用于人类和动物葡萄球菌感染的新蛋白
阅读：270发布：2021-03-16
专利汇可以提供用于人类和动物葡萄球菌感染的新蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及称作ply_pitti26的多肽，包含如SEQ ID NO：1所示的序列和该多肽的变体。此外，本发明涉及编码所述多肽和其变体的核酸和载体，涉及包含该核酸和/或载体的宿主细胞。最后，本发明涉及所述多肽、其变体、核酸序列、载体和宿主细胞的用途，尤其是用于感染或暴露于葡萄球菌病人的 治疗 或 预防 。，下面是用于人类和动物葡萄球菌感染的新蛋白专利的具体信息内容。
1.包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽或其变体，所述变体是：
a)一种多肽，其包含SEQ ID NO：1的CBD被另一种葡萄球菌特异性内溶素的CBD域替代而得到的序列，或
b)一种多肽，其包含除了SEQ ID NO：1的至少第一个N-末端氨基酸和至多前28个
N-末端氨基酸以外的SEQ ID NO：1的序列，或
c)一种多肽，其包含SEQ ID NO：1序列中一个或多个点突变或氨基酸取代，或
d)一种多肽，其除了包含SEQ ID NO：1的序列之外还包含代表标记部分、标签部分、或其它功能多肽序列的序列，或
e)一种多肽，其包含插入根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个附加的氨基酸残基，或
f)一种多肽，其包含代表a)、b)、c)、d)和e)变体的任意组合的多肽序列。
2.根据权利要求1的多肽，其中多肽可裂解金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌。
3.根据以上任一项权利要求的多肽，其中包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽的变体包含SH3型内溶素细胞结合域。
4.根据以上任一项权利要求的多肽，其中包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽的变体包含选自ply_USA或ply_pitti20的内溶素CBD域的CBD域。
5.根据权利要求4的多肽，其中包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽的变体包含SEQ ID NO：3或5所示的CBD域。
6.根据权利要求5的多肽，其包含SEQ ID NO：7或11所示的序列。
7.根据以上任一项权利要求的多肽，其中包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽的变体缺少SEQ ID NO：1的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、
14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或
28个N-末端氨基酸残基。
8.根据以上任一项权利要求的多肽，其中包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽的变体相对于SEQ ID NO：1显示单个或多个取代，其中被取代的残基选自SEQ ID NO：1的下列氨基酸残基：F19、W22、W36、F42、Y44、L55、L56、F67、L74、Y78、W107、Y115、I116、Y119、W123、W128、W137、W139、W154、E163、R167、E179、E189、Y200、Y275、Y276、C282、F300和C303。
9.根据权利要求8的多肽，其中替换的氨基酸残基F、W、Y、I、L被调换为氨基酸残基R、D、E、N、K、Q、H、S、T、M、G或A。
10.根据权利要求9的多肽，其相对于SEQ ID NO：1的序列显示选自下组的一个或多个取代：W22R、F42A、F44A、F67T、Y115S、W123M、W137A、W139A、W154H、、E163A、E179Q、E179A、E187Q、Y200A、Y200H、Y275A、Y275M、Y276A、C282A、F300A、C303S、W310A和W310M。
11.根据权利要求10的多肽，其相对于SEQ ID NO：1包含以下取代之一：F67T+Y115S、F67T+W137A、F67T+W139A、F67T+W154H、Y115S+W137A、Y115S+W139A、E163Q+R169A、E163A+R169A、E163Q+R167A+E189Q、E163A+R167A+E189Q、E163Q+R167A+E179Q+E189Q、E163Q+R167A+E179A+E189Q、E163A+R167A+E179Q+E189Q、E163A+R167A+E179A+E189Q、Y200A+Y275A、Y200A+Y276A、Y200A+C282A、Y200A+F300A、Y275A+Y276A、
L55H+L56T+E163A+R167A+Y200H、E163A+R167A+E179A+E189Q+Y200H、L55H+L56T+E163A+R16
7A+E179A+E189Q+Y200H、S237L+R354Q+A367V、和L55H+L56T+E163A+R167A+Y200H+S237L+R3
54Q+A367V。
12.根据以上任一项权利要求的多肽，其中多肽包含生物素或链霉抗生物素蛋白作为附加的标记部分。
13.根据权利要求1到11中任一项的多肽，其中多肽进一步包含HA-标签、His-标签、Strep-标签、Myc-标签或GST-标签。
14.根据权利要求13的多肽，其中多肽包含如SEQ ID NO：9或SEQID NO：13所示的序列。
15.包含如SEQ ID NO：15、18、20或22所示的序列或其变体的多肽。
16.包含编码根据权利要求1到15任一项的多肽的序列的核酸分子。
17.根据权利要求16的核酸分子，其中核酸分子包含选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、
14、16、17、19、21、或23的序列。
18.包含根据权利要求16或17的核酸的载体。
19.包含权利要求16或17的核酸分子或权利要求18的载体的宿主细胞。
20.根据权利要求1到15中任一项的多肽，其用作药物。
21.权利要求20的多肽，其中该多肽与载体一起施用。
22.根据权利要求1到15中任一项的多肽，其用作治疗或预防葡萄球菌感染的药物。
23.权利要求22的多肽，其中所述葡萄球菌感染是由金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌感染引起的。
24.根据权利要求22或23的多肽，其中葡萄球菌感染导致疾病状态。
25.根据权利要求22到24中任一项的多肽，其中疾病是菌血症、心内膜炎、角膜炎、植入物周围炎或牛乳腺炎。
26.根据权利要求22到25中任一项的多肽，其中多肽与载体一起施用。
27.根据权利要求22到26中任一项的多肽，其中多肽通过局部、口服或静脉注射施用。
28.清洁组合物，其包含根据权利要求1到15中任一项的多肽或根据权利要求19的宿主细胞。
29.化妆品组合物，包含根据权利要求1到15中任一项的多肽或根据权利要求19的宿主细胞。
30.药物组合物，包含根据权利要求1到15中任一项的多肽或根据权利要求19的宿主细胞。
31.根据权利要求1到15中任一项的多肽用于处理或防止食品、食品加工装置、食品加工设施或与食品接触的表面的葡萄球菌污染的用途。
32.根据权利要求1到15中任一项的多肽作为药物、食品或饲料诊断或环境诊断中的诊断手段的用途。
33.包含根据权利要求1到15中任一项的多肽的诊断试剂盒。
用于人类和动物葡萄球菌感染的新蛋白
[0001] 本发明涉及包含如SEQ ID NO：1所示的序列的称作p1y_pitti26的多肽，和该多肽的变体。此外，本发明涉及编码所述多肽和其变体的核酸和载体，涉及包含该核酸和/或载体的宿主细胞。最后，本发明涉及所述多肽、其变体、核酸序列、载体和宿主细胞的用途，尤其是用于感染或暴露于葡萄球菌的受试者的治疗或预防的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 全世界范围内，葡萄球菌(Staphylococcal)所导致的感染是高死亡率的严重疾病的主要原因。革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引起多种皮肤和软组织的感染以及危及生命的感染如菌血症和心内膜炎。而且，金黄色葡萄球菌经常与食物中毒有关。由于它对低pH值和高盐条件的耐受，这种病原体在多种食物产品，尤其是动物源的食物产品中生长，并产生耐热肠毒素。特别容易感染的是手术后的病人、或正在经历血液透析中病人，以及早产婴儿和免疫妥协的人，或需要假体装置的人。葡萄球菌所导致的感染是一个受到全球性关注的健康问题，原因是该感染的高分布(人群中约25-30％是无症状的携带者)和逐渐增多的金黄色葡萄球菌抗生素抗性株的出现。MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)是这个类群中的一个著名成员，它是导致医院内感染的主要原因。此外，还有许多多元抗药株，甚至那些对“最后防线的药物”如万古霉素(vancomycin)、利奈唑胺(linezolid)或达托霉素(daptomycin)有耐药性的菌株。抗生素抗性葡萄球菌感染使全球卫生预算增加了巨大的费用，因为病人经常需要长期住院并且不得不与其它病人隔离。
[0004] 除了凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)，来自凝固酶阴性葡萄球菌类群的病原体是重要的。例如，溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)，可引起角膜炎；表皮葡萄球菌(S.epidermidis)经常在植入装置上的生物被膜(biofilm)中被发现，与植入物周围炎(endoplastitis)有关；此外腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)引起泌尿道感染。除人类的感染之外，牛感染也起到重要作用。尤其，牛乳腺炎——一种乳腺感染，在产业上具有重要性。除了金黄色葡萄球菌，感染是由一些凝固酶阳性葡萄球菌如表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌(S.simulans)，产色葡萄球菌(S.chromogenes)，猪葡萄球菌(S.hyicus)，沃氏葡萄球菌(S.warneri)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)引起的。
