人成纤维细胞的分化
阅读：557发布：2020-05-11
专利汇可以提供人成纤维细胞的分化专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 部分基于将 成 纤维 细胞 分 化成 脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的方法。此外，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的 试剂 和 试剂盒 。此外，本发明提供了使用复合糖进行的增强的细胞外基质沉积。，下面是人成纤维细胞的分化专利的具体信息内容。
1.一种用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的方法，其包括：
a)在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基中生长至汇合；
b)在第一分化细胞培养基中培养所述细胞；
c)在第二分化细胞培养基中培养所述细胞；和
d)确认脂肪细胞的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在第一分化细胞培养基中培养4天。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞在第二分化细胞培养基中培养17天。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述成纤维细胞培养基是FibroLife S2细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一分化细胞培养基是AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二分化细胞培养基是AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述AdipoLife CompleteDifFactor 1细胞培养基包含AdipoLife细胞培养基和DifFactor 1补充剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DifFactor 1补充剂包含：
a)L-谷氨酰胺1-200mM；
b)Plasmanate 10-50％；
c)地塞米松10-1000μM；
d)胰岛素10-300μg/ml；
e)抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；
f)吲哚美辛0.1-10mM；
g)EGF 10-300μg/ml；和
h)曲格列酮10-1000μM。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基包含AdipoLife细胞培养基和DifFactor 2补充剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述DifFactor 2补充剂包含：
a)L-谷氨酰胺1-100mM；
b)Plasmanate 10-50％；
c)地塞米松10-1000μM；
d)胰岛素10-300μg/ml；
e)抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；
f)吲哚美辛0.1-10mM；和
g)EGF 10-300μg/ml。
11.通过根据权利要求1所述的方法产生的脂肪细胞。
12.一种将成纤维细胞分化成骨细胞的方法，其包括：
a)在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基中生长至汇合；
b)将所述细胞在骨发生细胞培养基中进行培养；和
c)确认骨细胞的存在。
13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述细胞在骨发生细胞培养基中培养3周。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述成纤维细胞培养基是Fibroblast S2细胞培养基。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述骨发生细胞培养基是OsteoLife完全细胞培养基。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述OsteoLife完全细胞培养基包含：
a)DMEM；
b)L-Ala-L-Gln 1-100mM；
c)FBS 1-50％；
d)EGF 0.1-20ng/ml；
e)bFGF 0.1-20ng/ml；
f)aFGF 0.1-20ng/ml；
g)β-甘油磷酸盐1-100mM；
h)抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；
i)地塞米松0.1-100μM
j)硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml；
k)透明质酸1-100μg/ml；和
l)半乳糖0.1-50g/L。
17.通过根据权利要求12所述的方法产生的骨细胞。
18.一种将成纤维细胞分化成软骨细胞的方法，其包括：
a)在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基中生长至80-90％汇合；
b)沉淀所述细胞；
c)将所述细胞重悬浮于1.5％藻酸盐溶液中；
d)将藻酸盐溶液中的所述细胞添加至100mM氯化钙以形成微珠；
e)将微珠上的细胞于软骨发生细胞培养基中生长；和
f)确认软骨细胞的存在。
19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述细胞在软骨发生细胞培养基中培养3周。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述成纤维细胞培养基是Fibroblast S2细胞培养基。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述软骨发生细胞培养基是ChondroLife软骨发生细胞培养基。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述ChondroLife软骨发生细胞培养基包含：
a)FibroLife；
b)葡萄糖0.1-10g/L；
c)Plasmanate 1-25％；
d)谷氨酰胺1-100mM；
e)地塞米松0.1-100μM；
f)胰岛素0.1-20μg/ml；
g)PS-转铁蛋白0.1-20μg/ml；
h)EGF 0.1-20ng/ml
i)抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；
j)L-脯氨酸10-1000μg/ml；
k)TGFβ30.1-20ng/ml；
l)葡糖醛酸1-100μg/ml；
m)半乳糖0.1-50g/L；
n)硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml；和
o)透明质酸1-100μg/ml。
23.通过根据权利要求18所述的方法产生的软骨细胞。
24.一种用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的试剂盒，其包括：
a)AdipoLife基础细胞培养基；
b)DifFactor 1补充剂；
c)DifFactor 2补充剂；
d)油红O染色剂；和
e)用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的说明书。
25.一种用于将成纤维细胞分化成骨细胞的试剂盒，其包含：
a)OsteoLife细胞培养基；
b)茜素红染色剂；和
c)用于将成纤维细胞分化成骨细胞的说明书。
