宿主外周血单个核细胞和T细胞的癌症DNA甲基化标志物
阅读：509发布：2020-05-15
专利汇可以提供宿主外周血单个核细胞和T细胞的癌症DNA甲基化标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 发现了癌症在宿主的T细胞和 外周血单个核细胞 (PBMC)的DNA中具有DNA甲基化标志物。本发明公开了源自PBMC的DNA的CG IDs，通过上述CG IDs在PBMC或T细胞的DNA中的甲基化 水 平预测 肝细胞 癌(HCC)临床进展分期和慢性 肝炎 。本发明还公开了，一种通过使用本发明所识别的CG IDs来预测HCC的 试剂 盒 ，以及焦 磷酸 测序DNA甲基化实验、受试者工作特征(ROC)实验、惩罚回归实验和层级 聚类分析 在预测HCC中的应用。本领域任一技术人员均可以使用本发明来获得用于任何癌症和任何癌症临床进展分期的DNA甲基化标志物。本发明描述的DNA甲基化标志物(CG IDs)将用于诊断：a.癌症；b.癌症不同临床进展分期；c.正在接受 治疗 的患者对治疗的反应；d.慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎。，下面是宿主外周血单个核细胞和T细胞的癌症DNA甲基化标志物专利的具体信息内容。
1.用于预测癌症的癌症患者外周血单个核细胞(PBMC)的DNA甲基化标志物，所述DNA甲基化标志物是通过全基因组DNA甲基化映射(mapping)的方法而得到的，例如Illumina450K或850K实验、全基因组重亚硫酸盐测序、甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)测序、或寡核苷酸微阵列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA甲基化标志物，其中，所述DNA甲基化标志物是如下所示的源自PBMC的DNA的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在PBMC或T细胞中的DNA甲基化水平来预测肝细胞癌(HCC)临床进展分期和慢性肝炎：
3.如权利要求1所述的DNA甲基化标志物，其中，所述DNA甲基化标志物是如下所示的源自T细胞的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在PBMC或T细胞中的DNA甲基化水平来预测HCC临床进展分期和慢性肝炎：
4.如权利要求1所述的DNA甲基化标志物，其中，所述DNA甲基化标志物是如下所示的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在T细胞或PBMC中的DNA甲基化测量值来预测不同HCC临床进展分期，其中所述CG IDs是使用统计模型例如惩罚回归或聚类分析得到的，用于区分HCC阶段1(BCLC-0期)和对照的靶CG IDs：cg14983135、cg10203922、cg05941376、cg14762436、cg12019814、cg14426660、cg18882449、cg02914652；
用于区分HCC阶段2(BCLC-A期)和对照的靶CG IDs：cg05941376、cg15188939、cg12344600、cg03496780、cg12019814；
用于区分HCC阶段3(BCLC-B期)和对照的靶CG IDs：cg05941376、cg02782634、cg27284331、cg12019814、cg23981150；
用于区分HCC阶段4(BCLC-C/D期)和对照的靶CG IDs：cg02782634、cg05941376、cg10203922、cg12019814、cg14914552、cg21164050、cg23981150；
用于区分HCC BCLC-0期和乙型肝炎的靶CG IDs：cg05941376、cg10203922、cg11767757、cg04398282、cg11151251、cg24742520、cg14711743；
用于区分HCC BCLC-0期和BCLC-A/B/C/D期的靶CG IDs：cg03252499、cg03481488、cg04398282、cg10203922、cg11783497、cg13710613、cg14762436、cg23486701；
用于区分HCC BCLC-A期和BCLC-B/C/D期的靶CG IDs：cg02914652、cg03252499、cg11783497、cg11911769、cg12019814、cg14711743、cg15607708、cg20956548、cg22876402、cg24958366；
用于区分HCC BCLC-0/A/B期和BCLC-C/D期的靶CG IDs：cg02782634、cg11151251、cg24958366、cg06874640、cg27284331、cg16476382、cg14711743。
5.如权利要求1所述的DNA甲基化标志物，其中，所述DNA甲基化标志物是如下所示的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在T细胞或PBMC中的DNA甲基化测量值来预测HCC临床进展分期，所述CG IDs是使用统计模型例如惩罚回归或聚类分析得到的，
6.用于预测癌症的试剂盒，其特征在于，包含用于检测如权利要求1所述的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
7.用于预测肝细胞癌HCC临床进展分期或慢性肝炎的试剂盒，其特征在于，包含用于检测如权利要求2所述的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
8.用于预测HCC临床进展分期或慢性肝炎的试剂盒，其特征在于，包含用于检测如权利要求3所述的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
9.用于预测HCC不同临床进展分期的试剂盒，其特征在于，包含用于检测如权利要求4所述的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
10.用于预测HCC临床进展分期的试剂盒，其特征在于，包含用于检测如权利要求5所述的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
11.基因通路，其特征在于，所述基因通路在癌症的外周血免疫系统中受表观调控。
12.DNA焦磷酸测序甲基化实验在预测HCC中的应用，其特征在于，通过使用如权利要求
1-5中任一项所述的DNA甲基化标志物，例如针对下述基因使用下述引物：
AHNAK(外正向GGATGTGTCGAGTAGTAGGGT，外反向
CCTATCATCTCCACACTAACGCT，内正向TGTTAGGGGTGATTTTTAGAGG，内反向
ATTAACCCCATTTCCATCCTAACTATCTT，和测序引物
TTTTAGAGGAGTTTTTTTTTTTTA)；
SLFN2L(外正向GTGATYTTGGTYAYTGTAAYYT,外反向
TCTCATCTTTCCATARACATTTATTTAR，内正向
AGGGTTTYAYTATATTAGYYAGGTTGG，内反向ATRCAAACCATRCARCCCTTTTRC，测序引物YYYAAAATAYTGAGATTATAGGTGT)；
AKAP7(外正向TAGGAGAAAGGGTTTATTGTGGT，外反向
ACACACCCTACCTTTTTCACTCCA，内正向
GGTATTGATTTATGGTTAGGGATTTATAG，内反向
AAACAAAAAAAACTCCACCTCCAATCC，测序引物GGGATTTATAGTTTTGTGAGA)；以及STAP1(外正向AGTYATGTYTTYTGYAAATAAAAATGGAYAYY，外反向
TTRCTTTTTAACCACCAACACTACC，内正向
YYGTTTYTTTYATYTTYTGGTGATGTTAA，内反向
ARARRRCAATCTCTRRRTAATCCACATRTR，测序引物
GGTGATGTTAATYTTYTGTTTA)。
13.受试者工作特征(ROC)实验在预测HCC中的应用，其特征在于，通过使用如权利要求
1-5中任一项所述的DNA甲基化标志物，所述DNA甲基化标志物例如为STAP1(cg04398282)。
14.层级聚类分析在预测HCC中的应用，其特征在于，通过使用如权利要求1-5中任一项所述的DNA甲基化标志物。
15.一种识别用于预测疾病的DNA甲基化标志物的方法，其特征在于包含对从样品中得到的DNA甲基化测量值执行统计分析的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化测量值是通过对样品中提取的DNA执行Ilumina Beadchip 450K或850K实验得到的。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化测量值是通过对样品中提取的DNA执行DNA焦磷酸测序、基于质谱分析法(EpityperTM)或PCR的甲基化实验得到的。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述统计分析包括皮尔森相关。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述统计分析包括受试者工作特征(ROC)实验。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述统计分析包括层级聚类分析实验。
