技术领域
[0001] 本
发明涉及一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，尤其涉及一种细胞冻存复苏后高效扩增的方法，该方法可以进行成人免疫细胞的储存及后期复苏培养应用临床
治疗项目。
背景技术
[0002] 免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别
抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化(activation)，分裂增殖、发生特异性免疫应答。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有一种淋巴细胞为自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞。
[0003] 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。PBMC是将白细胞进一步提取的、具有分化为更强大效应细胞的一部分。通过特定因子的诱导，PBMC在体外可以分化为多种免疫细胞，如现在广泛应用于
生物治疗的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)，树突状细胞(dendritic cells，DCs)和自然杀伤细胞(NK)等细胞。
[0004] 最新版的《世界癌症报告》由世卫组织下属的官方癌症机构国际癌症研究中心(IARC)负责，来自40多个国家的250多位科学家参与编撰，对全球180多个国家的28种癌症的总体情况和流行趋势进行了全面的描述和分析，这也是6年来首篇概述全球癌症情况的报告。
[0005] 报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。
[0006] 报告还显示，非洲、亚洲和中南美洲的发展中国家癌症发病形势最为严峻。2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。世卫的数据略低于中国自己的统计。全国
肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。
[0007] 细胞免疫治疗有可能成为
癌症治疗的主要手段。目前临床试验效果显示,细胞免疫治疗在一些较难治疗的癌症病例中,取得较为突出的临床效果和生存数据,是继手术和放疗、化疗后的一项突出有效的治疗方式。目前该治疗方式在国际上取得极大关注,如2011年《Nature》杂志发表文章认为“癌症细胞免疫治疗即将迎来新一轮的研究高潮,未来有可能在癌症治疗中占据相当重要的地位”；2012年底,《Science》杂志将癌症免疫治疗列为2013年最值得关注的六大科学领域之一。科学界的关注,表明该治疗方式的巨大潜
力,但也说明该方法目前还处于比较早期,在临床试验中研究较多,产业化需要逐步推进。
[0008] 据了解，人的免疫力在20岁的时候达到巅峰，40岁时免疫力只有巅峰时的1/2，到了70岁更是只剩下巅峰时期的1/10，免疫力下降意味着免疫细胞对抗病毒、细菌以及癌变的能力逐年降低，患病
风险也相对提高。而在年轻、健康的情况下储存优质免疫细胞，则是给人体生命的一份保障，也是为人体健康储存了一份希望。
发明内容
[0009] 本发明为了解决现有PBMC提取率较低、细胞冻存液含有动物血清、冻存细胞活率低下及复苏后细胞扩增能力不足等技术中存在的问题而提出的。
[0010] 本发明的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：
[0011] 一、对采集到的成人外周静脉血进行分离纯化，获得外周血单个核细胞；
[0012] 二、对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化；
[0013] 三、用冻存液重悬外周血单个核细胞进行稀释，使细胞悬液
密度达到1～10×107个/mL；
[0014] 四、将稀释后的细胞悬液分装至1.8mL冻存管中，每管添加1mL，并留样待检，将细胞冻存管放入4℃预温的程序降温盒中，转移到-80℃
冰箱暂时储存；
[0015] 五、预留的冻存细胞悬液进行细菌、
真菌、内毒素和支原体等指标的检测，指标检测合格后，冻存入库做长期保存；
[0016] 六、复苏时，将从冻存入库中取出的细胞转入预温至-80℃的冻存盒内后，平衡5min转入37℃
水浴融化；
[0017] 七、将融化后的细胞转移至含
质量百分含量为10％人血
白蛋白的生理盐水
混合液中洗涤，检测细胞活率，之后将细胞重悬于含有质量百分含量为10％人血白蛋白的无血清培养体系中接种培养，即完成所述的长期储存成人外周血单个核细胞。
[0018] 本发明包含以下有益效果：
[0019] 本发明有别于其他储存免疫细胞方式，是以细胞纯化及浓缩为手段，可将
抽取的血液中免疫细胞保留比例提高至传统方法的2到3倍，细胞复苏存活率高达95％以上，同时冻存细胞收率在95％以上(冻存后与冻存前细胞计数比值)，本发明的方法一次可冻存超过15亿个种类完整的免疫细胞，包含树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞及T细胞等，可有效应用于多种免疫
细胞疗法并可供多次治疗使用。正常情况下，免疫细胞保存期为20年左右。目前国际上通用的免疫细胞保存技术是将获得的免疫细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百年以上的细胞仍然具有其生物活性。在免疫细胞保存期间，可根据客户要求进行定期复苏、扩增，满足客户长期存储的需求的同时还可以用于客户
