外周血单个核细胞的分离方法
阅读：894发布：2020-05-11
专利汇可以提供外周血单个核细胞的分离方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 外周血单个核细胞 的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏 磷酸 缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有淋巴细胞分离液的离心管，使淋巴细胞分离液的液面与 水 平面呈50°～70° 角 ；将稀释后的外周血沿离心管的 侧壁 加入到淋巴细胞分离液中得到 混合液 ；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)装有混合液的离心管离心分离并取白膜层，即得到外周血单个核细胞层。该分离方法，操作简单，适合大量样本的分离；能够实现无菌操作，得到的外周血单个核细胞适宜临床应用；对分离的外周血单个核细胞的损伤很小，细胞得率高，分离过程中也不会受到干扰。，下面是外周血单个核细胞的分离方法专利的具体信息内容。
1.一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；
(2)倾斜装有所述淋巴细胞分离液的离心管，使所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将所述步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿所述离心管的侧壁加入到所述淋巴细胞分离液中得到混合液；
所述稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；
(3)将所述步骤(2)中装有混合液的所述离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到所述外周血单个核细胞层。
2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中外周血与杜氏磷酸缓冲液的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中将稀释后的外周血加入到所述淋巴细胞分离液中时，所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角。
4.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为3：2。
5.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心分离的转速为450～600g；所述离心分离的时间为20～30min。
6.根据权利要求5所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心分离的转速为500g；所述离心分离的时间为25min。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞分离的操作温度为20℃。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液包括Ficoll 400和泛影葡胺钠，所述淋巴细胞分离液在20℃时的密度为1.077g/mL。
9.权利要求1至8中任一项所述的外周血单个核细胞的分离方法分离得到的外周血单个核细胞，其特征在于，
对所述外周血单个核细胞培养后进行流式细胞分析，得到所述外周血单个核细胞的活性为96％～98％。
外周血单个核细胞的分离方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞分离技术领域，特别地，涉及一种外周血单个核细胞的分离方法。
背景技术
[0003] 目前热门的细胞免疫治疗疗法是引领未来疾病治疗的新技术，该疗法需要采集人体自身免疫细胞，经过体外培养使其扩增，再经过基因工程改造、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。该疗法具有疗效良好、副作用小、个性化等独特的优势，为癌症、血液病、心血管病、糖尿病、老年痴呆症等疾病提供了良好的治疗效果，在未来治疗中必将担当重要角色。其中，外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，简称PBMC)是参与机体免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMC主要包含淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞占比80％～90％，淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞两大类，它们根据其表面标记物和功能不同又可以分为不同的细胞亚群，按标记物的不同，T淋巴细胞有CD3+、CD4+、CD8+、CD45+细胞等亚群，按细胞功能的不同，还有辅助T细胞(helper T cells,Th)、效应T细胞(Effector T cells,Te)和细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)等等；B淋巴细胞有B1、B2两种亚型。单核细胞占比10％～20％，单核细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用。因此，对不同淋巴细胞亚群分离、鉴别以及进行功能研究对疾病诊断乃至治疗都具有十分重要的临床意义。