宿主外周血单个核细胞和T细胞的癌症DNA甲基化标志物
技术领域
背景技术
[0002] 肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见的癌症(1)，其在亚洲是特别流行的。并且肝细胞癌的发生率在乙型肝炎流行的区域是最高的，这表明其具有可能的因果关系(2)。对高危患者例如慢性肝炎患者的追踪和对由慢性肝炎向HCC转变的早期诊断可以提高治愈率。目前肝细胞癌患者的长期存活率是极低的，因为肝细胞癌几乎都是在中晚期诊断出的。如果提早诊断，肝癌可以被有效地治疗，其治愈率>80％。影像诊断的进步改善了HCC的非侵入式检测(3、4)。然而，目前的诊断方法，其包括影像和使用单个蛋白例如α-甲胎蛋白的免疫分析，经常不能提早诊断HCC(2)。该挑战不限于HCC，其它癌症中也同样存在。癌症的分子诊断聚焦于源自肿瘤的组织细胞和生物材料，包括血浆中的肿瘤DNA(5、6)、循环中的肿瘤细胞(7)和肿瘤宿主微环境(8、9)。目前流行并被广泛接受的假设是：驱动癌症发生和进展的分子变化主要在于肿瘤自身，而宿主的相关变化主要发生在肿瘤微环境中。因此，肿瘤微环境中免疫细胞的识别受到了极大的关注(10、11)。
[0003] DNA甲基化，DNA的共价修饰，是基因组功能表观调控的主要机理，其在包括HCC(16)在内的肿瘤中(12-15)普遍发生改变。肿瘤DNA甲基化特征性图谱可以区分肿瘤临床进展分期，并可以用作肿瘤分类、预后以及对化疗反应的响应的潜在有力工具(17)。在早期诊断中使用肿瘤DNA甲基化的主要缺陷在于，需要进行侵入式操作以及需要可疑肿瘤的解剖可视化。循环中的肿瘤细胞是肿瘤DNA的非侵入来源，其被用于测量肿瘤抑制基因中的DNA甲基化(18)。低甲基化的HCC细胞的DNA在患者血液中是可以检测到的(19)，并且全基因组重亚硫酸盐测序最近被用于检测来自HCC患者的血浆中的癌细胞的低甲基化DNA(20)。然而，该来源是有限的，特别是在癌症的早期阶段，并且其DNA甲基化图谱和宿主DNA甲基化图谱是混淆的。
[0004] 宿主免疫-监视在肿瘤发生中通过清除肿瘤细胞和抑制肿瘤生长而起重要的作用，这一想法在一个世纪以前就已经由Paul Ehrlich(21,22)提出了，但随后没有得到支持。然而，由动物和人体临床研究中积累的数据表明宿主的免疫系统在肿瘤发生中通过“免疫编辑”起到重要的作用，其涉及三个阶段：消除、平衡和逃避(23-25)。在人类进展性黑色素瘤(26-31)、食道癌(32)、卵巢癌(33、34)和结肠癌(35-37)的若干临床研究中，肿瘤浸润性细胞毒素CD8+T细胞的存在和较好的预后相关。当循环中的癌细胞在没有临床症状时是可以被检测到时，免疫系统被认为是癌症休眠现象的原因(15，38)。有趣的是，最近的肿瘤DNA甲基化和转录组分析揭示了浸润性淋巴细胞的肿瘤阶段特异性免疫标志物(39、40)。然而，这些标志物代表了肿瘤微环境中的靶免疫细胞，并且这些标志物在早期诊断中的使用需要侵入式操作。肿瘤浸润性免疫细胞代表的仅仅是一小部分外周血细胞(41-44)。白血球和EWAs研究中报道的总体(global)DNA甲基化变化显示了来自膀胱、头和颈、以及卵巢癌中的白血球的DNA甲基化差异，并且这些差异与白细胞分布的差异无关(45)。这些研究主要是为了识别癌症基因中潜在的DNA甲基化变化，其可能用作肿瘤中DNA甲基化变化的替代标志。然而，外周宿主免疫系统能否显示出响应与癌症进展相关的癌症状态的独特的DNA甲基化，尚未得到说明。
发明内容
[0006] 本发明描述了由中国北京区域的69位HCC患者构成的发现集(discovery set)(10位对照，和来自以下乙型肝炎、丙型肝炎、HCC临床进展分期BCLC-0期、BCLC-A期、BCLC-B期(阶段1-3)中的各10位患者、和来自BCLC-C/D期(阶段4)的9位患者)的DNA甲基化图谱，其中HCC临床进展分期是根据欧洲肝脏研究学会与欧洲癌症治疗研究组织EASL-EORTC肝细胞癌临床实践指南(表1)确定。本发明使用全基因组方法(Illumina450k实验)描绘DNA甲基化图谱，而对可能涉及的基因类型没有预想的偏重。本发明首次发现了，乙型肝炎和丙型肝炎的外周血单个核细胞中的DNA甲基化图谱与HCC中不同的DNA甲基化图谱，以及乙型肝炎和丙型肝炎的外周血单个核细胞中的DNA甲基化图谱与不同临床进展分期HCC不同的DNA甲基化图谱。这些图谱和之前描述的HCC肿瘤的DNA甲基化图谱没有明显重叠(16)，这表明它们反应了外周血单个核细胞的基因功能的变化，而不能代表肿瘤DNA甲基化的变化。因此，本发明表明了宿主免疫系统在癌症期间的DNA甲基化变化。本发明还表明了癌症患者的宿主T细胞中的DNA甲基化标志物。本发明还表明了在PBMCs和T细胞的DNA甲基化图谱之间存在显著的重叠。通过对一组独立的患者(n＝79)的T细胞DNA进行焦磷酸测序，本发明证实了在来自发现队列(discovery cohort)的HCC患者的T细胞中差异甲基化的4种基因。
[0007] 本发明表明：本发明可以通过使用基于这些DNA甲基化标志物的统计模型来预测未知样品的癌症和癌症临床进展分期。本发明对于理解疾病的机理及其治疗具有重要的启示，并提供了癌症外周血单个核细胞DNA的非侵入式诊断。通过使用任何本领域技术人员已知的用于全基因组甲基化映射的方法，例如全基因组重亚硫酸盐测序、捕获测序、甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)测序和任何其它可用的全基因组DNA甲基化映射方法，本领域技术人员可以根据本发明来获得任意癌症的免疫系统中DNA甲基化标志物。
[0008] 以下是本发明优选的实施例：
[0009] 在第一个方面，本发明提供一种用于预测癌症的癌症患者外周血单个核细胞(PBMC)的DNA甲基化标志物，所述DNA甲基化标志物是通过全基因组DNA甲基化映射(mapping)的方法而得到的，例如Illumina 450K或850K实验、全基因组重亚硫酸盐测序、甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)测序或寡核苷酸微阵列杂交。
[0010] 在一个实施方式中，DNA甲基化标志物是如下所示的源自PBMC的DNA的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在PBMC或T细胞中的DNA甲基化水平来预测肝细胞癌(HCC)临床进展分期和慢性肝炎：
[0011]
[0012]
[0013]
[0014] 在一个实施方式中，DNA甲基化标志物是如下所示的源自T细胞的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在PBMC或T细胞中的DNA甲基化水平来预测HCC临床进展分期和慢性肝炎：
[0015]
[0016]
[0017] 在一个实施方式中，DNA甲基化标志物是如下所示的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在T细胞或PBMC中的DNA甲基化测量值来预测不同HCC临床进展分期，其中所述CG IDs是使用统计模型例如惩罚回归或聚类分析得到的，
[0018] 用于区分HCC阶段1(BCLC-0期)和对照的靶CG IDs：cg14983135、cg10203922、cg05941376、cg14762436、cg12019814、cg14426660、cg18882449、cg02914652；
[0019] 用于区分HCC阶段2(BCLC-A期)和对照的靶CG IDs：cg05941376、cg15188939、cg12344600、cg03496780、cg12019814；
[0020] 用于区分HCC阶段3(BCLC-B期)和对照的靶CG IDs：cg05941376、cg02782634、cg27284331、cg12019814、cg23981150；
[0021] 用于区分HCC阶段4(BCLC-C/D期)和对照的靶CG IDs：cg02782634、cg05941376、cg10203922、cg12019814、cg14914552、cg21164050、cg23981150；
[0022] 用于区分HCC阶段1(BCLC-0期)和乙型肝炎的靶CG IDs：cg05941376、cg10203922、cg11767757、cg04398282、cg11151251、cg24742520、cg14711743；
[0023] 用于区分HCC阶段1(BCLC-0期)和阶段2-4(BCLC-A/B/C/D期)的靶CG IDs：cg03252499、cg03481488、cg04398282、cg10203922、cg11783497、cg13710613、cg14762436、cg23486701；
[0024] 用于区分HCC阶段2(BCLC-A期)和阶段3-4(BCLC-B/C/D期)的靶CG IDs：cg02914652、cg03252499、cg11783497、cg11911769、cg12019814、cg14711743、cg15607708、cg20956548、cg22876402、cg24958366；
