一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途
阅读：259发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途。所述的溶血剂由溶血剂A与溶血剂B组成。所述的溶血剂A含有聚 氧 乙烯型非离子 表面活性剂 、 有机酸 、季胺盐阳离子表面活性剂助 溶剂 、稳定剂和渗透压调节剂；所述的溶血剂B含有 碱 性无机盐和渗透压调节剂。与BeckmanCoulter公司生产的标准溶血剂的测定结果比较，相关性好、准确度高。特别是当血液标本出现异常细胞时，报警的灵敏度高、特异性好，显示了最有益的效果。，下面是一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途专利的具体信息内容。
1.一种血液白细胞五分类计数的溶血剂，其特征在于它由溶血剂A和溶血剂B组成，所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
聚氧乙烯型非离子表面活性剂 3.0～10.0份；
有机酸 1.0～5.0份；
季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂 1.0～5.0份；
稳定剂 1.0～5.0份；
渗透压调节剂 1.0～4.0份；
所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酸酯；聚氧乙烯型非离子表面活性剂的HLB值是8.0～19.0；
所述的有机酸选自甲酸、乙酸、柠檬酸或苯甲酸；
所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂选自十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十四烷基三甲基溴化铵；
所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸钾盐或乙二胺四乙酸钠盐；
所述的渗透压调节剂选自氯化钠、硫酸钠或氯化钾；
所述溶血剂A的pH为2～5；
所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
碱性无机盐 4.0～10.0份；
渗透压调节剂 35.0～80.0份；
所述的碱性无机盐选自硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠；
所述溶血剂B的pH值为8-12。
2.根据权利要求1所述的溶血剂，其特征在于所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
聚氧乙烯型非离子表面活性剂 4.0～8.0份；
有机酸 1.5～4.0份；
季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂 1.5～4.1份；
稳定剂 1.6～4.2份；
渗透压调节剂 1.5～3.5；
所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
碱性无机盐 4.5～8.0份；
渗透压调节剂 40.0～70.0份。
3.根据权利要求1所述的溶血剂，其特征在于所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
聚氧乙烯型非离子表面活性剂 4.5～6.0份；
有机酸 1.9～3.5份；
季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂 2.1～3.6份；
稳定剂 2.0～3.5份；
渗透压调节剂 1.8～2.8份；
所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
碱性无机盐 4.9～6.8份；
渗透压调节剂 45.0～60.0份。
4.根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的溶血剂在血液白细胞五分类计数中的用途。
一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种血液分析技术领域。更具体地，本发明涉及一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂，还涉及所述溶血剂的用途。【背景技术】
[0002] 在临床血液学检验中，对患者外周血白细胞计数与分类对许多疾病的诊断和治疗都具有非常重要的意义。使用全自动血液分析装置进行白细胞分类通常需要使用溶血剂。溶血剂一方面可以溶解红细胞，使细胞内的血红蛋白释放，用于血红蛋白的测定。另一方面，溶血剂在破坏红细胞后可以消除红细胞以及红细胞碎片对白细胞分析的干扰，以便后续进行白细胞计数和分类。
