抗LGR5单克隆抗体的施用
阅读：625发布：2020-11-05
专利汇可以提供抗LGR5单克隆抗体的施用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 大体上涉及癌症 生物 学领域。本文中提供的方法和组合物的一些实施方案涉及施用特异性结合LRG5的人源化的 抗体 或其 抗原 结合 片段 以 治疗 某些癌症。，下面是抗LGR5单克隆抗体的施用专利的具体信息内容。
1.治疗患有转移性结直肠癌的人类对象的方法，包括向有需要的对象施用有效量的人源化单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)，其中：
所述单克隆抗体包含含SEQ ID NO:13的重链和含SEQ ID NO:14的轻链；
所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；
所述单克隆抗体为静脉内给药；并且
所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合施用。
3.如权利要求2所述的方法，其中在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前，施用初始剂量的单克隆抗体。
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4.如权利要求3所述的方法，其中：所述伊立替康的初始剂量为约180mg/m ，给药约90分钟；所述亚叶酸的初始剂量为约400mg/m2，给药约120分钟，并且与所述初始剂量的伊立替康同时给药；所述氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用所述初始剂量的亚叶酸之后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
5.治疗患有癌症的对象的方法，包括向有需要的对象施用有效量的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)，其中：
所述单克隆抗体包含含SEQ ID NO:13的重链和含SEQ ID NO:14的轻链；
所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；
所述单克隆抗体为静脉内给药；并且
所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述单克隆抗体与化疗剂组合施用。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述化疗剂选自亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)。
8.如权利要求7所述的方法，其中在施用化疗剂之前，施用初始剂量的单克隆抗体。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合施用。
10.如权利要求7所述的方法，其中在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前，施用初始剂量的单克隆抗体。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟。
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12.如权利要求11所述的方法，其中所述亚叶酸的初始剂量为约400mg/m ，给药约120分钟，并且与所述初始剂量的伊立替康同时给药。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用所述初始剂量的亚叶酸之后给药。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体与选自贝伐单抗、阿柏西普、西妥昔单抗和帕尼单抗的其他治疗剂组合施用。
16.如权利要求5-14中任一项所述的方法，其中所述癌症包含实体瘤。
17.如权利要求5-14中任一项所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。
18.如权利要求5-14中任一项所述的方法，其中所述癌症选自具有APC突变的结肠癌、具有KRAS突变的结肠癌、转移性结直肠癌、转移性胰腺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。
19.如权利要求5-14中任一项所述的方法，其中所述癌症为转移性结直肠癌。
20.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述对象具有选自如下的特征：在施用所述单克隆抗体之前，用于转移性疾病的先前的化疗失败过至少1系(line)；无已知的脑转移；具有12周或更长的预期寿命；在施用所述单克隆抗体之前14天内，在无生长因子支持下，具有大于约1500细胞/mL的绝对中性白细胞计数；在施用所述单克隆抗体之前14天内，在无输血条件下，具有大于100,000血小板/mL的血小板计数；具有大于或等于9.0g/dL的血红蛋白；以及具有大于或等于3g/dL的血清白蛋白。
21.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述对象为哺乳动物。
22.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述对象为人。
23.包含药物组合物的容器，所述药物组合物包含给药剂量的特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的人源化单克隆抗体以及合适的药物载体，其中所述单克隆抗体的给药剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
24.如权利要求23所述的容器，其中所述药物组合物适合于静脉内给药。
25.特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的人源化单克隆抗体，其用于治疗转移性结直肠癌，其中：
所述单克隆抗体包含含SEQ ID NO:13的重链和含SEQ ID NO:14的轻链；
所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；
所述单克隆抗体为静脉内给药；并且
所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
26.如权利要求25所述的用于治疗转移性结直肠癌的人源化单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合施用。
27.如权利要求26所述的用于治疗转移性结直肠癌的人源化单克隆抗体，其中在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前，施用初始剂量的所述单克隆抗体。
28.如权利要求25所述的用于治疗转移性结直肠癌的人源化单克隆抗体，其中：所述伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟；所述亚叶酸的初始剂量为约400mg/m2，给药约120分钟，并且与所述初始剂量的伊立替康同时给药；所述氟尿嘧啶的初始剂量为约
400mg/m2，在施用所述初始剂量的亚叶酸之后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每
14天给药。
抗LGR5单克隆抗体的施用
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2016年3月22日递交的标题为“抗LGR5单克隆抗体的施用(ADMINISTRATION OF AN ANTI-LGR5 MONOCLONAL ANTIBODY)”的美国临时申请第62/311,
631号的权益，其内容通过引用明确地整体并入本文。
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技术领域
[0005] 本申请与电子格式的序列表同时递交。序列表以标题为BIONO14WOSEQLISTING的文件提供，其于2017年3月8日生成，大小为约40Kb。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
背景技术
[0006] 富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)，也称为GPR49/HG38/FEX，属于与糖蛋白激素受体结构相似的富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体(LGR)/受体蛋白的G蛋
白偶联受体(GPR)蛋白家族。LGR分为三个亚类：(1)糖蛋白激素受体，包括促甲状腺激素
(TSH)受体、促卵泡激素(FSH)受体和黄体生成素(LH)受体；(2)松弛素受体LGR7和LGR8；以及(3)LRG4、LGR5和LGR6。LGR5在多个组织中表达，包括肠、骨骼肌、胎盘、脑和脊髓。
白偶联受体(GPR)蛋白家族。LGR分为三个亚类：(1)糖蛋白激素受体，包括促甲状腺激素
(TSH)受体、促卵泡激素(FSH)受体和黄体生成素(LH)受体；(2)松弛素受体LGR7和LGR8；以及(3)LRG4、LGR5和LGR6。LGR5在多个组织中表达，包括肠、骨骼肌、胎盘、脑和脊髓。
[0007] 发明概述
[0008] 本文中提供的方法和组合物的实施方案包括治疗患有转移性结直肠癌的人类对象的方法，包括向有需要的对象施用有效量的特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶
联受体5(LGR5)的人源化单克隆抗体，其中：所述单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
联受体5(LGR5)的人源化单克隆抗体，其中：所述单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
[0009] 在一些实施方案中，所述单克隆抗体与亚叶酸(folinic acid)、氟尿嘧啶和伊立替康(irinotecan)组合给药。在一些实施方案中，在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前施用初始剂量的单克隆抗体。在一些实施方案中，伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟；亚叶酸的初始剂量为约400mg/m2，给药约120分钟，并且与初始剂量的伊立替康
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同时给药；氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m ，在施用初始剂量的亚叶酸后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
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同时给药；氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m ，在施用初始剂量的亚叶酸后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
[0010] 本文中提供的方法和组合物的实施方案包括治疗患有癌症的对象的方法，包括向有需要的对象施用有效量的特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的
人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的
重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的
重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
[0011] 在一些实施方案中，所述单克隆抗体与化疗剂组合给药。在一些实施方案中，所述化疗剂选自亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨(gemcitabine)和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)。
[0012] 在一些实施方案中，在施用化疗剂之前施用初始剂量的所述单克隆抗体。
[0013] 在一些实施方案中，所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合给药。在一些实施方案中，在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前施用初始剂量的单克隆抗体。
[0014] 在一些实施方案中，伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟。在一些实施方案中，亚叶酸的初始剂量为约400mg/m2，给药约120分钟，并且与初始剂量的伊立替康同时给药。在一些实施方案中，氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用初始剂量的亚叶酸之后给药。在一些实施方案中，亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
[0015] 在一些实施方案中，所述单克隆抗体与选自贝伐单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)、西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的其他治疗剂组合给
药。
药。
[0016] 在一些实施方案中，所述癌症包含实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。在一些实施方案中，所述癌症选自含有APC突变的结肠癌、含有KRAS突变的结肠癌、转移性结直肠癌、转移性胰腺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为转移性结直肠癌。
[0017] 在一些实施方案中，所述对象具有选自如下的特征：在施用所述单克隆抗体之前，对于转移性疾病而言，先前化疗失败过至少1系(line)；无已知的脑转移；具有12周或更长的预期寿命；在施用所述单克隆抗体之前14天内，在无生长因子支持下，具有大于约1500细胞/mL的绝对中性白细胞计数；在施用所述单克隆抗体之前14天内，在无输血条件下，具有大于100,000血小板/mL的血小板计数；具有大于或等于9.0g/dL的血红蛋白；以及具有大于或等于3g/dL的血清白蛋白。
[0019] 本文中提供的方法和组合物的实施方案包括包含药物组合物的容器，所述药物组合物包含给药剂量的特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的人源化
的单克隆抗体，以及合适的药物载体，其中所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述药物组合物适合静脉内给药。
的单克隆抗体，以及合适的药物载体，其中所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述药物组合物适合静脉内给药。
[0020] 本文中提供的方法和组合物的实施方案包括用于治疗转移性结直肠癌的特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的人源化单克隆抗体，其中：所述单克
隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周
给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合给药。在一些实施方案中，在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前施用初始剂量的单克隆抗体。在一些实施方案中，伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟；亚叶酸的初始
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剂量为约400mg/m ，给药约120分钟，并且与所述初始剂量的伊立替康同时给药；氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用所述初始剂量的亚叶酸之后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
隆抗体包含含有SEQ ID NO:13的重链和含有SEQ ID NO:14的轻链；所述单克隆抗体为每周
给药，至少4周；所述单克隆抗体为静脉内给药；并且所述单克隆抗体的剂量为约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述单克隆抗体与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康组合给药。在一些实施方案中，在施用亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康之前施用初始剂量的单克隆抗体。在一些实施方案中，伊立替康的初始剂量为约180mg/m2，给药约90分钟；亚叶酸的初始
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剂量为约400mg/m ，给药约120分钟，并且与所述初始剂量的伊立替康同时给药；氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用所述初始剂量的亚叶酸之后给药；并且亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
[0022] 图1为显示了人源化的单克隆抗体18G7H6A3与人LGR5(CHO)的直接FACS结合的图。
[0023] 图2为显示了仅FOLFIRI以及其与18G7H6A3组合时，对CT3 CRC肿瘤体积的影响的图。
[0024] 图3为显示了18G7H6A3处理显著降低MDA-MB-231-LM3原发肿瘤体积的图。
[0025] 图4显示了FolFiri处理具有CT1或CT3肿瘤的小鼠导致LGR5上调的图。
[0026] 图5为条形图，其显示了化疗导致JH109肿瘤中LGR5上调(大于4倍)。
[0027] 图6为显示了在与化疗(吉西他滨)组合给药时，观察到明显的18G7H6A3活性的图。
[0028] 图7为点图，其显示了抗体18G7H6A3降低了CT1癌症干细胞群的生存事件数量。
[0029] 图8为线图，其显示了与分离自仅采用FOLFIRI处理的小鼠的细胞相比，分离自采用抗LGR5抗体18G7H6A3和FOLFIRI组合处理的小鼠的细胞具有大幅降低的致肿瘤性。
[0030] 图9为线图，其显示了来自18G7H6A3FOLFIRI组合的再植细胞具有明显延迟的进展时间。
[0031] 图10为线图，其显示了在与化疗(FOLFIRI)组合进行预防性给药时，观察到明显的人源化的抗体18G7H6A3活性。
[0033] 图12为条形图，其显示了增加可溶性抗体18G7H6A3的浓度不影响Wnt3a加RSPO2组合对TCF/LEF启动子驱动的GFP表达的诱导，表明抗LGR5抗体18G7H6A3不会阻断RSPO驱动的
TCF/LEF启动子激活。阳性对照抗体C12证明能够抑制Wnt3a/RSPO2驱动的TCF/LEF启动子活
化。
TCF/LEF启动子激活。阳性对照抗体C12证明能够抑制Wnt3a/RSPO2驱动的TCF/LEF启动子活
化。
[0034] 图13为线图，其显示了R-spondin不会阻断抗体18G7H6A3与LGR5的结合。
[0035] 图14为条形图，其显示了抗体18G7H6A3与LGR5的结合抑制三元复合物的形成。
[0036] 图15显示了处理样本中LGR5的表达水平。
[0037] 图16显示了处理样本中CTNNB1的表达水平和p-β-连环蛋白的表达水平。
[0038] 图17显示了不同处理样本中差异表达的转录本。
[0039] 图18显示了18G7H6A3-(BNC101)处理的肿瘤中差异表达的基因。
[0040] 图19显示了FOLFIRI处理的肿瘤中差异表达的基因。
[0041] 图20显示了组合处理的肿瘤中差异表达的基因。
[0042] 图21显示了循环HLA+细胞中LGR5的水平。
[0043] 图22A和图22B显示了循环HLA+细胞中LGR5的水平。
[0044] 图23为显示了以吉西他滨/白蛋白结合型紫杉醇、或以吉西他滨/白蛋白结合型紫杉醇与18G7H6A3处理的小鼠的动物存活的图。
[0045] 发明详述
[0046] 本文中提供的方法和组合物的一些实施方案涉及施用特异性结合富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5(LGR5)的人源化的抗体或其抗原结合片段以治疗某些癌症。此类
人源化的抗体及其抗原结合片段的实施方案在2017年10月8日发表的第WO 2015/153916号
PCT公开中有公开，其通过引用整体并入本文。
人源化的抗体及其抗原结合片段的实施方案在2017年10月8日发表的第WO 2015/153916号
PCT公开中有公开，其通过引用整体并入本文。
[0047] LGR5通过谱系示踪研究鉴定，其为肠道中正常干细胞和肿瘤起始细胞的高特异性标志物。先前鉴定了约150个基因，在Wnt表达废除后其表达被淬灭。对这些“Wnt靶标基因”的全面定征发现，LGR5在隐窝基底(crypt-base)处的10-14种增殖的楔形细胞群上选择性
表达。这些隐窝基底的柱状(crypt-based columnar)细胞先前被建议作为候选的干细胞
群。采用可遗传的lacZ-LGR5报告基因进行的体内谱系示踪，已证实LGR5肠干细胞为多能
的、自我更新的成体肠干细胞群，其能够产生从隐窝基底起始并延伸至绒毛尖端(villus
tip)的lacZ+子细胞的不间断带状物。
表达。这些隐窝基底的柱状(crypt-based columnar)细胞先前被建议作为候选的干细胞
群。采用可遗传的lacZ-LGR5报告基因进行的体内谱系示踪，已证实LGR5肠干细胞为多能
的、自我更新的成体肠干细胞群，其能够产生从隐窝基底起始并延伸至绒毛尖端(villus
tip)的lacZ+子细胞的不间断带状物。
[0048] 癌症干细胞(CSC)上LGR5的特异性表达提供了选择性及有效靶向CSC的机会。相比正常组织，LGR5在CRC、胰腺肿瘤和大多数其他实体肿瘤中高度过表达，从而提供了靶向
CRC、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌中的CSC的广泛治疗窗口。
CRC、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌中的CSC的广泛治疗窗口。
[0049] CRC中看门基因突变(gate keeping mutation)是腺瘤样结肠息肉(APC)的丧失，导致通常调节结肠隐窝中干细胞自我更新和分化之间的平衡的Wnt信号传导的异常活化。
肠干细胞中失调的Wnt信号传导，导致结肠中形成作为恶性CRC前体的腺瘤性息肉。采用将
可诱导的APC基因敲除小鼠与其LGR5干细胞经4种(GFP/YFP/ECFP/RFP)荧光遗传标志物中
