本发明属于病毒的分子生物学领域。更具体涉及一种抑制丙型肝炎病毒感 染人细胞的12肽ZA，还涉及抑制丙型肝炎病毒结合人肝细胞和DC-SIGN+的靶细胞 的多肽的制备方法，同时还涉及一条能靶向结合丙肝病毒包膜糖蛋白E2的小分 子12肽，即多肽ZA在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途， 该多肽同时还作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。

丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎）是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV) 引起的肝脏炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布,主要通过血液传播。据世界卫 生组织统计,全球HCV感染率约为3 % ，估计有l. 7亿人感染HCV ,每年新发丙型 肝炎病例约3. 5万。我国血清流行病学调査资料显示,一般人群抗HCV阳性率为 3. 2 % ，各地区感染率有一定差异。急性HCV感染者约80 %发展为慢性丙型肝炎 (CHC)，在20年间约20 %可发展为肝硬化,每年约有1%〜4%肝硬化患者发展为 肝癌。CHC已成为不可忽视的重要疾病，及早发现和治疗CHC患者已受到重视。 CHC治疗目的包括根除或长期抑制病毒复制，减轻肝内炎症和纤维化,最终阻止 进展为肝硬化、肝癌和肝功能衰竭,并提高患者的生活质量。
抗病毒是CHC治疗的关键，目前抗病毒治疗主要有干扰素（Interferon, IFN) 治疗，包括普通IFN-a、复合干扰素（CIFN)、聚乙二醇化干扰素a (PGE—IFNa)。 自20世纪卯年代应用IFN治疗CHC以来,其远期疗效从IO %〜15 %提高至50 %〜60%。其次，干扰素与利巴伟林联合治疗是当前CHC治疗的一大进展，利 巴韦林的抗病毒机制属于免疫调节作用，它通过对T细胞介导的细胞毒性作用， 调节免疫应答。利巴韦林单一治疗并没有抗HCV作用，IFNa与利巴韦林联合应 用却能使患者获得更好的恢复。此外，基因治疗是将一种新的遗传物质导入患者细胞内并能给患者带来治疗作用。HCV基因治疗需要导入的基因特异性的阻断 或抑制病毒基因的表达或病毒蛋白合成的功能，除了细胞内干扰外，基因治疗还 包括通过刺激特异性免疫应答使体内产生持续性表达的抑制性分泌蛋白,阻止细 胞外水平HCV的播散。
上述治疗方法虽然能使部分患者（30X〜40X)获得持续性病毒应答（SVR)， 但半数以上患者无法达到SVR，并且干扰素治疗容易引起一系列的副作用，如 对神经系统、血液系统的影响，PGE — IFNa与利巴伟林联合治疗的患者中有37 %的人会出现抑郁症状，约20%的患者出现粒细胞减少，血小板减少及贫血。 此外，利巴伟林还易引起患者干咳、皮肽骚痒、皮疹及视网膜疾病。
慢性丙型肝炎治疗会产生严重的不良反应，从而限制用药剂量，并造成患者 的个体差异性。因而研制新型的抗HCV药物迫在眉睫。随着对丙肝病毒生物学 行为基础研究的深入，如何抑制病毒感染和入侵人肝细胞成为科研工作者寻求的 更普遍，更有效控制和更治丙型肝炎的方法。

本发明的目的是在于提供一种丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA，该多 肽分子量小，易于合成，应用方便、特异性高、无免疫原性、无毒副作用，该多 肽能特异性与丙肝病毒E2包膜糖蛋白结合，并阻止丙肝病毒侵入靶细胞，可作 为治疗丙肝病毒感染的新型药物。
本发明另一个目的是在于提供了一种抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12 肽的制备方法，该方法简便，成本低廉，易于推广。
本发明的再一个目的是在于提供了一种多肽，即多肽ZA,在制备治疗或预 防丙型肝炎的药物中的应用。
本发明还有一个目的在于提供了一种多肽，即多肽ZA在检测丙型肝炎病毒 包膜抗原的试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
核糖体文库筛选技术是将编码随机肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录 产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以 共价键结合，形成mRNA—核糖体一蛋白质三聚体结构，此三聚体形式将蛋白
6和mRNA信息连接在一起，使基因型和表型得到统一。利用固相化抗原或受体 的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的 mRNA—核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA， 回收核糖体富集库中的mRNA,逆转录成cDNA, PCR扩增，其产物可作为下一 轮体外合成的模板，经过几轮筛选，能找到与抗体特异性结合的多肽。近年来， 应用核糖体展示技术已进行了许多研究，如筛选配体或受体，筛选抗体或确定抗 原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物。
一种抑制丙肝病毒与人肝细胞结合的多肽具体制备步骤如下：
一、制备E2-GST融合蛋白的歩骤如下：
A. 挑取含有表达E2-GST融合蛋白的质粒pGEX-KG-E2(见参考文献Li， et al.， Engineering of 7V國glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNA immunization, J^cc/«e. 2007. 25:1544-1551.)的大肠杆菌BL21DE3 (购自美国invi加gen公司）接种 于3 ml含有氨节青霉素（50 pg/ ml)的LB培养基中，对照组别接种含 有pGEX-KG (GST蛋白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公 司）的大肠杆菌BL21DE3, 37'C培养12~16小时。