[0003] 近年来，已经有一些有关溶血剂的专利申请。例如CN 03116848.5公开了血细胞分析仪用的溶血剂的生产方法，该方法包括用高压反渗透过滤膜生产的过滤水经过离子交换树脂，使水的电阻ρ＞10MΩ/cm，在搅拌速度为30～50转/分下，先加入十二烷基三甲基氯化铵，溶解后，冷却至15～30℃后再加入十四烷基三甲基溴化铵，最后加入氰化钾和其他物料，杀菌消毒，过滤，灌装。CN 200610012725.8公开了一种环保无氰型溶血剂，它是由缓冲液和贮存液混合制成的溶血剂，缓冲液由磷酸氢二钠、柠檬酸和水组成；贮存液由十二烷基三甲基氯化铵、磷酸氢二钠和柠檬酸和水组成。CN200710051576.0公开了一种无氰化钾溶血剂的生产方法，该方法包括(1)纯净水制备；(2)缓冲液配制；(3)乙二胺四乙酸溶解；(4)十二烷基季胺盐溶解；(5)定容配制；(6)过滤灌装。CN 200710073144.X公开了溶血剂、白细胞分类试剂体系及分类方法。该溶血剂可将血液中的红细胞裂解，裂解红细胞后的血液可用于血红蛋白浓度的测定。此外，本发明还涉及一种白细胞分类试剂体系，包括前述溶血剂和一种抑制剂。溶血剂裂解红细胞后，加入抑制剂可以阻止溶血剂对白细胞形态和结构的破坏。CN 200710125208.6公开了一种溶血剂，所述溶血剂含有至少一种有机酸。该发明溶血剂中添加了血红蛋白衍生物的稳定剂，避免衍生物随反应温度的变化而发生变化，保证在仪器正常使用温度范围内均能够获得准确、稳定的测试结果。CN200810010718.3公开了一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，该溶血剂含有聚氧乙烯型非离子表面活性剂、固定剂、助溶剂、缓冲液和余量的去离子水。CN 200810106893.2公开了血细胞分析仪稀释液及溶血剂，该稀释液含有氯化钠、硫酸钠、亚硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、哌啦西啉钠、硼酸盐缓冲液与水；该溶血剂含有氯化钾、十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵、异丙醇、碳酸盐或盐酸缓冲液与水。但是，上述这些专利申请技术生产的溶血剂由于所用的阳离子表面活性剂的剂量大，并含有较多的无机盐，渗透压高，对白细胞膜的损伤较大，可使细胞质渗出，胞膜和胞内颗粒皱缩在胞核周围形成“膜包核”颗粒。在血液分析仪检测时只能按这种颗粒的体积大小将白细胞分成大、小2个细胞群或大、中、小3个细胞群；而不能按白细胞的大小、形态和内部结构特点进行五分类计数。因此，上述这些专利申请技术只能用于白细胞计数及对白细胞进行2或3分群计数。
[0004] 另外，US 5618733、5840515、6632676、2002/0098589、2004/0241769也公开了相关的溶血剂及其制备方法。例如Sakata等人(US 5618733)公开了用于白细胞四分类的测定方法。方法中采用了季胺盐类阳离子表面活性剂作为溶血剂。溶血剂对各类白细胞的损伤不同，会使各类细胞皱缩的情况产生差异，从而使各类白细胞低角度散射光强度产生差异。同时，试剂中还使用芳香族有机酸或酸性色素对各类白细胞进行染色，从而使各类白细胞的高角度散射光强度也产生差异。通过高、低角度散射光的组合，可以对白细胞进行四类细胞分类。不过化学染料的使用不仅会增加试剂的成本，而且增加了仪器和试剂的复杂性。Peovost(US 5840515)公开了以皂甙为主要组分的用于白细胞四分类的试剂。分析试剂为双试剂：第一个试剂为溶血剂，皂甙为其主要组分。皂甙的使用浓度恰好使红细胞全部溶解，但白细胞未受到或仅受到轻微损害。第二试剂为终止液，主要组分为鞘流液，可以终止皂甙对白细胞的进一步损害。终止反应后对细胞大小、复杂度或荧光进行分析即可将细胞分为四个亚群。但由于皂甙可以来源于多种植物，不同来源的皂甙其纯度、对细胞的破坏程度等理化性质会有很大差异。因此，选择何种来源的皂甙作为溶血剂是一个难以解决的问题。Crews等人(US6632676、2002/0098589、2004/0241769)公开了多种对白细胞进行五分类的方法。这个方法中采用了双试剂：第一试剂为溶血剂，其主要成分为皂甙，溶液的pH值为2.9～3.2。第二试剂为抑制剂，其中含HEPES盐溶液的pH值为9.75。反应完成后，对细胞的大小、光散射、不透明度等指标进行分析即可对白细胞进行分类。但该方法仍使用了皂甙，因此同样存在如前所述的皂甙作为溶血剂的问题。
[0006] [要解决的技术问题]
[0007] 本发明的目的是提供一种用于血液白细胞五分类计数的的溶血剂。
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述溶血剂的用途。
[0009] [技术方案]
[0010] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0011] 本发明涉及一种血液白细胞五分类计数的溶血剂。所述的血液白细胞五分类计数的溶血剂由溶血剂A和溶血剂B组成，所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
[0012]
[0013] 所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂的HLB值是8.0～19.0；
[0014] 所述溶血剂A的pH为2～5；
[0015] 所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
[0016] 碱性无机盐 4.0～10.0份；
[0017] 渗透压调节剂 35.0～80.0份；
[0018] 其中，所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂具有如下化学式：
[0019]
[0020] 式中：R代表碳原子数为10～20的烷基或链烯基；w+x+y+z等于3～20中的一个整数。
[0021] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
[0022]
[0023] 所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
[0024] 碱性无机盐 4.5～8.0份；
[0025] 渗透压调节剂 40.0～70.0份。
[0026] 根据本发明的一种更优选实施方式，所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
[0027]