[0005] 黏附法的细胞回收率除了与选择的吸附材料有关外，还与分离时输入细胞的流速有关；此方法有操作麻烦，分离纯度不高，回收率低。免疫磁珠分离法应用的是抗原抗体结合的原理分离细胞，这种方法具有分离纯度高的特点，细胞回收率也高；但是，免疫磁珠分离得到的淋巴细胞的效果和活力受磁珠的种类和抗体的影响，而且成本也很高。流式细胞分离法是20世纪70年代发展起来的细胞鉴定和分选技术，该技术集激光术、计算技术、电子物理技术、光电测量技术、荧光化学技术以及单克隆抗体技术于一体，通过流式细胞仪来实现；流式细胞分离技术已经较为成熟，可以同时检测细胞中DNA的含量、细胞体积、细胞膜受体以及表面抗原、细胞所处周期等许多生物信息；但是，流式细胞术分选细胞的成本较高，分离过程中也会对细胞造成损伤，从而影响细胞的活性。另外，流式细胞分离法无法进行无菌操作，这使得经流式细胞分选的细胞不宜再做培养方面的研究。
[0006] 上述免疫磁珠分离法和流式细胞分离法分离的淋巴细胞对分离样本是有选择的，通常这两种方法使用的样本均是进行过密度梯度离心获得的混合淋巴细胞，这也是上述两种方法可获得较高纯度的细胞的重要原因。因此，外周血单个核细胞最适用的分离方法是Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，但此方法依然存在比如对细胞损伤大、细胞得率低、分离过程中容易受到干扰等问题有待进一步解决。
发明内容
[0007] 本发明提供了一种外周血单个核细胞的分离方法，以解决现有的密度梯度离心法对细胞损伤大、细胞得率低且不适宜临床应用、分离过程中易受干扰的技术问题。
[0008] 本发明采用的技术方案如下：
[0009] 一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有所述淋巴细胞分离液的离心管，使所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；将所述步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿所述离心管的侧壁加入到所述淋巴细胞分离液中得到混合液；所述稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将所述步骤(2)中装有混合液的所述离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到所述外周血单个核细胞层。
[0010] 进一步地，所述步骤(1)中外周血与杜氏磷酸缓冲液的体积比为1：1。
[0011] 进一步地，所述步骤(2)中将稀释后的外周血加入到所述淋巴细胞分离液中时，所述淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角。
[0012] 进一步地，所述步骤(2)中稀释后的外周血与所述淋巴细胞分离液的体积比为3：2。
[0013] 进一步地，所述步骤(3)中离心分离的转速为450～600g；所述离心分离的时间为20～30min。
[0014] 进一步地，所述步骤(3)中离心分离的转速为500g；所述离心分离的时间为25min。
[0015] 进一步地，所述外周血单个核细胞分离的操作温度为20℃。
[0016] 进一步地，所述淋巴细胞分离液包括Ficoll 400和泛影葡胺钠，所述淋巴细胞分离液在20℃时的密度为1.077g/mL。
[0017] 根据本发明的另一方面，还提供了一种上述分离方法分离得到的外周血单个核细胞，对所述外周血单个核细胞培养后进行流式细胞分析，得到所述外周血单个核细胞的活性为96％～98％。
[0018] 进一步地，将上述分离方法分离得到的所述外周血单个核细胞与杜氏磷酸缓冲液混匀，于水平离心机离心分离，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀中加入所述杜氏磷酸缓冲液，吹打混匀得到细胞悬液进行细胞计数。
[0019] 进一步地，所述细胞计数的方法为吸取所述细胞悬液和浓度为0.4％的台盼蓝溶液混匀，检测细胞活力。
[0020] 进一步地，将所述细胞悬液置入离心机中，20℃、500g转速下离心，得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中加入含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基，混匀，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
[0021] 本发明具有以下有益效果：
[0022] 1、本发明的外周血单个核细胞的分离方法，对现有的密度梯度离心法进行了改进，操作简单，适合大量样本的分离；并能够实现无菌操作，分离得到的外周血单个核细胞适宜临床应用；对分离的外周血单个核细胞的损伤很小，细胞得率高，分离过程中也不会受到干扰。
[0023] 2、本发明分离方法分离得到的外周血单个核细胞，可用于肿瘤免疫疗法中对大规模血液单个核细胞的需求；可以提供同一个包含大量个体的单个核细胞，该方法分离的血液细胞纯度以及活性较高；可进行二次筛选，直接用于针对T淋巴细胞以及B淋巴细胞的治疗性研究。