的一种进行特异性且随机标记的小鼠杂交(crossed)的策略，证实了LGR5干细胞为这些小
鼠肠道肿瘤的来源或根源。诱导APC缺失后4周，单色肿瘤(即全部为GFP或全部为RFP)的出
现证实了这些肿瘤来源于单一LGR5干细胞。此外，该模型还允许LGR5干细胞中的荧光遗传
标记被转换成不同的颜色，以便产生红色肿瘤的RFP+LGR5癌症干细胞能够在中途被转化为
ECFP+LGR5癌症干细胞，其仍然接种(seed)至肿瘤，但现在产生侵入先前均为红色的GFP+肿瘤团块的蓝色肿瘤细胞。该转换实验不仅提供了LGR5CSC为肠肿瘤起源，能够启动并接种肠肿瘤生长的进一步证据，还提供了其连续维持肿瘤形成(即具有长期再生(repopulating)
能力)的进一步证据。
肠干细胞中失调的Wnt信号传导，导致结肠中形成作为恶性CRC前体的腺瘤性息肉。采用将
可诱导的APC基因敲除小鼠与其LGR5干细胞经4种(GFP/YFP/ECFP/RFP)荧光遗传标志物中
的一种进行特异性且随机标记的小鼠杂交(crossed)的策略，证实了LGR5干细胞为这些小
鼠肠道肿瘤的来源或根源。诱导APC缺失后4周，单色肿瘤(即全部为GFP或全部为RFP)的出
现证实了这些肿瘤来源于单一LGR5干细胞。此外，该模型还允许LGR5干细胞中的荧光遗传
标记被转换成不同的颜色，以便产生红色肿瘤的RFP+LGR5癌症干细胞能够在中途被转化为
ECFP+LGR5癌症干细胞，其仍然接种(seed)至肿瘤，但现在产生侵入先前均为红色的GFP+肿瘤团块的蓝色肿瘤细胞。该转换实验不仅提供了LGR5CSC为肠肿瘤起源，能够启动并接种肠肿瘤生长的进一步证据，还提供了其连续维持肿瘤形成(即具有长期再生(repopulating)
能力)的进一步证据。
[0050] 癌症中LGR5的功能作用已通过核糖核酸干扰(RNAi)敲低研究进行了证实。一组CRC肿瘤细胞系中LGR5的敲低，显著抑制了软琼脂集落的生长，还抑制了HCT116结肠肿瘤异种移植体的体内生长。随后显示LGR5RNAi敲低还能够减少患者来源的CRC肿瘤细胞的CSC集
落的体外生长(数据未显示)。最后，发现相比于对照LGR5-细胞，分选的LGR5+患者来源的异种移植CRC肿瘤细胞在体内具有高度致瘤性。
落的体外生长(数据未显示)。最后，发现相比于对照LGR5-细胞，分选的LGR5+患者来源的异种移植CRC肿瘤细胞在体内具有高度致瘤性。
[0051] CSC被认为是以手术和标准护理化疗治疗的许多癌症患者肿瘤复发的发生率高的原因。例如，发现化疗后乳腺癌患者的CD44+CSC富集，且高水平的CSC与对化疗的不良临床应答相关。类似地，在转移性CRC中，化疗后受损伤的肝中LGR5表达被上调，这表明响应化疗而增加的LGR5CSC能够启动和/或恶化转移性疾病。确实，已发现相比原发性CRC肿瘤，转移性位点中的LGR5表达明显更高。
[0052] 抗LGR5抗体
[0053] 如本文中所用，术语“抗体”包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化的抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fvs(scFv)、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)(包括双特异性sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体，以及以上中任一抗体的表位结合片段。本文中提供的数个实施方案中的抗体可以为单特异性、双特异性、三特异性或更多的多特异性。多特异性抗体可以对多肽的不同表位具有特异性，或者可以对多肽以及异源表位(诸如异源多肽或固体支持材
料)具有特异性。参见，例如，PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；WO 92/
05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；第4,474,893号美国专利；第4,714,681号美国专利；第4,925,648号美国专利；第5,573,920号美国专利；第5,601,819号美国专利；
Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；其每一个通过引用整体并入本文。
料)具有特异性。参见，例如，PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；WO 92/
05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；第4,474,893号美国专利；第4,714,681号美国专利；第4,925,648号美国专利；第5,573,920号美国专利；第5,601,819号美国专利；
Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；其每一个通过引用整体并入本文。
[0054] 如本文中所用，LGR5包括但不限于含有NCBI登录号NP_003658.1的多肽或其片段的人LGR5，其由NM_003667.2中的编码核苷酸序列或其片段所编码。NCBI登录号NP_
003658.1的氨基酸序列和完整录入以及NM_003667.2的核苷酸序列和完整录入通过引用全
部并入本文。本文考虑的LGR5片段的实例包括LGR5的胞外域、跨膜结构域或胞内结构域以
及以上的一部分。
003658.1的氨基酸序列和完整录入以及NM_003667.2的核苷酸序列和完整录入通过引用全
部并入本文。本文考虑的LGR5片段的实例包括LGR5的胞外域、跨膜结构域或胞内结构域以
及以上的一部分。
[0055] 数个实施方案涉及产生抗LGR5抗体的轻链和/或重链的杂交瘤，所述抗LGR5抗体包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体。在一个方面，
所述杂交瘤产生人源化的单克隆抗体或全人单克隆抗体的轻链和/或重链，如以下实施例
中制备和描述的18G7H6A3和18G7H6A1的轻链和/或重链。
所述杂交瘤产生人源化的单克隆抗体或全人单克隆抗体的轻链和/或重链，如以下实施例
中制备和描述的18G7H6A3和18G7H6A1的轻链和/或重链。
[0056] 一些实施方案涉及编码抗LGR5抗体的轻链或重链的核酸分子，所述抗LGR5抗体包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种。在一
些方面，核酸分子编码人源化或全人单克隆的轻链或重链，如以下实施例中制备和描述的
抗体18G7H6A3和18G7H6A1。
些方面，核酸分子编码人源化或全人单克隆的轻链或重链，如以下实施例中制备和描述的
抗体18G7H6A3和18G7H6A1。
[0057] 多种实施方案涉及包含编码抗LGR5抗体的轻链和/或重链的一个或多个核酸分子的载体，所述抗LGR5抗体包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗
LGR5抗体中的任一种。
LGR5抗体中的任一种。
[0058] 在多种实施方案中，可以修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，例如以增加抗体对靶标抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点实现此类碳水化合物的修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，进而导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位
点处的糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此类方法在第5,714,350号和第6,350,861号美国专利中有更为详细的描述；其每一个通过引用整体并入本文。
点处的糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此类方法在第5,714,350号和第6,350,861号美国专利中有更为详细的描述；其每一个通过引用整体并入本文。
[0059] 在数个实施方案中，抗体特异性结合包含以下LGR5多肽或由以下LGR5多肽组成的多肽，所述LGR5多肽与NCBI登录号NP_003658.1(SEQ ID NO:47)的人LGR5多肽或其片段具
有至少60％同一性、或至少70％同一性、或至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少97％同一性、或至少99％同一性、或100％同一性。此类片段可以为，例如所述LGR5多肽的至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、
400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个连续或非连续的氨基酸，或者为上述长度中的任一个之间的任意数量的连续或非连续的氨基酸。
有至少60％同一性、或至少70％同一性、或至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少97％同一性、或至少99％同一性、或100％同一性。此类片段可以为，例如所述LGR5多肽的至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、
400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个连续或非连续的氨基酸，或者为上述长度中的任一个之间的任意数量的连续或非连续的氨基酸。
[0060] 在数个实施方案中，抗体为抗体18G7H6A3，并且包含SEQ ID NO:13的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:11的DNA序列。在一些实施方案中，抗体为抗体18G7H6A3，并且具有包含SEQ ID NO:19的重链可变结构域。在数个实施方案中，抗体为抗体18G7H6A3，并且包含SEQ ID NO:14的轻链序列。在其他实施方案中，所述抗体为抗体18G7H6A3，并且包含SEQ ID NO:
21的轻链可变结构域。
21的轻链可变结构域。
[0061] 在一些实施方案中，所述抗体包含与上述序列的序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，在上述序列的重链、轻链或可变域的29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、
55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、
103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或118个残基范围内，所述抗体包含与上述抗体序列具有100％同一性的序列。
99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，在上述序列的重链、轻链或可变域的29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、
55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、
103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或118个残基范围内，所述抗体包含与上述抗体序列具有100％同一性的序列。
[0062] 在一些实施方案中，所述抗体包含与所述抗体序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含与所述抗体序列具有84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％同一性的序列。在一些实施方案中，在33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110或111个残基的范围内，所述抗体包含与所述抗体序列具有100％同一性的序列。
99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含与所述抗体序列具有84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％同一性的序列。在一些实施方案中，在33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110或111个残基的范围内，所述抗体包含与所述抗体序列具有100％同一性的序列。
[0063] 在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体包含含有GYSFTAYW(SEQ ID NO:23)的重链CDRl、含有ILPGSDST(SEQ ID NO:2)的重链CDR2以及含有ARSGYYGSSQY(SEQ ID NO:
3)的重链CDR3。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体包含含有ESVDSYGNSF(SEQ ID NO:4)的轻链CDRl、含有LTS的轻链CDR2以及含有QQNAEDPRT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR3。
3)的重链CDR3。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体包含含有ESVDSYGNSF(SEQ ID NO:4)的轻链CDRl、含有LTS的轻链CDR2以及含有QQNAEDPRT(SEQ ID NO:33)的轻链CDR3。
[0064] 在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体包含：(a)含有以上序列的具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDR1。所述抗体还可以具有重链CDR2，其具有含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。所述抗体还可以具有重链CDR3，其具有含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。除重链的这些修饰之外，所述抗体还可以具有轻链CDR1，其具有含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。所述抗体还可以具有轻链CDR2，其具有含1、2、3或4个氨基酸取代的变体。所述抗体还可以具有轻链CDR3，其具有1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。
[0065] 在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体包含这样的抗体，其包含与本文中所附序列表中描述的序列具有至少80％或90％序列同一性的重链可变区。所述抗体还可以
具有轻链可变区，所述轻链可变区与本文中描述的抗体序列具有至少80％或90％序列同一
性。
具有轻链可变区，所述轻链可变区与本文中描述的抗体序列具有至少80％或90％序列同一
性。
[0066] 可以例如通过针对最佳比对目的的序列比对来确定两个氨基酸序列(或两个核酸序列)的百分比同一性(例如，可以在第一个序列的序列中引入空位(gap))。然后比较相应
位点的氨基酸或核苷酸，以及两个序列间的百分比同一性为这些序列共有的相同位点数的
函数(即，％同一性＝相同位点#/总位点#×100)。两个序列的实际比较可以通过熟知的方
法完成，例如采用数学算法。这样的数学算法的具体非限制性实例描述于Karlin等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)中，其通过引用整体并入本文。如Schaffer等人,Nucleic Acids Res.,29:2994-3005(2001)中所述，将这样的算法整合到BLASTN和
BLASTX程序(version 2.2)中，其通过引用整体并入本文。在使用BLAST和空位BLAST
(Gapped BLAST)程序时，可以使用各自程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见http://
www.ncbi.nlm.nih.gov，提供于2002年4月10日。在一个实施方案中，检索的数据库为非冗余(NR)数据库，且用于序列比较的参数可以设定为：无滤过；预期值为10；字大小为3；矩阵为BLOSUM62；并且空位存在罚分为11和空位延伸罚分为1。
位点的氨基酸或核苷酸，以及两个序列间的百分比同一性为这些序列共有的相同位点数的
函数(即，％同一性＝相同位点#/总位点#×100)。两个序列的实际比较可以通过熟知的方
法完成，例如采用数学算法。这样的数学算法的具体非限制性实例描述于Karlin等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)中，其通过引用整体并入本文。如Schaffer等人,Nucleic Acids Res.,29:2994-3005(2001)中所述，将这样的算法整合到BLASTN和
BLASTX程序(version 2.2)中，其通过引用整体并入本文。在使用BLAST和空位BLAST
(Gapped BLAST)程序时，可以使用各自程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见http://
www.ncbi.nlm.nih.gov，提供于2002年4月10日。在一个实施方案中，检索的数据库为非冗余(NR)数据库，且用于序列比较的参数可以设定为：无滤过；预期值为10；字大小为3；矩阵为BLOSUM62；并且空位存在罚分为11和空位延伸罚分为1。
[0067] 数个实施方案还包括上述抗体的变体，所述抗体包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种，所述变体包含可变区轻链(VL)结构
域和/或可变区重链(VH)结构域中的一个或多个氨基酸残基取代。数个实施方案还包括上
述抗体的变体，所述变体在一个或多个VL CDR和/或一个或多个VH CDR中具有一个或多个另外的氨基酸残基取代。可以体外和体内测试通过在上述抗体的VH结构域、VH CDR、VL结构域和/或VL CDR中引入取代所产生的抗体，例如，测试其结合LGR5的能力(通过例如免疫测定，其包括但不限于ELISA和BIAcore)。
域和/或可变区重链(VH)结构域中的一个或多个氨基酸残基取代。数个实施方案还包括上
述抗体的变体，所述变体在一个或多个VL CDR和/或一个或多个VH CDR中具有一个或多个另外的氨基酸残基取代。可以体外和体内测试通过在上述抗体的VH结构域、VH CDR、VL结构域和/或VL CDR中引入取代所产生的抗体，例如，测试其结合LGR5的能力(通过例如免疫测定，其包括但不限于ELISA和BIAcore)。
[0068] 多种实施方案包括特异性结合LGR5的抗体，所述抗体包含特异性结合LGR5的抗LGR5抗体的VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR的衍生物，如以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种。可以使用本领域技术人员已知的标
准技术在编码抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，添加、缺失、和/或取代)，包括例如，定点诱变和PCR介导的诱变常用于产生氨基酸取代。在一个实施方案中，相对于最初的VH和/
或VL CDR，所述VH和/或VL CDR衍生物包含少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于
15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代，或少于2个氨基酸取代。在另一实施方案中，所述VH和/或VL CDR衍生物具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，对抗体特异性结合LGR5并非至关重要的氨基酸
残基)处产生的保守氨基酸取代(例如同上)。可选地，可以沿所有或部分的VH和/或VL CDR编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变，以及可针对生物学活性对得到的突变体进行筛选
以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以表达编码的抗体，且可以确定所述抗体的活性。
准技术在编码抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，添加、缺失、和/或取代)，包括例如，定点诱变和PCR介导的诱变常用于产生氨基酸取代。在一个实施方案中，相对于最初的VH和/
或VL CDR，所述VH和/或VL CDR衍生物包含少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于
15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代，或少于2个氨基酸取代。在另一实施方案中，所述VH和/或VL CDR衍生物具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，对抗体特异性结合LGR5并非至关重要的氨基酸
残基)处产生的保守氨基酸取代(例如同上)。可选地，可以沿所有或部分的VH和/或VL CDR编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变，以及可针对生物学活性对得到的突变体进行筛选
以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以表达编码的抗体，且可以确定所述抗体的活性。
[0069] 数个实施方案还包括特异性结合LGR5或其片段的抗体，所述抗体包含这样的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，其与本文中描述的抗体中的任一种的可变重链和/或轻
链的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，所述抗体包括所述抗LGR5抗体中的任一种，其包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的那
些抗LGR5抗体。
链的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，所述抗体包括所述抗LGR5抗体中的任一种，其包括以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的那
些抗LGR5抗体。
[0070] 另一实施方案包括在抗LGR5抗体的任意部分中引入保守氨基酸取代，如以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种。本领域熟知“保
守氨基酸取代”是指取代功能等同的氨基酸的氨基酸取代。保守氨基酸改变引起所产生的