[0005] 常规的抗生素治疗日益失效。因此，人们需要开发治疗细菌感染的新对策。这样的策略包括开发新抗生素以及寻找抗微生物肽。另外的途径有应用抗体和假定性的(putative)疫苗或噬菌体治疗。然而所有这些方法都显示出严重的缺点。在普遍使用时，新抗生素也会产生新抗性；抗微生物肽和单克隆抗体还需要大量投资方可能实现在治疗中的常规使用；到目前为止针对金黄色葡萄球菌的免疫方法未获成功，而噬菌体治疗会引起免疫应答和组织渗透(tissue penetration)、且噬菌体可能导致细菌毒素发生不希望的转移等问题。使用分离的肽聚糖水解酶类，即所谓的内溶素，是噬菌体治疗的一个进步。内溶素酶可水解其相应噬菌体的宿主生物体细菌的细胞壁。
[0006] 相关技术的描述
[0007] 感染宿主细菌后，噬菌体在宿主细胞中产生新的噬菌体颗粒。在生殖周期结束时，必须裂解宿主细胞以释放新一代噬菌体。内溶素被产生来作为裂解宿主细胞的工具。已发现，当将外源内溶素添加到未感染的细菌细胞中时，该内溶素也可作用于细菌细胞壁(“自外溶菌作用”lysis fromwithout)。Gasson于1991年(GB 2,255,561)首次公开了利用内溶素杀灭食品中的污染细菌的用途。Fischetti团队于2001年(Nelson&Fischetti，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，4107-4112；Loeffler et al.，2001，Science，94，
2170-2172)描述了首次使用小鼠模型系统的体内治疗和预防应用。这项工作描述了内溶素抗A组链球菌(group A streptococci)(口服)和抗肺炎双球菌(pneumococci)(鼻咽用药)的局部用药。后来，增加了抗炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的应用(Schuch et al.，2002，Nature 418，884-889)。Entenza等(2005，Antimicrob.Agents Chemother.，49，
4789-4792)报导了细胞溶素Cpl-1抗大鼠中引起心内膜炎的肺炎双球菌的应用。内溶素PlyGBS被用于杀灭小鼠模型中阴道和口咽中的B组链球菌(group B streptococci)(Cheng et al.，2005，Antimicrob.Agents Chemother.，49，111-117)。Fischetti(2006，BMC Oral Health，6，16-19)概述了噬菌体水解酶控制致病细菌的应用。
2170-2172)描述了首次使用小鼠模型系统的体内治疗和预防应用。这项工作描述了内溶素抗A组链球菌(group A streptococci)(口服)和抗肺炎双球菌(pneumococci)(鼻咽用药)的局部用药。后来，增加了抗炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的应用(Schuch et al.，2002，Nature 418，884-889)。Entenza等(2005，Antimicrob.Agents Chemother.，49，
4789-4792)报导了细胞溶素Cpl-1抗大鼠中引起心内膜炎的肺炎双球菌的应用。内溶素PlyGBS被用于杀灭小鼠模型中阴道和口咽中的B组链球菌(group B streptococci)(Cheng et al.，2005，Antimicrob.Agents Chemother.，49，111-117)。Fischetti(2006，BMC Oral Health，6，16-19)概述了噬菌体水解酶控制致病细菌的应用。
[0008] US5,997,862公开了以噬菌体衍生的细胞溶素治疗和预防细菌感染的许多治疗方法和药物组合物。其它一些专利教导了噬菌体衍生的细胞溶素治疗例如皮肤病学感染、眼睛感染、口腔和牙齿感染、呼吸道感染、多种疾病、一般细菌感染的具体组合物和应用，细胞溶素组合物肠道外的应用，和绷带组合物的应用。US 2007-077235描述了细胞溶素组合物治疗动物的乳腺炎。
[0009] 内溶素可分为五类：(1)N-乙酰胞壁酸酶(N-acetylmuramidases)(溶菌酶)，(2)内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidases)，和(3)溶菌性转糖酶(lytic transglycosylases)，它们均可切割肽聚糖的糖部分，(4)内肽酶，其切割肽部分，和(5)N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，(N-actylmuramoyl-L-alanine amidases)，其切断糖骨架和肽接头之间的酰胺键。内溶素呈现一种不同多肽域组合的模块型(modular)结构，这些多肽域表现酶活性或细胞结合活性，分别为所谓的EAD(酶活性域)和CBD(细胞结合域)。多数情况下，EAD位于内溶素的N-末端部分，CBD在C-末端部分，但是这一经验规则也有例外。也显示了不同细胞壁裂解酶之间的模块可以交换，产生新的功能酶，这些酶有时甚至显示出新的功能性质(Diazet al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，8125-8129；Croux et al.，1993，Molecular Microbiology，9，1019-1025；Donovan et al.，2006，Appl.&Environm.Microbiol.，72，2988-2996)。
[0010] 既然内溶素一般比抗生素更有特异性，不太可能很快产生抗性。因此，为了，应用作用于葡萄球菌属细菌的合适的内溶素，是对抗相应的感染的理想手段。在相关领域中已经描述了一些抗葡萄球菌属细菌的内溶素。与噬菌体P68有关的蛋白17是一种葡萄球菌内溶素，其也显示了抑制临床金黄色葡萄球菌分离株的抗菌活性(Takac et al.，2005，Antimicrobial Agents andChemotherapy，49，2934-2940)。源自金黄色葡萄球菌噬菌体Twort的内溶素plyTW对细菌细胞的水解活性只需要N-末端酶活性片段，然而与溶葡萄球菌素(lysostaphin)具有同源性的C-末端部分似乎是不必要的(Loessner etal.，1998，FEMS Microbiol.Lett，162，265-274)。Donovan 等 (2006，Appl.&Environm.Microbiol.，72，2988-2996)创造了一种无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)B30内溶素和溶血葡萄球菌的溶葡萄球菌素之间的嵌合内溶素，具有潜在的治疗乳腺炎的用途。一些团队将金黄色葡萄球菌噬菌体phi11的内溶素用于抗菌应用。Navarre等(1999，J.Biol.Chem.，274，
15847-15856)鉴定了phi11内溶素的多种酶活性，并且展示了酰胺酶域缺失的突变体仍具有活性。Donovan等(2006，FEMS Microbiol.Lett，265，133-139)在抗乳腺炎病原体的测定中使用完整的以及C-末端截断的phi11内溶素。有人在作用于金黄色葡萄球菌细胞壁、热灭活细胞和细菌生物膜的不同活性测定中检测了phi11内溶素和phi12内溶素的不同突变体(Sass&Bierbaum，2007，Appl.&Environment.Microbiol.，73，347-352)。沃氏葡萄球菌噬菌体ΦWMY的内溶素LysWMY，尽管据报道与phi11内溶素密切相关，但当酰胺酶和细胞结合域被删除时保留全部活性(Yokoi et al.，2005，Gene 351，97-108)。该结果表明，即使是密切相关的内溶素中，不同内溶素模块的功能和它们之间的相互作用也不尽相同。
15847-15856)鉴定了phi11内溶素的多种酶活性，并且展示了酰胺酶域缺失的突变体仍具有活性。Donovan等(2006，FEMS Microbiol.Lett，265，133-139)在抗乳腺炎病原体的测定中使用完整的以及C-末端截断的phi11内溶素。有人在作用于金黄色葡萄球菌细胞壁、热灭活细胞和细菌生物膜的不同活性测定中检测了phi11内溶素和phi12内溶素的不同突变体(Sass&Bierbaum，2007，Appl.&Environment.Microbiol.，73，347-352)。沃氏葡萄球菌噬菌体ΦWMY的内溶素LysWMY，尽管据报道与phi11内溶素密切相关，但当酰胺酶和细胞结合域被删除时保留全部活性(Yokoi et al.，2005，Gene 351，97-108)。该结果表明，即使是密切相关的内溶素中，不同内溶素模块的功能和它们之间的相互作用也不尽相同。
[0011] 尽管现有技术中已知针对葡萄球菌属细菌的不同内溶素，仍然需要高效率的、能以高效率的方式生产的、而且显示针对葡萄球菌属微生物的高活性的葡萄球菌内溶素。
[0014] 为了说明发明的特定方面，列出以下附图。它们不意在以任何方式限定本发明。
[0015] 图1提供了不同葡萄球菌内溶素的模块组织的图示
[0016] 内溶素由CHAP(半胱氨酸、组氨酸依赖性天冬酰胺酶/肽酶)和酰胺酶(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，ami)酶域、以及作为细胞结合域(CBD)的SH3-模块构成。
[0017] 图2显示针对热灭活葡萄球菌细胞的活性试验的溶菌区域的琼脂平板
[0018] 溶菌平板包括在顶层琼脂平板中测试的各个葡萄球菌株。将用于试验的含有待测的内溶素构建体质粒的大肠杆菌菌株或分离的内溶素制备物点样于平板的顶层。孵育后溶菌区域依赖于针对各个宿主细菌的溶菌活性出现。编号1表示没有裂解作用出现(-)的例子。编号2、3、和4标志各个内溶素变体的弱(+)，中(++)或强(+++)裂解活性。图中的琼脂平板示例性地展示了检验EADplypitti26_CBDplyUSA中一些点突变的活性的测定法。
[0019] 图3不同人工葡萄球菌内溶素构建体的对比
[0020] 该图显示了根据本发明的人工内溶素构建体的表达和溶解度(图3A)、和浊度测定中的活性(图3B)。“构建体3”是EADplypitti26_CBDplyUSA的同义词，“构建体5”是EADplypitti26_CBDplypitti20的同义词，构建体9和5是另外的人工内溶素。SDS-凝胶的泳道以“P”标示不溶的沉淀部分，以“S”标示可溶的上清部分。在边缘处标明分子质量标准。以箭头标示全长内溶素构建体的位置。如实施例2所描述地进行37℃时表达和溶解度的检测，活性的检测如实施例5同样进行，但使用的是蛋白表达后的细胞粗提物。
