品与过量的抗原 结合片段混合。然后测定所形成的复合物的量或者承载DCs的复合物的数 目，并最终将其与用标准样品所形成的复合物进行比较，其中该标准样品 在预期或已知的DC浓度范围内含有已知量的靶抗原。利用免疫沉淀法或 浊度法可观察复合物的形成，但是该形成一般对诸如用放射性同位素(例 如125I)、酶(例如过氧化物酶和β-半乳糖苷酶)或荧光发色团(荧光素) 这些标记物标记的试剂更灵敏。检测细胞或抗原的方法在本领域内是公知 的。对于细胞检测，流式细胞术尤其有用，而对于抗原检测，ELISA是优 选的。
利用本领域内公知的任何免疫分析法可以测试抗-DC抗原结合片段对 抗原的特异性识别。任何形式的直接结合分析方法都是适宜的。在一种这 样的分析方法中，结合对成分之一、抗原或推定抗原结合片段之一被标记。 合适的标记物包括(但不限于)放射性同位素(例如125I)、酶(例如过 氧化物酶)、荧光标记物(例如荧光素)以及化学发光标记物。一般参考 结合的另一方是不溶的(例如通过包被在固相诸如微滴板上)，从而易于 除去未结合的可溶性结合方。当标记的结合方与未标记的结合方进行结合 之后，洗涤固相并测定结合标记物的量。
当用于免疫治疗时，本文所述的抗原结合对可用治疗剂标记或不标记 (正如本文所述以及本领域内所公知的)。这些试剂可直接或间接偶联到 本发明的抗原结合片段上。直接偶联的一个例子是使用间隔组分。这些间 隔组分既是可溶的也可是不溶的(Diener等人(1986)科学231：148)，并 选择这些组分以便能够在靶位点释放药物。用于免疫治疗的、能够偶联抗 原结合片段的治疗剂的例子包括(但不限于)抗原(包括肿瘤抗原、病毒 抗原、细菌抗原、寄生虫衍生的抗原以及自身抗原)、生物应答修饰剂、 药物、放射性同位素、凝集素和毒素。生物应答修饰剂包括细胞因子和趋 化因子，其中这些细胞因子和趋化因子包括(但不限于)IL-2、IL-3、IL-4、 G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGF-β、MTP-AB、SDF-1、淋巴细 胞激活素、DC-CK1、Eotoxins、IP-10、TACR、Rantes、MIP-1α、MIP-1β、 SLC、ITAC、MIE、MDC、MCP-1、TCA-3、MCP-2、-3、-4和干扰素。 标记抗原结合片段的干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及它们的亚 类。
在为了免疫治疗而使用放射性同位素结合的抗原结合片段时，某些同 种型与其它型相比是更优选的，这取决于诸如同种型的稳定性和发射性这 些因素。如果需要的话，可利用下述的体内诊断技术来评估由抗原结合片 段进行的细胞群识别。通常，释放α和β粒子的同位素在免疫治疗中是优 选的。例如，能够穿透组织若干毫米的高能β发射体(90Y)是优选的。另 一方面，短范围的高能α发射体(212Bi)也是优选的。用于治疗目的的， 能够结合到本发明的抗原结合片段上的同位素的例子包括(但不限于)125I、 131I、90Y、67Cu、212Bi、211At、212Pb、47Sc、109Pd以及188Re。
凝集素通常为从植物材料中分离出来的蛋白质，其与特定的糖组分结 合。许多凝集素还能够凝集细胞并刺激淋巴细胞。然而，蓖麻毒蛋白是一 种已经在免疫治疗上使用的有毒凝集素。优选地通过将蓖麻毒蛋白的α肽 链与抗体分子结合而获得，该肽链负责对抗体的毒性，从而能够对毒性作 用进行位点特异性递送。
毒素是由植物、动物或微生物产生的有毒物质，其在足够剂量时通常 是致命的。白喉毒素是一种由可在治疗上使用的白喉棒杆菌 (Corynebacterium diphtheria)产生的物质。这种毒素由在适当条件下可 分离的α和β亚单位构成。有毒的A链成分可结合到本文所述的抗原结合 片段上并用于位点特异性递送到DCs的特定亚类上。
重组方法在本领域内是公知的。除非另外指出，否则本发明实际上利 用的是分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学 和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在诸如以 下文献中得到充分的解释：“分子克隆：实验室手册”，第二版(“Molecular Colning：A Laboratory Manual”，second edition)(Sambrook等人，1989)； “寡核苷酸合成”(“Oligonucleotide Synthesis”)(Gait，ed，1984)； “动物细胞培养”(“Animal Cell Culture”)(Freshney，edd.，1987)；“酶 学方法”(“Methods in Enzymology”)(Academic Press，Inc.)；“实验免 疫学手册”(“Handbook of Experimental Immunology”)(Wei和 Blackwell，eds.)；“哺乳动物细胞基因转移载体”(“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”)(Miller和Calos，eds.，1987)；“分子生物学最新方 法”(“Current Protocols in Molecular Biology”)(Ausubel等人，eds.，1987)； “PCR：聚合酶链反应”(“PCR：The Polymerase Chain Reaction”)，(Mullis等人，eds.，1994)；以及“免疫学最新方法”(“Current Protocols in Immunology”)(Coligan等人，eds.，1991)。这些技术可用来制 备多核苷酸和多肽，并因此被认为可以再现和实施本发明。特别有用的技 术将在以下部分讨论。
本发明提供了多种编码BDCA抗原的多核苷酸。本发明还包括为这些 抗原的功能上等同的变体和衍生物及其功能上等同的片段进行编码的多核 苷酸，这些多核苷酸可增强、减小或不显著地影响由其编码的多肽的性质。 这些功能上等同的变体、衍生物和片段可展示出特异性结合到其各自抗体 上的能力。例如，不会显著影响被编码多肽的性质的变化包括(但不限于)： 不改变被编码氨基酸序列的DNA序列的变化，以及导致氨基酸残基被保 守替换的DNA序列的变化，一个或一些氨基酸残基缺失或添加，以及氨 基酸残基被氨基酸类似物所替换。保守的替换是那些保守的氨基酸替换， 包括甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬 氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/蛋氨酸；赖氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨 酸/色氨酸。
本发明的多核苷酸可包括其它序列诸如在同一转录单位内的其它编码 序列、控制元件(例如启动子、核糖体结合位点以及聚腺苷酸化位点)、 在相同或不同的启动子控制下的其它转录单位、可对宿主细胞进行克隆、 表达和转化的序列，以及诸如可提供本发明的实施方案的任何结构。
本发明包括与编码BDCA-2和BDCA-3的多核苷酸(最好是图12所 示的cDNA序列)形成稳定杂交体的多核苷酸，该多核苷核至少有大约15 个连续核苷酸，而且优选的是至少大约20个核苷酸，更优选的是至少大约 25个连续的核苷酸，更优选的是至少大约35个连续的核苷酸，更优选的 是至少大约50个连续的核苷酸，甚优选的是至少大约75个核苷酸，更甚 优选的是至少大约100个核苷酸，更甚优选的是至少大约200个核苷酸， 还更优选的是至少大约300个核苷酸。只要存在至少一组条件，其中测试 多核苷酸显示了所需特异性，那么任何系列组条件都可用于这种测试。 可在不同的“严紧”条件下进行杂交反应。增大杂交反应严紧性的条件已 经被公开(参见例如，Sambrook和Maniatis)。相关条件的例子包括(为 了增大严紧性)：25℃、37℃、50℃和68℃的温育温度；10xSSC、6xSSC、 1xSSC、0.1xSSC(其中SSC是0.15M的NaCl和15mM的柠檬酸缓冲 液)的缓冲液浓度，以及它们用其它缓冲系统的等同物；0％、25％、50 ％和75％的甲酰胺浓度；5分钟至24小时的温育时间；1次、2次或更多 的洗涤步骤；1分钟、2分钟或15分钟的洗涤温育时间；以及6xSSC、1x SSC、0.1xSSC或去离子水洗涤液。
本发明还提供了编码BDCA多肽的多核苷酸。优选的是，这些多肽是 图12中的那些或者是由其衍生的。
本发明还包括与可检测的标记物共价连接的多核苷酸。这样的多核苷 酸是有用的，例如可用作检测相关核苷酸序列的探针。
利用化学合成、重组克隆方法、PCR或这些方法的任何组合可得到本 发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成方法在本领域内是公知的，并且在本 文中无需详细描述。本领域的技术人员可利用本文提供的序列数据、通过 利用DNA合成仪或者从商业服务部门订货，可得到所需的多核苷酸。
另外，编码BDCAs的核苷酸以及由其编码的肽可以从生成细胞系、 克隆载体或表达载体中得到。利用标准的重组技术可分离、扩增和处理编 码所需序列的RNA或DNA。这些技术包括用限制性核酸酶的消化方法以 及用聚合酶链式反应(PCR)的扩增方法或者这些方法的适当组合。PCR 技术在US专利号4,683,195；4,800,159；4,754,065；和4,683,202以及PCR： 聚合酶链反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)，Mullis等人编辑. Birkauswer Press，Boston(1994)中有所描述。可以利用本领域内公知的任 何方法来分离和纯化由其编码的肽。
可将包括所需序列的多核苷酸插入适当的载体内，而载体又被导入适 当的宿主细胞内，以便进行复制和扩增。可利用本领域内公知的任何方式 将多核苷酸插入宿主细胞内。可通过直接摄取、胞吞作用、转染作用、f- 交配或电穿孔法导入外源多核苷酸来转化细胞。外源多核苷酸一旦被引入， 就可作为非整合载体(如质粒)或者被整合到宿主细胞基因组内而在细胞 内存在。利用标准的方法将所扩增的DNA从宿主细胞中分离出来(参见 例如，Sambrook等人(1989))。还可从所转化的宿主细胞中得到RNA，可 用依赖于DNA的RNA聚合酶可得到RNA.
