白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法
阅读：419发布：2020-05-13
专利汇可以提供白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种白细胞分类计数 试剂 ，所述试剂包括：(1)花菁类 荧光 染料；(2)糖苷类化合物。本发明还公开包含所述白细胞分类计数试剂的 试剂盒 及其制备方法。本发明还公开了所述试剂和试剂盒用于白细胞分类计数的方法。利用本发明所公开的试剂、试剂盒和方法可以将白细胞四分类计数，其中白细胞各亚类区分度高、分类效果好，特别是解决了淋巴细胞和单核细胞之间分类不清，以及嗜酸细胞与中性粒细胞距离过近的问题。，下面是白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法专利的具体信息内容。
1.一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：
(1) 花菁类荧光染料；
(2) 糖苷类化合物，其中所述糖苷类化合物为烷基糖苷类化合物，
所述试剂还包含第二种非糖苷类化合物的非离子表面活性剂，
其中所述花菁类荧光染料为通式(I)或(II)的化合物或其组合：
其中
n为1、2或3；
X为C (CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：
卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
-
Y 为负离子；
其中
m为1、2或3；
X’为C(CH3)2、O、S或Se；
’ ’ ’
R1 和R2 各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
’ ’ ’ ’
R3、R4 各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、’ ’ ’ ’
烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3 和R4 不同时为苄基，且R3 为苄基时R4 不为C1-18烷基’
OR6 ；
’
R5 为C1-18烷基或者H；
’
R6 为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
-
Y' 为负离子。
2.权利要求1的白细胞分类计数试剂，其中所述通式(I)的化合物选自以下化合物A、化合物B和化合物C：
；
所述通式II的化合物选自以下化合物D、化合物E和化合物F：
。
3.权利要求1或2的白细胞分类计数试剂，所述第二种非离子表面活性剂具有以下通式III结构：
其中
R1为C8-23的烷基或链烯基；
R2为-O-、 或-COO-；
n为10到30的整数。
4.权利要求3的白细胞分类计数试剂，其中R1为辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基。
5.权利要求3的白细胞分类计数试剂，其中R1为月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基。
6.权利要求3的白细胞分类计数试剂，其中所述非离子表面活性剂选自十六烷基聚氧乙烯(15)醚、十二烷基醇聚氧乙烯(21)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚及其组合。
7.权利要求1或2的白细胞分类计数试剂，所述试剂还含有选自带有一个或多个羧基或磺酸基的酸或其盐的阴离子有机化合物。
8.权利要求7的白细胞分类计数试剂，其中所述带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子有机化合物选自甲酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、苹果酸、苯二甲酸、苯磺酸、α-萘磺酸、牛磺酸、磺基苯磺酸以及它们的碱金属盐。
9.权利要求1或2的白细胞分类计数试剂，所述试剂还含有选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、苯甲醇和2-苯氧基乙醇的醇类化合物。
10.权利要求1或2的白细胞分类计数试剂，所述试剂还含有选自防腐剂、金属螯合剂、缓冲剂、渗透压调节剂的其他添加剂。
11.一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-10中任一项的白细胞分类计数试剂，所述试剂的各组分可作为单一包装的形式存在，也可以将花菁类荧光染料与其他组分分开包装，作为两个以上分包装的形式存在。
12.一种用于制备白细胞分类计数试剂盒的方法，所述方法包括：
称取权利要求1-10中任一项白细胞分类计数试剂中的各种组分，溶解在水中，调节pH值，定容，包装于试剂盒中；或者
称取权利要求1-10中任一项白细胞分类计数试剂中的花菁类荧光染料，溶解在有机溶剂中，定容，分包装；称取权利要求1-10中任一项白细胞分类计数试剂中的其他组分，分别或一起溶解在水中，调节pH值，定容，分包装；将所述分包装包装于试剂盒中。
白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类
计数的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及血液细胞分类计数试剂及血液细胞分类计数方法，更具体地讲，本发明涉及用于对白细胞进行分类计数的血液分析试剂、包含所述试剂的试剂盒及其制备方法，以及采用所述试剂或试剂盒进行白细胞分类计数的方法。
背景技术
[0002] 血液细胞大致分为三类：红细胞、白细胞和血小板，其中白细胞又由淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞五个亚类组成。在生物学分析领域，尤其是临床检验分析领域，针对不同亚类白细胞进行准确的分类对于诊断和研究有着非常重要的作用，而各个亚类白细胞含量的变化在临床上被用作诊断和治疗的重要指标。例如，急性细菌性感染会造成中性粒细胞增多，寄生虫感染和过敏性疾病等会造成嗜酸性粒细胞增多。
[0003] 迄今为止，有关对白细胞进行分类和计数的试剂和方法已经有很多报道。其基本方法是采用溶血剂将红细胞和血小板溶解后对白细胞进行分类计数。而其中大部分是采用季铵盐或吡啶鎓等阳离子表面活性剂溶解红细胞，达到白细胞分类的目的。但相比阴离子和非离子型表面活性剂，季铵盐等阳离子型表面活性剂毒性较高。且其本身具有较强的抑菌作用，释放到环境中，会破坏环境中的微生物，对环境造成一定影响。