26.一种用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的试剂盒，其包括：
a)ChondroLife软骨发生细胞培养基；
b)阿新蓝染色剂；和
c)用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的说明书。
27.根据权利要求1所述的方法，其中在标准组织培养处理的塑料上培养所述细胞。
28.一种生成细胞外基质的方法，所述方法包括在至少一种复合糖存在的情况下培养细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中复合糖选自由透明质酸、甘露糖、唾液酸、硫酸软骨素、半乳糖、葡糖醛酸和硫酸氨基葡萄糖组成的组。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是从间充质干细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是从成纤维细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞。
人成纤维细胞的分化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0003] 本发明一般涉及成体干细胞，更具体地涉及用于允许人成纤维细胞获得间充质细胞(MSC)样状态的方法和诱导MSC潜能人成纤维细胞分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的方法以及使用其的方法。本发明一般涉及细胞外基质的建立和增强的沉积。
[0004] 发明背景
[0005] 干细胞是在多细胞生物体中发现的细胞，其可分化成不同的特化细胞类型或自我更新，以产生更多干细胞。干细胞与其它细胞类型区别在于两个重要特征。首先，它们是能够，有时在长期不活动后，通过细胞分裂自我更新的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可被诱导成为具有特殊功能的组织或器官特异性细胞。在某些器官诸如肠道和骨髓中，干细胞定期分裂以修复和替换磨损或损坏的组织。然而，在其他器官，诸如胰腺和心脏中，干细胞只在特殊条件下分裂。
[0006] 一种类型的干细胞是体细胞(成体)干细胞。成体干细胞是大许多器官和分化的组织中发现的对于自我更新和分化具有有限能力的相对罕见的未分化细胞。这类细胞在它们的分化能力上可变化，但它通常限于来源器官中的细胞类型。
[0007] 干细胞在健康和医学研究的许多不同领域中具有潜力。一些最严重的医学病症，诸如癌症和出生缺陷，是由于当细胞经历转化时出现的问题而引起的。理解正常细胞的发育和分化机制将允许更好地理解这些病症。
[0008] 干细胞的另一个潜在应用是使细胞和组织用于医学治疗。今天，捐赠器官和组织经常被用来取代患病或损坏的那些器官和组织。不幸的是，需要移植的人的数量远远超过可用于移植的器官数量。因细胞来源于患者而与患者组织匹配的成体干细胞，提供了治疗许多疾病、病症和失能(包括帕金森病、肌萎缩侧硬化、脊髓损伤，烧伤、心脏病、糖尿病和关节炎)的替代细胞和组织的可再生来源的可能性。
[0009] 成纤维细胞是合成细胞外基质(动物组织的结构框架(基质))并在伤口愈合中起着至关重要的作用的一种类型的细胞。细胞外基质的组成决定了结缔组织的物理性质。成纤维细胞产生各种胶原、糖胺聚糖、网状和弹性纤维以及糖蛋白。成纤维细胞是在动物结缔组织中最常见的细胞，并且从原始间充质细胞衍生而来。组织损伤刺激细胞因子和生长因子从细胞外基质释放并且诱导成纤维细胞的有丝分裂。
[0010] 成纤维细胞通常被视为终末分化的细胞类型。它们具有有限的增殖能力，并且不产生其它类型的细胞。然而，一些证据表明，成纤维细胞可以能够分化成其它细胞类型，因此有资格作为真正的成体干细胞。永生化鼠细胞系3T3L1因其分化成脂肪细胞的能力而被广泛地用于研究。该细胞系衍生自小鼠胚胎成纤维细胞。为了诱导脂肪生成，标准方案要求将细胞涂板在纤连蛋白上，达到汇合，并用胰岛素、地塞米松、抗坏血酸、吲哚美辛(COX1抑制剂)和罗格列酮(PPAR-γ交联剂)的组合进行处理。通常假定3T3L1细胞变成脂肪细胞的能力是细胞系的胚胎来源、物种和永生化的结果，这可赋予一定水平的表型的可塑性。偶尔地，观察到可具有少数脂滴的随机胚胎成纤维细胞。该观察加上文献中的证据表明，许多细胞类型保留少量多能干细胞，诸如肝母细胞，其可被引导至超过一个发育途径，并且一些癌症据认为由已保留无限增殖的能力然而不能分化的细胞产生。已发展了这样的假说，即如果给予对于期望的细胞类型是特异性的适当信号，所谓的“终末”分化细胞可顺从于它们的细胞命运的改变，从而表现先前未认识到有限的效力。已确定如果以与3T3L1永生化细胞系相似的方式处理，一个亚组的原代鼠胚胎成纤维细胞(约20％)和鸡胚胎成纤维细胞(约5％)，但无大鼠胚胎成纤维细胞，还能分化成脂肪细胞。然而，人成纤维细胞，尽管作为与3T3L1细胞相似的细胞类型，但却是不同的物种，来自从不同的组织来源，并且不是永生化的或胚胎的，从而不一定符合人成纤维细胞可以变成脂肪细胞的期望。因此，诱导人成纤维细胞以获得MSC样状态和这些细胞至脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的分化是必要的。
[0011] 细胞外基质是由细胞分泌的提供抗张强度、抗压性、三维组织信号和贮存生长因子和细胞因子的场所的物质。大体解剖学水平上的细胞外基质的实例是愈合伤口、肌腱、韧带、骨、软骨、血管、角膜、牙齿、头发和皮肤。细胞外基质的亚成分是各种各样的角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、巢蛋白、钙磷灰石、牙本质、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、基底膜和不太确定的结缔组织。
[0012] 蛋白聚糖提供多种功能。它们允许水保留组织中，结合生长因子、蛋白酶抑制剂和酶，参与信号转导，并通过结合于细胞外蛋白质帮助组织基质本身。附联于蛋白聚糖的糖(或碳水化合物)链被称为糖胺聚糖(GAG，也称为粘多糖)。所述GAG本身相对于它们的蛋白质主链是极其庞大的。聚集蛋白聚糖，最庞大的蛋白质之一，由90％的糖链组成。
[0013] 历史上，普通组织培养实践在细胞培养期间的任何阶段建立细胞外基质。大多数细胞和细胞系在被传代至新鲜的板之前将在平板上生活2-5天。任何给定的细胞持续分泌细胞外基质，但在标准组织培养条件下是特别不想要的，因为基质本身会在产生对于良好组织培养实践和甚至细胞在板上的分配所必需的单细胞悬浮液中带来问题。细胞可因此而停止增殖，进入静止状态。这样的结果与大多数研究者的要求(即可用于实验的快速分裂群体)直接相反。
[0014] 当需要将细胞外基质用于组织培养时，可用重组或纯化的蛋白质诸如胶原、玻连蛋白或纤连蛋白涂覆板。或者，可将细胞与已知建造对于细胞功能是必需的细胞外基质(虽然所述基质远未被充分确定)的另一种细胞类型共培养。在这两种情况下，研究人员仍然在寻求细胞的增殖，而非产生的细胞外基质可赋予的任何功能。
[0015] 对于组织工程，需要细胞外基质的存在。组织工程相对于组织培养是相对新的现象，与组织培养不同，组织工程利用合成物质或纯化的基质蛋白与随后接种至支架上的细胞的组合。组织工程需要细胞来建立细胞外基质以当在体内移植时形成大体组织。然而如上文中概述的，当前的细胞培养技术不允许细胞在细胞外基质上生长。
[0016] 存在对产生在其上生长细胞，用于组织工程以及伤口愈合的细胞外基质的方法的需要。
[0017] 发明简述
[0018] 本发明部分基于使得成纤维细胞能够获得具有潜能的间充质干细胞状态的方法。此外，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的试剂和试剂盒。此外，本发明还提供了使用特殊糖增强细胞外基质沉积的方法。