本发明还包括具有编码BDCA-2和/或BDCA-3的多核苷酸的各种载 体。这些载体可用于重组多肽的表达以及编码BDCA的多核苷酸的来源。 克隆载体可用来获得多核苷酸的复制拷贝，或者用于将多核苷酸贮存在贮 藏体中以便将来回收时使用。表达载体(以及含有这些表达载体的宿主细 胞)可用来获得由所包含的多核苷酸产生的多肽。它们还可用来在个体中 表达BDCA-2和/或BDCA-3，并因此具有能够合成多肽的完整细胞(诸如 在基因治疗中)。适当的克隆和表达载体包括本领域内公知的任何载体， 例如用于细菌、哺乳动物、酵母和昆虫表达系统的那些载体。特定的载体 和适宜的宿主细胞在本领域内是公知的并且在本文中无需详细描述(参见 例如，Gacesa和Ramji，载体(Vectors)，John Wiley和Sons(1994))。
克隆和表达载体一般含有可选择的标记物(例如，对用载体所转化的 宿主细胞的存活和生长所需的蛋白质进行编码的基因)，虽然这样的标记 基因可以在共导入宿主细胞内的另一个多核苷酸序列上。只有那些已经导 入可选择基因的宿主细胞将在选择性条件下生长。典型的选择性基因(a) 对抗生素或其它有毒物质(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤)具有抗 性；(b)补体营养缺陷；或者(c)供给不可从复合培养基中得到的关键营养 物。适宜标记基因的选择取决于宿主细胞，并且用于不同宿主的适宜基因 在本领域内都是公知的。载体一般还含有由宿主识别的复制系统。
合适的克隆载体可按照标准的技术来构建，或者从本领域内可得到的 大量克隆载体中选择。虽然所选择的克隆载体可根据待用的宿主细胞来改 变，但是有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，并且具有特定限制性 内切核酸酶的单一靶位点，或者携带用于标记的基因，该标记可用于选择 含有载体的克隆。适当的例子包括质粒和细菌病毒(例如pUC18、mp18、 mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNAs)以及穿梭 载体(例如pSA3和pAT28)。这些以及许多其它克隆载体可从来自BioRad， Stratagene和Invitrogen的商业载体中得到。
表达载体通常是含有编码感兴趣的BDCA的多核苷酸的可复制多核苷 酸构建体。编码BDCA的多核苷酸可操纵地连接到适当的转录控制元件(例 如启动子、增强子和终止子)上。为了进行表达(即翻译)，通常还需要 一个或多个翻译控制元件(例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密 码子)。这些控制元件(转录和翻译的)可由编码BDCA的基因衍生，或 者是异源的(即，由其它基因或其它有机体衍生的)。也可包括编码信号 肽的多核苷酸序列，以便使BDCA穿过或滞留在细胞膜，或者从细胞中分 泌出来。适于在真核细胞(包括酵母、禽和哺乳动物细胞)中表达的许多 表达载体在本领域内都是公知的。表达载体的一个例子是pcDNA3 (Invitrogen，San Diego，CA)，在该载体中，转录由巨细胞病毒(CMV) 早期启动子/增强子驱动。该载体还含有多个限制酶的识别位点，用于插入 感兴趣的多核苷酸。表达载体(系统)的另一个例子是杆状病毒/昆虫系统。 适用于抗体靶向的基因治疗的其它载体包含编码BDCA的多核苷酸。合适 的系统例如在Brown等人(1994)病毒学(Virol.)  198：477-488；以及 Miyamura等人(1994)美国国家科学院院报91：8507-8511中有所描述。
利用许多适当的方式(包括电穿孔、用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE- 葡聚糖或其它物质进行的转染；微粒轰击；脂质体转染；以及感染)将含 有感兴趣的多核苷酸的载体导入宿主细胞内。载体或编码BDCAs的多核 苷酸的导入方式的选择经常取决于宿主细胞的性质。
一旦导入合适的宿主细胞内，就可利用本领域内公知的任何分析方法 来测定BDCA的表达。例如，用RIA或ELISA检测培养上清液(如果该 多肽是被分泌的话)或细胞裂解物中它的存在。
本发明的载体可含有一种或多种编码BDCA的多核苷酸。它还可含有 编码其它多肽的多核苷酸序列，其中这些多肽可增强、促进或调节所需的 结果例如细胞因子(包括但不限于：IL-2、IL-4、GM-CSF、TNF-α和IFN- γ)。本发明还包括编码重组BDCAs的疫苗载体。
本发明的其它实施方案是，用编码BDCAs的多核苷酸转化的宿主细 胞以及包括多核苷酸序列的载体(如上所述)。可使用原核及真核宿主细 胞。原核宿主包括(但不限于)细菌细胞(例如大肠杆菌和分枝杆菌 (mycobacteria))。真核宿主包括(但不限于)酵母、昆虫、禽、植物 和哺乳动物细胞。宿主系统在本领域内是公知的并且无需在本文中详细描 述。哺乳动物宿主细胞的例子包括(但不限于)CHO和NS0，它们是从欧 洲细胞保藏中心(European Collection of Cell Cultrues)(英国)得到的。例 如，用CMV启动子驱动的质粒转染NS0细胞，随后使用谷氨酰胺合成酶 扩增该质粒，这为蛋白质制备提供了有用的系统。(Cockett等人(1990)生 物/技术(Bio/Technology)8：662-667)。
此外，本发明的宿主细胞还可用作编码BDCAs的多核苷酸库，或者 用作制备这些库的载体。它们还可用作体内表达BDCAs的载体。
本发明的多核苷酸具有若干用途。它们在例如用于制备BDCA的表达 系统中是有用的。它们还可用作杂交探针，以便用本领域内技术人员公知 的方法来测定样品中编码BDCAs或相关序列的多核苷酸的存在。而且， 这些多核苷酸还可用作有效扩增预期多核苷酸的引物。本发明的多核苷酸 在包括疫苗的药物组合物以及基因治疗中都是有用的。
这些多核苷酸还可用作检测BDCA编码序列的杂交探针。合适的杂交 样品包括用于基因治疗的体外被转化的细胞。在一个示例中，将DNA或 RNA从样品中提取出来，并在凝胶上随机运行和/或用限制性核酸酶进行 消化。所处理的样品多核苷酸一般被转移到适于洗涤的介质中。然后使样 品多核苷酸与编码BDCA的多核苷酸探针在允许稳定的双体形成(如果样 品含有互补多核苷酸序列的话)的条件下进行接触。利用适当的方式来检 测所形成的任何稳定的双体。例如，以标记形式提供多核苷酸探针，并且 洗涤之后与样品保留在一起的标记物将直接反映所形成的稳定双体的量。 在第二个示例中，杂交是在原位进行的。用标记探针覆盖适当制备的组织 样品，以便指示出编码BDCA的序列的部位。
短的多核苷酸还可用作PCR反应的引物，从而尤其可用来扩增包括与 引物杂交区域的较长序列。这可以制备的方式进行，以便产生用于进一步 的遗传操纵的多核苷酸。它还可以分析的方式进行，以便确定例如诊断的 感兴趣样品中是否存在编码BDCA的多核苷酸。
多核苷酸的另一用途是用于疫苗和基因治疗中。一般原理是多核苷酸 的施用或促进或弱化由其编码的多肽的表达。于是，本发明包括诱导免疫 应答的方法以及包括给个体施用有效量的编码BDCAs的多核苷酸的治疗 方法。在这些方法中，以直接的方式或通过用多核苷酸转染细胞的方式， 给个体施用编码BDCA的多核苷酸。优选的是，多核苷酸为环状质粒形式， 优选地为超螺旋构型的环状质粒。优选的是，在细胞内复制该多核苷酸。 于是，多核苷酸可操纵地与适宜的启动子(例如在靶组织型的细胞中内在 活化的异源启动子)相连。优选的是，一旦在细胞核内，质粒一直为环状 非复制的附加型分子。可用质粒构建体进行体外突变，以便例如编码具有 较大亲和力和/或亲合力的分子。
为了测定含有BDCA多核苷酸的质粒是否能够在真核细胞内表达，可 用质粒转染诸如COS-7、CHO或HeLa这些细胞。然后利用免疫测定法(例 如Western印迹法)测定表达。例如通过构建质粒以便用标志(诸如靶表 位或酶标记物)融合所得到的多肽，可以检测较小的BDCAs。通过纯化这 种肽、然后实施本文所述的功能测定法中的一种，可获得被表达的多肽的 其它特征。
在基因治疗的一种方式中，本发明的多核苷酸用于体外遗传改变细胞。 在这种策略中，用BDCA载体转染或转导从供体中取出的细胞或者从细胞 系中得到的细胞，然后给受体施用这些细胞。用于转染的适宜细胞包括外 周血单核细胞。
在另一治疗方式中，本发明的多核苷酸用于体内遗传改变细胞。该目 的包括(但不限于)治疗多种类型的癌症。
这些多核苷酸还可用来产生不表达BDCA-2的细胞以及表达BDCA-2 的转基因动物。
从本发明还可得到BDCA-2不表达或以明显下降的水平表达的工程化 细胞。通过选择细胞(最好是DC)并向细胞提供一个包括编码BDCA-2 基因的多核苷酸的表达构建体，可制备这样的细胞，其中该多核苷酸以与 启动子反义并与之操纵连接的方式就位。这样的多核苷酸的表达有效地产 生了缺少BDCA-2的细胞。
在本发明的其它实施方案中，提供了一种用于制备重组宿主细胞的方 法，该宿主细胞产生显著减小的BDCA-2量或者甚至“敲除”BDCA-2的 产生。利用本领域内技术人员公知的一种或多种方式可制备这些重组宿主 细胞。例如，通过将反义DNA或RNA的构建体掺入基因组内，可抑制基 因表达。内源BDCA-2基因的删除或突变可使其非功能化。将编码核酶 -RNA切割酶(特异性切割BDCA-2 mRNA)的核酸导入重组宿主细胞内。
术语“敲除”是指，部分或完全抑制细胞内的内源DNA序列(诸如 BDCA-2)编码的蛋白质的至少一部分的表达。术语“敲除构建体”是指 一核酸序列，该序列被设计用来减小或抑制细胞内的内源DNA序列编码 的蛋白质的表达。
这些重组构建体可掺入敲除的哺乳动物中，以便在DCs中抑制 BDCA-2的产生。敲除和转基因动物的制备是本领域内技术人员所公知的 并且在5,434,340、5,530,179和5,557,032中有所描述。
本发明还提供了用于制备动物的方法以及如此制备的过表达BDCA-2 的动物。这些方法一般包括将动物细胞导入动物体内，其中所述动物细胞 已于体外处理，插入了编码BDCA-2多肽的DNA片段，该动物细胞在动 物体内表达BDCA-2。
D.试剂盒
本发明包括含有抗-DC特异的抗原结合片段的试剂盒，该试剂盒用于 测定血清或其它来源中的包含可溶性BDCA-2(包括其同种型)的BDCA-2。 通过诊断实验室、实验性实验室、专业人员或私人个体来实施使用这种试 剂盒的诊断过程。对临床样品进行随机预处理，以便富集待测试的靶物。 然后使用者加入试剂盒中所含的试剂，以便检测诊断成分中的变化水平或 改变。
任选的是，试剂还可与标记物结合，以便检测与样品中的靶物所形成 的任何复合物。在另一种任选方式中，提供了第二试剂，该试剂在发现靶 物后能够与一级试剂结合并借此提供可检测的标记物。例如，标记的抗- 鼠IgG可用作二级试剂。当一级试剂为与生物素结合时，标记的亲和素可 用作二级试剂。
试剂盒可用于各种生物样品中，这些样品包括液体样品、细胞悬浮液 和组织样品。能够以试剂盒形式提供的适当分析方法包括本文所述的那些 方法。
每种试剂以固体形式或溶于/悬浮于液体缓冲剂的形式来提供，以便适 合库存贮藏，并且随后当进行测试时可用于交换或加入到反应介质中。还 提供了合适的包装。试剂盒可任意提供用于分析过程的其它成分。这些任 意成分包括(但不限于)缓冲剂、捕获试剂、展开剂、标记物、反应表面、 用于检测的装置、对照样品、说明书以及说明资料。
E、治疗组合物
1.物质的组合物
按照用于制备药物制剂的通常可接受的工艺方法来进行本文所述的药 物组合物的制备(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th Edition(1990)，E.W.Martin ed.，Mack Publishing Co.，PA)。根据预计使 用和施用形式，还需要处理药物组合物制备中的活性成分。合适的处理方 法包括消毒、与适宜的非毒性和非干扰成分的混合、分成剂量单位以及封 闭在配送装置中。在一实施方案中，治疗组合物含有DCs、其亚群或它们 的混合物。在另一实施方案中，这些组合物中含有本文所述的抗原结合片 段。优选的是，抗原结合片段是表1中的mAbs或由其衍生的。优选的是， DC组合物含有用这些抗原结合片段之一分离的DCs。
(a)施用的一般方式
本发明的药物组合物可利用适合于组合物剂型的方式来服用。一般的 给药途径包括：静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、口服、鼻内、真 皮内以及肺内施用(即通过气雾剂的形式)。人用的药物组合物一般通过 非肠道途径施用(最典型的是静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用)。虽 然不是必须的，但是所提供的药物组合物最好是适合于精确量施用的单位 剂量形式。本发明还预计包括慢释或缓释剂型，由此可长期提供相对恒定 水平的活性物质。
(b)液体制剂
例如，可通过将本文所列举的多肽或多核苷酸溶解或分散到液体赋形 剂(例如水、盐水、含水葡萄糖、乙二醇或乙醇)中，来制备药学上可接 受的液体组合物。组合物还可任选地含有其它药用制剂、药物制剂、载体 和辅助物质(例如润湿剂或乳化剂以及pH缓冲剂)。用于注射的组合物 可提供为液体溶液或悬浮液、乳液或者在注射之前适于溶解或悬浮于液体 中的固体形式。用于口服、鼻内或局部施用的药物组合物可以固体、半固 体或液体形式来提供，包括片剂、胶囊、粉剂、液体和悬浮液。对于通过 呼吸道施用的方式，优选的组合物是当与合适的气雾剂化装置一起使用时 可提供固体、粉末或液体气雾剂的组合物。
本发明还包括含有具膜结合肽的脂质体的组合物，从而可将脂质体特 异性递送到肿瘤或致瘤性细胞区域或递送至免疫系统。这些脂质体可制备 为除了含有肽之外，还含有免疫治疗剂(诸如接下来可在识别位点释放的 上述那些免疫治疗剂)(Wolff等人(1984)生物化学与生物物理学学报 (Biochem.Biophys.Acta)802：259)。另一个这样的递送系统采用嵌合 细小病毒B19衣壳来呈递抗原结合片段(Brown等人(1994)病毒学 198：477-488；以及Miyamura等人(1994)美国国家科学院院报 91：8507-8511)。这些嵌合系统包括在本文中以便使用。
