白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法
阅读：769发布：2020-05-12
专利汇可以提供白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种白细胞分类计数 试剂 ，所述试剂包括：(1)选自如下通式I和II的花菁类阳 离子化 合物；(2)如下通式III、IV和/或V表示的阳离子 表面活性剂 ；和(3)至少一种非离子表面活性剂。本发明还公开包含所述白细胞分类计数试剂的 试剂盒 。本发明还公开了所述试剂和试剂盒用于白细胞分类计数的方法。利用本发明所公开的试剂、试剂盒和方法，可以在很短时间内快速地将白细胞进行五种亚类识别，至少进行四分类计数，并区分出未成熟细胞和异常细胞。，下面是白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法专利的具体信息内容。
1.一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：
(1)选自如下通式I和II的花菁类阳离子化合物：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：
卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
-
Y 为负离子；
或者
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
R5’为C1-18烷基或者H；
R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Y-为负离子；
(2)阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂为通式III和/或IV的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂：
其中
R1和R2分别独立选自C6-18烷基和C6-18卤代烷基；
R3～R16分别独立选自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基和磺酸基；
Z-为卤素离子；
和/或
通式V的季铵盐型阳离子表面活性剂，
其中
R1为C6-14烷基或C6-14链烯基，优选选自己基、辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基，特别优选选自辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基；
R2为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
R3为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
R4为C1-4烷基或C2-4链烯基或苄基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基或苄基，特别优选甲基、乙基或丙基；
-
Z 为卤素离子；
(3)至少一种非离子表面活性剂；和
(4)至少一种带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物。
2.权利要求1的试剂，其中所述通式I的化合物选自：
所述通式II的化合物选自：
3.权利要求1-2中任一项的试剂，其中所述阳离子表面活性剂选自辛基溴化喹啉鎓、辛基溴化异喹啉鎓、癸基溴化喹啉鎓、癸基溴化异喹啉鎓、十二烷基溴化喹啉鎓、十二烷基溴化异喹啉鎓、十四烷基溴化喹啉鎓、十四烷基溴化异喹啉鎓、辛基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵以及组合。
4.权利要求1-3中任一项的试剂，其中所述非离子表面活性剂为选自具有如下通式VI结构的聚氧乙烯类非离子表面活性剂的至少一种或其组合，
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
VI
其中
R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
R2为-O-、 或-COO-；
n为8到30的整数。
5.权利要求4的试剂，其中所述非离子表面活性剂选自十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚及其组合。
6.权利要求1-5中任一项的试剂，其中所述带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物选自甲酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、苹果酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、α-萘磺酸、牛磺酸以及它们的碱金属盐。
7.权利要求1-6中任一项的试剂，所述试剂任选还含有至少一种醇类化合物。
8.权利要求7的试剂，其中所述醇类化合物选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、苯甲醇和
2-苯氧基乙醇。
9.一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-8中任一项的白细胞分类计数试剂，所述试剂可以是单成分试剂体系，也可以是两个以上试剂成分的试剂体系。
10.一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将血液样本加入到权利要求1-8中任一项的试剂或权利要求9的试剂盒中的试剂中混合反应，以溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质进行荧光标记；
(2)通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，将血液样本中白细胞进行分类计数。
11.权利要求10的方法，所述方法可以识别出白细胞中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞5个亚类；至少将白细胞分成与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团，并对所述各集团中所含细胞数目进行计数。
12.权利要求11的方法，所述方法还能够识别出未成熟细胞和/或异常细胞。
13.一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：
(1)选自如下通式I和II的花菁类阳离子化合物：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：
卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
-
Y 为负离子；
或者
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
R5’为C1-18烷基或者H；
R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Y-为负离子；
(2)阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂为通式III和/或IV的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂：
其中
R1和R2分别独立选自C6-18烷基和C6-18卤代烷基；
R3～R16分别独立选自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基和磺酸基；
