制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法及制得的
DC-CIK免疫细胞
技术领域
背景技术
[0002] DC-CIK联合免疫细胞，全称是细胞因子激活的杀伤细胞-树突状细胞混合疗法。它是既含有杀伤性免疫细胞同时还有树突状细胞。树突状细胞因为长得像树杈得名，是免疫系统很重要的一部分。树突细胞并不直接杀死细胞，它只是一种免疫呈递细胞，把
信号呈递给杀伤免疫细胞，理论上DC-CIK联合免疫细胞杀死癌症细胞的能
力应该更强，但是临床上DC-CIK疗法效果也是很有限，因为它无法突破DC-CIK疗法的
瓶颈：癌症的免疫抑制。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的问题是，提供一种通过阻断PD-1肿瘤免疫抑制通路来提高DC-CIK免疫细胞的肿瘤杀伤活性的方法制得的DC-CIK免疫细胞。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法，以外周血为原材料，通过Ficoll
密度梯度离心法分离获得PBMC和上层
血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK，CIK细胞每隔2天扩大培养、DC细胞在第4天扩大培养，然后在第7天进行混合培养，DC细胞在第5天用TNF-α进行刺激以促进其分
化成熟，然后加入Anti-PDL-1MAb对DC细胞进行封闭并在封闭12-24h后将全部DC细胞回收加入到CIK细胞诱导体系中共培养；CIK细胞在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在诱导培养的第13-15天使用Anti-PD-1MAb对CIK细胞的PD-1
抗原进行封闭，并在封闭12-
24h后回收全部细胞。
[0005] 具体地，包括以下步骤：
[0006] 1)采集人体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤从中制备出自体血清；
[0007] 2)配置细胞诱导培养基备用
[0008] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；
[0009] CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；
[0010] 3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至T-175细胞培养瓶中，分别加入40-50ml免疫细胞培养基，并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞及培养上清吸出，贴壁的细胞中加入40-50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
[0011] 4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，将所有细胞加入到提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶；在培养瓶中加入50-100ml CIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，诱导CIK细胞；
[0012] 5)培养第3天在CIK细胞诱导体系中按照体积分数5-10％加入自体血清，并按照终浓度300-1000IU/ml补加IL-2继续培养；
[0013] 6)培养第4天在DC细胞诱导体系中加入30-40ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；
[0014] 7)培养第5天在CIK细胞诱导体系中加入100-150mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0015] 8)培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a进行刺激，12-48小时之后在DC细胞诱导体系中加入2-20ug的Anti-PDL-1MAb孵育12-24小时之后回收全部DC细胞加入到CIK细胞诱导体系中，并将全部细胞加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中，加入200-300ml CIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb；
[0016] 9)第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入300-400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0017] 10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入600-800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0018] 11)第13-15天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入5-30ugAnti-PD-1MAb孵育，混合均匀后继续培养；
[0019] 12)12-24h后回收全部细胞。
[0020] 所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
[0021] 上述的制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法制得的DC-CIK免疫细胞。
[0022] 本发明的有益效果是：本发明通过在体外利用细胞因子高效诱导
外周血单个核细胞分化DC-CIK细胞中添加Anti-PD-1MAb、Anti-PDL-1MAb后其肿瘤杀伤活性显著提高。本方法采用美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基和自体血清、多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK分别进行诱导培养,并且在合适的时间点分别将DC和CIK相关的PD-1位点进行封闭，然后在一定时间点将细胞混合培养并应用，最终混合细胞的肿瘤杀伤活性得到了很大的提高具有更高的临床应用价值。
附图说明
[0023] 图1培养第7天的DC、培养第15天CIK细胞图(左图为诱导培养的CIK细胞,右图为诱导成熟的DC细胞)。
[0024] 图2肿瘤细胞杀伤实验图(左图为对照组HELA细胞,右图为杀伤实验组中HELA细胞，右图为效靶比20:1)。
[0025] 图3不同效靶比肿瘤细胞杀伤比例图。
具体实施方式
[0026] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
[0027] 本发明的制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法，以外周血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK，CIK细胞每隔2天扩大培养、DC细胞在第4天扩大培养，然后在第7天进行混合培养，DC细胞在第5天用TNF-α进行刺激以促进其分化成熟，然后加入Anti-PDL-1MAb对DC细胞进行封闭并在封闭12-24h后将全部DC细胞回收加入到CIK细胞诱导体系中共培养；CIK细胞在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在诱导培养的第13-15天使用Anti-PD-1MAb对CIK细胞的PD-1抗原进行封闭，并在封闭12-24h后回收全部细胞。
[0028] 具体地，包括以下步骤：
[0029] 1)采集人体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤从中制备出自体血清；
[0030] 2)配置细胞诱导培养基备用
[0031] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；
[0032] CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；
[0033] 3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至T-175细胞培养瓶中，分别加入40-50ml免疫细胞培养基，并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞及培养上清吸出，贴壁的细胞中加入40-50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
[0034] 4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，将所有细胞加入到提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶；在培养瓶中加入50-100ml CIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，诱导CIK细胞；
[0035] 5)培养第3天在CIK细胞诱导体系中按照体积分数5-10％加入自体血清，并按照终浓度300-1000IU/ml补加IL-2继续培养；
[0036] 6)培养第4天在DC细胞诱导体系中加入30-40ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；
[0037] 7)培养第5天在CIK细胞诱导体系中加入100-150mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0038] 8)培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a进行刺激，12-48小时之后在DC细胞诱导体系中加入2-20ug的Anti-PDL-1MAb孵育12-24小时之后回收全部DC细胞加入到CIK细胞诱导体系中，并将全部细胞加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中，加入200-300ml CIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb；
[0039] 9)第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入300-400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0040] 10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入600-800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0041] 11)第13-15天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入5-30ugAnti-PD-1MAb孵育，混合均匀后继续培养；
[0042] 12)12-24h后回收全部细胞。
[0043] 所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
[0044] 上述的制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法制得的DC-CIK免疫细胞。
[0045] 本发明利用肿瘤的PD-1免疫逃逸通路，通过封闭其相应的作用位点，以外周血作为原材料，配合美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基，加入自体血清及多种细胞因子成分，获得具有高效肿瘤杀伤性的DC-CIK联合免疫细胞。Anti-PD-1MAb和Anti-PDL-1MAb作为癌症免疫抑制的药物可以通过阻断其免疫抑制通路，从而大大的提高了DC-CIK的肿瘤杀伤活性。
[0047] 1.采集120ml外周血，以240ml生理盐
水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