肽的氨基酸序列中的沉默改变。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸用作功能等同物，且引起所述肽的氨基酸序列中的沉默改变。电荷中性且残基被较小残基置换的取代也可以
被认为是“保守取代”，即使残基在不同分组中(例如，以较小的异亮氨酸置换苯丙氨酸)。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。保守氨基酸取代的一些家族示于表1。
守氨基酸取代”是指取代功能等同的氨基酸的氨基酸取代。保守氨基酸改变引起所产生的
肽的氨基酸序列中的沉默改变。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸用作功能等同物，且引起所述肽的氨基酸序列中的沉默改变。电荷中性且残基被较小残基置换的取代也可以
被认为是“保守取代”，即使残基在不同分组中(例如，以较小的异亮氨酸置换苯丙氨酸)。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。保守氨基酸取代的一些家族示于表1。
[0071] 表1
[0072]家族 氨基酸
非极性 Trp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Pro
不带电荷极性 Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys
酸性/带负电荷 Asp、Glu
碱性/带正电荷 Arg、Lys、His
带β-支链的 Thr、Val、Ile
影响链取向的残基 Gly、Pro
芳香族的 Trp、Tyr、Phe、His
非极性 Trp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Pro
不带电荷极性 Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys
酸性/带负电荷 Asp、Glu
碱性/带正电荷 Arg、Lys、His
带β-支链的 Thr、Val、Ile
影响链取向的残基 Gly、Pro
芳香族的 Trp、Tyr、Phe、His
[0073] 用抗LGR5抗体阻断癌症干细胞生长
[0074] 数个实施方案涉及利用抗LGR5抗体在体外和体内阻断癌症干细胞生长。在一些实施方案中，阻断癌症干细胞生长的方法包括向癌症干细胞施用有效量的抗LGR5抗体，其中
所述有效量的所述抗LGR5抗体足以减少所述癌症干细胞的生长。
所述有效量的所述抗LGR5抗体足以减少所述癌症干细胞的生长。
[0075] 在一些实施方案中，阻断癌症干细胞生长的方法包括向癌症干细胞施用有效量的抗LGR5抗体，其中所述有效量的抗LGR5抗体足以减少或阻断癌症干细胞的增殖，或者减少
或阻断癌症干细胞的生长。
或阻断癌症干细胞的生长。
[0076] 在一些方面，在体外向癌症干细胞施用有效量的抗LGR5抗体。在其他方面，在体内向需要此治疗的患者中的癌症干细胞施用有效量的抗LGR5抗体。
[0077] 如本文所用，术语“癌症干细胞”是指能够广泛或无限增殖并产生癌症中大比例的癌细胞的细胞。在一些方面，所述大比例的癌细胞表示给定癌症中大多数的癌细胞。出于示例但不限制的目的，癌症干细胞可以是肿瘤的起始细胞或者包含大部分癌肿块的癌细胞的祖细胞。在一些方面，癌症干细胞指的是，在细胞无任何其他突变或者引入外源细胞增殖诱导剂或致癌剂的情况下，其被植入免疫受损个体时，能分裂形成一个或多个肿瘤的细胞。在一些方面，癌症干细胞分裂产生其他的癌症干细胞以及最终分化成癌细胞或癌组织。
[0078] 在一些实施方案中，癌症干细胞的生长、增殖或活力受阻，而不会干扰LGR5-RSpo结合或者信号传导。在一些实施方案中，癌症干细胞的生长、增殖或活力受阻，而不通过阻断或抑制通过Wnt的LGR5信号转导来干扰LGR5-RSpo结合或信号转导。
[0079] 如关于阻断癌症干细胞生长所用的，术语“有效量”是指足以将癌症干细胞的生长降低任何程度的抗LGR5抗体的量。本领域已知的任何测定方法均可用于测量癌症干细胞的生长。例如，可以通过集落数、总细胞数或者细胞群体或集落的体积/大小测量癌症干细胞生长。在数个实施方案中，可以通过以下实施例1中描述的肿瘤球生长测定来测量癌症干细胞生长。
[0080] 在某些实施方案中，如通过癌症干细胞群或肿瘤球生长减少至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者任意上述数目之间的任意百分比所测量的，有效量的抗LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生
长。在一些方面，所述抗LGR5抗体为以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和
18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
长。在一些方面，所述抗LGR5抗体为以下实施例中制备和描述的指定为18G7H6A3和
18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
[0081] 例如，在一些实施方案中，如通过癌症干细胞群或肿瘤球生长减少至少约5％-99％、5％-80％、5％-40％、10％-99％、10％-80％、10％-60％、10％-40％、20％-99％、
20％-80％、20％-60％、、20％-40％、50％-98％、50％-80％或60％-99％所测量的，有效量的抗LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生长。在一些方面，抗LGR5抗体为以下实施例中制备和
描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
20％-80％、20％-60％、、20％-40％、50％-98％、50％-80％或60％-99％所测量的，有效量的抗LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生长。在一些方面，抗LGR5抗体为以下实施例中制备和
描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
[0082] 在其他实施方案中，如通过癌症干细胞群或肿瘤球生长减少至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、
4.5、5.0、10、25、50、75、100、200或1000倍，或者任意上述数目之间的任意倍数所测量的，有效量的抗LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生长。在一些方面，抗LGR5抗体为以下实施例中制
备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
4.5、5.0、10、25、50、75、100、200或1000倍，或者任意上述数目之间的任意倍数所测量的，有效量的抗LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生长。在一些方面，抗LGR5抗体为以下实施例中制
备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的抗LGR5抗体中的任一种或它们的组合。
[0083] 在一些实施方案中，足以以上述任意程度阻断癌症干细胞生长的有效量的抗LGR5抗体浓度为约1nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、500nM、
550nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、
30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、
800mM、900mM、1000mM、1M、5M、10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M、45M、50M、75M、100M，或者上述浓度中任意两个之间的任意数。在一些方面，抗LGR5抗体组合物可以包含以下实施例中
制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的两种抗体。
550nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、
30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、
800mM、900mM、1000mM、1M、5M、10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M、45M、50M、75M、100M，或者上述浓度中任意两个之间的任意数。在一些方面，抗LGR5抗体组合物可以包含以下实施例中
制备和描述的指定为18G7H6A3和18G7H6A1的两种抗体。
[0084] 在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体以小于约200nM、小于约100nM、小于约80nM、小于约50nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约1nM，和任意上述值之间的范围的KD结合人LGR5。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体以小于约10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM和任意上述值范围内的亲和力结合LGR5。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体以大于约0.0001nM、0.001nM、0.01nM和任意上述值范围内的亲和力结合LGR5。
[0085] 在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体结合这样的表位，所述表位包含下述氨基酸或由下述氨基酸组成、或者在下述氨基酸以内：SEQ ID NO:47的氨基酸T175、
E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体结合这样的表位，所述表位包含富含亮氨酸重复6-9，或者由富含亮氨酸重复6-9组成，或者在富含亮氨酸重复6-9内(参见例如，Chen等人genes
Dev.27(12):1345-50，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，本文中提供的抗
LGR5抗体结合这样的表位，所述表位包含LGR5胞外结构域的凸面，或者由LGR5胞外结构域
的凸面组成，或者在LGR5胞外结构域的凸面内(参见例如，Chen等人genes Dev.27(12):
1345-50，其通过引用整体并入本文)。
E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260。在一些实施方案中，本文中提供的抗LGR5抗体结合这样的表位，所述表位包含富含亮氨酸重复6-9，或者由富含亮氨酸重复6-9组成，或者在富含亮氨酸重复6-9内(参见例如，Chen等人genes
Dev.27(12):1345-50，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，本文中提供的抗
LGR5抗体结合这样的表位，所述表位包含LGR5胞外结构域的凸面，或者由LGR5胞外结构域
的凸面组成，或者在LGR5胞外结构域的凸面内(参见例如，Chen等人genes Dev.27(12):
1345-50，其通过引用整体并入本文)。
[0086] 一些实施方案包括治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文中提供的抗LGR5抗体。在一些实施方案中，所述癌症选自：胰腺癌、结直肠癌、肺癌、、胰腺癌和乳腺癌如三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述结直肠癌包含腺瘤样结肠息肉(APC)基因的失活突变，不包含APC基因的失活突变，或者包含野生型APC基因。在一些实施方案中，癌症为。在一些实施方案中，所述癌症包含LGR5蛋白水平的升高。在一些实施方案中，所述癌症为表达升高水平LGR5的结肠癌。在一些实施方案中，所述癌症为表达升高水平LGR5的胰腺癌，在一些实施方案中，所述癌症为表达升高水平LGR5的乳腺癌。
[0087] 一些实施方案包括治疗对象的疾病的方法，其中所述疾病与β-连环蛋白活化和/或异常β-连环蛋白信号传导有关。一些实施方案包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文中提供的抗LGR5抗体。
[0088] 一些实施方案包括治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文中提供的抗LGR5抗体与至少一种其他的治疗剂的组合。在一些实施方案中，其他
的治疗剂包括化疗剂。在一些实施方案中，所述其他的治疗剂包括生物试剂。一些实施方案包括施用本文中提供的抗LGR5抗体与化疗剂和生物试剂的组合。在一些实施方案中，施用
本文中提供的抗LGR5抗体与化疗剂的组合，可以增加癌症如肿瘤中LGR5的表达水平。本文
中提供的方法的一些实施方案包括测定肿瘤或癌症中LGR5蛋白的表达水平。
的治疗剂包括化疗剂。在一些实施方案中，所述其他的治疗剂包括生物试剂。一些实施方案包括施用本文中提供的抗LGR5抗体与化疗剂和生物试剂的组合。在一些实施方案中，施用
本文中提供的抗LGR5抗体与化疗剂的组合，可以增加癌症如肿瘤中LGR5的表达水平。本文
中提供的方法的一些实施方案包括测定肿瘤或癌症中LGR5蛋白的表达水平。
[0089] 本文中提供的方法的一些实施方案包括鉴定使用本文中提供的抗LGR5抗体进行治疗的对象。一些实施方案包括确定所述对象是否患有这样的肿瘤，所述肿瘤相比正常组
织中相同LGR5蛋白的表达，具有升高的LGR5表达水平。一些实施方案包括：如果所述肿瘤具有升高的LGR5表达水平，则选择该对象用于治疗。一些实施方案还包括确定所述对象是否
患有包含APC基因的失活突变的肿瘤。一些实施方案还包括：如果肿瘤包含APC基因的失活
突变，则选择该对象用于治疗。
织中相同LGR5蛋白的表达，具有升高的LGR5表达水平。一些实施方案包括：如果所述肿瘤具有升高的LGR5表达水平，则选择该对象用于治疗。一些实施方案还包括确定所述对象是否
患有包含APC基因的失活突变的肿瘤。一些实施方案还包括：如果肿瘤包含APC基因的失活
突变，则选择该对象用于治疗。
[0090] 与上述相关的方法、组合物和相关的公开提供于，例如2013年5月10日出版的第WO 2013/067055号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本文)，以及例如2013年5月10日出
版的第WO 2013/067054号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本文)，以及例如2013年5
月10日出版的第WO 2013/067057号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本文)，以及例
如2013年5月10日出版的第WO 2013/067060号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本
文)。
版的第WO 2013/067054号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本文)，以及例如2013年5
月10日出版的第WO 2013/067057号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本文)，以及例
如2013年5月10日出版的第WO 2013/067060号PCT公开(其内容通过引用在此整体并入本
文)。
[0091] 药物组合物
[0092] 可以将本文中提供的特异性结合LGR5的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段，掺入至适合给药的药物组合物中。此类组合物通常包含所述人源化的单克隆抗体或其抗原
结合片段，以及药学上可接受的载体。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括任意及所有与给药兼容的溶剂、分散媒介、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版的本领域标准参考文献雷明登氏药学大全(Remington's
Pharmaceutical Sciences)中，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括
但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水溶性载体如固定油。将此类媒介和试剂用于药物活性物质为本领域所熟知的。除非到了任
意常规媒介或试剂与所述活性化合物不兼容的程度，其在所述组合物中的使用都是可以考
虑的。也可以将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
结合片段，以及药学上可接受的载体。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括任意及所有与给药兼容的溶剂、分散媒介、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版的本领域标准参考文献雷明登氏药学大全(Remington's
Pharmaceutical Sciences)中，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括
但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水溶性载体如固定油。将此类媒介和试剂用于药物活性物质为本领域所熟知的。除非到了任
意常规媒介或试剂与所述活性化合物不兼容的程度，其在所述组合物中的使用都是可以考
虑的。也可以将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
[0093] 制备本发明的药物组合物以适合其预期的给药途径。给药途径的实例包括肠胃外途径，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(即，外用)、穿黏膜和经直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。所述肠胃外制剂可以封装于玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0094] 适合注射用的药物组合物包含用于无菌可注射溶液或分散剂的临时制剂的无菌水溶液(为水溶性时)或分散剂和无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油TM.(Cremophor EL.TM.)(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐
水(PBS)。所述载体可以为溶剂或分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。在许多情况下，组合物中优选包含等渗
剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现所述可注射组合物的延长吸收。
水(PBS)。所述载体可以为溶剂或分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。在许多情况下，组合物中优选包含等渗
剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现所述可注射组合物的延长吸收。
[0095] 可以通过将所需量的活性化合物掺入至含有上述成分中的一种或其组合的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液，根据需要，随后进行过滤除菌。通常，通过将活性化合物掺入至包含基本分散介质和所需要的来自上述那些的其他成分的无菌媒介中来制备分散剂。
在将无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产
生所述活性成分加任何其他所需要的来自其先前经无菌过滤的溶液的成分的粉末。
在将无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产
生所述活性成分加任何其他所需要的来自其先前经无菌过滤的溶液的成分的粉末。
[0096] 将组合物以剂量单位形式进行制备是尤其有利的，以易于给药和剂量统一。如本文中使用的剂量单位形式是指适合用作待治疗对象的统一剂量的物理分离单元；每个单元
包含预定量的活性化合物，其经计算能够与所需要的药物载体结合产生预期的治疗效应。
本发明所述的剂量单元形式的说明取决于且直接依赖于所述活性化合物的独特特征和要
达到的特定治疗效果，以及在组合此类活性化合物用于个体治疗的领域中固有的限制。
包含预定量的活性化合物，其经计算能够与所需要的药物载体结合产生预期的治疗效应。
本发明所述的剂量单元形式的说明取决于且直接依赖于所述活性化合物的独特特征和要
达到的特定治疗效果，以及在组合此类活性化合物用于个体治疗的领域中固有的限制。
[0098] 试剂盒
[0099] 本文中提供的一些实施方案包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文中提供的人源化的抗体。在一些实施方案中，所述抗体被冻干。在一些实施方案中，所述抗体为水溶液。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于所述抗体给药的药物载体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含化疗剂。在一些实施方案中，所述化疗剂选自：亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)。
[0100] 一些实施方案包括含有药物组合物的容器，所述药物组合物包含给药剂量的特异性结合LGR5的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及合适的药物载体，其中所述剂
量适合治疗患有癌症的对象。所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量可以大
于、小于或等于约1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、
35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg，或者上述剂量中的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片
段的所述剂量为约2.5mg/kg至约20mg/kg，或约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述药物组合物适合静脉内给药。在一些实施方案中，所述药物组合物适合腹膜内注射。
量适合治疗患有癌症的对象。所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量可以大