[0019] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞，从而诱导成纤维细胞在标准条件下于成纤维细胞培养基(例如，FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；在第一分细胞化培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 1培养基)中培养细胞约4天；在第二分化培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 2培养基)细胞培养基中培养细胞17天；和确认脂肪细胞存在的方法。
[0020] 在优选的方面，将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至汇合。随后将成纤维细胞在AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基中生长约4天。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基中生长17天。在一个方面，使用Oil Red O品系检测积累的脂滴(脂肪细胞的主要特征)来确认脂肪细胞的存在。
[0021] 在一个方面，AdipoLife基础细胞培养基包括Dermalif培养基(Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)；L-谷氨酰胺1-20mM；Plasmanate 1-20％；地塞米松1-20μM；胰岛素1-100μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯1-100μg/ml；吲哚美辛5-500μM；EGF
1-10ng/ml；甘氨酸0.1-5mM；丙氨酸0.1-5mM；脯氨酸0.1-5mM；生物素0.0001-0.01mM；核黄素0.0001-0.01mM；维生素B12 0.0001-0.01mM；和硫辛酸0.0001-0.01mM。
1-10ng/ml；甘氨酸0.1-5mM；丙氨酸0.1-5mM；脯氨酸0.1-5mM；生物素0.0001-0.01mM；核黄素0.0001-0.01mM；维生素B12 0.0001-0.01mM；和硫辛酸0.0001-0.01mM。
[0022] 在优选的方面，AdipoLife基础细胞培养基包括Dermalife培养基；L-谷氨酰胺6mM；Plasmanate 2％；地塞米松5μM；胰岛素10μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯50μg/ml；吲哚美辛50μM；EGF 5ng/ml；甘氨酸0.67mM；丙氨酸0.28mM；脯氨酸0.35mM；生物素0.00041mM；核黄素0.000266mM；维生素B12 0.0010004mM；和硫辛酸0.000971mM。
[0023] 在另一个方面，DifFactor 1补充剂包括L-谷氨酰胺1-200mM；Plasmanate10-50％；地塞米松10-1000μM；胰岛素10-300μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；吲哚美辛0.1-10mM；EGF 10-300μg/ml；和曲格列酮10-1000μM。在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基之前，将培养基与AdipoLife基因培养基组合。
[0024] 在优选的方面，DifFactor 1补充剂包括L-谷氨酰胺103mM；Plasmanate 34％；地塞米松86μM；胰岛素172μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯860μg/ml；吲哚美辛860μM；EGF86μg/ml；和曲格列酮202μM，在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基之前，将所述补充剂与AdipoLife基础培养基组合。
[0025] 在其它方面，DifFactor 2补充剂包括L-谷氨酰胺1-200mM；Plasmanate10-50％；地塞米松10-1000μM；胰岛素10-300μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；吲哚美辛0.1-10mM；和EGF 10-300μg/ml。在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
[0026] 在优选的方面，DifFactor 2补充剂包括L-谷氨酰胺103mM；Plasmanate 34％；地塞米松86μM；胰岛素172μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯860μg/ml；吲哚美辛860μM；和EGF 86μg/ml，在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基，将所述补充剂与AdipoLife基础培养基组合。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供通过方法产生的脂肪细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(例如，FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；在第一分化细胞培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 1培养基)中培养细胞4天；在第二分化培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 2培养基)细胞培养基中培养细胞17天；和确认脂肪细胞的存在。
[0028] 在优选的方面，通过方法产生脂肪细胞，所述方法包括将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至汇合。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基中生长约4天。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基中生长17天。在一个方面，使用油红O染色剂检测积累的脂滴(脂肪细胞的主要特征)来确认脂肪细胞的存在。
[0029] 在另一个实施方案中，本发明提供了将成纤维细胞分化成骨细胞的方法，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在骨发生细胞培养基(OsteoLife Complete培养基)中培养3周；和确认骨细胞的存在。
[0030] 在优选的实施方案中，将成纤维细胞在FibroLife细胞培养基中生长至汇合。随后将成纤维细胞在OsteoLife完全细胞培养基中生长3周。在一个方面，使用茜素红染色剂(Alizarin Red stain)检测钙沉积(生成骨的骨细胞的主要特征)来确认骨细胞的存在。
[0031] 在一个方面，OsteoLife完全细胞培养基包括DMEM；L-Ala-L-Gln 1-100mM；FBS 1-50％；EGF 0.1-20ng/ml；bFGF 0.1-20ng/ml；aFGF 0.1-20ng/ml；β-甘油磷酸盐
1-100mM；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；地塞米松0.1-100μM；透明质酸1-100μg/ml、硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L。