[0028] 所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
[0029] 碱性无机盐 4.9～6.8份；
[0030] 渗透压调节剂 45.0～60.0份。
[0031] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酸酯。
[0033] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂选自十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十四烷基三甲基溴化铵。
[0034] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸钾盐或乙二胺四乙酸钠盐。
[0035] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的渗透压调节剂选自氯化钠、硫酸钠或氯化钾。
[0036] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的碱性无机盐选自硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。
[0037] 本发明还涉及所述溶血剂在白细胞五类细胞分析中的用途。
[0038] 下面将更详细地描述本发明。
[0039] 本发明涉及一种血液白细胞五分类计数的溶血剂。所述的血液白细胞五分类计数的溶血剂由溶血剂A和溶血剂B组成。溶血剂A用来溶解红血细胞，以便仪器能够对白细胞进行体积和内部结构的特征分析。所述的溶血剂A是一种酸性的、低渗的、含有表面活性剂的溶液，所述的溶血剂A能够引起所有细胞形态肿胀。由于红细胞无核，比白细胞含有更多的胆固醇，而且具有易于破碎变形的细胞膜，所以溶血剂A能更快地渗入红细胞质中，引起红细胞肿胀、破裂，使其溶解，于是红细胞在白细胞之前被溶解。溶血剂B是碱性高渗溶液，血液分析仪在运行时，在加入溶血剂A一定时间后加入溶血剂B，以阻止溶血剂A对白细胞进一步破坏。溶血剂B能够起到一种稳定的作用，能够将稀释后血样中的白细胞恢复到等渗、中性、接近原态的状态。在这个过程中，肿胀的白细胞脱水，细胞皱缩，而表面活性剂继续溶解破碎的红细胞膜，完整的白细胞重新达到平衡。当溶液的离子达到平衡的时候，白细胞停止皱缩，恢复到接近原态，便于血液分析仪采用VCS检测方法进行分析。
[0040] 本发明涉及一种血液白细胞五分类计数的溶血剂。所述的血液白细胞五分类计数的溶血剂由溶血剂A和溶血剂B组成。
[0041] 所述的溶血剂A由以重量份计的下述组分组成：
[0042]
[0043] 所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂的HLB值是8.0～19.0；
[0044] 所述溶血剂A的pH为2～5；
[0045] 所述的溶血剂B由以重量份计的下述组分组成：
[0046] 碱性无机盐 4.0～10.0份；
[0047] 渗透压调节剂 35.0～80.0份；
[0048] 其中，所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂具有如下化学式：
[0049]
[0050] 式中：R代表碳原子数为10～20的烷基或链烯基；w+x+y+z等于3～20中的一个整数。
[0051] 本发明溶血剂中的非离子表面活性剂和助溶剂，稳定性高，其裂解红细胞的能力较强，在溶血剂中的使用量较低，对白细胞的伤害较小。在pH值为2～5的条件下，在合适的浓度范围和作用时间内可引起了红细胞的肿胀，破裂，使其溶解。
[0052] 根 据 本 发 明，所 述 聚 氧 乙 烯 型 非 离 子 表 面 活 性 剂 的HLB 值(Hydrophile-Lipophile Balance Number)一般是8.0～19.0。这种表面活性剂为具有亲水基团和亲油基团的两亲分子，HLB值表示这种表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量，定义为表面活性剂的亲水亲油平衡值。它既与表面活性剂的亲水亲油性有关，又与表面活性剂的表面(界面)张力、界面上的吸附性、乳化性及乳状液稳定性、分散性、溶解性、去污性等基本性能有关，还与表面活性剂的应用性能有关。
[0053] 根据本发明，如果所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂的HLB值低于8.0，则其水溶性和分散性较差，不能形成均匀的溶液，配制的溶血剂性能不稳定，在血液分析仪上使用时白细胞分类结果差；如果所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂的HLB值高于19.0，尽管水溶性和分散性好，配制的溶血剂对白细胞的结构损害，在血液分析仪上使用时，白细胞有效计数量减少，白细胞分类结果也差。优选地，所述的HLB值是14.0～18.0。
[0054] 所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酸酯。这些聚氧乙烯型非离子表面活性剂都是目前市场上销售的产品，例如聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)的HLB值是16.7，由天津市昆达工贸有限公司、广州市碧盛贸易有限公司生产与销售的产品。
[0055] 优选地，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酸酯。
[0056] 更优选地，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酸酯。
