外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用
阅读：474发布：2020-05-14
专利汇可以提供外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及免疫细胞靶向 治疗 技术领域，特别涉及一种人体 外周血单个核细胞 诱导分化为记忆性免疫细胞，冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床 肿瘤 治疗提供了 基础 ，可根据肿瘤患者的 治疗方案 随时复苏细胞，解决了肿瘤患者T 细胞增殖 能 力 差和免疫无能问题；目前回输的免疫细胞尤其是克隆化效应T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，通过TCR基因 转染 TCM，赋予TCM细胞靶向性。，下面是外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用专利的具体信息内容。
1.一种外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞，其特征在于将新鲜分离的或者经过冻存后复苏的外周血单个核细胞经过筛选和二次阳性分选出记忆性免疫细胞，诱导后即得。
2.根据权利要求1所述的记忆性免疫细胞，其特征在于诱导分化操作如下：
（1）记忆性免疫细胞分离后重悬，加入300-2000u/mL IFN-γ、抗人50-200ng/mL CD3单克隆抗体、50-200ng/mL CD28单克隆抗体及500-2000u/mL重组人IL-2和50-200u/mL IL-1α完成初次刺激；
（2）每2天半量换液，补加500-2000u/mL重组人IL-2、500-1000 u/mL IL-7 和500-1000 u/mL重组人IL-15，培养时间为12-20天。
3.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于诱导后使用重组TCR腺病毒转染。
4.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中将记忆性免疫细胞用X-VIVO15重悬。
5.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中重悬的浓度为(0.4-
1.2)×106/mL。
6.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中外周血单个核细胞重悬后，加入500-1000u/mL IFN-γ、抗人90-200ng/mL CD3单克隆抗体、90-200ng/mL CD28单克隆抗体及500-1000u/mL重组人IL-2和90-200u/mL IL-1α完成初次刺激。
7.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（2）中补加500-1000u/mL重组人IL-2、500-1000 u/mL IL-7 和500-1000 u/mL重组人IL-15。
8.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于
（1）外周血单个核细胞重悬后，以1000IU/ml IFN-γ、抗人130ng/ml CD3单克隆抗体、抗人110ng/ml CD28单克隆抗体及重组人1000IU/ml IL-2、120u/mL IL-1α完成初次刺激；
（2）每2天半量换液，补加1000IU/ml重组人IL-2 、800 u/mL IL-7和800 u/mL重组人IL-15。
9.一种权利要求1-8中任一项所述的记忆性免疫细胞在临床肿瘤治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述肿瘤包括但不限于肾癌、恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、大肠癌、胃癌或淋巴瘤。
外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用
[0001]
技术领域
背景技术
[0002]过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法。然而目前还存在不少问题亟待解决，包括：1)如何获得充分数量的肿瘤反应性T细胞是决定过继性细胞治疗效果的最关键因素；2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8+T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。
[0003] 记忆性T细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力,能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞。有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离记忆性T细胞并通过TCR基因转染有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。
