一种诱导分化人外周血单个核细胞的方法
专利汇可以提供一种诱导分化人外周血单个核细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属 生物 技术领域，涉及一种将人 外周血单个核细胞 诱导分化为心肌细胞的培养方法。本发明方法从人外周血分离出单个核细胞，通过体外直接培养，用5－氮杂胞苷诱导其分化为心肌细胞。本发明方法诱导后的外周血单个核细胞具有心肌细胞的部分特点，又具有干细胞的特征。本方法可最大限度利用有分化潜 力 的干细胞，避免成体干细胞的损失。为人外周血单个核细胞诱导分化的分离和培养建立了方法学，为此类研究奠定了 基础 。本发明还为诱导后的单个核细胞回输体内后进一步分化为成熟的、有功能的心肌细胞，恢复心脏功能的临床应用提供了准备。，下面是一种诱导分化人外周血单个核细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导分化人外周血单个核细胞的方法，其特征在于采用分离人外周血单个核细胞后，经体外直接培养、5-氮杂胞苷诱导分化得到心肌细胞，包括下述步骤，1)分离人外周血单个核细胞：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞；2)体外培养人外周血单个核细胞：含20％FBS的DMEM培养液、培养箱37℃2、5％CO2，将人外周血单个核细胞种植于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上；3)诱导分化人外周血单个核细胞：DMEM培养液中加入5-氮杂胞苷10μmol/L；将人外周血单个核细胞种植于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上；4)鉴定心肌细胞标志：进行细胞形态学观察、相关蛋白的免疫细胞化学染色和相关基因的RT-PCR检测。
2.按权利要求1所述的诱导分化人外周血单个核细胞的方法，其特征在于所述的人外周血单个核细胞体外培养液内所含成分为：DMEM+20％FBS+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+HEPES2.5g/L+NaHCO3 3.7g/L+谷氨酰胺2％vol/vol。
3.按权利要求1所述的诱导分化人外周血单个核细胞的方法，其特征在于所述的培养液中所加的5-氮杂胞苷终浓度为浓度为10-20μmol/L。
4.按权利要求1所述的诱导分化人外周血单个核细胞的方法，其特征在于所述的人外周血单个核细胞种植密度为105cell/cm2。
5.按权利要求1所述的诱导分化人外周血单个核细胞的方法，其特征在于所述的包被明胶浓度为2％，密度为5-10μl/cm2。
6.按权利要求6所述的方法，其特征在于所述的包被明胶密度为5μl/cm2。
一种诱导分化人外周血单个核细胞的方法
技术领域
背景技术
干细胞移植治疗缺血性心脏病已经是心脏病学研究的前沿。移植的干细胞来源主要有两大类：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于法律和伦理学方面的问题，来源受到极大的限制，且有免疫排斥反应和形成畸胎瘤的风险。成体干细胞来源广泛，易得，具有高度相容性，可自体移植无须免疫抑制剂治疗，临床应用方便。成体干细胞主要包括骨髓干细胞、脐血干细胞和外周血成体干细胞。其中骨髓干细胞在采集时有一定困难，造成患者痛苦；脐血干细胞异体移植时存在排异反应，必须同时使用免疫抑制剂。而从外周血分离成体干细胞比从骨髓或脐血中分离成体干细胞更简单易行，外周血的采集量较大，并且从病人外周血中得到成体干细胞进行自体回输不存在排异反应，临床可行性大。有研究报道胚胎干细胞和骨髓干细胞在体外诱导分化为心肌细胞，但临床试验效果尚不确定。有关外周血单个核细胞诱导分化为心肌细胞的体外研究未见报道。
发明内容