B. 将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素（50pg/ml)的LB 液体培养基（LB液体培养基为：lOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯 化钠，溶解至1000ml双蒸水）中，37 。C培养到OD600为1〜2。
C. 加入100mM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，使其终浓度为0.1 mM, 3(TC诱导4〜5小时。
D. 将诱导以后的菌液分装到250 ml的离心管中，4。C，7700 g,5min离心， 弃上清。
E. 沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS (140mM氯化钠，2.7 mM氯化钾，10 mM 磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾）洗涤1次,4。C， 7700g，5min离心，
弃上清。
F. 将沉淀重悬于8 ml含1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF: 17.42 mg PMSF溶 于lml异丙醇中，-20 'C保存）的PBS中。
G. 将菌液放置冰中，超声碎菌，加入20。/。曲通X-100 (Triton X-100: 1mlTritonX-100溶于4 ml无菌双蒸水中），使其终浓度1%, 4°C,轻混30分 钟。
H. 每EP管中加入1 ml超声降解的菌液，4 °C, 12000 g, 10 min离心，取上清。
I. 4 °C, 12000 g,离心10min，再取上清。
J.各EP管加入20 pi琼脂糖凝胶4B (Sepharose 4B:购自Amersham
Biosciences公司），混匀，室温20〜25。C孵育30 min。 4°C， 5000 rpm，
5min，离心，弃上清。 K.每个EP管中各加入100 pi 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose
4B的悬浊液收集于一管，4'C,5000rpm, 5min，离心，弃上清，共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液（Glutathione Elution Buffer: 0.0154 g谷光苷肽溶解于0.25 ml pH 8.0的1M过滤除菌，分装， 4。C保存），室温20〜25。C轻轻混匀10 min， 4'C， 5000 rpm, 5 min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为E2-GST融合蛋白。 二、制备E2-GST融合蛋白抗体的步骤如下：
A. 将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1 mg/ ml，加入完全弗氏 佐剂（CFA)，注射至新西兰家兔（购自武汉大学医学院实验动物中心） 脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每点O. 1〜0.2ml，每只兔子抗原免 疫剂量为1 mg。
B. 两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂（IFA)为佐剂。 免疫位点及数量选择同基础免疫。
C. 共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。 末次免疫后第10天心脏釆血，室温静置凝固后，转入4"C冰箱静置过夜， 分离血清，血清即为E2-GST融合蛋白的抗体，置于-8(TC冰箱保存备用。
8三、制备随机DNA文库的步骤如下：
A. 寡核昔酸为3，-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)i2 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCT4G(F CCA-5'(90bp)(划线部分分别为 SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为Sflw/ZI酶切位点）（N代表 A, C, T或G， M代表A或C)
B. 第一轮PCR的上游引物Ul为5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG GA4 GG4 (?AT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(划线部分为5'端茎环和 斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTA GTA
G-5，(52 bp)(划线部分分别为^zwffl酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环)
C. 第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp)，（划线部分分别为/VI酶切 位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博 亚生物有限公司合成。随机DNA文库和引物由上海博亚生物有限公司 合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。
D. 以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为：
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5^1
dNTP mix(10mM) 1 fil
引物Ul (20|aM) 1 pi
引物Dl (20|uM) 1 [il
