技术领域
[0001] 本
发明涉及一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，属于细胞
生物学技术领域。
背景技术
[0002] 肥胖是一种较为常见的脂肪组织代谢紊乱性
疾病，并由此可引发
高血压、心脏病、糖尿病以及癌症等（Galic S, et al., 2010; Ailhaud G, et al., 1992）。系统、深入研究脂肪组织代谢规律与调控机制对于肥胖的
治疗和
预防具有重要意义。
[0003] 目前用于研究脂肪组织代谢与调控规律的细胞主要包括由原代培养获得的前体脂肪细胞和商品化的用于产生脂肪细胞的细胞系。通常，由原代培养获得的前体脂肪细胞与研究对象具有相同或相似的遗传特征，是研究脂肪细胞基因表达调控最佳的细胞类型，但目前，原代前体脂肪细胞在培养方法和鉴定上仍不太成熟。用于产生脂肪细胞的商品化细胞系主要是基于小鼠胚胎成纤维细胞建立的细胞系，包括3T3-L1、3T3-F442A、NIH-3T3和C3H10T1/2，其中，3T3-L1和3T3-F442A是研究脂肪细胞最为常用的前体脂肪细胞系，需要在特定条件下诱导才能转变为脂肪细胞，NIH-3T3和C3H10T1/2细胞系与前二者不同，它们为非定向前体脂肪细胞系，二者分化为脂肪细胞前一般需进行转基因操作、过表达某些基因才能转变为脂肪细胞，尤其是过表达C/EBPα和PPARγ基因。此外，由于小鼠和人的进化距离较远，小鼠和人的脂肪细胞在代谢规律上也不完全一致，利用小鼠的细胞系来研究人，其代表性也较差。因此，在人的肥胖研究方面，建立一种切实可行的、用于产生脂肪细胞的新方法显得极为重要。
[0004] 目前，已证实胚胎干细胞、间充质干细胞等类型的干细胞在一定条件下能够分化为脂肪细胞（Danic C, et al., 1997; Tang Q, et al., 2004）。但由于胚胎干细胞的使用存在严重的伦理问题，因此，在人上将胚胎干细胞诱导分化为脂肪细胞存在极大限制；间充质干细胞是一种来源于骨髓、
牙髓、脂肪、脐带等组织的干细胞类型，这类干细胞在一定条件下能够分化为脂肪细胞，但存在的问题是干细胞数量限制和分化效率较低。
[0005] 谱系重编程（Lineage reprogramming）技术的发明为脂肪细胞的来源提供了新的途径。谱系重编程技术是指不经过多能干细胞阶段，直接将已经分化的成熟细胞转换为另一种成熟细胞的方法。目前，国内
外科学家已利用谱系重编程技术将
体细胞转分化为神经细胞、心肌细胞、内皮细胞和
肝细胞等（Wada R, et al.,2013; Huang P, et al.,2011; Sheng C, et al., 2012）。但目前，仍未见利用此方法将成体细胞转分化为脂肪细胞的方法和研究。即便如此，谱系重编程技术大多依赖于转基因的方法使细胞发生转化，其安全性较差。基于全化学物质诱导的转分化技术目前诱导效率较低（Cheng L, et al., 2014; Park G, et al., 2015），且化学分子对细胞潜在的损伤也难以鉴定。
[0006] 基于以上分析，脂肪细胞的来源仍存在许多问题，亟待寻找一种诱导方法相对简单、安全性相对较好的脂肪细胞诱导方法。基于此，本发明尝试发明了一种利用鱼卵母细胞提取物作为诱导剂，将成纤维细胞先进行重编程操作，进一步利用脂肪细胞诱导分化培养基和维持培养基对重编程细胞进行交替诱导，获得脂肪细胞样细胞的方法（鉴于学术严谨性，诱导的脂肪细胞和正常脂肪细胞在表观遗传模式方面可能不完全相同，因此，本发明
专利将诱导后油红O
染色阳性的细胞称为脂肪细胞样细胞）。本发明方法所有步骤均不涉及转基因操作，产生的脂肪细胞样细胞安全性好，实验操作相对简单，实验的重复性也较好。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提出一种实验操作相对简单、实验重复性相对较好、产生的脂肪细胞样细胞安全性相对较好的脂肪细胞样细胞诱导方法。
[0008] 本发明所提供的诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，包括以下步骤。
[0009] （1）成纤维细胞的制备：包括成纤维细胞的分离、鉴定和培养。
[0010] （2）诱导剂的制备：诱导成纤维细胞重编程的诱导剂为鱼卵母细胞提取物。
[0011] （3）成纤维细胞的诱导：利用所述步骤（2）中制备的鱼卵母细胞提取物对所述步骤（1）中制备的成纤维细胞进行诱导，通过诱导，使成纤维细胞重编程为具有多向分化潜能的诱导多能干细胞。
