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一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

阅读：310发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法，属于细胞生物学技术领域。本发明外周血单个核细胞的冻存液的组分包括：8%二甲基亚砜、70%自体血浆、10%羟乙基淀粉、12%人血白蛋白。具体冻存程序为：a．在4℃等待，直至产品放入；b.以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。本发明的冻存液及冻存方法能显著增加冻存复苏后的细胞活性和回收率，诱导培养高纯度、高细胞活性、高扩增倍数的优质NK细胞，为NK细胞的临床治疗提供了有利保障。，下面是一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：按重量百分比之和为100%计，包括以下组分：8%二甲基亚砜、70%自体血浆、10%羟乙基淀粉、12%人血白蛋白。
2.如权利要求1所述一种人外周血单个核细胞的冻存液进行细胞冻存的过程为：利用程序降温仪对待冻存细胞进行梯度降温，降温完成后再转移至液氮中保存备用，具体冻存程序为：a．在4℃等待，直至产品放入；b.以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-
10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。
3.如权利要求1所述的一种人外周血单个核细胞的冻存液在人外周血单个核细胞冻存中的应用。

说明书全文

一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术

[0002] 外周血细胞包含红细胞、白细胞及血小板，而外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，属于白细胞的一种，包括淋巴细胞和单核细胞。PBMC是具有圆形细胞核的血液细胞，在髓系和淋巴系两个谱系中，均具有构成PBMC的相关细胞，是由不同比例的淋巴细胞（T细胞、B细胞及NK细胞）、树突状细胞和单核细胞组成的细胞群。PBMC是免疫系统的关键组成部分，因此在免疫学、传染病及移植治疗等多个领域中均被广泛应用。

[0003] 自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）是淋巴细胞的一种，来源于CD34+造血祖细胞，是人体免疫系统第一道防线的重要组成部分。该细胞主要存在于人外周血中，占外周血淋巴细胞的10-15%，同时在脾脏、骨髓及淋巴结中也有分布。NK细胞作为免疫细胞具有抵御病毒入侵及肿瘤杀伤的作用，通过调节树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）实现关键的免疫调节功能。NK细胞具有广谱的抗肿瘤作用，在过继免疫治疗恶性肿瘤中具有良好的应用前景。NK细胞是常见的免疫细胞治疗种类之一，主要来源于外周血单个核细胞，通过体外诱导和扩增培养获得。因此PBMC的质量对于后续NK细胞的应用至关重要。

[0004] 为了提高PBMC的应用质量，临床上常将PBMC冻存后备用，以保持细胞活性及功能，所以PBMC细胞冻存及复苏对免疫治疗的质量保障起到重要的作用。日本学者Makinos等采用单个核细胞冻存液配方为：5% DMSO+6% HES+4%人血白蛋白，能保证冻存后复苏的PBMC的活率达到88.4%，为目前已知报道中较高的存活率。该冻存方法为加入细胞冻存液后，将细胞转移至已经4℃预冷好的程序降温盒中，随后立即转移到-80℃冰箱中进行程序降温，24h后再转入液氮中长期保存备用。但这种冻存方法在冻存过程中容易改变细胞的化学及物理环境，并且极易导致细胞发生生物性损伤。冻存过程中容易形成冰晶，导致复苏后细胞活性降低，存在大量死细胞，同时细胞扩增倍数不佳，出现细胞衰老及凋亡等现象。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对上述问题，提供一种人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法。利用程序降温仪进行梯度降温的冻存方法，以提高复苏后的细胞活性及回收率，减少冻存过程中对细胞造成的损伤，有效提高NK细胞扩增倍数。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种人外周血单个核细胞的冻存液：按重量百分比之和为100%计，包括以下组分：8%二甲基亚砜（DMSO）、70%自体血浆、10%羟乙基淀粉（HES）、12%人血白蛋白。

[0007] 利用上述一种人外周血单个核细胞的冻存液进行细胞冻存的方法为：利用程序降温仪对待冻存细胞进行梯度降温，降温完成后再转移至液氮中保存备用，具体冻存程序为：a．在4℃等待，直至产品放入；b.以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。

[0008] 上述的一种人外周血单个核细胞的冻存液在人外周血单个核细胞冻存中的应用。

[0009] 本发明的优点在于：本发明的人外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法能显著增加冻存复苏后的细胞活性和回收率，诱导培养高纯度、高细胞活性、高扩增倍数的优质NK细胞，为NK细胞的临床治疗提供了有利保障。
附图说明

[0010] 图1本发明实施例流程图。

[0011] 图2本发明中应用不同编号冻存保护液配方冻存单个核细胞后复苏培养NK细胞的扩增倍数结果图。

[0012] 图3本发明中应用不同编号冻存保护液配方冻存单个核细胞后复苏培养NK细胞活性结果图。

[0013] 图4本发明中应用编号5的冻存保护液配方冻存单个核细胞后复苏培养的NK细胞流式检测结果图。

[0014] 图5本发明中应用编号5的冻存保护液配方冻存单个核细胞后PBMC复苏培养的NK细胞过程形态图（40×）。A：NK诱导培养一天时细胞形态；B：NK诱导培养三天时细胞形态；C：NK诱导培养五天时细胞形态；D：NK诱导培养七天时细胞形态。

具体实施方式

[0015] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

[0016] 实施例1 试剂：淋巴细胞分离液（GE，1714403）；无血清培养基（Corning，KBM581）；NK扩增试剂（杭州中赢生物医疗科技有限公司）；白介素2（山东泉港药业有限公司，20170917）。

