技术领域
[0001] 本
发明涉及细胞冻存复苏诱导技术领域，特别涉及一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法。
背景技术
[0002] 1970年Burnet提出了免疫监视机制，发现在特异性免疫中扮演重要
角色的T细胞，可在异常生长细胞或是
肿瘤细胞大量繁殖前便加以消灭、清除。已知临床上应用患者的免疫细胞进行免疫
治疗具有一定疗效，但此时人体的免疫细胞活性较低，因而影响免疫治疗效果，也很难保证患者在最需要的时候(如
放化疗后)提供足够数量的细胞，如果能预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏诱导为杀伤细胞，不仅能为患者节约
费用，还可减轻患者的痛苦。随着年龄增长，免疫细胞逐渐退化，这也是为什么癌症、传染病及慢性
疾病大多伴随着老化而来，储存免疫细胞并定期回输，可有效调节活化免疫功能，清除早期病变细胞。另外，免疫细胞需多次输注才能达到较好的治疗效果，多数医疗单位利用血细胞分离机采集单个核细胞，而这种采集方法价格昂贵，且多次采集给患者带来身心痛苦。
[0003] 公开号为CN104719282A的中国发明
专利申请，公开了一种外周血单个核细胞无血清冻存液，其按体积分数计包括以下组分：5～20％的二甲基亚砜、0.5～10％右旋糖酐40，余量为勃脉
力A。还公开了采用上述外周血单个核细胞无血清冻存液冻存外周血单个核细胞的方法。与
现有技术相比，本发明的冻存液不含动物血清、人血清、细胞培养基，且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK，在临床上颇具应用价值。但其冻存后复苏活率平均只有84.03％。诱导后的NKT细胞培养14天后，CD3+CD56+细胞为32.7％，显示诱导效果良好。
发明内容
[0004] 为了解决以上现有技术中外周血单个核细胞冻存复苏活率低，诱导活化率低的问题，本申请提供了一种冻存复苏成活率高，诱导活化率高的人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法。
[0005] 本发明是通过以下步骤得到的：
[0006] 人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导，本发明涉及冻存技术一种新的应用，利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，需要时复苏并诱导为杀伤细胞，不但可以实践疾病
预防的概念，更能提升预防医学的价值题。预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要 治疗时，复苏诱导为杀伤细胞，不仅能为患者节约费用，还可减轻患者的痛苦。
[0007] 一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)PBMC的分离与冻存：用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞，离心弃上清，细胞沉淀用冷冻保存液悬浮，冷冻保护液为500ul细胞培养液，再加等体积的冻存母液，放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪，最终将细胞保存于-196℃液氮内，冻存母液组成为20％-40％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷70％-40％,5％-10％甘油磷脂，5％-10％EG。
[0009] (2)PBMC的复苏：将装有待复苏人体外周血单个核细胞的冻存管放入37℃
水中，并不断摇动，保证管内液体在1min内80％溶解，然后将复苏的人体外周血单个核细胞加入装有DMEM培养基的离心管中离心，去上清，得到复苏的PBMC；
[0010] (3)复苏后向AIL诱导：PBMC按照细胞
密度(0.4-1.2)×106/mL用X-VIVO15重悬，添加300-2000u/mL IFN-γ和50-100u/mL ATP诱导培养AIL细胞，第二天补加因子50-200u/mL IL-1α、500-2000u/mL IL-2、500-1000u/mL IL-7、50-200ng/mL CD3单抗、50-200ng/mL CD28；此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mL IL-2的X-VIVO15培养基。
[0011] 优选步骤(1)中冻存母液组成为30％DMSO和低分子量40KD右旋糖苷50％,10％甘油磷脂，10％EG。
[0012] 优选步骤(3)中PBMC按照细胞密度1×106/mL用X-VIVO15重悬，添加1000u/mL IFN-γ和80u/mL ATP诱导培养AIL细胞，放置37℃，5％CO2
培养箱中培养，第二天补加因子120u/mL IL-1α、1100u/mL IL-2、800u/mL IL-7、130ng/mL CD3单抗、110ng/mL CD28。
[0013] 所述的方法，优选步骤(2)中PBMC复苏效率85％-99％。
[0014] 所述的方法，优选步骤(1)中冻存细胞密度控制在107-108个/mL。
[0015] 所述的方法，优选步骤(1)中降温梯度如下：
[0016] a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；
[0017] b.以5℃/min降至0℃，保持5min；
[0018] c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；