可以许多方式来评估本发明中所列举的组合物的功效。因此，试验化 合物可制备为合适的药物组合物并且施与测试对象。最初的研究最好用小 动物(例如小鼠或兔)进行，其次任选地用非人灵长类动物进行，然后最 终用人进行。优选的是，测试以前没有抗体应答的个体的免疫原性。按照 适当的治疗时间表来施用适当测试剂量的试验组合物。在预定的范围内比 较不同剂量和时间安排是合适的。抗原结合片段的施用剂量范围应大得足 以产生所需的疗效，该疗效是，疾病的症状被改善了，并且不会产生不适 当的副作用(例如不想要的交叉反应和过敏反应)。通常，剂量随着患者 的年龄、健康状况、性别和病情程度来变化，且本领域技术人员可确定剂 量。当存在任一并发症时，各个医师可调节剂量。通常，当结合治疗剂服 用这些组合物时，可使用相当于用于体内免疫诊断成像的较低剂量的组合 物。
2.抗原结合片段
本发明包括含有本文所述的抗原结合片段的药物组合物。这些药物组 合物可单独或结合其它治疗形式(化疗、放疗或免疫治疗(如WO98/23735； WO98/34642；WO97/10000；WO97/10001；以及WO97/06821所述))，用 于诱导或协助免疫应答以及治疗肿瘤疾病，或者包括耐受性，以及治疗自 身免疫疾病(GvHD、同种移植排斥、过敏原等等)。其它的治疗方法在 本文中有所描述并且或在本领域内是公知的。适宜的疾病包括(但不限于)： 病毒、寄生虫、细菌、真菌引起的疾病、肿瘤以及自身免疫疾病。
在鼠乳腺癌模型中，Flt3-配体(Flt3-L)为用于各种造血谱系(包括 DCs和B细胞)的刺激细胞因子，已经鼠乳腺癌细胞一起作为疫苗使用 (Chen等人(1997)癌研究57：3511-6)。DCs还可载有肿癌抗原或被转导， 以表达肿瘤抗原；然后将这些细胞用作肿瘤接种的佐剂。在适当的MHC 限制下，DCs将肿瘤相关抗原内源性呈递到传入淋巴系统中(Wan等人 (1997)人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)8：1355-63；Peiper等人(1997)外 科学(Surgery)122：235-41；以及Smith等人(1997)国际免疫学(Int. Immunol.)9：1085-93)。目前的黑素瘤疫苗操纵抗原呈递网络，并且在 介导肿瘤保护性免疫时有效地结合了最佳细胞和抗体抗-肿瘤免疫应答。这 些治疗方法已经导致疾病的消退、延缓疾病的恶化或者在一些情形中对生 存有所改善，并且极少有副作用(Kuhn等人(1997)皮肤外科学(Dermatol. Surg.)23：649-54)。Conforti等人(1997)外科肿瘤杂志(J.Surg. Oncol.)66：55-64还对黑素瘤疫苗进行了综述。
疫苗可包装在药学上可接受的载体内，并掺合有本领域内所公知的佐 剂或其它成分(例如细胞因子)。除了允许制剂中存在含有细菌和细菌成 分的佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂)，兽用的疫苗基本上与人用的相 似。
F、治疗方法
本发明还包括用来治疗本文所述和/或本领域内公知的各种紊乱的方 法。这些方法包括施用一定量的含有有效量的本发明组合物的药物组合物， 以获得所需的效果、改善现存状况或者防止复发。对于癌症的治疗，所施 用的药物组合物的量是产生所需效果的有效量。有效量可以一次或一系列 的施用来提供。有效量可以弹丸剂或连续灌注的方式来提供。适当的活性 剂包括抗-肿瘤药物、生物应答调节剂和效应子细胞(诸如Douillard等人 (1986)杂文瘤(Hybridomas)(Supp.1：5139)中所述的那些)。
药物组合物和治疗方式适用于通过直接或间接引发对肿瘤的免疫应答 来治疗病人。“个体”、“病人”或“受试者”是脊椎动物，优选的是哺 乳动物，更优选的是人。哺乳动物包括(但不限于)：人、野生动物、未 驯服的动物、农场动物、运动动物和宠物。“癌症受试对象”是哺乳动物， 最好是被诊断为癌症、肿瘤或者有得这些病危险的人。
正如本文所用的，“治疗”是指，试图改变接受治疗的个体或细胞的 病程而进行的临床介入方案，并且为了预防或者在临床病理的过程中实施 该“治疗”。治疗效果包括(但不限于)：阻止疾病的发生或复发、减轻 症状、消除疾病的任何直接或间接病理结果、阻止肿瘤转移、减小疾病恶 化的速度、减轻或缓和疾病状况以及缓解或改善预后。
与病情相关的“病理”是包括健康的正常的生理状况，或者被影响个 体的生活质量的任一状况。这可包括(但不限于)：被影响的组织对以前未 影响区域的破坏性侵入、以消耗正常组织功能为代价的生长、不规律或被 抑制的生物活性、炎性或免疫性应答的加重或抑制、对其它病原生物或介 质的易感性增大以及不利的临床症状例如可由护理医师确定的疼痛、发烧、 恶心、疲劳、心情变化以及诸如其它与疾病相关的特征。
“有效量”是在治疗时足以产生有益或预期临床结果的量。有效量可 以一个或多个剂量施与病人。就治疗而言，有效量是足以缓和、改善、稳 定、逆转或减缓病情发展或者还减轻了疾病的病理结果的量。有效量一般 可由医师在一个接一个病例的基础上确定，并且在本领域技术人员的技术 范围内。在确定合适剂量以便获得有效量时一般要考虑几个因素。这些因 素包括病人的年龄、性别和体重、接受治疗的身体状况、病情的严重程度 以及所施用的抗原结合片段的剂型和有效浓度。
本文所用的术语“免疫调节”或“调节免疫应答”包括免疫刺激以及 免疫抑制作用。免疫刺激作用包括(但不限于)直接或间接增强细胞或体 液免疫应答的作用。免疫刺激作用的例子包括(但不限于)：增加了抗原 特异的抗体的产生；淋巴细胞群(例如NK细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、 巨噬细胞等)的活化或增殖；增加了细胞因子或趋化因子的合成，这些因 子包括(但不限于)IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、干扰素、TNF- α、IL-10、TGF-β等。免疫抑制作用包括直接或间接降低细胞或体液免 疫应答的作用。免疫抑制作用的例子包括(但不限于)：降低了抗原特异 性抗体的产生例如IgE产生降低；具有免疫抑制活性的淋巴细胞或其它细 胞群(诸如可导致免疫耐受性的那些细胞群)的激活；以及增加了对某些 细胞功能具有抑制作用的细胞因子的合成，这些因子包括(但不限于)IL-10 和TGF-β。此类因子的一个例子是IFN-γ，它似乎阻断了IL-4诱导的向 IgE和IgG1的类转换，借此降低了这些抗体亚类的水平。
接受癌症治疗的合适的人类受试者还包括两个治疗组，这可根据临床 标准来区分。具有“晚期疾病”或“严重的肿瘤负载”的病人是那些具有 临床上可测到的肿瘤的病人。临床上可测到的肿瘤是指可基于肿块而检测 的肿瘤(例如通过触摸、CAT扫描、声波图、乳房造影图或X射线；用其 上的阳性生化或组织病理标志来鉴定此类群体是不够的)。将本发明中列 举的药物组合物施与这些病人，以便诱出抗肿瘤应答，目的在于减轻病情。 理想的治疗结果是肿块减小了，但是任何临床症状的改善都是有益的。临 床改善包括肿瘤恶化的危险或速度减小了或者肿瘤的病理结果减轻了。
第二组适宜受试者是本领域内公知的“佐剂组”。这些个体具有癌症 历史并且已经对另一治疗方式有响应。以前的治疗方法包括(但不限于) 外科切除术、放疗和传统的化疗。结果，这些个体无临床上可测到的肿瘤。 然而，独想他们在原来的肿瘤部位附近或者由于转移而有疾病恶化的危险。
本文所用的“佐剂”有几重意思，所有这些意思依据该术语所在的上 下文中而明了。在药物制备的上下文中，佐剂是化学或生物剂，其与抗原 结合施用(同时或不同时施用)或将其重组融合至抗原，从而可增强抗原 的免疫原性(参见Singh等人(1999)自然生物技术(Nature Biotech.) 17：1075-1081)。也已提议将所分离的DCs可用作佐剂。此处所用的组合 物包括在本发明中。在癌症诊断或治疗的上下文中，佐剂是指，无临床上 可测到的肿块但被怀疑有复发危险的一类癌症病人。
这一组还可亚分成高危和低危个体。亚分是基于初始治疗之前或之后 所观察的特征而作出的。这些特征在临床领域是公知的并且适于为每种不 同的癌症下定义。高危亚组的典型特征是，肿瘤已经侵袭了邻近组织或者 显示出牵涉到淋巴结。
另一适宜组是具有癌症的遗传素质但还没有明显的癌症临床迹象的病 人。例如，对与乳腺癌有关的基因突变测试显阳性的女性，由于其还处于 分娩年龄，因此希望在治疗中预防性服用一种或多种本文所述的抗原结合 片段，以便在适合实施预防手术之前阻止癌症的发生。
特别合适的受试者是具有(但不限于)以下癌症的病人：恶性胶质瘤、 黑素瘤、成神经细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤以及多种癌症(包 括小细胞肺癌)。合适的癌症还包括肿瘤学领域内公知的任何癌症，包括 (但不限于)：星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、间胶质瘤、 室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层瘤(PNET)、软骨肉 瘤、骨原性肉瘤、胰管腺癌、小和大的细胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、 内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、及其肝转移瘤、淋巴 管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、 横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头 状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒膜癌、精原 细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室 管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、成神 经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球 蛋白血症、以及重链病、乳腺癌(例如管和小叶腺癌)、子宫颈的鳞状腺 癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱的过渡鳞状细胞癌、B和T细 胞淋巴瘤(结的和扩散的)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑瘤、软 组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
病人可具有疾病进化形式，其中治疗目的包括疾病发展的缓和及逆转 以及/或者副作用的改善。病人具有病史，他们为此已经接受了治疗，其中 治疗目的一般包括复发危险的减小或延迟。
自身免疫紊乱是由导致多种细胞、组织和器官的自身破坏的错导免疫 应答引起的。这些紊乱的起因是未知的。已知通过MHC的自身识别在免 疫应答中是重要的。然而，对自身免疫应答和负责自身免疫的细胞的抑制 还不十分清楚。
自身免疫是由几个因素(包括遗传、激素和环境影响)综合引起的。 许多自身免疫紊乱的特征在于B细胞的超活性，是以白细胞和自身抗体的 增殖和高丙种球蛋白血症为标志。B细胞的超活性可能与T细胞的异常有 关。激素和遗传因素强烈影响自身免疫紊乱的发生；例如，红斑狼疮显著 影响分娩年龄的女性，并且某些HLA单倍型与特定自身免疫紊乱渐增的 危险性有关。
一般的自身免疫紊乱包括(但不限于)：类风湿性关节炎、青少年类 风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、眼干 燥综合征、肺出血肾炎综合征、瑞特综合征、硬皮病、脉管炎、多肌炎和 皮肤肌炎。这些疾病中的许多种都包括与免疫紊乱有关的异常的炎症反应。 本文所述的DCs在这些紊乱的治疗中是适用的，尤其是当用来灭活或诱导 紊乱中所涉及的T细胞的耐受原性时。治疗方法在本领域内是公知的。正 如本文所讨论的，由本文所述的方法获得的一种或多种DCs亚类在自身免 疫的治疗中是适用的。
抗原结合片段的“免疫活性”是指，特异性结合完整抗体识别的抗原。 这些结合能够或者不能够激发免疫应答。特异性免疫应答可激发抗体、B 细胞应答、T细胞应答、这些形式的任何组合以及由此生成的效应子功能。 这些功能包括(但不限于)抗体介导的功能ADCC和补体介导的细胞溶解 (CDC)。T细胞应答包括(但不限于)：T辅助细胞功能、细胞毒T细 胞功能、炎症/诱导性T细胞功能以及T细胞介导的免疫抑制。能够按照 任一上述这些标准直接或间接激发特异性免疫应答的化合物(单独或与载 体或佐剂结合)被称作“免疫原”。抗原结合片段的“活性”或“功能” 是指任一种的抗体免疫活性，包括癌症的检测、改善或缓和。
“免疫应答”是指对恶性或疾病组织、致病因子和身体暴露在其中的 其它外源因子的免疫应答的诱导或增强。免疫应答可以是体液应答(这一 点通过抗体的产生而证实)；和/或细胞介导的应答，(这一点通过此类细 胞诸如天然杀伤细胞或细胞毒T细胞(CTLs)和由此产生的细胞因子所 显示的溶细胞应答所证实)。可通过感染或恶性部位的单核细胞浸润，来 监测免疫应答。典型的是，这些监测是通过组织病理来实施的。“癌症特 异的免疫应答”是针对恶性肿瘤而不是针对非癌细胞发生的应答。本文所 述的治疗一般可诱导或促进细胞介导的免疫应答，但也能诱导或促进抗体 介导的免疫应答。这些治疗还可影响对抗原的免疫应答的类型。
按照本发明的组合物还适用于诱导抗原特异的Th1免疫应答。可以在 根据本发明处理的宿主中测到刺激了Th1型免疫应答，并且可利用本领域 内公知的任何方法来测定，这些方法包括(但不限于)：在抗原攻击之前 和之后测得的IL-4水平降低了；或者，与抗原致敏的、或者致敏且攻击的 无本发明组合物处理的对照宿主相比，检测到被处理的宿主内IL-4的水平 较低(或者甚至检测不到)；与抗原致敏的或者致敏且攻击的对照宿主相 比，被处理的宿主内IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ，优选的是IFN- γ)的水平上升；与未处理的对照相比，被处理的宿主内产生IgG2a抗体； 在抗原攻击之前和之后可测到，抗原特异性IgE水平降低，或者，与抗原 致敏的、或者致敏且攻击的未处理宿主相比，检测到被处理的宿主内抗原 特异性IgE水平较低(或者甚至检测不到)。通过利用本文所述以及本领 域内公知的方法体外或离体测定由APCs和/或淋巴细胞(优选地DCs和/ 或T细胞)释放的细胞因子，可以实施诸如此类的各种测定。
偏向于Th1的细胞因子诱导可增强细胞免疫应答，诸如由NK细胞、 细胞毒性杀伤细胞、Th1辅助和记忆细胞实施的那些应答。这些应答用于 抗病毒、真菌、原生动物寄生虫、细菌、变态反应性疾病和哮喘以及肿瘤 的预防性或治疗性接种中尤其有益。