-
Z 为卤素离子；
和/或
通式V的季铵盐型阳离子表面活性剂，
其中
R1为C6-14烷基或C6-14链烯基，优选选自己基、辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基，特别优选选自辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基；
R2为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
R3为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
R4为C1-4烷基或C2-4链烯基或苄基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基或苄基，特别优选甲基、乙基或丙基；
Z-为卤素离子；和
(3)至少一种非离子表面活性剂。
14.权利要求13的试剂，其中所述通式I的化合物选自：
所述通式II的化合物选自：
15.权利要求13-14中任一项的试剂，其中所述阳离子表面活性剂选自辛基溴化喹啉鎓、辛基溴化异喹啉鎓、癸基溴化喹啉鎓、癸基溴化异喹啉鎓、十二烷基溴化喹啉鎓、十二烷基溴化异喹啉鎓、十四烷基溴化喹啉鎓、十四烷基溴化异喹啉鎓、十六烷基溴化喹啉、十六烷基溴化异喹啉、辛基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵以及组合。
16.权利要求13-15中任一项的试剂，其中所述非离子表面活性剂为选自具有如下通式VI结构的聚氧乙烯类非离子表面活性剂的至少一种或其组合，
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
VI
其中
R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
R2为-O-、 或-COO-；
n为8到30的整数。
17.权利要求16的试剂，其中所述非离子表面活性剂选自十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚及其组合。
18.权利要求13-17中任一项的试剂，所述试剂任选还含有至少一种醇类化合物。
19.权利要求18的试剂，其中所述醇类化合物选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、苯甲醇和2-苯氧基乙醇。
20.一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求13-19中任一项的白细胞分类计数试剂，所述试剂可以是单成分试剂体系，也可以是两个以上试剂成分的试剂体系。
21.一种白细胞分类计数试剂的制备方法，所述方法包括，将权利要求1-8以及13-19中任一项的试剂成分溶于水中，成为单成分试剂体系；或者将权利要求1-8以及13-19中任一项的试剂成分中的花菁类阳离子化合物溶于有机溶剂，其他成分溶于水中，成为两个以上试剂成分的试剂体系。
白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及血液细胞分类计数试剂及血液细胞分类计数方法，更具体地讲，本发明涉及用于对白细胞进行分类计数的血液分析试剂、包含所述试剂的试剂盒及采用所述试剂或试剂盒进行白细胞分类计数的方法。
背景技术
[0002] 人体血液的细胞大致分为三类：红细胞、白细胞和血小板，其中白细胞又可以分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞(包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞)五个亚类。血细胞在骨髓中生成，从未成熟细胞分化、成熟后再进入末梢血液发挥各自功能。正常健康人的末梢血中的白细胞的各个亚类的比例是恒定的，当人体出现一些疾病时，就会表现出某一类白细胞数量的增大或减小。此外，在正常健康人的静脉血中并不会出现一些未发育成熟的DNA含量比正常白细胞高的未成熟白细胞(immature leukocyte)，而在患有白血病、癌症骨髓转移和重症感染症等病人的静脉血中则往往会出现未成熟白细胞，常见的是幼稚粒细胞；而在被病毒如肝炎病毒、巨细胞病毒等感染的病人的静脉血中往往会出现一些异常细胞，常见的为异常淋巴细胞等。因此在临床检验领域，用患者血液对白细胞进行分类计数，并检测出未成熟白细胞及异常细胞的有无及计数，以此对某些病症进行筛查是极其常见并且是非常重要的。
[0003] 现在，医院多采用自动血细胞分析仪对白细胞进行分类计数。从检测手段来看，白细胞的分类计数方法主要分为阻抗法和激光流式法两类，而其他的一些检测手段如射频、直流电等技术则应用较少。白细胞的两分群、三分群一般都采用阻抗法，而对于五分类和其他异常形态白细胞的识别则普遍采用激光流式法，通过测定多角度散射光、荧光染料标记的荧光量、抗原抗体标记的量以及其各种组合来对白细胞进行分类。
[0004] 在医院对病人血液样本进行分析处理时，从病人体内采集新鲜抗凝血样后，有时会放置一段时间后进行分析，有时会对放置较长时间的病人血样进行复检。随着放置时间的延长，新鲜血样逐渐老化，而同一血样的新鲜血和老化血之间细胞形态会出现一些变化，往往会造成老化血的白细胞分类计数可信度降低。
[0005] 中国专利CN95115317.x公开了一种通过两种试剂对白细胞进行五分类的方法。其中第一试剂含有带阴离子的有机化合物如酸性色素，将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞加中性粒细胞四类，第二试剂将血细胞分成嗜碱性粒细胞和其他细胞类群。该方法通过综合这两种结果对白细胞分成五类。检测时采用激光散射法。采用本方法对嗜碱性粒细胞进行分类时需要较长的稳定时间，至少要120秒后才能测定，这样会限制仪器的检测速度。此外本方法无法很好的对于未成熟白细胞进行识别和计数。
[0006] 美国专利3883247是一篇白细胞五分类方法专利，通过异染色质荧光染料如吖啶橙对白细胞核酸进行染色，通过不同的白细胞亚类红色和绿色荧光量的差异来对白细胞进行分类。该方法采用的吖啶橙对人体毒性较大，容易污染环境。该方法的另一个不足是其所需要的染色时间比较长，需要几十秒到几分钟，这就会限制仪器的检测速度。
[0007] 美国专利4882284是一篇白细胞五分类方法专利，采用非溶血的方法通过噁嗪类荧光染料对血细胞中的各种细胞进行染色，然后通过不同细胞的前向散射光、侧向散射光和红色荧光强度来对白细胞进行分类。采用该方法时，由于同时需要测定红细胞、白细胞和血小板，则一些异常红细胞如大红细胞等会影响白细胞准确计数。
[0008] 申请号88101677，审定号为CN1018586B的中国专利是一篇白细胞五分类方法和试剂系统专利。该专利先采用酸性溶血剂对红细胞进行充分溶解并保持白细胞完整，再通过碱性盐溶液抑制过度溶解并对白细胞进行分类。其检测系统采用光散射或者射频/直流电法。用此方法不能很好区分出未成熟白细胞与正常白细胞。此外该专利进行分类的最适反应条件为常温，而实际测定时外界环境温度往往会发生变化，测量结果也会随之产生波动，导致分类计数准确性降低，根据此方法，为了保持温度恒定在室温从而消除温度对反应的影响，就需要在仪器中同时添加制冷和加热装置，这样会大大增加仪器成本。
[0009] 中国专利CN97123137.0是一篇早幼白细胞分类计数的方法专利，该专利采用含有非离子表面活性剂和氨基酸的溶血剂对血样进行处理，使早幼白细胞保持生存状态而使其他白细胞损伤，通过荧光染料对上述白细胞进行染色从而精确对早幼白细胞和白细胞进行分类计数。但该方法只能将白细胞分成淋巴、单核和粒细胞三类，无法对白细胞进行五分类。
发明内容
[0010] 本发明一方面提供了一种白细胞分类计数试剂，所述试剂包括：
[0011] (1)选自如下通式I和II的花菁类阳离子化合物：
[0012]
[0013] 其中