[0012] （4）诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化：将所述步骤（3）中获得的诱导多能干细胞在脂肪细胞诱导培养基和维持培养基中进行交替诱导。
[0013] （5）脂肪细胞样细胞的鉴定：通过油红O染色的方法对所述步骤（4）中获得的诱导细胞进行鉴定。
[0014] 所述步骤（1）中成纤维细胞为来源于动物的
皮肤成纤维细胞。
[0015] 所述步骤（2）中诱导剂为鱼卵母细胞提取物，所使用的鱼为昆明产当地鲫鱼，优选卵黄充满时相时期的鲫鱼。
[0016] 所述步骤（3）中使用的鱼卵母细胞提取物终浓度为10 20μg/ml，成纤维细胞的诱~导时间为72小时。
[0017] 所述步骤（4）中使用的脂肪细胞分化诱导培养基组份包括
基础培养基、10%胎
牛血清、100U/ml
氨苄青霉素、100mg/ml
链霉素、10mg/L胰岛素、0.1mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1.0μmol/L地塞米松、0.1mmol/L吲哚美辛；维持培养基组份包括基础培养基、10%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100mg/ml链霉素、10mg/L胰岛素。
[0018] 所述步骤（5）中判断诱导多能干细胞是否分化为脂肪细胞样细胞，即检测诱导多能干细胞经过定向培养后是否有脂肪细胞特异性脂滴生成，检测方法为油红O染色。油红O储存染液配置方法为：将0.7g油红O溶于200ml的异丙醇中，充分溶解后用0.22μm
过滤器进行过滤，4℃条件避光储存备用。当进行油红O染色时，需要将油红O储存液配置成油红O工作液，油红O工作染液配置方法为：将油红O储存液与超纯
水以3:2比例充分混合，0.22μm过滤器过滤后使用。
[0019] 本发明的实质性特点和显著进步在于，本发明提供了一种非转基因操作的、可获得安全性相对较好的脂肪细胞样细胞的方法，在人或其它非啮齿类动物脂肪组织代谢及调控等研究方面不再局限于使用基于小鼠的前体脂肪细胞系。本发明方法的另一显著特点在于本发明的方法实验操作相对简单，实验设备和技术要求不高，在脂肪组织代谢等研究领域具有广阔应用前景。
附图说明
[0020] 图1是培养的人成纤维细胞。
[0021] 图2是重编程细胞Sox2、Nanog、Oct4/3表达免疫组化图。A为Sox2基因，B为Nanog，C为Oct4/3，D为对照组成纤维细胞。
[0022] 图3是诱导的脂肪细胞样细胞油红O染色图。
[0023] 图4是对照细胞油红O染色图。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和
实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例仅为了便于更好理解本发明而不局限于本发明范围。
[0025] 实施例1。
[0026] 诱导剂的制备。
[0027] 本实施例诱导剂为鱼卵母细胞提取物，实验用鱼为鲫鱼，优选卵黄充满时相时期的鲫鱼，其制备方法为：（1）将用于鱼卵母细胞提取物制备的鲫鱼完全浸没于75％的酒精中浸泡15～20分钟；（2）在通
风橱中以无菌的条件下取出鱼卵，然后置入预冷的研钵中，将研钵置于
冰上进行充分
研磨；（3）研磨完成后，加入预冷的生理盐水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清；（4）使用0.22微米孔滤器进行过滤，利用考
马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白含量；（5）根据测得的蛋白浓度用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/ml，4℃保存备用。
[0028] 实施例2。
[0029] 人皮肤成纤维细胞的制备。
[0030] 本实施例成纤维细胞来源于年龄20-25周岁、健康男性的包皮组织，其制备方法包括如下步骤。
[0031] （1）人皮肤的采集：选择年龄20-25周岁、健康男性的包皮组织，在无菌的条件下，剪取约1×1cm2备用。实验用包皮组织由解放军昆明总医院泌尿外科提供，并通过解放军昆明总医院医学伦理委员会的批准，样品采集患者均知情同意，该材料仅用于本研究。
[0032] （2）人皮肤成纤维细胞的制备：将所述步骤（1）中采集的皮肤组织用生理盐水反复冲洗后置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml
硫酸链霉素的1×PBS溶液中清洗三次，剪弃脂肪和结缔组织，然后将组织剪碎成0.5 1mm3大小的组织