[0021] 图4表达后溶解度的对比
[0022] 显示了内溶素构建体表达后在30℃时进行的溶解度测试(实施例2中所描述的)。图4A显示了野生型plypitti26溶解度测试的SDS-凝胶，图4B是EADplypitti26_CBDplyUSA的相应的测试。“P”表示不可溶的“沉淀部分”而“S”表示上清中发现的可溶蛋白部分。内溶素的条带以星号标记，图4A的箭头表示一种大肠杆菌蛋白，该蛋白的移动地仅比plypitti26慢一点。分子质量标准参照物以“M”标记。
[0023] 图5EADplypitti26_CBDplyUSA和野生型plypitti26对未处理细胞的裂解活性的对比
[0024] 记录了加入纯化的plypitti26(编号1、2、3)或EADplypitti26_CBDplyUSA(编号4、5、6)后，对金黄色葡萄球菌细胞的浓度依赖性裂解情况。如实施例5所描述地进行了测定。向细菌细胞的悬液中加入2μg、5μg或10μg各种分离的内溶素蛋白(以箭头表示加入，曲线编号的增加表示蛋白浓度的增加)并记录样品浊度的降低直到完全裂解。
[0025] 图6人血清中的裂解活性
[0026] 图6显示了在人血清中进行的以浊度测定法测量的EADplypitti26_CBDplyUSA对金黄色葡萄球菌细胞的裂解。相对测定时间(s)测量了光密度(abs)的降低。在0时间点加入浓度为25μg/ml(------)、50μg/ml(-·-·-·-·-·)或100μg/ml(-··-··-··-)的EADplypitti26_CBDplyUSA。实线表示未加入内溶素的对照。实施例6描述了该测定。
[0027] 图7EADplypitti26_CBDplyUSA与野生型pitti26相比的稳定性
[0028] 该图显示了在储存缓冲液中25℃孵育后的内溶素产物的SDS-凝胶的照片(见实施例6)。图7A中，EADplypitti26_CBDplyUSA上样于凝胶，图7B显示了plypitti26蛋白。第一个条带表示25℃孵育时间以小时计的分子质量标准参照物。以箭头标记全长内溶素的位置。
[0029] 图8抗凝血酶的稳定性
[0030] 图8A是显示凝血酶消化前后的EADplypitti26_CBDplyUSA(条带3、4)和野生型plypitti26(条带1、2)的SDS-凝胶的照片。第一个条带(M)是分子质量标准参照物。泳道1和3是对照(未加入凝血酶)，泳道2和4显示加入凝血酶后的蛋白样品。以箭头标记全长内溶素的位置。图8B显示了凝血酶消化前后使用浊度测量的活性测定。左侧显示的是plypitti26，右侧显示的是EADplypitti26_CBDplyUSA。实线表示未加入凝血酶的裂解活性，虚线表示凝血酶消化后残留的活性。实施例8描述了该实验。
[0031] 图9人血液中的稳定性
[0032] 图9显示了37℃时在人血液中预孵育后的EADplypitti26_CBDplyUSA的稳定性。未经预孵育时达到的活性水平设为100％。(●)标示在缓冲液中预孵育后的活性，(▲)标示在人EDTA-血液中的各个预孵育。实施例9中描述了这些测定。
[0033] 图10A-C
[0034] 图 10A 显 示 了 修 饰 的 EADplypitti26_CBDplyUSA-EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5的氨基酸序列。图10B和C显示了编码修饰型EADplypitti26_CBDplyUSA-EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2M5的核酸序列。
[0035] 图11缓冲液中的裂解活性
[0036] 图11显示了不同内溶素构建体对金黄色葡萄球菌细胞的裂解活性的对比。测量加入浓度为1μg/ml(左面)或10μg/ml的蛋白后每分钟和每mg蛋白达到的600nm吸光度的降低(ΔA600/min mg)。使用的蛋白构建体从左至右为plypitti26(方格)，EADplypitti26_CBDplyUSA( 水 平 线 )，EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5(灰 色 )，EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8(白色)，EADplypitti26_CBDLS-Add2M5(垂直线)，EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5(黑色)，溶葡萄球菌素(棋盘格)。
[0037] 图12人血清中的裂解活性
[0038] 图12显示了不同内溶素构建体对金黄色葡萄球菌细胞的裂解活性的对比。测量加入浓度为10μg/ml(左图)或25μg/ml的蛋白后每分钟和每mg蛋白达到的600nm吸光度的降低(ΔA600/min mg)。使用的蛋白构建体从左至右为EADplypitti26_CBDplyUSA(水平 线 )，EADplypitti26CBDplyUSA-Add2_M5(灰 色 )，EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8(白色)，EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5(垂直线)，EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5(黑色)。
[0039] 图13葡萄球菌内溶素的热稳定性
[0040] 图13显示了葡萄球菌内溶素热变性过程中测量到的典型曲线。测量温度升高时360nm(A360)处的吸收(T，℃)。图13显示了使用浓度为0.1mg/ml的EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5测量到的浊度信号。箭头标示的是当蛋白开始聚集、A360信号显著增加时的温度。该温度定义为聚集温度Taggr。
[0041] 图14EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5的药代动力学研究
[0042] 图14A显示了在静脉注射内溶素EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5变体之后的不同时间点上，该蛋白质在大鼠血清中的残留活性；其中该活性是在微孔板中通过浊度测定测量的。所示的活性值(ΔA620/min)表示注射后，在每个时间点从3只大鼠中取得的样品测量到的平均值±标准误差。
[0043] 图14B显示了在静脉注射变体EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M55分钟后采取的大鼠血清中的内溶素活性(黑线)与对照组的对比，该对照组在免疫前血清中使用150μg/ml蛋白(灰线)或在配方缓冲液中使用150μg/ml蛋白。
[0044] 发明详述
[0045] 如本文所用的术语“内溶素”或“肽聚糖水解酶”涉及适合水解细菌细胞壁的酶。该酶包含以下活性中的至少一种：内肽酶、羧肽酶、N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰-胞壁质酶(溶菌酶或溶菌性转糖酶)或N-乙酰-氨基葡糖苷酶，上述活性构成了内溶素的“酶活性区域”(EAD)。或者，该酶是噬菌体或原噬菌体编码的，或衍生自细菌编码的相关酶，即所谓“自溶素”(autolysins)。而且，内溶素通常也包含没有酶活性、并且可结合于宿主细菌的细胞壁区域，即所谓CBD(细胞壁结合区域)。术语“内溶素”也涉及包含内肽酶区域及CBD的溶葡萄球菌素和ALE-1。
[0046] 如本文所用的术语“模块”指内溶素的具有特定功能的亚单元。通常，模块是相对小的功能单元如CHAP-，mi-或SH3-模块。
[0047] 如本文所用的术语“域”指内溶素的具有特定功能、并且也能够与结构域吻合(coincide)的亚单元。术语“域”优选地用于描述可由多于一个模块组成的EAD与CBD域之间的拮抗作用。
[0048] 如本文所用的术语“CBD”涉及内溶素的细胞壁结合域或细胞壁靶向域，其通常位于该蛋白的C-末端。CBD域不具有水解细胞壁的酶活性，但常常介导内溶素与细菌细胞壁的结合。CBD可包含SH3-域。
[0049] 如本文所用的术语“EAD”涉及内溶素中负责水解细菌肽聚糖的酶活性域。它包含内溶素的至少一种酶活性。EAD也可以由多于一个的酶活性模块组成。
[0050] “CHAP”域(半胱氨酸、组氨酸-依赖性酰胺水解酶/肽酶)是细菌、噬菌体、古细菌和锥虫科(Trypanosomidae)的真核生物蛋白中发现的一个110到140个氨基酸的区域。该蛋白可能主要在肽聚糖水解中起作用。CHAP域通常与细菌类型的SH3域和一些酰胺酶域家族相关联。含有CHAP域的蛋白质可在亲核攻击机制中利用催化性的半胱氨酸残基。CHAP域包含两个不变的氨基酸残基：一个半胱氨酸和一个组氨酸。这些残基构成含CHAP域的蛋白质的推定活性位点的一部分。
[0051] 如本文所用的术语“ami”描述的是一种酶学定义的(enzymaticallydefined)模块，其展现出酰胺酶活性，即它水解肽聚糖骨架中的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramine)和肽接头中毗连的氨基酸(通常是L-ala)之间的酰胺键。酰胺酶的活性通常是金属离子依赖性的。
[0052] 如本文所用的术语“肽酶M23”是指一种锌依赖性金属肽酶域，其作为内肽酶切开甘氨酰-甘氨酰肽键。肽酶M23区域发现于例如溶葡萄球菌素和ALE-1中。
[0053] 如本文所用的术语“SH3”域，有时也被称作Src同源性3域，描述的是一种大约60个氨基酸的小型非催化性蛋白域，是与其它结合配偶相互作用的蛋白质所特有的。它的识别特征是一种富脯氨酸共有基序。SH3域通常位于CBD中。肽聚糖水解酶中发现的SH3域经常是SH3b或SH35型的。
[0054] 如本文所用的术语“改组”是指来自不同酶的多肽的不同片段组合成为新的嵌合多肽构建体。在这个语境下，所述酶优选地是内溶素，所述片段优选地是模块(modules)。通常，以分子生物学方法在核酸水平上组合片段。为了结构上或克隆的原因，片段之间可引入小的接头序列。
[0055] 如本文所用的术语“野生型”是指蛋白或多肽天然存在的氨基酸序列或编码所述蛋白或多肽的核酸分子的核苷酸序列。