[0014] n为1、2或3；
[0015] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0016] R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
[0017] R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
[0018] R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0019] R5为H或C1-18烷基；
[0020] Y-为负离子；
[0021] 或者
[0022]
[0023] 其中
[0024] n为1、2或3；
[0025] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0026] R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
[0027] R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
[0028] R5’为C1-18烷基或者H；
[0029] R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0030] Y-为负离子；
[0031] (2)阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂为通式III和/或IV的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂：
[0032]
[0033] 其中
[0034] R1和R2分别独立选自C6-18烷基和C6-18卤代烷基；
[0035] R3～R16分别独立选自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基和磺酸基；
[0036] Z-为卤素离子；
[0037] 和/或
[0038] 通式V的季铵盐型阳离子表面活性剂，
[0039]
[0040] 其中
[0041] R1为C6-14烷基或C6-14链烯基，优选选自己基、辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基，特别优选选自辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基；
[0042] R2为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0043] R3为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0044] R4为C1-4烷基或C2-4链烯基或苄基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基或苄基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0045] Z-为卤素离子；和
[0046] (3)至少一种非离子表面活性剂。
[0047] 在本发明另一方面，所述白细胞分类计数试剂还包含至少一种带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物。
[0048] 本发明另一方面提供了一种用于白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一项实施方案的白细胞分类计数试剂，所述试剂可以是单成分试剂体系，也可以是两个以上试剂成分的试剂体系。
[0049] 本发明又一方面提供了一种白细胞分类计数试剂的制备方法，所述方法包括，将本发明任一项实施方案的试剂成分溶于水中，成为单成分试剂体系；或者将其中的花菁类阳离子化合物溶于有机溶剂，其他成分溶于水中，成为两个以上试剂成分的试剂体系。
[0050] 本发明还一方面提供了一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将血液样本加入到本发明任一项实施方案的试剂中或加入到本发明所提供的试剂盒所含的试剂中混合反应一段时间，以溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质进行荧光标记；(2)通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，将血液样本中白细胞进行分类计数。
[0051] 利用本发明各实施方案所公开的试剂、试剂盒和方法，可以在很短时间内快速地将白细胞进行五种亚类识别，至少进行四分类计数，并区分出未成熟细胞和异常细胞，如幼稚粒细胞、异常淋巴细胞等。另外，由于反应温度在20-50℃之间，都能保证分类结果的稳定。因此在实际应用中只需要在检测仪器中安装加热装置就可以保证反应的恒温，不用安装制冷装置，这样可以大大节约仪器成本。采用本发明公开的试剂和方法对白细胞进行分类时，对离体保存二到三天的老化血的白细胞分类处理效果仍然很好，而且受环境温度的影响很小，适用范围更加广泛。附图说明
[0052] 图1是本发明测定方法中使用的细胞分析仪的光学系统示意图。
[0054] 图3是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例2)
[0055] 图4是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例3)
[0056] 图5A-E本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂对白细胞进行分类计数测定值与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性(实施例4)
[0057] 图6A-F是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图，其中(A)、(B)、(C)分别为未加入醇类的试剂E对保存时间为4小时、36小时、72小时的血液样本测定结果；图6(D)、(E)、(F)分别为加入醇类的试剂F对保存时间为4小时、36小时、72小时的血液样本测定结果(实施例5)。
[0058] 图7是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例6)
[0059] 图8是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例7)
[0060] 图9是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例8)
[0061] 图10是使用本发明一个实施方案的白细胞分类计数试剂测定血液的侧向散射光强度和侧向荧光强度信号所生成的散点图(实施例9)
具体实施方式
[0062] 定义
[0063] 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0064] 本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。
例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
[0065] 本文中使用的术语“烷氧基”是指与基团-O-结合的上述定义的“烷基”，其中所述“烷基”包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
[0066] 本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