发明内容
[0004]为了解决过继性细胞治疗技术中免疫细胞在体内难以长期存活，缺少靶向性的问题；
本申请提供了一种从低温冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化记忆性T细胞（TCM），TCM诱导活化率高的诱导方法，然后将肿瘤特异TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有长效性和靶向性。
本申请提供了一种从低温冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化记忆性T细胞（TCM），TCM诱导活化率高的诱导方法，然后将肿瘤特异TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有长效性和靶向性。
[0005] 本发明是通过以下步骤得到的：本发明利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏并分离纯化TCM，并诱导为杀伤性T细胞，肿瘤特异TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有靶向性。解决肿瘤患者记忆性T细胞增殖能力差和免疫无能的问题。
[0006] 一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后记忆性T细胞分离纯化、诱导活化和肿瘤特异TCR基因转染自体TCM的方法，包括以下步骤：健康人PBMC冻存复苏，从中分离纯化TCM，研究体外活化后，CIK细胞和TCM来源的效应T细胞（TE）细胞分化表型的差异。并以肿瘤抗原特异性TCR基因修饰CIK和TCM，明确TCR基因修饰CIK和TCM的抗肿瘤免疫功能。
[0007] 1.CIK诱导：PBMC按照细胞密度(0.4-1.2)×106/mL用X-VIVO15重悬，添加300-2000u/mL IFN-γ和50-100u/mL ATP诱导培养CIK细胞，第二天补加因子50-200u/mL IL-1α、500-2000u/mL IL-2、500-1000 u/mL IL-7、50-200ng/mL CD3单抗、50-200ng/mL CD28；
此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mL IL-2的X-VIVO15 培养基。
此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mL IL-2的X-VIVO15 培养基。
[0008] 2.TCM的分选、刺激与基因转染(1)磁珠负性筛选CD8+T细胞，二次阳性分选TCM。
[0009] (2) 协同刺激抗体/细胞因子初次刺激（培养后第1天）。以300-2000u/mL IFN-γ、抗人50-200ng/mL CD3单克隆抗体、50-200ng/mL CD28单克隆抗体及500-2000u/mL重组人IL-2和50-200u/mL IL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加500-2000u/mL重组人IL-2、500-1000 u/mL IL-7 和500-1000 u/mL重组人IL-15。
[0010] （3）重组TCR腺病毒转染（培养后第3天）CIK细胞及TCM细胞。
[0011] （4）培养后5天进行肿瘤抗原再刺激。（5）台盼蓝染色法获取CIK细胞及TCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至35天）。
[0012] （6） 流式细胞术荧光原位杂交法检测活化后细胞数量高峰期（第14天）CIK细胞与TCM来源TE端粒相对长度。
[0013] 3.CIK与TCM来源TE细胞分化表型：流式细胞术检测CIK细胞与TCM经刺激活化后CD45RO、CD62L、CD44、CCR7、CD28等标CIK与TCM来源TE细胞分化表型记分子表达与动态变化（至体外培养后第33天）。
[0014] 6.TCR基因转染CIK和TCM来源TE的抗肿瘤免疫功能：（1）流式细胞术检测腺病毒转染后外源TCR基因表达效率（转染后第3-14天）；
（2）CTL活性：肿瘤抗原再刺激后一天，以钙黄绿素标记靶细胞（HepG-2，SMMC-7721,MCF-7）
检测分别来源于CIK细胞，TCM，TCR基因转染CIK细胞，TCR基因转染TCM的各组TE不同效靶比对靶细胞的特异性裂解百分比。
（2）CTL活性：肿瘤抗原再刺激后一天，以钙黄绿素标记靶细胞（HepG-2，SMMC-7721,MCF-7）
检测分别来源于CIK细胞，TCM，TCR基因转染CIK细胞，TCR基因转染TCM的各组TE不同效靶比对靶细胞的特异性裂解百分比。
[0015] （3）抗体阻断实验：抗人HLA-A2抗体与HLA-A2阳性靶细胞HePG-2和SMMC-7721共孵育后， 钙黄绿素释放法检测抗体阻断对TCR基因转染TCM来源TE的CTL活性影响。
[0016] （4）细胞裂解核蛋白分泌：肿瘤抗原再刺激后一天，各组TE细胞作用于靶细胞HEPG2，SMMC7721后4小时。胞内细胞因子染色法检测T细胞内新合成的穿孔素与颗粒酶分泌。