[0025] 用于区分HCC阶段1-3(BCLC-0/A/B期)和阶段4(BCLC-C/D期)的靶CG IDs：cg02782634、cg11151251、cg24958366、cg06874640、cg27284331、cg16476382、cg14711743。
[0026] 在一个实施方式中，DNA甲基化标志物是如下所示的CG IDs，其用于通过使用所述CG IDs在T细胞或PBMC中的DNA甲基化测量值来预测HCC临床进展分期，其中所述CG IDs是使用统计模型例如惩罚回归或聚类分析得到的，
[0027]
[0030] 在一个实施方式中，本发明提供一种用于预测HCC临床进展分期或慢性肝炎的试剂盒，其特征在于，包含用于检测说明书表6中的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
[0031] 在一个实施方式中，本发明提供一种用于预测HCC不同临床进展分期的试剂盒，其特征在于，包含用于检测说明书表4中的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
[0032] 在一个实施方式中，本发明提供一种用于预测HCC临床进展分期的试剂盒，其特征在于，包含用于检测说明书表5中的DNA甲基化标志物的DNA甲基化测量值的装置和试剂。
[0033] 在第三个方面，本发明提供一种基因通路，其特征在于，所述基因通路在癌症的外周血免疫系统中受表观调控。
[0034] 在第四个方面，本发明提供了本发明所公开的CG IDs的应用。
[0035] 在一个实施方案中，本发明提供了DNA焦磷酸测序甲基化实验在预测HCC中的应用，其特征在于通过使用上述CG IDs，例如针对下述基因使用下述引物：
[0036] AHNAK(外正向GGATGTGTCGAGTAGTAGGGT，外反向CCTATCATCTCCACACTAACGCT，内正向TGTTAGGGGTGATTTTTAGAGG，内反向ATTAACCCCATTTCCATCCTAACTATCTT，和测序引物TTTTAGAGGAGTTTTTTTTTTTTA)；
[0037] SLFN2L(外正向GTGATYTTGGTYAYTGTAAYYT,外反向TCTCATCTTTCCATARACATTTATTTAR，内正向AGGGTTTYAYTATATTAGYYAGGTTGG，内反向ATRCAAACCATRCARCCCTTTTRC，测序引物YYYAAAATAYTGAGATTATAGGTGT)；
[0038] AKAP7(外正向TAGGAGAAAGGGTTTATTGTGGT，外反向ACACACCCTACCTTTTTCACTCCA，内正向GGTATTGATTTATGGTTAGGGATTTATAG，内反向AAACAAAAAAAACTCCACCTCCAATCC，测序引物GGGATTTATAGTTTTGTGAGA)；
[0039] 以及
[0040] STAP1(外正向AGTYATGTYTTYTGYAAATAAAAATGGAYAYY，外反向TTRCTTTTTAACCACCAACACTACC，内正向YYGTTTYTTTYATYTTYTGGTGATGTTAA，内反向ARARRRCAATCTCTRRRTAATCCACATRTR，测序引物GGTGATGTTAATYTTYTGTTTA)。
[0041] 在一个实施方案中，本发明提供了受试者工作特征(ROC)实验在预测HCC中的应用，其特征在于通过使用上述CG IDs，例如STAP1(cg04398282)。
[0042] 在一个实施方案中，本发明提供了层级聚类分析在预测HCC中的应用，其特征在于，通过使用上述CG IDs。
[0043] 在第五个方面，本发明提供一种识别用于预测疾病的DNA甲基化标志物的方法，其特征在于包含对从样品中得到的DNA甲基化测量值执行统计分析的步骤。
[0044] 在一个实施方案中，本发明提供一种识别用于预测疾病的DNA甲基化标志物的方法，其特征在于，所述DNA甲基化测量值是通过对样品中提取的DNA执行Ilumina Beadchip450K或850K实验得到的。
[0045] 在一个实施方案中，DNA甲基化测量值是通过对样品中提取的DNA执行DNA焦磷酸测序、基于质谱分析法(EpityperTM)或PCR的甲基化实验得到的。
[0046] 在一个实施方案中，所述方法包含对从样品中得到的DNA甲基化测量值执行统计分析的步骤，统计分析包括皮尔森相关。
[0047] 在一个实施方案中，统计分析包括受试者工作特征(ROC)实验。
[0048] 在一个实施方案中，统计分析包括层级聚类分析实验。
[0049] 定义
[0050] 此处使用的术语“CG”是指，含有胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的DNA中的二核苷酸序列。这些二核苷酸序列在人类和其它动物DNA中能够被甲基化。CG ID显示了其在人类基因组中的位置，如Illumina 450K所示(公众可以通过下述地址获知此处所列的CGs注释：https：//bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/IlluminaHumanMethylation450k .db.html，其保存在R语言安装包
IlluminaHumanMethylation450k .db中，如Triche T和Jr .所述
IlluminaHumanMethylation450k.db：Illumina Human Methylation 45k注释数据，R语言安装包2.0.9版)。
IlluminaHumanMethylation450k .db中，如Triche T和Jr .所述
IlluminaHumanMethylation450k.db：Illumina Human Methylation 45k注释数据，R语言安装包2.0.9版)。
[0051] 此处使用的术语“惩罚回归”是指，旨在从大量生物标志物中识别用于预测结果所需的最小数量的预测因子的统计方法，其使用如下述文献中所述的R统计包“penalized”执行：Goeman,J.J.L1penalized estimation in the Cox proportional hazards model，Biometrical Journal52(1),70-84。
[0052] 此处使用的术语“聚类”是指，将一组对象以一种方式进行分组，所述方式使得相同组(称为一类)中的对象相比其它组(类)中的对象，彼此间更加相似(从某种意义上或另一种意义)。
[0053] 此处使用的术语“层级聚类”是指，一种基于类之间的相似(近)或相异(远)程度构建“类”的层级的统计方法，例如下述文献中所述：Kaufman,L.；Rousseeuw,P.J.(1990).Finding Groups in Data：An Introduction to Cluster Analysis(1ed.).New York：John Wiley.ISBN 0‐471‐87876‐6。
[0054] 此处使用的术语“基因通路”是指，一组编码蛋白的基因，已知所述蛋白在生理通路或过程中彼此间互影响。这些通路通过生物计算机方法例如Ingenuity通路分析进行表征：http：//www.ingenuity.com/products/ipa。
[0055] 此处使用的术语“受试者工作特征(ROC)实验”是指，一种用于说明预测因子性能而创建图表的统计方法。在预测因子的不同阈值设定下(即甲基化的不同百分比)，相对于假阳性率，预测真阳性率，其预测因子例如下述文献中所述：Hanley,James A.；McNeil,Barbara J.(1982)."The Meaning and Use of the Area under a Receiver Operating Characteristic(ROC)Curve".Radiology 143(1)：29–36。
[0056] 此处使用的术语“多变量线性回归”是指，一种评估例如甲基化比例、年龄、性别等的多个“独立变量”或“预测因子”和例如癌症或癌症阶段的“结果”或“因变量”之间关系的统计方法。该方法测定了，当模型中包含若干种“独立变量”时，每种“预测因子”(独立变量)在预测“结果”(因变量)的统计显著性。附图说明
[0057] 图1：外周血单个核细胞中癌症特异性DNA甲基化标志物的全基因组分布。
[0058] 图1A.来自健康对照(Ref.)、慢性乙型肝炎(HepB)、慢性丙型肝炎(HepC)以及HCC各临床进展分期(CAN1、CAN2、CAN3、CAN4)之间的DNA甲基化上升的差异的全基因组图(IGV(整合基因组学查看器)基因组浏览器)；
[0059] 图1B.上图表示伴随HCC进展甲基化减少的位点的DNA甲基化β值。下图表示伴随HCC进展DNA甲基化增加的位点的DNA甲基化β值。
[0060] 图2.处于正常、慢性肝炎和HCC各临床进展分期状态的69位个体的HCC进展的DNA甲基化标志物。每列代表一位个体，每行代表一个CG位点，甲基化水平由灰度级表示。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0061] 图3.