[0067] 本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0068] 本文中使用的术语“杂环基”是指包含3-14、优选3-10、更优选3-6个环成员并包含一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子的单环或稠环体系。
[0069] 本文中使用的术语“芳基”是指包含4-20，优选5-10个碳原子，并且符合4n+2电荷规则的芳香族基团。
[0070] 本文中使用的术语“识别”是指通过荧光和散射光信息的差异将五个白细胞亚类(单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、未成熟或异常细胞中的某一类细胞与其他类细胞区分开来。
[0071] 本文中使用的术语“分类计数”是指通过荧光和散射光信息的差异至少将白细胞分成与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团共计四个集团，并对各集团中的细胞数目进行计数。
[0072] 本发明的白细胞分类计数试剂
[0073] 本发明一方面提供了一种白细胞快速分类计数试剂，所述试剂可以对血液样本白细胞实现五种亚类识别的试剂，至少实现四分类计数。所述五种亚类是指单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；所述四分类计数是指将白细胞分成与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团共计四个集团，并对各集团中的细胞数目进行计数。另外本发明的试剂还可以识别未成熟或异常细胞，这些未成熟或异常细胞主要是正常血液中很少出现的，包括未成熟粒细胞、异常淋巴细胞、异型淋巴细胞等。
[0074] 所述试剂包括：
[0075] (1)选自如下通式I和II的花菁类阳离子化合物：
[0076]
[0077] 其中
[0078] n为1、2或3；
[0079] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0080] R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
[0081] R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
[0082] R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0083] R5为H或C1-18烷基；
[0084] Y-为负离子；
[0085] 或者
[0086]
[0087]
[0088] 其中
[0089] n为1、2或3；
[0090] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0091] R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
[0092] R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；
[0093] R5’为C1-18烷基或者H；
[0094] R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0095] Y-为负离子；
[0096] (2)阳离子表面活性剂，所述阳离子表面活性剂为通式III和/或IV的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂：
[0097]
[0098] 其中
[0099] R1和R2分别独立选自C6-18烷基和C6-18卤代烷基；
[0100] R3～R16分别独立选自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基和磺酸基；-
[0101] Z 为卤素离子；
[0102] 如/或
[0103] 通式V的季铵盐型阳离子表面活性剂，
[0104]
[0105] 其中
[0106] R1为C6-14烷基或C6-14链烯基，优选选自己基、辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基，特别优选选自辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基；
[0107] R2为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0108] R3为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0109] R4为C1-4烷基或C2-4链烯基或苄基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基或苄基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0110] Z-为卤素离子；和
[0111] (3)至少一种非离子表面活性剂
[0112] 在一方面，所述白细胞分类计数试剂还包含至少一种带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物。
[0113] 1.花菁类阳离子化合物
[0114] 本发明的试剂应包含至少一种花菁类阳离子化合物，这类阳离子化合物是一类能与细胞内核酸类物质(包括DNA、RNA、以及类似性质细胞器)特异性结合，并在633nm到650nm波长范围内的红色激光照射下激发出荧光的花菁类阳离子型荧光染料，不同类型细胞由于细胞内部核酸类物质量的不同从而在荧光强度上产生差异，并能通过荧光信号强度加以放大和识别。
[0115] 可用于本发明的花菁类阳离子化合物为具有以下通式I或II的化合物。
[0116]
[0117] 其中
[0118] n为1、2或3；
[0119] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0120] R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
[0121] R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
[0122] R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0123] R5为H或C1-18烷基；
[0124] Y-为负离子。
[0125] 优选n为1或2，更优选n为1。
[0126] 优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X为S。
[0127] 优选R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基或卤素；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-18烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-12烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R1和R2均为H。
[0128] 优选R3为H、C1-18烷基、OR5、COOR5或卤素；更优选R3为H、C1-12烷基、OR5、COOR5或卤素；最优选R3为H、C1-6烷基、OR5、COOR5或卤素。
[0129] 优选R4为C1-18烷基、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选R4为C1-18烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；最优选R4为C1-6烷基或苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0130] 优选R5为H或C1-12烷基，更优选R5为H或C1-6烷基。