本发明方法从人外周血分离出单个核细胞，通过体外直接培养，用5-氮杂胞苷诱导其分化为心肌细胞。5-氮杂胞苷是胞苷类似物，作为DNA甲基化抑制剂，通常应用于肿瘤治疗。本发明方法采用10μmol/L浓度的含5-氮杂胞苷的DMEM培养液刺激诱导外周血单个核细胞24小时，结果证实外周血单个核细胞能够向心肌细胞分化。使其既有部分心肌细胞的特征，又具备部分干细胞的特征。具备了回输体内后进一步分化为成熟心肌细胞的条件。
本方法从外周血中分离出单个核细胞直接培养、诱导分化，可最大限度利用外周血中有分化潜力的干细胞，避免成体干细胞的损失。
本发明的技术方案通过下述步骤实现：1)分离人外周血单个核细胞：取人股动脉抗凝血10-15ml，用Ficoll密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞。
2)体外培养人外周血单个核细胞：含20％FBS的DMEM培养液、培养箱37℃、5％CO2，将人外周血单个核细胞种植于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上；3)诱导分化人外周血单个核细胞：DMEM培养液中加入5-氮杂胞苷10μmol/L；将人外周血单个核细胞种植于包被有明胶的培养瓶中或小玻片上；4)鉴定心肌细胞标志：进行细胞形态学观察、相关蛋白的免疫细胞化学染色和相关基因的RT-PCR检测。
上述DMEM完全培养液按下述方法配制：取DMEM(低糖型粉剂)10g，青霉素100mg，链霉素100mg，HEPES 2.5g，NaHCO33.7g，加入双蒸水1000ml，磁力搅拌均匀，过滤除菌，作为DMEM完全培养液储存液，分装备用。其中每80ml上述DMEM完全培养液加胎牛血清FBS(Gibco公司)20ml和谷氨酰胺Gluta Max(Gibco公司)2ml，作为工作液，即可使用。
所说的DMEM完全培养液内所含成分为：DMEM+20％FBS+0.1mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素+HEPES(2.5g/L)+NaHCO3(3.7g/L)+谷氨酰胺(2％vol/vol)。
所述5-氮杂胞苷(Sigma公司)，按10-20μmol/L的不同终浓度加入DMEM完全培养液中，按需使用。
所述外周血单个核细胞按105cell/cm2种植；培养瓶中或小玻片上包被有1-2％的明胶，密度为5-10μl/cm2，优选明胶密度为5μl/cm2。
本发明实验所用试剂均为市购。
本发明心肌细胞特性及相关抗原鉴定结果显示，①，相差显微镜下细胞形态学特征观察，单个核细胞接种初期，贴壁细胞大多呈现圆形。经5-氮杂胞苷刺激后，于培养第7、14、18天，贴壁细胞呈纺锤形且数量明显增多，体积逐渐增大呈球形及杆状外观，分布渐密集，并有聚集成簇的趋势。
②，免疫细胞化学染色法(DAB两步法)检测心肌细胞相关抗原的表达，结果显示，经5-氮杂胞苷刺激诱导后单个核细胞的肌钙蛋白T(Troponin T)、α-肌节肌动蛋白(α-Sarcomeric Actin)、结蛋白(Desmin)和肌球蛋白(Myosin)均呈阳性结果(细胞浆显棕色、细胞核呈蓝色为阳性细胞)。表明本发明所培养和诱导的单个核细胞在一定程度上与心肌细胞的内部组成相一致。
③，RT-PCR检测心肌细胞有关基因的表达结果显示，诱导分化后的单个核细胞存在GATA-4和MEF-2D心肌细胞早期发育相关基因的表达，存在α肌球蛋白重链(α-MHC、190bp)和β肌球蛋白重链(β-MHC、257bp)基因的表达，而未经诱导分化的单个核细胞则未见α-MHC和β-MHC的表达。检测结果在基因的水平证实了诱导后的MNC具有心肌细胞的部分特征。
④，流式细胞检测计数：用FITC-CD34和PE-AC133抗体同时标记待测细胞后，流式细胞检测计数结果为，CD34阳性率：49.63±6.02％；AC133阳性率：48.58±6.48％；CD34阳性或AC133阳性率：53.04±5.60％；用FITC间接免疫荧光法标记α-Sarcomeric Actin后，流式细胞检测计数结果为，α-Sarcomeric Actin阳性率：42.70±11.73％(n＝3)结果表明，体外培养诱导的单个核细胞已经向心肌细胞方向分化。