寡核苷酸（0.05|ag^l) 1 pi
双蒸水 40|al
Tag DNA聚合酶 1 (al
总体积 50|al
反应程序：
a. 95°C， 2分钟
b. 95°C, 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
E. PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶（0.4g琼脂糖粉末溶解于20mllXTAE溶
9液）电泳，然后用回收试剂盒（QIAEX II gel Extraction Kit,美国promega
公司）回收。
F. 经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应 体系为：
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 |al
dNTPmix(10mM) 1 jal
引物Ul (20 nM) 1 |al
引物Dl (20 pM) 1 |al
第一轮PCR产物 4(il 双蒸水 37nl Tag DNA聚合酶 1 pi
总体积 50pl 反应程序：
a. 95°C， 2分钟
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
G. 步骤F所得得PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回 收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA文库。
四、制备核糖体文库的步骤如下：
A.核糖体文库构建及筛选流程（见参考文献Wu, et al., 26(11): 2057-2063.)如图2所示：将编码IO"个随机12肽的DNA库在体外进行偶 联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放， 从而形成一个稳定的mRNA-核糖体-新生多肽复合体结构。利用连接有 S印harose 4B (sigma公司）的E2-GST融合蛋白（E2-GST-Sepharose 4B) 亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体一多 肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体 富集库中的mRNA，逆转录成cDNA. PCR扩增，其产物可作为下一轮体外 合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2蛋白特异性结合的多肽。
10B.反应体系:
DNA模板(0. 3 mg/ml)
10 pi
S30 Premix without Amino Acids
20 pi
氨基酸混合液（无甲硫氨酸)
2.5 pi
氨基酸混合液（无亮氨酸)
2.5 (il
E. coli S30 Extract
15 pi
总体积
50 pi
轻轻混匀EP管中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP 管底部。
C. 3(TC孵育2. 5小时。
D. EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库。
五、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下：
A. 在100 |al体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase (Promega公司，美国)，10 X DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6 pl， 37。C温育30min。然后加6 中止缓冲液，65°C， 10 min灭活DNase。
B. 取60 (^1 E2-GST-Sepharose 4B, 4 °C ， 5000 rpm， 5min离心，弃上清。
C. 沉淀用500 pi洗脱缓冲液：（washing buffer : 50 mM pH 7.5的Tris-醋 酸，150 mM氯化钠NaCl, 0.1 %Tween-20, 50 mM醋酸镁）洗涤3次。
D. 将100 pi体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B 中，4'C摇动1小时。
E. 4 °C， 5000 rpm， 5min离心，弃上清，沉淀用washing buffer洗涤3次。
F. 沉淀中加入100 |al elution buffer, 4'C摇动10 min使mRNA与核糖体解 离，4°C， 5000 rpm， 5min离心，取上清。
G. 用RNaidKit (购自bio101公司，美国）回收mRNA，具体方法如下：
a. 上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt (RNaid Kit成份）混匀。
b. 再加入10 ^ RNA MATRIX (RNaid Kit成份），室温放置5 min。
c. 13000 rpm， lmin离心，弃上清。
d. 用RNA wash (RNaid Kit成份)洗涤2次，（RNA wash:乙醇=1:1)。e. 加入lOp无RNase的1120， 45〜55。C温育5 min。
f. 13000 rpm， 2 min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。 H. RT-PCR，其反应体系为
AMV/Tfl 5 X Reaction buffer 10 pi
dNTP mix混合物 1 |al
引物U 1(20 mM) 1 pi
引物D 1(20 mM) 1 pi
MgS04(25 mM) 2 pi
AMV Reverse Transcription 1 jal
Tfl DNA Polymerase 1 (Xl
RNA模板 1 pi
无酶水 29 ^
总体积 50 (al