[0062] 图3A.HCC各临床进展分期(CAN1、CAN2、CAN3、CAN4)差异性甲基化CG位点之间重叠的CG位点数量；
[0063] 图3B.在HCC进展期间(CAN1、CAN2、CAN3、CAN4)，变为低甲基化或超甲基化的CGs数量。
[0064] 图4.使用源自HCC阶段1(BLC-0期)(20位患者)的DNA甲基化标志物对49位慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0065] 图5.使用源自HCC阶段2(BLC-A期)(20位患者)的DNA甲基化标志物对49位慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0066] 图6.使用源自HCC阶段3(BLC-B期)(20位患者)的DNA甲基化标志物对49位慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0067] 图7.使用源自HCC阶段4(BLC-C/D期)(20位患者)的DNA甲基化标志物对49位慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0068] 图8.使用350个CG DNA甲基化标志物(表3)对69位对照、慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0069] 图9.使用31个CG DNA甲基化标志物(表5)对69位对照、慢性肝炎和HCC患者的预测。黑色代表甲基化程度最高，白色代表甲基化程度最低，灰色代表甲基化程度中等。
[0070] 图10.
[0071] 图10A.使用本发明所述的以下预测性CGs的DNA甲基化测量值对区分HCC阶段2-4(BLC-A/B/C/D期)和阶段1(BLC-0期)的预测(可能性为0至1)，目标CG IDs：cg03252499、cg03481488、cg04398282、cg10203922、cg11783497、cg13710613、cg14762436、cg23486701；
[0072] 图10B.使用本发明所述的以下预测性CGs的DNA甲基化测量值对区分HCC阶段3-4(BLC-B/C/D期)和阶段1及2(BLC-0/A期)的预测(可能性为0至1)，目标CG IDs：cg02914652、cg03252499、cg11783497、cg11911769、cg12019814、cg14711743、cg15607708、cg20956548、cg22876402、cg24958366；
[0073] 图10C.使用本发明所述的以下预测性CGs的DNA甲基化测量值对区分HCC阶段4(BLC-C/D期)和阶段1至3(BLC-0/A/B期)的预测(可能性为0至1)，目标CG IDs：cg02782634、cg11151251、cg24958366、cg06874640、cg27284331、cg16476382、cg14711743。
[0074] 图11.来自健康对照(n＝10；TCTRL-1至TCTRL-10)和HCC各临床进展分期(n＝10；TCAN1、TCAN2、TCAN3、TCAN4)的T细胞之间的DNA甲基化图谱的差异。
[0075] 图12.使用源自T细胞的370个CGs(表6)在PBMC的DNA中的DNA甲基化测量值对49位慢性肝炎和HCC患者的预测。
[0076] 图13.
[0077] 图13A.使用源自PBMC的DNA的350个CGs(表3)在T细胞DNA中的DNA甲基化测量值预测HCC；
[0078] 图13B.源自HCC不同临床进展分期的T细胞(TCAN1-4)的DNA的差异性甲基化CGs与源自HCC不同临床进展分期的PBMC(PBMCCAN1、PBMCCAN2、PBMCCAN4)的DNA的差异性甲基化CGs之间的重叠；
[0079] 图13C.使用源自PBMC的DNA的31个CGs(表5)在T细胞DNA中的DNA甲基化测量值预测HCC。
[0080] 图14.通过对复制集中所有对照样品和HCC早期临床进展分期的T细胞DNA中的4个基因的DNA甲基化差异进行焦磷酸测序来进行确证。
[0081] 图15.使用T细胞DNA中作为生物标志物的STAP1的甲基化来区分HCC和健康对照的特异度(真阳性分数)(Y轴)和灵敏度(无假阳性)(X轴)的受试者工作特征(ROC)(Illumia 450K数据)(图15A)；测量PBMC中作为生物标志物的STAP1甲基化来区分HCC和全部对照(健康和慢性肝炎)的特异度(真阳性分数)(Y轴)和灵敏度(无假阳性)(X轴)的受试者工作特征(ROC)(图15B)。
[0082] 图16.(使用焦磷酸测序)测量T细胞中作为生物标志物的STAP1的甲基化来区分HCC和健康对照的特异度(Y轴)和灵敏度(X轴)的受试者工作特征(ROC)(图16A)；(使用焦磷酸测序)测量T细胞中作为生物标志物的STAP1的甲基化来区分HCC和全部对照的特异度(Y轴)和灵敏度(X轴)的受试者工作特征(ROC)(图16B)。
具体实施方式
[0083] 实施例1.与HCC癌症临床进展分期相关的外周血单个核细胞(PBMC)中的DNA甲基化标志物
[0084] 患者样品
[0085] 根据欧洲肝脏研究学会与欧洲癌症治疗研究组织EASL-EORTC临床实践指南：肝细胞癌的管理来诊断HCC临床进展分期。将患者分成四组，包括BLC-0期(阶段1)、BLC-A期(阶段2)、BLC-3期(阶段3)、和BLC-C/D期(阶段4)。为了简单起见，上述各期在本发明附图和实施例中指阶段1至4。根据美国肝病研究学会AASLD对于乙型肝炎的实践指南来确认慢性乙型肝炎的诊断，以及根据AASLD推荐来诊断慢性丙型肝炎，以及测试、管理和治疗丙型肝炎。严格的排除标准为：能够改变T细胞或单核细胞特征的任何其它已知的炎性疾病(除了乙型肝炎或丙型肝炎以外的细菌或病毒性感染、糖尿病、哮喘、自身免疫疾病、活性甲状腺疾病)。患者的临床特征见表1和表2。研究参与者同意首都医科大学的规定。该研究得到了位于北京的首都医科大学和麦吉尔大学(IRB研究编号A02-M34-13B)的伦理批准。
[0086] 表1.训练队列(training cohort)的临床数据
[0087] 由全部患者的PBMC细胞准备DNA。从健康对照和HCC患者中分离T细胞(患者ID：1-1、1-3、1-6、2-2、2-3、2-4、3-6、4-2、4-3)
[0088]
[0089] 表2.测试(复制)队列的临床数据
[0091]
[0092] Illumina Beadchip 450K分析
[0093] 将取自患者的血液加入涂敷了EDTA的试管中，使用标准方法通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心来分离外周血单个核细胞，并从Ficoll-Hypaque层之上使用常规实验步骤来收集单核细胞，因为它们具有较低的密度，通过清洗从血小板中分离单核细胞(46)。使用市售人DNA提取试剂盒(Qiagen)从细胞中提取DNA。然后使用重亚硫酸盐转化DNA，并进行Illumina HumanMethyaltion450k BeadChip杂交，使用生产商推荐的标准方法进行扫描。如麦吉尔基因组魁北克创新中心推荐，根据Illumina Infinum HD技术用户指南，样品针对玻璃片和其在微阵列中的位置随机分组，并且所有的样品均被杂交并同时扫描以减小批次影响。Illumina微阵列杂交和扫描由麦吉尔基因组魁北克创新中心根据生产商指南进行。