[0004] 除了阳离子型表面活性剂以外，糖苷类化合物中的一种，皂苷类非离子表面活性剂作为一种来源广泛的纯天然表面活性剂，由于其具有较强的溶血作用，在白细胞分类中也有应用。
[0005] 美国专利5155044公开了一种采用两步法进行白细胞分类的方法。该方法包含一种对全血样本进行化学处理的试剂系统，该系统包括一种溶血剂和一种抑制剂。该溶血剂含酸或酸和皂苷的混合物。在该方法中，酸起到决定性作用，皂苷只起到更加彻底破坏红细胞，以避免其干扰测定的作用。
[0006] 美国专利4751179公开了一种白细胞分类的试剂系统和用自动细胞计数装置区分白细胞的方法。该试剂系统由包含皂苷的第一试剂和用于固定的第二试剂组成。
[0007] 美国专利5840515公开了一种对血液样本中白细胞进行分类的方法。该方法包括三个步骤：第一步，使用包含皂苷的溶解剂对红细胞进行裂解，同时不破坏白细胞的完整性；第二步，对红细胞裂解的终点进行判断；第三步，反应达到终点阈值后，加入抑制剂，终止溶解试剂的溶血作用。
[0008] 美国专利6632676公开了一种对白细胞进行五分类的方法。该方法采用两种试剂：试剂一为一种含皂苷的溶血剂；试剂二为一种抑制剂，具有调节作用的缓冲体系，以终止皂苷的溶血作用。
[0009] 美国专利6114130公开了一种用于白细胞四分类的试剂。该试剂包含一种阳离子表面活性剂、一种糖苷类物质(特指皂苷)、至少一种无机盐和调节pH值的缓冲体系。
[0010] 上面所提到的使用皂苷类非离子型表面活性剂对白细胞进行分类的现有技术中，大部分使用两步法或三步法，需要两种或多种试剂，增加了仪器设计的复杂度及生产成本。此外，目前使用皂苷对白细胞的各种分类方法，所获得的分类效果并不理想，尤其是淋巴细胞与单核细胞两个细胞群之间的分类不清晰。
发明内容
[0011] 本发明一方面涉及一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：
[0012] (1)花菁类荧光染料；
[0013] (2)糖苷类化合物。
[0014] 优选所述糖苷类化合物为皂苷或烷基糖苷类化合物。
[0015] 优选所述花菁类荧光染料为通式(I)或(II)的化合物或其组合：
[0016]
[0017] 其中
[0018] n为1、2或3；
[0019] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0020] R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
[0021] R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
[0022] R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0023] R5为H或C1-18烷基；-
[0024] Y 为负离子；
[0025]
[0026] 其中
[0027] m为1、2或3；
[0028] X’为C(CH3)2、O、S或Se；
[0029] R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
[0030] R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
[0031] R5’为C1-18烷基或者H；
[0032] R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0033] Y′-为负离子。
[0034] 任选本发明公开的试剂还包含第二种具有以下通式III结构的非离子表面活性剂：
[0035] R1-R2-(CH2CH2O)n-H
[0036] III
[0037] 其中
[0038] R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
[0039] R2为-O-、 或-COO-；
[0040] n为10到30的整数。
[0041] 任选本发明公开的试剂还含有选自带有一个或多个羧基或磺酸基的酸或其盐的阴离子有机化合物。
[0042] 任选本发明公开的试剂还含有醇类化合物。
[0043] 任选本发明公开的试剂还含有选自防腐剂、金属螯合剂、缓冲剂、渗透压调节剂的其他添加剂。
[0044] 本发明还一方面涉及一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所公开的白细胞分类计数试剂，所述试剂的各组分可作为单一包装的形式存在，也可以将花菁类荧光染料与其他组分分开包装，作为两个以上分包装的形式存在。
[0045] 本发明还一方面涉及一种用于制备白细胞分类计数试剂盒的方法，包括：
[0046] 称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的各种组分，溶解在水中，调节pH值，定容，包装于试剂盒中；或者
[0047] 称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的花菁类荧光染料，溶解在有机溶剂中，定容，分包装；称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的其他组分，分别或一起溶解在水中，调节pH值，定容，分包装；将所述分包装包装于试剂盒中。
[0048] 本发明再一方面涉及一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤：
[0049] (1)将血液样本加入到本发明公开的白细胞分类计数试剂或试剂盒中的试剂中混合反应一段时间，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质采用荧光染料进行标记；
[0050] (2)通过测定白细胞的侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息以及侧向荧光强度信息中的任意两种，优选通过测定白细胞的侧向荧光强度信息和侧向散射光强度信息，可以至少实现四分类计数，即与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团，对所述集团内所含细胞数目进行计数。
[0051] 本发明公开的白细胞分类计数试剂使用糖苷类的非离子型表面活性剂，它具有来源广泛、无毒、无刺激性、对人体皮肤温和、生物降解迅速且彻底、原料来自可再生资源等优点。此外，本发明公开的白细胞分类计数试剂具有中性pH值，对仪器管路腐蚀性小。本发明公开对白细胞分类方法采用一步法测定，反应时间短，反应速度快，所需仪器相对两步法更加简单，降低了生产成本，具有很好的生产应用前景。使用本发明公开的白细胞分类计数试剂和白细胞分类计数方法得到的散点图，白细胞各亚类区分度高、分类效果好，特别是解决了淋巴细胞和单核细胞之间分类不清，以及嗜酸细胞与中性粒细胞距离过近的问题。所获得的分类计数结果，与传统方法有较好的相关性。附图说明