本发明还包括通过连接BDCA-2而下调I型干扰素的产生、通过连接 BDCA-2而下调Th1的免疫应答，以及通过连接BDCA-2而使免疫应答偏 向于Th2的免疫应答。通过妨碍BDCA-2的连接可逆转这些指征。本发明 还包括筛选用于干扰BDCA-2的连接的合适组分以及这些组分的组合物。
当抗原结合片段与多种治疗剂结合使用时，通常将这两种物质基本上 同时施用。术语“基本上同时”的意思是，相对于时间而言，它们可以合 理地一起施用。可以每日或者任何其它适当的时间间隔来施用治疗剂，这 取决于诸如疾病的性质、病人的身体状况和治疗剂的半衰期这些因素。
可通过注射或者通过在一段时间逐渐灌注的方式来施用治疗组合物。 抗原结合片段可以单独或与其它治疗剂一起静脉内施用、腹膜内施用、肌 内施用、皮下施用、腔内施用、结内施用、鞘内施用或经皮肤施用。
施用的另一种方法是损伤内施用例如直接注射到肿瘤内。对癌症病人 所实施的多种免疫治疗形状的损伤内施用不会产生全身施用免疫剂所见的 毒性(Fletcher等人(1987)淋巴因子研究(Lymphokine Res.) 6：45；Rabinowich等人(1987)癌研究(Cancer Res.)47：173；Rosenberg等 人(1989)科学233：1318；以及Pizz等人(1984)国际癌杂志(J.Int.Cancer) 34：359)。
另外，希望将组合物局部施用在需要治疗的病灶区；这可例如通过在 手术过程中注射、借助于导管或借助于埋入物通过局部输注来实现，其中 所述埋入物是多孔、无孔或胶质材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。 一种合适的此类膜是由Guilford sciences提供的Gliadel。
BDCA-2与抗-BDCA-2单克隆抗体(AC144)的连接诱导细胞内的Ca2+动员这一事实表明，通过触发BDCA-2信号或者抑制BDCA-2信号的触 发，可在功能上调节浆细胞样DC(以及表达BDCA-2的所有其它细胞) 。考虑到DC的功能性调节，以下方面包括在权利要求书中：
A)D4+和CD8+T细胞应答的诱导和下调。
B)使免疫应答向耐受性或免疫性分化。
C)使CD4+T细胞向Th1细胞的发育、Th2细胞的发育或Th3/T- 调节性-1 CD4+T细胞的发育分化。后者也许通过分泌TGF-β和/或IL-10 来下调免疫应答。
D)DC通常被认为是T细胞的抗原呈递细胞。然而，最近来自几个 实验室的研究业已表明，它们在B细胞的活化和抗体合成的调节中起着重 要的作用。因此通过DCs上的BDCA-2可调节B细胞应答。同样，对于 NK细胞应答也是如此。
由于I型干扰素可诱导人类的Th1型免疫应答(Parronchi等人(1996) 欧洲免疫学杂志(Eu r.J.Immunol.)  26：697-703)，因此BDCA-2的触 发使CD4+T细胞应答向Th2细胞发育分化，其中对BDCA-2信号的抑制 使CD4+T细胞向Th1细胞发育分化。本发明还包括通过分别触发BDCA-2 信号或抑制BDCA-2信号的触发，而使CD4+T细胞应答向Th2或Th1细 胞发育分化。
本文提到的所有出版物借此全部作为本文的参考文献。所提供的以下 实施例是为了阐述本发明，而并非是为了限定本发明。
实施例1
DC特异的mAb的产生
五只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Simonsen Laboratories，Gilroy，CA) 在麻醉下于第0、4、7、11和14天右足垫接种5x105至1x106个纯化的 HLA-DR+lin-血液DC，并且在第-3、0、4、7、11和14天于左足垫接种大 约1x106HLA-A2+Bristol-8 B淋巴母细胞瘤细胞。在注射前，将这两种细 胞都在室温下与1：100PHA(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)一起温育10 分钟，然后用PBS洗涤。该处理提供了非特异性佐剂效果并且无需使用佐 剂(例如弗氏佐剂)。
在第15天，即第五次注射HLA-DR+lin-DC之后的那天，取出小鼠右 足腘淋巴结。制备淋巴细胞悬液，并用改良Kohler和Milstein(1975)自 然256：495所述方法将细胞与SP2/0 Ag14骨髓瘤细胞融合。将融合细胞置 于96孔板，其中融合细胞在补充了以下成分的DMEM中：20％ FCS (HyClone，Logan，UT)、2mmol/L的L-谷氨酰胺、15mmol/L的Hepes、 10-4mmol/L的次黄嘌呤(Gibco/BRL)，然后放在37℃、含有9％CO2的 培养箱中。
当出现可视的杂交瘤克隆时，用流式细胞术筛分这些孔的上清液以了 解抗体分泌和对PBMC无非反应性(＜1％的阳性细胞)。简言之，将大鼠 抗-小鼠κmAb结合的聚苯乙烯珠(2.5μm的直径，Interfacial Dynamics Corp.，Portland，OR)和PBMC的混合物与50μl杂交瘤上清液在室温下一 起温育20分钟。然后用含有5mmol/L EDTA和0.5％ BSA的PBS(pH7.4) (PBS/EDTA/BSA)将微球/细胞混合物洗涤两次，通过用PE结合的大鼠 抗-小鼠IgM mAb(克隆X54，BD Biosciences，San jose，CA)、大鼠抗- 小鼠IgG1 mAb(克隆X56，BD Biosciences)和大鼠抗-小鼠IgG2 mAb(克 隆X57，BD Biosciences)进行染色，来检测珠和测试细胞与上清液中的小 鼠IgM、IgG1、IgG2a与IgG2b的结合。利用散射信号在流式细胞术分析 时可容易地辨别PBMC和聚苯乙烯珠。
然后为了测定对相当比例的血液DC的反应性，而利用流式血细胞计 数分析来筛分满足第一轮筛分标准的培养上清液。简言之，在室温下，将 大鼠抗-小鼠mAb结合的聚苯乙烯殊和富集的血液DC(PBMC耗竭了B 细胞、T细胞和单核细胞的PBMC)的混合物与50μl的杂交瘤上清液一起 温育20分钟。然后用PBS/EDTA/BSA将混合物洗涤两次，通过用PE结 合的大鼠抗-小鼠IgM mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和大鼠抗-小鼠IgG2 mAb进行染色，来检测珠和富集的血液DC与上清液中的小鼠IgM、IgG1、 IgG2a与IgG2b的结合。为了辨别流式细胞术分析中的HLA-DR+DC与 HLA-DR-细胞，洗涤珠/细胞混合物一次，然后通过与100μg/ml的小鼠 IgG2a在室温下一起温育5分钟，以饱和PE结合的大鼠抗-小鼠IgG2 mAb 和珠结合的大鼠抗-小鼠κmAb的游离结合位点，并用抗-HLA-DR-FITC (克隆AC122，IgG2a)复染该混合物。
所选择的杂交瘤细胞在培养物中扩增，然后在液氮中冷冻贮藏，通过 极限稀释建立亚克隆，并将阳性亚克隆系列也冷冻于液氮中。利用 ISOTYPE Ab-STAT试剂盒(SangStat Medical Corp.，Palo Alto，CA)来 测定mAb的同种型。
为了制备mAb，杂交瘤细胞既可以腹水瘤于Balb/c小鼠中生长，收集 富含mAb的腹水液，也可在细胞培养物(滚瓶培养或中空纤维培养)中 收集富含mAb的培养上清液。如下从腹水液或细胞培养上清液中制备纯 的IgG mAb：首先用蛋白A亲和层析，随后在一些情形中，通过疏水相互 作用层析，于在4℃下贮藏在含5mmol/L EDTA和0.05％叠氮钠的PBS中。 所纯化的mAb与FITC(Sigma，St.Louis，MO)、PE(Cyanotech Corp.， Kailua Kona，HI)、Cy5(Amersham Life Science Inc.，Arlington Heights， IL)、APC(Europa Bioproducts Ltd.，剑桥，基因)、生物素(Pierce， Rockford，IL)和胶体超顺磁珠(大约50nm的直径，Miltenyi Biotec GmbH， Bergisch Gladbach，德国)按照标准技术结合。Hermanson(1996)生物结 合技术(Bioconjugate Techniques，)Academic Press Inc.，San Diego，785 页；Aslam等人(1998)生物结合：用于生物医学科学的蛋白质偶联技术 (Bioconjugation：protein coupling techniques for the biomedical sciences.)Macmillan Reference Ltd.，伦敦，833页；以及Kantor等人(1997) 用胶体超顺磁颗粒进行的磁性细胞分类(Magnetic cell sorting with colloidal superparamagnetic particles.)此文在细胞制备方法及应用(Cell Separation Methods and Applications)一书中，Recktenwald等人编辑， Marcel Dekker Inc.纽约，153-173页。
细胞的制备
来自正常的健康志愿者的血沉棕黄层是从Institute for Transfusionmedicine，Hospital Merheim，Cologne，德国获得的。用标准的 Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)密度梯度离心技术从血沉棕黄层 中制备PBMC。
用等离子氯化铵缓冲液(155mmol/L的NH4C、l0mmol/L的KHCO3以及0.1mM的EDTA)裂解红细胞，而从血沉棕黄层中制备外周血白细胞 (Hansel等人(1991)J.Immunol.Met.145：105-110)。利用在别处所详细 描述的二步免疫磁性细胞分类(MACS)技术，将CD4+lin-血液DC从PBMC 中分离出来(Robert等人(1999)；以及Miltenyi等人(1999)在流式细胞术和 细胞分类(Flow cytometry and cell sorting.)Radbruch编辑. Springer-Verlag，Berlin.一书中的高梯度磁性细胞分类(High gradient magnetic cell sorting.)218-247页)。简言之，利用抗CD3 mAb(克隆 BW264/56)、抗CD11b mAb(克隆MI/70.15.11.5)、抗CD16 mAb (克隆VEP-13)，来耗竭单核细胞、T细胞和NK细胞，并且在一些试验 中B细胞和单核细胞上表达有一种未充分说明的抗原(克隆L179)。然后 从被耗竭的细胞部分中，用抗CD4(M-T321)抗体富集血液DC至高度纯 化。为了筛分杂交瘤培养上清液(见上文)，基于CD3和L179抗原的表 达通过免疫磁性耗竭T细胞、B细胞和单核细胞，而仅仅部分富集了血液 DC。
可如下将表达CD1c-、BDCA-2-和BDCA-3的细胞从PBMC或扁桃体 中分离出来：用PE-或FITC结合的mAb(分别为AD5-8E7，AC144和 AD6-5E8)作为初级试剂而用抗-PE或抗-FITC mAb结合的微珠(Miltenyi Biotec GmbH)作为二级试剂来进行间接的磁性标记，然后用MACS富集 所标记的细胞。在一些试验中，基于用抗-BDCA-3 mAb(AD5-5E8)结合 的微珠进行的直接磁性标记来分离BDCA-3+细胞。如下获得没有污染 CD1c+B细胞的高度纯化的CD1c+血液DC：利用CD19 mAb结合的微珠 (Miltenyi Biotec GmbH)免疫磁性耗竭CD18+B细胞，随后免疫磁性富 集CD1c+细胞。通过基于用磁性标记试剂偪盒(Miltenyi Biotec)对表达CD3-、 CD7-、CD14-、CD15-、CD36-、CD45RA-和HLA-DR的细胞进行的间接 磁性标记而免疫磁性耗竭非嗜碱性粒细胞，可从PBMC中纯化出嗜碱性粒 细胞。基于分别用CD14、CD34和CD3 mAb结合的微珠(Miltenyi Biotec GmbH)进行的直接磁性标记可免疫磁性纯化CD14+单核细胞、CD34+造 血祖细胞和CD3+T细胞。
细胞培养
为了产生“未成熟”单核细胞衍生的DC(Mo-DC)，在500-1000U/ml rIL-4(PeproTech，Rocky Hill，NJ)和100ng/ml rGM-CSF(ReproTech) 的存在下，于37℃，湿润的含有5％CO2的环境下，于培养基(补充有 2mmol/L的L-谷氨酰胺、10％FCS(Sigma)、100mmol/L)的丙酮酸钠 (Gibco/BRL)、100U/ml的青霉素(Gibco/BRL)和100μg/ml的链霉素 (Gibco/BRL的RPMI1640(Gibco BRL))中以5x105至1x106个细胞 /ml的细胞密度将所纯化的CD14+单核细胞培养7天。为了产生“成熟” Mo-DC，将“未成熟”Mo-DC洗涤一次，并在20ng/ml的TNF-α (PeproTech)的存在下于培养基中再培养3天。为了产生CD34+造血祖 细胞衍生的DC(CD34-DC)，在100ng/ml rFlt3-配体(PeproTech)、0.5ng/ml 的rTGF-β1(PeproTech)、10ng/ml的rTNF-α、20ng/ml的rSCF (PeproTech)和100ng/ml的rGM-CSF的存在下，在培养基中以5x104 个细胞/ml的细胞密度将所纯化的CD34+细胞培养11天。在10ng/ml rIL-3 (PeproTech)的存在下，在培养基中以5x105至1x106个细胞/ml的细胞 密度将新鲜分离的CD4+lin-血液DC培养多达48小时。在没有任何细胞因 子存在下或在10ng/ml rIL-3、20ng/ml IL-4(PeproTech)和 100ng/mlGM-CSF的存在下，在培养基中以5x105至1x106个细胞/ml的 细胞密度将所分离的表达CD1c-、BDCA-2和BDCA-3的细胞培养多达48 小时。
实施例2
血液DCs的流式细胞术分析
FACScalibur(BD Biosciences)可用于单色、双色、三色或四色流式 细胞术。数据(5x103至2x105个细胞/样品)是以列表的方式获得的并且 用CellQuest软件(BD Biosciences)进行分析。