使用基于R语言的ChAMP Bioconductor包(47)分析Illumina微阵列。使用minfi质量控制和校准选项，将IDAT文件用作champ.load函数的输入值。针对在至少一个样品中的检测值为P>0.01的探针，过滤原始数据。过滤出X或Y染色体的探针，以减小性别影响，以及带有如文献(48)中所识别的SNPs的探针，以及如文献(48)中所识别的可以与多个位置匹配的探针。使用champ.svd函数对非标准化数据(non-normalized data)分析批次影响。前6个主成分中的5个和组及批次(玻璃片)有关。使用β-混合物位数校准(BMIQ)，借助于champ.norm函数(norm＝"BMIQ")，来执行内阵列(Intra-array)的校准，以调整因Infinium2型探针的设计引入的数据偏差(47)。在BMIQ校准之后，使用champ.runcombat函数校正了批次影响。
使用基于R语言的ChAMP Bioconductor包(47)分析Illumina微阵列。使用minfi质量控制和校准选项，将IDAT文件用作champ.load函数的输入值。针对在至少一个样品中的检测值为P>0.01的探针，过滤原始数据。过滤出X或Y染色体的探针，以减小性别影响，以及带有如文献(48)中所识别的SNPs的探针，以及如文献(48)中所识别的可以与多个位置匹配的探针。使用champ.svd函数对非标准化数据(non-normalized data)分析批次影响。前6个主成分中的5个和组及批次(玻璃片)有关。使用β-混合物位数校准(BMIQ)，借助于champ.norm函数(norm＝"BMIQ")，来执行内阵列(Intra-array)的校准，以调整因Infinium2型探针的设计引入的数据偏差(47)。在BMIQ校准之后，使用champ.runcombat函数校正了批次影响。
[0094] 根据Houseman算法(49)，使用estimateCellCounts函数并参考FlowSorted.Blood.450k数据，执行在本发明样品中外周血单个核细胞分布的细胞计数分析。批次校正的标准化数据的的β值用于下游统计分析。
[0095] 为了计算HCC各临床进展分期与450K个CG位点的DNA甲基化数量分布之间的线性相关度，使用R语言下的皮尔森相关函数，且通过使用Benjamini Hochberg的“fdr”方法(调整P值(Q)<0.05)以及传统的Bonferroni correction(Q<1x10-7)校正多重检验，来计算标准化DNA甲基化值与HCC各临床进展分期(其中序号0表示对照，1和2分别表示乙型肝炎和丙型肝炎，3-6分别表示HCC的四个临床进展分期)之间的皮尔森相关度。乙型肝炎和丙型肝炎，可以使用类似的方法，例如新一代Illumina微阵列例如Illumina 850K微阵列。
[0096] 位点特异性DNA甲基化水平的定量分布和HCC进展之间的相关性
[0097] 该分析显示大量的DNA甲基化标志物与HCC进展相关(160,904个位点)。本发明的分析集中在变化最显著的3924个位点(r>0.8；r<-0.8；Δβ>0.2/、Δβ>-0.2，p<10-7)。相对于慢性乙型肝炎和丙型肝炎以及对照，这些位点在HCC进展期间的DNA甲基化的增强变化的全基因组图如图1A所示。HCC期间位点DNA甲基化水平的增加或降低的盒图证明伴随HCC进展的DNA甲基化的变化，并且伴随HCC的进展，低甲基化含量增加(图1B)。使用减一皮尔森相关分析的聚类显示这些位点可以将所有个体HCC患者从对照、乙型肝炎和丙型肝炎个体中分类出来，除了患者CAN1-5被分类在HepC和HCC的界线上，这表明不同组的个体成员之间具有很强的一致性(图2)。
[0098] HCC的外周血单个核细胞的DNA甲基化标志物用于区分癌样品和对照
[0099] 这些DNA甲基化标志物因此具有，将患者样品分类为不同HCC临床进展分期的应用。图2中的热图显示出随着HCC进展的DNA甲基化差异的变化的增强。重要的是，本发明各分析的结合显示DNA甲基化标志物能够将最早期临床进展分期的个体HCC患者从乙型肝炎和丙型肝炎中区分出来，这在HCC的早期诊断中是一个关键的挑战。并且，本发明的分析表明来自HCC患者的PBMC的DNA甲基化的变化可以与由病毒引发的慢性炎症导致的变化相区别。基于本发明的发现，本领域技术人员可以获取类似的其它癌症的DNA甲基化标志物。
[0100] 实施例2.独特且重叠的差异甲基化位点和不同HCC临床进展分期有关，并可以将HCC从乙型肝炎和丙型肝炎中区分开来
[0101] 发明人通过使用在ChAMP中执行Bioconductor包Limma(50)描述了健康对照和各HCC临床进展分期之间的差异甲基化CGs。各HCC临床进展分期和健康对照之间的差异甲基化CG位点的数量(p<1x10-7)随着临床分期的进展而增加；阶段1(BLC-0期)为14375个；阶段2(BLC-A期)为22018个；阶段3(BLC-B期)为30709个；阶段4(BLC-C/D期)为54580个。使用基于R语言的超几何费舍尔精确检验测定两组之间重叠的显著性。癌症各阶段之间存在显著的重叠(图3A)，这暗示着HCC所有临床进展分期中存在受影响的共同标志物(p<1.9e-297)。
[0102] HCC中低甲基化的位点相比于超甲基化的位点的比例由BLC-0期的26％上升至BLC-C/D期的57％(图3B)。这种伴随着HCC进展的低甲基化位点数量的增加与皮尔森相关分析(图1、图2)的结果相一致。对于各HCC临床进展分期，通过使用阈值p<1x10-7(在Bonferroni校正之后的全基因组显著性)和Δβ为+/-0.3(用于HCCBLC-0期)以及p<10-10和Δβ为+/-0.3(用于BLC-A/B/C/D期)(对后期阶段使用更严谨的阈值来降低用于分析的位点数量)，获得高稳健性的CG甲基化标志物，所述CG甲基化标志物用于进一步分析(BLC-0期为74个，BLC-A期为14个，BLC-B期为58个，BLC-C/D期为298个)。通过整合从每个阶段独立获得的标志物列表，并去除各阶段之间多余的CG位点，从而获得组合的无冗余的350个CG位点(表3)。
[0103] 表3.从PBMC DNA中得到的最显著的350个CG IDs，其在HCC各临床进展分期和健康对照之间差异甲基化
[0104]
[0105]
[0106] 在本研究和临床设定中，HCC患者是一组有关酒精、吸烟(52-55)、性别(56)和年龄(57)的异质性群体，并且这些因子已知会影响DNA甲基化。此外，外周单核细胞是细胞的异质性混合物，个体之间细胞分布的改变可能也会影响DNA甲基化。本发明使用Houseman算法首次测定了每个病例的细胞计数分布(49)。通过两因素ANOVA及随后进行的成对比较以及多重检验的校正，发现不同组之间的细胞计数没有显著区别。对CGs执行组别、性别和年龄作为辅因子的多因素ANOVA，所述CGs是使用loop_anova lmFit函数借助于用于多重检验的Bonferoni调整来筛选得到的与HCC相关的CGs。对筛选后的与HCC相关的CG位点执行多变量线性回归分析，来测试如果使用基于R语言的lmFit函数在线性回归模型中以细胞计数、性别、年龄、和嗜酒作为辅变量，这些相关性是否还存在。使用Venny比较不同组的差异甲基化(相对于对照)基因列表(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)。使用减一皮尔森相关分析进行层级聚类，并且在布洛德研究所的基因E应用中生成热图(http：//www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/)。然后对350个CG位点的校准后的β值执行多变量线性回归，其以组别(HCC对非-HCC)、性别、酒精、吸烟、年龄和细胞计数作为辅变量可以将HCC从所有其它组中区分出来。即使模型中包含其它辅变量，所有CG位点对各组辅变量仍然是高度显著的。在对350个测量值进行Bonferroni校正之后，342个CG位点对于组别(HCC对非-HCC)仍然是高度显著的。执行多因子ANOVA分析，其中将350个位点的β值作为可靠变量，并将组别(HCC对非-ANOVA)、性别和年龄作为非可靠变量，来测定性别和组别、年龄和组别、以及在性别+年龄和组别之间的DNA甲基化是否存在可能的相互作用。