[0019] d.以1℃/min降至-45℃，保持35min；
[0020] e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；
[0021] f.结束。
[0022] 所述的方法，优选步骤(3)中诱导培养12-20天。
[0023] 所述的方法，优选步骤(1)中离心速率1800rpm/min，时间8min，步骤(2)中离心速率1000rpm/min，时间5min。
[0024] 所述的方法，优选储存的外周血单个核细胞接收标准：细胞总数MNC≥2×108，WBC≥4×108，细胞活性≥95％。
[0025] 所述的方法，优选储存的外周血单个核细胞入库标准：细胞总数MNC≥1×108，细胞活性≥90％。
[0026] 所述的方法，优选储存的外周血单个核细胞出库标准：细胞总数MNC≥0.2×108，细胞活性≥90％。
[0027] 利用冻存技术保存了PBMC的活性，本实验证实使用冷冻过的外周血单个核细胞能够定向诱导生成扩增活化的自体淋巴细胞(AIL)细胞，并且其扩增能力、细胞纯度和细胞毒活性均与新鲜细胞直接诱导生成的AIL细胞没有明显的差别。本实验结果为冷冻的外周血单个核细胞诱导的AIL细胞应用于临床肿瘤治疗提供了
基础，可根据肿瘤患者的
治疗方案随时复苏细胞，使现有的抗肿瘤免疫治疗方法更加灵活多变。利用本技术可长期保存外周血单个核细胞，并且长期保存后诱导成的AIL细胞杀伤活性不发生变化。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 1)本发明为冷冻的外周血单个核细胞诱导的AIL细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，使现有的抗肿瘤免疫治疗方法更加灵活多变；
[0030] 2)利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，预先储存健康的免疫细胞，需要时复苏并诱导为杀伤细胞，当日后患者需要治疗时，复苏诱导为杀伤细胞，不仅能为患者节约费用，还可减轻患者的痛苦。不但可以实践疾病预防的概念，更能提升预防医学的价值题；
[0031] 3)本发明中复苏的细胞存活率94.2％±3.42％，利用冻存技术保存了PBMC的细胞活性，复苏后诱导为AIL细胞的比率为53.1％，活化率高，从而提高了采集的外周血单个核细胞的复苏和诱导活化率。
附图说明
[0032] 图1培养第8天冻存组和新鲜组形态对比(A表示冻存组，B表示对照组，200倍放大)[0033] 图2培养前AIL细胞表型，图3冻存诱导第14天AIL细胞表型，
图4对照组第14天AIL细胞表型，
图5 AIL培养增殖情况。
具体实施方式
[0034] 下面结合具体
实施例对本发明进行进一步说明：
[0035] 实施例1
[0036] 一、PBMC细胞的分离与冻存：
[0037] a.PBMC细胞的分离：外周血用电动助吸器按照每管不多于35mL，平均分至50mL离心管中， 931g，离心8min，吸取上层
血浆至50mL离心管中，取1.5mL于EP管中，标记，-80℃保存。用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面。596g，离心20min。可见明显分层。吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50mL离心管中。分别向各管中加NA，稀释混匀，定容至40mL/管。931g，离心8min。吸弃上清，加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。
[0038] b.PBMC细胞冷冻保存：纯化后细胞重悬于自配冷冻保存液中，轻轻混匀后置-20℃
冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下，同时把冻存管放4℃冰箱平衡15min。分装入2-10mL冻存管内，管壁做好标识。放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪器，最终将细胞保存于-196℃液氮内，降温梯度如下：
[0039] (a)4℃等待，至产品放入程序降温仪；
[0040] (b)以5℃/min降至0℃，保持5min；
[0041] (c)以2℃/min降至-10℃，保持5min；
[0042] (d)以1℃/min降至-45℃，保持35min；
[0043] (e)以5℃/min降至-90℃，保持5min；
[0044] (f)结束。
[0045] 二、PBMC冷冻后复苏：于冷冻保存1、2、4、8、12和24个月后复苏细胞：取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在1min内80％溶解，将细胞吸到一定量DMEM洗涤液中，并洗涤冻存管1次，移入50mL离心管中，233g离心5min。弃上清，加入适量培养基，轻轻混匀，留取500μl做计数测细胞活性。
[0046] 三、细胞计数和台盼蓝拒染法测细胞活性
[0047] 全自动
血细胞分析仪检测细胞样本，读取屏幕上显示的WBC数值。根据公式细胞数T＝WBC*V计算细胞总数。准备两个1.5mL Ep管，在第1个Ep管中加入95μl DMEM溶液，在第2个Ep管中加入30μl 0.4％台盼蓝溶液。细胞样品充分混匀后，吸取5μl样品加入95μl DMEM溶液中，用吸管吹打混匀制成细胞混悬液。取30μl细胞混悬液加入30μl台盼蓝溶液中混匀后，取10μl细胞和染液的混悬液，镜下观察计数板中四个象限活细胞数(C)和被染成蓝色的死细胞数(N)，应用下列公式计算细胞活性：活细胞率(％)＝[100-10N/C]×100％[0048] 四、PBMC回收率