[0057] 在本发明的所述溶血剂A中，如果所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂的含量低于3.0重量份，则会在白细胞散点图左侧出现干扰散点，影响白细胞分类结果；如果所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂的含量高于10.0重量份，则会使白细胞散点图向左移，也影响白细胞分类结果。因此，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂的含量一般是3.0～10.0重量份；优选地，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂的含量是4.0～8.0重量份；更优选地，所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂的含量是4.5～6.0重量份。
[0058] 为了保持所述溶血剂A中的聚氧乙烯型非离子表面活性剂对红细胞的裂解能力，必须将溶血剂的pH值保持在合适范围内。在本发明中，使用有机酸将pH值保持在一个合适范围内。所述的有机酸应该理解是一种能够调节溶血剂pH值的有机酸。在本发明中，本发明溶血剂A的pH值为2.0～5.0。如果溶血剂A的pH值低于2.0，仪器检测时白细胞不能重新恢复到中性、接近原态的状态，会影响白细胞分类结果并容易损害血液分析仪的液路管道；如果溶血剂A的pH值高于5.0，仪器检测时白细胞同样不能重新恢复到中性、接近原态的状态，也会影响白细胞分类结果。本发明溶血剂A的pH值优选地为2.2～4.0。因此，一般而言，凡是具有调节溶血剂A的pH值功能，又不会影响溶血剂A其它性能的有机酸都是本发明可以使用的有机酸。所述的有机酸优选地选自甲酸、乙酸、柠檬酸或苯甲酸。更优选地，所述的有机酸选自甲酸、乙酸或柠檬酸。这些有机酸都是目前市场上销售的产品。
[0059] 在本发明中，如果所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂含量为3.0～10.0重量份，而所述溶血剂A的有机酸含量低于1.0重量份，pH值偏高，仪器检测时白细胞不能重新恢复到中性、接近原态的状态，则会影响白细胞分类结果；如果在所述溶血剂A中的有机酸大于5.0重量份，pH值偏低，仪器检测时白细胞同样不能重新恢复到中性、接近原态的状态，则会影响白细胞分类结果并容易损害血液分析仪的液路管道。因此，所述溶血剂A的有机酸含量一般是1.0～5.0重量份；优选地，所述溶血剂A的有机酸含量是1.5～4.0重量份；更优选地，所述溶血剂A的有机酸含量是1.9～3.5重量份。
[0060] 在非离子表面活性剂裂解红细胞后会产生大量细胞碎片，这些碎片会聚集成团干扰白细胞分类计数。本发明的溶血剂A中使用了一种助溶剂，目的是为了溶解由于裂解红细胞而产生的细胞碎片。因此，在本发明中在所述溶血剂A中的助溶剂应该理解是一种能够有助于红细胞充分溶解，而使白细胞保持稳定的溶剂，因此，凡是具有这种功能而又不会影响溶血剂A其它性能的任何溶剂都是本发明可以使用的助溶剂。所述的助溶剂是季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂，所述的助溶剂优选地选自十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十四烷基三甲基溴化铵。在本发明中，所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂都是目前市场上销售的产品，例如十四烷基三甲基氯化铵(也称三甲基十四烷基氯化铵、肉豆蔻基三甲基氯化铵或N，N，N-三甲基-1-十四烷氯化物)为江苏金特耐科技有限公司销售的产品。
[0061] 更优选地，所述的助溶剂选自十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵或十四烷基三甲基溴化铵。
[0062] 非常优选地，所述的助溶剂选自十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十四烷基三甲基溴化铵。
[0063] 在本发明中，如果所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂含量为3～10重量份，而所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂的含量低于1重量份，则助溶效果较差，影响白细胞分类结果；如果所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂的含量高于5重量份，则会使白细胞的结构受损，仪器检测时白细胞不能重新恢复到接近原态的状态，也影响白细胞分类结果。因此，所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂的含量一般是1.0～5.0重量份；优选地，所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂的含量是1.5～4.1重量份；更优选地，所述的季胺盐阳离子表面活性剂助溶剂的含量是2.1～3.6重量份。
[0064] 在本发明中，在所述溶血剂A中的稳定剂应该理解是一种能够防止血细胞或血小板聚集，可以鳌合溶血剂中存在的多价离子，从而避免多价离子与溶血剂中的其它成分结合，但又不会影响溶血剂性能的任何化学物质。因此，凡是具有这种功能而又不会影响溶血剂A其它性能的任何化学物质都是本发明可以使用的稳定剂。优选地，所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸钾盐或乙二胺四乙酸钠盐。