[0107] 然而在Bonferroni校正之后，组别仍然对全部350个CG位点保持显著，性别或年龄没有发现显著的相互作用。总而言之，这些数据表明了在HCC和其它非-HCC患者包括乙型肝炎和丙型肝炎的PBMC DNA之间具有稳健的DNA甲基化差异。
[0108] 实施例3：通过减一皮尔森聚类分析，癌症临床进展分期特异性DNA甲基化标志物用于预测来自患者的未知样品，从而检测早期临床进展分期的HCC癌症，并区分早期临床进展分期的HCC癌症和慢性肝炎
[0109] 通过比较10个健康对照和10个临床进展分期特异性HCC患者，获得了每个HCC临床进展分期的差异甲基化位点。其它临床进展分期和乙型肝炎和丙型肝炎样品没有被这些差异甲基化CGs“训练”(“训练”被用于模型来获得差异甲基化位点)，它们作为未知样品的“交叉验证”集来解释以下问题：首先，源自癌症一个临床进展分期的标志物是否可以正确地将没有被这些标志物“训练”的HCC样品分类？其次，被“训练”用于区分HCC和健康对照的DNA甲基化标志物是否也能够将HCC从乙型肝炎和丙型肝炎中区分？区分HCC和慢性肝炎对于HCC的早期诊断是一个关键的挑战，因为显著比例的HCC患者是由慢性肝炎发展为HCC的。
[0110] 通过减一皮尔森相关分析，对所有HCC和肝炎样品进行层级聚类，其中每个单独分析使用一组CG甲基化标志物，所述CG甲基化标志物通过仅仅测试一个HCC临床进展分期和对照而被“发现”。其它所有临床进展分期相对于这些标志物是“naive”的，并用作“交叉验证”。交叉验证是指一种统计策略，其在研究中样品的一小组子集用于“发现”标志物列表(预测因子)，其能将两组之间彼此区分(即“癌症”和“对照”)。这些“被发现”的标志物随后作为预测因子在研究中的其它“新”样品中被测试。如图4-7中所示，独立得到的各HCC特定临床进展分期的标志物集被“交叉验证”；它们正确地从一组样品中预测了HCC，所述样品包括“新”HCC和非HCC病例(图4使用BLC-0期标志物，图5使用BLC-A期标志物，图6使用BLC-B期标志物，图7使用BLC-C/D期标志物)。显著地，通过仅仅比较HCC一个阶段和健康对照而发现的CG标志物能够正确地从一组包含HCC和慢性肝炎病例的品中预测HCC。这为慢性肝炎和癌症具有不同的DNA甲基化谱提供了进一步的证据，其可以用于预测一个患者是否仍是慢性肝炎，或他/她是否已经转变为HCC。有趣的是，相同的标志物也可以正确地预测乙型肝炎和丙型肝炎病例(图4-7)。
[0111] 使用费舍尔超几何检验(p<1.921718e-297)表明，可以区分各HCC临床进展分期的独立得到的CG标志物之间的重叠(图3A)，对于各临床进展分期之间全部可能的重叠均是显著的。独立使用仅仅10个病例和对照而得到的各临床进展分期标志物之间高度显著的重叠，强烈地证明了这些标志物的稳健性，并表明这些差异甲基化CGs可以用作HCC外周标志物，其可以用于早期检测。
[0112] 虽然在癌症不同临床进展分期差异甲基化CGs之间存在很大的重叠，但是该重叠是部分的。本发明在此证明我们可以利用350个CG的列表(如上所述)(表3)来区分HCC各个临床进展分期。使用这350个CGs通过对所有样品进行减一皮尔森相关分析的层级聚类，可以根据临床进展分期正确地将HCC病例进行分类，而乙型肝炎和丙型肝炎病例被分类到健康对照。虽然健康对照和HCC不同临床进展分期的差异性甲基化位点之间还存在较大的重叠，差异甲基化的强度随着HCC进展而增强。因此，这350个CG位点的甲基化水平也可以用于区分HCC各临床进展分期。包含检测如表3中所述的CG IDs的DNA甲基化测量值的装置和试剂的试剂盒，可以用于预测肝细胞癌(HCC)各临床进展分期和慢性肝炎。注意，DNA甲基化标志物列表通过仅仅比较健康对照和HCC单个临床进展分期而得到的，然而该列表可以正确地预测其它“新”乙型肝炎和丙型肝炎病例为非HCC(图8)。
[0113] 本发明的内容表明了源自HCC患者的PBMC的差异甲基化CGs可以用于区分特定临床进展分期的HCC和对照，以及区分特定临床进展分期的HCC和慢性肝炎患者。
[0114] 实施例4：临床进展分期特异性CG甲基化标志物，通过使用惩罚回归区分早期临床进展分期HCC和晚期临床进展分期HCC
[0115] 数据表明PBMC DNA甲基化标志物可以区分不同HCC临床进展分期。本发明然后定义了区分HCC各临床进展分期所需最少数量的CG位点列表。使用用于拟合惩罚回归模型的R包“penalized”对不同临床进展分期的样品之间的350个CG位点进行惩罚回归(51)。R包“penalized”使用似然交叉验证，并且对每个留出来的对象进行预测。拟合的模型识别了用于预测BLC-0期vs对照的8个CGs，用于预测BLC-A期vs对照的5个CGs，用于区分BLC-A期vs对照的5各CGs，用于区分BLC-C/D期vs对照的7个CGs，以及足以区分BLC-0期和乙型肝炎的7个CGs(表4)。选择以下CGs：可以区分BLC-0期和后期阶段BLC-A/B/C/D期的8个CGs，以及将BLC-0期和BLC-A期从后期阶段BLC-B/C/D期中区分的10个CGs，以及能够将从全部早期阶段(BLC-0/A/B期)中区分的7个CGs(表4)。31个CG阶段-分隔符的整合列表(在去除重复之后，表5)在PBMC DNA甲基化的测量值，通过减一皮尔森聚类可以精确地预测所有HCC病例以及它们的临床进展分期(图9)。包含检测如表4和表5中所述的CG IDs的DNA甲基化测量值的装置和试剂的试剂盒，可以用于预测肝细胞癌(HCC)各临床进展分期。
[0116] 表4.使用惩罚回归模型，可以将不同临床进展分期的HCC从对照和乙型肝炎和丙型肝炎中区分的CG标志物
[0117]
[0118] 表5.使用惩罚回归模型，可以将不同临床进展分期的HCC从对照、乙型肝炎和丙型肝炎中区分的31个CGs的整合列表(去除重复的CGs)
[0119]cg14983135 cg10203922 cg05941376 cg14762436 cg12019814
cg03496780 cg02782634 cg27284331 cg23981150 cg14914552
cg13710613 cg23486701 cg11911769 cg14711743 cg15607708
cg14426660 cg18882449 cg02914652 cg15188939 cg12344600
cg21164050 cg03252499 cg03481488 cg04398282 cg11783497
cg20956548 cg22876402 cg24958366 cg11151251 cg06874640
cg16476382
cg03496780 cg02782634 cg27284331 cg23981150 cg14914552
cg13710613 cg23486701 cg11911769 cg14711743 cg15607708
cg14426660 cg18882449 cg02914652 cg15188939 cg12344600
cg21164050 cg03252499 cg03481488 cg04398282 cg11783497
cg20956548 cg22876402 cg24958366 cg11151251 cg06874640
cg16476382
[0120] 实施例5：具有100％特异性和灵敏度的CG惩罚回归模型在预测未知样品的不同癌症临床进展分期中的应用
[0121] 然后对其它“naive”(未用于发现标志物的新样品)HCC病例、乙型肝炎和丙型肝炎对照，使用通过表4中所列的CGs用于区分特定临床进展分期而得到的惩罚模型，来预测每个病例是HCC不同临床进展分期的可能性。这些分析的结果如图10所示。该惩罚模型能够以100％灵敏度和100％特异性预测所有临床进展分期样品。