[0017] 1.人外周血单个核细胞的获取：（1）采集健康的供者外周血140ml，用75%酒精的无尘布擦拭采血管外表面后，分离外周血单个核细胞。

[0018] （2）将外周血以2000rmp，离心8min；淋巴细胞分离液15ml/管分装至50ml离心管中。

[0019] （3）外周血离心后吸取上层血浆至50ml离心管中，将血浆56℃灭活处理30min后，离心，取上清，即为自体血浆。生理盐水稀释下层血细胞，血细胞与生理盐水的体积比为1:1，混匀后缓慢地加至淋巴细胞分离液上层。

[0020] （4）1600rpm，离心20min。

[0021] （5）吸弃上清，小心地将白色单个核细胞层吸至新的50ml离心管中。

[0022] （6）向各管中加生理盐水，稀释混匀，定容至40ml/管。

[0023] （7）2000rpm，离心8min。

[0024] （8）吸弃上清，每管加入10ml生理盐水，重悬，并为1管后定容至40ml，吹打混匀，取500ul进行细胞计数、活性检测。

[0025] 2. PBMC冻存（1）冻存保护液配制见表1：
表1. 冻存保护液配方
（2）细胞冻存程序：
PBMC细胞冻存的预设温度程序如下：a．在4℃等待，直至产品放入；b.以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以
5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束，将冻存结束的细胞转移至液氮中。

[0026] 3.PBMC细胞复苏：（1）取出细胞冻存管，37℃水浴解冻。

[0027] （2）用移液管将冻存管中的细胞转移至15ml离心管中。

[0028] （3）逐滴加入冻存液5倍体积的无血清培养基（预先平衡至室温），边加边混匀，这一步主要是为防止PBMC的渗透压变化太大，导致细胞破裂或损伤。

[0029] （4）再加入5倍体积的无血清培养基，混匀，离心。

[0030] （5）重悬细胞后，再加入10ml无血清培养基洗涤一次。

[0031] （6）计数，进行试验。

[0032] 4.NK细胞的体外诱导培养：（1）PBMC细胞计数结果在2.0×107-4.0×107范围内，离心收集全部细胞，用30ml无血清培养液重悬，同时加入2ml NK扩增试剂。

[0033] （2）1800rpm，离心8min。

[0034] （3）弃上清，加入15ml 含有200IU/L白介素2和5%自体血浆的NK细胞培养液，吹打混匀后加入培养瓶中。

[0035] （4）做好标记后，将培养瓶标放入37℃、5.0%的CO2培养箱中培养。

[0036] 5.NK细胞的培养：（1）细胞铺瓶3天后进行换液、换瓶。

[0037] （2）第5天，加含5%自体血浆的NK细胞培养液10ml。

[0038] （3）转移培养袋：第7天计数，若细胞数量大于1×108，则加入4mlNK扩增试剂，如细胞数量在3-8×107则长至第8天再添加NK扩增试剂。加含5%自体血浆的NK细胞培养液使总细胞浓度在1.0×106个/ml。随培养体积逐步增大，可转入T175培养瓶扩大体积培养，培养液体积大于200ml或细胞数量大于1×108，则可以转移至培养袋培养。

[0039] （4）第8-11天每天观察，加含1%自体血浆的NK细胞培养液使得细胞浓度在1×106个/ml。

[0040] （5）第12-15天每天观察，加入适量NK细胞培养液使得细胞浓度在2×106个/ml。14-15天收获细胞。

[0041] 6.NK细胞的表型分析：（1）样本处理：将培养的NK细胞样本转移至流式检测管中，加入3ml PBS充分混匀，
1600rpm，离心5min。弃上清，根据细胞样本浓度和体积，用适量PBS悬浮细胞，调整细胞浓度
7
为1×10/ml。

[0042] （2）荧光标记细胞：标记流式检测管，每一样本标记2管，分别为管1：IgG-FITC/IgG-PE、管2：CD3-FITC/CD56-PE，每管加入相应的荧光抗体各8μl，并加入100ul待测细胞样本悬液。

[0043] （3）在旋涡振荡器上混匀后，室温避光孵育15min。

[0044] （4）加3ml PBS洗涤，1600rpm，离心5min，弃上清，加入500ul PBS重悬沉淀，充分混匀。

[0045] （5）上机检测并打印检测报告。

[0046] （6）如不能及时上机检测，离心丢弃上清后，加入4%多聚甲醛固定液悬浮细胞并避光保存，可供1周内上机检测。

[0047] 本实施例流程图见图1。

[0048] 本发明中应用不同编号冻存保护液配方冻存单个核细胞，PBMC复苏后活性及回收率见表2。

[0049] 表2本发明中应用不同编号冻存保护液配方冻存单个核细胞后，诱导培养的NK细胞的扩增倍数结果见图2。图2结果表明：与传统冻存保护液编号1相比，优化后的冻存保护液配方能够明显提升PBMC冻存复苏后，诱导培养的NK细胞的扩增倍数，其中编号5冻存液的冻存效果最为显著。

[0050] 本发明中应用不同编号冻存保护液配方冻存单个核细胞，复苏后诱导培养的NK细胞活性结果见图3。图3结果表明：使用编号5冻存保护液冻存PBMC复苏后诱导培养的NK细胞活性最高。

[0051] 本发明中应用编号5的冻存保护液配方冻存单个核细胞后PBMC复苏培养的NK细胞流式检测图NK细胞活性结果见图4。图4结果表明：应用编号5的冻存保护液配方冻存单个核细胞后PBMC复苏培养的表型为CD3-CD56+的NK细胞比率高，能够达到90.3%。

[0052] 本发明中应用编号5的冻存保护液配方冻存单个核细胞后PBMC复苏培养的NK细胞过程形态图（40×）见图5。图5结果表明：该冻存保护液和冻存方法能够保证后期诱导培养的NK细胞质量，NK细胞生长状态较好。

[0053] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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