[0132] 上述具有通式I结构的化合物的具体可为如下的化合物A、化合物B或化合物C。
[0133]
[0134]
[0135] 通式I化合物及其制备方法已在申请号为200710137258.6中国专利申请中公开，在此通过引用将其全文结合于此。
[0136] 或者
[0137]
[0138] 其中
[0139] n为1、2或3；
[0140] X为C(CH3)2、O、S或Se；
[0141] R1’和R2’各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5’、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
[0142] R3’、R4’各自独立选自C1-18烷基COOR6’、C1-18烷基OR6’、苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基，条件是R3’和R4’不同时为苄基，且R3’为苄基时R4’不为C1-18烷基OR6’；；
[0143] R5’为C1-18烷基或者H；
[0144] R6’为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
[0145] Y-为负离子。
[0146] 优选n为1或2，更优选n为1。
[0147] 优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X为S。
[0148] 优选R1’和R2’各自独立选自H或C1-18烷基；更优选R1’和R2’各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R1’和R2’均为H。
[0149] 优选R3’和R4’各自独立选自C1-8烷基COOR6’、C1-8烷基OR6’、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R3’和R4’各自独立选自C1-6烷基COOR6’、C1-6烷基OR6’、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
[0150] 优选R5’为H或C1-12烷基，更优选R5’为H或C1-6烷基。
[0151] 优选R6’为C1-6烷基或者苯基，所述苯基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代。
[0152] Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离- - - -子，例如卤素离子、ClO4、PF6、CF3SO3、BF4、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
[0153] 上述具有通式II结构的化合物具体可为如下的化合物D、化合物E或化合物F。
[0154]
[0155]
[0156] 通式II化合物及其制备方法已在申请号为200810002503.7中国专利申请中公开，在此通过引用将其全文结合于此。
[0157] 本发明化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式I或式II化合物的衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
[0158] 典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。
[0159] 上述化合物在本发明各实施方案中的合适浓度范围在0.002ppm到2000ppm，优选的浓度范围为0.02ppm到200ppm，更优选的浓度为0.2ppm到20ppm。
[0160] 由于上述化合物在非水溶剂中稳定性更好，因此优选将它们与本发明所公开的试剂中的水溶性组分分开保存。在本文中所使用的术语水溶性组分是指本发明的白细胞分类计数试剂中包括阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂以及阴离子化合物等的组分。
[0161] 2.阳离子表面活性剂
[0162] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂包含阳离子表面活性剂，主要起溶血剂作用，用于溶解红细胞和血小板，并对白细胞膜进行部分损伤，使染料能快速进入细胞并于细胞内核酸物质结合。
[0163] 所述的阳离子表面活性剂为通式III和/或IV的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂：
[0164]
[0165] 其中
[0166] R1和R2分别独立选自C6-18烷基和C6-18卤代烷基；
[0167] R3～R16分别独立选自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基和磺酸基；
[0168] Z-为卤素离子；
[0169] 和/或
[0170] 通式V的季铵盐型阳离子表面活性剂，
[0171]
[0172] 其中
[0173] R1为C6-14烷基或C6-14链烯基，优选选自己基、辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基，特别优选选自辛基、癸基、月桂基或十四烷基的直链烷基；
[0174] R2为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0175] R3为C1-4烷基或C2-4链烯基，优选甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0176] R4为C1-4烷基或C2-4链烯基或苄基，优选甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基或苄基，特别优选甲基、乙基或丙基；
[0177] Z-为卤素离子。
[0178] 优选可用于本发明的喹啉鎓盐型阳离子表面活性剂选自辛基溴化喹啉鎓、辛基溴化异喹啉鎓、癸基溴化喹啉鎓、癸基溴化异喹啉鎓、十二烷基溴化喹啉鎓、十二烷基溴化异喹啉鎓、十四烷基溴化喹啉鎓、十四烷基溴化异喹啉鎓以及组合；
[0179] 优选可用于本发明的季铵盐型阳离子表面活性剂选自辛基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵以及组合。
[0180] 上述阳离子表面活性剂的浓度范围可在0.1g/L到5.0g/L之间，由于所用物质不同而不同。对于上述阳离子表面活性剂来说，其溶血能力的大小与通式III中R1、通式IV中R2、通式V中R1的链长度是成正相关的，C原子数越多，溶血能力越强，所需要的浓度就越低。在本发明中的最佳的阳离子表面活性剂浓度对应的溶血能力只要能将红细胞和血小板充分溶解成细胞碎片，并将白细胞膜部分损伤，使染料能充分进入细胞的程度即可，最好使用远远小于使白细胞裸核时的用量。
[0181] 3.非离子表面活性剂
[0182] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂包含至少一种非离子表面活性剂，用于损伤白细胞，并能够固缩细胞内部物质，放大不同白细胞亚类内部结构的散射光强度差异。所述非离子表面活性剂为选自具有如下通式VI结构的聚氧乙烯类非离子表面活性剂的至少一种或其组合，
[0183] R1-R2-(CH2CH2O)n-H
[0184] VI
[0185] 其中
[0186] R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
[0187] R2为-O-、 或-COO-；
[0188] n为8到30的整数。
