一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法
专利汇可以提供一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属 生物 细胞技术领域，具体涉及一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法。本发明直接用MNC细胞进行体外培养以获得EPCs，在培养液中加入生长因子，以一定的种植 密度 植于用明胶包被的培养瓶中或小玻片上，进行常规培养获得ECPs。本发明简化了传统培养方法的步骤，有效的避免MNC CD34+的不必要损失，提高EPCs的得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明方法为人外周血EPCs的分离和培养建立了方法学，为今后临床应用做准备，能相应减少外周血的用量，为自体回输 治疗 缺血性 疾病 创造条件。，下面是一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法专利的具体信息内容。
1.一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于分离人外周血单个核细胞，通过体外直接培养后，得到血管内皮祖细胞，包括下述步骤：1)分离人外周血单个核细胞：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞；2)体外培养单个核细胞：培养液中加入生长因子，将单个核细胞种于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上，所述培养液含20％胎牛血清的M-199，肝素100U/ml，青霉素0.1mg/ml，和0.1mg/ml的链霉素，所述生长因子是牛垂体提取物，终浓度为3-15μg/ml；3)血管内皮祖细胞鉴定：进行细胞形态学、功能、蛋白和细胞表面分子及基因鉴定。
2.按权利要求1所述的人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于所述的单个核细胞种植密度为105-106个细胞/cm2。
3.按权利要求1所述的人外周血血管内皮祖细胞的培养方法，其特征在于所述的包被明胶浓度为2％，密度为5-10μl/cm2。
4.按权利要求1所述的方法，其中步骤2的生长因子牛垂体提取物的终浓度为9μg/ml。
5.按权利要求2所述的方法，其中单个核细胞种植密度是105个细胞/cm2。
6.按权利要求3所述的方法，其中包被明胶密度为5μl/cm2。
一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法
技术领域
背景技术
用磁式细胞分选法从人的外周血中分离出CD34+的单个核细胞(MNCCD34+)，体外培养显示它能分化为内皮细胞，给缺血动物模型回输显示它参与了出生后血管生成(Angiogenesis，AG)的过程。因而首次证明血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)来源于MNCCD34+。此后陆续有从胚胎、骨髓、脐静脉血分离出同样的EPCs的报道。
目前，传统的EPCs分离培养法如下：1.用已知的Ficoll密度梯度离心法将外周血分离出单个核细胞(MNC)层。
2.用人CD34+抗体包被的免疫磁珠采取磁珠分选法在MNC中分离出MNCCD34+。然后将MNCCD34+单独种植于培养皿中进行培养。
3.MNCCD34+的培养：培养液：medium-199+20％胎牛血清+牛脑提取物+抗生素，或EBM-2+5％FBS+人VEGF-1+人FGF-2+人EGF+人IGF-1+抗坏血酸。(VEGF为血管内皮生长因子，FGF为成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，IGF为胰岛素样生长因子)培养皿采用人纤维结合蛋白(fibronectin)或胶原I型(collagen typeI)包被。
传统的培养方法较为繁琐，在用CD34+抗体包被的免疫磁珠分选MNC的过程中不可避免会有MNC CD34+的损失，造成细胞收率较低。另外，国外传统方法要求实验条件较高，因此其方法的可重复性较差。
发明内容
医学界公认EPCs有以下用途：a.促进血管新生的作用，改善脏器缺血导致的功能障碍，EPCs的体内回输可用来治疗人体缺血性疾病：如缺血性心脏病、脑缺血、肾缺血、肢端缺血坏死等一系列疾病，尤其将在心肌梗死、心绞痛等缺血性心脏病的治疗过程中起到巨大作用；b.帮助修复损伤的血管内膜，如经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和其他血管的介入手术不可避免的多少会损伤血管内膜，EPCs的回输将促进损伤内膜的修复，减少因内膜损伤而导致的介入术后的血管再狭窄；c.帮助恢复和重建动脉粥样硬化的血管内皮功能，防止动脉粥样硬化的进一步恶化，减少心肌梗死的发生；d.在肿瘤学方面，通过研究EPCs在肿瘤血管生成过程中的作用，采取相应的抑制措施，为抑制肿瘤血管生成以及抑制肿瘤生长开辟新途径。
本发明一种人外周血血管内皮祖细胞的培养方法通过下述步骤实现：1、分离人外周血MNC：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出MNC。