反应程序为：48°C， 45分钟；94'C， 2分钟；94°C， 30秒；63°C, l分
钟，72°C， 2分钟；共31个循环；72°C， 7分钟 I. 2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。 J.回收分子量大小为155 bp的RTPCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181 bp 的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19 (购自美国invitrogen公 司）上，具体步骤为：
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
10XY+Buffer 2 pi
6薩HI 1 )al
M 1 |al
ddH20 17 pi
总体积 20 pi 37'C水浴2小时
M.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668 kb
12的pUC 19目的片断，然后用回收试剂盒（QIAEX II gel Extraction Kit,美 国promega公司）回收。
a.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：
DNA 4 (al
pUC 19 2 |al
10 X Buffer 2 (il
T4连接酶 2 pi
双蒸水 10 |al
总体积 20 pi 16'C孵育20小时
b. 将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5 a 。取连接产物 10^1，加入100plDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C 90秒，再冰 浴5分钟，加入80(^1 LB液体培养基（LB液体培养基为：10g胰蛋白 胨，5g酵母提取物，10 g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水），37°C， 225 rpm振摇40〜50分钟。取200(^1菌液均匀涂在有氨节青霉素（Amp。抗 性的LB固体培养基（LB固体培养基为：lOg胰蛋白胨，5g酵母提取 物，10 g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000 ml双蒸水）上（氨苄青霉素 浓度为50 lVml)， 37'C培养过夜。
c. 挑取单个克隆菌落，置于3 ml LB液体培养基(含氨苄青霉50 Pg/ml) 培养过夜。
d. 提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
e. PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：
10 X Taq DNA polymerase buffer 5 |al
dNTP mix混合物(IO mM) 1 pi
引物U2(20pM) 1 pi
引物D 1(20 |_iM) 1 nl
质粒DNA 1 pi
双蒸水 40 pi
Taq DNA Polymerase 1 pi
13总体积 50 pi
反应程序为：95°C， 2分钟；95°C， 30秒；62°C， 1分钟，72°C， l分 钟24秒；共25个循环；72°C， 5分钟
f.将步骤g所得产物经5amM和i^rt鉴定，正确的克隆送至上海华诺 公司测序。
根据测序结果，请西安美联公司合成的，得到了一种分离的多肽，其氨基酸
序列为：
ZA (SEQIDNO:l): GFGRYRRHGSPW
六、表面等离子共振技术（SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的步骤如下：
A. 让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。
B. 注射40nl氨基偶联试剂（含0. 02M的EDC禾卩0. 05 M的NHS)，活化CM5 传感片上的羧基。
C. 用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5mg/ml，注射该溶液40 pl。
D. 上机检测，流速为20 nl/min。
E. 将多肽ZA、 ZC(对照多肽）稀释为不同浓度，以2 pl/min上机与CM5传 感片上的E2蛋白作用7分钟。
F. 以2 |al/min的流速注射10 pl的HC1再生液使基线恢复，实时采集响 应信号。
G. 用测试仪器Biocore(美国)上的专用软件进行数据分析。分析结果见图3， 显示多肽与E2蛋白的亲和力是ZA> > ZC。
七、流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下：
A.培养人肝癌细胞Huh7. 5(见参考文献Zhong, et al., Robust hepatitis C virus infection in vitro, 2005, PNAS， 102: 9294-9299)和DC-SIGN+-NIH3T3 (表面 有DC-SIGN分子的小鼠的成纤维细胞）细胞（见参考文献Wu， et al., Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGN interactions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency vimstype I transmission. J. virol. 2002, 76: 5905-5914)。培养条件均为10%胎 牛血清的DMEM培养基（Gibco公司购买），培养于37。C，含5%二氧 化碳的培养箱中。
B. 将多肽PE2A、 PE2B、 PE2C、 PE2D分别与E2-GST蛋白混合（对照管加入 GST蛋白），总体积为50 (il，其中多肽的浓度均为500 iaM， E2-GST蛋 白和GST蛋白的浓度均为20 pg/ml， 37。C孵育30分钟。