[0189] 所述非离子表面活性剂具体可选自十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚及其组合。
[0190] 所述聚氧乙烯类非离子表面活性剂的浓度基于所用物质的不同而不同，可在例如0.5g/L至5g/L的较大范围内变化。对于上述聚氧乙烯类非离子表面活性剂来说，其对细胞的损伤能力大小与通式VI结构中R1和R2的链长度，及聚氧乙烯的聚合数n都有关系。具体来说，当聚氧乙烯的聚合数n一定时，R1和R2的所代表的疏水基团的C原子数越多，对细胞的损伤能力越弱，所需要的浓度就越大；当R1和R2的所代表的疏水基团的C原子数一定时，聚氧乙烯的聚合数n越大对细胞的损伤能力越弱，所需要的浓度就越大。
[0191] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂所包含的非离子表面活性剂可以为一种非离子表面活性剂或者两种及其以上的非离子表面活性剂的组合。由于不同非离子表面活性剂对不同白细胞亚类的损伤效果不一样，如果将两种及其以上的非离子表面活性剂组合使用，对某些血液样本的白细胞亚类的分类效果会更加明显。对于两种及其以上的非离子表面活性剂的组合中其中每种非离子表面活性剂的浓度来说，采用上面所提到的单一非离子表面活性剂的浓度范围并使整体效果达到最佳即可。
[0192] 4.带有一个或多个羧基或磺酸基的阴离子化合物
[0193] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂包含任选包含一种阴离子化合物，用于与细胞内阳离子结合从而导致白细胞亚类内部散射光强度发生变化。所述阴离子化合物选自带有羧基或者磺酸基的酸及其盐。
[0194] 所述阴离子化合物可以是带有一个或者多个羧基的羧酸及其盐。对于带有一个羧基的羧酸及其盐，优选选自甲酸及其碱金属盐、乙酸及其碱金属盐、苯甲酸及其碱金属盐等；对于带有多个羧基的羧酸及其盐，优选选自柠檬酸及其碱金属盐、苹果酸及其碱金属盐、邻苯二甲酸及其碱金属盐等。
[0196] 对于上述阴离子化合物的浓度范围来说，以能达到较好在散射光强度上达到区分出白细胞亚类的效果为佳，其浓度可以在0.1g/L到20g/L，优选1g/L到5g/L，也可以根据种类作适当调整。
[0197] 5.醇类化合物
[0198] 本发明所公开的白细胞分类试剂还任选包含醇类化合物。虽然不受任何理论的约束，但认为醇类化合物的存在有助于固缩细胞内部蛋白类物质，防止白细胞内部细胞质过度流失，保护白细胞膜不被溶血剂过度破坏，维持白细胞一定的形态和内部结构。这尤其有助于维持老化血中的白细胞内部蛋白物质的固定，维持散射光强度，保持老化血的白细胞分类效果。所述的醇类对种类没有特别要求，甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等烷基醇类和苯甲醇、2-苯氧基乙醇等带有芳香环的醇类均可。
[0199] 实验表明，血液离体后，血细胞仍能继续代谢，不断消耗样本中的氧及不断产生乳酸等酸性代谢产物，但这种代谢由于离开活体组织，细胞没有分裂再生能力，故随着时间的延长，血细胞内部蛋白、核酸等物质的代谢逐渐失衡，细胞逐渐老化。同一血样的老化血与新鲜血相比，其白细胞亚类的形态和内部结构都会发生一定变化。而采用本发明的白细胞分类计数试剂，由于含有一定浓度范围的醇类，对一定程度的老化血液的处理达到类似新鲜血液的效果，使老化血的各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内，这样，临床需求复检时，仍可以进行白细胞分类，并保持较准确计数。虽然具体机理未知，但推测可能是由于醇类具有使蛋白质变性的作用，使得老化血细胞较脆弱的细胞膜以及内部蛋白物质等得到一定程度的固定，抑制了阳离子表面活性剂等溶血剂组分对其的过度损伤，使得老化血液的处理结果与新鲜血液的处理结果类似。
[0200] 所述醇类化合物的浓度随着其结构中碳原子数的增加而降低来说，可在0.1g/L-200g/L的较大范围内变化。
[0201] 6.其他成分
[0202] 本发明所公开的白细胞分类计数试剂还可以包含有缓冲剂，以将试剂的pH维持在6到8左右。对于缓冲剂的选择没有特殊的要求，常见的缓冲系统如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等都可以用于本发明。缓冲剂的使用量通常在10-500mM。
[0203] 本发明白细胞分类计数试剂还可以包含有其他常规添加剂，如防腐剂、金属螯合剂等，以有助于试剂的防腐和长期保存。对于防腐剂的种类没有特殊的要求，市场上常见的防腐剂如凯松、庆大霉素均可；金属螯合剂可以选择乙二铵四乙酸及其碱金属盐。这些添加剂的浓度以不影响白细胞分类计数为宜。
[0204] 本发明的白细胞分类计数试剂的渗透压优选10mOsm到100mOsm之间。采用这一较低的渗透压有助于溶解红细胞和血小板，从而可以采用较低的溶血剂组分含量。
[0205] 本发明的用于白细胞分类计数的试剂盒
[0206] 本发明还有一个方面为用于白细胞分类计数试剂的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所公开的白细胞分类计数试剂。所述试剂盒可用于处理血液样本，并对血液样本中白细胞实现五种亚类识别并至少实现四种分类计数。
[0207] 在所述试剂盒中，所述试剂可以是单成分试剂体系，也可以是两个以上试剂成分的试剂体系。
[0208] 由于用于本发明试剂的花菁类阳离子化合物在非水溶剂中稳定性更好，因此优选将它们与本发明所公开的试剂中的水溶性组分分开保存。优选将所述花菁类阳离子化合物保存在有机溶剂中。对于有机溶剂来说，只要其能充分溶解所述花菁类阳离子化合物并在水中有一定溶解度即可，没有其它特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油，二甲亚砜等均可。
[0209] 所述花菁类阳离子化合物在有机溶剂中的保存浓度只要能保证化合物充分溶解并且不低于其最终使用浓度即可。通常情况下花菁类阳离子化合物在有机溶剂中的保存浓度的范围在0.01ppm到1000ppm为宜，优选1ppm到100ppm。
[0210] 在本公开中，也将所述水溶性组分称为“溶血剂”，将花菁类阳离子化合物类所在的组分称为“染色液”。使用本发明所述的试剂盒时，将染色液与溶血剂及血液样本按照一定体积比混合一段时间后再进行检测。对于所述染色液与溶血剂的体积比没有特别的限制，通常按照1∶10到1∶100的比例进行混合，优选1∶40到1∶60的比例。
[0211] 白细胞分类计数试剂的制备方法
[0212] 本发明公开了一种白细胞分类计数试剂的制备方法，所述方法包括，将本发明任一项实施方案的试剂成分溶于水中，成为单成分试剂体系；或者将其中的花菁类阳离子化合物溶于有机溶剂，其他成分溶于水中，成为两个以上试剂成分的试剂体系。对于有机溶剂来说，只要其能充分溶解所述花菁类阳离子化合物并在水中有一定溶解度即可，没有其它特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油，二甲亚砜等均可。
[0213] 对白细胞分类计数的方法
[0214] 本发明另一方面提供了一种对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括如下步骤：
[0215] 1将血液样本加入到本发明所公开的白细胞分类计数试剂中混合反应一段时间，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态变化，对白细胞内部核酸物质采用荧光染料进行标记。