1-100mM；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；地塞米松0.1-100μM；透明质酸1-100μg/ml、硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L。
[0032] 在优选的方面，OsteoLife完全细胞培养基包括DMEM；L-Ala-L-Gln 6mM；FBS1％；EGF 5ng/ml；bFGF 5ng/ml；aFGF 5ng/ml；β-甘油磷酸盐10mM；抗坏血酸-2-磷酸酯
50μg/ml；地塞米松0.1μM；透明质酸1-100μg/ml、硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L，通过用茜素红染色剂检测钙沉淀(生成骨的骨细胞的主要特征)入手来确认骨细胞的存在。
50μg/ml；地塞米松0.1μM；透明质酸1-100μg/ml、硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L，通过用茜素红染色剂检测钙沉淀(生成骨的骨细胞的主要特征)入手来确认骨细胞的存在。
[0033] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过方法产生的骨细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在骨发生细胞培养基(OsteoLife Complete培养基)中生长3周；和确认骨细胞的存在。
[0034] 在优选的实施方案中，通过方法产生骨细胞，所述方法包括将成纤维细胞在FibroLife细胞培养基中生长至汇合。随后将成纤维细胞在OsteoLife完全细胞培养基中生长3周。在一个方面，使用茜素红染色剂检测钙沉积(生成骨的骨细胞的主要特征)来确认骨细胞的存在。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明提供了将成纤维细胞分化成软骨细胞的方法，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至80-90％汇合；沉淀细胞；将细胞重悬浮于1.5％的藻酸盐溶液中；使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙，以形成微珠；将微珠中的细胞于软骨发生细胞培养基(ChondroLife培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长3周；和确认软骨细胞的存在。
[0036] 在优选的实施方案中，将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基生长至80-90％汇合。随后沉淀细胞，重悬浮于1.5％藻酸盐溶液。随后使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙，以形成微珠。随后将微珠中的细胞于ChondroLife细胞培养基中生长3周。在一个方面，使用阿新蓝染色剂(Alcian Blue stain)检测硫酸化蛋白聚糖(软骨细分泌软骨的主要特征)来确认软骨细胞的存在。
[0037] 在一个方面，ChondroLife软骨发生细胞培养基包括FibroLife；葡萄糖0.1-10g/L；Plasmanate 1-25％；谷氨酰胺1-100mM；地塞米松0.1-100μM；胰岛素0.1-20μg/ml；PS-转铁蛋白0.1-20μg/ml；EGF 0.1-20ng/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；L-脯氨酸10-1000μg/ml；TGFβ3 0.1-20ng/ml；葡糖醛酸1-100μg/ml；半乳糖0.01-50g/L；
硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml；和透明质酸1-100μg/ml。
硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml；和透明质酸1-100μg/ml。
[0038] 在优选的方面，ChondroLife软骨发生细胞培养基包括FibroLife；葡萄糖4.5g/L；Plasmanate 2％；谷氨酰胺6mM；地塞米松0.1μM；胰岛素5μg/ml；PS-转铁蛋白5μg/ml；EGF 5ng/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯50μg/ml；L-脯氨酸40μg/ml；TGFβ3 2ng/ml；葡糖醛酸3.24μg/ml；半乳糖2g/L；硫酸氨基葡萄糖10μg/ml；和透明质酸10μg/ml。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过方法产生的软骨细胞，所述方法包括：在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至80-90％汇合；沉淀细胞；将细胞重悬浮于1.5％藻酸盐溶液；使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠；将微珠中的细胞在软骨发生细胞培养基(ChondroLife培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中培养3周；和确认软骨细胞的存在。
[0040] 在优选的实施方案中，通过方法产生软骨细胞，所述方法包括将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基生长至80-90％汇合。随后沉淀细胞，将其重悬浮于1.5％藻酸盐溶液中。随后使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠。随后将微珠中的细胞在ChondroLife细胞培养基中培养3周。在一个方面，使用阿新蓝染色剂检测硫酸化蛋白聚糖(软骨细分泌软骨的主要特征)来确认软骨细胞的存在。
[0041] 在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的试剂盒，所述试剂盒包括AdipoLife基础细胞培养基；DifFactor 1补充剂；DifFactor 2细胞补充剂；油红O染色剂；和用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的说明书。
[0042] 在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成骨细胞的试剂盒，其包括OsteoLife完全细胞培养基；茜素红染色剂；和用于将成纤维细胞分化成骨细胞的说明书。
[0043] 在其它实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的试剂盒，其包括：100mM氯化钙溶液；ChondroLife软骨发生细胞培养基；阿新蓝染色剂；和用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的说明书。
[0044] 在一个实施方案中，本发明提供了通过在至少一种复合糖存在的情况下培养细胞来生成细胞外基质的方法。在一个方面，所述复合糖可以是，但不限于，透明质酸、甘露糖、唾液酸、硫酸软骨素、半乳糖、葡糖醛酸和硫酸氨基葡萄糖。在另一个方面，所述细胞是从间充质干细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞。在其它方面，所述细胞可以是，但不限于，从成纤维细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞。在另外的方面，所述细胞可以是，但不限于，骨细胞、软骨细胞、血管或伤口愈合细胞。
[0045] 发明详述