[0052] 图1显示了流式细胞分析仪光学系统的示意图。
[0053] 图2显示了本发明公开实施例1获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0054] 图3显示了本发明公开实施例2所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为前向散射光强度。
[0055] 图4显示了本发明公开实施例3所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0056] 图5显示了本发明公开实施例4所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0057] 图6显示了本发明公开实施例5所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0058] 图7显示了本发明公开实施例6所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0059] 图8显示了本发明公开实施例7所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0060] 图9显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的白细胞分类散点图。其中X轴为侧向散射光强度，Y轴为荧光强度。
[0061] 图10显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的白细胞分类在三维空间中的散点图。其中X、Y、Z轴分别对应侧向散射光强度、前向散射光强度和荧光强度。
[0062] 图11显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的本发明结果与传统方法结果(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的白细胞总数相关性。
[0063] 图12显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的本发明结果与传统方法结果(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的中性粒细胞比例相关性。
[0064] 图13显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的本发明结果与传统方法结果(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的淋巴细胞比例相关性。
[0065] 图14显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的本发明结果与传统方法结果(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的单核细胞比例相关性。
[0066] 图15显示了本发明公开实施例8所述方法，获得的本发明结果与传统方法结果(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的嗜酸性细胞比例相关性。
具体实施方式
[0067] 定义
[0068] 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0069] 本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。
例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
[0070] 本文中使用的术语“烷氧基”是指与基团-O-结合的上述定义的“烷基”，其中所述“烷基”包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
[0071] 本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
[0072] 本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0073] 本文中使用的术语“杂环基”是指包含3-14、优选3-10、更优选3-6个环成员并包含一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子的单环或稠环体系。
[0074] 本文中使用的术语“芳基”是指包含4-20，优选5-10个碳原子，并且符合4n+2电荷规则的芳香族基团。
[0075] 本文中使用的术语“分类计数”是指通过荧光和散射光信息的差异至少将白细胞分成与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团共计四个集团，并对各集团中的细胞数目进行计数。
[0076] 本发明公开的白细胞分类计数试剂
[0077] 本发明一方面提供了一种对血液样本中白细胞实现至少四分类的白细胞分类计数试剂。所述四分类是指将白细胞分成与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团共计四个集团。
[0078] 根据本发明的一个方面，所述白细胞分类计数试剂包括：
[0079] (1)花菁类荧光染料；
[0080] (2)糖苷类化合物。
[0081] 1.花菁类荧光染料
[0083] 所述的荧光染料优选为花菁类荧光染料，更优选所述花菁类荧光染料为以下通式(I)或(II)的化合物或其组合。
[0084]
[0085] 其中
[0086] n为1、2或3；
[0087] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0088] R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
[0089] R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
[0090] R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0091] R5为H或C1-18烷基；