[0017] （5）细胞因子分泌：肿瘤抗原再刺激后一天，各组TE细胞作用于靶细胞HEPG2，SMMC77-721，MCF24小时后，ELISA法检测细胞培养液上清中IFN-r，IL-2含量。
[0018] 7.统计学分析实验数据以均数士标准差来表示。应用SPSS16.0统计软件进行统计分析。各指标先进行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2x2析因设计的方差分析（不同组细胞肿瘤杀伤活性比较，抗体抑制试验，各组细胞的细胞因子分泌。采用重复测量的方差分析完成各组细胞不同时间地点细胞数量分析。采用单因素方差分析对不同组细胞端粒长度进行分析。当P<0.05时，被认为差异具有统计学意义。
[0019] 优选步骤（2）TCM分选、刺激和TCR基因转染：分离后第1天，以1000IU/ml IFN-γ、抗人130ng/ml CD3单克隆抗体、抗人110ng/ml CD28单克隆抗体及重组人1000IU/ml IL-2、120u/mL IL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加重组人IL-2 (终浓度为1000IU/ml)、
800 u/mL IL-7和800 u/mL重组人IL-15。
800 u/mL IL-7和800 u/mL重组人IL-15。
[0020] 利用冻存技术保存了PBMC的活性，本实验证实使用冷冻过的外周血单个核细胞能够定向分离纯化TCM，体外诱导活化后，TCM来源的效应T细胞（TE）其扩增能力、细胞纯度和细胞毒活性均与新鲜细胞直接诱导生成的TCM细胞没有明显的差别。体外培养过程中，与CIK细胞相比，来自TCM细胞的TE细胞具有更高的增殖倍数； TCR基因转染TCM细胞来源TE的CTL活性具有抗原特异性和MHC限制性。
[0021] 本实验结果为冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，使现有的抗肿瘤免疫治疗方法更加灵活多变，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题。
[0023] 本发明的有益效果：1）本发明为冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题；
2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化效应T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，通过TCR基因转染TCM，赋予TCM细胞靶向性。
2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化效应T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，通过TCR基因转染TCM，赋予TCM细胞靶向性。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：实施例1
一、PBMC细胞的分离与冻存：
a.PBMC细胞的分离：外周血用电动助吸器按照每管不多于35 mL，平均分至50 mL离心管中，931 g，离心8 min，吸取上层血浆至50 mL离心管中，取1.5 mL于EP管中，标记，-80℃保存。用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面。596 g，离心20 min。可见明显分层。吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50 mL离心管中。分别向各管中加NA，稀释混匀，定容至40 mL/管。931 g，离心8 min。吸弃上清，加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。
一、PBMC细胞的分离与冻存：
a.PBMC细胞的分离：外周血用电动助吸器按照每管不多于35 mL，平均分至50 mL离心管中，931 g，离心8 min，吸取上层血浆至50 mL离心管中，取1.5 mL于EP管中，标记，-80℃保存。用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面。596 g，离心20 min。可见明显分层。吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50 mL离心管中。分别向各管中加NA，稀释混匀，定容至40 mL/管。931 g，离心8 min。吸弃上清，加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。
[0025] b.PBMC细胞冷冻保存：纯化后细胞重悬于自配冷冻保存液中，轻轻混匀后置-20℃冰箱冷却平衡5-15 min到4 ℃以下，同时把冻存管放4 ℃冰箱平衡15 min。分装入2 -10mL冻存管内，管壁做好标识。放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪器，最终将细胞保存于-196 ℃液氮内，降温梯度如下：
（a）4℃等待，至产品放入程序降温仪；
（b）以5℃/min 降至0℃，保持5min；
（c）以2℃/min 降至-10℃，保持5min；
（d）以1℃/min 降至-45℃，保持35min；
