专利汇可以提供一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 属于细胞免疫学技术领域,具体地说是一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。用于检测制成的人γδT细胞。本发明包括以下步骤:制备人γδT细胞后通过 显微镜 进行形态学观察、流式细胞仪进行纯度和免疫表型分析。本发明的优点是:检验获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点,从而确保制成的人γδT细胞能够满足临床的需要,而且实现了IPP等非肽 磷酸 类 抗原 、抗TCRγδ 抗体 等刺激剂相比培养成本大大降低;解决了 现有技术 体外培养γδT细胞数量低、毒性弱、成本高等问题的效果。,下面是一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法专利的具体信息内容。
1.一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法,其特征在于:
首先制备一种人γδT细胞,包括:(1)用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原,其具体步骤为:
步骤1:将结核杆菌菌体种子湿重50~100克接种于200ml的苏通式液体培养基内,于37℃培养箱内静止培养2周,然后将其分装到含有10%~30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内,每瓶50ml,分装成4瓶,再继续于37℃培养箱内静止培养4周,收集培养的细菌悬液,经4000转/分,离心30分钟以收获结核杆菌菌体;
步骤2:将收集的菌体经生理盐水洗涤2次,再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体,115℃高压蒸汽处理20分钟,4000转/分,离心30分钟收集上清液,即为Mtb-Hag;
(2)用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs,同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21,其具体步骤为:
无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血,经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞,具体步骤为:1500转/分,离心10分钟,吸取上层血浆层,56℃灭活30分钟后离心备用,用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞,人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中,2000转/分,离心20分钟,小心吸取白膜层,用生理盐水洗涤2次,转速分别为1600转/分,1300转/分,均离心7分钟,即得到外周血单个核细胞;将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为1~10μg/ml的Mtb-HAg、
50~500IU/ml rhIL-2、5~20ng/ml rhIL-21和1%~10%自体血浆的RPMI1640、AIM-V或
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GT-T551培养基内,调细胞密度为(1~2)×10/ml,转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内,于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养;
(3)细胞培养72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2,以后根据细胞生长
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状态每2~3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液,以维持细胞密度为(0.5~2.0)×10/ml;
(4)根据细胞生长状态,第10~15天收获细胞;
将细胞培养24小时即可见γδT细胞沉于培养器皿的底部,并趋于集落化,48小时集落开始变大,培养6~10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞,对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色,发现大多数细胞体积增大,呈椭圆形或不规则形,细胞核大多为椭圆形或圆形,核染色疏松,核膜不规则,有突起,每个细胞可见1个小核仁,呈深蓝色;胞质丰富,染成灰蓝色,形态不规则,有伪足,近核处有淡染现象,也有呈不规则形;取培养10天的细胞100μl,加入100μl0.4%台盼蓝染色液,活细胞不染色,死细胞染成蓝色,显微镜下计数;
分别取第0、7、14、21和28天的细胞,用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次,调整细胞密度为1×106/ml,每个检测管内加入50μl细胞悬液,加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC、抗TCRγδ-PE)染色,4℃避光孵育30分钟,用上述PBS洗涤2次,加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后,用流式细胞仪进行检测,数据文件采用WinMDI软件分析。
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