于、小于或等于约1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、
35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg，或者上述剂量中的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片
段的所述剂量为约2.5mg/kg至约20mg/kg，或约2.5mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方案中，所述药物组合物适合静脉内给药。在一些实施方案中，所述药物组合物适合腹膜内注射。
[0101] 治疗方法
[0102] 方法、组合物和试剂盒的一些实施方案包括治疗患有癌症的对象的方法。一些此类方法包括向有需要的对象施用有效量的特异性结合LGR5的人源化的单克隆抗体或其抗
原结合片段。所述对象可以为哺乳动物，例如人。
原结合片段。所述对象可以为哺乳动物，例如人。
[0103] 在一些实施方案中，所述癌症包含实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症可以为结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌或肺癌。在一些实施方案中，所述癌症可以为包含APC突变的结肠癌、包含KRAS突变的结肠癌、转移性结直肠癌、转移性胰腺癌、三阴性乳腺癌或小细胞肺癌。
[0104] 特异性结合LGR5的所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括重链CDR，如含SEQ ID NO:23的重链CDR1、含SEQ ID NO:25的重链CDR2，和/或含SEQ ID NO:27的重链CDR3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含SEQ ID NO:
19的重链可变结构域。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含
SEQ ID NO:13的重链。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括轻
链CDR，如含SEQ ID NO:29的轻链CDR1、含SEQ ID NO:31的轻链CDR2，和/或含SEQ ID NO:33的轻链CDR3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含SEQ ID
NO:21的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含SEQ ID NO:14的轻链。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括
含SEQ ID NO:13的重链和含SEQ ID NO:14的轻链。在一些实施方案中，所述人源化的单克
隆抗体或其抗原结合片段为18G7H6A3。
19的重链可变结构域。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含
SEQ ID NO:13的重链。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括轻
链CDR，如含SEQ ID NO:29的轻链CDR1、含SEQ ID NO:31的轻链CDR2，和/或含SEQ ID NO:33的轻链CDR3。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含SEQ ID
NO:21的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括含SEQ ID NO:14的轻链。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括
含SEQ ID NO:13的重链和含SEQ ID NO:14的轻链。在一些实施方案中，所述人源化的单克
隆抗体或其抗原结合片段为18G7H6A3。
[0105] 用于治疗患有癌症的对象的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量可以大于、少于或等于约1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg，或者上述剂量的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片
段的剂量为约2.5mg/kg至约20mg/kg，或者为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
段的剂量为约2.5mg/kg至约20mg/kg，或者为约2.5mg/kg至约15mg/kg。
[0106] 所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段的给药频率可以为每天、每周或每月。在一些实施方案中，给药可以为每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次或每6天一次。在一些实施方案中，给药可以为每周一次、每2周一次、每3周一次或每4周一次。在一些实施方案中，给药可以为每月给药。
[0107] 施用所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段的途径可适于生物学给药。例如，可以通过腹膜内注射，或者通过静脉内途径给药。
[0108] 施用人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段可以与化疗剂组合施用。化疗剂的实例包括亚叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康、吉西他滨和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)。在一些实施方案中，FOLFIRI组合：亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康，可以与人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段组合施用。在一些实施方案中，治疗癌症的方
法中与人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段组合的初始剂量的化疗剂，可以在施用初始
剂量的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在一些实施方案中，治疗癌症的
方法中与人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段组合的初始剂量的化疗剂，可以在施用初
始剂量的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段后施用。
法中与人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段组合的初始剂量的化疗剂，可以在施用初始
剂量的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在一些实施方案中，治疗癌症的
方法中与人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段组合的初始剂量的化疗剂，可以在施用初
始剂量的人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段后施用。
[0109] 在一些实施方案中，伊立替康的初始剂量可以为约180mg/m2，给药约90分钟；亚叶酸的初始剂量为约400mg/m2，给药约120分钟，并且与初始剂量的伊立替康同时施用；和/或氟尿嘧啶的初始剂量为约400mg/m2，在施用初始剂量的亚叶酸后施用。在一些实施方案中，亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康为每14天给药。
[0110] 在一些实施方案中，人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段可以与其他治疗剂组合施用。其他治疗剂的实例包括贝伐单抗、阿柏西普、西妥昔单抗和帕尼单抗。
实施例
实施例
[0111] 实施例1-LGR5抗体的人源化
[0112] 将人种系序列用作使鼠源抗体18G7.1人源化的受体框。为了找到最接近的种系序列，在NCI IgBLAST种系序列数据库(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)中鉴定了表达最相似的
轻链和最相似的重链。在该检索中，对18G7.1的CDR序列进行了掩蔽。最合适表达的序列的选择包括检查经典残基和界面残基的序列同一性，以及检查CDR环长度的相似性。
轻链和最相似的重链。在该检索中，对18G7.1的CDR序列进行了掩蔽。最合适表达的序列的选择包括检查经典残基和界面残基的序列同一性，以及检查CDR环长度的相似性。
[0113] 为了确定候选人源化序列与亲本鼠源单克隆抗体18G7.1之间关键结构框残基中可能的结构冲突，生成三维模型。抗体结构的合成用于制作具有移植的候选人源化序列的
同源模型，然后进行分子能量最小化。将采用计算机软件Pymol的结构分析，用于确定可能潜在地负面影响正确折叠的残基。
同源模型，然后进行分子能量最小化。将采用计算机软件Pymol的结构分析，用于确定可能潜在地负面影响正确折叠的残基。
[0114] 根据该分析，构建了6个候选VH链，其包含：1)功能性人框架，基于对折叠的可能影响的分析，所述人框架在候选的人源化框架区内含有所选择的取代，和ii)亲代的18G7.1鼠源抗体CDR(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。人IgG1恒定区的框内融合是化学合成的。
[0115] 类似地，构建两个候选VL链，其包含：1)功能性人框架，基于对折叠的可能影响的分析，所述人框架在候选的人源化框架区内含有所选择的取代，和ii)亲代的18G7.1鼠源抗体CDR(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)。候选VL链和候选VH链与人IgG1恒定区的框内融合是化学合成的。
[0116] 通过共转染至哺乳动物细胞，对所选择的候选变体人源化重链和轻链组合的功能进行了测试。将上述6个候选的人源化18G7.1重链中的每一个与候选的18G7.1轻链中的每
一个一起共转染至HEK 293细胞，并通过流式细胞术测定条件培养物的LGR5抗原结合活性。
另外，将上述3个候选的人源化18G7.1重链与第二候选18G7.1轻链一起共转染至HEK293细
胞，并通过流式细胞术测定条件培养物的LGR5抗原结合活性。挑选称为18G7H6且呈现最稳
健结合的18G7.1候选重链/轻链的组合(人源化变体)用于亲和力成熟。
一个一起共转染至HEK 293细胞，并通过流式细胞术测定条件培养物的LGR5抗原结合活性。
另外，将上述3个候选的人源化18G7.1重链与第二候选18G7.1轻链一起共转染至HEK293细
胞，并通过流式细胞术测定条件培养物的LGR5抗原结合活性。挑选称为18G7H6且呈现最稳
健结合的18G7.1候选重链/轻链的组合(人源化变体)用于亲和力成熟。
[0117] 实施例2-人源化LGR5抗体的亲和力成熟
[0118] 为了增加所选的人源化变体18G7H6的亲和力，采用了丙氨酸扫描诱变与饱和诱变的组合。将重链CDR1以及轻链CDR1和CDR3中的残基突变为丙氨酸，将其转染至HEK 293细
胞，并通过流式细胞术测定生成的条件培养物的LGR5抗原结合活性。对重链CDR3进行饱和
诱变，其中将CDR3的每个残基突变为19种天然存在的氨基酸中的每一种，除非该位置处原
来的氨基酸相同。将各种突变体转染至HEK 293细胞，并通过流式细胞术测定生成的条件培养物的LGR5抗原结合活性。
胞，并通过流式细胞术测定生成的条件培养物的LGR5抗原结合活性。对重链CDR3进行饱和
诱变，其中将CDR3的每个残基突变为19种天然存在的氨基酸中的每一种，除非该位置处原
来的氨基酸相同。将各种突变体转染至HEK 293细胞，并通过流式细胞术测定生成的条件培养物的LGR5抗原结合活性。
[0119] 以递增的数量将这些突变合并至3种构建体。然后将这3种构建体转染至HEK 293细胞，并通过流式细胞术测定生成的条件培养物的LGR5抗原结合活性。挑选了2种构建体
18G7H6A1和18G7H6A3用于进一步表征。表1A列出了抗体的某些序列。
18G7H6A1和18G7H6A3用于进一步表征。表1A列出了抗体的某些序列。
[0120] 表1A
[0121]
[0122]
[0123] 实施例3-制备人源化的LGR5抗体
[0124] 构建了用于18G7H6A1、18G7H6A3和嵌合体18G7.1(来自18G7.1的鼠源Fab融合至人IgG1Fc)的GS单基因载体(被称为18G7Ch)，扩增，并采用瞬时转染将其以200ml体积瞬时共
转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SV GS-KO)，以用于表达评估。然后开始大规模的瞬时转
染，CHOK1SV GS-KO细胞的终体积为5升，且18G7H6A1和18G7H6A3的终体积均为2.5升。使用一步法蛋白A色谱法对澄清的培养上清液进行纯化。利用包含作为对照样本的内部人抗体
的1mg/ml浓度的纯化材料，进行SE-HPLC、SDS-PAGE和内毒素测量形式的产品质量分析。结果显示高纯度的回收产品(>95.7％)。
转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SV GS-KO)，以用于表达评估。然后开始大规模的瞬时转
染，CHOK1SV GS-KO细胞的终体积为5升，且18G7H6A1和18G7H6A3的终体积均为2.5升。使用一步法蛋白A色谱法对澄清的培养上清液进行纯化。利用包含作为对照样本的内部人抗体
的1mg/ml浓度的纯化材料，进行SE-HPLC、SDS-PAGE和内毒素测量形式的产品质量分析。结果显示高纯度的回收产品(>95.7％)。
[0125] 实施例4-构建人源化LGR5抗体的细胞系
[0126] 通过利用表达载体p18G7H6A3/DGV转染CHOK1SV GS-KO宿主细胞，来产生表达18G7H6A3抗体的稳定GS-CHO转染子库。构建包含编码抗体的基因的DGV，进行转染，并通过采用FACS方法，对转染子库进行单细胞分选，随后产生了生成的克隆细胞系。针对存在的单集落，对克隆期间产生的96孔板进行一周一次筛选。在约2周后，采用 系统方法，针
对抗体的产生，对来自多达1000个集落的上清液进行筛选。在筛选的1000个集落中，991个产生了可检测水平的抗体。对Octet数据进行了分级，并挑选最高生产力的集落用于进一步处理。
对抗体的产生，对来自多达1000个集落的上清液进行筛选。在筛选的1000个集落中，991个产生了可检测水平的抗体。对Octet数据进行了分级，并挑选最高生产力的集落用于进一步处理。
[0127] 在96深孔板于CD CHO培养基中，对最高等级的集落进行悬浮培养，并随后使其适应继代培养基。使用尽可能模拟生物反应器过程的给料方案，进行所选择的细胞系的生产
力测定。在第12天收获培养物，并采用 系统方法测定抗体浓度。收获的抗体浓度范
围为<20mg/L至3000mg/L。基于在生产力筛选中的等级位置、该细胞系所来源的亲代库以及每个细胞系来源于单一集落的证据，挑选了20个细胞系用于进一步评估。通过连续继代培
养，将挑选的20个细胞系的培养物从96深孔板扩增至摇瓶。基于在“简化的(abridged)”分批补料(fed-batch)悬浮培养中生产力筛选的等级位置，以及在常规继代培养期间在摇瓶
培养物中具有可接受的生长特征(常规继代培养，每mL始终≥1x 106个活细胞)，在两个10L实验室规模的搅拌罐生物反应器中，挑选领头(lead)细胞系用于进行评估。该领头细胞系
在常规继代培养期间显示出一致的高生长和活力，且在收获时具有>2000mg/L的滴度。该细胞系被用于制备原始细胞库(Master Cell Bank,MCB)，并在10L实验室规模的生物反应器
中进行评估。
力测定。在第12天收获培养物，并采用 系统方法测定抗体浓度。收获的抗体浓度范
围为<20mg/L至3000mg/L。基于在生产力筛选中的等级位置、该细胞系所来源的亲代库以及每个细胞系来源于单一集落的证据，挑选了20个细胞系用于进一步评估。通过连续继代培
养，将挑选的20个细胞系的培养物从96深孔板扩增至摇瓶。基于在“简化的(abridged)”分批补料(fed-batch)悬浮培养中生产力筛选的等级位置，以及在常规继代培养期间在摇瓶
培养物中具有可接受的生长特征(常规继代培养，每mL始终≥1x 106个活细胞)，在两个10L实验室规模的搅拌罐生物反应器中，挑选领头(lead)细胞系用于进行评估。该领头细胞系
在常规继代培养期间显示出一致的高生长和活力，且在收获时具有>2000mg/L的滴度。该细胞系被用于制备原始细胞库(Master Cell Bank,MCB)，并在10L实验室规模的生物反应器
中进行评估。
[0128] 实施例5-人源化LGR5抗体结合人LGR5
[0129] 使用基于FACS的测定用来测量纯化的18G7H6A1和18G7H6A3与CHO细胞表面上过表达的重组人LGR5的结合。在4℃，利用18G7H6A1或18G7H6A3的连续稀释对CHO和CHO-LGR5细
胞进行染色，利用PE缀合的抗人IgG二抗检测表面染色，并在FACScalibur上进行分析。
18G7H6A1和18G7H6A3对人LGR5结合的EC50小于10nM。将抗体对照(MOPC)以及无LGR5的野生
型CHO用作本实验中的阴性对照。18G7H6A3显示不与野生型CHO结合，并且同种型对照未显
示与人LGR5的任何可测量结合。
胞进行染色，利用PE缀合的抗人IgG二抗检测表面染色，并在FACScalibur上进行分析。
18G7H6A1和18G7H6A3对人LGR5结合的EC50小于10nM。将抗体对照(MOPC)以及无LGR5的野生
型CHO用作本实验中的阴性对照。18G7H6A3显示不与野生型CHO结合，并且同种型对照未显
示与人LGR5的任何可测量结合。
[0130] 为了确定用于研究18G7H6A3的疗效和安全性的潜在动物模型物种，在一系列体外结合研究中，测定18G7H6A3与由同源物种表达的LGR5的交叉反应。参见图1，如所示，发现抗体18G7H6A3(BNC101)强烈结合人LGR5和食蟹猕猴LGR5，但不结合大鼠或小鼠LGR5。
[0131] 实施例6-人源化LGR5抗体与结合至板的重组体人LGR5胞外域的结合
[0132] 利用基于ELISA的平板结合测定，体外评估18G7H6A1和18G7H6A3与人LGR5的结合。该测定测量了抗体与结合至ELISA板的纯化重组体LGR5胞外域-IgG-Fc融合体的结合，通过
利用辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG-CH1二抗，检测结合LGR5的抗体。发现18G7H6A3对人
LGR5-Fc的EC50为300pM。
利用辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG-CH1二抗，检测结合LGR5的抗体。发现18G7H6A3对人
LGR5-Fc的EC50为300pM。
[0133] 实施例7-人源化LGR5抗体对肿瘤细胞的结合特征
[0134] 通过流式细胞术分析了18G7H6A3对表达不同水平LGR5的人癌症细胞系的结合特征，以确定18G7H6A3对异源肿瘤群的潜在靶向特征。通过流式细胞术对LGR5在多个肿瘤细
胞系中的表达水平进行定量。
胞系中的表达水平进行定量。
[0135] 这些研究中分析的人肿瘤细胞系包括结肠癌癌细胞系(CT1(Bionomics)、CT3(Bionomics)、DLD1(ATCC)、Ls174T(ATCC)、LoVo(ATCC)、SW48(ATCC)、SW480(ATCC)、SW620(ATCC)和HCT116(ATCC))；三阴性乳腺癌细胞系(Hs578T(ATCC)和MDA-MB-231(ATCC))；胰腺癌细胞系(AsPC-1(ATCC)、BxPC3(ATCC)、Capan2(ATCC)、HPAFII(ATCC)、SW1990(ATCC)、
CFPAC(ATCC)、Panc10.05(ATCC)和PANC-1(ATCC))；顺铂敏感的卵巢癌细胞系(OVCAR3
(ATCC)和SK-OV-3(ATCC))；顺铂耐受的卵巢癌细胞系(SK-OV-3/CP、OVCAR8/CP、Igrov1/CP和A2780/CP(TGEN))，以及肺腺癌细胞系HOP62(ATCC)。
CFPAC(ATCC)、Panc10.05(ATCC)和PANC-1(ATCC))；顺铂敏感的卵巢癌细胞系(OVCAR3
(ATCC)和SK-OV-3(ATCC))；顺铂耐受的卵巢癌细胞系(SK-OV-3/CP、OVCAR8/CP、Igrov1/CP和A2780/CP(TGEN))，以及肺腺癌细胞系HOP62(ATCC)。
[0136] 利用TrypLE细胞解离缓冲液(Life Technologies)消化(lift)生长至接近汇合的细胞、计数并以1x105个细胞/孔接种至96-孔V形底板中。18G7H6A3的测定起始浓度为
100nM，并于染色缓冲液(PBS/0.8％牛血清白蛋白)中进行连续稀释。样本在冰上孵育30分
钟，然后于4℃以1800rpm离心2分钟，并用染色缓冲液洗涤3次。将50μl以1:250稀释的二抗山羊抗人IgG-PE缀合物(Southern Biotech)加入至染色缓冲液的每个对应孔中。将样本在
冰上另外孵育15分钟，然后按上述进行洗涤，并重悬于100μl含有碘化丙啶(PI)的染色缓冲液(Life Technologies)，以排除死细胞。在FACScalibur流式细胞仪上，利用CellQuest
(Becton Dickinson)和FlowJo(TreeStar,Inc)软件分析样本。
100nM，并于染色缓冲液(PBS/0.8％牛血清白蛋白)中进行连续稀释。样本在冰上孵育30分
钟，然后于4℃以1800rpm离心2分钟，并用染色缓冲液洗涤3次。将50μl以1:250稀释的二抗山羊抗人IgG-PE缀合物(Southern Biotech)加入至染色缓冲液的每个对应孔中。将样本在
冰上另外孵育15分钟，然后按上述进行洗涤，并重悬于100μl含有碘化丙啶(PI)的染色缓冲液(Life Technologies)，以排除死细胞。在FACScalibur流式细胞仪上，利用CellQuest
(Becton Dickinson)和FlowJo(TreeStar,Inc)软件分析样本。
[0137] 通过流式细胞术对LGR5在多种肿瘤细胞系中的细胞表面表达水平进行了定量。CT1结直肠肿瘤细胞和胰腺癌细胞系Panc-1、Capan2和CFPAC属于最高LGR5表达。在胰腺癌
细胞系(AsPC-1、SW1990、HPAFII)、顺铂耐受性卵巢癌细胞系(OVCAR8/CP、A2780/CP和
Igrov1/CP)以及结肠癌、乳腺癌和卵巢癌细胞系(SW48、Hs578T和OVCAR3)中观察到中等表
达水平。结肠癌细胞系(SW480、LoVo)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)中观察到低但可检测水平的LGR5细胞表面表达。表2概述了18G7H6A3FACS与肿瘤细胞系结合的数据。