本发明方法具备如下优点，本发明方法诱导后的外周血单个核细胞既具有心肌细胞的部分特点，又具有干细胞的特征。说明培养和诱导后的单个核细胞在体外既能够向心肌细胞方向分化；又具有进一步分化和增殖的潜力。
外周血中成体干细胞存在于单个核细胞中，一般认为CD34阳性是干细胞的表面标志，以往按照CD34或者AC133阳性筛选干细胞进行实验研究，不可避免的造成干细胞的损失。本发明从外周血中分离出单个核细胞直接培养、诱导，可最大限度利用有分化潜力的干细胞，避免成体干细胞的损失。
本发明方法为人外周血单个核细胞诱导分化的分离和培养建立了方法学，为此类研究奠定了基础。
本发明方法还充分为临床应用做准备，若将诱导后的单个核细胞回输体内，可经过归巢作用回流到缺血的心肌组织，这些细胞在心肌组织微环境中，可以进一步分化为成熟的、有功能的心肌细胞，从而恢复心脏功能。
附图说明
图1，单个核细胞培养第14天(200×)。
图2，单个核细胞培养第18天(400×)。
图3，单个核细胞培养的第14天，Myosin免疫细胞化学染色阳性(400×)。
图4，单个核细胞培养的第14天，α-Sarcomeric Actin免疫细胞化学染色阳性。(400×)。
图5，单个核细胞体外培养第7天，RT-PCR显示：GATA-4和MEF-2D心肌细胞早期发育相关基因的表达。
图6，单个核细胞体外培养第14天，RT-PCR显示：α肌球蛋白重链(α-MHC、190bp)和β肌球蛋白重链(β-MHC、257bp)基因的表达。
具体实施方式
2、体外培养以及诱导分化人外周血单个核细胞：将单个核细胞按105cell/cm2的密度接种于包被有1-2％明胶的培养瓶中或小玻片上，明胶密度为5μl/cm2，培养液为DMEM完全培养液。细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，第3-4天更换为含有5-氮杂胞苷(浓度为10-20μmol/L)的DMEM完全培养液。刺激24小时，再换为原DMEM完全培养液继续培养。然后，每隔3到4天根据细胞生长情况决定半量或全量换液。
3、心肌细胞特性及相关抗原鉴定：细胞形态学特征：相差显微镜下观察，单个核细胞接种于培养板初期，贴壁细胞大多呈现圆形。在细胞接种3-4天后，给予5-氮杂胞苷刺激诱导。在5-氮杂胞苷刺激24小时后贴壁细胞开始伸长。在培养的第7天左右，部分贴壁细胞呈纺锤形，分布较稀疏。在培养的第14天左右，纺锤形细胞数量明显增多，分布较密集，，并有聚集成簇的趋势。在培养的第18天，贴壁细胞体积逐渐增大呈球形及杆状外观。
心肌细胞相关抗原的表达：在单个核细胞培养的第14天(即5-氮杂胞苷刺激诱导后第10天)，通过免疫细胞化学染色法(DAB两步法)检测发现肌钙蛋白T(Troponin T)、α-肌节肌动蛋白(α-Sarcomeric Actin)、结蛋白(Desmin)和肌球蛋白(Myosin)均呈阳性结果(细胞浆显棕色、细胞核呈蓝色为阳性细胞)。
心肌细胞有关基因的表达：在体外培养的第7天，RT-PCR结果显示：诱导分化后的单个核细胞存在GATA-4和MEF-2D心肌细胞早期发育相关基因的表达。体外培养的第14天，RT-PCR结果显示经5-氮杂胞苷诱导分化后的单个核细胞存在α肌球蛋白重链(α-MHC、190bp)和β肌球蛋白重链(β-MHC、257bp)基因的表达，而未经诱导分化的单个核细胞则未见α-MHC和β-MHC的表达。
流式细胞检测计数：(1)在单个核细胞培养第14天，用FITC-CD34和PE-AC133抗体同时标记待测细胞后，进行流式细胞检测计数。
CD34阳性率：49.63±6.02％；AC133阳性率：48.58±6.48％；CD34阳性或AC133阳性率：53.04±5.60％。
(2)单个核细胞培养第14天，用FITC间接免疫荧光法标记α-Sarcomeric Actin后，对所培养细胞进行流式细胞检测计数。
α-Sarcomeric Actin阳性率：42.70±11.73％(n＝3)所用上述检测方法为常规已知方法。
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