[0056] 如本文所用的术语“变体”是指天然存在的蛋白的修饰形式。变体产生自多肽的改组、或多肽的突变、增加标签或标签的添加、或这些不同可能性的组合。产生变体的合适的突变是氨基酸缺失、氨基酸添加或取代(氨基酸交换、点突变)。缺失、添加或取代的氨基酸的数目从1到几百不等。编码蛋白变体的各个核酸的修饰由遗传密码决定。
[0057] 发明人使用噬菌体分离的常规技术从污水样品中分离到了一些有抗葡萄球菌活性的裂解性噬菌体(Adams，1959，《bacterophages，Interscience Pub.，New York，p.447-451)。使用分子生物学技术和从传染病菌株中分离的金黄色葡萄球菌鉴定了一些溶原噬菌体。
[0058] 一种分离的噬菌体命名为pitti26。从分离的溶原噬菌体的噬菌体基因组中鉴定并分离了内溶素蛋白。从裂解性噬菌体pitti26中分离了一种优选的内溶素，命名为ply_pitti26(SEQ ID NO：1)。从裂解噬菌体pitti20中鉴定了另一种内溶素，命名为ply_pitti20。从原噬菌体ΦSA2usa的基因组中鉴定了一种原噬菌体衍生的内溶素，plyUSA，将其整合到甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌株USA300的基因组中(Diep et al.，The Lancet，2006，367，731-739；databank entry NC_007793)。
[0059] 葡萄球菌属细菌特异性噬菌体的内溶素通常由：两个酶活性域，即CHAP域和酰胺酶域(ami)，以及一个经常被定义为SH3b或SH3_5型的SH3-域的细胞结合域(CBD)，所组成。
[0060] 溶葡萄球菌素和ALE-1(一种溶葡萄球菌素同源物)都是肽聚糖水解酶类，它们特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁，因为这两种蛋白都包含能切断肽聚糖链之间的五甘氨酸联结的内肽酶域(肽酶_M23)，以及发挥CBD或靶向域功能的C-末端SH3b域。溶葡萄球菌素被模仿葡萄球菌腐生变种(Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus)分泌，ALE-1被头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)EPK1分泌。溶葡萄球菌素是作为前体蛋白被生产出来的，在成熟时失去N-末端的串联重复。ALE-1所含的N-末端重复区域不受到翻译后加工。有人确定，ALE-1的细胞壁靶向域由92个C-末端氨基酸(残基27到362)组成(Lu et al.，2006，J.Biol.Chem.，281，549-558)。该区域与溶葡萄球菌素C-末端的SH3b域非常相似(82％同一性)。
[0061] 本发明的发明人将内溶素plypitti26的CHAP和酰胺酶域与原噬菌体内溶素plyUSA的细胞结合域与内溶素plypitti20的细胞结合域、与溶葡萄球菌素的细胞壁靶向域、以及ALE-1的细胞壁靶向域组合而产生嵌合内溶素，这些嵌合内溶素具有一些新性质，可以使用这些内溶素变体作为抗葡萄球菌感染的治疗或预防药剂，作为抗葡萄球菌的消毒(disinfection)或清洁(sanitation)的抗微生物剂，或作为葡萄球菌诊断技术的手段。新性质是，例如，嵌合内溶素在缓冲系统、在治疗上相关的溶液如血液或血清中的更高的活性；在葡萄球菌属或金黄色葡萄球菌种中，优选地MRSA菌株中，更宽的宿主范围；嵌合内溶素的更高的溶解度(优选是表达后)，和更高的蛋白稳定性，优选是耐热稳定性、长期稳定性或针对蛋白酶的稳定性。分离的内溶素plypitti26以及嵌合酶可用于裂解葡萄球菌属的细菌。
[0062] 一方面本发明涉及一种称作ply_pitti26的多肽，其包含如SEQ ID NO：1所示的序列。
[0063] 在另一方面，本发明涉及该包含如SEQ ID NO：1所示的序列的名为ply_pitti26的多肽的变体。下述实施方案被认为是ply_pitti26的变体：
[0064] a)多肽，其包含ply_pitti26的CBD被另一种葡萄球菌特异性内溶素的CBD域替代而得到的序列，或
[0065] b)多肽，其包含除了ply_pitti26的至少第一个N-末端氨基酸和至多前28个N-末端氨基酸以外的ply_pitti26的序列，或
[0066] c)多肽，其包含ply_pitti26的序列中一个或多个点突变或氨基酸取代，或[0067] d)多肽，其除了包含SEQ ID NO：1之外还包含标记部分、标签、或其它功能多肽序列，或
[0068] e)多肽，其包含插入根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的一个或多个附加的氨基酸残基，或
[0069] f)a)、b)、c)、d)和e)的任意组合。
[0070] 如上所述，本发明涉及包含SEQ ID NO：1的序列的多肽及其变体。所述多肽及其变体被认为是根据本发明的多肽。它们都具有这样的共同特征，即发挥能裂解葡萄球菌属细菌的内溶素的功能。所述针对葡萄球菌的特异性可通过本领域已知的多数方法或如下文所描述地那样进行检验，例如，通过向包含一个或多个所述葡萄球菌属种类的样品中加入重组内溶素变体，确定加入(重组)内溶素后浊度的变化。
[0071] 在一个优选的实施方案中，所述ply_pitti26变体是ply_pitti26的CBD域被另一种内溶素的CBD替代而成的多肽。大体上，对于从抗-葡萄球菌内溶素中选择其它的CBD没有限制，只要得到的(重组)内溶素保持对葡萄球菌属细菌，尤其是金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌的特异性。在一个特别优选的实施方案中，所述重组内溶素包含SH3型的内溶素细胞结合域。优选地，CBD域选自ply_USA或ply_pitti20或溶葡萄球菌素或ALE-1的内溶素CBD域。作为ply_USA 的CBD，尤其是如SEQ ID NO：3所示的序列是优选的。ply_pitti20的CBD尤其是如SEQ ID NO：5所示的序列是优选的。SEQ IDNO：7和11显示了这种具有经交换的CBD的ply_pitti26重组内溶素变体的实例。
[0072] 在一个进一步的优选的实施方案中，ply_pitti26的变体包含除了特定数目的N-末端残基之外的ply_pitti26序列。本发明的发明人发现，如果从SEQID NO：1中除去超过28个N-末端氨基酸残基，则内溶素活性消失。因此，适当的ply_pittii26变体大体上包含SEQ ID NO：1的序列但缺少SEQ IDNO：1的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或28个N-末端氨基酸残基。特别优选的是缺少ply_pitti26的4个、9个或28个N-末端氨基酸残基的变体。
[0073] 一个优选的实施方案中，称作ply_pitti26的多肽的变体显示相对于SEQID NO：1的单个或多个取代。特别地，被取代为其它氨基酸残基的位点是F19、W22、W36、F42、Y44、L55、L56、F67、L74、Y78、W107、Y115、1116、Y119、W123、W128、W137、W139、W154、E163、R167、E179、E189、Y200、Y275、Y276、C282、F300、C303和/或W310。所有位点是以SEQ ID NO：1为参考表示的。
[0074] 一个更优选的实施方案中，疏水氨基酸残基例如F、W、Y、I、和L，尤其是那些应当位于蛋白表面的疏水氨基酸残基，被疏水性更弱的氨基酸例如R、D、E、N、K、Q、H、S、T、M、G、A取代，其中特别地优选A。因为疏水蛋白容易聚集，所述取代能增加该蛋白的溶解度。如果同源蛋白或模块的结构是已知的，则可根据蛋白的高分辨结构或模型来预测氨基酸残基的潜在的表面暴露。优选地将带电荷的氨基酸例如E、D和R、K取代为不带电荷的氨基酸(例如用Q或A取代E，用N或A取代D，用A取代R或K)，这是因为带电荷的氨基酸通常是蛋白酶的识别位点。半胱氨酸优选地被取代为A或S，因为半胱氨酸在氧化性的条件下容易形成二硫桥，这对酶的结构和功能可能是不利的。
[0075] 特别优选的变体是在SEQ ID NO：1序列中发生选自以下组的突变。所有的取代是参照SEQ ID NO：1的位置给出的：W22R、F42A、Y44A L55H、L56T、F67T、Y115S、W123M、W137A、W139A、W154H、E163Q、E163A、R167A、E179Q、E179A、E187Q、E189Q、Y200A、Y200H、Y275A、Y275M、Y276A、C282A、F300A、C303S、W310A和/或W310M。所述取代可以是SEQ ID NO：1的单突变体(single mutant)或者可以是两个或更多所述取代的组合。优选的SEQ ID NO：1的多突变体(multiple mutants)是选自包含以下多突变体的组：L55H+L56T、F67T+Y115S、F67T+W137A、F67T+W139A、F67T+W154H、Y115S+W137A、Y115S+W139A、E163Q+R167A、E163A+R167A、E163Q+R169A、E163A+R169A、E163Q+R167A+E189Q、E163A+R167A+E189Q、E163Q+R167A+Y200H、E163A+R167A+Y200H、E163Q+R167A+E179Q+E189Q、E163Q+R167A+E179A+E189Q、E163A+R167A+E179Q+E189Q、E163A+R167A+E179A+E189Q、Y200A+Y275A、Y200A+Y276A、Y200A+C282A、Y200A+F300A、Y275A+Y276A、Y275A+F300A、C282A+F300A、Y200A+Y275A+Y276A、Y275A+Y276A+F300A、L55H+L56T+E163Q+R167A+Y200H、L55H+L56T+E163A+R167A+Y200H、E163Q+R167A+E179A+E189Q+Y200H、
E163A+R167A+E179A+E189Q+Y200H、L55H+L56T+E163Q+R167A+E179A+E189Q+Y200H、L55H+L5
6T+E163A+R167A+E179A+E189Q+Y200H、和S237L+R354Q+A367V、L55H+L56T+E163A+R167A+Y2
00H+S237L+R354Q+A367V和L55H+L56T+E163Q+R167A+Y200H+S237L+R354Q+A367V。
E163A+R167A+E179A+E189Q+Y200H、L55H+L56T+E163Q+R167A+E179A+E189Q+Y200H、L55H+L5