[0092] Y-为负离子。
[0093] 优选n为1或2，更优选n为1。
[0094] 优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X为S。
[0095] 优选R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基或卤素；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-18烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-12烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R1和R2均为H。
[0096] 优选R3为H、C1-18烷基、OR5、COOR5或卤素；更优选R3为H、C1-12烷基、OR5、COOR5或卤素；最优选R3为H、C1-6烷基、OR5、COOR5或卤素。
[0097] 优选R4为C1-18烷基、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选R4为C1-18烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；最优选R4为C1-6烷基或苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0098] 优选R5为H或C1-12烷基，更优选R5为H或C1-6烷基。
[0100] 上述具有通式I结构的花菁类荧光染料化合物例如为以下的化合物A、化合物B、化合物C。
[0101]
[0102] 化合物A
[0103]
[0104] 化合物B
[0105]
[0106] 化合物C
[0107] 通式I化合物及其制备方法参见申请号为200710137258.6的中国专利申请。该专利申请详细记载相关化合物的合成办法。该专利申请文件通过引用结合到本文中来。
[0108]
[0109] 其中
[0110] m为1、2或3；
[0111] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0112] R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
[0113] R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
[0114] R5’为C1-18烷基或者H；
[0115] R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0116] Y′-为负离子。
[0117] 优选m为1或2，更优选m为1。
[0118] 优选X’为C(CH3)2、O或S；更优选X’为C(CH3)2或S；最优选X’为S。
[0119] 优选R’1和R’2各自独立选自H或C1-18烷基；更优选R’1和R’2各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R’1和R’2均为H。
[0120] 优选R’3和R’4各自独立选自C1-8烷基COOR’6、C1-8烷基OR’6、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R’3和R’4各自独立选自C1-6烷基COOR’6、C1-6烷基OR’6、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0121] 优选R’5为H或C1-12烷基，更优选R’5为H或C1-6烷基。
[0122] 优选R’6为C1-6烷基或者苯基，所述苯基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代。
[0123] Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离- - - -子，例如卤素离子、ClO4、PF6、CF3SO3、BF4、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
[0124] 上述具有通式II结构的花菁类荧光染料化合物例如为以下的化合物以下化合物D、化合物E和化合物F：
[0125]
[0126] 化合物D
[0127]
[0128] 化合物E
[0129]
[0130] 化合物F
[0131] 通式II化合物及其制备方法参见申请号为200810002503.7中国专利申请。该专利申请通过引用将其全文结合于此。
[0132] 所述花菁类荧光染料化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在本发明的一个作为选择的实施方案中，所述通式I或II化合物可作为其衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
[0133] 典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。
[0134] 上述花菁类荧光染料化合物在本发明各实施方案中的合适浓度范围在0.002ppm到2000ppm，优选的浓度范围为0.02ppm到200ppm，更优选的浓度为0.2ppm到20ppm。
[0135] 由于上述花菁类荧光染料化合物在非水溶剂中稳定性更好，因此优选将它们与本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的水溶性组分分开保存。在本文中所使用的术语水溶性组分是指本发明的白细胞分类计数试剂中包括糖苷类化合物、非离子表面活性剂以及阴离子化合物等的组分。
[0136] 2.糖苷类化合物
[0137] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂还包含能够快速溶解红细胞，并使白细胞发生细微变化的糖苷类化合物。
[0138] 所述糖苷类化合物是一种糖苷类表面活性剂，它属于非离子型表面活性剂，常见的糖苷类表面活性剂有烷基糖苷和皂苷。
[0139] 烷基糖苷是一种新型的非离子型表面活性剂，它是由糖的半缩醛羟基同醇羟基脱水而生成的化合物。烷基糖苷可以是单一数目的烷基和某一种糖组成的单苷纯品，比如辛基葡萄糖苷、癸基葡萄糖苷、十二烷基麦芽糖苷等；也可以是不同数目烷基与不同种类糖组成的多苷混合物，比如以C8～C10天然脂肪醇和葡萄糖为原料制成的烷基多糖苷混合物。
[0140] 可用于本发明的白细胞分类计数试剂的烷基糖苷类化合物可采用以下结构通式表示：