细胞系(AsPC-1、SW1990、HPAFII)、顺铂耐受性卵巢癌细胞系(OVCAR8/CP、A2780/CP和
Igrov1/CP)以及结肠癌、乳腺癌和卵巢癌细胞系(SW48、Hs578T和OVCAR3)中观察到中等表
达水平。结肠癌细胞系(SW480、LoVo)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)中观察到低但可检测水平的LGR5细胞表面表达。表2概述了18G7H6A3FACS与肿瘤细胞系结合的数据。
[0138] 表2
[0139]
[0140]
[0141] 实施例8-人源化抗LGR5抗体抑制体内恶性结直肠肿瘤生长
[0142] CT1原发性CRC异种移植模型来源于IV期转移性结肠癌患者。该肿瘤的DNA测序鉴定到常见的多种基因的结肠癌突变，包括K-Ras、PI3K、PTEN、p53和APC。在第0天，将在无血清条件下的培养基中保存的低传代CT1肿瘤球在人工基底膜(Matrigel)中经皮下注射至
SCID/Bg小鼠，并每周两次监测肿瘤大小和体重。在第25天，当肿瘤达到120mm3时，将CT1皮下肿瘤随机分入10只小鼠的组内。采用PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A1、18G7H6A3或人/小鼠嵌合体18G7Ch处理小鼠。以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，持续2.5周(总共5次剂量)。
SCID/Bg小鼠，并每周两次监测肿瘤大小和体重。在第25天，当肿瘤达到120mm3时，将CT1皮下肿瘤随机分入10只小鼠的组内。采用PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A1、18G7H6A3或人/小鼠嵌合体18G7Ch处理小鼠。以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，持续2.5周(总共5次剂量)。
[0143] 在4次剂量(15mg/kg，每周两次)过程期间，相比PBS和MOPC抗体对照，抗体18G7H6A3显示显著的体内抗肿瘤活性。虽然抗体18G7H6A1显示抗肿瘤活性，相比18G7H6A1
和亲代鼠源嵌合体18G7Ch抗体，单克隆18G7H6A3显示更优的活性。表3显示了1-4次剂量的
Lgr5+Ab后，CT1肿瘤体积减小的百分比(组相比MOPC)。
和亲代鼠源嵌合体18G7Ch抗体，单克隆18G7H6A3显示更优的活性。表3显示了1-4次剂量的
Lgr5+Ab后，CT1肿瘤体积减小的百分比(组相比MOPC)。
[0144] 表3
[0145]剂量#: 1 2 3 4
18G7Ch 9.2％ 30.6％ 19.5％ 29.0％
18G7H6A1 17.5％ 19.1％ 14.2％ 19.0％
18G7H6A3 38.8％ 42.0％ 28.9％ 35.4％
18G7Ch 9.2％ 30.6％ 19.5％ 29.0％
18G7H6A1 17.5％ 19.1％ 14.2％ 19.0％
18G7H6A3 38.8％ 42.0％ 28.9％ 35.4％
[0146] 实施例9-人源化抗LGR5抗体抑制体内结直肠肿瘤生长
[0147] CT3原发CRC异种移植模型来源于III期mCRC患者，在K-Ras、H-Ras、APC、PI3K、PTEN、STK11、RB1、TP53、FGFR2、VANGL2和ISCO具有突变。将低传代冷冻保存的CT3原发性异种移植体肿瘤片段植入5只SCID/Bg小鼠。在植入后第41天，从5只携带CT3原发性异种移植
体的SCID小鼠移出平均合并为～1150mm3的肿瘤，进行解离并在人工基底膜中经皮下重新
植入CB.17SCID小鼠，并每周两次监测肿瘤大小和体重。当肿瘤达到平均130mm3时，将小鼠随机分配(植入后34天)。以PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A3、18G7H6A1或人/小鼠嵌合体
18G7Ch处理小鼠。从第34天开始，以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，持续2.5周(5次剂量)。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及总体健康和外观，直至结束。
体的SCID小鼠移出平均合并为～1150mm3的肿瘤，进行解离并在人工基底膜中经皮下重新
植入CB.17SCID小鼠，并每周两次监测肿瘤大小和体重。当肿瘤达到平均130mm3时，将小鼠随机分配(植入后34天)。以PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A3、18G7H6A1或人/小鼠嵌合体
18G7Ch处理小鼠。从第34天开始，以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，持续2.5周(5次剂量)。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及总体健康和外观，直至结束。
[0148] 4次剂量(15mg/kg，每周两次)后，相比PBS和MOPC抗体对照，虽然抗体18G7H6A1显示抗肿瘤活性，但单克隆18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性。相比于亲代鼠源嵌合体18G7Ch
抗体，18G7H6A3显示更优的活性，且与18G7H6A1显示等同的活性。表4显示了n次剂量的测试Ab后，CT3肿瘤体积减小的百分比(组对比MOPC)。
抗体，18G7H6A3显示更优的活性，且与18G7H6A1显示等同的活性。表4显示了n次剂量的测试Ab后，CT3肿瘤体积减小的百分比(组对比MOPC)。
[0149] 表4
[0150]Ab剂量#： 1 2 3 4
18G7Ch 22.6％ 8.9％ 17.0％ 13.8％
18G7H6A1 18.3％ 12.6％ 28.8％ 28.7％
18G7H6A3 34.2％ 38.1％ 23.4％ 28.2％
18G7Ch 22.6％ 8.9％ 17.0％ 13.8％
18G7H6A1 18.3％ 12.6％ 28.8％ 28.7％
18G7H6A3 34.2％ 38.1％ 23.4％ 28.2％
[0151] 实施例10-人源化抗LGR5抗体与FOLFIRI组合抑制体内结直肠肿瘤生长
[0152] 将CSC条件下生长的CT3细胞植入CB.17SCID小鼠。在植入后第40天，当肿瘤达到～160mm3时，将小鼠随机分入处理组，所述处理组包括i)PBS，ii)FolFiri(5FU 30mg/kg、亚叶酸90mg/kg和伊立替康24mg/kg)，每5天给药，为期15天(总共3次剂量)；以及iii)FolFiri
(如ii中)与18G7H6A3(15mg/kg，每周两次)的组合。肿瘤体积分析表明，相比FolFiri方案，
18G7H6A3与FolFiri的组合减弱了CT3肿瘤生长。组合处理在第61、65、68、71和75天分别将肿瘤体积减少了约58％、53％、45％、33％和37％(图2)。
(如ii中)与18G7H6A3(15mg/kg，每周两次)的组合。肿瘤体积分析表明，相比FolFiri方案，
18G7H6A3与FolFiri的组合减弱了CT3肿瘤生长。组合处理在第61、65、68、71和75天分别将肿瘤体积减少了约58％、53％、45％、33％和37％(图2)。
[0153] 实施例11-人源化抗LGR5抗体抑制体内胰腺癌肿瘤的生长
[0154] 为了评估18G7H6A3作为单一试剂或与标准护理组合的功效，检测了胰腺癌异种移植模型。将AsPC-1细胞(在1:1比例的人工基底膜+RPMI中)植入CB17.SCID小鼠。在植入后第
20天，将肿瘤随机分为5组：i)PBS，ii)MOPC(15mg/kg，每周两次，ip)，iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)，iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)，和v)吉西他滨和18G7H6A3以上述剂量并行联合。
20天，将肿瘤随机分为5组：i)PBS，ii)MOPC(15mg/kg，每周两次，ip)，iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)，iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)，和v)吉西他滨和18G7H6A3以上述剂量并行联合。
[0155] 发现相比于盐水和/或对照IgG，单一试剂的18G7H6A3在植入后第41天抑制肿瘤生长多达近40％。另外，相比仅吉西他滨，18G7H6A3与吉西他滨的组合显著抑制AsPC-1模型中的肿瘤生长(在植入后第61天多达36％)。相比PBS和对照IgG，单一试剂的18G7H6A3直至第
65天才提供了肿瘤生长的一些抑制。
65天才提供了肿瘤生长的一些抑制。
[0156] 实施例12-人源化的抗LGR5抗体抑制体内三阴性乳腺癌肿瘤生长
[0157] 该体内研究使用低传代三阴性乳腺癌细胞(ER-、PR-、无HER2过表达)进行。将MDA-MB-231-LM3细胞培养于DMEM/10％FBS/抗-抗培养基的贴壁培养物中。在第0天，将于RPMI：人工基底膜(1:1)中的MDA-MB-231-LM3细胞注入CB.17SCID小鼠的第4乳腺脂肪垫，并每周
3
两次监测肿瘤大小和体重。在第27天，在肿瘤达到～155mm时，将MDA-MB-231-LM3肿瘤随机分为4组10只小鼠的组。以PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理小鼠。以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，为期3.5周(7次剂量)。发现相比于PBS(60.7％肿瘤生长抑制)或
MOPC抗体(49.3％肿瘤生长抑制)对照，抗体18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性(图3)。
3
两次监测肿瘤大小和体重。在第27天，在肿瘤达到～155mm时，将MDA-MB-231-LM3肿瘤随机分为4组10只小鼠的组。以PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理小鼠。以15mg/kg的剂量向小鼠给药，每周两次(BIW)，为期3.5周(7次剂量)。发现相比于PBS(60.7％肿瘤生长抑制)或
MOPC抗体(49.3％肿瘤生长抑制)对照，抗体18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性(图3)。
[0158] 实施例13-以SN38或PI3K/mTOR抑制剂处理的结直肠癌细胞中LGR5的表达抑制
[0159] 以PI3K/mTOR双抑制剂(NVP)或2种不同的细胞毒素剂，包括SN38(伊立替康的活性代谢物)或5FU(5氟尿嘧啶)，处理了一系列CRC细胞系(包括DLD1、HCT116、LS174t、LoVo、SW48、SW480和SW620)。以1um上述试剂处理细胞，并于72小时后收获。然后以缀合至Alexa Fluor647的抗LGR5Mab对细胞进行染色，并通过流式细胞术，采用FACScalibur分析数据。
[0160] CRC细胞系的流式细胞术分析显示，以PI3K/mTOR抑制剂处理时，LoVo、HCT116、LS174t、SW48、SW480和SW620细胞中LGR5的表达更高。另外，以SN38处理提高了HCT116、
LS174t、SW48、SW480，且特别是SW620细胞中LGR5的表达。然而，5FU处理不诱导这些细胞系中任一种的LGR5表达，这表明这些细胞系中存在独特的调控LGR5表达的潜在机制。这些数
据表明，LGR5+细胞更耐受上述试剂处理，因为处理大多靶向LGR5阴性非癌症干细胞群。为了理解这些试剂处理是否上调这些细胞的LGR5表达，我们通过流式细胞术分析了所有细胞
系中的LGR5细胞表面表达。以PI3K/mTOR抑制剂处理后，LoVo中LGR5表达显著上调。这些数据表明，以小分子抑制剂或细胞毒素剂处理靶向LGR5阴性细胞，并且造成这些细胞中LGR5
表达增加。
LS174t、SW48、SW480，且特别是SW620细胞中LGR5的表达。然而，5FU处理不诱导这些细胞系中任一种的LGR5表达，这表明这些细胞系中存在独特的调控LGR5表达的潜在机制。这些数
据表明，LGR5+细胞更耐受上述试剂处理，因为处理大多靶向LGR5阴性非癌症干细胞群。为了理解这些试剂处理是否上调这些细胞的LGR5表达，我们通过流式细胞术分析了所有细胞
系中的LGR5细胞表面表达。以PI3K/mTOR抑制剂处理后，LoVo中LGR5表达显著上调。这些数据表明，以小分子抑制剂或细胞毒素剂处理靶向LGR5阴性细胞，并且造成这些细胞中LGR5
表达增加。
[0161] 实施例14-以小分子抑制剂或细胞毒素剂处理的胰腺癌细胞系中LGR5表达被促进
[0162] 除了CRC细胞系，为了进一步扩宽上述发现，研究了以相关标准护理(包括纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、吉西他滨和紫杉酚)和靶向胰腺癌大多数相关
通路的小分子抑制剂(如PI3K、MEK和GSK3β的抑制剂)处理的一系列胰腺细胞系中LGR5的表达。检测的胰腺细胞系包括：AsPc1、HPAFII、PANC1、BxPC3、CFPAC、PANC10.05、Capan2和SW1990。如通过流式细胞术所评估，以纳米粒白蛋白结合型紫杉醇处理导致PANC1、BxPc3和PANC10.05中LGR5上调。吉西他滨处理上调PANC1的LGR5，而紫杉酚处理导致HPAFII中的
LGR5表达增加。PI3K/mTOR处理导致CFPAC中LGR5的上调，而MEK抑制剂上调HPAFII和SW1990中的LGR5。
通路的小分子抑制剂(如PI3K、MEK和GSK3β的抑制剂)处理的一系列胰腺细胞系中LGR5的表达。检测的胰腺细胞系包括：AsPc1、HPAFII、PANC1、BxPC3、CFPAC、PANC10.05、Capan2和SW1990。如通过流式细胞术所评估，以纳米粒白蛋白结合型紫杉醇处理导致PANC1、BxPc3和PANC10.05中LGR5上调。吉西他滨处理上调PANC1的LGR5，而紫杉酚处理导致HPAFII中的
LGR5表达增加。PI3K/mTOR处理导致CFPAC中LGR5的上调，而MEK抑制剂上调HPAFII和SW1990中的LGR5。
[0163] 实施例15-以FOLFIRI方案(5FU、亚叶酸和伊立替康)处理的结直肠癌肿瘤中LGR5被上调
[0164] 为了研究化疗是否改变结直肠肿瘤中的LGR5表达，每5天以5FU(30mg/kg，i.p)、亚叶酸(90mg/kg)和2种不同剂量的伊立替康(24mg/kg或8mg/kg)处理小鼠。这些研究的结果表明，虽然CT3肿瘤对所述化疗方案敏感，但CT1肿瘤未完全消退且显示对所述方案的一些
耐受性(图4)。为了检测FOLFIRI处理对LGR5表达的影响，从CT1和CT3患者来源的肿瘤提取
总mRNA，并通过qRT-PCR测定了LGR5的表达，并通过将来自对应GAPDH转录物的各样本中
LGR5的Ct值(循环阈值)减去以产生DCT(ΔCt)值进行分析。数据表示为2的DCT次方。LGR5丰度的分析表明，相比于对应的盐水处理的肿瘤，LGR5转录物在CT1(约2倍)和CT3肿瘤(约3.5倍)中增加。
耐受性(图4)。为了检测FOLFIRI处理对LGR5表达的影响，从CT1和CT3患者来源的肿瘤提取
总mRNA，并通过qRT-PCR测定了LGR5的表达，并通过将来自对应GAPDH转录物的各样本中
LGR5的Ct值(循环阈值)减去以产生DCT(ΔCt)值进行分析。数据表示为2的DCT次方。LGR5丰度的分析表明，相比于对应的盐水处理的肿瘤，LGR5转录物在CT1(约2倍)和CT3肿瘤(约3.5倍)中增加。
[0165] 实施例16-以仅吉西他滨和吉西他滨与纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇组合处理的胰腺癌肿瘤中LGR5被上调
[0166] 为了研究胰腺癌的标准护理化疗处理是否改变胰腺肿瘤中的LGR5表达，每周两次以吉西他滨和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇的组合(于JH109原发性异种移植体中)处理小
鼠。在终点分析时，利用肿瘤cDNA的qRT-PCR数据显示，相比于对应的盐水处理的肿瘤，化疗处理的肿瘤中的LGR5表达明显增加，表明以标准护理处理导致肿瘤细胞中LGR5上调。
鼠。在终点分析时，利用肿瘤cDNA的qRT-PCR数据显示，相比于对应的盐水处理的肿瘤，化疗处理的肿瘤中的LGR5表达明显增加，表明以标准护理处理导致肿瘤细胞中LGR5上调。
[0167] JH109模型中LGR5的表达，该模型为患者来源的胰腺肿瘤的异种移植模型。将在受体内连续传代但从未暴露于体外培养条件的肿瘤块植入小鼠。以化疗方案(吉西他滨和纳
米颗粒白蛋白结合型紫杉醇的组合)处理携带肿瘤的小鼠，导致肿瘤生长的显著抑制。与结肠癌模型一致，化疗导致JH109肿瘤中LGR5的上调(大于4倍)，进一步表明，化疗处理时癌症干细胞群富集。参见，例如图5。
米颗粒白蛋白结合型紫杉醇的组合)处理携带肿瘤的小鼠，导致肿瘤生长的显著抑制。与结肠癌模型一致，化疗导致JH109肿瘤中LGR5的上调(大于4倍)，进一步表明，化疗处理时癌症干细胞群富集。参见，例如图5。
[0168] 实施例17-人源化抗LGR5抗体抑制体内胰腺肿瘤生长
[0169] 还在胰腺癌异种移植模型中研究了18G7H6A3的功效。将PANC1细胞植入CB.17SCID小鼠(在1:1比例的人工基底膜+RPMI中皮下植入1E6/小鼠)，并在植入后第41天随机分为处
理组：i)PBS，ii)IgG对照(15mg/kg，每周两次，ip)，iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)，iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)，以及v)吉西他滨和18G7H6A3的并行联合(15mg/kg，每周两次，ip)。将吉西他滨在分配组中施用，持续3周，以抑制肿瘤生长。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及总体健康和外观。
理组：i)PBS，ii)IgG对照(15mg/kg，每周两次，ip)，iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)，iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)，以及v)吉西他滨和18G7H6A3的并行联合(15mg/kg，每周两次，ip)。将吉西他滨在分配组中施用，持续3周，以抑制肿瘤生长。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及总体健康和外观。
[0170] 肿瘤体积的分析表明，虽然单一试剂的18G7H6A3存在有利于抑制肿瘤生长的趋势(在植入后第70天多达30％)，但是相比仅吉西他滨的组，18G7H6A3和吉西他滨的组合显著
抑制PANC1肿瘤的生长(在植入后第80天多达52％)。参见图6。
抑制PANC1肿瘤的生长(在植入后第80天多达52％)。参见图6。
[0171] 在本实施例中，在与化疗(吉西他滨)组合给药时观察到的18G7H6A3的显著活性可以归因于靶标抗原LGR5响应吉西他滨处理而增加的表达。
[0172] 实施例18-人源化抗LGR5抗体抑制体内预处理的胰腺肿瘤生长
[0173] 除了细胞系，我们还在JH109原发性患者来源的胰腺癌异种移植模型中研究了18G7H6A3作为单一试剂或与标准护理组合的功效。JH109异种移植模型来自已接受4种治疗
方案(包括5-FU、吉西他滨、爱必妥(Erbitux)和放疗)的患者。原来的患者肿瘤已在免疫缺陷型小鼠中进行了连续传代，而未暴露至体外培养。为了检测JH109模型中18G7H6A3的功
效，以下述方案处理携带肿瘤的小鼠(n＝7)：对照IgG(15mg/kg，i.p，每周两次)、18G7H6A3(15mg/kg，i.p，每周两次)单一试剂、标准护理化疗(吉西他滨(50mg/kg，i.p，每周一次)和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(30mg/kg，i.v，每周一次)的组合)、化疗和对照IgG的组合，以及化疗和18G7H6A3的组合。虽然单一的18G7H6A3mAb不影响肿瘤生长，但相比于单独的化疗，18G7H6A3与纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨化疗的组合导致显著更大程度的
肿瘤抑制。相比单独的化疗，18G7H6A3和化疗组合导致77％的较大肿瘤生长抑制。以
18G7H7A3化疗组合处理的3只小鼠，其肿瘤完全消除(无可检测的肿瘤)。18G7H6A3化疗组合组甚至在中止处理后，继续抑制肿瘤生长，并且1只小鼠在中断化疗后三个月仍然没有任何可测量的肿瘤。在本实施例中，在与化疗(吉西他滨加纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇)组合
给药时观察到的18G7H6A3的显著活性可以归因于靶标抗原LGR5响应吉西他滨纳米颗粒白
蛋白结合型紫杉醇处理而增加的表达，并且证明了在化疗处理以消除原发肿瘤块之后，在
体内预防原发肿瘤再生长或复发。
方案(包括5-FU、吉西他滨、爱必妥(Erbitux)和放疗)的患者。原来的患者肿瘤已在免疫缺陷型小鼠中进行了连续传代，而未暴露至体外培养。为了检测JH109模型中18G7H6A3的功
效，以下述方案处理携带肿瘤的小鼠(n＝7)：对照IgG(15mg/kg，i.p，每周两次)、18G7H6A3(15mg/kg，i.p，每周两次)单一试剂、标准护理化疗(吉西他滨(50mg/kg，i.p，每周一次)和纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(30mg/kg，i.v，每周一次)的组合)、化疗和对照IgG的组合，以及化疗和18G7H6A3的组合。虽然单一的18G7H6A3mAb不影响肿瘤生长，但相比于单独的化疗，18G7H6A3与纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨化疗的组合导致显著更大程度的
肿瘤抑制。相比单独的化疗，18G7H6A3和化疗组合导致77％的较大肿瘤生长抑制。以
18G7H7A3化疗组合处理的3只小鼠，其肿瘤完全消除(无可检测的肿瘤)。18G7H6A3化疗组合组甚至在中止处理后，继续抑制肿瘤生长，并且1只小鼠在中断化疗后三个月仍然没有任何可测量的肿瘤。在本实施例中，在与化疗(吉西他滨加纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇)组合
给药时观察到的18G7H6A3的显著活性可以归因于靶标抗原LGR5响应吉西他滨纳米颗粒白
蛋白结合型紫杉醇处理而增加的表达，并且证明了在化疗处理以消除原发肿瘤块之后，在
体内预防原发肿瘤再生长或复发。
[0174] 实施例19-人源化LGR5抗体处理减少癌症干细胞群
[0175] 对于流式细胞术分析，以针对干细胞特异性标志物CD44和CD166的多种抗体，对来自5个单独肿瘤的细胞进行染色。将肿瘤解离，耗尽小鼠细胞，然后对活细胞计数。解离的细胞用于通过流式细胞术分析细胞表面干细胞标志物的表达。
[0176] 如通过CD166+/CD44+、LGR5+/CD166+或LGR5+/CD166+/CD44+亚群所确定的，癌症干细胞群存在减少了(图7)。