[0065] 在本发明中，所述的稳定剂的含量一般是1.0～5.0重量份；优选地，所述的稳定剂的含量是1.6～4.2重量份；更优选地，所述的稳定剂的含量是2.0～3.5重量份。
[0066] 溶血剂A是一种低渗酸性溶液，必须将溶血剂A的渗透压保持在30～100m0sm/kg的合适范围内，因此在溶血剂A中应该含有渗透压调节剂。在所述溶血剂A中的渗透压调节剂应该理解是一种不影响溶血过程中的白细胞形态，并将溶血剂的渗透压保持在30～100m0sm/kg范围内的化学物质。因此，凡是具有这种功能而又不会影响溶血剂A其它性能的任何化学物质都是本发明可以使用的渗透压调节剂。在本发明的溶血剂A成分中使用中性无机盐作为渗透压调节剂。优选地，所述的渗透压调节剂是氯化钠、硫酸钠或氯化钾。
[0067] 在溶血剂A中，如果所述聚氧乙烯型非离子表面活性剂含量为3～10重量份，而所述的渗透压调节剂的含量低于1重量份，则会使所配制的溶血剂渗透压偏低，仪器检测时白细胞不能重新恢复到等渗、接近原态的状态，影响仪器白细胞分类结果；如果所述的渗透压调节剂的含量高于4重量份，则会使所配制的溶血剂渗透压明显增高，仪器检测时白细胞也不能重新恢复到等渗、接近原态的状态，也影响仪器白细胞分类结果。因此，所述的渗透压调节剂的含量一般是1～4重量份；优选地，所述的渗透压调节剂的含量是1.5～3.5重量份；更优选地，所述的渗透压调节剂的含量是1.8～2.8重量份。
[0068] 在本发明中，所述的溶血剂B含有碱性无机盐，所述碱性无机盐的作用是为了将溶血剂B的pH值控制在通常8～12，优选地9～11的合适范围内，将稀释后血样中的白细胞重新恢复到等渗、中性、接近原态的状态。
[0069] 所述的碱性无机盐选自硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。优选地，所述的碱性无机盐选自硼酸钠、碳酸钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。更优选地，所述的碱性无机盐选自硼酸钠、碳酸钠或磷酸氢二钠。
[0070] 在溶血剂B中，所述的碱性无机盐的含量低于4.0重量份，则会使配制的溶血剂B的pH值偏低，仪器检测时白细胞不能重新恢复到中性、接近原态的状态；如果所述的碱性无机盐的含量高于10.0重量份，则会配制的溶血剂B的pH值偏高，仪器检测时白细胞也不能重新恢复到中性、接近原态的状态；这两种情况都可以影响白细胞分类结果。因此，所述的碱性无机盐的含量一般是4.0～10.0重量份；优选地，所述的碱性无机盐的含量是4.5～8.0重量份；更优选地，所述的碱性无机盐的含量是4.9～6.8重量份。
[0071] 为了必须将溶血剂B的渗透压保持在800～1200m0sm/kg，优选地900～1100m0sm/kg的范围内，因此在溶血剂B中应该含有渗透压调节剂。在所述溶血剂B中的渗透压调节剂应该理解是一种将溶血剂B的渗透压保持在800～1200m0sm/kg范围内的化学物质。因此，凡是具有这种功能而又不会影响溶血剂B其它性能的任何化学物质都是本发明可以使用的渗透压调节剂。在本发明的溶血剂B成分中使用中性无机盐作为渗透压调节剂。优选地，所述的渗透压调节剂是氯化钠、硫酸钠和氯化钾。
[0072] 在溶血剂B中，所述的渗透压调节剂的含量低于35.0重量份，则会使配制的溶血剂B的渗透压减低，仪器检测时白细胞不能重新恢复到等渗、接近原态的状态；如果所述的渗透压调节剂的含量高于80.0重量份，则会使配制的溶血剂B的渗透压增高，仪器检测时白细胞也不能重新恢复到中性、接近原态的状态；这两种情况都可以影响白细胞分类结果。因此，所述的渗透压调节剂的含量一般是35.0～80.0重量份；优选地，所述的渗透压调节剂的含量是40.0～70.0重量份；更优选地，所述的渗透压调节剂的含量是45.0～60.0重量份。
[0073] 本发明溶血剂的制备方法如下：
[0074] 溶血剂A的制备：按照本说明书公开的溶血剂A组分含量，用分析天平准确称取各种物料，在三角烧瓶中先加入所述的季铵盐阳离子表面活性剂助溶剂和所述的稳定剂，再加入适量的温度40～50℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入聚氧乙烯型非离子表面活性剂搅拌，溶解后冷却至20～25℃，加入适量有机酸甲酸调节pH值至2～5，最后加入预先溶解的氯化钠溶液将其渗透压调节至30～100mOsm/Kg。
[0075] 溶血剂B的制备：按照本说明书公开的溶血剂B组分含量，用分析天平准确称取各种物料，在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂(约90％量)和碱性无机盐(约90％量)，加入适量的温度40～50℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至20～25℃后，再加入碳酸钠无机碱(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至8～12，最后加入余量的渗透压调节剂(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至800～
1200mOsm/Kg。
1200mOsm/Kg。
[0076] 溶血剂A和溶血剂B在使用时，由血液分析仪按厂家预先设定的体积比先后自动加入到被检测的样本中。
[0077] 本发明还涉及所述溶血剂在白细胞五分类计数中的用途。