[0026] 图1是本发明优选实施例的外周血中不同组分的比重示意图；
[0027] 图2是本发明优选实施例的外周血中分离的单个核细胞示意图；
[0028] 图3是本发明优选实施例中核算染料Propidium iodide(PI)测定活细胞数目的数据图；
[0029] 图4是本发明优选实施例的单个核细胞中五种亚型细胞的流式分群图。
具体实施方式
[0031] 本发明提供了一种外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：(1)将外周血与杜氏磷酸缓冲液混匀得到稀释后的外周血；将淋巴细胞分离液装于离心管中并遮光保存；(2)倾斜装有淋巴细胞分离液的离心管，使淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角；
将步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿离心管的侧壁加入到淋巴细胞分离液中得到混合液；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将步骤(2)中装有混合液的离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到外周血单个核细胞层。
将步骤(1)中得到的稀释后的外周血沿离心管的侧壁加入到淋巴细胞分离液中得到混合液；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1；(3)将步骤(2)中装有混合液的离心管放置在水平离心机中离心分离并取白膜层，即得到外周血单个核细胞层。
[0032] 上述步骤中，设置稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1～2：1，更有选的，稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为3：2，是经过大量摸索而得到的，能够提高细胞得率。步骤(2)中将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液中时，控制淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°～70°角，可以较大限度地保护两者的交界面不被冲破。
[0033] 本发明的外周血单个核细胞的分离方法，对现有的密度梯度离心法进行了改进，操作简单，适合大量样本的分离；并能够实现无菌操作，分离得到的外周血单个核细胞适宜临床应用；对分离的外周血单个核细胞的损伤很小，细胞得率高，分离过程中也不会受到干扰。
[0034] 优选的，步骤(1)中外周血与杜氏磷酸缓冲液的体积比为1：1。采用此体积比，外周血与杜氏磷酸缓冲液能够更加充分地混合，从而也有助于稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的混合。
[0035] 优选的，步骤(2)中将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液中时，淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角。控制淋巴细胞分离液的液面与水平面呈60°角，可以最大限度地保护稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的交界面不被冲破。
[0036] 优选的，步骤(2)中稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为3：2。采用上述体积比时，细胞得率最高。
[0037] 优选的，步骤(3)中离心分离的转速为450～600g；离心分离的时间为20～30min。更优选的，步骤(3)中离心分离的转速为500g；离心分离的时间为25min。步骤(3)在进行离心时，采用上述离心转速，标准规范，对细胞的损伤较小。
[0038] 优选的，外周血单个核细胞分离的操作温度为20℃。严格设置操作环境的温度为20℃，以使淋巴细胞分离液与杜氏磷酸缓冲液的效果发挥到最大，减少细胞损伤。
[0039] 优选的，淋巴细胞分离液包括Ficoll 400和泛影葡胺钠，淋巴细胞分离液在20℃时的密度为1.077g/mL。采用上述淋巴细胞分离液，可以为细胞提供一个合适的渗透压以及低的细胞毒性，从而使分离得到的单个核细胞具有较高的纯度以及细胞活率。
[0040] 本发明还提供了上述分离方法分离得到的外周血单个核细胞，对外周血单个核细胞培养后进行流式细胞分析，得到外周血单个核细胞的活性为96％～98％。
[0041] 本发明分离方法分离得到的外周血单个核细胞，可用于肿瘤免疫疗法中对大规模血液单个核细胞的需求；可以提供同一个包含大量个体的单个核细胞，该方法分离的血液细胞纯度以及活性较高；可进行二次筛选，直接用于针对T淋巴细胞以及B淋巴细胞的治疗性研究。
[0042] 优选的，将上述分离方法分离得到的外周血单个核细胞与杜氏磷酸缓冲液混匀，于水平离心机离心分离，得到细胞沉淀；将细胞沉淀中加入杜氏磷酸缓冲液，吹打混匀得到细胞悬液进行细胞计数。采用上述方法可以对分离得到的外周血单个核细胞层进行细胞计数。
[0043] 优选的，细胞计数的方法为吸取细胞悬液和浓度为0.4％的台盼蓝溶液混匀，检测细胞活力。