2、体外培养MNC：在体外细胞培养液中加入生长因子；将MNC细胞种于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上，明胶密度为5-10μl/cm2；细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，每3-4天半量换液一次。
上述MNC的体外细胞培养液为M-199+20％FBS+肝素100U/ml+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；生长因子为牛垂体提取物(市购)，以3-15μg/ml的终浓度加入培养液中；细胞按105-106cell/cm2种植；培养瓶中或小玻片上包被有2％的明胶，明胶密度为5-10μl/cm2。
3、血管内皮祖细胞特性鉴定：细胞形态学特征：每ml外周血经Ficoll密度梯度离心可得到MNC 1-2×106，培养一天的贴壁率约为30％，多数细胞形态为圆形。培养的第2天出现梭形贴壁细胞(attaching cell，AT cell)，并出现成簇现象，第4天梭形细胞多见并形成条索状或管状分布。
细胞功能鉴定：在培养的第7天，将细胞和DiI标记的乙酰化的低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)10μg/ml在37℃孵浴24h，结果为85％的贴壁细胞都特异性地摄取了乙酰化的LDL，说明所述贴壁细胞具有内皮细胞家族的功能特性。
蛋白和细胞表面分子鉴定：在培养的第14天，将培养在小玻片上的细胞进行vWF和Flk-1的免疫组化染色以及CD31和CD34的免疫荧光染色，和CD31、CD34的流式细胞计数检测。结果显示AT cell胞浆内vWF、Flk-1(VEGFR-2)、CD31、CD34均呈阳性，流式细胞计数结果：CD31为70.24±10.12％(n＝5)，CD34为55.37±14.85％(n＝8)。所述的vWF、Flk-1、CD31、CD34均为内皮细胞家族特异性标志，其中Flk-1、CD34为EPCs的特异性标志。
基因鉴定：在培养的第14天，用Tris抽提细胞RNA，用RT-PCR方法检测细胞Flt-1(VEGFR-1)mRNA的表达。Flt-1为内皮细胞家族的特异性基因之一，在血管的发育过程中是必须的。本方法使用了不同引物如下：引物1(317bp)——Choi K，Development.1998；125.
sense，5′CTCTGATGGTGATCGTGG3′；antisense，5′CATGCGTCTGGCCACTTG3′.
引物2(1080bp)——Bellamy WT，Cancer Res.1999；59.
sense，5′GAGAATTCACTATGGAAGATCTGATTTCTTACAGT′；antisense，′GAGCATGCGGTAAAATACACATGTGCTTCTAG 3′.
结果显示细胞表达Flt-1基因。
本发明所用试剂均为市购，本发明所用检测方法为常规已知方法。
本发明培养的来源于MNC的AT细胞在生长过程中呈现出特殊的形态特征，如细胞呈梭形贴壁生长、有成簇现象和条索状或管状的生长现象。同时AT细胞具有内皮细胞家族特性：a.功能方面：AT细胞能摄取Ac-LDL，具备了内皮细胞的功能；b.蛋白和细胞表面分子方面：AT细胞胞浆含有vWF、Flk-1，细胞表面分子CD31和CD34阳性，说明AT细胞具有内皮细胞家族的特异性标志；c.基因方面：用两种来自Flt-1基因不同片段的引物进行的RT-PCR检测结果均显示AT细胞表达内皮细胞特异性基因Flt-1。另外，由于Flk-1和CD34目前被认为是EPCs的特异性标志，进一步证明了本发明培养所得的AT细胞就是EPCs。本发明通过直接培养MNC得到EPCs，简化了传统培养方法的实验步骤，有效的避免MNC CD34+的不必要损失，提高EPCs的得率，可重复性高，并节省大量的经费。本发明方法为人外周血EPCs的分离和培养建立了方法学，为以后的研究奠定基础。本方法还充分为今后临床应用做准备，能相应减少外周血的用量，为日后自体回输治疗缺血性疾病创造条件。
附图说明
图1是所培养细胞的形态特征图其中：a.贴壁细胞的成簇现象b.梭形细胞呈条索状分布c.梭形细胞呈管状分布图2是细胞功能鉴定图其中：a.红色荧光为摄取了LDL的AT cellb.同一视野中普通光显微镜下景象图3是免疫荧光和免疫组化图其中：a.免疫荧光检测显示绿色荧光为CD31阳性的细胞，绿色CD31阳性部分位于细胞浆内b.免疫荧光检测显示绿色荧光为CD34阳性的细胞，绿色CD34阳性部分同样也位于细胞浆内c.免疫组化检测显示vWF阳性染色，棕色vWF阳性部分分布于细胞浆内，苏木素反染后显示细胞核为蓝色d.免疫组化检测显示Flk-1阳性染色，棕色Flk-1阳性部分分布于细胞浆内，苏木素反染后显示细胞核为蓝色。
图4是流式细胞计数分析图其中：黑色曲线为阴性对照，绿色曲线为CD31(a)和CD34(b)阳性曲线。
图5是Flt-1的RT-PCR电泳图其中：内参照为长度510bp的βactin。
具体实施方式
2、体外培养MNC：培养液为M-199+20％FBS+肝素100U/ml+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；生长因子为牛垂体提取物，以9μg/ml的终浓度加入培养液中；将细胞按105/cm2种于包被有2％明胶的培养瓶中或小玻片上，明胶密度为5μl/cm2；细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，每3-4天半量换液一次。
3、血管内皮祖细胞特性鉴定：按上述方法进行。
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