[0177] 实施例20-人源化的LGR5抗体处理降低了体内结肠癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率
[0178] 在结肠癌CT3模型中检测了18G7H6A3与FolFiri组合的效果(实施例10)。该原发性肿瘤功效研究的结果表明，相比仅FolFiri，18G7H6A3与3轮FOLFIRI方案的组合在降低肿瘤生长方面更为有效。为了确定所述18G7H6A3FOLFIRI组合方案是否还能有效降低癌症干细
胞(CSC)频率，将来自第78天的肿瘤收获，解离，合并并在有限稀释测定中以10、30、100个细胞/侧翼再次植入肿瘤初始CB17.Scid小鼠的新组群。然后每周两次监测小鼠的肿瘤生长，
并在无进一步处理的情况下允许肿瘤生长。
胞(CSC)频率，将来自第78天的肿瘤收获，解离，合并并在有限稀释测定中以10、30、100个细胞/侧翼再次植入肿瘤初始CB17.Scid小鼠的新组群。然后每周两次监测小鼠的肿瘤生长，
并在无进一步处理的情况下允许肿瘤生长。
[0179] 相比分离自以仅FOLFIRI处理的小鼠的细胞，分离自以抗LGR5抗体18G7H6A3与FOLFIRI组合处理的小鼠的细胞具有大幅降低的致肿瘤性(图8)。另外，相比仅FOLFIRI，来自18G7H6A3FOLFIRI组合的再植入的细胞具有明显更慢的肿瘤生长特征和延迟的进展时间
(图9)。最后，通过因素6的线性回归分析，在第40天，18G7H6A3的处理降低了癌症干细胞的频率(18G7H6A3/FOLFIRI的1/856.3对比FOLFIRI的1/138.6)。这些数据表明，18G7H6A3与
FOLFIRI组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。对于30个细胞/动物的数据而言，第68天
为最后一天。数据具有显著性，p＝0.0039。
(图9)。最后，通过因素6的线性回归分析，在第40天，18G7H6A3的处理降低了癌症干细胞的频率(18G7H6A3/FOLFIRI的1/856.3对比FOLFIRI的1/138.6)。这些数据表明，18G7H6A3与
FOLFIRI组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。对于30个细胞/动物的数据而言，第68天
为最后一天。数据具有显著性，p＝0.0039。
[0180] 实施例21-人源化LGR5抗体的处理降低体内胰腺癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率
[0181] 在胰腺癌PANC1模型中检测了18G7H6A3与吉西他滨组合的效果。该研究表明，相比仅吉西他滨，18G7H6A3与吉西他滨组合显著抑制PANC1模型中的肿瘤生长。将来自这些处理组的肿瘤细胞收获、解离、合并并在有限稀释测定(500、1500、4500或13500个细胞/动物)中，再次植入CB.17SCID小鼠的新组群，并在无处理的情况下允许生长。
[0182] 在有限稀释测定的再植入中，相比于分离自以仅吉西他滨处理的小鼠的细胞，分离自以抗LGR5抗体18G7H6A3于吉西他滨组合处理的小鼠的细胞具有大幅降低的致肿瘤性。
以吉西他滨与18G7H6A3组合处理的再植入PANC1肿瘤，在植入4500个细胞的小鼠(吉西他滨
40％对比组合的20％)以及在植入13500个细胞的小鼠(吉西他滨100％对比组合的70％)
中，显示出移植频率的降低。使用线性回归，在相比于组合组的吉西他滨中，吉西他滨植入肿瘤中的癌症干细胞的频率更高为约1.5倍(14883分之1对比21336分之1)。这些数据表明，
18G7H6A3与吉西他滨组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。
以吉西他滨与18G7H6A3组合处理的再植入PANC1肿瘤，在植入4500个细胞的小鼠(吉西他滨
40％对比组合的20％)以及在植入13500个细胞的小鼠(吉西他滨100％对比组合的70％)
中，显示出移植频率的降低。使用线性回归，在相比于组合组的吉西他滨中，吉西他滨植入肿瘤中的癌症干细胞的频率更高为约1.5倍(14883分之1对比21336分之1)。这些数据表明，
18G7H6A3与吉西他滨组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。
[0183] 除了PANC1肿瘤，我们还在有限稀释实验(采用500、1500、4500和13500个细胞)中分析了在吉西他滨作为单一试剂或与18G7H6A3组合处理的携带AsPC-1肿瘤的小鼠中的移
植百分比和癌症干细胞频率。处理后第40天的肿瘤体积测量显示，在植入4500个或13500个细胞的小鼠中，在吉西他滨相比组合的组中，携带肿瘤的小鼠的百分比降低(40％和80％分别相比30％和50％)。在相比组合的组的吉西他滨中，癌症干细胞的频率也较大，大于1.5
倍，进一步表明18G7H6A3与吉西他滨的组合靶向胰腺癌的癌症干细胞群。
植百分比和癌症干细胞频率。处理后第40天的肿瘤体积测量显示，在植入4500个或13500个细胞的小鼠中，在吉西他滨相比组合的组中，携带肿瘤的小鼠的百分比降低(40％和80％分别相比30％和50％)。在相比组合的组的吉西他滨中，癌症干细胞的频率也较大，大于1.5
倍，进一步表明18G7H6A3与吉西他滨的组合靶向胰腺癌的癌症干细胞群。
[0184] 实施例22-人源化LGR5抗体的处理降低体内三阴性乳腺癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率
[0185] 在三阴性乳腺癌MDA-MB-231-LM3模型(实施例12)中检测了18G7H6A3与紫杉醇组合的效果。该研究表明，相比仅紫杉醇，18G7H6A3与紫杉醇组合对肿瘤生长具有最低的附加抑制。将这些肿瘤收获、解离、合并并在有限稀释测定中以10、30、100个细胞/侧翼再次植入CB.17SCID小鼠的新组群，并在无处理的情况下允许生长。
[0186] 相比分离自以仅紫杉醇处理的小鼠的细胞，分离自以抗LGR5抗体18G7H6A3与紫杉醇组合处理的小鼠的细胞具有大幅降低的致肿瘤性。另外，相比仅紫杉醇，来自18G7H6A3加紫杉醇肿瘤的再植入细胞具有明显更慢的肿瘤生长特征并延迟进展时间。最后，通过线性
回归分析，18G7H6A3加紫杉醇处理降低了癌症干细胞的频率。这些数据表明，18G7H6A3与紫杉醇组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。
回归分析，18G7H6A3加紫杉醇处理降低了癌症干细胞的频率。这些数据表明，18G7H6A3与紫杉醇组合有效靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。
[0187] 实施例23-以人源化抗LGR5抗体和化疗进行的预防性处理抑制体内转移性结直肠癌生长
[0188] 使用来源于结直肠癌患者的肝转移(met)的低传代结直肠癌细胞(BMCRC086)进行体内研究。在第0天，将BMCRC086细胞解冻，悬浮于RPMI：人工基底膜(1:1)中，并皮下注入CB.17SCID小鼠的后侧。每周两次监测动物的肿瘤大小和体重。在第7天，以PBS、18G7H6A3、FOLFIRI或FOLFIRI与18G7H6A3组合处理小鼠。以15mg/kg剂量的PBS和18G7H6A3向小鼠给
药，每周两次(BIW)，为期7.5周(16次剂量)。以FOLFIRI(在第7天、第12天、第17天、第22天、第27天和第32天，30mg/kg氟尿嘧啶和90mg/kg亚叶酸；在第8天、第13天、第18天、第23天、第
28天和第33天，24mg/kg伊立替康)向小鼠给药，为期4周(6次剂量)。相比仅FOLFIRI，
18G7H6A3与FOLFIRI的组合显示显著的抗肿瘤活性(图10)。
药，每周两次(BIW)，为期7.5周(16次剂量)。以FOLFIRI(在第7天、第12天、第17天、第22天、第27天和第32天，30mg/kg氟尿嘧啶和90mg/kg亚叶酸；在第8天、第13天、第18天、第23天、第
28天和第33天，24mg/kg伊立替康)向小鼠给药，为期4周(6次剂量)。相比仅FOLFIRI，
18G7H6A3与FOLFIRI的组合显示显著的抗肿瘤活性(图10)。
[0189] 实施例24-人源化LGR5抗体的处理抑制Wnt信号传导通路
[0190] 在体内肿瘤功效研究中，通过蛋白印迹分析对来自结肠癌CT1(实施例8)和CT3(实施例9)的18G7H6A3处理的肿瘤进行表征。在处死后从每只处理的小鼠(每组n＝5-10只小
鼠)切除肿瘤样本，立即在液氮冷却的研钵中冷冻，研杵碾碎(深冷粉碎)，在液氮中快速冷冻并储存于-80℃直至使用。利用冰冷的裂解缓冲液(包含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的还原
RIPA缓冲液)将深冷粉碎的肿瘤裂解30分钟，偶尔涡旋数次。将包含肿瘤裂解蛋白的上清液在SDS-PAGE凝胶上运行，然后进行针对多种Wnt-信号蛋白(及其磷酸化形式)的蛋白印迹。
在CT1和CT3肿瘤的蛋白印迹中，观察到处理组之间大量显著差异。在图11中，磷酸化-
Thr41/Ser45-β-连环蛋白(Wnt信号蛋白)是无效的标志物，且随后被降解形成蛋白，其证明
18G7H6A3能够体内抑制肿瘤细胞中的LGR5信号传导。
鼠)切除肿瘤样本，立即在液氮冷却的研钵中冷冻，研杵碾碎(深冷粉碎)，在液氮中快速冷冻并储存于-80℃直至使用。利用冰冷的裂解缓冲液(包含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的还原
RIPA缓冲液)将深冷粉碎的肿瘤裂解30分钟，偶尔涡旋数次。将包含肿瘤裂解蛋白的上清液在SDS-PAGE凝胶上运行，然后进行针对多种Wnt-信号蛋白(及其磷酸化形式)的蛋白印迹。
在CT1和CT3肿瘤的蛋白印迹中，观察到处理组之间大量显著差异。在图11中，磷酸化-
Thr41/Ser45-β-连环蛋白(Wnt信号蛋白)是无效的标志物，且随后被降解形成蛋白，其证明
18G7H6A3能够体内抑制肿瘤细胞中的LGR5信号传导。
[0191] 实施例25-人源化LGR5抗体处理不会抑制体外Wnt-信号传导通路
[0192] 以含有TCF-LEF报告子载体的慢病毒(GFP Cignal,QIAGEN)转导亲代HEK-293T细胞和稳定表达LGR5的HEK-293T细胞，并挑选稳定表达的报告子。以25,000个/孔在96孔板中接种亲代系和表达LGR5的稳定报告子系，贴壁过夜，进行血清饥饿，并以抗体或媒介物处理
6小时，然后以重组人Wnt3a(3nM)和重组人R-脊椎蛋白(R-spondin)处理18小时。基于不同
R-脊椎蛋白在活化TCF/LEF报告子细胞系中的活性分析，检测每种R-脊椎蛋白1-3的两种浓
度以及一种浓度的R-spo4(100pM、300pM、1nM、3nM或10nM)。在酶标仪上测量报告子驱动的GFP信号。对于测试的R-脊椎蛋白，显示的所有实验是来自三个独立实验(各实验以一式两
份进行)的汇总数据(数据为平均值+SD)。
6小时，然后以重组人Wnt3a(3nM)和重组人R-脊椎蛋白(R-spondin)处理18小时。基于不同
R-脊椎蛋白在活化TCF/LEF报告子细胞系中的活性分析，检测每种R-脊椎蛋白1-3的两种浓
度以及一种浓度的R-spo4(100pM、300pM、1nM、3nM或10nM)。在酶标仪上测量报告子驱动的GFP信号。对于测试的R-脊椎蛋白，显示的所有实验是来自三个独立实验(各实验以一式两
份进行)的汇总数据(数据为平均值+SD)。
[0193] 如图12中所示，增加浓度的可溶性18G7H6A3，通过与Wnt3a加RSPO1、RSPO2或RSPO3的组合，不影响TCF/LEF启动子驱动的GFP表达的诱导。还显示了阳性对照抗体76C12，显示其在RSPO和Wnt存在下，通过LGR4和LGR5抑制信号传导活性的诱导。该数据证明，抗LGR5抗体18G7H6A3不会阻断RSPO驱动的TCF/LEF启动子的激活。
[0194] 实施例26-人源化的LGR5抗体通过ADCC(抗体依赖性细胞毒性)机制靶向肿瘤细胞
[0195] 使CHO-LGR5细胞培养至汇合，并向下旋转，重悬于PBS中并计数。将等份的细胞(约10万个)加入至另一个含有100μM预热(37℃)CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)的管，并将混合物在细胞培养箱中孵育15分钟。最终的CFSE浓度为约1μM。接下来，将细胞洗涤并重悬于预热的培养基，并放入培养箱中再孵育30分钟，然后用PBS洗涤。然后以18G7H6A3(100μM)对染色细胞进行染色。为了确保抗体与CHO-LGR5细胞结合，在一些研究中，还以缀合第二山羊抗人PE的抗体对等份的细胞进行染色，并在实验室的calibur仪器上进行分析。在实验室的避光位置且在室温下，用DDAO-SE(DDAO琥珀酰亚胺酯；2μM染料用于10万个细胞，)将U937细胞染色15分钟。然后将细胞与1ml的FBS(胎牛血清)随后在避光位置孵育5分钟。接下来，用补充有FBS(10％)的PBS洗涤细胞，并重悬于补充有FBS(2.5％)的RPMI中。将CHO-LGR5-
18G7H6A3和U937-DDAO-SE标记的细胞均在细胞培养箱中共孵育5小时，并在实验室的
calibur仪器上进行分析。作为阴性对照，还将等份的CHO-LGR5-CFSE细胞(无18G7H6A3染
色)与U937共孵育，并在calibur仪器上进行分析。
18G7H6A3和U937-DDAO-SE标记的细胞均在细胞培养箱中共孵育5小时，并在实验室的
calibur仪器上进行分析。作为阴性对照，还将等份的CHO-LGR5-CFSE细胞(无18G7H6A3染
色)与U937共孵育，并在calibur仪器上进行分析。
[0196] 流式细胞术数据的分析表明，以CFSE和18G7H6A3染色的大多数CHO-LGR5细胞为活细胞，并且可以在calibur仪器上检测到。另外，U937(U937(人单核细胞细胞系；效应子细胞)和CHO-LGR5细胞在染色时均可以检测到，并单独地获得。最后，U937-DDAO-SE和CHO-
LGR5-CFSE-18G7H6A3的共孵育鉴定到了双阳性细胞群，然而，U937和缺少18G7H6A3的CHO-
LGR5-CFSE的共孵育没有产生双阳性群。双阳性群的存在指示U937(其表达FcR)与CHO-
LGR5-18G7H6A3(其表达Fc部分)的交叉结合，并进一步暗示ADCC是18G7H6A3的抗肿瘤活性
的机制之一。
LGR5-CFSE-18G7H6A3的共孵育鉴定到了双阳性细胞群，然而，U937和缺少18G7H6A3的CHO-
LGR5-CFSE的共孵育没有产生双阳性群。双阳性群的存在指示U937(其表达FcR)与CHO-
LGR5-18G7H6A3(其表达Fc部分)的交叉结合，并进一步暗示ADCC是18G7H6A3的抗肿瘤活性
的机制之一。
[0197] 实施例27-人源化LGR5抗体内化LGR5
[0198] 在过表达LGR5的CHO细胞上检测18G7H6A3的内化。以100nM抗体将细胞于4℃染色30分钟至2小时，洗掉过量的抗体，并将染色的细胞在4℃或37℃孵育。在不同的时间点以缀合有AlexaFluor488的二抗对细胞进行染色，来监测细胞表面结合抗体的内化。37℃孵育
时，内化率具有6.703±1.282分钟表面定位的测量t1/2值。在4℃孵育，内化被大量阻断，尽管观察到表面结合抗体的一些减少。
时，内化率具有6.703±1.282分钟表面定位的测量t1/2值。在4℃孵育，内化被大量阻断，尽管观察到表面结合抗体的一些减少。
[0199] 实施例28-人源化LGR5抗体不会竞争性阻断可溶性RSPO与LGR5的结合
[0200] 使用竞争性ELISA方式，检测了人R-脊椎蛋白1/2/3/4蛋白存在下生物素-18G7H6A3与hLGR5-Fc的相互作用。将LGR5-Fc以2μg/mL包被于96-孔高结合ELISA板上，并在
4℃孵育过夜。以PBS+1％BSA将板封闭。将生物素-18G7H6A3于结合缓冲液中稀释至1μg/mL。
从先前的LGR5-Fc与生物素-18G7H6A3之间的直接结合ELISA选择浓度，以产生高于EC50浓
度的强信号。将竞争子蛋白以不同浓度与生物素-18G7H6A3同时添加至ELISA板。将链霉亲
和素-HRP(R&D Systems，cat#890803)的1:1,000稀释液用于检测。以TMB(Thermo)使板显
影，并在SpectraMax Plus 384酶标仪于450nm处收集数据。使用GraphPad Prism 6程序进
行数据分析。将ELISA重复3次，其中对生物素-mAb和竞争子浓度进行了一些修改。
4℃孵育过夜。以PBS+1％BSA将板封闭。将生物素-18G7H6A3于结合缓冲液中稀释至1μg/mL。
从先前的LGR5-Fc与生物素-18G7H6A3之间的直接结合ELISA选择浓度，以产生高于EC50浓
度的强信号。将竞争子蛋白以不同浓度与生物素-18G7H6A3同时添加至ELISA板。将链霉亲
和素-HRP(R&D Systems，cat#890803)的1:1,000稀释液用于检测。以TMB(Thermo)使板显
影，并在SpectraMax Plus 384酶标仪于450nm处收集数据。使用GraphPad Prism 6程序进
行数据分析。将ELISA重复3次，其中对生物素-mAb和竞争子浓度进行了一些修改。
[0201] 作为阳性对照，LGR5-Fc在板上与生物素-18G7H6A3和hLGR5-Fc的结合相竞争。检测了R-脊椎蛋白1/2/3/4阻断生物素-18G7H6A3与包被于板上的LGR5-Fc结合的能力。所述
蛋白购自R&D Systems，并且为表达于哺乳动物细胞中的全长构建体。在最高浓度的R-脊椎蛋白处，未观察到抗体与LGR5结合的完全阻断(图13)。
蛋白购自R&D Systems，并且为表达于哺乳动物细胞中的全长构建体。在最高浓度的R-脊椎蛋白处，未观察到抗体与LGR5结合的完全阻断(图13)。
[0202] 实施例29-人源化LGR5抗体不会竞争性阻断可溶性RSPO与LGR5的结合
[0203] 单独配体(RSPO或Norrin)与LGR5的结合不足以诱导LGR5信号传导。相反，LGR5与多种共受体形成三元复合物来驱动信号传导。为了检测18G7H6A3对LGR5三元复合物形成的
影响，使用ELISA方式检测了R-脊椎蛋白1/2/3/4和Norrin存在下LGR5与RNF43、ZNRF3和
LRP6的结合。将RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc以4μg/mL(于1x PBS中)包被于96孔高结合板上。将板在4℃下孵育过夜并用PBS+1％BSA封闭。全部在1μg/mL的R-脊椎蛋白1/2/3/4或0.5μg/mL的Norrin存在或缺少下，将LGR5-Fc于第一缓冲液中稀释至1μg/mL。在加入至ELISA板之前，将R-脊椎蛋白1/2/3/4或Norrin与hLGR5-Fc一起预孵育。每个条件采用三个重复的
孔，检测三个重复。使用1:2,000的抗FLAG mAb(Cell Signaling)检测结合的hLGR5-Fc。将
1:10,000稀释的抗小鼠IgG HRP(JIR)用于检测。以TMB(Thermo)使板显影，并在SpectraMax Plus 384酶标仪上于450nm处收集数据。使用GraphPad Prism 6程序进行数据分析。观察到与LGR5、配体RSPO或Norrin，以及共受体(RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc)形成的三元复合物。
影响，使用ELISA方式检测了R-脊椎蛋白1/2/3/4和Norrin存在下LGR5与RNF43、ZNRF3和
LRP6的结合。将RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc以4μg/mL(于1x PBS中)包被于96孔高结合板上。将板在4℃下孵育过夜并用PBS+1％BSA封闭。全部在1μg/mL的R-脊椎蛋白1/2/3/4或0.5μg/mL的Norrin存在或缺少下，将LGR5-Fc于第一缓冲液中稀释至1μg/mL。在加入至ELISA板之前，将R-脊椎蛋白1/2/3/4或Norrin与hLGR5-Fc一起预孵育。每个条件采用三个重复的
孔，检测三个重复。使用1:2,000的抗FLAG mAb(Cell Signaling)检测结合的hLGR5-Fc。将
1:10,000稀释的抗小鼠IgG HRP(JIR)用于检测。以TMB(Thermo)使板显影，并在SpectraMax Plus 384酶标仪上于450nm处收集数据。使用GraphPad Prism 6程序进行数据分析。观察到与LGR5、配体RSPO或Norrin，以及共受体(RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc)形成的三元复合物。
[0204] 接下来，在LGR5-Fc和RSPO或Norrin存在下，还另外向ELISA板中加入了18G7H6A3。18G7H6A3显著减少了用RSPO和Norrin配体二者以及所有三种共受体(RNF43、ZNRF3和LRP6)
形成的LGR5三元复合物。参见图14。由于18G7H6A3不直接或竞争性地与配体结合相竞争，该数据是抑制作用变构模型的证据。
形成的LGR5三元复合物。参见图14。由于18G7H6A3不直接或竞争性地与配体结合相竞争，该数据是抑制作用变构模型的证据。
[0205] 实施例30-抗LGR5抗体18G7H6A3的表位定位
[0206] 为了进一步表征抗体18G7H6A3结合的LGR5的特异性区域，使用氢氘交换质谱分析进行了表位定位实验。在进行氢-氘交换实验前，将在不同浓度盐酸胍(GdnHCl)中用未氘化的缓冲液制备的测试消化物用来优化得到单独LGR5的最佳肽覆盖的蛋白酶解条件。对于
DXMS的胃蛋白酶消化，将样本在5℃解冻，然后立即在填充有猪胃蛋白酶(Sigma)的蛋白酶
柱上消化，采用100μl/min的流速和0.05％三氟乙酸。在C18收集柱上收集消化的片段，并在C18反相柱(Vydac)上分离，采用6％-38％的线性乙腈梯度。将柱的洗脱液直接电喷雾进LCQ Classic质谱仪(Thermo Finnigan,Inc.)或Q-TOF质谱仪(Micromass)。通过使用SEQUEST
(Thermo Finnigan,Inc.)，帮助从MS/MS数据集确定胃蛋白酶产生的肽。然后通过DXMS
Explorer(Sierra Analytics Inc.,Modesto,CA)进一步验证该肽的集合。比较不同浓度
GdnHCl的肽覆盖图，并将每个单独蛋白或蛋白复合物的最佳覆盖图的条件用于随后的氘交
换试验。如前所述，所有步骤均在0℃下进行。
DXMS的胃蛋白酶消化，将样本在5℃解冻，然后立即在填充有猪胃蛋白酶(Sigma)的蛋白酶
柱上消化，采用100μl/min的流速和0.05％三氟乙酸。在C18收集柱上收集消化的片段，并在C18反相柱(Vydac)上分离，采用6％-38％的线性乙腈梯度。将柱的洗脱液直接电喷雾进LCQ Classic质谱仪(Thermo Finnigan,Inc.)或Q-TOF质谱仪(Micromass)。通过使用SEQUEST
(Thermo Finnigan,Inc.)，帮助从MS/MS数据集确定胃蛋白酶产生的肽。然后通过DXMS
Explorer(Sierra Analytics Inc.,Modesto,CA)进一步验证该肽的集合。比较不同浓度
GdnHCl的肽覆盖图，并将每个单独蛋白或蛋白复合物的最佳覆盖图的条件用于随后的氘交
换试验。如前所述，所有步骤均在0℃下进行。