以下mAb(克隆名)用于本次的流式细胞术的研究中：CD1a(HI149)、 CD10(HI10a)、CD11a(G43-25B)、CD11c(B-ly6)、CD25(M-A261)、 CD27(M-T271)、CD32(FL18.26)、CD38(HIT2)、CD40(5C3)、 CD43(IG10)、CD54(HA58)、CD62L(Dreg56)、CD64(10.1)、 CD69(FN50)、CD98(UM7F8)、抗-HLA-DQ(TU169)以及抗-TCRαβ T1OB9.1A-31(来自PharMingen，San Diego，CA)；CD2(S5.2)、CD8 (SK1)、CD13(L138)、CD14(MFP9)、CD19(SJ25-CI)、CD33 (P67.6)、CD34(8G12)、CD45RO(UCHL-1)、CD56(NCAM16.2)、 CD71(L01.1)、CD123(9F5)、抗-IgD(TA4.1)、抗-小鼠IgG1(X56)、 抗-小鼠IgG2(X57)和抗-小鼠IgM(X54)(来自BD Biosciences)；CD5 (CLB-T11/11，6G4)、CD7(CLB-T-3A1/1，7F3)、CD16(CLB-FcRgran/l， 5D2)、CD45RA(F8-11-13)、CD80(CLB-DALI)(来自CLB，Amsterdam， Netherlands)；CD18(7E4)、CD23(9P25)；CD58(AICD58)、CD77 (38.13)、CD83(HB15A)、CD86(HA5.2B7)、CD116(SC06)(来 自Coulter Immunotech，Marseilles，法国)；CD4(M-T321)、CD11b (MI/70.15.11.5)、CD14(TUK4)、CD15(VIMC6)、抗-HLA-DR(910/D7)、 抗-AC133(AC133/1)和抗-TCRαβ(BW242/412)(来自Milenyi Biotec GmbH)、CD36(AC106)、CD123(AC145)、抗-HLA-DR(AC122 和AC123)和抗-GPA(AC107)(来自Amcell，Sunnyvale，CA)；CD1c (M241)(来自Ancell，Bayport，MN)；多克隆抗-IgG、抗-IgM(SA-DA4)、 多克隆抗-κ以及多克隆抗-λ(来自Southern Biotechnology Associates，Birminghsm.Alabama)；CD61(VIPL2)(来自W.Knapp， Institute of Immunology，University of Vienna，维也纳，奥地利)；CD44 (IM7)(来自J.Moll，Forschungszentrum Karlsruhe，Karlsruhe，德国)； CD20(H147)(来自Caltag Laboratories，Burlingame，CA)；抗-CLA (HECA-452)(来自E.Butcher，Department of Pathology，Stanford University，Stanford，CA)；抗-FcεRI(15-1)(来自J.P.Kinet，Molecular Allergy and Immunology Section，National Institute of Allergy and Infectious Diseases，National Institutes of Health，Rockville，Maryland)； CD11c(Ki-M1)(来自M.R.Parwaresch，Department of Pathology， Christian Albrechts University，Kiel，德国)；CMRF-44和CMRF-56(来 自D.N.Hart，Mater Medical Research Institute，Mater Misericordiae Hospitals，South Brisbane，昆士兰，澳大利亚)；以及抗-HLA-A、-B、-C (W6/32)(来自Sigma)。
所有抗体都用作FITC-、PE-、生物素-或Cy5结合的mAb。对于用生 物素化mAb进行的间接免疫荧光染色，使用链亲合素-APC(BD Biosciences)。为了排除流式细胞术分析中的死细胞，用碘化丙碇给细胞 染色。为了使Fc受体介导的mAb结合最小化，大多数实验在含有人IgG 的FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec GmbH)存在下给细胞染色。
显微镜分析
用细胞离心机(Cytospin3，Shandon，Pittsburgh，PA)将细胞下旋至载 玻片上。对于荧光显微术，载玻片在细胞离心之后于空气中干燥过夜并安 装有荧光镜架(Fluoromount G)(Southern Biotechnology Associates)。 对于May Grunwald/Giemsa染色，载玻片在细胞离心之后于空气中干燥至 少2小时，并在室温下于May Grunwald/Giemsa溶液(Merck，Darmstadt， 德国)中染色2分钟，然后在蒸馏水中进行彻底漂洗，再在室温下于Giemsa 溶液(Merck)中染色15分钟，并在蒸馏水中反复洗涤，空气中干燥至少 2小时。利用Zeiss Axioscop，显微镜(Zeiss，Oberkochen，德国)进行分析。 用Xillix Microlmager Ml1400-12X(Xillix，Vancouver，加拿大)制作数字 图片。
实施例3
交叉抑制、共帽化和其内化分析
为了分析两个不同的mAb克隆是否识别相同(或者紧密相关的)的 抗原表位，可进行交叉抑制结合测定。在4℃下将1x106至2x106个细胞 与浓度大约100μg/ml的两种mAb克隆之一预温育10分钟，然后在4℃下 用另一种mAb克隆以最佳滴度与PE的结合物染色5分钟。用PBMC来 分析BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4特异性mAb克隆的交叉抑制，并用 MOLT-4细胞来分析CD1c特异性mAb克隆的交叉抑制。用流式细胞术 来分析细胞染色。
为了确定AD5-5E8和AD5-14H12是否识别相同抗原(或者相同的抗 原复合物)，进行了共帽化测定。简言之，通过用PE结合的AD5-14H12 mAb 和抗-PE mAb结合的微珠进行间接磁标记，从而将表达BDCA-3的细胞从 PBMC中分离出来，所分离的细胞于37℃下温育30分钟，以便诱导mAb- 抗原复合物的帽化。之后，用补充有0.1％叠氮钠的冰冷PBS/EDTA/BSA (PBS/EDTA/BSA/叠氮化物)洗涤细胞，并在4℃下用在PBS/EDTA/BSA/ 叠氮化物中的FITC结合的AD5-5E8mAb染色10分钟。利用荧光显微镜 分析细胞染色。
利用共内化分析来考证AC144和AD5-17F6是否识别相同的抗原(或 者相同的抗原复合物)。简言之，在室温下于PBS/BSA中将1x106的PBMC 与50μg/ml的AC144mAb一起温育15分钟，并在PBS/BSA中洗涤两次， 然后于37℃下在细胞培养基中温育30分钟。为了分析AC144 mAb在培养 之后是否被内化，在培养期之前或之后用大鼠抗-小鼠IgG1-PE给若干等 份的细胞染色。为了确定所有的AC144 mAb结合位点在培养之前是否已 被未结合的AC144 mAb饱和，以及培养之后是否重新出现任何游离的结 合位点，在培养期之前和之后用AC144-PE给若干等份的细胞染色。为了 分析AD5-17F6抗原是否被共内化，在培养期之前和之后用AD5-17F6-PE 给若干等份染色。用CD123-FITC和HLA-DR-Cy5给所有细胞进行复染， 以便能够在流式细胞术分析中选通CD123亮HLA-DR+浆细胞样DC。
实施例4
胞吞分析
为了评估血液DC亚类的胞吞作用，在37℃下将纯化的CD1c+、 BDCA-2+和BDCA-3+血液DC，以及(作为对照的)纯化CD3+T细胞于含 有1mg/ml萤光黄(LY)的培养基中温育0、15、45和75分钟。之后， 细胞在冰冷的PBS/EDTA/BSA中洗涤三次并用流式细胞术分析。
实施例5
所分离的血液DCs与未培养的血细胞的反应性
按照表1所列的mAb与血细胞的反应性，可将其分成四组：(1) AC144、AD5-13A11和ADB-4B8；(2)AD5-17F6；(3)AD5-5E8和 AD5-14H12；以及(4)AD5-8E7。
第一组的mAb即AC144、AD5-13A11和ADB-4B8，可对所有PBMC 的大约0.41±0.17％(n＝10)染色(图1A)。在前面和侧面散射信号的点阵 图中，这些稀有细胞构成了位于小的静止期淋巴细胞和单核细胞之间的均 相细胞群(图1B)。因此，这些稀有细胞不表达分别在T细胞、单核细胞、 B细胞和NK细胞上表达的αβT细胞受体(TCRαβ)、CD14、CD19 和CD56(图1A)，即谱系标志物。高度纯化的血液DC(＞95％的HLA-DR+、 TCRαβ-、CD14-、CD19-和CD56-)的染色揭示出：第一组的mAb可与 CD11c-CD123亮血液DC反应(图2)，但不与CD11c+血液DC反应。为 了分析它们是否全部都与单一抗原反应，我们进行双色染色和交叉抑制研 究。结果表明，这一组的所有mAb都识别相同抗原的同一个表位。该抗 原被命名为BDCA-2。
如图3所示，第二组的mAb即AD5-17F6，它识别的PBMC中的细 胞与AC144识别的PBMC中的细胞相同，其中所述AC144为第一组中 BDCA-2特异的mAb之一。然而，被AD5-17F6染色的抗原不同于BDCA-2。 这可由共内化实验明确证实，其中AD5-17F6在抗-BDCA-2 mAb介导的 BDCA-2的内化之前和之后所显示的表面染色强度相同；这还可由培养后 对DC的染色明确证实，其中AC144 mAb和AD5-17F6 mAb显示出完全 不同的染色模式(图4)。被AD5-17F6识别的抗原命名为BDCA-4并且 等同于神经纤毛旦白-1(He等人(1997))。
第三组的mAb即AD5-5E8和AD5-14H12，可对所有PBMC的大约 0.04±0.01％(n＝10)染色(图1A)。根据散射信号(图1B)和用抗TCR  αβ、CD14、CD19和CD56的mAb进行的复染(图1A)，这些细胞可 与淋巴细胞和单核细胞区分开，并比第一组抗体识别的细胞稍大些。因此， 对血液DC的染色表明AD5-5E8和AD5-14H12识别的是不同的亚类，这 个亚类被命名为CD11c暗CD123-血液DC(图2)。根据双色染色、交叉 封闭研究和共帽化实验，这两种mAb似乎识别同一抗原的两个在空间上 不相关的表位。我们将该抗原命名为BDCA-3。
第四组mAb即AD5-8E7，可与高达2.39±0.96％(n＝10)的未分级 PBMC反应(图1A)。对谱系标志物TCRαβ、CD14和CD19的光散 射分析(图1B)和复染色揭示出该mAb不与T细胞及单核细胞反应，但 小的静止期CD19+B细胞的主要亚类反应。对纯化DC的染色表明，除了 B细胞之外，AD5-8E7也可染色血液DC的第三亚类，该亚类不同于第一 和第二组的mAb所识别的那些亚类，并命名为CD11c亮CD123暗血液DC。 相当比例的CD11c亮CD123暗血液DC表达CD56(参见以下部分)。由于 这个原因，一些可与AD5-8E7反应的PBMC为CD56染色(图1A)。 AD5-8E7不与纯化的NK细胞反应。由AD5-8E7识别的抗原最初被命名 为BDCA-1，因为它似乎是一个新抗原。然而，随后又发现AD5-8E7完全 封闭CD1c mAb M241与MOLT-4细胞的结合(图6)。于是，被AD5-8E7 识别的抗原是CD1c。
表1所列的mAb没有一个可与粒细胞、血小板、红细胞、纯化嗜碱 性粒细胞和纯化CD34+造血祖细胞反应。
实施例6
BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在所培养的血液DC、Mo-DC和 CD34-DC上的表达
新鲜分离的浆细胞样CD11c-血液DC的生存和成熟依赖于IL-3，而 CD11c+血液DC的生存和成熟远非细胞因子依赖的。在rIL-3的存在下， 对全血DC培养0、1、3、6、9、12、18、24、36和48小时之后，分析 BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在CD11c-和CD11c+血液DC上的表达。结 果如图4所示。在48小时之内BDCA-2在CD11c-血液DC上的表达完全 下调。相反，BDCA-4在CD11c-血液DC上的表达甚至进一步被上调，并 且不像BDCA-2，BDCA-4还在大部分CD11c+DC上(如果不是所有的话) 以高水平表达。在CD11c-血液DC上BDCA-3的表达被迅速诱导，并在 24小时之后达到最高的表达水平。此后，BDCA-3的表达似乎又被下调。 分析BDCA-3在CD11c+血液DC上的表达被以下事实复杂化：即BDCA-3- CD11c亮和BDCA-3+CD11c暗亚类在培养开始时均存在。至少在培养的6 小时之内在BDCA-3+CD11暗血液DC群上BDCA-3的表达保持不变，并 且在3小时之内在BDCA-3-CD11c亮血液DC亚类的至少一些细胞上 BDCA-3的表达被诱导。
BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在Mo-DC和CD34-DC上的表达
单核细胞和CD34+造血祖细胞离体产生功能CD1a+DC(Bender等人 (1996)；Pickl等人(1996)；Romani等人(1994)；Sallusto等人(1994)；Caux等 人(1992)；Mackensen等人(1995)；Szabolcs等人(1995)；Herbst等人(1996)； de Wynter等人(1998)；以及Strunk等人(1996))。图7表明，Mo-DC和 CD34-DC表达CD1a、CD1c和BDCA-4，但不表达BDCA-2和BDCA-3， 其中Mo-DC通过在rGM-CSF和IL-4存在下培养单核细胞7天而产生， 且其中CD34-DC通过在rFlt3-配体、rTGF-β1、rTNF-α、rSCF和rGM-CSF 存在下培养CD34+造血祖细胞11天而产生。
实施例7
在抗-BDCA-2介导的交联之后BDCA-2被内化
通过用FITC结合的AC144 mAb(IgG1)给PBMC染色，提出了抗 -BDCA-2 mAb标记的BDCA-2+细胞在37℃温育导致mAb内化的可能性。 其次，在37℃温育后，通过用PE结合的大鼠抗-小鼠IgG1 mAb进行染色 来检测残留的细胞表面相关mAb。如图8所示，当细胞在37℃下进行温 育时，大鼠抗-小鼠IgG1-PE的的染色强度非常迅速地降到背景水平。相 反，AC144-FITC染色强度仅仅暂时降到大约50％的水平，但其后又返回 到接近预温育水平。这证实，BDCA-2在抗-BDCA-2 mAb交联之后被内化， 并具有类似于受体介导的胞吞作用的动力学特性。AC144-FITC染色强度 的瞬时下降可能是由于胞吞作用之前BDCA-2/抗-BDCA-2 mAb复合物的 斑化作用和帽化作用。