6T+E163A+R167A+E179A+E189Q+Y200H、和S237L+R354Q+A367V、L55H+L56T+E163A+R167A+Y2
00H+S237L+R354Q+A367V和L55H+L56T+E163Q+R167A+Y200H+S237L+R354Q+A367V。
[0076] 一个进一步的优选的实施方案中，ply_pitti26变体包含附加的标记部分例如生物素或链霉抗生物素蛋白，或标签，例如HA-标签(氨基酸序列EQKLISEEDL)，His-标签 (Nieba et al.，1997，Anal.Biochem.，252，217-228)，Strep-tag(Voss&Skerra，1997，Protein Eng.，10，975-982)，Myc- 标 签 (Evan etal.，Mol&Cell Biol，5，3610-3616)，GST- 标 签 (Peng et al.1993，Protein.Expr.Purif.，412，95-100)，JS- 标 签 (WO2008/077397)，半胱氨酸标签(EP1399551)或本领域已知的其它标签。优选的其它功能多肽序列是例如蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，上述ply_pitti26的变体可用于帮助ply_pitti26或所述变体的生物技术生产。
[0077] 在进一步的优选实施方案中，ply_pitti26变体包含一个或多个附加的氨基酸残基。优选地，根据本发明的多肽包含一个、两个、三个、或四个附加的氨基酸残基，其中所述残基可以是毗邻的残基，或它们可以插入独立的位点。优选的是附加一个或两个，更优选的是一个氨基酸残基。最优选的是在第一位(position one)后附加一个氨基酸残基，优选的是附加氨基酸残基A。如果ply_pitti26中已经插入一个或多个氨基酸残基，那么上述的氨基酸取代的优选位点就需要根据插入氨基酸残基的数目和位点作调整。举例来说，如果一个氨基酸残基插入了第二位，则位点F19将成为F20，W22将成为W23，以此类推。如果插入多于一个的氨基酸残基，新的位置需相应地调整。
[0078] 需要了解的是，以上所例示的各个ply_pitti26变体不应认为是严格独立的实施方案，而应认为是可结合的。例如，根据本发明的ply_pitti26变体可包含一种或多种选自下组的变化：SEQ ID NO：1的N-末端截短、如上文所述的一个或多个取代、另一个内溶素的CBD域、一个或多个氨基酸添加以及例如His-标签，条件是这样的重组内溶素仍然是对葡萄球菌特异性的。本领域技术人员可容易地确定所述变体中的哪一个适合实现他的目的，并且总是可使用所属领域的常规方法检验该变体对抗葡萄球菌的活性，例如，通过测定裂解活性对含有葡萄球菌的溶液的光密度的影响。这样的组合变体的说明性实例是SEQ ID NO：9(具有plyUSA的CBD和附加的C-末端His-标签的ply_pitti26)和SEQ ID NO：13(具有ply_pitti20的CBD和附加的C-末端His-标签的ply_pitti26)。
[0079] 具有替换的CBD以及进一步第二位上的一个氨基酸添加的ply_pitti26变体的说明性实例是SEQ ID NO：28(具有plyUSA的CBD和第二位上添加的氨基酸残基A的ply_pitti26)，命名为EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2。
[0080] 以下描述了ply_pitti26变体的其它说明性的实例，这些变体具有替换的CBD、一个或多个氨基酸取代、以及进一步在第二位上的一个附加氨基酸残基。特别优选的是具有根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽。所述多肽衍生自ply_pittii26，具有如SEQ ID NO：7所示的plyUSA的CDB，并具有以下五个单氨基酸取代：L56H、L57T、E164A、R168A和Y201H；和一个附加的A2。该变体命名为EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5。注释“M5”代表每个这样的构建体：其包含ply_pitti26的EAD中特别优选的五个单氨基酸取代的组合L56H、L57T、E164A、R168A和Y201H。注释“Add2”代表每个这样的构建体：其包含在ply_pitti26的EAD中第二位上附加的单个氨基酸残基。进一步特别优选的是将ply_pitti26的EAD和溶葡萄球菌素的CBD结合而成的变体，其名为EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5，并具有如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，或者，是将ply_pitti26的EAD与ALE-1细胞溶素的CBD结合而成的变体，其名为EADplypitti26CBDALE1-Add2_M5，并具有如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列。
[0081] 而且，特别优选的是具有根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。所述多肽衍生自ply_pitti26，具有如SEQ ID NO：7所示的plyUSA的CDB，并具有以下八个单氨基酸取代：L56H、L57T、E164A、R168A、Y201H、S238L、R355Q、和A368V，以及一个附加的A2。该变体名为EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8。
[0082] 另一方面本发明涉及编码本发明多肽之一的核酸分子。本领域技术人员容易想到可以有许多方法构建编码根据本发明的多肽之一的核酸分子，例如考虑到简并遗传密码。本领域技术人员在知晓本发明多肽的氨基酸序列的基础上能够选择最适合其目的的核苷酸序列，例如具有与其期望的表达宿主的密码子用法适应的密码子用法的核苷酸序列。包含编码本发明多肽的序列的核酸分子分别地被认为是本发明的核酸或核苷酸序列。
[0083] 一个优选的实施方案中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：1的序列的内溶素。优选地，所述核酸包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0084] 另一个优选的实施方案中，编码的多肽是ply_pitti26变体，特别是CBD域被另一种葡萄球菌噬菌体内溶素的CBD所取代的变体。SEQ ID NO：4和6、和25和27分别是中编码plyUSA或ply_pitti20或溶葡萄球菌素或ALE-1的CBD的核苷酸序列的说明性实例。进一步说明本发明的核苷酸序列的实施例分别是SEQ ID NO：8(编码具有ply_USA的CBD的ply_pitti26)，10(编码具有ply_USA的CBD和附加的C-末端His-标签的ply_pitti26)，12(编码具有ply_pitti20的CBD的ply_pitti26)和14(编码具有ply_pitti20的CBD和附加的C-末端His-标签的ply_pitti26)。
[0085] 在一个优选的实施方案中，核酸分子编码包含SEQ ID NO：15的序列的多肽，名为EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5。优选地，所述核苷酸包含如SEQ ID NO：16和17所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：16是分别从噬菌体pitti26和原噬菌体ΦSA2usa中分离的核苷酸序列，它具有编码已被取代的氨基酸残基的核苷酸密码子修饰，即L56H、L57T、E164A、R168A和Y201H，还具有一个插入的密码子，编码附加的氨基酸残基A2。SEQ IDNO：17衍生自SEQ ID NO：16但其为了在E.coli K12中表达进行了密码子优化。进一步的优选的实施方案是核苷酸序列SEQ ID NO：19，其也进行了密码子优化，SEQ ID NO：21，和SEQ ID NO：23，分别编码根据本发明的多肽EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8、EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5、和EADplypitti26_CBDALE 1-Add2_M5。
[0086] 在进一步的方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列的载体。优选地，所述载体使本发明所述的多肽得以在适当的宿主细胞中表达。所述宿主细胞的选择可仅仅出于生物技术上的原因，例如产率、溶解度、成本等等。但如果所述细胞将施用于受试者，也可从医疗的观点进行选择，例如非致病的细菌或酵母、人细胞。所述载体可提供根据本发明的所述多肽的组成型或诱导型表达。
[0087] 本发明的进一步的方面，上述多肽和/或细胞用于治疗或预防受试者的葡萄球菌感染，特别是治疗或预防金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌感染的方法。所述个体可以是人类受试者或动物，特别是畜牧业和/或乳业使用的动物例如牛。所述治疗的方法包括以足够量的本发明所述多肽应用于感染部位或要进行预防感染处理的部位。
[0088] 特别地，所述治疗方法可用于治疗或预防皮肤、软组织的感染，特别是金黄色葡萄球菌感染；菌血症、和/或心内膜炎。
[0089] 一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的多肽在治疗角膜炎，特别是溶血葡萄球菌引起的角膜炎的方法中被使用。
[0090] 一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗或预防植入物周围炎，特别是表皮葡萄球菌引起的植入物周围炎。
[0091] 一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗或预防泌尿道感染，特别是腐生葡萄球菌引起的植入物周围炎。