[0122] 实施例6：DNA甲基化标志物，用于通过由T细胞提取的DNA来区分HCC和健康对照[0123] 多变量分析表明，即使当把细胞计数的差异考虑进来，HCC和其它组(对照和慢性肝炎)之间的PBMC DNA甲基化的差异依然存在。进一步地，为了测定一旦特定细胞类型被分离而降低细胞组合物的复杂性时(虽然T细胞子类型仍然具有异质性)，癌症和对照之间DNA甲基化的差异是否会消失，分析了分离自参与本研究的39位HCC患者中的10位患者和所有健康对照(n＝10)的T细胞之间的DNA甲基化图谱的差异(样品来自各HCC临床进展分期，如表1中说明所示)，来测定一旦特定细胞类型被分离而部分降低细胞组合物的复杂性时，癌症和对照之间的DNA甲基化差异是否会消失。
[0124] 使用抗CD3免疫磁珠(Dynabed生命技术)分离T细胞，使用CHAMP包对HCC和健康对照之间的校准的DNA甲基化值进行线性(混合效应)回归，其表明在阈值为p<1x10-7时有24863个差异甲基化位点。在阈值为p<1x10-7和Δβ>0.3，<-0.3时筛选出370个稳健的差异甲基化CGs(表6)，并通过执行减一皮尔森相关分析对健康对照和HCC T细胞DNA执行层级聚类(图11)。这370个CGs可以正确地将所有样品分类到两个组：HCC和对照。包含检测如表6中所述的CG IDs的DNA甲基化测量值的装置和试剂的试剂盒，可以用于预测HCC各临床进展分期和慢性肝炎。
[0125] 表6.源自T细胞的最显著的370个CG IDs列表，其可以通过细胞DNA来区分HCC和健康对照
[0126]
[0127]
[0128]
[0129] 实施例7：T细胞中发现的DNA甲基化标志物用于预测“未训练”的HCC和慢性肝炎患者
[0130] 这些可以将区分HCC和健康对照的T细胞的370个CG位点，可以用于将“未训练的”不同的慢性肝炎和健康对照的PBMC样品(n＝69)进行分类。如图12所示的聚类分析，显示这370个在T细胞DNA中差异甲基化的CG位点，可以将个体HCC、肝炎和健康对照的DNA从PBMC中以100％的准确度进行分类。因此，通过使用T细胞DNA发现的差异甲基化CGs，在不同患者中(29位患有HCC的不同患者，20位患有慢性肝炎)通过PBMC中的DNA甲基化测量值得到了交叉验证。
[0131] 实施例8：源自于PBMC DNA分析的350个CG位点(表3)和31个CG位点(表5)用于使用T细胞DNA预测HCC癌症
[0132] 通过分析PBMC DNA得到的350个CG位点可以正确地将健康对照和HCC样品的T细胞进行分组(图13A)。下述两组显著的CGs之间存在高度显著的重叠(费舍尔，p<1x10-7)：通过使用T细胞DNA来区分健康对照和HCC的显著CGs，以及通过使用PBMC DNA来区分不同的HCC临床进展分期和对照的CGs(图13B)。
[0133] 本发明同样表明，对PBMC DNA甲基化测量值进行惩罚回归筛选后的31个CGs(表5)能通过使用减一皮尔森相关分析准确地将HCC患者和对照的T细胞DNA甲基化测量值进行分组并确定HCC临床进展分期(图13C)。这些数据表明即使当细胞类型的复杂性通过分离特定的细胞类型而降低时，HCC和其它样品间的DNA甲基化差异仍然存在，并且为这些CGs和HCC及它们的预测值之间的关联提供了进一步的“交叉验证”。
[0134] 实施例9：HCC的PBMC的差异甲基化基因在免疫相关的经典通路中富集[0135] HCC进展在甲基化组中具有广泛的印迹(全基因组DNA甲基化图谱)(图1)。为了深入理解源自HCC患者的PBMC和T细胞中差异甲基化基因的功能印记，使用Ingenuity通路分析(IPA)将由差异甲基化分析生成的基因列表进行基因组富集分析。我们首先对CGs相关基因进行基因组富集分析，所述CGs与HCC各临床进展分期在皮尔森相关分析中表现出线性相关(r>0.8；r<-0.8；Δβ>0.2，Δβ<-0.2)(图1)。显然地，和这些CGs相关的基因的最上游调控子是TGFbeta(p<1.09x10-17)、TNF(p<7.32x10-15)、地塞米松(p<7.74x10-12)和雌二醇(p<4x10-12)，其均为免疫系统的主要免疫炎症和应力调节子。识别的最高疾病是癌症(p值为
1x10-5至2x10-51)和肝脏疾病(p<1.24x10-5至1.11x10-25)。注意到肝脏增生(p<6.19x10-1至
1.11x10-25)和肝细胞癌(p<5.2x10-1至3.76x10-25)的强烈信号。对差异性甲基化基因的检查表明：免疫调节分子的大量代表例如IL2、IL4、IL5、IL16、IL7、Il10、IL18、Il24、Il1B和白介素受体例如IL12RB2、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2RA、IL4R、IL5RA；趋化因子例如CCL1、CCL7、CCL18、CCL24，以及趋化因子受体例如CCR6、CCR7和CCR9；细胞受体例如CD2、CD6、CD14、CD38、CD44、CD80和CD83；TGFbeta3和TGFbetaI、NFKB、STT1、STAT3和TNFa。
1x10-5至2x10-51)和肝脏疾病(p<1.24x10-5至1.11x10-25)。注意到肝脏增生(p<6.19x10-1至
1.11x10-25)和肝细胞癌(p<5.2x10-1至3.76x10-25)的强烈信号。对差异性甲基化基因的检查表明：免疫调节分子的大量代表例如IL2、IL4、IL5、IL16、IL7、Il10、IL18、Il24、Il1B和白介素受体例如IL12RB2、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2RA、IL4R、IL5RA；趋化因子例如CCL1、CCL7、CCL18、CCL24，以及趋化因子受体例如CCR6、CCR7和CCR9；细胞受体例如CD2、CD6、CD14、CD38、CD44、CD80和CD83；TGFbeta3和TGFbetaI、NFKB、STT1、STAT3和TNFa。
[0136] PBMC和T细胞差异甲基化基因之间的比较的IPA分析显示NFKB、TNF、VEGF、IL4和NFAT作为普通上游调控子。总而言之，HCC PBMC和T细胞的DNA甲基化改变显示出免疫调控功能中具有强烈的标志物。先前已经描述了HCC和非癌变肝脏组织之间的差异性甲基化启动子(16,58)。本发明测定了HCC的癌症活体检查(1983个启动子)和外周血单个核细胞(545个启动子)之间差异性甲基化的启动子之间是否存在重叠，发现有44个启动子的重叠，其在费舍尔超几何检验中不是统计学显著的(p＝0.76)。这些数据表明，外周血单个核细胞中观察到的DNA甲基化变化反应了HCC免疫系统的变化，并且这些差异甲基化CGs很有可能不是来自肿瘤的循环DNA的印迹，或肿瘤中发生的DNA甲基化变化的“替代物”。这些通路的应用为向靶向外周免疫系统的的癌症治疗提供新目标。
[0137] 实施例10：通过对差异甲基化CGs进行焦磷酸测序来预测HCC和癌症
[0138] 使用PyroMark Q24机器执行焦磷酸测序，使用 Q24软件(Qiagen)分析结果。所有的数据都表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用R语言进行统计分析。用于分析的引物列于表7。
[0139] 表7.用于HCC预测因子：AHNAK、SLFN2L、AKAP7、STAP1的焦磷酸测序[0140]
[0141] 针对复制集(replication set)，本发明使用T细胞DNA来降低细胞组合物问题。复制集包括79人，其中10位健康对照、乙型肝炎、丙型肝炎和3个癌症阶段各10人、以及19个BLC-0期样品(表2)。经检测发现，在发现集中以下基因在和HCC对比中的T细胞甲基化差异非常显著：STAP1(cg04398282)(包含在表6中)、AKAP7(cg12700074)、SLFNL2(cg00974761)，并且包含一个另外的HCC中低甲基化基因：成神经细胞分化相关蛋白(AHNAK)(cg14171514)。