[0046] 本发明部分基于将成纤维细胞分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的方法。因此，本发明提供用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞的试剂和试剂盒。
[0047] 在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于描述的特定组合物、方法和实验条件，这样组合物、方法和条件可变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案，并且无意是限制性的，因为本发明的方法仅在所附权利要求中受到限制。
[0048] 如本说明书和所述权利要求中使用的，除非上下文中明确地另有所指，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“所述方法”的称谓包括本文中所述类型的一种或多种方法和/或步骤，在阅读本公开内容后，它们将对本领域普通技术人员变得显而易见。
[0049] 除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文中描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施和测试，但现在描述优选方法和材料。
[0050] 成纤维细胞是合成细胞外基质(动物组织的结构框架(基质))并在伤口愈合中起着至关重要作用的一种类型的细胞。细胞外基质的组成决定了结缔组织的物理性质。成纤维细胞产生各种胶原、糖胺聚糖、网状和弹性纤维以及糖蛋白。它们是在动物结缔组织中最常见的细胞，并且从原始间充质细胞衍生而来。组织损伤刺激细胞因子和生长因子从细胞外基质释放并且诱导成纤维细胞的有丝分裂。
[0051] 间充质干细胞或MSC是能够分化成多种细胞类型的多能干细胞。已显示MSC在体外或体内分化成的细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和如最近所描述的，β-胰岛细胞。MSC具有极大的自我更新能力，同时保持其多能性。
[0052] 骨细胞是负责骨形成的单核细胞；在本质上，成骨细胞是除了成纤维细胞产物外还表达骨涎蛋白和骨钙蛋白的特化的成纤维细胞。
[0053] 骨细胞产生类骨质的基质，其主要由I型胶原组成。成骨细胞也负责该基质的矿化。锌、铜、钙和钠是该过程中所需的一些矿物质。骨骼是不断地受负责基质和矿物质的产生的成骨细胞以及改造组织的破骨细胞重塑的动态组织。骨细胞倾向于随年龄增加而减少，从而影响骨组织的形成和骨吸收的平衡。
[0054] 脂肪细胞，也称为脂细胞或脂肪细胞(fat cell)，是主要构成脂肪组织，专门合成脂质和将其作为能量源贮存的细胞。脂肪细胞在维持适当的能量平衡，响应于激素刺激动员能量源，和通过信号分泌物控制变化中对于身体是非常重要的。在显微镜下，脂肪细胞显现臃肿的脂质。细胞的细胞核被移至一侧并且细胞的质膜看起来象围绕脂肪池的细线。
[0055] 软骨细胞是仅在软骨中发现的细胞。它们产生并维持软骨基质，所述基质主要由胶原和蛋白聚糖组成。取决于软骨的类型和它们被发现时所在的组织，软骨细胞在软骨内的组织不同。
[0056] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的方法，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(例如，FibroLife S2,Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在第一分化细胞培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 1)中生长约4天；将细胞在第二分化细胞培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 2)中生长17天；和确认脂肪细胞的存在。
[0057] 在优选的方面，将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基(表1)中生长至汇合。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基(AdipoLife基础培养基(表3)+DifFactor 1补充剂(表4))中生长约4天。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基(AdipoLife基础培养基(表3)+DifFactor 2补充剂(表5))中培养17天。在一个方面，脂肪细胞的存在使用油红O染色剂检测积累的脂滴(脂肪细胞的主要特征)来确认。
[0058] 表1 FibroLife基础 FibroLife S2
[0059]
[0060]
[0061] 表2 DermaLife
[0062]
[0063]
[0064] 表3 AdipoLife基础细胞培养基
[0065]
[0066]
[0067] 表4 DifFactor 1补充剂
[0068]组分 终浓度 优选浓度
L-谷氨酰胺 1-200mM 103mM
Plasmanate 10-50％ 34％
地塞米松 10-1000μM 86μM
胰岛素 10-300μg/mL 172μg/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 860μg/mL
吲哚美辛 0.1-10mM 860μM
EGF 10-300μg/mL 86μg/mL
曲格列酮 10-1000μM 202μM
L-谷氨酰胺 1-200mM 103mM
Plasmanate 10-50％ 34％
地塞米松 10-1000μM 86μM
胰岛素 10-300μg/mL 172μg/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 860μg/mL
吲哚美辛 0.1-10mM 860μM
EGF 10-300μg/mL 86μg/mL
曲格列酮 10-1000μM 202μM
[0069] 表5 DifFactor 2补充剂
[0070]组分 终浓度 优选浓度
L-谷氨酰胺 1-200mM 103mM
Plasmanate 10-50％ 34％
地塞米松 10-1000μM 86μM
胰岛素 10-300μg/mL 172μg/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 860μg/mL
吲哚美辛 0.1-10mM 860μM
EGF 10-300μg/mL 86μg/mL
L-谷氨酰胺 1-200mM 103mM
Plasmanate 10-50％ 34％
地塞米松 10-1000μM 86μM
胰岛素 10-300μg/mL 172μg/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 860μg/mL
吲哚美辛 0.1-10mM 860μM
EGF 10-300μg/mL 86μg/mL
[0071] 本发明的方法使用标准皮氏培养皿。先前的公开内容已显示需要使用额外的涂层诸如纤连蛋白涂覆标准平板，以便细胞附着。通过使用本文中公开的培养基，细胞可生长在标准细胞培养皿中而不需额外涂层。在无额外涂层存在的情况下生长细胞的能力是本发明的令人惊讶的方面。
[0072] 在一个方面，AdipoLife基础细胞培养基包括Dermalife；L-谷氨酰胺1-20mM；Plasmanate 1-20％；地塞米松1-20μM；胰岛素1-100μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯
1-100μg/ml；吲哚美辛5-500μM；EGF 1-10ng/ml；甘氨酸0.1-5mM；丙氨酸0.1-5mM；脯氨酸0.1-5mM；生物素0.0001-0.01mM；核黄素0.0001-0.01mM；维生素B12 0.0001-0.01mM；
和硫辛酸0.0001-0.01mM。