[0092] 一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的多肽用于治疗动物葡萄球菌感染的治疗(或预防)的方法，特别是家禽和乳牛。特别地，本申请的多肽适合用于牛乳腺炎，特别是由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、产色葡萄球菌、猪葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌引起的牛乳腺炎，的治疗(或预防)方法。
[0093] 此外，本发明的多肽可在预防上用作清洁剂(sanitizing agent)，尤其是手术前后，或例如血液透析中。类似地，在预防上或严重感染时，可以以本发明的多肽治疗早产婴儿和免疫妥协的人，或那些需要假体装置的受试者。在同一语境下，对于由葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌(MRSA)导致的医院内感染，可以用本发明的多肽处理进行预防性处理，或者在严重感染期内进行处理。在这个实施方案中，本发明的多肽可用作消毒剂，也可与消毒溶液中用到的其它成分如去污剂、表面活性剂(tensids)、溶剂、抗生素、羊毛硫抗生素(lanthibiotics)、或细菌素(bacteriocins)结合使用。
[0094] 在一个特别优选的实施方案中，如果治疗(或预防)的感染是由多元抗药葡萄球菌菌株，特别是抗万古霉素，利奈唑胺或达托霉素的菌株引起的，本发明的多肽用于医学治疗。此外，通过与常规抗菌剂例如抗生素、羊毛硫抗生素、细菌素、其它内溶素等等结合施用，本发明的多肽可用于治疗方法。
[0095] 在根据本发明的治疗(或预防)方法中，给药剂量和途径取决于要治疗的疾病种类和感染部位。给药途径可以是，例如，在具体实施方案中，口服、局部、鼻咽、非口服、静脉注射、直肠或其它任一施用途径。
[0096] 为了将本发明的多肽施用于感染部位(或有感染危险的部位)，本发明的多肽可制成一定的方式，以保护内溶素在到达感染部位前不受蛋白酶、氧化、免疫应答等环境影响。
[0097] 因此，本发明的多肽可制成胶囊、糖衣片、丸剂、栓剂、注射溶液或其它任一医学上适合的盖仑制剂。一些实施方案中，这些盖仑制剂可包含合适的载体、稳定剂、调料、缓冲液或其它合适的试剂。
[0098] 例如，为了进行局部用药，可以用洗液或膏药的方式施用本发明的多肽。
[0099] 为了进行鼻咽用药，根据本发明的多肽可制成盐水通过喷雾器应用于鼻部。
[0100] 为了进行肠的治疗(treatment of the intestine)，例如在牛乳腺炎中，可考虑栓剂剂型。可选地，可以考虑口服用药。这种情况下，需保护本发明的多肽不受恶劣的消化环境的影响，直到其到达感染部位。所述保护可通过例如使用细菌作为载体实现，其使本发明的多肽抵抗胃部的初步消化，之后保护本发明的多肽到达肠内环境。
[0101] 所有的医药应用均依赖于本发明的多肽遇到葡萄球菌属的细菌时，可将其特异和快速地裂解的效果。通过减少致病菌和细菌负荷并同时减轻免疫系统负担，其可立即对受治者的健康状况产生影响。因此，本领域技术人员面对的主要任务是针对要治疗的各个疾病正确地制备本发明的多肽。为了达到这个目的，通常可以使用与这些应用所用的常规药物相同的盖仑制剂。
[0102] 在进一步的方面，本发明的上述多肽和/或细胞是药物组合物的成分，该药物组合物可选地包含载体物质。
[0103] 在更进一步的方面，所述多肽和/或细胞是化妆品组合物的成分。如上所述，一些葡萄球菌属的物种可刺激病人身体上暴露于环境中的表面例如皮肤。为了防止这种刺激或为了消除所述葡萄球菌属病原体的轻微症状，可使用特定的化妆品制剂，其包含足够量的本发明的多肽以裂解已经存在的或新近感染的葡萄球菌。
[0105] 本发明进一步的方面涉及所述根据本发明的多肽在葡萄球菌诊断方面的应用。在该方面中，根据本发明的多肽用作特异性裂解葡萄球菌属细菌的方法。通过添加去污剂如Triton X-100或其它削弱细菌细胞包膜的添加剂如多粘菌素B，可以有助于利用根据本发明的多肽裂解细菌细胞。作为第一步的特异性的细胞裂解是随后特异性检测葡萄球菌属细菌所需要的，该检测使用基于核酸的方法如PCR、核酸杂交、或NASBA(核酸序列依赖的扩增)，免疫方法如IMS、免疫荧光技术或ELISA技术，或其它依赖细菌细胞的细胞内成分的方法如使用葡萄球菌属细菌特异性蛋白的酶法测定。
[0106] 本发明进一步的方面涉及包含根据本发明的多肽、去污剂如TritonX-100或其它可削弱细菌细胞包膜的添加物如多粘菌素B的诊断试剂盒。该试剂盒可包含除此之外的装置和物质以进行检测，如PCR装置、用于核酸杂交或NASBA(核酸序列依赖的扩增)、免疫方法如IMS、免疫荧光技术或ELISA技术，或其它依赖细菌细胞的细胞内成分的方法如使用葡萄球菌属细菌特异性蛋白的酶法测定的装置。实施例
[0107] 所 有 克 隆 操 作 均 使 用 根 据 Sambrook 等 (Molecular cloning.A laboratorymanual；2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)的标准技术完成。突变和缺失的引入也使用标准技术。
[0108] 实施例1：根据本发明的内溶素的克隆
[0109] 对于EADplypitti26_CBDplyUSA，CHAP-Ami2域的核苷酸序列扩增自裂解性噬菌体pitti26(自行分离的)，CBD序列扩增自plyUSA。对于EADplypitti26_CBDplypitti20，CBD衍生自plypitti20(自行分离的)。通过连接反应合并这些片段，并通过限制位点NcoI和BamHI将之克隆到表达载体pET14b内。通过限制位点NcoI和BamHI将这一新构建体克隆到表达载体pQE60中，以在此序列中增加一个C-末端多聚His-标签。该构建体包含附加的位于C-末端的Ser-Arg-Ser-(His6)序列。
[0110] 实施例2：根据本发明的内溶素的表达和溶解度测定
[0111] 分别使用大肠杆菌HMS174(DE3)(pET14b构建体)和大肠杆菌M15(pQE构建体)进行克隆构建体的表达。细胞在包含氨苄青霉素和利福平(HMS174(DE3))或氨苄青霉素(M15)的LB培养基中生长，在30℃或37℃下摇床培养，并在OD600nm0.4-0.6(对数中期)时加入1mM的IPTG。进一步摇床培养3-4小时后，通过离心收获细胞并在-20℃冷藏。
[0112] 对于溶解度测定，将收获的细胞重新悬浮于裂解缓冲液(20mM Tris/HClpH8.0，5mM EDTA)，超声波处理(2x 30秒)并离心。将沉淀溶于与上清液精确等体积的缓冲液。将相同样品体积的沉淀和上清部分用12％SDS-PAGE分析。
[0113] 尽管37℃表达时重组产生的内溶素的溶解度一般很小，30℃表达时EADplypitti26_CBDplyUSA的溶解度显著高于野生型plypitti26。plypitti26的几乎所有蛋白均在不溶的沉淀部分中被发现，而EADplypitti26_CBDplyUSA在表达时则发现有大约
30％到40％的可溶部分。EADplypitti26_CBDplypitti20与此相似。
30％到40％的可溶部分。EADplypitti26_CBDplypitti20与此相似。
[0114] 实施例3：根据本发明的内溶素的纯化
[0115] 根据制造者的说明使用Ni-NTA-Sepharose柱(Amersham)，纯化可溶性带有His-标签的本发明内溶素构建体。细胞沉淀悬浮于平衡缓冲液(25mMTris/HCl pH 8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，0.1％吐温20，10％甘油)中，离心、上样到用相同的缓冲液平衡的柱子上。在洗脱缓冲液(25mM Tris/HClpH 8.0，500mM咪唑，0.1％吐温20，10％甘油)中对蛋白进行洗脱，用SDS-PAGE对洗脱的级分进行分析。将包含纯化内溶素的级分汇集后对储存缓冲液(20mM Tris/HCl pH 7.5，10mM DTE，0.1mM ZnSO4)透析，并在-20℃储存。
[0116] 根据本发明的可溶性不带His-标签的内溶素的纯化遵循阴离子交换层析、大小排阻层析和疏水层析的标准纯化程序进行，使用例如StreamlineHST、Superdex、和HiTrap Capto MMC柱(GE Healthcare)。
[0117] 如将沉积在包涵体中的不可溶性内溶素物质(实施例2中的沉淀部分)在变性条件下溶解再进行重折叠，可以增加活性内溶素的量。例如通过将表达温度升高到37℃，可以增加沉积在包涵体中的蛋白的量。例如在Navarre et al.，1999，J.Biol.Chem.274，15847-15856中描述了溶解和再折叠的合适条件。
[0118] 实施例4：琼脂平板活性测定
[0119] 离心法收集葡萄球菌属菌株在Brain Heart Infusion培养基中(Oxoid)37℃生长18小时的隔夜培养物，将细胞沉淀重悬浮于1x DPBS(Merck)，从而将原体积缩小100倍，80℃热灭活20分钟。超声波处理细胞并溶于包含氨苄青霉素和IPTG的LB顶级琼脂(0.7％琼脂(Bacto)；100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)；1mM IPTG(Roth))，并用于“裂解平板”的制备。这些平板可以用蛋白溶液或含有目标蛋白编码质粒的大肠杆菌溶液覆盖。如果裂解蛋白具有活性并至少部分以可溶和活性形式表达，则可在平板上看到溶菌圈。
[0120] 使用不同的凝固酶阳性(金黄色葡萄球菌)和凝固酶阴性(如表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，腐生葡萄球菌，模仿葡萄球菌)葡萄球菌菌株，以琼脂平板测定方法检测EADplypitti26_CBDplyUSA与野生型pitti26之间裂解活性的对比。该检测在用琼脂平板裂解测定方法中进行。将浓缩的热灭活(如80℃20分钟)葡萄球菌细胞固定在琼脂顶层中以获得浓厚的菌苔。将分离的内溶素溶液(5μl到10μl)或携带包含各种内溶素的质粒的大肠杆菌转化物点在琼脂顶层表面。将平板在30℃下培养几小时(1到12小时)，然后检查内溶素点周围的溶菌圈。通常，裂解圈半径增加与溶菌圈变透明的同时发生指示更有效率的细胞裂解。结果见表1。
[0121] 表1：EADplypitti26_CBDplyUSA和plypitti26裂解的宿主范围
[0122]PR0F0S培 来源 葡萄球菌种类 plypitti26 EADplypitti26_CBDpl
养物保藏号. yUSA
S462 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S460 临床分离株 金黄色葡萄球菌 ++ +++