[0207] 通过将蛋白缓冲液中的LGR5-Fc或者以18G7H6A3预孵育的LGR5-Fc，与D2O缓冲液混合至50％D2O终浓度来开始交换实验。将混合物在0℃孵育10、30、100、300、1,000、3,000或10,000秒，然后通过加入冰冷淬灭溶液(0.96％甲酸、0～0.8M盐酸胍)将交换反应淬灭，使得样本具有0.58％终浓度的甲酸和0～0.5M终浓度的盐酸胍，pH2.5。然后将样本立即在
干冰上冷冻，并储存于-80℃。如前所述，DXMS实验的数据处理利用专业软件(DXMS
Explorer，Sierra Analytics Inc.)。
干冰上冷冻，并储存于-80℃。如前所述，DXMS实验的数据处理利用专业软件(DXMS
Explorer，Sierra Analytics Inc.)。
[0208] 由于18G7H6A3的结合以及当抗体与抗原结合时封埋了表面暴露的残基，氢/氘(H/D)-交换数据提供了关于在溶剂暴露中变化的细节。HD交换数据分析表明，18G7H6A3在R-脊椎蛋白结合位点表面对面上，与富亮氨酸重复6-9凸面内的SEQ ID NO:47的氨基酸T175、
E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260结合，如通过X射线结晶研究所确定的(参见，例如，Chen等人Gene Dev.27(12):1345-50，其通过引用整体并入本文)。这些数据表明，LGR5与R-脊椎蛋白结合所涉及的残基不涉及结合18G7H6A3。这些初步的结果并不能排除这样的事实：LGR5中的其他结构元件可能涉及18G7H6A3的结合位
点。
E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260结合，如通过X射线结晶研究所确定的(参见，例如，Chen等人Gene Dev.27(12):1345-50，其通过引用整体并入本文)。这些数据表明，LGR5与R-脊椎蛋白结合所涉及的残基不涉及结合18G7H6A3。这些初步的结果并不能排除这样的事实：LGR5中的其他结构元件可能涉及18G7H6A3的结合位
点。
[0209] 实施例31-向患有结肠癌的人类患者施用18G7H6A3
[0210] 以化疗来治疗患有结肠癌的人类患者群体，并监测肿瘤体积。观察到，在开始化疗时，平均肿瘤体积停止增加且事实上减小。在较长的持续时间段后，肿瘤体积稳定并最终开始增大。
[0211] 以化疗和18G7H6A3共同给药治疗患有结肠癌的人类患者第二群体。再次监测平均肿瘤体积。观察到，在开始化疗时肿瘤体积停止增加，且事实上减小。观察到肿瘤体积减小至比第一群体的体积小得多的最小体积。还发现相对于第一群体，肿瘤体积在相当长的一
段时期内保持低水平。
段时期内保持低水平。
[0212] 实施例32-向患有结肠癌的人类患者施用18G7H6A3
[0213] 对患有结肠癌的人类患者的第一群体仅施用化疗。对患有结肠癌的人类患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的组合。
[0214] 第一群体显示肿瘤大小和生长的暂时减少，其后肿瘤生长继续且症状恢复。化疗治疗后肿瘤生长耐受随后的化疗治疗。
[0215] 第二群体显示肿瘤大小减少至基线水平，且肿瘤生长停止。在治疗方案期间和完成治疗方案后，肿瘤生长未重新开始。在完成治疗方案后，第二群体中生长未恢复，且癌症症状不再存在。
[0216] 实施例33-向患有结肠癌的人类患者施用18G7H6A3增加了存活
[0217] 对患有结肠癌的人类患者的第一群体仅施用化疗。对患有结肠癌的人类患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的组合。
[0218] 监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大大高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体活过治疗之后第一年。
[0219] 在后来的间隔时进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。
[0220] 实施例34-向患有乳腺癌的人类患者施用18G7H6A3
[0221] 以化疗来治疗患有乳腺癌的人类患者群体，并监测肿瘤体积。观察到在开始化疗时平均肿瘤体积停止增加，且事实上减小。在延长的时间段之后，肿瘤体积稳定并最终开始增加。
[0222] 采用化疗与18G7H6A3共同给药治疗患有乳腺癌的人类患者的第二群体。再次监测平均肿瘤体积。观察到当开始化疗时，肿瘤体积停止增加，且事实上减小。观察到肿瘤体积减小至相比第一群体大幅减小的最小体积。还发现相对于第一群体，肿瘤大小在相当长的
一段时间内保持低水平。
一段时间内保持低水平。
[0223] 实施例35-向患有乳腺癌的人类患者施用18G7H6A3
[0224] 对患有乳腺癌的人类患者的第一群体仅施用化疗。对患有乳腺癌的人类患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的组合。
[0225] 第一群体显示肿瘤大小和生长的暂时减少，其后肿瘤生长重新开始且症状恢复。化疗治疗后的肿瘤生长耐受随后的化疗治疗。
[0226] 第二群体显示肿瘤大小减小至基线水平且肿瘤生长停止。在治疗方案期间和完成治疗方案时，肿瘤生长未重新开始。在完成方案后，在第二群体中生长未恢复且癌症症状不再存在。
[0227] 实施例36-向患有乳腺癌的人类患者施用18G7H6A3增加存活
[0228] 对患有乳腺癌的人类患者的第一群体仅施用化疗。对患有乳腺癌的人类患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的组合。
[0229] 监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大幅高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体存活过治疗之后第一年。
[0230] 在后面的间隔进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。
[0231] 实施例37-向患有结肠癌的人类患者施用18G7H6A3降低了副作用
[0232] 对患有结肠癌的人类患者的第一群体施用化疗和阻断LGR5-RSPO结合和信号传导的抗LGR5抗体。对患有结肠癌的人类患者的第二群体施用化疗和18G7H6A3。
[0233] 第一群体显示出与干扰通过LGR5的RSPO1信号转导相关的非治疗副作用。这些副作用不利于患者健康。
[0234] 施用18G7H6A3与化疗的组合的第二群体没有显示出与干扰通过LGR5的RSPO1信号转导相关的非治疗副作用。
[0235] 实施例38-晚期CRC肿瘤中LGR5的表达。
[0236] 使用RNAscope技术，利用LGR5特异性探针研究了LGR5转录物的表达。在包括结肠、肠、小脑和胰腺的组织中可检测到LGR5转录物。在包括CT1CRC和JH109胰腺肿瘤的患者来源的异种移植(PDX)组织中也可检测到LGR5转录物。在肿瘤发生的不同阶段(包括早期(I级)与晚期(转移性)损伤)分离的CRC患者样本中研究了LGR5的表达。LGR5转录物在CRC I级、II级和II级损伤中有表达，且在CRC转移性损伤中高度表达。
[0237] 实施例39-转移性胰腺患者来源的异种移植体中LGR5的表达
[0238] 采用定量聚合酶链式反应(QPCR)研究了转移性胰腺患者来源的异种移植体中的LGR5表达。将肿瘤组织样本快速冷冻，或者加入含有RNAlater的冷冻管(Qiagen,CA)中，并在4℃孵育数小时后转移至-70℃。使用Qiagen RNeasy提取试剂盒(Qiagen,CA)提取总RNA，并使用SuperScriptIII试剂盒(Life Technologies,CA)及厂商提供的方案合成cDNA。在
StepOne热循环仪(Life Technologies,CA)中，使用人特异性LGR5和GAPDH引物以及下述热
条件测量人LGR5转录物丰度：50℃(2分钟)；90℃(2分钟)，以及40个循环的90℃(15秒)和60℃(1分钟)，以及熔解曲线评估(65℃-95℃)。使用2^δCt方程式定量LGR5丰度。
StepOne热循环仪(Life Technologies,CA)中，使用人特异性LGR5和GAPDH引物以及下述热
条件测量人LGR5转录物丰度：50℃(2分钟)；90℃(2分钟)，以及40个循环的90℃(15秒)和60℃(1分钟)，以及熔解曲线评估(65℃-95℃)。使用2^δCt方程式定量LGR5丰度。
[0239] LGR5在转移性胰腺患者来源的异种移植体中高度表达。化疗治疗导致胰腺肿瘤中LGR5表达增加。使用人特异性引物，可使用QPCR测量一系列胰腺患者来源的异种移植物的
LGR5转录物。虽然在大多数肿瘤中可检测到LGR5，在转移性肿瘤中存在增加的LGR5表达趋
势，进一步表明LGR5在晚期肿瘤发生中的作用。
LGR5转录物。虽然在大多数肿瘤中可检测到LGR5，在转移性肿瘤中存在增加的LGR5表达趋
势，进一步表明LGR5在晚期肿瘤发生中的作用。
[0240] 在包括JH109、ASPC1和PANC1的一系列胰腺肿瘤中研究了LGR5表达。以标准护理治疗(SOC)(在JH109中Gemzar和Abraxane，以及在PANC1和ASPC1中单独的Gemzar)处理，导致
各个上述肿瘤中LGR5表达的诱导(图15)。显然地，在以18G7H6A3和SOC组合处理的肿瘤中，LGR5表达降低至与对照(盐水或MOPC)相当的水平。这些数据进一步表明，LGR5的表达可用
作为PANC肿瘤中响应组合处理(18G7H6A3+SOC)的生物标志物。
各个上述肿瘤中LGR5表达的诱导(图15)。显然地，在以18G7H6A3和SOC组合处理的肿瘤中，LGR5表达降低至与对照(盐水或MOPC)相当的水平。这些数据进一步表明，LGR5的表达可用
作为PANC肿瘤中响应组合处理(18G7H6A3+SOC)的生物标志物。
[0241] 实施例40-CTNNB1是CRC和胰腺肿瘤中18G7H6A3的靶标基因之一
[0242] 研究了Wnt通路中18G7H6A3的潜在靶标。制备Wnt QPCR板(Qiagen，CA)，在96孔PCR板中具有约80个Wnt通路基因的引物。将来自18G7H6A3或MOPC(对照)处理的肿瘤的cDNA合并，并在Wnt板中进行了QPCR。将每个板的数据针对对应的GAPDH进行标准化，并使用2^δCt方程式测量每个基因的丰度。为了测量倍数差异，将每个18G7H6A3处理的肿瘤中的数据除
以来自MOPC处理组的对应值。大于1或小于1的值分别指示18G7H6A3处理组的上调或下调。
对上调或下调基因数量的初步评估显示，在两个肿瘤模型(CT1和CT3)中，下调基因均多于
上调基因，表明18G7H6A3对基因表达具有抑制效果。详细的分析鉴定了数个差异表达的基
因，包括FZDB、FZD7、WNT7B、FBXW11、FZD1、DVL1、CSNK2A1和CTNNB1。
以来自MOPC处理组的对应值。大于1或小于1的值分别指示18G7H6A3处理组的上调或下调。
对上调或下调基因数量的初步评估显示，在两个肿瘤模型(CT1和CT3)中，下调基因均多于
上调基因，表明18G7H6A3对基因表达具有抑制效果。详细的分析鉴定了数个差异表达的基
因，包括FZDB、FZD7、WNT7B、FBXW11、FZD1、DVL1、CSNK2A1和CTNNB1。
[0243] 在宫颈癌中，LGR5表达与CTNNB1之间可能存在紧密关联性。在其他研究中，LGR5的过表达(使用LGR5重组载体)或下调(使用shRNA)分别导致CTNNB1的上调或下调(Chen Q,Cao HZ,Zheng PS.2014.Oncotarget 5:9092-105)。另外，对来自宫颈癌患者的免疫组织化学片子的分析显示，LGR5与CTNNB1表达间存在显著相关性。在本研究中，使用QPCR(以测量转录本水平)和蛋白印迹(以评估蛋白表达)进一步研究了CTNNB1的表达。使用人特异性引
物，研究了胰腺和CRC肿瘤中的CTNNB1表达。类似于实施例45中解释的LGR5表达，以SOC处理增加了CTNNB1表达，且18G7H6A3和SOC的组合导致CTNNB1表达降低。另外，在以18G7H6A3处理的CT1肿瘤中，CTNNB1表达降低了约35％。因而，以18G7H6A3处理抑制了CTNNB1。通过蛋白印迹分析研究了β-连环蛋白和磷酸化-β-连环蛋白的表达(指示Wnt通路中活性的缺少)。
ASPC1肿瘤中的蛋白印迹数据证实了QPCR数据，其中18G7H6A3作为单一试剂或18G7H6A3与
SOC的组合上调了pβ-连环蛋白，表明在这些肿瘤中Wnt通路活性被抑制(图16)。
物，研究了胰腺和CRC肿瘤中的CTNNB1表达。类似于实施例45中解释的LGR5表达，以SOC处理增加了CTNNB1表达，且18G7H6A3和SOC的组合导致CTNNB1表达降低。另外，在以18G7H6A3处理的CT1肿瘤中，CTNNB1表达降低了约35％。因而，以18G7H6A3处理抑制了CTNNB1。通过蛋白印迹分析研究了β-连环蛋白和磷酸化-β-连环蛋白的表达(指示Wnt通路中活性的缺少)。
ASPC1肿瘤中的蛋白印迹数据证实了QPCR数据，其中18G7H6A3作为单一试剂或18G7H6A3与
SOC的组合上调了pβ-连环蛋白，表明在这些肿瘤中Wnt通路活性被抑制(图16)。
[0244] 在一系列CRC、胰腺和乳腺肿瘤中，研究了Wnt通路的其他组分，包括p-β-连环蛋白、GSK-3β(总的以及磷酸化的)和LRP6。蛋白印迹数据的定量显示在ASPC1和PANC1肿瘤中，Wnt通路信号传导被显著抑制，但也揭示了在其他模型中存在利于Wnt通路下调的一些趋
势。对18G7H6A3处理无响应的BMCRC086肿瘤，对LGR5表达和Wnt信号传导通路的组分也为阴性的，其进一步支持了以下结论，即18G7H6A3的作用机制为特异性靶向LGR5和抑制Wnt信号传导。
势。对18G7H6A3处理无响应的BMCRC086肿瘤，对LGR5表达和Wnt信号传导通路的组分也为阴性的，其进一步支持了以下结论，即18G7H6A3的作用机制为特异性靶向LGR5和抑制Wnt信号传导。
[0245] 研究了包括ASPC1、PANC1和JH109的胰腺肿瘤中Wnt通路基因的表达。基于体内数据，在PANC1和ASPC1中，18G7H6A3处理的肿瘤与PBS处理的肿瘤之间的肿瘤体积存在差异。
相反，JH109肿瘤未响应采用18G7H6A3单一试剂或SOC化疗组合进行的标准治疗方案。研究
了在响应性细胞(PANC1和ASPC1)和非响应性细胞(JH109)中Wnt基因表达的差异。在组合体
处理组中，Wnt6、FZD8、FOSL1、Wnt11、NFATC和FZD5在ASPC1和PANC1组合处理的肿瘤中均被下调，在JH109肿瘤中则被上调。在胰腺和CRC数据中，在PANC1、ASPC1、CT1和CT3细胞中的包括WNT11、WNT6、FRZB和PRICKEL的基因均被下调，但在JH109细胞中未被下调。
相反，JH109肿瘤未响应采用18G7H6A3单一试剂或SOC化疗组合进行的标准治疗方案。研究
了在响应性细胞(PANC1和ASPC1)和非响应性细胞(JH109)中Wnt基因表达的差异。在组合体
处理组中，Wnt6、FZD8、FOSL1、Wnt11、NFATC和FZD5在ASPC1和PANC1组合处理的肿瘤中均被下调，在JH109肿瘤中则被上调。在胰腺和CRC数据中，在PANC1、ASPC1、CT1和CT3细胞中的包括WNT11、WNT6、FRZB和PRICKEL的基因均被下调，但在JH109细胞中未被下调。
[0246] 基因树分析确定了以18G7H6A3处理的胰腺肿瘤中被共调控的潜在基因，其包括Wnt11、FRAT1、LEF1、GSK3B、FZD8和LRP6。对每种处理中差异表达的转录物的分析，也确定了胰腺肿瘤中被上调/被下调大于2倍的基因(图17)。18G7H6A3处理相对于对照处理的肿瘤，
诸如Wnt7A的一些基因在所有肿瘤中是常见的。
诸如Wnt7A的一些基因在所有肿瘤中是常见的。
[0247] 实施例41-18G7H6A3抑制CT1肿瘤中的转录
[0248] 在早期与晚期肿瘤发生中，研究了被18G7H6A3靶向的基因的表达。小鼠植入CT1，并且于第3天、第10天和第17天自对照、18G7H6A3、FOLFIRI或组合的组中收获肿瘤。在第3天从每个肿瘤收获并制备总RNA，用于使用Illumina人芯片进行基因阵列杂交。对差异表达的基因(大于1.5或2倍，p<0.05)的总体分析表明，在以18G7H6A3(作为单一试剂或与FOLFIRI
组合)处理的肿瘤中，相比上调的基因，存在更多的下调的基因。这表明18G7H6A3处理可能对整个细胞转录机制具有更强的抑制作用。PCA(主成分分析)也显示，18G7H6A3与对照处理肿瘤中，整体基因表达接近。然而，在将18G7H6A3加入至FOLFIRI(即，组合的组)时，组合的组相对于FOLFIRI存在明显的区别，表明靶向LGR5可能明显地改变了FOLFIRI处理的肿瘤中
的基因表达。
组合)处理的肿瘤中，相比上调的基因，存在更多的下调的基因。这表明18G7H6A3处理可能对整个细胞转录机制具有更强的抑制作用。PCA(主成分分析)也显示，18G7H6A3与对照处理肿瘤中，整体基因表达接近。然而，在将18G7H6A3加入至FOLFIRI(即，组合的组)时，组合的组相对于FOLFIRI存在明显的区别，表明靶向LGR5可能明显地改变了FOLFIRI处理的肿瘤中
的基因表达。
[0249] 在相对于媒介物的18G7H6A3中差异表达基因的分析，确定了18G7H6A3处理肿瘤中数个被下调的肿瘤启动子，如ANGPT2、AKAP12和ADM，以及18G7H6A3处理的肿瘤中数个被上调的肿瘤抑制因子，如DAB1、MIR655、NKX1-2(图18)。相反，FOLFIRI处理似乎会上调肿瘤启动子(FBN2、HKDC1、ABCB1、FGF2)，以及一些肿瘤抑制因子，如TRIB3、ATF3和TIMP3(图19)。
FOLFIRI和18G7H6A3的组合导致诸如ALDOC、CDH5、ITGA2的更多肿瘤启动子的下调，也导致诸如ZBTB11、ITPKA、PSMC3IP和BAK1的更多肿瘤抑制因子的上调(图20)。
FOLFIRI和18G7H6A3的组合导致诸如ALDOC、CDH5、ITGA2的更多肿瘤启动子的下调，也导致诸如ZBTB11、ITPKA、PSMC3IP和BAK1的更多肿瘤抑制因子的上调(图20)。
[0250] 实施例42-在胰腺患者来源的异种移植的原位模型中，18G7H6A3的处理显著减少了外周血中的人CTC
[0251] 为了研究18G7H6A3在抑制原发性肿瘤生长和转移中的作用，检测了一系列胰腺患者来源的异种移植体样本和PANC1424细胞以及PANC1427细胞中的LGR5表达。
[0252] 将肿瘤样本皮下植入NOD/SCID(非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷)小鼠，并随后植入指定用于体内研究的受体的胰腺中。每周超声测量肿瘤体积，并将具有～100mm3肿瘤
的小鼠纳入功效研究，并以如下试剂处理：1-MOPC同种型(15mg/kg，每周两次；ip)；2-
18G7H6A3(15mg/kg，每周两次；ip)；3-SOC(Gemzar 50mg/kg；ip，每周两次；以及Abraxane
30mg/kg，iv，每周两次)；4-上述剂量的18G7H6A3和SOC的组合。在研究结束时，从每只携带肿瘤的小鼠收集外周血用于CTC(采用流式细胞术)和循环DNA评估。对于流式细胞术，利用
RBC裂解缓冲液(ACK buffer,Life Tech,CA)，采用厂商方案处理血液样本，并在4℃用人
HLA-FITC(eBiosciences,CA)和人LGR5-AF647(BD Pharmingen,CA)染色30分钟。将细胞用
染色缓冲液(PBS-FBS3％)洗涤两次并用7AAD(7-氨基放线菌素)洗涤，然后于实验室的FACS calibur仪器进行收获，并使用FCS Express软件(De Novo,CA)分析数据。
的小鼠纳入功效研究，并以如下试剂处理：1-MOPC同种型(15mg/kg，每周两次；ip)；2-
18G7H6A3(15mg/kg，每周两次；ip)；3-SOC(Gemzar 50mg/kg；ip，每周两次；以及Abraxane
30mg/kg，iv，每周两次)；4-上述剂量的18G7H6A3和SOC的组合。在研究结束时，从每只携带肿瘤的小鼠收集外周血用于CTC(采用流式细胞术)和循环DNA评估。对于流式细胞术，利用
RBC裂解缓冲液(ACK buffer,Life Tech,CA)，采用厂商方案处理血液样本，并在4℃用人
HLA-FITC(eBiosciences,CA)和人LGR5-AF647(BD Pharmingen,CA)染色30分钟。将细胞用
染色缓冲液(PBS-FBS3％)洗涤两次并用7AAD(7-氨基放线菌素)洗涤，然后于实验室的FACS calibur仪器进行收获，并使用FCS Express软件(De Novo,CA)分析数据。
[0253] LGR5在不同胰腺患者来源的异种移植体样本中表达。在外周血中检测到人CTC。虽然HLA+细胞的百分比在相对于18G7H6A3的MOPC中没有显著地改变，但是循环HLA+LGR5+细
胞的百分比在18G7H6A3处理小鼠中显著地降低(图21)。
胞的百分比在18G7H6A3处理小鼠中显著地降低(图21)。
[0254] 相对于组合处理小鼠，在化疗处理小鼠中HLA+细胞的百分比没有显著变化，然而，18G7H6A3与SOC的组合几乎完全地消融了并行(concurrent)和消减(debulk)设置中的HLA+
LGR5+细胞(图22A和图22B)。在胰腺患者来源的异种移植原位模型中，18G7H6A3的处理(以
单一试剂或与SOC组合)显著地降低了外周血中的人CTC。
LGR5+细胞(图22A和图22B)。在胰腺患者来源的异种移植原位模型中，18G7H6A3的处理(以
单一试剂或与SOC组合)显著地降低了外周血中的人CTC。
[0255] 实施例43-其他模型中的LGR5表达
[0256] 使用流式细胞术和RNAscope，研究了来自食蟹猕猴(Cynomolgus macaques,Cynos)的皮肤样本中的LGR5表达。在第0天、第7天、第14天和第21天，以媒介物或不同剂量的18G7H6A3(G2:10mg/kg；G3:50mg/kg；和G4:150mg/kg)处理来自食蟹猕猴的皮肤样本。在研究结束时，将皮肤样本置于补充有抗生素(青霉素和链霉素)和抗真菌溶液(抗-抗100X，
Life Technologies，CA)的DMEM中。使用胶原酶和嗜热菌蛋白酶的混合物(Liberase，Roch Inc，CA)消化皮肤样本。在以释放酶(Liberase)孵育过夜并机械破碎后，分离皮肤祖细胞
(progenitor,SP)。用大鼠抗人LGR5(AF647,BD Pharmingen,CA)对SP进行染色，并在实验室的calibur仪器中进行分析。使用FCS Express(Denovo Software,CA)进行的数据分析表
明，在食蟹猕猴SP中可检测到LGR5，然而，在18G7H6A3(以不同剂量)与媒介物处理组之间
LGR5的频率不存在显著差异。使用RNAscope，在皮肤区域尤其是在毛囊中可检测到LGR5，并且在皮肤上皮细胞中检测到程度小得多的LGR5。在相对于18G7H6A3处理样本的媒介物处理
样本中，LGR5阳性区域不存在显著差异。
Life Technologies，CA)的DMEM中。使用胶原酶和嗜热菌蛋白酶的混合物(Liberase，Roch Inc，CA)消化皮肤样本。在以释放酶(Liberase)孵育过夜并机械破碎后，分离皮肤祖细胞
(progenitor,SP)。用大鼠抗人LGR5(AF647,BD Pharmingen,CA)对SP进行染色，并在实验室的calibur仪器中进行分析。使用FCS Express(Denovo Software,CA)进行的数据分析表