[0142] 全部对照(健康和乙型肝炎和丙型肝炎)和HCC BLC-0期、BLC-A期(0+A)之间的线性回归表明HCC BLC-0期、BLC-A期和全部4个CG在多重检验校正之后具有显著的相关(STAP1 p＝4.04x10-7；AKAP7 p＝.0.046；SLFNL2 p＝0.012；AHNAK p＝0.003436)。全部对照和HCC所有临床进展分期之间的线性回归表明了在多重检验校正之后，STAP1(p＝6.6x10-6)和AHNAK与HCC(p＝0.026)具有显著的相关。
[0143] ANOVA分析显示了验证的全部4个CG在对照组(健康对照和乙型肝炎和丙型肝炎)与早期HCC组(BLC-0+A；1、2)的甲基化之间具有显著的差异。在全部对照和全部HCC的组之间的比较显示了下述基因甲基化的显著差异：STAP1(p＝1.7x10-6)、AKAP7(p＝0.042)、AHNAK(p＝0.0062)，但是SLFNL2的差异是有一定趋势的但不显著(p＝0.071)。ANOVA显示了-6STAP1甲基化诊断的显著效应(F＝10.017；p＝7.49x10 )。
[0144] 对于对照的5种不同的诊断亚组(健康对照、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎)和早期HCC(阶段1和2或BLC-0和BLC-A)的多重检验校正之后的成对分析显示，BLC-0期(BCLC 0)HCC和健康对照(p＝0.00037)、慢性乙型肝炎(p＝0.00849)、慢性丙型肝炎(p＝0.00698)的其中之一之间的显著差异，以及BLC-A期(BCLC A)和健康对照(p＝0.00018)、乙型肝炎(p＝0.00670)、丙型肝炎(p＝0.00534)的其中之一之间的显著差异。尽管下述基因存在诊断影响：SLFN2L甲基化(F＝3.9376；p＝0.00810)AHNAK(F＝3.0219；p＝0.02809)和AKAP7(F＝
3.4；p＝0.01633)，不同的诊断亚组之间的成对比较不显著。
3.4；p＝0.01633)，不同的诊断亚组之间的成对比较不显著。
[0145] 这些数据表明这4个CG位点可以用于预测早期HCC阶段，并将它们从对照中区分出来(图14)。
[0146] 实施例11：发现的差异甲基化CGs列表通过受试者工作特征(ROC)分析用于预测HCC；STAP1的实施例
[0147] 对生物标志物的诊断值的测量为受试者工作特征(ROC)，其测量“灵敏度”(真发现分数)作为“特异度”(假发现分数)的函数。ROC检验测定一个阈值(即特定CG的甲基化比例)，其可以提供最准确的预测(“真发现”的最高分数，以及“假发现”的最少数量)(59)(图15)。
[0148] 将每个样品的DNA甲基化水平与阈值DNA甲基化值进行对比，然后样品被归类为对照或HCC。本发明首次测定了来自健康对照和HCC的T细胞的校准的Illumina 450K beta值的ROC特征(图15A)。STAP1基因cg04398282表现为完美的生物标志物。当阈值DNA甲基化beta值为0.757时(任何具有更高值的样品被归类为HCC，任何具有低于0.757的值的样品被归类为对照)，识别(calling)的HCC样品的准确度为100％，曲线下面积(AUC)为1，其灵敏度和特异度均为100％。STAP1生物标志物是通过比较来自HCC和健康对照的T细胞的DNA甲基化而发现的。我们因此可以通过使用来自PBMC DNA样品的校准的beta值来检查ROC特征从而交叉确认STAP1 cg04398282的生物标志物特性，所述样品包括乙型肝炎和丙型肝炎以及29个额外的HCC患者，所述HCC患者没有被包含在T细胞DNA甲基化的分析中(图15B)。使用PBMC DNA预测所有HCC样品(全部临床进展分期)的准确度为96％，使用阈值beta值为
0.6729并且AUC为0.9741379(灵敏度为0.975以及特异度为0.973)。
0.6729并且AUC为0.9741379(灵敏度为0.975以及特异度为0.973)。
[0149] 使用T细胞DNA复制集中STAP1的焦磷酸测序值检查ROC特征(图16)。STAP1的CG甲基化值通过焦磷酸测序位点定量为总体低于Illumina 450K值。在STAP1 cg04398282的DNA甲基化的阈值40.2％处，将HCC从所有其它对照(健康和乙型肝炎和丙型肝炎)中识别的准确度为82.2％。用于区分HCC和所有对照的曲线下面积(AUC)为0.8(85％的灵敏度，以及73％的特异度)(图16A)。在STAP1 cg04398282的阈值为50.12％时，将HCC BLC-0期从所有对照中区分出的准确度为83.6％，并且AUC为0.89(84％的灵敏度以及83％的特异度)。阈值甲基化水平为47.2时，将HCC BLC-0期从健康对照中区分的准确度为93％(图16A)，且AUC为
0.94(94％的灵敏度以及94％的特异度)(图16B)。总而言之，STAP1表明HCC外周血单个核细胞中的DNA甲基化标志物可以用于将BLC-0期从慢性肝炎以及健康对照中区分，其为肝癌早期诊断的关键障碍。使用T细胞DNA来识别STAP1，并且其在通过复制集中得到证实(图14)。
0.94(94％的灵敏度以及94％的特异度)(图16B)。总而言之，STAP1表明HCC外周血单个核细胞中的DNA甲基化标志物可以用于将BLC-0期从慢性肝炎以及健康对照中区分，其为肝癌早期诊断的关键障碍。使用T细胞DNA来识别STAP1，并且其在通过复制集中得到证实(图14)。
[0150] 此处使用的用于测量DNA甲基化的方法仅仅是提供了一个例子，并没有排除其它测量DNA甲基化的方法。应该注意到，本领域技术人员可以使用很多公知领域公开充分的可接受和使用的方法来测量STAP1和其他差异甲基化位点的DNA甲基化，例如Illumina 850K试验、基于如Epityper(Seqenom)方法的质谱分析法、使用甲基化特异性引物的PCR扩增(MS-PCR)、高分辨溶解(HRM)、DNA甲基化敏感性的限制酶和重亚硫酸盐测序。
[0151] 本发明的应用
[0152] 本发明的应用涉及HCC和癌症的分子诊断领域。本领域技术人员可以使用本发明得到其它癌症的类似的生物标志物。并且，由这些基因得到的基因和通路，通过使用实施例9所列的靶标，可以指导将新药物集中在外周免疫系统中。目前DNA甲基化在癌症中的研究一直集中在肿瘤、肿瘤微环境(8,9)和循环的肿瘤DNA(5,6)中，并主要在这方面做出了进展。然而，关于宿主系统中是否存在可以告知我们疾病的系统范围的机制和/或可以用作癌症的非侵入式预测因子的DNA甲基化变化的问题，仍然存在。HCC是一个非常有趣的例子，因为它可以频繁地从先存的慢性肝炎和肝硬化进展而来(2)，并且可以提供解决该问题的可追踪的临床范例。本发明表明宿主免疫系统的质量可能定义了癌症的临床出现和轨迹。
[0153] 重要的是，本发明表明在HCC BLC-0期和慢性肝炎乙型和丙型之间的明确边界可以用来诊断慢性肝炎向HCC的早期转变，如本发明的实施例中所示。本发明同样表明如何将本发明用于区分癌症的几个临床进展分期。所有的试验均需要一组已知的样品和未知的样品，所述已知的样品具有本发明公开的CG IDs的甲基化值，其使用层级聚类、ROC或惩罚回归来训练模型；将使用本发明实施例中所述的这些模型来分析未知样品。
[0154] 本发明提到了不同的从属权利要求的事实，并不意味着本领域技术人员不能使用这些权利要求的组合来预测癌症。此处公开的用于测量、统计分析和预测癌症的癌症临床进展分期和慢性肝炎的实施例，不能认为是对本发明的限制。为了测量癌症患者的DNA甲基化，其它变型对于本领域技术人员而言是显而易见的，例如Illumina 850K试验、捕获微阵列测序、下一代测序、甲基化特异性PCR、表位型、基于限制酶的分析，和其它公知领域发现的方法。类似地，除了此处所列的，公知领域存在大量的可以使用本发明来预测患者样品的癌症的统计方法。
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