[0216] 2通过测定白细胞的荧光强度信息和散射光强度信息，可以识别出血液样本中白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞5个亚类；至少实现四分类计数，即与单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞分别对应的三个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞对应的一个集团，对所述集团内所含细胞数目进行计数；并能够在荧光强度和散射光强度的散点图上一定位置作为未成熟细胞如幼稚粒细胞、异常细胞如异常淋巴细胞的识别区域，从而识别出这些未成熟或异常细胞。
[0217] 所述的混合反应时间在5-30秒内即可，优选15秒-25秒。由于本发明所公开的试剂能迅速作用于白细胞，使其细胞膜部分损伤，从而使染料能快速进入细胞膜并标记白细胞内的核酸物质。所以采用本发明的方法能快速将白细胞进行分类计数，有利于提高自动化检测仪器的检测速度，尤其适用于大量血液样本的检测。
[0218] 本发明所述的分类过程中，血样与本发明所公开的试剂的混合比例没有特别限制，但通常情况下采用血样与本发明试剂的体积比为1∶10到1∶100的比例进行混合，优选1∶40到1∶60的比例。
[0219] 所述的分类过程的反应温度为20℃到50℃，实验证明在20℃到50℃的广泛温度范围内采用本发明所公开的试剂及方法都能对白细胞进行很好的分类。只要将反应温度固定在20℃到50℃的任一温度下，都能保证分类结果的稳定。本发明的优选温度为40℃到45℃，采用该温度的原因是通常情况下的室内温度都不会高于40℃，因此在实际应用中只需要在检测仪器中安装加热装置就可以保证反应的恒温，不用安装制冷装置，这样可以大大节约仪器成本。
[0220] 本发明所述荧光强度信息的测定可以利用激光流式法测定侧向激发荧光来完成，测定角度为90度；细胞内部形态信息的测定可以利用激光流式法测定散射光来完成，测定角度为90度。本发明所采用的激光流式法可以利用图1所示的公知装置。其中激光器光源的选择可以选择同所使用的荧光染料激发波长相适应的激光器。
[0221] 本发明方法具体可以采用如下的步骤：
[0222] 1将血液样本加入到本发明试剂中，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞，使白细胞各亚类产生形态和内部结构的变化，同时对白细胞内部核酸类物质进行荧光染料标记，形成测量样本液。
[0224] 3对散射光强度信息和侧向荧光强度信息进行处理分析。通过不同白细胞亚类的散射光及荧光信号的差异，在散射光强度及侧向荧光强度所形成的的二维或者三维散点图将白细胞进行分类计数，并区分出未成熟细胞或异常细胞。本散射光强度信息指侧向散射光强度信息，或前向散射光强度信息，这样可以采用侧向散射光强度信息、前向散射光强度信息、侧向荧光强度信息形成三维散点图信息进行识别，也可以采用侧向散射光强度信息或前向散射光强度信息，与侧向荧光强度信息形成二维散点图，进行识别。
[0225] 采用本发明所公开的方法对白细胞进行分类计数时，能较好的将幼稚粒细胞与成熟粒细胞区分，也能较好的将异常淋巴细胞与正常淋巴细胞区分。由于幼稚粒白细胞属于发育前期的粒细胞，细胞核大，胞内核酸物质多，因此与成熟粒细胞相比，结合的荧光染料更多，激发的荧光强度更大，在侧向荧光强度方向，幼稚粒细胞与成熟粒细胞有明显的区别，如图3所示。而异常淋巴细胞由于含有较多的核酸类物质，在侧向荧光强度方向与正常淋巴细胞也有明显的区别，如图4所示。也能同时将幼稚粒细胞和异常淋巴细胞同时区分，如图7所示。
[0226] 实施例
[0227] 以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。
[0228] 除非另有声明，否则以下实施例中使用水为溶剂配制各试剂成分，所用的血液细胞检测设备为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC系列流式细胞分析仪，检测波长640nm。所述细胞分析仪的光学系统示意图如图1所示。
[0229] 实施例1
[0230] 如下配制用于白细胞分类计数的试剂A，该试剂由以下成分组成：
[0231] 上述结构式A的化合物 0.5ppm
[0232] 癸基溴化异喹啉鎓 0.4g/L
[0233] 十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚 1.3g/L
[0234] 苯甲酸钠 2.0g/L
[0235] 甲醇 50g/L
[0236] 磷酸二氢钠 3g/L
[0237] 磷酸氢二钠 4.8g/L
[0238] 将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂A中，在温度保持25℃的条件下，混合25秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。
[0239] 实施例2
[0240] 如下配制用于白细胞分类的试剂B，该试剂由以下成分组成：
[0241] 上述结构式B的化合物 0.5ppm
[0242] 十四基溴化喹啉鎓 0.1g/L
[0243] 十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚 1.5g/L
[0244] 苯磺酸 2.0g/L
[0245] Tris 1.2g/L
[0246] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0247] 取一个幼稚粒细胞(IG)偏高的新鲜抗凝血样本(镜检结果IG％为2.5％)，将该血样20μl加入到上述的1ml试剂B中，在温度保持45℃的条件下，混合15秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光信息。结果如图3所示，从散点图可以明显看到，除了正常的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞外，在正常中性粒细胞上方有明显的幼稚粒细胞出现，在侧向散射光强度及荧光强度信号所形成的的二维散点图上采用手工划界的方法对其计数结果IG％为2.3％，与镜检结果近似。
[0248] 实施例3
[0249] 如下配制用于白细胞分类的试剂C，该试剂由以下成分组成：
[0250] 上述结构式C的化合物 0.5ppm
[0251] 十二基三甲基氯化铵 0.6g/L
[0252] 十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚 1.6g/L
[0253] 牛磺酸 2.0g/L
[0254] Tris 1.2g/L
[0255] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0256] 取一个异常淋巴细胞含量偏高的新鲜抗凝血样本(镜检结果异常淋巴细胞百分含量为3.0％)，将该血样20μl加入到上述的1ml试剂C中，在温度保持45℃的条件下，混合15秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光信息。结果如图4所示，从散点图可以明显看到，除了正常的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞外，在正常淋巴及单核细胞上方有明显的异常淋巴细胞出现，在例向散射光强度及荧光强度信号所形成的的二维散点图上采用手工划界的方法对其计数结果异常淋巴细胞百分含量为2.6％，与镜检结果近似。
[0257] 实施例4
[0258] 如下配制用于白细胞分类的试剂盒D，该试剂盒由以下的染色液I和溶血剂II组成：
[0259] 染色液I
[0260] 上述结构式D的化合物 10ppm
[0261] 将染料溶于乙二醇中保存。
[0262] 溶血剂II
[0263] 十二烷基溴化异喹啉鎓 0.2g/L
[0264] 十六烷基醇聚氧乙烯(25)醚 1.5g/L
[0265] 柠檬酸钠 2.0g/L
[0266] 乙醇 50g/L
[0267] HEPES 3g/L
[0268] 将上述溶血剂组分溶于1L水中，并用氢氧化钠将pH调节到7.0。