[0141] R-(CH2)m-CH3
[0142] 其中
[0143] m为5-17的整数，优选为6-14，更优选为7-11的整数。
[0144] R为单糖、单糖的聚合物或多糖。更具体的说R可选自葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖，以及这些物质的聚合物。
[0145] 皂苷别称皂角素、皂素、皂角、碱皂体、皂甙、皂角苷或皂草苷，是一类较复杂的苷类化合物。皂苷，在植物界分布很广，许多植物例如人参、三七、知母、远志、甘草、桔梗、柴胡等都含有皂苷。皂苷由皂苷配基与糖、糖醛酸或其他有机酸组成，组成皂苷的糖常见的有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-木糖。常见的糖醛酸有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等。皂苷按皂苷配基的结构分为两类：一类是甾族皂苷，其皂苷配基是螺甾烷的衍生物，多由27个碳原子所组成(如薯蓣皂苷)，大多存在于百合科和薯蓣科植物中；第二类是三萜皂苷，其皂苷配基是三萜的衍生物，大多由30个碳原子组成。三萜皂苷分为四环三萜和五环三萜，大多存在于五加科和伞形科等植物中。
[0146] 可用于本发明所公开的白细胞分类计数试剂的甾类皂苷通常具有下式A或B所示的结构：
[0147]
[0148] 其中
[0149] R3为H或CH3；
[0150] R1为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖；
[0151] R2为直连糖或支链糖，组成其糖类的单糖类型包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖。
[0152] 可用于本发明所公开的白细胞分类计数试剂的帖类皂苷通常具有如下结构通式：
[0153]
[0154] 其中
[0155] R4为直连糖或支链糖，组成其糖类的单糖类型包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖；
[0156] R5为CH3或CH2OH；
[0157] R6为CH3或CH2OH；
[0158] 或者
[0159]
[0160] 其中，R4和R7为直连糖或支链糖，组成其糖类的单糖类型包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖。
[0161] 或者
[0162]
[0163] 其中
[0164] R4和R7为直连糖或支链糖，组成其糖类的类型包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖。
[0165] 或者
[0166]
[0167] 其中
[0168] R7和R8为直连糖或支链糖，组成其糖类的单糖类型包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、来苏糖、夫糖等常见糖类及其去氧糖。
[0169] 与传统表面活性剂相比糖苷类表面活性剂具有来源广泛、无毒、无刺激性、对人体皮肤温和、生物降解迅速且彻底、原料来自可再生资源等优点。
[0170] 此外，糖苷类表面活性剂作为一种具有较强溶血能力的非离子型表面活性剂，在较低的浓度下就能够起到溶解红细胞的作用。溶解红细胞后，还能够有效的降低红细胞碎片大小，防止血影细胞发生聚集，尤其是可以破坏红细胞的抗膜性，维持白细胞的正常测定。同时，它在溶解红细胞的同时，也会相应的破坏白细胞，组成白细胞细胞膜的一些成分(可能是脂类分子)会被破坏，从而在白细胞膜上出现一些小孔。这些小孔的存在致使细胞内外互通，细胞内物质可以溢出，而细胞外物质能够进入。这种效果产生的一个结果是，荧光染料标记物能够快速进入细胞，并与细胞内的核酸物质(DNA或RNA)结合。
[0171] 皂苷通常是一种天然提取的混合物，为各种糖类的组成部分与帖类或者甾类部分组成的复杂混合物。这就容易造成对细胞的处理程度不一致，处理后的细胞均一性不好，各细胞亚群的细胞团比较散，而且重复性和可生产性可能较差。
[0172] 相反，烷基糖苷可以是单一的化合物，因此采用烷基糖苷对细胞进行处理均一性较好，各亚类细胞团的聚集程度也较好，生产性更好。因此，在本发明公开的白细胞分类计数试剂中优选采用烷基糖苷。
[0173] 对于上述糖苷类表面活性剂的浓度范围，所加入的量根据所选糖苷的性质、反应时间、反应温度和其他成分的使用量而不同，通常用量在0.025g/L-10g/L范围内，优选的用量为0.05g/L到0.5g/L。
[0174] 3.非离子表面活性剂
[0175] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂任选还包含另一种非糖苷类化合物的非离子表面活性剂，用于固缩细胞内部物质，放大不同白细胞亚类内部结构的散射光强度差异，并保护白细胞不被过度损伤。
[0176] 所述非离子表面活性剂为选自通式III结构的非离子表面活性剂：
[0177] R1-R2-(CH2CH2O)n-H
[0178] III
[0179] 其中
[0180] R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
[0181] R2为-O-、 或-COO-；
[0182] n为10到30的整数。
[0183] 对于上述具有通式III结构的聚氧乙烯类非离子表面活性剂，其HLB值在10-20之间的化合物很合适使用，特别是十六烷基聚氧乙烯(15)醚、十二烷基醇聚氧乙烯(21)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚等都很适合。
[0184] 对于上述聚氧乙烯类非离子表面活性剂的浓度范围来说，由于所用物质不同而不同。上述的十二烷基醇聚氧乙烯(21)醚可以为0.05g/到1.5g/L，优选0.1g/L到1.0g/L；十六烷基醇聚氧乙烯(23)醚可以为0.05g/L到1.5g/L，优选0.1g/L到1.0g/L；十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚可以为0.05g/L到1.5g/L，优选0.1g/L到1.0g/L；十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚可以为0.03g/L到1.0g/L，优选0.05g/L到0.8g/L。
[0185] 该类型非离子表面活性剂的作用机制仍然不够清楚，但它被认为具有结合白细胞细胞膜的能力，从而保护细胞膜避免强溶血剂的溶解作用。例如，在某种情况下，当糖苷化合物的溶血能力强到致使白细胞遭受到不必要的破坏时，所述非离子表面活性剂的加入会产生很好的效果。此外，该类型非离子表面活性剂还能使细胞发生适当的皱缩和固化，从而放大不同白细胞亚类内部结构的散射光强度差异。