S1516 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S459 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S457 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S456 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1519 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S463 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1551 DSMZ346 金黄色葡萄球菌 ++ +++
S1517 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S458 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1550 DSMZ20231 金黄色葡萄球菌 ++ ++
S467 临床分离株 金黄色葡萄球菌， + +++
MRSA
S469 临床分离株 金黄色葡萄球菌， +++ +++
MRSA
S468 临床分离株 金黄色葡萄球菌， +++ +++
MRSA
S1573 自行分离株，病 表皮葡萄球菌 - +++
人
S1508 临床分离株 表皮葡萄球菌 +++ +++
S1510 临床分离株 表皮葡萄球菌 +++ +++
S1546 DSMZ20044 表皮葡萄球菌 + +++
S27 自行分离株 溶血葡萄球菌 + +++
S1548 DSMZ20228 溶血葡萄球菌 + +++
S1509 临床分离株 溶血葡萄球菌 - +++
S1549 DSMZ20263 溶血葡萄球菌 + +++
S1429 自行分离株，食 腐生葡萄球菌 - +++
品
S1512 临床分离株 溶血葡萄球菌 ++ +++
养物保藏号. yUSA
S462 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S460 临床分离株 金黄色葡萄球菌 ++ +++
S1516 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S459 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S457 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S456 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1519 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S463 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1551 DSMZ346 金黄色葡萄球菌 ++ +++
S1517 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S458 临床分离株 金黄色葡萄球菌 +++ +++
S1550 DSMZ20231 金黄色葡萄球菌 ++ ++
S467 临床分离株 金黄色葡萄球菌， + +++
MRSA
S469 临床分离株 金黄色葡萄球菌， +++ +++
MRSA
S468 临床分离株 金黄色葡萄球菌， +++ +++
MRSA
S1573 自行分离株，病 表皮葡萄球菌 - +++
人
S1508 临床分离株 表皮葡萄球菌 +++ +++
S1510 临床分离株 表皮葡萄球菌 +++ +++
S1546 DSMZ20044 表皮葡萄球菌 + +++
S27 自行分离株 溶血葡萄球菌 + +++
S1548 DSMZ20228 溶血葡萄球菌 + +++
S1509 临床分离株 溶血葡萄球菌 - +++
S1549 DSMZ20263 溶血葡萄球菌 + +++
S1429 自行分离株，食 腐生葡萄球菌 - +++
品
S1512 临床分离株 溶血葡萄球菌 ++ +++
[0123]
[0124] 表1显示了EADplypitti26_CBDplyUSA与野生型内溶素Pitti26宿主范围的比较。以琼脂平板活性测定法检测针对不同的葡萄球菌菌株的裂解活性。按照图2的图例的描述定义强(+++)、中(++)、弱(+)和无(-)裂解。第一列显示根据PROFOS培养物保藏中心的菌株编号。第二列是各个菌株的来源。“临床分离株”是指分离自诊断为葡萄球菌感染的病人的菌株。DSMZ编号代表可自“Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen”(Braunschweig)定购的菌株，其余是本实验室自行分离的菌株。裂解测定证实EADplypitti26_CBDplyUSA的活性常常比野生型酶plypitti26的活性好，特别是对于凝固酶阴性的非金黄色葡萄球菌菌株。这也意味着EADplypitti26_CBDplyUSA与plypitti26相比具有更广泛的宿主。凝固酶阴性葡萄球菌(除金黄色葡萄球菌之外的种类)与体弱和免疫妥协的人的感染有关，引起戴有内置装置或其它植入物人群的生物被膜(biofilm)形成的问题，并与乳腺炎有关。腐生葡萄球菌尤其引起泌尿道感染的问题。
[0125] 实施例5：浊度测定以掌握裂解活性
[0126] 我们所使用的针对内溶素活性的第二个活性检验是浊度测定，其利用光度计“在线”地测量细菌细胞的裂解。600nm处的吸收度是培养细胞密度的量度标准，当细胞裂解时，其也会随样品变得明显澄清而降低。与上述琼脂平板测定法不同，该分析使用非热处理的细菌细胞，因此更严谨，也与医药上应用的真实情况更接近。噬菌体内溶素裂解细菌导致的光密度(OD)下降，以浊度测定测量之。目标细菌在Brain Heart Infusion(Oxoid)中长至OD600达到0.8左右(对数生长期)。收获细胞并悬浮于TBST缓冲液(20mM Tris/HCl pH7.5，60mM NaCl，0.1％吐温)+2mM CaCl2，使OD600为1。如图所示，加入小体积的内溶素浓溶液达到如图所述的最终蛋白浓度。监视30℃时光度计(Jasco)中1ml体积样品OD600的变化，直至形成稳定的基线。检验蛋白的添加未打断测量。
[0127] 针对金黄色葡萄球菌细胞测试不同浓度的分离的plypitti26和EADplypitti26_CBDplyUSA内溶素。在相同蛋白浓度下，EADplypitti26_CBDplyUSA通常比plypitti26表现更高的活性，再一次显示其具有比天然产生的内溶素更优秀的性质。至于测定中使用的较低蛋白浓度，EADplypitti26_CBDplyUSA在很短的时间(几分钟)内达到了完全裂解(表现为无残留吸收)。在蛋白浓度低至1μg、0.5μg、甚至0.2μg时同样进行了检测，同样，经过较长时间后也达到了完全裂解。获得的特异性活性以ΔOD600每mg蛋白和分钟定义，算得EADplypitti26_CBDplyUSA的特异性活性的值为大约50单位。将该特异性活性与代表本领域的水平的全长和截短的phi11内溶素(Donovan et al.，2006，FEMS Microbiol.Lett，265，133-139；)——其为0.8和1.5单位之间——EADplypitti26_CBDplyUSA是非常有效的葡萄球菌内溶素。甚至plypitti26都更显著地优于phi11内溶素。
[0128] 实施例6：人血清中的活性测定
[0129] 根据实施例5光度浊度测定进行血清中EADplypitti26_CBDplyUSA的活性的检测。将对数生长期金黄色葡萄球菌细胞重悬于血清中，随后用不同浓度EADplypitti26_CBDplyUSA进行裂解测定。该测定能够对人血清中金黄色葡萄球菌细胞的裂解进行直接测量。与在渗透压裂解最优化的(osmolytically optimized)裂解缓冲液中进行裂解相比，在血清中实现高效的裂解需要十倍左右量的蛋白。而且，血清中的裂解动力学比缓冲液中的慢。检测人血清中EADplypitti26_CBDplyUSA的活性。可以证实虽然EADplypitti26_CBDplyUSA与最优化的检测条件下相比需要稍微更高的蛋白浓度，并且裂解稍微缓慢，但在人血浆中存在的条件下仍然是有效的细胞溶素。
[0130] 实施例7：室温下长期孵育的稳定性
[0131] 在储存缓冲液(20mM Tris/HCl pH 7.5，10mM DTE，0.1mM ZnSO4)中25℃孵育最长达一周，检测EADplypitti26_CBDplyUSA与plypitti26相比的稳定性。以SDS-PAGE和浊度测定监控蛋白降解。EADplypitti26_CBDplyUSA在整个时间段内是稳定的，没有观察到改变，而plypitti26孵育时间超过9小时则明显降解，孵育120小时后观察不到全长蛋白，但可观察到对应于较小片段的蛋白条带的出现。
[0132] 在标准条件(参见实施例5)下以浊度测定记录经检测蛋白的残留活性。与SDS-PAGE获得的稳定性数据相一致的是，EADplypitti26_CBDplyUSA的活性降低显示较plypitti26为慢。EADplypitti26_CBDplyUSA长时间保留了全部活性，而plypitti26的活性在4小时后已显著降低。
[0133] 这一点与活性的降低相关，提示了在这些条件下只有全长内溶素具有酶活性。该实验证实，特别是EADplypitti26_CBDplyUSA在合理的时间内，即使在室温下也是稳定的。当蛋白保存于更低温度，例如在4℃冰箱中或在-20℃或-80℃低温冰箱中时，稳定性大大增加。
[0134] 实施例8：针对抗凝血酶和V8蛋白酶的蛋白酶稳定性
[0135] 用50μg凝血酶与终浓度1.1mg/ml的各个蛋白于25℃孵育过夜，进行蛋白酶稳定性测定。孵育缓冲液是20mM Tris/HCl pH 7.5、10mM DTE、0.1mM ZnSO4。第二天，以SDS-凝胶和浊度测定分析蛋白样品。检测过程中，只有少量的EADplypitti26_CBDplyUSA被降解，而在相同条件下plypitti26没有全长蛋白残留。这意味着，凝血酶孵育后EADplypitti26_CBDplyUSA仍然是高活性的，而plypitti26完全失去其活性。EADplypitti26_CBDplyUSA显示出凝血酶抗性，它这个性质使得它在创伤或静脉内应用中有用处。
[0136] 将内溶素(浓度0.2mg/ml)和V8蛋白酶(1μg/ml)在以下缓冲液：20mMTris/HCl、100mM NaCl、pH 8.0中于25℃孵育过夜，检测抗V8蛋白酶的蛋白酶稳定性。第二天，以SDS-凝胶和浊度测定分析蛋白样品。