指定的免疫细胞治疗等服务。同时，由于储存及后期复苏培养过程中没有任何动物源血清或蛋白的添加，保障了临床应用的安全性及
稳定性，大大降低应用后的副反应发生情况。
附图说明
[0020] 图1为成人PBMC提取效率图；
[0021] 图2为成人PBMC复苏活率图；
[0022] 图3为CIK诱导培养扩增倍数图；
[0023] 图4为成人PBMC冻存后复苏回收率图。
具体实施方式
[0024] 具体实施方式一：本实施方式的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：
[0025] 一、对采集到的成人外周静脉血进行分离纯化，获得外周血单个核细胞；
[0026] 二、对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化；
[0027] 三、用冻存液重悬外周血单个核细胞进行稀释，使细胞悬液密度达到1～10×107个/mL；
[0028] 四、将稀释后的细胞悬液分装至1.8mL冻存管中，每管添加1mL，并留样待检，将细胞冻存管放入4℃预温的程序降温盒中，转移到-80℃冰箱暂时储存；
[0029] 五、预留的冻存细胞悬液进行细菌、真菌、内毒素和支原体等指标的检测，指标检测合格后，冻存入库做长期保存；
[0030] 六、复苏时，将从冻存入库中取出的细胞转入预温至-80℃的冻存盒内后，平衡5min转入37℃水浴融化；
[0031] 七、将融化后的细胞转移至含质量百分含量为10％人血白蛋白的生理盐水混合液中洗涤，检测细胞活率，之后将细胞重悬于含有质量百分含量为10％人血白蛋白的无血清培养体系中接种培养，即完成所述的长期储存成人外周血单个核细胞。
[0032] 本实施方式有别于其他储存免疫细胞方式，是以细胞纯化及浓缩为手段，可将抽取的血液中免疫细胞保留比例提高至传统方法的2到3倍，细胞复苏存活率高达95％以上，同时冻存细胞收率在95％以上(冻存后与冻存前细胞计数比值)，本实施方式的方法一次可冻存超过15亿个种类完整的免疫细胞，包含树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞及T细胞等，可有效应用于多种免疫细胞疗法并可供多次治疗使用，是业界储存免疫细胞种类最多、数量最完整的细胞储存技术。正常情况下，免疫细胞保存期为20年左右。目前国际上通用的免疫细胞保存技术是将获得的免疫细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百年以上的细胞仍然具有其生物活性。在免疫细胞保存期间，可根据客户要求进行定期复苏、扩增，满足客户长期存储的需求的同时还可以用于客户指定的免疫细胞治疗等服务。
[0033] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中获得外周血单个核细胞的方法为：离心收集成人外周静脉血，并水浴灭活，离心收集
血浆上清液，每10mL分装一支，-80℃保存，备用；采用淋巴细胞分离液分离血细胞中的单个核细胞，并收集单个核细胞。其它与具体实施方式一相同。
[0034] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化的具体操作如下：用复方
电解质溶液洗涤单个核细胞两次，收集最后一次洗涤的上清液，并进行细菌、真菌、支原体和内毒素检测，检测合格后，离心收集的细胞待用。其它与具体实施方式一相同。
[0035] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中的冻存液配制如下：按细胞无血清培养基、人血白蛋白和DMSO的体积比为4:5:1的比例混合而成。其它与具体实施方式一相同。
[0036] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：冻存液中的人血白蛋白的质量分数至少为10％。其它与具体实施方式一相同。
[0037] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五中指标检测合格是指：细菌、真菌、支原体检测皆为阴性，内毒素含量不高于0.25EU/mL。其它与具体实施方式一相同。
[0038] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：该方法所用
试剂为药用或GMP级别。其它与具体实施方式一相同。
[0039] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤七中无血清培养体系中含有单克隆
抗体和细胞因子；其中，单克隆抗体的在无血清培养体系中的浓度为500ng/mL。其它与具体实施方式一相同。
[0040] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：细胞因子为浓度20～100ng/ml GM-CSF、0.5～4ng/ml IL-1α、1000～4000IU/ml IL-2、5～ 30ng/ml IL-4、
0.25 ～ 2ng/ml IL-7、0.2 ～ 2ng/ml IL-12、0.25 ～ 2ng/ml IL-15、500 ～ 2000IU/ml IFN-γ、50～500ng/ml anti-CD3-McAb中的一种或多种任意比混合。其它与具体实施方式一相同。