实施例8
所分离的CD1c+ 、BDCA-2+ 和BDCA-3+ 血液DC的形态学 通过用PE结合的一级mAb和抗-PE Ab结合的微珠进行间接磁性标记并 通过MACS富集被标记的细胞，可将CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+细胞 从PBMC中分离出来(图9)。在细胞离心的载玻片进行May Grunwald/Giemsa染色时(图9)，新鲜分离的表达BDCA-2的细胞展示 出来自血液和扁桃体的CD11c-CD4+lin-DC的典型淋巴浆细胞样形态学： 即，具有卵形或锯齿形细胞核的中等尺寸的圆形细胞。相反，新鲜分离的 CD1c+血液DC以及新鲜分离的BDCA-3+血液DC均显示出来自血液或扁 桃体的CD11c+CD4+lin-DC的典型形态学特征：即，具有短细胞突起和更 多超小叶形细胞核的非圆形细胞。除了CD1c+BDC之外，在所分离的 CD1c+PBMC的细胞离心载玻片上还可看到具有典型的小的静止期淋巴细 胞形态的CD1c+B细胞。如果在富集CD1c+细胞之前将CD19+B细胞从 PBMC中磁性分离出来，可获得高度纯化的CD1c+BDC。
实施例9
CD1c+、BDCA-2+ 和BDCA-3+ 血液DC的表面表型
通过用PE-和FITC结合的mAb进行双色免疫荧光来分析BDCA-2+ 和BDCA-3+血液DC的表型。对于CD1c+血液DC的分析，用CD19-Cy5 进行三色染色，以便排除B细胞。表位分析结果如表2所示并可总结如下： 血液DC亚类都不表达CD1a、CD8、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、 CD25、CD27、CD34、CD61、CD69、CD7.1、CD77、CD80、CD83、血 型糖蛋白A(GPA)、TCRαβ、AC133、IgD、IgM和CMRF-56抗原。 所有的血液DC亚类都表达相似水平的CD43、CD44、CD54和MHCI类 分子。BDCA-2+血液DC与其它两个亚类不同，因为其不表达CD13、CD40、 CD45RO、CD56，但表达CD45RA和少量的CD10，且其表达较低水平的 CD18、CD38、CD58、CD98、CD116和CLA，以及表达较高水平的CD4。 CD1c血液DC与其它两个亚类不同，因为其表达CD2，且表达较高水平 的MHC II类分子，但表达较低水平的CD62L，并且还表达Fc受体CD32、 CD64和FcεR1。可能是由于对Fc受体的表达，CD1c+血液DC也为IgG、 κ和λ阳性；另外，一些CD1c+DC为CD14和CD11b阳性，而它们的表 达水平与CD1c和CD2表达水平成反比。BDCA-3+血液DC不同于其它两 个亚类，因为其以非常低的水平来表达CD36并且似乎还表达低水平的 CD5。最后，除了CD11c和CD123外，至少一种其它抗原即CD33，可用 于区分所有三个亚类：CD33以低水平表达在BDCA-2+DC上，以中等水 平表达在BDCA-3+DC上，而以高水平表达在CD1c+DC上。
                        表2     抗原     克隆   BDCA-2+   BDCA-3+   CD1c+     CD1a     HI149     -     -     -     CD1c     M241     -     -     +     CD2     S5.2 -/次要亚类+     -     +     CD4     M-T321     ++     +     +     CD5   CLB-T1/1，6G4     -     -/+     -     CD7   CLB-T3A1，7F3 -/次要亚类+     -     +   CD8     SK1     -     -     -   CD10     HI1Oa     -/+     -     -   CD11a     G43-25B     +     ++     +   CD11b     M1/7O.15.11.5     -     -     -/+   CD11c     Ki-M1     -     +     ++   CD13     L138     -     +     +   CD14     TUK4     -     -     -/+   CD15     VIMC6     -     -     -   CD16     CLB-FcR Gran/1     -     -     -   CD18     7E4     +     ++     ++   CD19     SJ25-C1     -     -     -   CD20     HI47     -     -     -   CD23     9P25     -     -     -   CD25     M-A251     -     -     -   CD27     M-T271     -     -     -   CD32     FL 18.26(2003)     -     -     +   CD33     P67.6     -/+     +     ++   CD34     8G12     -     -     -   CD36     AC106     +     -/+     +   CD38     HIT2     +     ++     ++   CD40     FC3     -     -/+     -/+   CD43     1G10     +     +     +   CD44     IM7     +     +     +   CD45RA     F8-11-13     +     -     -   CD45RO     UCHL-1     -     +     +   CD54     HA58     +     +     +   CD56     NCAM16.2     -     -/亚类+     -/亚类+   CD58     AICD58     +     ++     ++     CD61     VIPL2     -     -     -     CD62L     DREG56     -     +     +     CD64     10.1     ++     ++     +     CD69     FN50     -     -     -     CD71     LO1.1     -     -     -     CD77     38.13     -     -     -     CD80     DAL-1     -     -     -     CD83     HB15A     -     -     -     CD86     HA5.2B7     +     ++     +++     CD98     HIM6     ++     +++     +++     CD116     SC06     +     ++     ++     CD123     AC145     ++     -     +     HLA-DR     AC122     +     +     ++     HLA-DQ     TU169     +     +     ++  HLA-A，B，C     W6/32     +     +     +     GPA     AC107     -     -     -     TCRαβ     T10B9.1A-31     -     -     -     AC133     AC133     -     -     -     FcεR1     15-1     -     -     +     IgD     TA4.1     -     -     -     IgG     多克隆     -     -     +     IgM     SA-DA4     -     -     -     κ     多克隆     -     -     +     λ     多克隆     -     -     +     CLA     HECA-452     ++     +++     +++     CMRF44     CMRF44     -     - -/次要亚类+     CMRF56     CMRF56     -     -     -
实施例10
培养之后MHC II类、CD83和共刺激分子在CD1c+ 、BDCA-2+ 和 BDCA-3+ 血液DC上的表达
在没有任何补充细胞因子的培养基中将新鲜分离的CD1c+血液DC和 BDCA-3+血液DC培养1天，并且在转染CD32的成纤维细胞上于补充有 IL-3和CD40 mAb的培养基中，将新鲜分离的BDCA-2+血液DC培养2 天。培养期之后，分析细胞CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的 表达。为了对比，还包括通过在GM-CSF和IL-4的存在下培养单核细胞7 天而产生的所谓“未成熟”Mo-DC，以及通过在TNF-α的存在下培养“未 成熟”Mo-DC 3天而产生的所谓“成熟”Mo-DC(Sallusto等人(1995)实 验医学杂志182：389-400；以及Sallusto等人(1998)免疫学杂志 28：2760-2769)。如图10所示，与“未成熟”Mo-DC和“成熟”Mo-DC 相反，培养期之后血液DC亚类都不表达CD1a。然而，共刺激分子CD80 和CD86、DC活化抗原CD83(Zhou等人(1995)；Zhou等人(1992)免疫学 杂志149：735-742；以及Zhou等人(1996)美国国家科学院院报USA 93：2588-2592)以及HLA-DR分子在培养之后于所有三种血液DC亚类上 均上调到与成熟Mo-DC相当的类似水平上。该结果与另一实验没有明显 的不同，其中在另一实验中，所有三种血液DC亚类在补充有IL-3、IL-4 和GM-CSF的培养基中培养2天。正如以前对来自血液和扁桃体的 CD11c-CD4+lin-DC所显示的，BDCA-2+血液DC当在没有IL-3的培养基 培养时会迅速死亡。
实施例11
新鲜分离的CD1c+ 、BDCA-2+ 和BDCA-3+ 血液DC的胞吞能力
通过在LY的存在下于37℃培养纯化的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+ 血液DC以及作为对照的纯化CD3+T细胞，并在不同时间段之后用流式细 胞术来分析LY的摄取，可测定上述细胞的胞吞能力。如图11所示，不像 纯化的CD3+T细胞，纯化的CD1c+血液DC、BDCA-3+血液DC以及在某 种程度上BDCA-2+血液DC具有胞吞LY的能力。用FITC-葡聚糖可获得 类似的结果。所有的血液DC群的胞吞能力与Mo-DC相比都要低得多。
通过用AD5-17F6 mAb(AD5-17F6亲和柱)纯化抗原并用MALDI TOF质谱法分析所纯化的抗原，可获得BDCA-4的氨基酸序列。BDCA-4 与神经纤毛旦白-1等同(He等人(1997))。
实施例12
BDCA-2与抗-BDCA-2单克隆抗体(AC144)的连接诱导胞内Ca2+动 员，而BDCA-4(神经纤毛旦白-1)与抗-BDCA-4的连接不诱导Ca2+动员。
材料和方法：
测定BDCA-2+BDCA-4+BDC和BDCA-2转染或未转染的U937细胞中 的胞质钙。BDCA-2+BDCA-4+血液DC和BDCA-2转染或未转染的U937 细胞载有Indo-1 AM(Sigma，St.Louis，MO)(正如Valitutti等人所述，(1993) 欧洲免疫学杂志.23：790-795)。分别将抗-BDCA-2(AC144，IgG1)或抗 -BDCA-4(AD5-17F6，IgG1)mAb加入到新鲜分离的 BDCA-2+BDCA-4+BDC和BDCA-2转染或未转染的U937细胞中，随后加 入或不加入作为交联剂的大鼠抗-小鼠IgG1mAb(X56)。在流式细胞荧光 测定仪分析细胞，以便检测Ca2+流出。该分析中只包括活的(基于散射标 准)和Indo-1标记的细胞(基于405nm/525nm的发射光谱)。
图13表示，抗-BDCA-2 mAb单独(A)和/或抗-BDCA-2加上交联的 二级mAb(B、D、E)可对免疫磁性纯化的BDCA-2+BDCA-4+BDC(A、 B)和BDCA-2转染的U937细胞(D)诱导细胞内动员，而对未转染的 U937细胞(E)却不诱导。
将免疫磁性纯化的BDCA-2+BDCA-4+BDC上的BDCA-4与抗 -BDCA-4mAb连接并与二级mAb交联不会诱导胞质Ca2+动员。所示出的 是，Ca2+依赖的Indo-1-荧光405nm/525mm之比(Y轴)对时间(X轴， 1024值对应于204，80秒)的作图。
如图13所示，将浆细胞样BDC(图13A和B)和BDCA-2转染的 U937细胞(图13D)上的表面BDCA-2与特异性mAb(AC144，IgG1)， (随后进行(图13B和D)或不进行(图13A)二级交联mAb(大鼠抗- 小鼠IgG1，X56)，可引发胞质钙浓度迅速快速且暂时的升高。相反，浆 细胞样DC与抗-BDCA-4 mAb(AD5-17F6)、然后与二级交联mAb(大 鼠抗-小鼠IgG1，X56)温育(图14C)，以及未转染的U937细胞与抗 -BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)、然后与二级交联mAb(大鼠抗-小鼠IgG1， X56)温育(图13E)都不会诱导胞质钙浓度快速且暂时的升高。
实施例13
通过用抗-BDCA-2 mAb触发BDCA-2，可抑制纯化的 BDCA-2+ BDCA-4+ BDC对病毒刺激(流感病毒株PR8)的应答而导致的I 型干扰素的产生
