一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法
专利汇可以提供一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种hIL‑10重组载体，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组 氨 酸(6×His)的重组载体，如重组载体的质粒图谱所示；重组载体的构建、表达及鉴定方法步骤包括：1)rh‑IL10基因的扩增；2)重组载体的构建、表达及其鉴定；rh‑IL10融合蛋白的纯化方法步骤为：1)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的粗提；2)包涵体洗涤；3)包涵体溶解；4)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的纯化；5)融合蛋白his‑intein‑IL10‑RGD的复性及自切割；6)IL10‑RGD纯化；增加了hIL‑10在体内的靶向性，赋予了蛋白具有抗 肿瘤 以及 机体 免疫功能的活性，更为重要的是其在 伤口愈合 过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而 预防 抑制瘢痕 纤维 化的形成。，下面是一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法专利的具体信息内容。
1.一种hIL-10重组载体，其特征在于，采用IMPACT系统表达，其融合蛋白标签为6个组氨酸的重组载体，如重组载体的质粒图谱图1所示；
所述的一种hIL-10重组载体的构建、表达及鉴定方法包括以下步骤：
(一)rh-IL10基因的扩增
1)总RNA的提取
正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10％PRMI1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5％ CO2培养箱，37℃培养48h，收集细胞，根据SigmaRNA抽提试剂盒方法，提取总RNA，-80℃保存备用；
2)RNA反转录及IL-10 cDNA的扩增
利用Takara公司反转录试剂盒，按照说明进行RT-PCR反应：第一步去除基因组DNA，5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，Total RNA 500ng，Rnase Free dH2O加至10μl，42℃温育2min；第二步反转录，分别加PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl，RTPrimer Mix1μl，5×PrimeScript Buffer 24μl，第一步反应液10μl，Rnase Free dH2O加至20μl，37℃温育30min，85℃反应3min后得到cDNA；
(二)重组载体的构建、表达及其鉴定
1)pTWIN1-IL10表达载体的构建
按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点，合成如下2条引物F1、R1；
RGD导向肽氨基酸序列如下：H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH；
RGD基因序列：5′tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3′；
F1：5′GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3′BspQI
R1：5′CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3′Pstl以F1、R1为引物，cDNA为模板，随之按95℃ 10s预变性，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃
1min，30个循环后72℃进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWIN1载体分别经BspQ I/Pstl双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化DH5α，挑取单克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定，得到pTWIN1-IL10-RGD表达载体；
2)pTWIN1-his-IL10表达载体的构建
带有his标签his-IL10-RGD扩增引物：
F2：5′CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3′Ndel/6xhisR2：5′AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG3′Pstl
以F2、R2为引物，pTWIN1-IL10-RGD为模板，随之按95℃ 10s预变性，95℃ 30s，60℃
30s，72℃ 1.2min，30个循环后72℃进行延伸5min，得到PCR产物，产物及pTWIN1-IL10-RGD载体分别经Ndel/Pstl双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化Rosetta，挑取单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pTWIN1-his-IL10-RGD表达载体的工程菌；
3)rhIL-10重组蛋白在大肠杆菌中的表达
上述工程菌pTWIN1-his-IL10-RGD/Rosetta接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，次日以1％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素发酵培养基中，继续在
37℃震荡培养至对数生长中期，培养液光密度OD600为0.6时，加入1mM IPTG继续培养5hr诱导表达，离心收集菌体；
4)rhIL-10蛋白表达的检测及鉴定
将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12％的SDS-PAGE电泳分析表达产物，IPTG诱导与未诱导样相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融合蛋白的分子量大小相符；将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL发光，可见一明显显色带，分子量一致，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应；
rh-IL10融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
1)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的粗提
取诱导表达的菌体20g，用200ml裂解液：10mM Tris-Cl，pH8.5；1mM EDTA，pH8.0，磁力搅拌器充分搅拌15min后，加入200μl的50μg/ml溶菌酶，充分搅拌15min，4℃静置1hr，取样
50μl，12000rpm离心5min，上清中加入2×loading buffer混匀，沉淀中加入50μl ddH2O重悬，加入2xloading buffer混匀；废水煮5min，12000rpm离心5min，经SDS-PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的；
2)包涵体洗涤
第一，加入0.1％单位为w/v的脱氧胆酸钠DOC，继续加入1mM MgCl2，加入2.5μg/ml DNA酶Dnase l，磁力搅拌器充分搅拌20min，取样50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；
第二，加入200ml裂解液，0.5％单位为w/v的脱氧胆酸钠DOC进行洗涤，磁力搅拌器搅拌
15min，取样50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；
第三，加入200ml裂解液，0.5％单位为v/v Triton X-100，磁力搅拌器搅拌15min，取样
50μl后静置10min，4℃离心，12000rpm/min，离心20min，弃上清；
第四，重复上一步操作；
3)包涵体溶解
第一，400ml溶解液溶解包涵体，磁力搅拌器搅拌1.5hr，4℃静置过夜；其中，溶解液为
0.1M Tris-Cl，pH 10.0，0.1M NaCl，8M尿素，10mM 2-巯基乙醇；
第二，将上述溶解液12000rpm离心20min，收集上清；
第三，将上清装入透析袋，用pH8.0溶解液不含β-ME透析24-36hr，换液2-3次，离心收集上清；
4)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的纯化
取GE公司镍柱基质NI Sepharose Fast Flow装柱，柱体积5.4×15cm，用pH8.0溶解液不含β-ME平衡，上样后分别用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3M咪唑pH8.0溶解液线性梯度洗脱，收集各个峰样品，SDS-PAGE鉴定；
5)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的复性及自切割
于4℃时，在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性，在pH6.0缓冲液中融合蛋白his-intein-IL10-RGD发生自切割，透析至pH8.0缓冲液中；SDS-PAGE跑胶鉴定；
6)IL10-RGD纯化
0.1M pH为8.0的Tris-ClpH8.0，0.1M NaCl缓冲液平衡柱，上样后缓冲液平衡柱后用含
0.01、0.02、0.15、0.25M咪唑线性洗脱，收集各个峰样品，浓缩后SDS-PAGE鉴定；银染结果证明样品纯度达95％以上，即为rhIL-10-RGD。
一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法
技术领域
背景技术
发明内容
1hr，取样50μl，12000rpm离心5min，上清中加入2×loadingbuffer混匀，沉淀中加入50μl ddH2O重悬，加入2×loading buffer混匀。废水煮5min，12000rpm离心5min，经SDS-PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的；
具体实施方式
5hr诱导表达，离心收集菌体。
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