[0041] 具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：细胞因子为50～500ng/ml anti-CD3-McAb、500 ～ 2000IU/ml IFN-γ、0.5 ～ 4ng/ml IL-1α、1000 ～
4000IU/ml IL-2和0.25～2ng/ml IL-7按任意比混合。其它与具体实施方式一相同。
[0042] 本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
[0043] 通过以下
实施例验证本发明的有益效果：
[0044] 实施例1 PBMC的分离制备：
[0045] 1.离心收集样本血浆，并水浴灭活，离心收集血浆上清液，每10ml分装一支，-80℃保存，备用；
[0046] 2.采用淋巴细胞分离液分离血细胞中的单个核细胞，并收集单个核细胞；
[0047] 3.用复方
电解质溶液洗涤细胞两次，以彻底去除淋巴细胞分离液，收集细胞最后一次洗涤的上清液，并进行细菌、真菌、支原体和内毒素检测。离心收集的细胞待用；
[0048] 实施例2 PBMC的冻存：
[0049] 1.配制细胞冻存液：按照细胞无血清培养基、人血白蛋白和DMSO按照4:5:1的体积比混合而成；
[0050] 2、用配置好的细胞冻存液将收集的PBMC混合均匀，并调整细胞浓度为1×107个/ml；
[0051] 2.将细胞悬液分装到1.8ml冻存管中，并抽样进行病毒、细菌、真菌、支原体和内毒素检测，将细胞冻存管放入程序降温盒，-80℃暂时保存。带所有监测结果合格后，将细胞入库，
封存在液氮中做长期保存。
[0052] 实施例3 PBMC的复苏及培养：
[0053] 1.将液氮中取出的冻存管室温平衡1min后，快速转移至37℃水浴锅中融化细胞；
[0054] 2.将融化后的细胞悬液转移至离心管中，并添加细胞洗涤液，离心收集细胞，共进行两次清洗；
[0055] 3.用培养基重悬细胞，并吹打均匀，使细胞充分分散开，(以CIK细胞培养为例)接种于培养瓶中，并添加人自体血浆上清，使血浆浓度达到5％，并添加干扰素γ，使其终浓度为4000IU/ml；
[0056] 4.接种24小时后，添加抗CD3抗体，使其终浓度为1μg/ml，添加白介素2，使其终浓度为4000IU/ml；
[0057] 5.根据培养情况随时添加培养基(白介素2，1000IU/ml，自体血浆0.5％)；
[0058] 6.培养14天后
收获细胞分别进行流式、细菌、真菌、革兰氏、支原体和内毒素检测。；
[0059] 为证明免疫细胞储存的有效性，分别对细胞复苏后的活率(见图2)，回收率，CIK扩增倍数(见图3)、CIK流式指标(见表1)和CIK体内杀瘤性检测和CIK体外杀瘤性检测(见表2)。
[0060] 表1效应细胞的阳性比率统
[0061]
[0062] 表2 MTT法进行体外杀瘤性实验的结果
[0063]
[0064]
[0065] 体外杀瘤性实验的靶细胞为K562。K562的培养条件为10％FBS的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO2。从本实施例2中冻存的四个批次的样本中随机选取10组细胞，按照实施例3所述实验方法进行复苏和CIK的诱导北洋，组别分别标记为1-10。将K562接种于3
96孔板中，每孔接种细胞5×10个。待K562完全贴壁后，取培养成熟的CIK，并离心获得
4
细胞，采用10％FBS的RPMI-1640培养基将细胞沉淀重悬，并调整细胞密度为5×10(效应细胞：靶细胞为20：1)个/ml，每个组别选择5个孔，并做好标注，弃掉其中的培养基，添加重悬好的CIK细胞悬液，每孔添加200μl。并在6h采用MTT测其吸光值(OD570nm)，并按照下述公式计算其杀瘤性：
[0066] 杀伤率＝[(空白组OD值—实验组OD值)/空白组OD值]×100％。
[0067] 体外杀瘤性结果见表2。
[0068] 体内杀瘤性实验选用30只裸鼠，雌性，体重15-18g，5周龄。将K562细胞用生理盐5 5
水悬浮，调整细胞浓度为2×10/ml，每只裸鼠注射细胞体积为1ml，即2×10个细胞。在无菌条件下，将制备好的肿瘤细胞悬浮液接种于裸鼠左腋下。将裸鼠随机分为十组，标为1-10组，另外选取三只裸鼠为对照组，仅进行肿瘤细胞和生理盐水的注射。收获的CIK注射方式
6
为尾缘静脉注射，注射细胞数为2×10个细胞。小鼠培养至20天时进行解剖，获得肿瘤组织并称重。并按照下述公式计算其抑癌率：
[0069] 抑癌率＝[(对照组肿瘤重量—实验组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量]×100％。
[0070] 体内杀瘤性实验结果见表3。
[0071] 表3 CIK体内杀瘤性实验结果
[0072]
[0073]
[0074] 综上，本发明提供了一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法。针对目前的健康人群提供了一项“免疫细胞生命
银行”的保障。在未来10年内，肿瘤人群还将由于环境和饮食的问题持续翻倍增长。面对肿瘤对生命及健康的挑战，本发明未雨绸缪，关键时刻将给予强力回击，以期将肿瘤扼杀在摇篮之中。
[0075] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同
修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