明，在食蟹猕猴SP中可检测到LGR5，然而，在18G7H6A3(以不同剂量)与媒介物处理组之间
LGR5的频率不存在显著差异。使用RNAscope，在皮肤区域尤其是在毛囊中可检测到LGR5，并且在皮肤上皮细胞中检测到程度小得多的LGR5。在相对于18G7H6A3处理样本的媒介物处理
样本中，LGR5阳性区域不存在显著差异。
[0257] 研究了分离自食蟹猕猴的外周血单核细胞的基因表达。使用Qiagen RNeasy试剂盒提取总RNA，并使用Superscript cDNA合成试剂盒(Life Technologies,CA)合成cDNA。将来自各个处理的cDNA合并，并加入至RT2Sybergreen qPCR master混合物(SABiosciences,
MA)。将最终混合物加入至包含针对趋化因子或炎性细胞因子的食蟹猕猴QPCR引物的96孔
板的每个孔中。PCR热特征包括：95℃，10分钟，和40个循环的95℃，15秒，及60℃，1分钟，然后进入熔解曲线阶段。通过从对应的GAPDH减去将各个板中的数据(Ct值)标准化，并且使用
2^DCT方程式计算各个转录物的丰度。18G7H6A3组与媒介物处理组之间差异表达(大于2倍)
的转录物数量的分析显示，与基因阵列数据一致，相比于上调基因，存在更多的下调基因。
随着剂量增加，存在更少的上调基因和更多的下调基因。其中在最后剂量18G7H6A3之后，持续4周未接受任何处理的食蟹猕猴的G4恢复(G4R)组，显示几乎相似数目的上调和下调基
因。详细的分析确定了差异表达的基因(CCL11、IL3、SPP1、CCL13、CXCL6和TNFRSF11b)，其表达与18G7H6A3的剂量呈负相关，即在10mg/kg中最高，而在150mg/kg中最低。
MA)。将最终混合物加入至包含针对趋化因子或炎性细胞因子的食蟹猕猴QPCR引物的96孔
板的每个孔中。PCR热特征包括：95℃，10分钟，和40个循环的95℃，15秒，及60℃，1分钟，然后进入熔解曲线阶段。通过从对应的GAPDH减去将各个板中的数据(Ct值)标准化，并且使用
2^DCT方程式计算各个转录物的丰度。18G7H6A3组与媒介物处理组之间差异表达(大于2倍)
的转录物数量的分析显示，与基因阵列数据一致，相比于上调基因，存在更多的下调基因。
随着剂量增加，存在更少的上调基因和更多的下调基因。其中在最后剂量18G7H6A3之后，持续4周未接受任何处理的食蟹猕猴的G4恢复(G4R)组，显示几乎相似数目的上调和下调基
因。详细的分析确定了差异表达的基因(CCL11、IL3、SPP1、CCL13、CXCL6和TNFRSF11b)，其表达与18G7H6A3的剂量呈负相关，即在10mg/kg中最高，而在150mg/kg中最低。
[0258] 在处理之间通常被下调的基因包括CCL1、IFNγ、CCR8、IL2、IL3和IL4，其中的一些在M1或M2巨噬细胞中富集。
[0259] 实施例44-人源化抗LGR5抗体抑制体内小细胞肺癌肿瘤生长
[0260] 患者来源的小细胞肺癌异种移植模型。将来自BLG293肿瘤的解离的肿瘤细胞于人工基底膜中经皮下植入CB.17SCID小鼠，并每周两次监测肿瘤大小和体重。当肿瘤达到
3
130mm 的均值时，将小鼠随机分配。以PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理小鼠。向小鼠以
15mg/kg每周给药两次(BIW)。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及整体健康和
外观，直至结束。
3
130mm 的均值时，将小鼠随机分配。以PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理小鼠。向小鼠以
15mg/kg每周给药两次(BIW)。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及整体健康和
外观，直至结束。
[0261] 相比PBS(24.9％肿瘤生长抑制)和MOPC抗体(24.7％肿瘤生长抑制)对照，18G7H6A3显示出显著的抗肿瘤活性。
[0262] 实施例45-18G7H6A3增加了消减化疗后胰腺肿瘤复发的小鼠的存活
[0263] 通过以化疗(吉西他滨/Abraxane)和18G7H6A3处理，Panc1427(UCSD1427)肿瘤完全被消减(消退)。当肿瘤被消退时，移除化疗，并以18G7H6A3处理小鼠或不处理小鼠。相比对照动物，以18G7H6A3处理的动物明显更健康，在对照动物中有数只小鼠由于严重的健康
观察结果如跛行或体重减轻不得不被安乐死。在第150天，相对于以仅化疗处理的4/8的小
鼠存活，以18G7H6A3和化疗处理的7/8的小鼠存活。图23对这些结果进行了总结。
观察结果如跛行或体重减轻不得不被安乐死。在第150天，相对于以仅化疗处理的4/8的小
鼠存活，以18G7H6A3和化疗处理的7/8的小鼠存活。图23对这些结果进行了总结。
[0264] 实施例46-向患者施用18G7H6A3
[0265] 按如下所述，在转移性结直肠癌患者中进行了BNC101(抗LGR5人源化的单克隆抗体)的I期剂量递增研究。完成产品的名称：输注用BNC101溶液(BNC101Solution for
Infusion)。活性成分名称：BNC101、18G7H6A3、ET101、LGR5抗体。
Infusion)。活性成分名称：BNC101、18G7H6A3、ET101、LGR5抗体。
[0266] 研究目的
[0267] 为了确定静脉内施用转移性结直肠癌患者的BNC101的最大耐受剂量(MTD)、推荐II期剂量(RP2D)、安全性、耐受性和药代动力学(PK)特性。主要目的为，确定作为单一试剂和与化疗组合的BNC101在转移性结直肠癌患者中的MTD。第二目的如下，确定作为单一试剂和与化疗组合的BNC101在转移性结直肠癌患者的RP2D。评估BNC101的安全性和耐受性[不
良事件(AE)、剂量遗漏(omission)或延迟]。评估BNC101的免疫原性(针对BNC101的抗体产
生)。确定作为单一试剂和与化疗组合的BNC101的药代动力学(PK)(半衰期、递送体积和清
除)。以BNC101治疗的转移性结直肠癌患者的整体反应率(ORR)、无进展存活(PFS)和整体存活(OS)的初步评估。示例性的目的如下，评估疾病相关的生物标志物(CEA)的改变。评估活性的生物标志物[药效动力学，例如循环肿瘤细胞(CTC)、LGR5+细胞、循环肿瘤DNA]。
良事件(AE)、剂量遗漏(omission)或延迟]。评估BNC101的免疫原性(针对BNC101的抗体产
生)。确定作为单一试剂和与化疗组合的BNC101的药代动力学(PK)(半衰期、递送体积和清
除)。以BNC101治疗的转移性结直肠癌患者的整体反应率(ORR)、无进展存活(PFS)和整体存活(OS)的初步评估。示例性的目的如下，评估疾病相关的生物标志物(CEA)的改变。评估活性的生物标志物[药效动力学，例如循环肿瘤细胞(CTC)、LGR5+细胞、循环肿瘤DNA]。
[0268] 安全性终点
[0269] 评估治疗紧急事件(临床和实验数据)。评估剂量中断和中止。
[0270] 关键患者的选择标准
[0271] 1.签署书面知情同意书。2.年龄>18岁。3.东方肿瘤协作组(ECOG)体力状态分数为0-1。4.组织学或细胞学验证的结直肠癌患者，其对于转移性疾病已失败过至少2系(line)
的化疗(单一治疗队列(cohort))或至少1系的化疗(组合治疗队列)，且根据医生和患者的
观点，尝试实验性治疗并非是不合理的。在6个月内的佐剂FOLFOX(亚叶酸；氟尿嘧啶(5-
FU)；和奥沙利铂)被认为是一种治疗。在第1种治疗后，维持策略不认为是另外一种治疗。5.患者必须具有可接近的、易于活检而不会将患者或其治疗置于危险的肿瘤病灶。单一治疗
递增队列3以及之后的患者、单一治疗扩增队列和所有组合治疗的患者，均同意并愿意提供
2种系列的肿瘤病灶活检(可能时，优选至少2个新鲜核/开孔(punches))。活检可以来自肝
转移，代替原发性肿瘤。新鲜活检中肿瘤组织的存在由受训练的病理学家采用合适的临时
组织学或细胞学程序进行验证。6.根据实体瘤疗效评价标准(RECIST)版本1.1的可测量的
疾病。7.无已知的脑转移。8.预期寿命至少≥12周。9.正常器官和骨髓功能：a.在纳入之前的14天内，无生长因子支持下的绝对中性白细胞计数>1,500/mL。b.在纳入之前的14天内，无输血条件下的血小板>100,000/mL。c.血红蛋白≥9.0g/dL-患者可以输血或接受红血球
生成治疗来满足这一标准。d.总胆红素<1.5x惯例(institutional)正常值上限(ULN)(对于
患Gilbert综合征对象，<2x ULN)。e.血清白蛋白≥3g/dL。10.天冬氨酸转氨酶(AST)(血清谷草转氨酶，SGOT)和丙氨酸转氨酶(ALT)(血清谷丙转氨酶，SGPT)<2.5x惯例ULN(对于有肝参与的对象<5x惯例ULN，但不能够与增加的胆红素相关)。11.对于接受活检的患者，凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)/国际标准比率(INR)落入正常限制范围(±
15％)。12.肌酸酐<1.5x惯例ULN或者对于肌酸酐水平高于惯例正常值的对象，肌酸酐清除
率>60mL/min/1.73m2。13.具有生育潜能的女性和男性做好充足的避孕措施。
的化疗(单一治疗队列(cohort))或至少1系的化疗(组合治疗队列)，且根据医生和患者的
观点，尝试实验性治疗并非是不合理的。在6个月内的佐剂FOLFOX(亚叶酸；氟尿嘧啶(5-
FU)；和奥沙利铂)被认为是一种治疗。在第1种治疗后，维持策略不认为是另外一种治疗。5.患者必须具有可接近的、易于活检而不会将患者或其治疗置于危险的肿瘤病灶。单一治疗
递增队列3以及之后的患者、单一治疗扩增队列和所有组合治疗的患者，均同意并愿意提供
2种系列的肿瘤病灶活检(可能时，优选至少2个新鲜核/开孔(punches))。活检可以来自肝
转移，代替原发性肿瘤。新鲜活检中肿瘤组织的存在由受训练的病理学家采用合适的临时
组织学或细胞学程序进行验证。6.根据实体瘤疗效评价标准(RECIST)版本1.1的可测量的
疾病。7.无已知的脑转移。8.预期寿命至少≥12周。9.正常器官和骨髓功能：a.在纳入之前的14天内，无生长因子支持下的绝对中性白细胞计数>1,500/mL。b.在纳入之前的14天内，无输血条件下的血小板>100,000/mL。c.血红蛋白≥9.0g/dL-患者可以输血或接受红血球
生成治疗来满足这一标准。d.总胆红素<1.5x惯例(institutional)正常值上限(ULN)(对于
患Gilbert综合征对象，<2x ULN)。e.血清白蛋白≥3g/dL。10.天冬氨酸转氨酶(AST)(血清谷草转氨酶，SGOT)和丙氨酸转氨酶(ALT)(血清谷丙转氨酶，SGPT)<2.5x惯例ULN(对于有肝参与的对象<5x惯例ULN，但不能够与增加的胆红素相关)。11.对于接受活检的患者，凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)/国际标准比率(INR)落入正常限制范围(±
15％)。12.肌酸酐<1.5x惯例ULN或者对于肌酸酐水平高于惯例正常值的对象，肌酸酐清除
率>60mL/min/1.73m2。13.具有生育潜能的女性和男性做好充足的避孕措施。
[0272] 给药和日程
[0273] 递增以交错形式发生于两组单独的队列中：单一试剂BNC101剂量递增发生于组合化疗队列中的剂量递增。在后者中，BNC101与FOLFIRI组合增加剂量。直至已测定单一治疗队列的RP2D，组合化疗队列才开始治疗。组合化疗队列中的递增开始要比单一化疗队列的
单一试剂RP2D低一个水平。尽管预期BNC101与化疗组合不会出现附加毒性，可以获得低于
初始剂量的两个额外的递减水平，以防需要它们。
单一试剂RP2D低一个水平。尽管预期BNC101与化疗组合不会出现附加毒性，可以获得低于
初始剂量的两个额外的递减水平，以防需要它们。
[0274] BNC101单一治疗
[0275] 采用标准的3+3I期研究设计。起始剂量为在动物中的最高无明显损害作用水平(NOAEL)剂量(在人中为2.5mg/kg)的1/30，其计算已考虑受体结合的物种差异。随后的
BNC101剂量水平为5、10和15mg/kg。
BNC101剂量水平为5、10和15mg/kg。
[0276] 给药日程为每周(q1w)。
[0277] 周期持续时间为4周(28天)(4周的输注)，周期间无休息周。
[0278] 进行剂量递增来确定MTD。在给药队列内允许无计量递增或减少。在所有情况下，BNC101都应当在早上给药，以能够及时准备和运送血液样本用于在同一天进行的转化研
究。
究。
[0279] 利用3名患者的队列，以2.5mg/kg(在动物中的最高NOAEL剂量的1/30)的剂量开始剂量递增。如果在28天(4次BNC101给药)结束时，未观察到归因于研究药物的CTCAE等级≥
2AE，则以下一个剂量水平(5mg/kg)治疗第二3名患者的队列。在3名患者的队列中继续进一步的剂量递增(以10mg/kg开始，随后为15mg/kg)。
2AE，则以下一个剂量水平(5mg/kg)治疗第二3名患者的队列。在3名患者的队列中继续进一步的剂量递增(以10mg/kg开始，随后为15mg/kg)。
[0280] 如果3名对象队列中的1/3对象出现剂量限制性浮性(DLT)，则该剂量增加至6名对象。如果2名或更多对象出现DLT，则不会再施用该水平的剂量至其他对象，并将3名另外的对象加入至前一剂量队列，除非在那一剂量水平已经治疗了6名对象。
[0281] 从第一次给药时开始直至28天，评估对象的DLT。合适时，对于新纳入对象的剂量递增，发生于队列中的所有对象均已完成其28天DLT评估之后。在第56天时(2个周期)和在
第56天之后具有稳定性疾病或响应的对象会被允许继续接受每周的BNC101给药直至疾病
出现进展。
第56天之后具有稳定性疾病或响应的对象会被允许继续接受每周的BNC101给药直至疾病
出现进展。
[0282] 如果在测试的最高BNC101剂量组合下无DLT报告，则以BNC101暴露显示的PK特性与实验室动物中证明的最大暴露相当的患者队列为组合化疗的RP2D。
[0283] 在最高剂量水平导致6名对象中的<2名出现3级(不包括在24小时内3级输注反应消退)或4级AE(DLT)，或者在不存在这样的毒性的情况下已实现充足的PK暴露之后，会进一步纳入至少9名额外的对象。
[0284] BNC101与FOLFIRI组合
[0285] 在完成BNC101单一治疗剂量递增，达到声明的安全性和RP2D后，可以以低于单一治疗中确定的RP2D的1个剂量水平的BNC101，对其组合化疗队列开始转移性结直肠癌患者
的治疗。这些队列每个包含3名对象。按照与单一治疗队列所使用的相同的规则进行递增。
如果在最多6名患者中的2名中显示该初始BNC101剂量显示DLT，则将根据3+3规则提供2名
额外的递减队列，来鉴定组合化疗的RP2D。
的治疗。这些队列每个包含3名对象。按照与单一治疗队列所使用的相同的规则进行递增。
如果在最多6名患者中的2名中显示该初始BNC101剂量显示DLT，则将根据3+3规则提供2名
额外的递减队列，来鉴定组合化疗的RP2D。
[0286] 如果在测试的最高BNC101剂量组合下无DLT报告，则以BNC101暴露显示的PK特性与实验室动物中证明的最大暴露相当的患者队列为与化疗组合的RP2D。
[0287] 在最高剂量水平导致6名对象中的<2名出现3级(不包括在24小时内3级输注反应消退)或4级AE(DLT)，或者在不存在这样的毒性的情况下已实现充足的PK暴露之后，会进一步纳入至少9名额外的对象。
[0288] FOLFIRI组分：伊立替康(IRI)-起始剂量180mg/m2(90分钟，在第1天)；亚叶酸(LV)-起始剂量400mg/m2(给药120分钟，在第1天，与IRI同时给药)；5-FU大药丸-起始剂量
400mg/m2(在第1天的LV后给药)；5-FU输注-起始剂量2400mg/m2(给药48小时，从第1天开
始)。FOLFIRI循环每14天重复一次。
400mg/m2(在第1天的LV后给药)；5-FU输注-起始剂量2400mg/m2(给药48小时，从第1天开
始)。FOLFIRI循环每14天重复一次。
[0289] DLT定义
[0290] DLT定义为在任何给定递增队列的第1个周期(第0天-第28天)出现的以下中的任一种：采用NCI CTCAE v4.0的3级或4级非血液毒性(包括过敏反应)；大于48小时持续时间
的3级恶心或4级呕吐或≥3级腹泻，尽管进行了合适的治疗仍然发生；任意持续时间的4级
血小板减少；和4级非并发的中性粒细胞减少(即，无感冒或感染)，在单一治疗队列中为任意持续时间，或者在组合化疗队列中持续>7天。需要住院的4级发热性中性粒细胞减少，和需要延迟治疗超过3周和延长QTc间隔至≥500msec或者从基线平均QTc间隔增加60msec的
任意3级血液毒性。任意其他药物相关的≥3级非血液不良事件(包括过敏反应)，除了未接
受最大医学管理的对象中的高血脂或可以利用补充物控制的电解质异常。所有AE均被认为
与治疗潜在相关，除非观察到的毒性与疾病进展(PD)间存在明确的关联性。符合这些标准
的不良事件不会被认为是报告DLT或测定MTD的目的。
的3级恶心或4级呕吐或≥3级腹泻，尽管进行了合适的治疗仍然发生；任意持续时间的4级
血小板减少；和4级非并发的中性粒细胞减少(即，无感冒或感染)，在单一治疗队列中为任意持续时间，或者在组合化疗队列中持续>7天。需要住院的4级发热性中性粒细胞减少，和需要延迟治疗超过3周和延长QTc间隔至≥500msec或者从基线平均QTc间隔增加60msec的
任意3级血液毒性。任意其他药物相关的≥3级非血液不良事件(包括过敏反应)，除了未接
受最大医学管理的对象中的高血脂或可以利用补充物控制的电解质异常。所有AE均被认为
与治疗潜在相关，除非观察到的毒性与疾病进展(PD)间存在明确的关联性。符合这些标准
的不良事件不会被认为是报告DLT或测定MTD的目的。
[0291] 治疗时长
[0293] 样本大小
[0294] 在本研究中测定多达约54名患者，以确定BNC101在单一治疗和组合化疗中的毒性特征、DLT和MTD和/或RP2D。预期对于每个剂量水平队列，1-6名可评估的患者可提供足够的数据来评估BNC101的毒性和PK特性。一旦确定RP2D，在单一治疗和组合化疗组中均会出现
这些队列的扩增(至最少9名另外的患者)。如果在测试的最高BNC101剂量下无DLT报告，则
以BNC101暴露显示的PK特性与实验室动物中证明的最大暴露相当的患者队列为RP2D。
这些队列的扩增(至最少9名另外的患者)。如果在测试的最高BNC101剂量下无DLT报告，则
以BNC101暴露显示的PK特性与实验室动物中证明的最大暴露相当的患者队列为RP2D。
[0295] 随访频率
[0296] 对于4周的周期的每一周，每7(±3)天。在终止治疗后，直到死亡、丢失随访、患者撤回知情书或赞助商终止研究为止，每3个月收集存活随访信息和随后的抗癌症治疗。
[0297] 安全性评估
[0298] 从第0天-第28天(第1个周期)，评估对象的DLT。报告不良事件直至最后一次给药后的30天。连续报告不良事件。报告在最后一次给药后的第28天与第30天之间出现的不良
事件，但不会整合至MTD的测定。每周分选体能状态，并在基线、在每个周期开始时(例如每4周)、在研究结束(EOS)随访时，以及在解决任意AE时，进行身体检查。
事件，但不会整合至MTD的测定。每周分选体能状态，并在基线、在每个周期开始时(例如每4周)、在研究结束(EOS)随访时，以及在解决任意AE时，进行身体检查。
[0299] 心电图(ECG)检测
[0300] 以一式三份获得所有12个领头的ECG，且相隔至少5分钟。在第1个周期第1天和第15天密集获得基线(在第一次给药前14天内)的ECG，且在第8天和第22天获得给药前的ECG。
于第2个周期和随后周期的第1天，获得给药前的ECG。必须收集EOS ECG。ECG将会送至当地实验室进行评估。
于第2个周期和随后周期的第1天，获得给药前的ECG。必须收集EOS ECG。ECG将会送至当地实验室进行评估。
[0301] 响应评估
[0302] 在基线和每8周进行计算机断层扫描(CT)。第一次响应评估在第56天(2个周期)。如果在之前28天内未进行，则在EOS随访时重复抗肿瘤响应的放射研究。基于每月进行电话随访或记录检查，为期6个月，并在其后每3个月进行，为期18个月(总共24个月)。
[0303] 药代动力学评估
[0304] 在第1个周期，第1天和第15天密集获取药代动力学样本，且第8天和第22天稀疏地获取。在第2个周期和随后周期的第1天稀疏地获取样本。在BNC101给药前(在输注开始前)、BNC101输注期间和BNC101输注后(在输注结束后)，采集血液样本。
[0305] 细胞和分子生物标志物评估
[0306] 在第1个周期的每周、每个随后周期的第1天和治疗结束时，采集患者的基线血液，用以测量CTC和作为药效动力学效应的指示因子的生物标志物(包括但不限于LGR5)的水平。患者在基线和第1个周期、第22天还有2次匹配的皮肤活检(每个活检为2个新鲜核/开
孔)。可以采集患者的另外的毛发样本(包括收集毛囊)。
孔)。可以采集患者的另外的毛发样本(包括收集毛囊)。
[0307] 肿瘤病灶活检
[0308] 对于单一治疗递增队列1和2，不需要活检。对于单一治疗递增队列3和之后的队列，以及单一治疗扩增队列，匹配的活检(基线和第22天)则为强制性的。对于所有组合治疗患者，匹配的活检为强制性的。可能时，优选每个活检最少2个新鲜核/开孔。活检可以来自肝转移，代替原发性肿瘤。新鲜活检中肿瘤组织的存在由受训练的病理学家采用合适的临
时组织学或细胞学程序进行验证。所有样本均为去识别化的。个体的身份不会被研究者或
赞助商所确定。存储于中央参考实验室的密码保护数据不会泄露给患者或治疗患者的医
师。患者信息被严格用于匿名报告研究数据。此类研究数据不会放入患者图表或被医师获
取，且不会也不能用于诊断或治疗目的。
时组织学或细胞学程序进行验证。所有样本均为去识别化的。个体的身份不会被研究者或
赞助商所确定。存储于中央参考实验室的密码保护数据不会泄露给患者或治疗患者的医
师。患者信息被严格用于匿名报告研究数据。此类研究数据不会放入患者图表或被医师获
取，且不会也不能用于诊断或治疗目的。
[0309] 免疫原性评估
[0310] 在基线、每次剂量之前、治疗结束时检测抗BNC101抗体的存在，以及终止治疗后每4周检测，为期12周。由于单一治疗相对于组合治疗队列中患者的不同特性和预期演变，在每个类群中可以获得不同数目的样本。
[0311] 本文中使用的术语“包括(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征为(characterized by)”同义，且为包括性的或开放性的，并不排除另外的、未叙述的元素或方法步骤。
[0312] 以上说明书公开了本发明的数种方法和材料。本发明允许修改方法和材料，以及改变制造方法和设备。考虑本公开或实施本文中公开的发明，这样的修改将变得对本领域
技术人员是显而易见的。因此，本发明不试图限制于本文中公开的特定实施方案，但其包括属于本发明的真正范围和精神内的所有修改和改变。
技术人员是显而易见的。因此，本发明不试图限制于本文中公开的特定实施方案，但其包括属于本发明的真正范围和精神内的所有修改和改变。
[0313] 本文中引用的所有参考文献，包括但不限于发表的和未发表的申请、专利和文献引用，均通过引用整体并入本文，并据此成为本申请的一部分。直至通过引用并入的发表物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾为止，本说明书意图代替和/或优
先于任何此类相矛盾的材料。
先于任何此类相矛盾的材料。
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