[0044] 优选的，上述分离得到的外周血单个核细胞的培养方法：将细胞悬液置入离心机中，20℃、500g转速下离心，得到细胞沉淀，向细胞沉淀中加入含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基，混匀，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。采用上述方法培养分离得到的外周血单个核细胞，培养24小时后，可以在显微镜下观察细胞的形态及活性。
[0045] 实施例
[0046] 以下各实施例中使用的试剂均为市售。
[0047] 实施例1
[0048] 本发明的优选实施例公开了一种外周血单核细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0049] (1)在分离细胞前，将生物安全柜、超净台灭菌，并分装淋巴细胞分离液于离心管中，淋巴细胞分离液包括Ficoll 400和泛影葡胺钠，淋巴细胞分离液在20℃时的密度为1.077g/mL；用锡箔纸包住离心管以达到避光的效果。分离细胞的当天采集血样即新鲜外周血，用医用抗凝管采集10支，6ml/支，共计60ml。采集的血样置于室温运输，保证1小时内送至实验室。实验室相关人员接到血样后，立即做好登记工作并立即进行传染病“术前四项检查”，使用病毒表面抗原联合检测试剂盒检测，包括乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒的相关病原学检查，一旦发现血样携带病原体，则应立即销毁。如果以上四项均为阴性结果，则可用于单个核细胞的分离实验。在分离细胞前，可先将血样进行离心，收集少许血清以便后续用于质量检验。图1为所采集的外周血中不同组分的比重情况。
[0050] (2)将血样平均分到4支50ml离心管中，每管含有15ml血样，将杜氏磷酸缓冲液(简称DPBS)与上述新鲜外周血以1：1的比例充分混匀得到稀释后的外周血。
[0051] (3)倾斜装有淋巴细胞分离液的离心管，使倾斜后分离液的液面与水平界面呈60°夹角。使用一次性3ml巴氏吸管吸取稀释后的外周血，沿着淋巴细胞分离液的离心管侧壁小心滴加到淋巴细胞分离液中得到混合液，注意不要冲破两者的交界面。分别将4支离心管中的稀释后的外周血均滴加到淋巴细胞分离液中，稀释后的外周血与淋巴细胞分离液的体积比为3：2。
[0052] (4)设置水平离心机模式为慢升慢降，室温20℃下，离心转速设置为500g，将上述4支离心管置于离心机中离心25min。离心结束后，缓慢取出离心管，小心吸弃上清(血浆层)，轻缓吸取中间白膜层于新的离心管中，即为外周血单个核细胞层。
[0053] (5)将上述分离得到的外周血单个核细胞层与DPBS缓冲液混匀，设置离心机模式为正常升降速条件，室温20℃下，设置离心转速为500g，离心8min。离心结束后，小心吸弃上清，并向下层细胞沉淀中加入合适体积的DPBS缓冲液，充分吹打混匀后得到细胞悬液进行细胞计数。计数方法：吸取20uL细胞悬液与20uL 0.4％台盼蓝溶液混匀，检测细胞活力。
[0054] (6)剩余的细胞悬液置入离心机中，正常升降速条件，20℃、500g转速下离心8min，得到细胞沉淀。向上述细胞沉淀中加入含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基，混匀，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。培养24小时后，可以在显微镜下观察细胞的形态及活性，如图2所示。
[0055] (7)取适量上述培养24小时后的外周血单个核细胞，进行流式细胞分析，通过流式细胞分析对细胞的活性、单个核细胞中的各个亚型进行检测。
[0056] 针对细胞活性的分析，选用核酸染料Propidium iodide(PI)对活细胞数目进行测定，本实施例分离所得细胞的活性为97.9％，如图3所示。本实施例还针对CD3+、CD8+、CD14+、CD19+、CD56+五种细胞亚型进行了分析，如图4所示。
[0057] 实施例2
[0058] 本优选实施例与实施例1大致相同，区别在于，将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液中时，淋巴细胞分离液的液面与水平面呈50°角；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液混合时的体积比为1：1；离心分离时，离心机的转速设置为450g，离心时间为30min。
[0059] 上述分离得到的外周血单个核细胞，培养24小时后，进行流式细胞分析，分离所得细胞的活性为96.5％。
[0060] 实施例3
[0061] 本优选实施例与实施例1大致相同，区别在于，将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液中时，淋巴细胞分离液的液面与水平面呈70°角；稀释后的外周血与淋巴细胞分离液混合时的体积比为2：1；离心分离时，离心机的转速设置为600g，离心时间为20min。
[0062] 上述分离得到的外周血单个核细胞，培养24小时后，进行流式细胞分析，分离所得细胞的活性为97％。
[0063] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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