1-100μg/ml；吲哚美辛5-500μM；EGF 1-10ng/ml；甘氨酸0.1-5mM；丙氨酸0.1-5mM；脯氨酸0.1-5mM；生物素0.0001-0.01mM；核黄素0.0001-0.01mM；维生素B12 0.0001-0.01mM；
和硫辛酸0.0001-0.01mM。
[0073] 在优选的方面，AdipoLife基础细胞培养基包括Dermalife；L-谷氨酰胺6mM；Plasmanate 2％；地塞米松5μM；胰岛素10μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯50μg/ml；吲哚美辛50μM；EGF 5ng/ml；甘氨酸0.67mM；丙氨酸0.28mM；脯氨酸0.35mM；生物素0.00041mM；
核黄素0.000266mM；维生素B12 0.0010004mM；和硫辛酸0.000971mM。
核黄素0.000266mM；维生素B12 0.0010004mM；和硫辛酸0.000971mM。
[0074] 在另一个方面，DifFactor 1补充剂包括L-谷氨酰胺1-200mM；Plasmanate10-50％；地塞米松10-1000μM；胰岛素10-300μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；吲哚美辛0.1-10mM；EGF 10-300μg/ml；和曲格列酮10-1000μM。在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
[0075] 在优选的方面，DifFactor 1细胞培养基包括L-谷氨酰胺103mM；Plasmanate34％；地塞米松86μM；胰岛素172μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯860μg/ml；吲哚美辛860μM；EGF 86μg/ml；和曲格列酮202μM，在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
[0076] 在其它方面，DifFactor 2补充剂包括L-谷氨酰胺1-200mM；Plasmanate10-50％；地塞米松10-1000μM；胰岛素10-300μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；吲哚美辛0.1-10mM；和EGF 10-300μg/ml。在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
[0077] 在优选的方面，DifFactor 2细胞培养基包括L-谷氨酰胺103mM；Plasmanate34％；地塞米松86μM；胰岛素172μg/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯860μg/ml；吲哚美辛
860μM；和EGF 86μg/ml，在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
860μM；和EGF 86μg/ml，在即将用于产生AdipoLife Complete DifFactor 2细胞培养基之前，将所述培养基与AdipoLife基础培养基组合。
[0078] 曲格列酮(Rezulin、Resulin或Romozin)是抗糖尿病和抗炎症药物，并且是噻唑烷二酮类药物种类的成员。曲格列酮是PPARα和–更强地–PPARγ受体的配体。TZD的一个成员是罗格列酮，其对PPARγ受体的专一性远高于曲格列酮并且是用于通过交联PPARγ受体诱导3T3L1品系进入脂肪生成的最初药物。罗格列酮在鼠和鸡胚胎成纤维细胞中起作用，但不再可用于在人成纤维细胞上测试。曲格列酮被选择作为用于交联PPARγ受体的可能替代。其不如罗格列酮专一并且其EC50在物种间差异相当大，但迄今结果表明当将曲格列酮与其它成分组合使用时，最少70％的人细胞培养物的表面被脂质积累细胞覆盖。曲格列酮用于本申请的显著地短寿命的试剂(以粉末形式在-20℃存在3个月)。我们的特定制剂DifFactor 1允许当在-20℃下贮存时贮藏期限延长至至少2年。
[0079] 在一个实施方案中，本发明提供了通过方法产生的脂肪细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(例如，FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在第一分化细胞培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 1培养基)中培养约4天；将细胞在第二细胞培养基(例如，AdipoLife Complete DifFactor 2培养基)中培养17天；和确认脂肪细胞的存在。
[0080] 在优选的方面，通过方法产生脂肪细胞，所述方法包括将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至汇合。随后将细胞在AdipoLife Complete DifFactor 1细胞培养基中生长约4天。随后将细胞在DifFactor 2细胞培养基中生长17天。在一个方面，使用油红O染色剂检测脂滴的积累(脂肪细胞的主要特征)来确认脂肪细胞的存在。
[0081] 在另一个实施方案中，本发明提供了将成纤维细胞分化成骨细胞的方法，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2,Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在骨发生细胞培养基(OsteoLife Complete培养基)培养3周；和确认骨细胞的存在。
[0082] 在优选的实施方案中，将成纤维细胞在FibroLife S2(表1)细胞培养基中生长到汇合。随后将成纤维细胞在OsteoLife Complete培养基(表6)细胞培养基中生长3周。在一个方面，使用茜素红染色剂检测钙沉积(生成骨的骨细胞的主要特征)来确认骨细胞的存在。
[0083] 表6 OsteoLife完全
[0084]组分 终浓度 优选浓度
DMEM n/a n/a
L-Ala-L-Gln 1-100mM 6mM
胎牛血清 1-50％ 1％
EGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
bFGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
aFGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
β-甘油磷酸盐 1-100mM 10mM
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 50μg/mL
地塞米松 0.1-100μM 0.1nM
透明质酸 1-100μg/ml 1-100μg/ml
硫酸氨基葡萄糖 1-100μg/ml 1-100μg/ml
半乳糖 0.1-50g/L 0.1-50g/L
DMEM n/a n/a
L-Ala-L-Gln 1-100mM 6mM
胎牛血清 1-50％ 1％
EGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
bFGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
aFGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
β-甘油磷酸盐 1-100mM 10mM
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 50μg/mL
地塞米松 0.1-100μM 0.1nM
透明质酸 1-100μg/ml 1-100μg/ml
硫酸氨基葡萄糖 1-100μg/ml 1-100μg/ml