（e）以5℃/min 降至-90℃，保持5min；
（f）结束。
（a）4℃等待，至产品放入程序降温仪；
（b）以5℃/min 降至0℃，保持5min；
（c）以2℃/min 降至-10℃，保持5min；
（d）以1℃/min 降至-45℃，保持35min；
（e）以5℃/min 降至-90℃，保持5min；
（f）结束。
[0026] 二、PBMC冷冻后复苏：于冷冻保存1、2、4、8、12和24 个月后复苏细胞：取出冻存管，迅速投入 37 ℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在1 min 内80%溶解，将细胞吸到一定量 DMEM 洗涤液中，并洗涤冻存管1 次，移入50 mL 离心管中，233 g 离心5 min。弃上清，加入适量培养基，轻轻混匀，留取500 微升做计数测细胞活性。
[0027] 三、细胞计数和台盼蓝拒染法测细胞活性全自动血细胞分析仪检测细胞样本，读取屏幕上显示的WBC数值。根据公式细胞数T=WBC*V计算细胞总数。准备两个1.5 mL Ep管，在第1个Ep管中加入95 µl DMEM溶液，在第2个Ep管中加入30 µl 0.4%台盼蓝溶液。细胞样品充分混匀后，吸取5 µl样品加入95 µl DMEM溶液中，用吸管吹打混匀制成细胞混悬液。取30 µl细胞混悬液加入30 µl台盼蓝溶液中混匀后，取10微升细胞和染液的混悬液，镜下观察计数板中四个象限活细胞数（C）和被染成蓝色的死细胞数（N），应用下列公式计算细胞活性：活细胞率（%）= [100-10N/C]×100%四、PBMC回收率
计算PBMC回收率，采用公式：PBMC细胞回收率=(分离后细胞数/分离前细胞数)×100%。
计算PBMC回收率，采用公式：PBMC细胞回收率=(分离后细胞数/分离前细胞数)×100%。
[0028] 实施例2在实施例1基础上，分选纯化TCM细胞，并进行体外诱导和转染，如下
1.T细胞亚群磁珠分选：
（1）细胞计数。
1.T细胞亚群磁珠分选：
（1）细胞计数。
[0029] （2）制备单细胞悬液（用30孔径的尼龙网过滤）。
[0030] （3）加入缓冲液清洗细胞，离心，1500rpm,5min（4-8℃）（4）加入80ul/107个细胞的缓冲液。
[0031] (5)加入20ul/107个细胞的抗体包被磁珠。
[0032] （6）4-8℃孵育10分钟。
[0033] （7）加入1ml/107个细胞的缓冲液清洗细胞并离心，1500rpm,5min（4-8℃）。
[0034] （8）加入500ul/107个细胞的缓冲液重悬细胞。
[0035] （9）准备好分离柱，并用缓冲液500ul清洗MS柱。
[0036] (10)把细胞悬液小心加至分选柱底表面。
[0038] (13 )收集细胞，对于CD8+负性筛选，收集步骤（11）流出的细胞悬液；对于CD62L、CD44阳性筛选，收集步骤（12）流出的细胞悬液。
[0039] 2. TCM的刺激与基因转染（1）分离获得的PBMC用X-VIVO15重悬，以抗人50-200ng/mL CD3单克隆抗体、50-200ng/mL抗人CD28单克隆抗体及500-2000u/mL重组人IL-2完成初次刺激。每2天半量换液，补加
500-2000u/mL重组人IL-2 、500-1000 u/mL IL-7和500-1000 u/mL重组人IL-15。
500-2000u/mL重组人IL-2 、500-1000 u/mL IL-7和500-1000 u/mL重组人IL-15。
[0040] （2）重组TCR腺病毒转染（培养后第3天）CIK细胞及TCM细胞。将PBMC调整浓度为1x106/mlX-VIVO15培养基中。按不同MOI值比例加入重组病毒颗粒，37℃细胞培养箱中孵育
12H后换液，继续培养。
（3）培养后5天进行肿瘤抗原再刺激。
12H后换液，继续培养。
（3）培养后5天进行肿瘤抗原再刺激。
[0041] （4）台盼蓝染色法获取CIK细胞及TCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至35天）。
[0042] 实施例3在实施例2配方a的基础上，进行诱导配方的选择
分离后第1天，以1000IU/ml IFN-γ、抗人130ng/ml CD3单克隆抗体、抗人110ng/ml CD28单克隆抗体及重组人1000IU/ml IL-2、120u/mL IL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加重组人IL-2 (终浓度为1000IU/ml)、800 u/mL IL-7和800 u/mL重组人IL-15。
分离后第1天，以1000IU/ml IFN-γ、抗人130ng/ml CD3单克隆抗体、抗人110ng/ml CD28单克隆抗体及重组人1000IU/ml IL-2、120u/mL IL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加重组人IL-2 (终浓度为1000IU/ml)、800 u/mL IL-7和800 u/mL重组人IL-15。
[0043] 分离获得的PBMC用X-VIVO15重悬，以抗人130ng/mL CD3单克隆抗体、110ng/mL抗人CD28单克隆抗体及1000u/mL重组人IL-2完成初次刺激。每2天半量换液，补加1000u/mL重组人IL-2 和800 u/mL重组人IL-15。在传统TCM细胞培养基础上采用添加IFN-γ、IL-1α、重组人细胞因子IL-7。