C. 将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和 DC-SIGN+-NIH3T3细胞混合，总体积为100 (il，其中细胞个数为2X106 个。37。C孵育30分钟。
D. 每管加入1 mlPBS洗涤，1000 rpm， 5 min，弃上清，用80 (il重悬细胞。
E. 加入20 pi 1: 500的E2-GST抗体，37'C孵育30分钟。
F. 重复D步骤一次。
G. 加入1 pl PE标记的羊抗兔的二抗，37。C孵育30分钟。
H. 每管加入1 ml PBS洗涤，1000 rpm， 5 min，弃上清，用500 pl重悬细胞。
I. 上机检测，结果见图4，图5，显示多肽ZA(SEQ ID NO:l)能显著抑制 E2蛋白与Huh7.5及DC-SIGN+-NIH3T3细胞结合，而多肽ZC(另一对 照12肽)的抑制作用较弱。
本发明的优点
本实验首次应用核糖体文库筛选了与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽。筛选 到的多肽ZA抑制与丙肝病毒E2糖蛋白蛋白具有高亲和力，且能抑制E2蛋白侵袭 人体肝脏细胞Huh7.5和DC细胞。该多肽ZA作为两种特异性抗病毒多肽，可与抗 丙肝病毒药物协同作用，以抑制病毒对人体细胞特异性感染，竞争性抑制病毒 HCVE2与病毒的细胞受体CD81的结合。该多肽的筛选，为预防和治疗丙肝病毒 感染以及阐明丙肝病毒与宿主细胞相互作用的机制奠定了基础。本发明所提供的 针对丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽弥补了以上提及的干扰素及其它药物治 疗丙型肝炎的不足，并且显示出了明显的抑制病毒入侵作用。其最大的优点是可 以高效、特异、快速的抑制丙肝病毒结合到肝细胞上，并且分子量小、安全性高、 毒副作用小、和免疫原性低等。
15附图说明 图l.随机DNA文库的构建流程图。
RBS表示核糖体结合位点，N代表A, C, T或G， M代表A或C
图2.核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的构建流程图。
图3. SPR检测多肽ZA、多肽ZC与E2蛋白的亲和力，它们结合的亲合力大小
是：多肽ZA))多肽ZC。
图4.流式细胞仪检测多肽ZA、多肽ZC分别抑制E2蛋白结合人肝癌细胞
Huh7. 5的能力；A—多肽ZA能显著抑制E2蛋白结合人肝细胞Huh7. 5，而多肽C的抑
制作用较弱，B —多肽ZA抑制E2蛋白与人肝细胞Huh7.5细胞的结合，且呈剂量依
赖关系。
图5.流式细胞仪检测多肽ZA抑制E2蛋白结合DC-SIGN+-NIH3T3细胞的能力； 八一多肽2八显著抑制£2蛋白结合人细胞00516^-1«}«13， B —多肽ZA抑制E2蛋白 与DC-SIGN靶细胞结合，多肽2八抑制£2蛋白结合0(]-310„]^373的能力的一定剂 量依赖性。
图6.流式细胞仪检测E2-GST蛋白显著大于对照GST蛋白与人靶细胞（如人肝 细胞Huh7. 5，或DOSIGN+NIH3T3细胞）的结合能力。

实施例1
一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下：
A. 挑取含有pGEX-KG-E2的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司） 培养于3 ml含有氨苄青霉素（50 g/ ml)的LB培养基中，对照组别接 种含有pGEX-KG (GST蛋白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公司），37°。培养12〜16小时。
B. 将小试管中的菌液分别转移到200 ml含有氨苄青霉素（50 g/ ml)的 LB液体培养基（LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物， 10 g氯化钠，溶解至1000 ml双蒸水）中，37 r培养到OD600为1〜2。
C. 加入100 mM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，使其终浓度为0.1 mM, 30'C诱导4〜5小时。
D. 将诱导以后的菌液分装到250 ml的离心管中，4t:,7700g,5min离心，
16弃上清。
E. 沉淀用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷 酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾）洗涤1次,4'C， 7700g,5min离心，弃上清。
F. 将沉淀重悬于8 ml含1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF: 17.42 mg PMSF溶 于lml异丙醇中，-20 'C保存）的PBS中。
G. 将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20。/。曲通X-100 (20%TritonX-100:
1 ml TritonX-lOO溶于4 ml无菌双蒸水中），使其终浓度1%， 4°C,轻混 30分钟。
H. 每EP管中加入1 ml超声降解的菌液，4 °C, 12000 g, 10 min离心，取上清。
I. 上清再次离心，4 °C, 12000 g, 10 min，再取上清。
J.各EP管加入20 nl琼脂糖凝胶4B (Sepharose 4B:购自Amersham
Biosciences公司），室温(20陽25。C,以下相同）轻混30 min。 4'C， 5000
rpm， 5min，离心，弃上清。 K.每个EP管各加入100 pi 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B