[0269] 取50支新鲜抗凝血，按照下述方法对其淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进行分类计数。
[0270] 取20μl上述染色液I，并从每支血样中取20μl，一并加入到上述的1ml溶血剂II中，在温度保持40℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光强度信息。在侧向散射光强度及荧光强度信号所形成的的二维散点图上采用手工划界的方法对淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进行分类计数。并和常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果进行比较，做出相关性分析。
[0271] 所得结果如图5(A-E)所示。白细胞总数(A)、淋巴细胞％(B)、单核细胞％(C)、中性粒细胞％(D)、嗜酸性粒细胞％(E)中的任何一个都可见与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果有良好的相关性。
[0272] 实施例5
[0273] 如下配制用于白细胞分类的试剂E，该试剂由以下成分组成：
[0274] 上述结构式E的化合物 0.5ppm
[0275] 十四基三甲基氯化铵 0.3g/L
[0276] 十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚 1.3g/L
[0277] 邻苯二甲酸 3.0g/L
[0278] Tris 2.4/L
[0279] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0280] 如下配制另一种用于白细胞分类的试剂F，该试剂由以下成分组成：
[0281] 上述结构式E的化合物 0.5ppm
[0282] 十四基三甲基氯化铵 0.3g/L
[0283] 十二烷基醇聚氧乙烯(23)醚 1.3g/L
[0284] 邻苯二甲酸 3.0g/L
[0285] 2-苯氧基乙醇 3g/L
[0286] Tris 2.4g/L
[0287] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0288] 取新鲜抗凝血一支，在冰箱内4℃保存，分别于保存时间为4小时、36小时、72小时取出，按照实施例一中所述的检测方法，分别使用试剂E和试剂F对该血样进行测定。测定结果的散点图如图6(A-F)，其中图6(A)、(B)、(C)分别为未加入醇类的试剂E对保存时间为4小时、36小时、72小时的血液样本测定结果；图6(D)、(E)、(F)分别为加入醇类的试剂F对保存时间为4小时、36小时、72小时的血液样本测定结果。从上述测定结果的对比可以明显看出，采用未加入醇类的试剂E对不同保存时间的血液样本进行测定时，随着血液老化时间的延长，各个白细胞亚类尤其是淋巴细胞和单核细胞的分类效果下降的很明显；而当试剂中含有一定浓度的醇类(试剂F)时，对老化血的分类效果相比于未加入醇类的试剂有明显提高。当使用试剂F对新鲜血(见图6D)与72小时的老化血(见图6F)进行白细胞分类时，在散点图上各个白细胞亚类尤其是淋巴细胞和单核细胞的分类效果得到了很好的保持。
[0289] 实施例6
[0290] 如下配制用于白细胞分类的试剂G，该试剂由以下成分组成：
[0291] 上述结构式F的化合物 0.5ppm
[0292] 辛基溴化异喹啉鎓 0.6g/L
[0293] 十六烷基醇聚氧乙烯(30)醚 1.6g/L
[0294] 柠檬酸钠 2.0g/L
[0295] Tris 1.2g/L
[0296] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0297] 取一个幼稚粒细胞(IG)和异常淋巴细胞含量都偏高的新鲜抗凝血样本(镜检结果IG％为5.0％，异常淋巴细胞百分含量为2.4％)，将该血样20μl加入到上述的1ml试剂G中，在温度保持42℃的条件下，混合15秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光信息。结果如图7所示，从散点图可以明显看到，除了正常的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞外，在正常中性粒细胞上方有明显的幼稚粒细胞出现，在侧向散射光强度及荧光强度信号所形成的的二维散点图上采用手工划界的方法对其计数结果IG％为5.3％，与镜检结果近似；在正常淋巴及单核细胞上方有明显的异常淋巴细胞出现，在侧向散射光强度及荧光强度信号所形成的的二维散点图上采用手工划界的方法对其计数结果异常淋巴细胞百分含量为
2.6％，与镜检结果近似。
2.6％，与镜检结果近似。
[0298] 实施例7
[0299] 如下配制用于白细胞分类计数的试剂H，该试剂由以下成分组成：
[0300] 上述结构式A的化合物 0.5ppm
[0301] 十二烷基溴化异喹啉鎓 0.2g/L
[0302] 十二烷基醇聚氧乙烯(25)醚 1g/L
[0303] 苯氧基乙醇 2g/L
[0304] Tris 1.2g/L
[0305] 用盐酸将pH调节到7.0。
[0306] 将新鲜抗凝20μl加入到上述的1ml试剂H中，在温度保持40℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为
90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图8所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。
90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图8所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞五类。
[0307] 实施例8
[0308] 如下配制用于白细胞分类计数的试剂I，该试剂由以下成分组成：
[0309] 上述结构式C的化合物 0.5ppm
[0310] 十四烷基溴化喹啉鎓 0.15g/L
[0311] 十二烷基醇聚氧乙烯(30)醚 1.5g/L
[0312] 苯氧基乙醇 2g/L
[0313] HEPES 2g/L
[0314] 用NaOH将pH调节到7.0。
[0315] 将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂I中，在温度保持40℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图9所示，白细胞被至少分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
[0316] 实施例9
[0317] 如下配制用于白细胞分类计数的试剂J，该试剂由以下成分组成：
[0318] 上述结构式D的化合物 0.5ppm
[0319] 十六烷基溴化异喹啉鎓 0.1g/L
[0320] 十二烷基醇聚氧乙烯(30)醚 1.3g/L
[0321] 苯氧基乙醇 2g/L
[0322] HEPES 2g/L
[0323] 用NaOH将pH调节到7.0。
[0324] 将新鲜抗凝血20μl加入到上述的1ml试剂J中，在温度保持40℃的条件下，混合20秒后用激光流式法(光源：红色半导体激光，波长640nm)检测白细胞。采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。结果如图10所示，白细胞被至少分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
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