[0044] 实验共分四组，A组为对照组：1000IU/ml IL-2+ 130ng/mL CD3+110ng/mL CD28+ 800 u/mL IL-15；
B组：1000IU/ml IFN-γ+1000IU/ml IL-2 +130ng/mL CD3+110ng/mL CD28+800 u/mL IL-15；
C组：1000IU/ml IFN-γ+120u/mL IL-1α+1000IU/ml IL-2+130ng/mL CD3+110ng/mL CD28+ 800 u/mL IL-15；
D组：1000IU/ml IFN-γ+120u/mL IL-1α+800 u/mL IL-7+1000IU/ml IL-2+800 u/mL CD3+110ng/mL CD28+800 u/mL IL-15。
B组：1000IU/ml IFN-γ+1000IU/ml IL-2 +130ng/mL CD3+110ng/mL CD28+800 u/mL IL-15；
C组：1000IU/ml IFN-γ+120u/mL IL-1α+1000IU/ml IL-2+130ng/mL CD3+110ng/mL CD28+ 800 u/mL IL-15；
D组：1000IU/ml IFN-γ+120u/mL IL-1α+800 u/mL IL-7+1000IU/ml IL-2+800 u/mL CD3+110ng/mL CD28+800 u/mL IL-15。
[0045] 此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有1000u/mL IL-2和800 u/mL重组人IL-15的X-VIVO15 培养基。在培养第3、6、9、12、14d，应用血球计数仪进行细胞计数；在培养第14d，应用流式细胞术检测冻存组和对照组TCM细胞CD45RO+CD62L+阳性表达。
[0046] 实施例41.流式细胞术荧光原位杂交法检测端粒相对长度
以PNA Kit/FITC试剂盒检测CD8+T细胞和TCM端粒长度。以已知端粒长度的EB病毒阴性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM作为对照组细胞计算端粒相对长度。为排除样本间端粒长度变异，以未活化的PBMC计算端粒长度指数。
以PNA Kit/FITC试剂盒检测CD8+T细胞和TCM端粒长度。以已知端粒长度的EB病毒阴性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM作为对照组细胞计算端粒相对长度。为排除样本间端粒长度变异，以未活化的PBMC计算端粒长度指数。
[0047] 端粒长度指数按照下列公式计算：端粒长度指数=不同亚群T细胞端粒相对长度/未活化PBMC端粒相对长度
2. 重组人腺病毒Ad5F35-TRVA-TRBV转染CIK和TCM细胞
重组人腺病毒Ad5F35-TRVA-TRBV以MOI=100的比例分别转染CIK细胞和TCM。
2. 重组人腺病毒Ad5F35-TRVA-TRBV转染CIK和TCM细胞
重组人腺病毒Ad5F35-TRVA-TRBV以MOI=100的比例分别转染CIK细胞和TCM。
[0048] 3.CFSE标记靶细胞检测CTL活性。
[0049] 抗原再刺激后一天，以CFSE标记HEPG2、SMMC-7721、MCF-7细胞，检测来源于CIK细胞，TCM，TCR基因转染CIK，TCR基因转染TCM细胞的TE效应细胞在不同效比对各种细胞的特异性裂解百分比。
[0050] 特异性裂解百分比=实验组荧光值-自发释放组荧光值）/（最大释放组荧光值-自发释放组荧光值）x100%4. 流式细胞术检测T细胞膜表面标志分子表达。
[0051] 在各检测时间点，以荧光标记抗人CD3，CD8，CD62L,CD44,CD45RO,CD28,CCR7等单克隆抗体染色各组TE细胞。流式细胞术分析阳性细胞比例。
[0052] 5. 胞内细胞因子的流式检测：抗原再刺激后一天，检测各组TE细胞作用于靶细胞HEPG2、SMMC-7721后4小时穿孔素及颗粒酶阳性细胞比例。以胞内细胞因子染色法检测细胞内新合成的穿孔素和颗粒酶B分泌。
[0053] 本发明中使用的主要仪器和试剂如下：无血清培养基(X-VIVO15)、Pague plus分离液、重组人IFN-γ、重组人IL-2、重组人IL-
15、IL-7、鼠抗人CD3单克隆抗体和鼠抗人CD28单克隆抗体。Ⅱ级生物安全柜（Termoscitific）、低温台式台式离心机（Beckman Coulter）、超低温冰箱和二氧化碳培养箱（Termoscitific）和流式细胞分析仪。
15、IL-7、鼠抗人CD3单克隆抗体和鼠抗人CD28单克隆抗体。Ⅱ级生物安全柜（Termoscitific）、低温台式台式离心机（Beckman Coulter）、超低温冰箱和二氧化碳培养箱（Termoscitific）和流式细胞分析仪。
[0054] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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