的悬浊液收集于一管，4°C, 5000 rpm, 5 min，离心，弃上清，共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的Glutathione Elution Buffer (0.0154 g谷光 苷肽溶解于0.25 ml pH 8.0的1M PBS过滤除菌，分装，4'C保存），室 温轻混10 min， 4。C, 5000 rpm, 5 min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为所需E2-GST融合蛋白。
二、制备E2重组蛋白抗体的步骤如下：
A. 将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1 mg/ ml，加入完全弗氏 佐剂（CFA)，注射至新西兰家兔脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结， 每点0. 1〜0.2ml，每只兔子抗原免疫剂量为1 mg。
B. 两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂（IFA)为佐剂。 免疫位点及数量选择同基础免疫。C.共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。 末次免疫后第IO天心脏采血，室温静置凝固后，转入4'C冰箱静置过夜， 分离血清，血清即E2-GST融合蛋白抗体，置于-8(TC冰箱保存备用。
三、制备随机DNA文库的步骤如下(见图1):
A. 寡核昔酸为3'-CCT CTATATAGGTAC CGA TCG (NNM)12 AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCT/4GG CCA-5'(90bp)(划线部分分别为 SD序列、启始密码子、HisTag、斜体部分为S"附/ZI酶切位点）（N代表 A, C， T或G, M代表A或C)
B. 第一轮PCR的上游引物Ul为5'-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACA ACG GA4 GAT ATA TCC ATG -3' (43 bp)(划线部分为5'端茎环和 斜体部分为核糖体结合位点:RBS)，下游引物Dl为3'-GTA GTA ££I
Q-5'(52 bp)(划线部分分别为5flwHI酶切位点、Gly-Ser序列和3，端茎环)
C. 第二轮PCR的上游引物U2为5'-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3' (42 bp),(划线部分分别为户M酶切 位点和Tac启动子)。下游引物为Dl。随机DNA文库的构建示意图见图
D. 以寡核普酸为模板，用引物Ul和Dl进行第一轮PCR,反应体系为：
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5 jil
dNTPmix(10mM) 1 pi
引物Ul (20 pM) 1 jal
引物Dl (20 jaM) 1 (il 寡核苷酸（0.05吗小1)
双蒸水 40nl
Tag DNA聚合酶 1 jal
总体积 50nl
反应程序：
a. 95°C， 2分钟
18b. 95°C， 36秒；63°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
E. PCR产物经2%的琼脂糖凝胶（0.4 g琼脂糖粉末溶解于20 mil X TAE溶 液）电泳，然后用回收试剂盒（QIAEX II gel Extraction Kit,美国promega
公司）回收。
F. 经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应 体系为：
10 X Tag DNA Polymerase buffer (含Mg2+) 5^1
dNTP mix(10mV0 1 pi
引物Ul (20 pM) 1 pi
引物Dl (20 pM) 1 pi
第一轮PCR产物 —I
双蒸水 37pl
Tag DNA聚合酶 1 pi
总体积 50pl
反应程序：
a. 95°C， 2分钟
b. 95°C， 36秒；62°C， 36秒；72°C， 84秒；共25个循环。
c. 72°C， 5分钟
G.步骤F所得得PCR产物经2。/。的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回 收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA模板。
四、制备核糖体展示文库的步骤如下：
A.核糖体文库制备及筛选（见参考文献Wu, et al., Pep/zWM 26(11): 2057-2063.),构建及筛选流程如图2所示：将编码IO"个随机12肽的DNA 库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能 从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定 的复合体结构。利用连接有S印harose 4B的E2-GST蛋白（E2-GST— S印harose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA
19一核糖体一多肽复合物，通过降低Mg^浓度，核糖体解离，释放mRNA， 回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA. PCR扩增，其产物可作为 下一轮体外合成的模板，经连接有S印harose 4B的GST蛋白（GST — S印harose 4B)反筛以去除非特异性结合的多肽，E2-GST — S印harose 4B 正筛，经过六轮筛选，筛选到与E2蛋白特异性结合的多肽。
B.反应体系：
DNA模板（0. 3 mg/ml) 10 pl
S30 Premix without Amino Acids 20 jjl
氨基酸混合液（无甲硫氨酸） 2.5 pi
氨基酸混合液（无亮氨酸） 2.5 pi
E.coli S30 Extract 15 pi