[0078] 本发明溶血剂用于检测白细胞五类计数时，其使用方法如下：先使用Beckman Coulter LH 750血液分析仪及配备的白细胞分类溶血剂(Beckman Coulter公司生产的标准试剂)检测抗凝静脉血，然后把白细胞分类溶血剂吸入管分别从该血液分析仪配备的溶血剂I和II的瓶中取出，按照该血液分析仪说明书要求，按下相应操作键排出溶血剂I和II管道内残留的白细胞分类溶血剂；再将溶血剂I和II的吸入管分别放入装有本发明白细胞分类溶血剂A和B瓶中，按下相应的操作键将本发明的溶血剂A和B吸入到该血液分析仪溶血剂I和II的管道内。然后，按照该血液分析仪说明书要求，检测待测血标本进行白细胞分类计数。
[0079] 采集临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本，使用该血液分析仪配备的稀释液分别与本发明说明书实施例1-6制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。实施例1-6溶血剂均可在散点图上将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其散点图分别见图1-6。
[0080] 现以本发明的实施例2溶血剂为例进行说明，随机抽取临床新鲜全血样本30份，采用该血液分析仪配备的稀释液分别与本发明的实施例2溶血剂、Beckman Coulter公司生产的标准溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行白细胞分类计数。检测结果列于表1和图7和图8中。
[0081] 测定结果进行数据分析：采用Microsoft Office Excel 2007软件对使用Beckman Coulter公司生产的标准溶血剂和本发明制备的白细胞五分类溶血剂检测的白细胞分类计数结果进行统计分析。分析数据误差主要用相关性系数和相对偏差表示。统计分析结果与分析数据误差也都列于表1中。
[0082] 表1：实施例2制备的溶血剂与贝克曼LH750血液分析仪
[0083] 溶血剂的白细胞分类测定值比较
[0084]
[0085] 注：NE：中性粒细胞、LY：淋巴细胞、MO：单核细胞、EO：嗜酸性粒细胞、[0086] BA：嗜碱性粒细胞，s：标准差、r：相关系数。
[0087] 结果准确性的判断标准：见中华人民共和国医药行业标准YY/T0456.2-2003《血细胞分析仪应用试剂---溶血剂》其中4.9“准确性”：对自主研制的替代溶血剂要求其白细胞分群结果应在由原装试剂所得结果的均值±2s范围之内。
[0088] 由表1的结果非常清楚地表明，本发明的白细胞五分类溶血剂检测的白细胞分类结果不仅在行标要求的范围内，而且r值和相对偏差都显示明显优于现有的行标要求。与Beckman Coulter公司生产的标准溶血剂的测定结果比较表明，本发明的白细胞五分类溶血剂的相关性好，准确度高。
[0089] [有益效果]
[0090] 本发明的有益效果：尽管现有技术中已有使用非离子表面活性剂等，但多用于电阻抗法血液分析仪进行白细胞三分群，而且非离子表面活性剂种类众多，HLB值差别很大。本发明在研究现有技术的基础上，通过反复实验研究，筛选出HLB值在14～18范围内、与现有技术中已有使用的非离子表面活性剂分子结构不同的一类非离子表面活性剂，并配以适量阳离子表面活性剂作为助溶剂，在酸性低渗环境下，达到了一定浓度的该组合溶血剂溶血效果好，且对白细胞形态影响较小，便于采用VCS分析技术的血液分析仪进行自动化分析，得到准确的白细胞分类计数。与Beckman Coulter公司生产的标准溶血剂的测定结果比较，相关性好、准确度高。特别是当血液标本出现异常细胞时，报警的灵敏度高、特异性好，显示了最有益的效果。这是现有技术没有达到的效果，也是本发明溶血剂的亮点，是研制试剂比较高的境界。
【附图说明】
【附图说明】
[0091] 图1是本发明实施例1制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0092] 图2是本发明实施例2制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0093] 图3是本发明实施例3制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0094] 图4是本发明实施例4制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0095] 图5是本发明实施例5制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0096] 图6是本发明实施例6制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的散点图。
[0097] 图7是本发明实施例2制备的溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的结果图。
[0098] 图8是Beckman Coulter公司生产的标准溶血剂对白细胞进行五类细胞分析的结果图。【具体实施方式】
[0099] 实施例1：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0100] 溶血剂A的制备：
[0101] 用分析天平分别准确称取3.0重量份聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、5.0重量份甲酸、1.0重量份十四烷基三甲基氯化铵、5.0重量份EDTA钾盐、1.0重量份氯化钠。在三角烧瓶中先加入上述的十四烷基三甲基氯化铵和EDTA钾盐，再加入适量的温度40℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入上述的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯搅拌，溶解后冷却至20℃，加入有机酸甲酸调节pH值至2.90±0.1，最后加入预先溶解的氯化钠溶液将其渗透压调节至60±5mOsm/Kg。
