专利汇可以提供一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且一种hIL-10重组载体,采用IMPACT系统表达,其融合蛋白标签为6个组 氨 酸(6×His)的重组载体,如重组载体的质粒图谱所示;重组载体的构建、表达及鉴定方法步骤包括:1)rh-IL10基因的扩增;2)重组载体的构建、表达及其鉴定;rh-IL10融合蛋白的纯化方法步骤为:1)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的粗提;2)包涵体洗涤;3)包涵体溶解;4)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的纯化;5)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的复性及自切割;6)IL10-RGD纯化;增加了hIL-10在体内的靶向性,赋予了蛋白具有抗 肿瘤 以及 机体 免疫功能的活性,更为重要的是其在 伤口愈合 过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合,从而 预防 抑制瘢痕 纤维 化的形成。,下面是一种rhIL-10重组载体构建及其蛋白提纯的方法专利的具体信息内容。
1.一种hIL-10重组载体,其特征在于,采用IMPACT系统表达,其融合蛋白标签为6个组氨酸(6×His)的重组载体,如重组载体的质粒图谱所示。
2.根据权利要求1所述的一种hIL-10重组载体的构建、表达及鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
(一)rh-IL10基因的扩增
1)总RNA的提取
正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞,PBS洗涤2次,重悬于10%PRMI1640培养液,加入终浓度为10g/L的ConA,置5%CO2培养箱,37℃培养48h,收集细胞,根据Sigma RNA抽提试剂盒方法,提取总RNA,-80℃保存备用;
2)RNA反转录及IL-10 cDNA的扩增
利用Takara公司反转录试剂盒,按照说明进行RT-PCR反应:第一步去除基因组DNA,
5×gDNA Eraser Buffer 2μl,gDNA Eraser 1μl,Total RNA 500ng,Rnase Free dH2O加至10μl,42℃温育2min;第二步反转录,分别加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl,RT Primer Mix1μl,5×PrimeScript Buffer 24μl,第一步反应液10μl,Rnase Free dH2O加至20μl,37℃温育30min,85℃反应3min后得到cDNA。
(二)重组载体的构建、表达及其鉴定
1)pTWIN1-IL10表达载体的构建
按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点,合成如下2条引物F1、R1;
RGD导向肽氨基酸序列如下:H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH;
RGD基因序列:5′tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3′;
F1:5′GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3′BspQI
R1:5′CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3′Pstl以F1、R1为引物,cDNA为模板,随之按95℃10s预变性,95℃30s,55℃30s,72℃1min,
30个循环后72℃进行延伸5min,得到PCR产物,产物及pTWIN1载体分别经BspQ I/Pstl双酶切,回收目的片段进行连接,连接产物转化DH5α,挑取单克隆,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定,得到pTWIN1-IL10-RGD表达载体;
2)pTWIN1-his-IL10表达载体的构建
带有his标签his-IL10-RGD扩增引物:
F2:5′CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3′Ndel/6xhisR2:5′AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG3′Pstl
以F2、R2为引物,pTWIN1-IL10-RGD为模板,随之按95℃10s预变性,95℃30s,
60℃30s,72℃1.2min,30个循环后72℃进行延伸5min,得到PCR产物,产物及pTWIN1-IL10-RGD载体分别经Ndel/Pstl双酶切,回收目的片段进行连接,连接产物转化Rosetta,挑取单克隆,抽提质粒,酶切鉴定,进一步经测序鉴定,构建成pTWIN1-his-IL10-RGD表达载体的工程菌;
3)rhIL-10重组蛋白在大肠杆菌中的表达
上述工程菌pTWIN1-his-IL10-RGD/Rosetta接种于含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,次日以1%(v/v)的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素发酵培养基中,继续在37℃震荡培养至对数生长中期,培养液光密度OD600为0.6时,加入1mM IPTG继续培养5hr诱导表达,离心收集菌体;
4)rhIL-10蛋白表达的检测及鉴定
将诱导表达的菌体培养物离心,收集菌体,采用12%的SDS-PAGE电泳分析表达产物,IPTG诱导与未诱导样相比,在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带,与预计融合蛋白的分子量大小相符。将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上,常规Western blot分析,ECL发光,可见一明显显色带,分子量一致,未诱导菌株,标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应。
3.rh-IL10融合蛋白的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的粗提
取诱导表达的菌体20g,用200ml裂解液(10mM Tris-Cl,pH8.5;1mM EDTA,pH8.0),磁力搅拌器充分搅拌15min后,加入200μl溶菌酶(50μg/ml),充分搅拌15min,4℃静置1hr,取样50μl,12000rpm离心5min,上清中加入2×loading buffer混匀,沉淀中加入50μl ddH2O重悬,加入2xloading buffer混匀。废水煮5min,12000rpm离心5min,经SDS-PAGE检测发现表达的融合蛋白存在于沉淀中,说明诱导表达的重组蛋白是以包涵体形式存在的;
2)包涵体洗涤
第一,加入0.1%(w/v)脱氧胆酸钠(DOC),继续加入1mM MgCl2,加入2.5μg/ml DNA酶(Dnase l),磁力搅拌器充分搅拌20min,取样50μl后静置10min,4℃离心,12000rpm/min,离心20min,弃上清;
第二,加入200ml裂解液,0.5%DOC(w/v)进行洗涤,磁力搅拌器搅拌15min,取样
50μl后静置10min,4℃离心,12000rpm/min,离心20min,弃上清;
第三,加入200ml裂解液,0.5%Triton X-100(v/v),磁力搅拌器搅拌15min,取样
50μl后静置10min,4℃离心,12000rpm/min,离心20min,弃上清;
第四,重复上一步操作;
3)包涵体溶解
第一,400ml溶解液(0.1M Tris-Cl(pH 10.0),0.1M NaCl,8M尿素,10mM 2-巯基乙醇(β-ME))溶解包涵体,磁力搅拌器搅拌1.5hr,4℃静置过夜;
第二,将上述溶解液12000rpm离心20min,收集上清;
第三,将上清装入透析袋,用pH8.0溶解液不含β-ME透析24-36hr,换液2-3次,离心收集上清;
4)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的纯化
取GE公司镍柱基质NI Sepharose Fast Flow装柱,柱体积5.4×15cm,用pH8.0溶解液不含β-ME平衡,上样后分别用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3M咪唑pH8.0溶解液线性梯度洗脱,收集各个峰样品,SDS-PAGE鉴定;
5)融合蛋白his-intein-IL10-RGD的复性及自切割
于4℃时,在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性,在pH6.0缓冲液中融合蛋白his-intein-IL10-RGD发生自切割,透析至pH8.0缓冲液中。SDS-PAGE跑胶鉴定;
6)IL10-RGD纯化
0.1M Tris-Cl(pH8.0),0.1M NaCl缓冲液平衡柱,上样后缓冲液平衡柱后用含0.01、
0.02、0.15、0.25M咪唑线性洗脱,收集各个峰样品,浓缩后SDS-PAGE鉴定;银染结果证明样品纯度达95%以上,即为rhIL-10-RGD。
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