半乳糖 0.1-50g/L 0.1-50g/L
[0085] 在一个方面，OsteoLife Complete细胞培养基包括DMEM；L-Ala-L-Gln 1-100mM；FBS 1-50％；EGF 0.1-20ng/ml；bFGF 0.1-20ng/ml；aFGF 0.1-20ng/ml；β-甘油磷酸盐
1-100mM；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；地塞米松0.1-100μM；透明质酸1-100μg/ml；硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L。
1-100mM；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；地塞米松0.1-100μM；透明质酸1-100μg/ml；硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L。
[0086] 在优选的方面，OsteoLife Complete细胞培养基包括DMEM；L-Ala-L-Gln 6mM；FBS 1％；EGF 5ng/ml；bFGF 5ng/ml；aFGF 5ng/ml；β-甘油磷酸盐10mM；抗坏血酸-2-磷酸酯50μg/ml；地塞米松0.1μM；透明质酸1-100μg/ml；硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml和半乳糖0.1-50g/L。
[0087] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过方法产生的骨细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2,Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至汇合；将细胞在骨发生细胞培养基(OsteoLife完全培养基)培养3周；和确认骨细胞的存在。
[0088] 在另一个方面，本发明提供通过方法产生的骨细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至汇合；将细胞在OsteoLife完全细胞培养基培养3周；和通过用茜素红染色剂进行染色以检测钙沉积(生成骨的骨细胞的主要特征)来确认骨细胞的存在。
[0089] 在另一个实施方案中，本发明提供了将成纤维细胞分化成软骨细胞的方法，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2,Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长至80-90％汇合；沉淀细胞；将细胞重悬浮于1.5％藻酸盐溶液中；使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠；将微珠中的细胞在软骨发生细胞培养基(ChondroLife,Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长3周；和确认软骨细胞的存在。
[0090] 在优选的实施方案中，将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至80-90％汇合。随后沉淀细胞，将其悬浮于1.5％藻酸盐溶液中。随后使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠。随后将在微珠中的细胞在ChondroLife细胞培养基(表7)生长3周。在一个方面，使用阿新蓝染色剂检测硫酸化蛋白聚糖(分泌软骨的软骨的软骨细胞的主要特征)来确认软骨细胞的存在
[0091] 表7 ChondroLife
[0092]组分 终浓度 优选浓度
FibroLife n/a n/a
葡萄糖 0.1-10g/L 4.5g/L
Plasmanate 1-25％ 2％
谷氨酰胺 1-100mM 6mM
地塞米松 0.1-100μM 0.1μM
胰岛素 0.1-20μg/mL 5μg/mL
PS-转铁蛋白 0.1-20μg/mL 5μg/mL
EGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 50μg/mL
L-脯氨酸 10-1000μg/mL 40μg/mL
TGFβ3 0.1-20ng/mL 2ng/mL
葡糖醛酸 1-100μg/mL 3.24μg/mL
半乳糖 0.1-50g/L 2g/L
硫酸氨基葡萄糖 1-100μg/mL 10μg/mL
透明质酸 1-100μg/mL 10μg/mL
FibroLife n/a n/a
葡萄糖 0.1-10g/L 4.5g/L
Plasmanate 1-25％ 2％
谷氨酰胺 1-100mM 6mM
地塞米松 0.1-100μM 0.1μM
胰岛素 0.1-20μg/mL 5μg/mL
PS-转铁蛋白 0.1-20μg/mL 5μg/mL
EGF 0.1-20ng/mL 5ng/mL
抗坏血酸-2-磷酸酯 10-1000μg/mL 50μg/mL
L-脯氨酸 10-1000μg/mL 40μg/mL
TGFβ3 0.1-20ng/mL 2ng/mL
葡糖醛酸 1-100μg/mL 3.24μg/mL
半乳糖 0.1-50g/L 2g/L
硫酸氨基葡萄糖 1-100μg/mL 10μg/mL
透明质酸 1-100μg/mL 10μg/mL
[0093] 在一个方面，ChondroLife软骨发生细胞培养基包括FibroLife；葡萄糖0.1-10g/L；Plasmanate 1-25％；谷氨酰胺1-100mM；地塞米松0.1-100μM；胰岛素0.1-20μg/ml；PS-转铁蛋白0.1-20μg/ml；EGF 0.1-20ng/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯10-1000μg/ml；L-脯氨酸10-1000μg/ml；TGFβ3 0.1-20ng/ml；葡糖醛酸1-100μg/ml；半乳糖.01-50g/L；硫酸氨基葡萄糖1-100μg/ml；和透明质酸1-100μg/ml。
[0094] 在优选的方面，ChondroLife软骨发生细胞培养基包括FibroLife；葡萄糖4.5g/L；Plasmanate 2％；谷氨酰胺6mM；地塞米松0.1μM；胰岛素5μg/ml；PS-转铁蛋白5μg/ml；EGF 5ng/ml；抗坏血酸-2-磷酸酯50μg/ml；L-脯氨酸40μg/ml；TGFβ3 2ng/ml；葡糖醛酸3.24μg/ml；半乳糖2g/L；硫酸氨基葡萄糖10μg/ml；和透明质酸10μg/ml。
[0095] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过方法产生的软骨细胞，所述方法包括在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基(FibroLife S2培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)生长至80-90％汇合；沉淀细胞；将细胞重悬浮于1.5％藻酸盐溶液中；使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠；将微珠中的细胞在软骨发生细胞培养基(ChondroLife培养基，Lifeline Cell Technology,Walkersville,MD)中生长3周；和确认软骨细胞的存在。
[0096] 在优选的实施方案中，通过方法产生软骨细胞，所述方法包括将成纤维细胞在FibroLife S2细胞培养基中生长至80-90％汇合。随后沉淀细胞，将其重悬浮于1.5％藻酸盐溶液中。随后使用注射器将藻酸盐细胞溶液添加至100mM氯化钙以形成微珠。随后将微珠中的细胞在ChondroLife细胞培养基中生长3周。在一个方面，使用阿新蓝染色剂检测硫酸化蛋白聚糖(分泌软骨的软骨细胞的主要特征)不确认软骨细胞的存在。