[0186] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂所包含的非离子表面活性剂可以为一种非离子表面活性剂或者两种及其以上的非离子表面活性剂的组合。对于两种及其以上的非离子表面活性剂的组合中其中每种非离子表面活性剂的浓度来说，采用上面所提到的单一非离子表面活性剂的浓度范围并使整体效果达到最佳即可。
[0187] 4.带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物
[0188] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂任选还可以包含使白细胞产生形态差异的阴离子有机化合物。所述阴离子有机化合物能够与受损的白细胞内阳离子荷电成分结合，从而改变不同种类细胞内容物的复杂程度。特别是细胞皱缩后，这种改变将被更明显的放大，从而增强不同细胞在散射光强度上的差异，有利于更好的区分。同时，阴离子有机化合物还可能与荧光染料结合，在一定程度上收缩细胞在荧光方向的强度，达到使每种亚群的细胞的荧光强度更均一的目的，从而使得细胞在荧光方向不会过于分散，而变得更加聚集。
[0189] 所述阴离子有机化合物可以选自带有一个或多个羧基或者磺酸基的酸或其盐。
[0190] 对于带有一个羧基的羧酸及其盐，优选选自甲酸及其碱金属盐、乙酸及其碱金属盐、苯甲酸及其碱金属盐等；对于带有多个羧基的羧酸及其盐，优选选自柠檬酸及其碱金属盐、苹果酸及其碱金属盐、苯二甲酸及其碱金属盐等。
[0192] 对于上述阴离子化合物的浓度范围来说，以能达到较好区分出白细胞亚类的效果为佳，其浓度可以在0.05g/L到25g/L，优选0.5g/L到5g/L，也可以根据种类作适当调整。
[0193] 5.醇类化合物
[0194] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂还可以包含一定量的醇类。虽然不希望受任何理由的约束，但认为醇类化合物能够起到固定细胞，增强细胞膜通透性的作用，从而有利于荧光染料进入细胞膜，降低染料的使用浓度。此外，醇类化合物可能还对一些细胞膜异常抗溶的细胞处理具有作用。即醇类化合物具有助溶的作用，使得异常细胞的处理效果有一定的改进。对于醇类的种类，没有特殊的要求，常见的甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、2-苯氧乙醇等均可以用于本发明。
[0195] 对于上述醇类的浓度范围来说，对于不同的醇类其优选的浓度范围不一样。如选用甲醇时其优选浓度为30g/L到150g/L，选用乙醇时其优选浓度为20g几到100g/L，选用2-苯氧基乙醇时优选浓度为0.5g/L到5g/L。大致上不同醇类浓度随着其结构中碳原子数的增加而降低。
[0196] 6.其他添加剂
[0197] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂还可以包含有缓冲剂，以将试剂的pH维持在5到10左右。对于缓冲剂的选择没有特殊的要求，常见的缓冲系统如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等都可以用于本发明。缓冲剂的使用量通常在10-500mM。
[0198] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂还可以包含有其他常规添加剂，如防腐剂、金属螯合剂等，以有助于试剂的防腐和长期保存。对于防腐剂的种类没有特殊的要求，市场上常见的防腐剂如凯松、庆大霉素均可；金属螯合剂可以选择乙二铵四乙酸及其碱金属盐。这些添加剂的浓度以不影响白细胞分类计数为宜。
[0199] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂的渗透压优选10mOsm到100mOsm之间。采用这一较低的渗透压有助于溶解红细胞和血小板，从而可以采用较低的溶血剂组分含量。
[0200] 本发明的用于白细胞分类计数的试剂盒
[0201] 本发明还有一个方面为用于白细胞分类计数试剂的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所公开的白细胞分类计数试剂。所述试剂盒可用于处理血液样本，并对血液样本中白细胞实现四种分类计数。
[0202] 在所述试剂盒中，所述试剂的各组分可作为单一包装的形式存在，也可以将花菁类荧光染料与其他组分分开包装，作为两个以上分包装的形式存在。
[0203] 由于用于本发明试剂的花菁类荧光染料在非水溶剂中稳定性更好，因此优选将它们与本发明所公开的试剂中的水溶性组分分开保存。优选将所述花菁类荧光染料保存在有机溶剂中。对于有机溶剂来说，只要其能充分溶解所述花菁类荧光染料并在水中有一定溶解度即可，没有其它特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油，二甲亚砜等均可。
[0204] 所述花菁类荧光染料在有机溶剂中的保存浓度只要能保证化合物充分溶解并且不低于其最终使用浓度即可。通常情况下花菁类荧光染料在有机溶剂中的保存浓度的范围在0.01ppm到1000ppm为宜，优选1ppm到100ppm。
[0205] 在本发明公开中，也将所述水溶性组分称为“溶血剂”，将花菁类荧光染料类所在的组分称为“染色液”。使用本发明所述的试剂盒时，将染色液与溶血剂及血液样本按照一定体积比混合一段时间后再进行检测；也可以先将染色液和溶血剂混合后，再与血液样本按一定体积比混合后进行检测。对于所述染色液与溶血剂的体积比没有特别的限制，通常按照1∶10到1∶100的比例进行混合，优选1∶40到1∶60的比例。
[0206] 本发明再一方面公开了一种用于制备白细胞分类计数试剂盒的方法，所述方法包括：
[0207] 称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的各种组分，溶解在水中，调节pH值，定容，作为单一包装的形式存放于试剂盒中；或者
[0208] 称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的花菁类荧光染料，溶解在有机溶剂中，定容，分包装；称取本发明所公开的白细胞分类计数试剂中的其他组分，溶解在水中，调节pH值，定容，分包装；将所述分包装存放于试剂盒中。其中所述其他组分是指除花菁类荧光染料外的本发明所公开的试剂中的其他水溶性组分。所述其他组分可一起溶解于水中，调节pH值，定容，作为一个包装存放于试剂盒中，也可以分别溶解于水中，调节pH值，定容，作为多个包装存放于试剂盒中。