[0137] 实施例9：人血液中的稳定性
[0138] 于37℃将EADplypitti26_CBDplyUSA在保存缓冲液(20mM Tris/HClpH 7.5，10mM DTE，0.1mM ZnSO4)或人EDTA-血液中预孵育标明的时间，然后以浊度测定(实施例5)测量活性。以标明的次数离心人血液样品沉淀血红细胞，加入上清的100μl蛋白溶液以启动浊度测定。孵育直至2小时，在缓冲液和血液中预孵育后测量的活性几乎相同。于37℃在血液中孵育4小时后，EADplypitti26_CBDplyUSA几乎完全被灭活，然而对照孵育却检测到80％残留的活性。
[0139] 实施例10：修饰型内溶素
[0140] 我 们 从 EADplypitti26_CBDplyUSA、EADplypitti26C_BDplypitti20、EADplypitti26_CBDALE1、和EADplypitti26_CBDLS的序列出发生产了一些修饰型嵌合内溶素。
[0141] N-末端截短
[0142] 构建了一些EADplypitti26_CBDplyUSA的N-末端截短形式，并以琼脂平板测定法检测其活性。两个分别截短4个和9个氨基酸的构建体在平板测定中显示出活性，然而，截短29个氨基酸的构建体不再显示活性。
[0143] 定点诱变
[0144] 为 了 进 一 步 稳 定 化 和 增 溶 plypitti26、EADplypitti26_CBDplyUSA、EADplypitti26_CBDplypitti20、EADplypitti26_CBDALE 1、和EADplypitti26_CBDLS，以特定引物在氨基酸序列内所选的位点上进行定点突变，形成单氨基酸取代，以琼脂平板活性测定法检测各个变体的活性。我们以常规的定点诱变方法将疏水氨基酸(F、W、Y、I、L)突变为弱疏水氨基酸R、D、E、N、K、Q、H、S、T、M、G、A。带电荷的氨基酸E和R优先被交换为不带电荷的氨基酸(Q或A取代E、A取代R)。C优先被交换为A或S。表2所列的取代保留了内溶素的活性或者增强了内溶素作为抗葡萄球菌感染的治疗、诊断和预防药剂的性质。
[0145] 表 2：plypitti26、EADplypitti26_CBDplyUSA、EADplypitti26_CBDplypitti20、EADplypitti26_CBDALE1、和EADplypitti26_CBDLS中发生单氨基酸突变而得到的、表现抗葡萄球菌的裂解活性的修饰型内溶素。需了解的是，如果单氨基酸突变出现在具有氨基酸插入的plypitti26变体中，例如在第2位插入A的变体，如优选的实施方案EADplypitti26_CBDLS-Add2_M、EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5、EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5或EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8之中时，其编号将改变。
[0146]
[0147]
[0148]
[0149] 实施例11：不同裂解蛋白在缓冲液中抗金黄色葡萄球菌细胞的裂解活性的对比[0150] 根据实施例5所述“浊度测定以掌握裂解活性”的方案进行测定。从裂解曲线的初始斜坡计算比活性(ΔA600/min mg)，此处吸光度的降低几乎是线性的。以浓度1μg/ml和10μg/ml的裂解蛋白进行测定。发现，蛋白浓度为10μg/ml时比活性通常较低，因为所测吸光度的降低(ΔA600/min)与蛋白浓度无线性关系。从测定中获得了以下缓冲液中裂解活性的顺序：EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5高于EADplypitti 26_CBDplyUSA-Add2_M8高于EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5高于EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5高于EADplypitti26_CBDplyUSA高于plypitti26高于溶葡萄球菌素。测定中，溶葡萄球菌素的表现最差，plypitti26第二差。然而令人惊讶地，plypitti26的EAD和溶葡萄球菌素的CBD的组合-EADplypitti26_CBDLS-Add2M5-表现第二好。变体EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5也反映出该现象，因为ALE1细胞溶素与溶葡萄球菌素非常相似。plypitti26的变体EADplypitti26_CBDplyUSA和EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5表现出比plypitti26更高的裂解活性。
[0151] 实施例12：不同裂解蛋白在人血清中抗金黄色葡萄球菌细胞的裂解活性的对比[0152] 根据实施例6所述“人血清中的活性测定”的方案进行测定。从裂解曲线的初始斜坡计算比活性(ΔA600/min mg)，此处吸光度的降低几乎是线性的。以浓度10μg/ml和25μg/ml的裂解蛋白进行检测。发现，蛋白浓度为25μg/ml时比活性有些低，因为所测吸光度的降低(ΔA600/min)与蛋白浓度不成线性关系。以下人血清中裂解活性的顺序是从裂解蛋白为10μg/ml的测定中获得的：EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5高于EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5 高 于 EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5 高 于 EADplypitti26_CBDplyUSA高于EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8。我们发现，不同的内溶素构建体在人血清中裂解效率，与在缓冲液中测量到的结果是不同的。内溶素plypitti26对人血清中的金黄色葡萄球菌细胞不表现出裂解活性，但似乎是被未知的因素抑制了。具有plyUSA的CBD的plypitti26修 饰型变 体，即EADplypitti26_CBDplyUSA 和EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5和EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8，在人血清中表现出高于plypitti26的特异性裂解活性。尽管溶葡萄球菌素在缓冲液中的裂解活性非常差，使用溶葡萄球菌素的CBD的构建体EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5却在人血清中显示了最好的特异裂解活性。在人血清中，使用ALE-1细胞溶素的CBD的构建体EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5显示了第三好的特异裂解活性。
[0153] 实施例13：热稳定性测定
[0154] 利用耐热稳定性测定，即用光度计测量波长360nm处的蛋白聚集，来检测葡萄球菌内溶素的热稳定性。在含有20mM Hepes、10mM CaCl2、50mM精氨酸，pH 7.5的缓冲液中溶解蛋白(浓度0.1mg/ml)。将装有缓冲蛋白溶液的比色杯放入光度计，以每分钟1℃的步伐加热。在室温和65℃左右之间测量360nm(A360)处的吸光度。没有蛋白变性时，A360信号仅显示了轻微的倾斜，但是从特定的温度，即聚集温度Taggr开始，吸收度曲线开始上升并表现峰状。该信号变化与聚集同时发生，并伴随着蛋白的失活。因此，所观察到的聚集温度Taggr是蛋白热稳定性的标尺。在表3中给出了不同的葡萄球菌内溶素变体Taggr的对比。
[0155] 表3：
[0156]蛋白 Taggr，℃
ply_pitti26 50
EADplypitti26_CBDplyUSA 55
EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M 55
EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M 55
EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5 56
EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5 51
ply_pitti26 50
EADplypitti26_CBDplyUSA 55
EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M 55
EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M 55
EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5 56
EADplypitti26_CBDALE1-Add2_M5 51
[0157] 结果发现Ply_pitti26是本实验所测得的稳定性最低的酶。ply_pitti26的CBD与plyUSA或溶葡萄球菌素的CBD的交换使其稳定性增加了5℃。EADplypitti26_CBDLS-Add2_M5是最稳定的内溶素，其Taggr是56℃，其次是EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M5、EADplypitti26_CBDplyUSA、和EADplypitti26_CBDplyUSA-Add2_M8各自的Taggr均是55℃。ply_pitti26的CBD与ALE-1细胞溶素的CBD的交换仅带来1℃的微弱稳定化。
[0158] 实施例14：plypitti26及其变体用作抗葡萄球菌感染的治疗、诊断和预防药剂的相关有利性质的表征
[0159] 针对衍生自plypitti26的不同嵌合内溶素，以及具有最多7个单氨基酸突变的修饰型蛋白，对比了它们与活性和稳定性相关的不同性质。根据实施例8所述的方案检测蛋白酶抗性，根据实施例5和6检测缓冲液和血清中的裂解活性，分别地，以琼脂平板测定法(实施例4)确定宿主范围，以实施例7所述的测定法确定长期孵育中的稳定性。在表4中以半定量的方式概括测定结果。
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