[0102] 溶血剂B的制备：
[0103] 用分析天平分别准确称取4.0重量份硫酸钠和80.0重量份碳酸钠。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂硫酸钠(约90％量)和碱性无机盐碳酸钠(约90％量)，加入适量的温度50℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至20℃后，再加入余下碳酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至10.5±0.2，最后加入余量的硫酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至1050±15mOsm/Kg。
[0104] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图1。其中中性粒细胞60.8％、淋巴细胞27.2％、单核细胞8.1％、嗜酸性粒细胞2.9％、嗜碱性粒细胞1.0％。
[0105] 实施例2：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0106] 溶血剂A的制备：
[0107] 分别用分析天平准确称取10.0重量份聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、1.0重量份柠檬酸、5.0重量份十二烷基三甲基溴化铵、1.0重量份EDTA钾盐、4.0重量份氯化钾。在三角烧瓶中先加入上述的十二烷基三甲基溴化铵和EDTA钾盐，再加入适量的温度42℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯搅拌，溶解后冷却至24℃，加入有机酸柠檬酸调节pH值至4.5±0.1，最后加入预先溶解的氯化钾溶液将其渗透压调节至100±3mOsm/Kg。
[0108] 溶血剂B的制备：
[0109] 用分析天平分别准确称取10.0重量份氯化钾和35.0重量份磷酸氢二钾。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂氯化钾(约90％量)和碱性无机盐磷酸氢二钾(约90％量)，加入适量的温度48℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至25℃后，再加入余下磷酸氢二钾(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至11.5±0.2，最后加入余量的氯化钾(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至950±15mOsm/Kg。
[0110] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图3。其中中性粒细胞62.6％、淋巴细胞26.6％、单核细胞7.3％、嗜酸性粒细胞2.7％、嗜碱性粒细胞0.8％。
[0111] 实施例3：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0112] 溶血剂A的制备：
[0113] 分别用分析天平准确称取8.0重量份聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、1.5重量份乙酸、4.1重量份十六烷基三甲基氯化铵、1.6重量份EDTA钠盐、3.5重量份氯化钠。在三角烧瓶中先加入上述的十六烷基三甲基氯化铵和EDTA钠盐，再加入适量的温度50℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯搅拌，溶解后冷却至25℃，加入有机酸乙酸调节pH值至2.0±0.1，最后加入预先溶解的硫酸钠溶液将其渗透压调节至80±3mOsm/Kg。
[0114] 溶血剂B的制备：
[0115] 用分析天平分别准确称取8.0重量份氯化钠和40.0重量份硼酸钠。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂氯化钠(约90％量)和碱性无机盐硼酸钠(约90％量)，加入适量的温度48℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至25℃后，再加入余下硼酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至11.5±0.2，最后加入余量的氯化钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至900±15mOsm/Kg。
[0116] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图2。其中中性粒细胞61.9％、淋巴细胞26.5％、单核细胞7.6％、嗜酸性粒细胞3.2％、嗜碱性粒细胞0.8％。
[0117] 实施例4：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0118] 溶血剂A的制备：