[0049] 计算PBMC回收率，采用公式：PBMC细胞回收率＝(分离后细胞数/分离前细胞数)×100％。
[0050] 五、诱导AIL细胞的体外扩增培养
[0051] AIL诱导培养：PBMC按照细胞密度1×106/mL用X-VIVO15重悬，添加诱导因子诱导培养；此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mL IL-2的X-VIVO15培养基。细胞第15天
收获做流式检测和内毒素检测。
[0053] 留取冻存前细胞洗涤液进行细菌和真菌培养。
[0054] 七、统计学分析
[0055] 数据用SPSS13.0统计
软件包处理，以 和百分率分别表示计量结果和计数结果，P<0.05示差异有统计学意义。趋势图用EXCEL制作。
[0056] 实施例2
[0057] 在实施例1基础上，设置不同冷冻保存液配方，如下
[0058] 在500ul细胞培养液中分别加入等体积的以下组分的冻存母液：
[0059] a、30％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷50％,10％甘油磷脂，10％EG；
[0060] b、37.5％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷62.5％,
[0061] c、33.3％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷55.6％,11.1％EG
[0062] d、33.3％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷55.6％,11.1％甘油磷脂
[0063] 表1不同冷冻保护液对PBMC的保护效果(％， n＝5)
[0064]
[0065] 四组冻存保护液比较，冻存效果有统计学差异(P＜0.05)
[0066] 采用配方a的PBMC在-196℃液氮中储存24个月后复苏，镜下观察见细胞形态完整，圆形饱满，PBMC复苏效率94.2％±3.42％。而配方b、c、d中的复苏率远远低于配方a，表明，经过冻存母液的配方选择，大大提高了PBMC的复苏效率。
[0067] 实施例3
[0068] 在实施例2配方a的基础上，进行诱导配方的选择
[0069] PBMC按照细胞密度1×106/mL用X-VIVO15重悬，添加1000u/mL IFN-γ和80u/mL ATP诱导培养AIL细胞，放置37℃，5％CO2培养箱中培养，第二天选择性补加因子120u/mL IL-1α、1100u/mL IL-2、800u/mL IL-7、130ng/mL CD3单抗、110ng/mL CD28；在传统AIL细胞培 养基础上采用添加重组人细胞因子IL-7和CD28。
[0070] 实验共分四组，
[0071] A组为对照组：IFN-γ+IL-2+ATP+IL-1α+CD3；
[0072] B组：IFN-γ+IL-2+ATP+IL-1α+CD3+IL-7；
[0073] C组：IFN-γ+IL-2+ATP+IL-1α+CD3+CD28；
[0074] D组：IFN-γ+IL-2+ATP+IL-1α+CD3+IL-7+CD28，
[0075] 此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mL IL-2的X-VIVO15培养基。在培养第3、6、9、12、14d，应用血球计数仪进行细胞计数；在培养第14d，应用流式细胞术检测冻存组和对照组AIL细胞CD3CD56阳性表达。
[0076] 表2不同时期各组细胞因子配方诱导的AIL细胞数( n＝5)
[0077]
[0078] 注：细胞培养第6d起，D组AIL组细胞数较对照组AIL细胞数多，差异有显著性(P＜0.05)。
[0079] 表3使用不同细胞因子配方诱导PBMC至AIL的诱导率(％ n＝5.)
[0080]各组细胞因子 第14d应用流式细胞仪检测各组细胞诱导率
A组 (35.4±5.5)％
B组 (48.9±4.1)％
C组 (48.4±5.5)％
D组 (57.9±3.7)％
[0081] 从表2和3可以看出，D组诱导因子具有更好的诱导效果。
[0082] 实施例4
[0083] 表4效应细胞的体外细胞毒活性(％ n＝5.)
[0084] 未冻存的新鲜组与冻存组(使用实施例2中的a组冻存液配方和实施例3中的D组诱导因子配方)单个核细胞诱导的AIL细胞对NK敏感(K562)或非敏感株细胞(Hela)及贴壁或悬浮生长的肿瘤细胞均显示出强大的杀伤活性，且该活性随效靶浓度比的增加而增大，两组间的细胞毒活性无显著性差异(P值>0.05)，见表4.
[0085] 表4新鲜组与冻存组单个核细胞诱导的AIL细胞杀伤活性
[0086]
[0087] 倒置
显微镜下观察：外周血单个核细胞呈悬浮生长，大小均匀，折光性一致，AIL细胞经4d培养后部分细胞明显增大，可见细胞集落，胞核密度加强，体积增大，胞膜光滑，未见突起，新鲜与冻存后的单个核细胞诱导的AIL细胞在形态(分别见图1中A和B)和表型(图2-4)上无明显差别，增殖高峰期均在10-12d(图5)。
[0089] 无血清培养基(C液)、Pague plus分离液(A液)、AIL试剂B液均购自齐鲁细胞治疗公司，注射用重组人白介素-2(IL-2)、DMSO(WAK-Chemie)、CD3、CD56记
抗体及同型对照购自Beckman Coulter。Ⅱ级
生物安全柜(Termoscitific)、低温台式台式离心机(Beckman Coulter)、超低温冰箱和二
氧化
碳培养箱(Termoscitific)。
[0090] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