[0209] 如上所述，由于用于本发明试剂的花菁类荧光染料在非水溶剂中稳定性更好，因此优选先将它们与本发明所公开的试剂中的水溶性组分分开保存、更优选将所述花菁类荧光染料保存在有机溶剂中，随后再将所述花菁类荧光染料成分与其他组分分开放置于试剂盒中。
[0210] 对白细胞分类计数的方法
[0211] 本发明另一方面提供了一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括如下步骤：
[0212] 1将血液样本加入到本发明所公开的白细胞分类计数试剂中混合反应一段时间，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质采用荧光染料进行标记。
[0213] 2通过测定白细胞的侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息以及侧向荧光强度信息中的任意两种，优选通过测定白细胞的侧向荧光强度信息和侧向散射光强度信息，可以至少实现四分类计数，即与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团，对所述集团内所含细胞数目进行计数。
[0214] 所述的混合反应时间在5-30秒内即可，优选15秒-25秒。由于本发明所公开的试剂能迅速作用于白细胞，使其细胞膜部分损伤，从而使染料能快速进入细胞膜并标记白细胞内的核酸物质。所以采用本发明的方法能快速将白细胞进行分类计数，有利于提高自动化检测仪器的检测速度，尤其适用于大量血液样本的检测。
[0215] 本发明所述的分类过程中，血样与本发明所公开的试剂的混合比例没有特别限制，但通常情况下采用血样与本发明试剂的体积比为1∶10到1∶100的比例进行混合，优选1∶40到1∶60的比例。
[0216] 所述的分类过程的反应温度为20℃到50℃，优选35℃到45℃。
[0217] 本发明所述荧光强度信息的测定可以利用激光流式法测定侧向激发荧光来完成，测定角度为90度；细胞内部形态信息的测定可以利用激光流式法测定侧向散射光来完成，测定角度为90度；细胞的大小信息可以利用利用阻抗或激光流式法测定前向散射光来完成，测定角度1-5度。本发明所采用的激光流式法可以利用图1所示的公知装置。其中激光器光源的选择可以选择同所使用的荧光染料激发波长相适应的激光器。
[0218] 本发明方法具体可以采用如下的步骤：
[0219] 1将血液样本加入到本发明试剂中，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态和内部结构的变化，同时对白细胞内部核酸类物质进行荧光染料标记，形成测量样本液。
[0221] 3对散射光强度信息和侧向荧光强度信息进行处理分析。通过不同白细胞亚类的散射光及荧光信号的差异，在散射光强度及侧向荧光强度所形成的的二维或者三维散点图将白细胞进行分类计数。本散射光强度信息指侧向散射光强度信息，或前向散射光强度信息，这样可以采用侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息、侧向荧光强度信息形成三维散点图信息进行识别，也可以采用侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息以及侧向荧光强度信息的任意两种的组合形成二维散点图信息进行识别。
[0222] 本发明优选在侧向散射光强度及侧向荧光强度所形成的二维散点图或侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息、侧向荧光强度信息形成三维散点图对白细胞进行分类计数。
[0223] 以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。
[0224] 除非另有声明，否则以下实施例中所用的试剂为化学纯以上纯度的试剂，所用的血液细胞检测设备为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC系列流式细胞分析仪，检测波长640nm。所述细胞分析仪的光学系统示意图如图1所示。
[0225] 实施例
[0226] 实施例1
[0227] 荧光染料A 0.5ppm
[0228] 十二烷基葡萄糖苷 0.05g/L
[0229] 磷酸缓冲液 20mM
[0230] pH 7.0
[0231] 配制20nM磷酸缓冲液(pH7.0)，按量称取荧光染料和十二烷基葡萄糖苷，加入800ml磷酸缓冲液中，搅拌溶解，用磷酸缓冲液定容。过滤，备用。
[0232] 将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持35℃的条件下，混合25秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为
90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0233] 实施例2
[0234] 荧光染料E 0.5ppm
[0235] 皂苷 0.05g/L
[0236] 聚氧乙烯(15)十六烷基醚 0.8g/L
[0237] 磷酸缓冲液 20mM
[0238] pH 7.0
[0239] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液，这里的皂苷采购自东京化成工业株式会社。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持43℃的条件下，混合23秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，并采用测定角度为1-5度的低角度散射光测定细胞的前向散射光强度信息。结果如图3所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0240] 实施例3
[0241] 荧光染料A 0.5ppm
[0242] 辛基葡萄糖苷 0.1g/L
[0243] 水杨酸钠 2.0g/L
[0244] HEPES 20mM
[0245] 用NaOH调节pH 7.0
[0246] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持38℃的条件下，混合25秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图4所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0247] 实施例4