[0119] 用分析天平分别准确称取4.0重量份聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、4.0重量份甲酸、1.5重量份十四烷基三甲基氯化铵、4.2重量份EDTA钾盐、1.5重量份氯化钠。在三角烧瓶中先加入上述的十四烷基三甲基氯化铵和EDTA钾盐，再加入适量的温度42℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入上述的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯搅拌，溶解后冷却至21℃，加入有机酸甲酸调节pH值至5.0±0.1，最后加入预先溶解的氯化钠溶液将其渗透压调节至30±3mOsm/Kg。
[0120] 溶血剂B的制备：
[0121] 用分析天平分别准确称取4.5重量份硫酸钠和70.0重量份碳酸钠。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂硫酸钠(约90％量)和碱性无机盐碳酸钠(约90％量)，加入适量的温度42℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至21℃后，再加入余下碳酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至10.5±0.2，最后加入余量的硫酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至800±15mOsm/Kg。
[0122] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图4。其中中性粒细胞61.2％、淋巴细胞28.2％、单核细胞6.5％、嗜酸性粒细胞3.4％、嗜碱性粒细胞0.7％。
[0123] 实施例5：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0124] 溶血剂A的制备：
[0125] 分别用分析天平准确称取4.5重量份聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、3.5重量份乙酸、2.1重量份十六烷基三甲基氯化铵、3.5重量份EDTA钠盐、1.8重量份硫酸钠。在三角烧瓶中先加入上述的十六烷基三甲基氯化铵和EDTA钠盐，再加入适量的温度46℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯搅拌，溶解后冷却至23℃，加入有机酸乙酸调节pH值至3.0±0.1，最后加入预先溶解的硫酸钠溶液将其渗透压调节至50±3mOsm/Kg。
[0126] 溶血剂B的制备：
[0127] 用分析天平分别准确称取4.9重量份氯化钠和45.0重量份硼酸钠。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂氯化钠(约90％量)和碱性无机盐硼酸钠(约90％量)，加入适量的温度48℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至25℃后，再加入余下硼酸钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至11.5±0.2，最后加入余量的氯化钠(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至1000±15mOsm/Kg。
[0128] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图5。其中中性粒细胞59.1％、淋巴细胞29.4％、单核细胞7.6％、嗜酸性粒细胞3.0％、嗜碱性粒细胞0.9％。
[0129] 实施例6：本发明血液白细胞五分类计数溶血剂的制备
[0130] 溶血剂A的制备：
[0131] 分别用分析天平准确称取6.0重量份聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、1.9重量份柠檬酸、3.6重量份十二烷基三甲基溴化铵、2.0重量份EDTA钾盐、2.8重量份氯化钾。在三角烧瓶中先加入上述的十二烷基三甲基溴化铵和EDTA钾盐，再加入适量的温度44℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；然后加入聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯搅拌，溶解后冷却至22℃，加入有机酸柠檬酸调节pH值至4.0±0.1，最后加入预先溶解的氯化钾溶液将其渗透压调节至50±3mOsm/Kg。
[0132] 溶血剂B的制备：
[0133] 用分析天平分别准确称取6.8重量份氯化钾和60.0重量份磷酸氢二钾。在三角烧瓶中先加入渗透压调节剂氯化钾(约90％量)和碱性无机盐磷酸氢二钾(约90％量)，加入适量的温度44℃重蒸馏水(水的电阻ρ＞10MΩ/cm)搅拌使其溶解；冷却至22℃后，再加入余下磷酸氢二钾(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其pH调节至10.5±0.2，最后加入余量的氯化钾(预先用所述重蒸馏水溶解)溶液将其渗透压调节至1200±15mOsm/Kg。
[0134] 使用临床新鲜全血EDTA-K2抗凝样本与本实施例制备的溶血剂，在贝克曼LH750全自动血液分析仪上进行测定。该溶血剂均可将白细胞分成五个细胞群，分别为中性粒细胞(紫红色)、淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(绿色)、嗜酸性细胞(橘黄色)和嗜碱性细胞(白色)，其结果见图6。其中中性粒细胞60.2％、淋巴细胞28.1％、单核细胞7.8％、嗜酸性粒细胞2.8％、嗜碱性粒细胞1.1％。
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