[0048] 2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得300ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤
膜过滤上清后获得近290ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
[0049] 3.配置细胞诱导培养基备用：
[0050] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度8％的步骤2中制备的自体血清、150IU/ml的IL-4和1000IU/ml的GM-CSF；
[0051] CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清和1000IU/ml的IL-2；
[0052] 4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得12.0*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照8*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、4ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
[0053] 5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养基。
[0054] 6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后加入到预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基，并按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。
[0055] 7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、50000IU的IL-2继续培养。
[0056] 8.培养第4天在DC细胞诱导体系中加入30-40ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；
[0057] 9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0058] 10.培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度800IU/ml加入TNF-a进行刺激，36小时之后加入2ug的Anti-PDL-1MAb孵育，12小时之后回收全部DC细胞与CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液(图1)共同加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200ml CIK细胞诱导培养基并加入10ug的CD3McAb以及20ug的CD28McAb；
[0059] 11.第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0060] 12.第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0061] 13.第14天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入5ugAnti-PD-1MAb孵育24小时，回收全部细胞用于杀伤肿瘤细胞的杀伤；
[0062] 14.将Hela细胞(子
宫颈癌细胞系)预先接种至6孔板中，按照DC-CIK细胞的计数结果分别按照5:1、10:1、20:1、40:1的效靶比对肿瘤细胞系杀伤8h(图2)，通过MTT法对肿瘤细胞的杀伤效率进行检测(图3)。
[0063] 实施例2
[0064] 1.采集120ml脐带血，以240ml生理盐水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
[0065] 2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得315ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤膜过滤上清后获得近285ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
[0066] 3.配置细胞诱导培养基备用：
[0067] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度8％的步骤2中制备的自体血清、150IU/ml的IL-4和1000IU/ml的GM-CSF；
[0068] CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清和1000IU/ml的IL-2；
[0069] 4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得12.2*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照8*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、3ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
[0070] 5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养。
[0071] 6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后加入到预包被10ug CD3McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被10ug CD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100ml CIK细胞诱导培养基，并按照终浓度
1000IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。
[0072] 7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、50000IU的IL-2继续培养。
[0073] 8.培养第4天在DC细胞培养体系中加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
[0074] 9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
[0075] 10.培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度800IU/ml加入TNF-a进行刺激，12小时之后加入3ug的Anti-PDL-1MAb孵育36小时之后与CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液共同加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200ml CIK细胞诱导培养基并加入10ug的CD3McAb以及20ug的CD28McAb；
[0076] 11.第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0077] 12.第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0078] 13.第13天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入7.5ugAnti-PD-1MAb孵育24小时后将DC+CIK细胞共培养的培养袋中的所有细胞
收获。
[0079] 实施例3
[0080] 1.采集85ml外周血，以160ml生理盐水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
[0081] 2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得215ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤膜过滤上清后获得近210ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
[0082] 3.配置细胞诱导培养基备用：
[0083] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5％的步骤2中制备的自体血清、80IU/ml的IL-4和800IU/ml的GM-CSF；
[0084] CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5％的步骤2中制备的自体血清和300IU/ml的IL-2；
[0085] 4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得8.4*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照5*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、2ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
[0086] 5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养。
[0087] 6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后加入到预包被4ug CD3McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被4ug CD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100ml CIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。
[0088] 7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、30000IU的IL-2继续培养。
[0089] 8.培养第4天在DC细胞培养体系中加入30mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
[0090] 9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0091] 10.培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度800IU/ml加入TNF-a进行刺激，24小时之后加入5ug的Anti-PDL-1MAb孵育24小时之后与CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液共同加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基并加入10ug的CD3McAb以及20ug的CD28McAb；
[0092] 11.第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0093] 12.第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800ml CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0094] 13.第15天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入10ugAnti-PD-1MAb孵育12小时后回收全部细胞。
[0095] 综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