在应答包膜病毒、细菌和肿瘤细胞时，CD4+CD123亮CD11c-浆细胞样 DC表现为主要的I型干扰素产生细胞(Fitgerald-Bocarsly等人(1993)药 物治疗(Pharmacol.Ther.)60：39-62；Siegal等人(1999)科学284：1835-1837； Cella等人(1999)自然医学(Nature Med.)5：919-923)。由于这个原因， 它们已经被称为天然I型干扰素生成细胞(NIPC)。浆细胞样DC表达 BDCA-2和BDCA-4。如图14所示，将浆细胞样DC上的表面BDCA-2与 特异的mAb、然后与二级交联mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)连接，可 抑制由来自血液或扁桃体的免疫磁性纯化的浆细胞样 BDCA-2+BDCA-4+DC对流感病毒株PR8(5HAU/ml)的应答而导致的I 型干扰素的分泌。在含有抗-BDCA-2、流感病毒和交联mAb的培养物(图 14，AC144+RamG1+FLU)中I型干扰素的产生水平远低于仅含有流感 病毒的培养物(图14，FLU)或者含有同种型对照mAb(抗-细胞角蛋白 mAb CK3-11D5，IgG1)、流感病毒和交联mAb的培养物(图14，CK3 +RamG1+FLU)中I型干扰素的产生水平。
相反，浆细胞样DC上的表面BDCA-4与特异的mAb、然后与二级交 联mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)连接，不会抑制由来自血液或扁桃体的 免疫磁性纯化的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC对流感病毒株PR8 (5HAU/ml)的应答而导致的I型干扰素的分泌。I型干扰素在含有抗 -BDCA-4、流感病毒交联的mAb的培养物(图14，17F6+RamG1+FLU) 中的生成水平与在含有同种型对照mAb(抗-细胞角蛋白mAb CK3-11D5， IgG1)、流感病毒和交联mAb的培养物(图14，CK3+RamG1+FLU) 中的生成水平相同。
材料和方法：
通过用抗-BDCA-4(AD5-17F6)结合的微珠进行直接磁性标记并用 MACS富集所标记的细胞，可将表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC 从PBMC(图14A)或扁桃体细胞(图14B)中分离出来。在存在以下物 质的培养基中，培养所分离的表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC 24 小时：a)只存在IL-3(图14，对照)；b)IL-3、抗-BDCA-2 mAb(AC144， IgG1)和大鼠抗-小鼠IgG1 mAb(图14，AC144+RamG1)；c)IL-3、抗 -BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株 PR8(图14，AC144+RamG1+FLU)；d)IL-3和流感病毒株PR8(图14， FLU)；e)IL-3、抗-细胞角蛋白mAb(CK3-11D5，IgG1)、大鼠抗-小 鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(图14，CK3+RamG1+FLU)；以及f)IL-3、 抗-BDCA-4 mAb(AD5-17F6)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8 (图14，17F6+RamG1+FLU)。
参照标准的INF-α曲线通过评估对Daudi细胞增殖的抑制可测定培养 物上清液中所分泌的I型干扰素(Nederman等人(1990)生物制剂 (Biologicals)18：29-34)。
关于对BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC产生的I型干扰素的抑制，在 SLE病人体内发现循环的I型干扰素与型I干扰素诱导因子的水平升高(类 似于抗-DNA抗体和DNA复合物)，并且它们还与疾病的活动性有关。另 外，用I型干扰素治疗的非自身免疫紊乱病人频繁地产生自身抗体并且偶 尔导致SLE。来自Ronnblom等人(1999)临床和实验免疫学(Clin.Exp. Immunol.)115：196-202；(1999)免疫学杂志163：6306-6313；以及(2000)免疫 学杂志165：3519-3526的几篇论文表明，来自病人的I型干扰素诱导因子可 诱导来自健康供体的PBMC分泌I型干扰素，并且它们还选择性激活天然 I型干扰素生成细胞(NIPC＝浆细胞样DC)。
此处提出的BDCA-2的连接抑制了病毒刺激而诱导的I型干扰素的产 生，这一发现表明可利用BDCA-2的结合来治疗疾病，它不仅通过BDCA-2 的连接而且通过耗竭NIPC(＝BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC)而发挥 作用。因此本发明还包括体内、体外及离体耗竭NIPC。这种耗竭适用于 自身免疫疾病的治疗或预防。
图14表示是BDCA-2(而不是BDCA-4)与特异性mAb、然后与二 级交联mAb的连接可抑制由来自血液或扁桃体的浆细胞样 BDCA-2+BDCA-4+DC对流感病毒株PR8刺激的应答而导致的I型干扰素 的分泌。在以下物质的存在下，将来自血液(A)或扁桃体(B)的浆细胞 样BDCA-2+BDCA-4+DC培养24小时：只有IL-3(对照)；IL-3、抗 -BDCA-2 mAb和大鼠抗-小鼠IgG1 mAb(AC144+RamG1)；IL-3、抗 -BDCA-2 mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(AC144+ RamG1+FLU)；IL-3和流感病毒株PR8(FLU)；IL-3、抗-细胞角蛋 白mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株PR8(CK3+ RamG1+FLU)；IL-3、抗-BDCA-4 mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流 感病毒株PR8(17F6+RamG1+FLU)。参照标准的I型干扰素曲线通过 生物分析方法可测定在培养物上清液中所分泌的I型干扰素(U/ml)。
实施例14
BDCA-2不仅能够胞吞配体，而且能够将其递送到加工和装载抗原的 区室中，并将其呈递给CD4+ II类限制性T细胞。
材料和方法：
通过用抗-BDCA-4(AD5-17F6)结合的微珠进行直接磁性标记并用 MACS富集所标记的细胞，可将表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC 从PBMC中分离出来。在IgG1 mAb(0.2μg/ml)的存在下，将分离的表达 BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC于96孔平底微板上与4x104个细胞/ 孔的B13 T细胞克隆(Lanzavecchia等人(1988)实验医学杂志 167：345-352)共培养。以下是分析中所用的mAb：AC144(抗-BDCA-2， IgG1)、ZM3.8(抗-ILT3，IgG1)和CK3-11D5(抗-细胞角蛋白，IgG1)。 48小时之后，用(3H)胸苷(1μCi/孔)脉冲标记培养物，并且在继续培 养16小时之后测定所掺入的放射活性。将(3H)胸苷的摄入(cpm)对培 养物中所分离的表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC数作图(图15)。
图15表示所分离的表达BDCA-2和BDCA-4的浆细胞样DC可将抗 -BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)呈递给小鼠IgG1特异的T细胞克隆。与 抗-ILT-3 mAb(ZM3.8，IgG1，▲)和抗-细胞角蛋白mAb(CK3-11D5， IgG1，●)相比，BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC可将抗-BDCA-2 mAb (AC144，IgG1，■)更有效地呈递给T细胞。
于37℃温育抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)标记的 BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC，可导致抗-BDCA-2 mAb/BDCA-2复合物 在细胞表面极迅速地内化(图8)。此处表明，抗-BDCA-2 mAb(AC144， IgG1)进入了加工和装载抗原的区室并且由该抗体衍生的肽被有效地呈递 给特异于小鼠IgG1肽表位的CD4+II类限制性T细胞克隆(B13)。将抗 -BDCA-2 mAb的呈递与结合到受体(ILT3)上的IgG1 mAb的呈递进行 比较，其中所述受体已知能够将其配体靶向到加工和装载肽的区室内，还 将抗-BDCA-2 mAb的呈递与不结合BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC上的 细胞表面分子但是能够摄入流体相中的IgG1 mAb(抗-细胞角蛋白 mAbCK3-11D5，IgG1)的呈递进行比较。如图15所示，与抗-ILT-3 mAb 和抗-细胞角蛋白mAb相比，BDCA-2+BDCA-4+浆细胞样DC可将抗 -BDCA-2 mAb(AC144)更有效地呈递给T细胞。
实施例15
在扁桃体细胞中，BDCA-2的表达被限制在CD123+ T细胞区相关的浆 细胞样DC上，而BDCA-4也可低水平地表达在一些其它细胞上。
图16表示BDCA-2和BDCA-4在扁桃体浆细胞样CD123+DC上表达。 所示出的是，分别用FITC结合的抗BDCA-2 mAb(AC144)和PE结合 的抗CD123和BDCA-4的mAb(AD5-17F6)对扁桃体细胞进行双色染色。 注意，BDCA-2的表达被限制在CD123亮的浆细胞样DC上，而BDCA-4 也可低水平地表达在一些其它细胞上。
实施例16
BDCA-4 mAb(AD5-17F6)识别神经纤毛旦白-1
神经纤毛旦白-1是脑衰蛋白/semaphorin家族的受体，其介导神经细 胞导向。内皮细胞和肿瘤细胞也表达神经纤毛旦白-1，而后者作为血管内 皮生长因子的同种型特异性受体。但以前不知道神经纤毛旦白-1在血液和 扁桃体中的浆细胞样DC上表达并且它可作为至少是在新鲜未培养血液中 浆细胞样DC的极好标记物。
材料和方法：
用抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))将神经纤毛旦白 -1从未转染的PAE细胞(P)和神经纤毛旦白-1转染的PEA细胞(NP) 的细胞裂解物中免疫沉淀出来(Soker等人(1998)细胞92：735-745)。用 BDCA-4特异的mAb AD5-17F6(ML)或神经纤毛旦白-1特异的mAb (来自Shay Soker，波士顿儿童医院(Children’s Hospital，Boston)， MA(S))通过SDS-PAGE和Western印迹法来分析所沉淀的蛋白质。
图17表示，用抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))将神 经纤毛旦白-1从神经纤毛旦白-1转染的PEA细胞(NP)(而不是未转染 的PAE细胞(P))的细胞裂解物中免疫沉淀出来。利用BDCA-4特异的 mAb AD5-17F6(ML)或神经纤毛旦白-1特异的mAb(来自Shay Soker， 波士顿儿童医院MA(S))通过SDS-PAGE和Western印迹法来分析所沉 淀的蛋白质。
注意，BDCA-4特异的mAb AD5-17F6从神经纤毛旦白-1转染的PEA 细胞(NP)(而不是未转染的PAE细胞(P))中免疫沉淀出大约130-140kDa 的特定条带。可用来自Shay Soker(S)的神经纤毛旦白-1特异的mAb(而 不是抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(ML))来检测该条带。于是，在标准 免疫沉淀实验中我们的抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6识别天然形式的神经 纤毛旦白-1，但是当用于SDS-PAGE/Western印迹实验中时却不能检测到 神经纤毛旦白-1的变性形式。
令人感兴趣的是，神经纤毛旦白-1还可由内皮和肿瘤细胞来表达，而 后者作为血管内皮生长因子(VEGF)的同种型特异性受体。更感兴趣的 是，有几篇论文(Gabrilovich等人(1996)自然医学2：1267；自然医学2： 1096-103；Gabrilovich等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5： 2963-70；Ohm等人(1999).免疫学杂志163：3260-8；Oyama等人(1998)免疫 学杂志160：1224-32；Gabrilovich等人(1998).血液92：4150-66；Ishida等人 (1998)免疫学杂志161：4842-51)业已表明，由大多数肿瘤所产生的VEGF 减小了体内DC的生成和功能。还不清楚对DCs的这些作用是否由神经纤 毛旦白-1(BDCA-4)介导，但是本发明包括神经纤毛旦白-1介导的对DCs 的功能调节。
实施例17
通过用抗-BDCA-2 mAb触发BDCA-2，可抑制纯化的 BDCA-2+ BDCA-4+ BDC对poly I：C刺激的应答而导致的I型干扰素(IFN- α)的产生
在对包膜病毒、细菌和肿瘤细胞的应答中，CD4+CD123亮CD11c-浆细 胞样DC表现为主要的I型干扰素产生细胞(Fizgerald-Bocarsly等人(1993) 药物治疗(Pharmacol.Ther.)60：39-62；Siegal等人(1999)科学 284：1835-1837；Cella等人(1999)自然医学5：919-923)。由于这个原因， 它们也已被称作天然I型干扰素生成细胞(NIPC)。浆细胞样DC表达 BDCA-2和BDCA-4。如图19所示，将浆细胞样DC上的表面BDCA-2与 特异的mAb、然后与二级交联mAb(山羊抗-小鼠IgG)的连接，可抑制 由来自血液或扁桃体的免疫磁性纯化的浆细胞样BDCA-2+BDCA-4+DC对 poly I：C刺激的应答而导致的IFN-α的分泌。IFN-α在具有抗-BDCA-2、 poly I：C和交联mAb(图18，AC144+山羊抗-小鼠IgG+poly I：C)的培 养物中的生成水平与在具有小鼠IgG、poly I：C和交联mAb(图18，小鼠 IgG1+山羊抗-小鼠IgG+poly I：C)的培养物中的生成水平一样低。