[0097] 在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的试剂盒，其包括AdipoLife基础细胞培养基；DifFactor 1补充剂；DifFactor 2补充剂；油红O染色剂；和用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的说明书。
[0098] 在一个实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成骨细胞的试剂盒，其包括OsteoLife细胞培养基；茜素红染色剂；和用于将成纤维细胞分化成骨细胞的说明书。
[0099] 在其它实施方案中，本发明提供了用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的试剂盒，其包括ChondroLife软骨发生细胞培养基；阿新蓝染色剂；和用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的说明书。
[0100] 细胞外基质是由细胞分泌的提供抗张强度、抗压性、三维组织信号和贮存生长因子和细胞因子的场所的物质。大体解剖学水平上的细胞外基质的实例是愈合伤口、肌腱、韧带、骨、软骨、血管、角膜、牙齿、头发和皮肤。细胞外基质的亚成分是各种各样的角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、巢蛋白、钙磷灰石、牙本质、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、基底膜和不太确定的结缔组织。
[0101] 蛋白聚糖由蛋白质主链与多个附联的糖链组成。其外观很象具有数千条长腿的线状千足虫。蛋白聚糖的实例是粘膜、睾丸蛋白聚糖、基膜聚糖、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、纤调蛋白、多配体聚糖、神经蛋白聚糖、磷脂酰肌醇聚糖和基底膜聚糖。
[0102] 附联于蛋白聚糖的糖(或碳水化合物)链称为糖胺聚糖(GAG，也称为粘多糖)。它们是由重复二糖单位(由一个六碳糖(也称为己糖或己糖醛酸)和一个含氮六碳糖(称为己糖胺)组成的)组成的长的无支链糖链。附联于蛋白聚糖的GAG的长度和数目变化极大。它们还可在不同位置以不同量被硫酸化或乙酰化。GAG的实例是不同种类的硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、软骨素和硫酸皮肤素。不附联于蛋白质骨架的唯一的GAG是透明质酸(或透明质烷)。GAG在细胞外基质、细胞表面被大量发现，并且共价结合于膜糖基磷脂酰肌醇。GAG也可以以非常有限的量出现在细胞内。
[0103] 糖类链的组分的实例可以是葡萄糖、甘露糖、唾液酸、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、糠醛酸、己糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖胺和葡糖胺。如上所述，所述糖在多个位置被乙酰或硫酸化。
[0104] 蛋白聚糖提供多种功能。它们允许水保留组织中，结合生长因子、蛋白酶抑制剂和酶，参与信号转导，并通过结合于细胞外蛋白质帮助组织基质本身。GAG本身相对于它们的蛋白质主链是极其庞大的。聚集蛋白聚糖，最庞大的蛋白质之一，由90％的糖链组成。
[0105] 如本文中所用，术语“复合糖”和“复合糖类(complex sugar)”包括单体和多聚体糖链。使用糖作为补充剂增强细胞外基质的沉积是本发明一个独特的方面。它们对于细胞类型还可以是特异的。作为实例，先前的研究显示使用与本发明中公开的制剂类似但无硫酸氨基葡萄糖的制剂将间充质干细胞用于软骨发生。该特定的复合糖先前已显示对于基质从间充质干细胞的分泌是有利的。类似地，已显示透明质酸的存在对于基质从成纤维细胞的沉积是有利的。在令人惊讶的方面，本发明公开了某些复合糖在培养基中的使用大大增加了来源于骨细胞的钙的积累，而其它糖的使用积极地抑制钙的积累。例如，已经历软骨发生的MSC需要使用半乳糖、葡糖醛酸及透明质酸，这极大地增强了软骨形成，并且硫酸氨基葡萄糖的使用会抑制基质沉积。在已经历骨发生的MSC的情况下，半乳糖、硫酸氨基葡萄糖和透明质酸允许极大增加的钙沉积量，而甘露糖或葡萄糖对于基质形成是不利的。允许获得MSC样状态的成纤维细胞需要半乳糖、葡糖醛酸和硫酸氨基葡萄糖来进行软骨形成，而透明质酸会抑制其。糖的实例是透明质酸、半乳糖、硫酸氨基葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、唾液酸、硫酸软骨素和半乳糖胺。
[0106] 在一个实施方案中，本发明提供了通过在至少一种复合糖存在的情况下培养细胞来生成细胞外基质的方法。在一个方面，所述复合糖可以是，但不限于，透明质酸、甘乳糖、唾液酸、硫酸软骨素、半乳糖、葡糖醛酸和硫酸氨基葡萄糖。在另一个方面，所述细胞为从间充质干细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞。在其它方面，所述细胞可以是，但不限于，从成纤维细胞衍生的脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。所述成纤维细胞在分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞之前可能需要MSC样状态。在另外的方面，所述细胞可以是，但不限于，骨细胞、软骨细胞、血管或伤口愈合细胞。
[0107] 下列实施例旨在举例说明但不限制本发明。
[0108] 实施例1
[0109] 成纤维细胞至脂肪细胞的分化
[0110] 已开发了将成纤维细胞分化成脂肪细胞的方法。
[0111] 在标准组织培养处理的塑料上将成纤维细胞在FibroLife S2中生长。将成纤维细2 2
胞以20,000个细胞/cm涂板，将细胞在约2天内生长至汇合(大约80,000个细胞/cm )。
胞以20,000个细胞/cm涂板，将细胞在约2天内生长至汇合(大约80,000个细胞/cm )。
[0112] 当细胞达到汇合时，将细胞培养基改变成AdipoLife Complete DifFactor 1培养基。继续每2天更换一次细胞培养基。4天后，将细胞培养基改变成AdipoLife Complete DifFactor 2培养基，进行17天。在于AdipoLife Complete DifFactor 2培养基中培养5天后，脂质积累可见。
[0113] 在3周的培养后，用油红O染色剂对细胞进行染色以测定积累的脂质。
[0114] 实施例2
[0115] 纤维细胞至骨细胞的分化
[0116] 开发了将成纤维细胞分化成骨细胞的方法。
[0117] 在标准组织培养处理的塑料上将成纤维细胞在FibroLife S2中生长。将成纤维细2 2
胞以20,000个细胞/cm涂板，将细胞在约2天内生长至汇合(大约80,000个细胞/cm )。
胞以20,000个细胞/cm涂板，将细胞在约2天内生长至汇合(大约80,000个细胞/cm )。
[0118] 当细胞达到汇合时，将细胞培养基改变成OsteoLife完全培养基(表6)。每隔3-4天更换一次细胞培养基。将细胞在成OsteoLife完全培养基中生长3周。
[0119] 用茜素红测定对细胞进行染色以检测积累的钙。将细胞在OsteoLife完全培养基上生长7天后，钙积累可见(数据未显示)。
[0120] 实施例3
[0121] 成纤维细胞至软骨细胞的分化
[0122] 开发了用于将成纤维细胞分化成软骨细胞的方法。
[0123] 将成纤维细胞在标准组织培养处理的塑料上于FibroLife S2中生长。将成纤维
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