[0248] 荧光染料C 1.0ppm
[0249] 皂苷 0.6g/L
[0250] Tris 40mM
[0251] 柠檬酸钠 5g/L
[0252] 聚氧乙烯(23)十六烷基醚 0.5g/L
[0253] 用盐酸调节pH 7.5
[0254] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液，这里的皂苷采购自东京化成工业株式会社。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持40℃的条件下，混合23秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图5所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0255] 实施例5
[0256] 荧光染料B 1.0ppm
[0257] 皂苷 0.6g/L
[0258] Tris 40mM
[0259] 柠檬酸钠 5g/L
[0260] 聚氧乙烯(25)十六烷基醚 0.5g/L
[0261] 用盐酸调节pH7.5
[0262] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液，这里的皂苷采购自东京化成工业株式会社。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持42℃的条件下，混合23秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图6所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0263] 实施例6
[0264] 荧光染料B 1.0ppm
[0265] 皂苷 0.6g/L
[0266] Tris 40mM
[0267] 柠檬酸钠 5g/L
[0268] 乙二醇 5g/L
[0269] 用盐酸调节pH7.5
[0270] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液，这里的皂苷采购自东京化成工业株式会社。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持44℃的条件下，混合23秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图7所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0271] 实施例7
[0272] 荧光染料D 2.0ppm
[0273] 癸基麦芽糖苷 0.1g/L
[0274] HEPES 20mM
[0275] 聚氧乙烯(21)十二烷基醚 0.9g/L
[0276] 2-苯氧基乙醇 1.0g/L
[0277] 用NaOH调节pH 7.2
[0278] 按与实施例1相同的方法，采用上述组分配制溶液。将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂中，在温度保持42℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图8所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0279] 实施例8
[0280] 如下制备由染色剂(I)和溶血剂(II)组成的试剂盒：
[0281] 染色剂(I)
[0282] 荧光染料F 25.0ppm
[0283] 溶剂为乙二醇
[0284] 溶血剂(II)
[0285] 辛基麦芽糖苷 0.1g/L
[0286] HEPES 20mM
[0287] 邻苯二甲酸氢钾 0.5g/L
[0288] 聚氧乙烯(21)十二烷基醚 0.9g/L
[0289] 2-苯氧基乙醇 1.0g/L
[0290] 用NaOH调节pH 7.2
[0291] 称取染料F适量，溶解于乙二醇中，配制25ppm的染色剂(I)。按与实施例1相同的方法，采用溶液剂(II)中所述组分配制溶血剂(II)。
[0292] 取20μl上述染色液(I)，血样20μl，一并加入到上述的1ml溶血剂(II)中，在温度保持42℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长633nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图9所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。
[0293] 采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息，采用测定角度为1-5度的低角度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，组成三维空间散点图。所获得的白细胞在三维立体空间中的分类信息结果如图10所示，白细胞被清晰的分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类，其中淋巴细胞和单核细胞间的区分较图9的清晰。
[0294] 对依照实施例8获得的白细胞总数和各分类细胞所占比例进行计数，并与传统方法(BC5500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)的结果进行相关性分析。白细胞总数结果相关性如图11所示，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞各部分比例结果相关性如图12-15所示。
[0295] 由以上公开的实施例及其相关附图可见，本发明所公开的白细胞分类计数试剂能有效地将白细胞分类为四个集团。由相应的散点图可见，白细胞各亚类区分度高、分类效果好，特别是淋巴细胞和单核细胞以及嗜酸细胞与中性粒细胞可被清楚地区分。另外，由实施例2(图3)与实施例1(图2)的比较可见，加入第二种非离子表面活性剂可明显促进白细胞各亚类的分离，分类效果更好。由实施例6(图7)与实施例7(图8)比较可见，使用烷基糖苷能使同类型的细胞在散点图上表现得更加聚集。由实施例1(图2)与实施例3(图4)比较可见，阴离子有机化合物的加入使细胞在散点图的荧光方向上表现得更聚集。实施例7(图8)或8(图9)与实施例4(图5)比较可见，醇类物质的加入改善了分类效果。
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