总体积 50 pi
轻轻混匀步骤B中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP 管底部。
C. 3(TC孵育2. 5小时。
D. EP管冰上放置5分钟中止反应。即得到核糖体展示文库。
五、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下（见 图2):
A. 在100 体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase (Promega公司，美国)，10XDNase I缓冲液(Promega公司，美国)6pl， 37 。C温育30min。然后加6 |al中止缓冲液，65°C， 10 min灭活DNase。
B. 取60 |il E2-GST-Sepharose 4B， 4 °C ， 5000 rpm， 5 min离心，弃上清。
C. 沉淀用500 pi washing buffer (50 mM pH 7.5的Tris-醋酸，150 mM NaCl， 0.1 %Tween-20, 50 mM醋酸镁）洗涤3次。
D. 将100 |il体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中， 4'C摇动1小时。
E. 4 °C， 5000 rpm， 5min离心，弃上清，沉淀用洗脱缓冲液洗涤3次。
F. 沉淀中加入100 pi elution buffer, 4'C摇动10 min使mRNA与核糖体解离，4°C， 5000rpm, 5 min离心，取上清。 G.用RNaidKit (购自biol01公司，美国）回收mRNA，具体方法如下：
g. 上清中加入3倍体积的RNABinding Salt (RNaid Kit成份）混匀。
h. 再加入10 W RNAMATRIX (RNaid Kit成份），室温放置5 min。
i. 13000 rpm， lmin离心，弃上清。
j.用RNA wash (RNaid Kit成份）洗涤2次，（RNA wash:乙醇=1:1)。
k.加入10 )al无RNase的H20， 55。C温育5 min。
1. 13000 rpm， 2 min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。
H. RT-PCR，其反应体系为
AMV/Tfl 5 X Reaction buffer 10 pi
dNTPmix混合物 1 pi
引物U 1(20 )_iM) 1 pi
引物D 1(20 pM) 1 |il
硫酸镁(25mM) 2 pi
AMY Reverse Transcription 1 (xl Tfl DNA聚合酶 1 ^
RNA模板 1
无酶水 29 |al
总体积 50 pi
反应程序为：48°C， 45分钟；94°C， 2分钟；94°C， 30秒；63°C， l分
钟，72°C， 2分钟；共31个循环；72°C， 7分钟 I. 2%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。 J.回收分子量大小为155bp的RTPCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181 bp 的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19 (购自美国invitrogen公 司）上，具体歩骤为：
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
10XY+Buffer 2 pi
21尸Wl 1 |Lll
ddH20 17 (il
总体积 20 pi 37。C水浴2小时
b. 分别回收分子量大小为128 bp的DNA片段以及分子量大小为2.668 kb的pUC 19目的片断(回收方法同上)。
c. 用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：
DNA 4 pi
pUC 19 2 pi
10 X Buffer 2 pi
T4连接酶 2 pi
双蒸水 10 W
总体积 20 pi 16'C孵育20小时
d. 将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5 a 。取连接产物 lOpl，加入100plDH5a感受肽细胞，冰浴30分钟，42°C 90秒， 再冰浴5分钟，加入800^1 LB液体培养基（LB液体培养基为：10 g 胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至lOOOml双蒸水）， 37°C， 225 rpm振摇40〜50分钟。取200|xl菌液均匀涂在有氨苄青 霉素（Am-)抗性的LB固体培养基（LB固体培养基为：lOg胰蛋 白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至lOOOml双 蒸水）上（氨苄青霉素浓度为50 Pg/nil), 37t:培养过夜。
e. 挑取单个克隆菌落，置于3 ml LB液体培养基(含氨苄青霉50 Pg/ml) 培养过夜。
f. 提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
g. PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：
10 XTaq DNA polymerase buffer 5 pi
dNTPmix混合物(10mM) 1 (il
22引物U2(20mM) 1 (al
引物D 1(20 mM) 1 1^1
质粒DNA 1 pl
双蒸水 40 pl
Taq DNA Polymerase 1 (il
总体积 50 (il
反应程序为：95°C， 2分钟；95°C， 30秒；62°C， 1分钟，72°C， l分 钟24秒；共25个循环；72°C， 5分钟
h.将步骤g所得产物经5tra//1和i^I鉴定，正确的克隆送至上海华诺 公司测序。