块，加入含有200U/ml胶原酶、~300U/ml透明质酸酶的DMEM培养基，置于4℃条件下过夜。按1:1的比例加入含有0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的1×PBS消化液，置于37℃条件、180rpm的空气摇床中20min，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml，以终止反应；1000rpm离心10min后弃上清、收集细胞，用DMEM培养基洗脱2次后，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基调整为每毫升约2×
105个细胞接种于六孔培养板中，将细胞置于37℃、5%CO2、 90%湿度条件下培养，每2天更换一次培养液。
[0033] 通过鉴定、培养和传代后的成纤维细胞及形态特征如附图1所示。由附图1可知，通过传代培养，成纤维细胞聚集在一起，呈梭形排列。
[0034] 实施例3。
[0035] 人皮肤成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物诱导。
[0036] 用所述实施例1中制备的诱导剂诱导所述实施例2中制备的人皮肤成纤维细胞为诱导多能干细胞，其方法包括如下步骤。
[0037] （1）成纤维细胞的诱导：当所述实施例2中制备的人皮肤成纤维细胞传代至第四代，且成纤维细胞生长至80%细胞融合时，加入蛋白浓度为10mg/ml的卵母细胞提取液进行诱导72小时，使成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。鱼卵母细胞提取液的终浓度为10~20ug/ml。
[0038] （2）诱导多能干细胞的鉴定：当所述步骤（1）完成后即完成人皮肤成纤维细胞的重编程，利用免疫组化方法鉴定重编程细胞Sox2、Nanog和Oct4/3三个基因的表达情况。
[0039] Sox2、Nanog和Oct4/3三个基因表达情况如附图2所示。由附图2所示，这三个基因在重编程细胞中均呈阳性表达，且细胞形态逐渐发生变化，呈现梭形、三
角形、多角形等形态，细胞核较大，呈扁圆形。
[0040] 以上说明，人皮肤成纤维细胞经鱼卵母细胞提取物诱导后呈现干细胞的特征，具有向其它类型细胞分化的潜能。
[0041] 实施例4。
[0042] 诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化。
[0043] 诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化包括以下步骤。
[0044] （1）诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的定向诱导：将所述实施例3中产生的诱导多能干细胞置于脂肪细胞诱导培养基和维持培养基中交替诱导5个循环，共培养20天，其中每个循环在诱导培养基中培养3天，在维持培养基中培养1天，循环完成后再在维持培养基中维持培养3天，合计培养23天。
[0045] 本实施例中诱导培养基组份包括基础培养基、10%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100mg/ml链霉素、10mg/L胰岛素、0.1mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1.0μmol/L地塞米松、
0.1mmol/L吲哚美辛；维持培养基组份包括基础培养基、10%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、
100mg/ml链霉素、10mg/L胰岛素。
[0046] 诱导完成后，利用油红O染色方法鉴定诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化情况。
[0047] （2）油红O染色鉴定：将所述步骤（1）中诱导好的细胞与对照组细胞分别加入2ml、4%多聚甲
醛固定30min，固定完成后，吸走多聚甲醛溶液，用1×PBS溶液冲洗2次，冲洗完成后加入1ml油红O工作染液染色30min，染色完成后，吸走油红O染色液，用1×PBS溶液冲洗3次，冲洗完成后置于
显微镜下观察染色效果。诱导的脂肪细胞样细胞和对照组细胞的油红O染色如附图3和附图4。由附图3和附图4可见，诱导细胞内有大量的脂滴出现，未诱导的细胞没有脂滴出现。
[0048] 通过以上实施例可以说明，利用本发明的方法可以将成纤维细胞诱导为脂肪细胞样细胞。