材料和方法：
用BDCA-4微珠，将CD11c-CD123亮浆细胞样DC从人外周血单核细 胞中分离。在37℃下于RPMI、10％FCS、10mMHEPES、50μM2-ME、 20μg/ml庆大霉素中使CD11c-CD123亮浆细胞样DC(1x106细胞/ml)与 10μg/ml的AC144mAb或小鼠IgG1mAb(CF6B，抗-TPO)一起温育30 分钟。加入20μg/ml的山羊抗-小鼠IgG(Chcmicon International)，并将 细胞于37℃再温育30分钟。在37℃下这些细胞与或不与20μg的poly I：C (Sigma)一起温育24小时。收获培养上清液并用ELISA(Endogen)测 定IFN-α的浓度。测定灵敏度是3pg/ml。
图18表示，是BDCA-2(而不是BDCA-4)与特异的mAb、然后与 二级交联mAb的连接抑制由来自血液或扁桃体的浆细胞样 BDCA-2+BDCA-4+DC对poly I：C刺激的应答而导致的IFN-α的分泌。在 37℃下使来自血液的BDCA-2+BDCA-4+DC与10μg/ml的AC144 mAb(2 和4)或小鼠IgG1mAb(CF6B，抗-TPO，1和3)一起温育30分钟。加 入20μg/ml的山羊抗-小鼠IgG并将细胞于37℃下再温育30分钟。在37 ℃下这些细胞与(3和4)或不与(1和2)20μg的poly I：C(Sigma)一 起温育24小时。收获培养上清液并用ELISA测定INF-α的浓度。
实施例18
在多种组织和纯化血细胞群中用RT-PCR分析BDCA-2 mRNA的表 达
核酸与氨基酸序列
通过COS细胞中的表达克隆而获得编码BDCA-2的cDNA。图5示出 了BDCA-2的氨基酸序列(全部六个外显子均表达的同种型)。BDCA-2 是新的C-型凝集素II型膜蛋白。这些凝集素例如在Bates等人(1999)免疫 学杂志163：1973-1983中有所描述。实施例20给出了BDCA-2与已知的C 型凝集素的比较。
图19表示用来自CLONTECH的人多组织cDNA系列的分析(泳道1： 心脏；泳道2：脑；泳道3：胎盘；泳道4：肺；泳道5：肝；泳道6：骨 骼肌；泳道7：肾；泳道8：胰腺；泳道9：脾；泳道10：胸腺；泳道11： 睾丸；泳道12：卵巢；泳道13：小肠；泳道14：淋巴结；泳道15：骨髓； 泳道16：胎儿肝脏；泳道17：扁桃体)，以及从血液白细胞的不同群体所 制备的cDNAs的分析(泳道18：T细胞；泳道19：B细胞；泳道20：NK 细胞；泳道21：单核细胞；泳道22：CD11c亮CD123低DC；泳道23： CD11c-CD123亮浆细胞样BDC)，用于了解BDCA-2 cDNA的存在。
所有的cDNAs被归一化到若干不同管家基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶、 磷脂酶A2、α-微管蛋白和β-肌动蛋白)的mRNA的表达水平上。归一 化确保了对靶mRNAs组织特异性和相对丰度的精确评估。将相同量的 cDNA(大约50pg)用于每个RT-PCR反应。用BDCA-2特异性引物(正 向引物：5’-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT(SEQ ID NO：)和反 向引物：5’-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO：))以 及上述四个管家基因的引物(CLONTECH)，用AdvanTaq Plus DNA Polymerase(CLONTECH)来实施RT-PCR反应。
循环条件如下：94℃ 30秒以及68℃ 2分钟。扩增BDCA-2时进行 34次循环，扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)时进行38次循环。注意， 仅仅在CD11c-CD123亮浆细胞样DC可检测到BDCA-2 mRNA信号。如果 再进行4次PCR循环用于扩增BDCA-2 cDNA(38次循环而不是34次循 环)，那么在胰腺、睾丸、卵巢、骨髓和扁桃体中也可检测到弱信号。对 来自睾丸的cDNA(38次PCR循环)，与来自CD11c-CD123亮浆细胞样 DC的信号相比，较短的转录本(剪接变体)信号更突出，并且来自全长 转录本的信号确实只在更多次的PCR循环下才可检测到。
实施例19
BDCA-2的外显子/内含子的结构以及BDCA-2的剪接变体
可如下获得BDCA-2剪接变体的信息：来自浆细胞样DC的mRNA 用在起始密码子之前的mRNA序列(正向引物：5′- TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT(SEQ ID NO：))和在终止密码 子之后的与mRNA序列互补的引物(反向引物：5′- TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO：))来进行RT-PCR 扩增，然后将所得到的片段克隆入质粒并对插入片段测序。结果如图20 所示。作为比较，图21示出了小鼠树突状细胞相关的C型凝集素2 (Dectin-2)的剪接变体。
图22对已扣除了内含子的BDCA-2和小鼠Dectin-2的mRNA序列同 源比较，其中指出了扣除的内含子所在位置。表3示出了外显子的参数。
                            表3     外显子     mRNA     编码的氨     基酸残基    编码的氨   基酸残基数     0     0-361     0     1     362-522     1-10     10     2     523-615     11-41     31     3     616-726     42-78     37     4     727-872     78-127     49     5     873-988     128-166     39     6     989-1283     167-213     47
内含子的部位是基于人类杂色体12克隆RP11-277J24、工作草图序 列、21无序片段(GenBank登记号AC006517)和基于转录本剪接的规 则。BDCA-2的内含子/外显子构建类似于Dectin-2。
至少产生了四种BDCA-2的剪接变体。它们是：编码具有全部六个外 显子的蛋白质的mRNA；编码含有外显子1、3、4、5和6的蛋白质的mRNA； 编码含有外显子1、2、4、5和6的蛋白质的mRNA；以及编码含有外显 子1、2、3、5、和6的蛋白质的mRNA。
实施例20
BDCA-2的同源性和蛋白质的结构域
图23示出了人BDCA-2、人DCIR(树突状细胞免疫受体)和小鼠 Dectin-2(树突状细胞相关的C型凝集素-2)的氨基酸序列的同源性比较。 人DCIR(GenBank登记号AJ133532)是与人分子中的BDCA-2最高度 同源的分子(参见Bates等人(1999)免疫学杂志163：1973)，在一段191aa 中约51％的aa相同。
小鼠Dectin-2(GenBank登记号AF240357)是与人BDCA-2最接近 的鼠同源物(参见Ariizumi等人(2000)生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 16：11957；WO98/28332；PCT/US97/23761；以及美国专利6,046,158)，在一 段211aa中约51％的aa相同。
BDCA-2(213aa)、DCIR(237aa)和Dectin-2(209aa)均为钙依赖 的(C-型)凝集素家族的II型膜糖蛋白。这些分子中的每一种都含有推定 的胞质结构域(BDCA-2：aa 1-21；DCIR：aa 1-44；Dectin-2：aa 1-17)、推定 的跨膜结构域(BDCA-2：aa 22-41；DCIR：aa 44-69；Dectin-2：aa 18-40)和 推定的胞外结构域(BDCA-2：aa 42-231；DCIR：aa 70-237；Dectin-2：aa 40-209)。在推定的胞外结构域内，这些分子中的每一种都在COOH末端 含有一个单一的糖识别结构域(CRD)(BDCA-2：aa 83-206；DCIR：aa 106-230；Dectin-2：aa 79-202)。图23示出了人BDCA-2、人DCIR和小 鼠Dectin-2的对比排列。
表4示出了用PROSITE数据库所找到的推定的蛋白质结构域/基序。
                            表4     结构域     BDCA-2     Dectin-2     DCIR   ASN糖基化   110-113 NCSV   137-140 NSSY   164-167 NVTF     131-134 NESL    185-188 NESS   依赖于cAMP和   cGMP的蛋白激酶   磷酸化位点   53-56 KRLS   135-138 SQK    78-81 KKTT   蛋白激酶C   磷酸化位点   51-53 TVK   107-109 SQK     15-17 TLR     49-51 SRR     72-74 SEK     94-96 STK    80-82 TTK    130-132 SEK    211-213 SPK   酪蛋白激酶II   磷酸化位点   123-126 TREE   187-190 SSEE     94-97 STKE     101-104 STSE    1-9 TYAE    80-83 TTKE   119-122 TEAE   200-203 SICE    87-90 TTLE   126-129 SWQD   130-133 SEKD   146-149 TQEE   168-171 SDPE   228-231 SVCE   酪氨酸激酶   磷酸化位点   57-64   KLREYQQY   50-58   RRLYELHTY   酰胺化位点   148-151 GGRR   N-十四烷   基化位点   11-16 GVCWTL   68-73 GTMVSE   77-82 GCCPNH   20-25 GINTAS   C-型凝集素   结构域特征   180-206   11-17 176-202   203-230
BDCA-2含有三个推定的N-糖基化位点(aa 110-113 NCSV；aa 137-140 NSSY；aa 164-167 NVTF)，而Dectin-2(aa 131-134 NESL)和DCIR(aa 185-188 NESS)只含有一个推定的N-糖基化位点。BDCA-2和Dectin-2的 所有推定的磷酸化位点都位于推定的胞外结构域内。因此，它们通过胞内 激酶而磷酸化几乎是不可能的。正如许多在天然杀伤基因复合物内编码的 C型凝集素(例如CD94、Ly-49和NKG2)，DCIR在胞质结构域内含有 共有的免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM基序；(I/V)XYXX(L/V)， 为(aa 5-10 ITYAEV)。有趣的是，在BDCA-2和Dectin-2的相对短的胞 质尾部(BDCA-2：21 aa；Dectin-2：17 aa)没有发现该ITIM基序。
实施例21
BDCA-3蛋白的分析
用10ng/ml的PMA(Sigma)和0.5mg/ml的离子霉素刺激表达BDCA-3 的HD-MY-Z细胞达24小时，以便上调BDCA-3的表达。将3x107个PMA/ 离子霉素刺激的HD-MY-Z细胞在4℃下与1mg/ml的 Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)温育15分钟使细胞被表面生物素化，然后 洗涤两次，将细胞重悬于补充有10％蔗糖和蛋白酶抑制剂(来自Serva的 苯甲磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂A、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)的50mM Tris-HCl pH8.0中，并在0℃进行超声(5x4秒，70％输出)。所超声的 细胞于4℃以900xg离心10分钟，以便除去胞核及完整细胞。上清液于4 ℃以30,000xg的条件离心2小时，以便得到纯化的细胞膜。通过在0℃ 于补充有蛋白酶抑制剂和1％NP-40的50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl中温育1小时，以裂解胞膜。通过在4℃以30,000xg进行离心， 可除去未溶解的胞膜碎片。将MnCl2和CaCl2加入到上清液中，并使它们 各自的终浓度为1mM。将裂解物于ConA Sepharose柱(1ml)上吸附， 并且用10ml的洗脱缓冲剂(0.5MD(+)甘露糖，20mM Tris-HCl pH7.4， 0.5M NaCl，1％NP-40)来洗脱所结合的蛋白质，并用Cetriprep-10离心浓 缩机(Amicon)将其浓缩到1ml的体积。
通过在4℃与150μl的抗-NIP mAb结合的微殊(Miltenyi Biotec)一 起温育30分钟并进行μMACS柱分离，可预清洁蛋白质。为了特异性免 疫沉淀BDCA-3，蛋白质可与2μg NIP结合的BDCA-3特异性 mAbAD5-14H12(IgG1)一起温育，或者为了控制特异性，可在4℃与2μ g作为一级试剂的NIP结合的CD19特异性mAb SJ25-C1(IgG1)一起温 育14小时，并且在4℃与作为二级试剂的抗-NIP mAb结合的微珠一起温 育3小时。利用μMACS柱分离技术来分离所沉淀的蛋白质。用70μl含 有DTT的的SDS-PAGE缓冲剂洗脱所保留的蛋白质。用链亲和素-过氧化 物酶通过SDS-PAGE(4-12％)和Western印迹法来分析所沉淀的蛋白质。
图24的结果表明，BDCA-3特异性mAb AD5-14H12可从HD-MY-Z 细胞上特异性免疫沉淀出大约100kD的细胞表面蛋白质。因此，BDCA-3 具有100kD的表观分子量。
虽然为了清楚和理解起见，业已借助图解和实施例对上述发明进行了 详细描述，本领域的技术人员应当理解可对它们进行某些改变和改进。因 此，这些描述和实施例不应该构成对本发明范围的限定，该范围记载在后 面所附的权利要求中。
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