M.根据测序结果，请西安美联公司合成12肽，见表l。 表l筛选出的与E2蛋白结合的多肽序列
分离的肽 氨基酸序列
ZA GFGRYRRHGSPW SEQ ID NO:1
zc(对照） LSVLV工SMEWW
实施例2
表面等离子共振技术（SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的歩骤如下：
A. 让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。
B. 注射40 )al氨基偶联试剂（含0.02 M的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亚胺（EDC)和0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS))，活化CM5传
感片上的羧基。
C. 用pH值为5. 0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5 mg/ml,注射该溶液40 pl。
D. 上机检测，流速为20 nl/min。
E. 将多肽AA、 ZC稀释为不同浓度，以2pl/min上机与CM5传感片上的E2 蛋白作用7分钟。
F. 以2 pl/min的流速注射10 pi的HCl再生液使基线恢复，实时釆集响 应信号。G.用该仪器Biocore(美国)的专用软件进行数据分析，我们发现分析ZA与 E2蛋白的亲和力最高，结果见图3，其亲和力有关参数见表2。
表2多肽与E2蛋白相互结合作用的动力学数据
多 table see original document page 24
实施例3
流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下：
A. 培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong, et al.， Robust hepatitis C virus infection in vitro, 2005, PNAS, 102: 9294-9299)和DC-Sign-NIH3T3 (表面 有DC-Sign分子的小鼠的成纤维细胞）细胞（见参考文献Wu, et al., Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGN interactions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virus type I transmission. J. virol. 2002, 76: 5905-5914)。培养条件均为10%胎牛 血清的DMEM培养基（Gibco公司购买），培养于37°C，含5%二氧化 碳的培养箱中。
B. 将多肽ZA、 ZC分别与E2-GST蛋白混合（对照管加入GST蛋白），总体积 为50pl，其中多肽的浓度均为500 pM， E2-GST蛋白和GST蛋白的浓度 均为20 |ag/ml, 37。C孵育30分钟。
C. 将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN+ -皿113丁3细胞混合，总体积为100 pl，其中细胞个数为2乂106个。37°C 孵育30分钟。
D. 每管加入1 ml PBS洗涤，1000 rpm， 5 min，弃上清，用80 pi重悬细胞。
E. 加入20pll: 500的E2-GST抗体，37。C孵育30分钟。
F. 重复D步骤一次。
G. 加入1 pi PE标记的羊抗兔的二抗，37'C孵育30分钟。
H. 每管加入1 ml PBS洗涤，1000 rpm， 5 min，弃上清，用500 pi重悬细胞。
I. 经上机检测，申请人发现ZA能显著抑制E2蛋白结合到Huh7.5细胞(图4)及00810>^+->^1313细胞（图5),且成剂量依赖关系，多肽剂量愈大， 其与E2的亲合力愈强，抑制HCVE2侵袭靶细胞能力愈强(图4B和图5B)。 而E2-GST结合人Huh7.5细胞及00810#^1113丁3细胞的能力显著大于 对照蛋白GST与人Huh7.5细胞及DC-SIGN+-NIH3T3细胞没有结合能力
(图6)。
实施例4
多肽的细胞毒性实验，即分离得到的多肽对人源性细胞系的毒性作用。 利用MTT法检测多肽对人Molt4细胞的毒性，
A. 培养人MoIt4细胞（见参考文献Minowada J , et al. Rosette-forming human lymphoid cell lines, Establishment and evidence for origin of thymus-derived lymphocytes. J. Natl. Cancer Inst. 49: 891-895, 1972.)于96孔板，每孔5X 106
个细胞。
B. 分别加入不同浓度的PE2A、 PE2B、 PE2D于Molt4细胞，每个浓度做6个 复孔。
C. 37'C培养细胞72小时，在培养结束前4小时加入20ml5mg/ml的MTT。
D. 2000转/分钟离心细胞IO分钟，弃上清。
E. 每孔加入100ml 二甲亚砜（DMSO)室温（20〜26°C)孵育10分钟。
F. 酶标仪测量各孔细胞的OD580值。
结果显示，ZA, ZC的半数致死剂量（IC50)均大于200iaM,表明它们的毒性很 小，具备用于临床实验的基本要求。SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途<130>抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途
<160> 1
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 12
<212> PRT<213>人工合成
<400〉 1
Gly Phe Gly Arg Tyr Arg Arg His Gly Ser Pro Trp1 5 10

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