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来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞

阅读：285发布：2023-03-11

专利汇可以提供来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供通过活体外分化多能干细胞获得的间充质细胞群。多能间充质细胞可依次分化成更特殊化的细胞类型如成骨细胞，具有的性质使它们适合于个体中再构成肌骨骼细胞功能。本公开所述组合物、方法和技术可用于多种商业上重要的诊断、药物筛选和治疗应用。，下面是来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种获得体外培养中增殖的细胞群的方法，所述细胞群特征是群体中至少30％的细胞是来自已建立的细胞系的人胚胎干细胞的后代，且是成骨细胞，其特征在于，所述方法包括在间充质细胞生长培养基中培养来自已建立的细胞系的人胚胎干细胞或它们的选自正常的人间充质细胞和来自人胚胎干细胞系的成纤维细胞系的后代，所述培养基含BMP-4、地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸。
2.采用权利要求1所述方法获得的体外培养中增殖的人细胞群，其特征在于，所述细胞群特征是群体中至少30％的细胞是来自已建立的细胞系的人胚胎干细胞的后代，且是成骨细胞。
3.如权利要求2所述的细胞群，其特征在于，所述间充质细胞是成骨细胞，所述细胞表达骨钙蛋白。
4.如权利要求3所述的细胞群，其特征在于，所述成骨细胞表达胶原-1。
5.如权利要求3所述的细胞群，其特征在于，所述成骨细胞表达碱性磷酸酶。
6.如权利要求2所述的细胞群，其特征在于，所述成骨细胞具有立方形的形状。

说明书全文

来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞

[0001] 本申请是国际申请号为PCT/US 02/20998、国际申请日为2002年7月3日、进入中国国家阶段的申请号为02813555.5、名称为“来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞”的发明专利申请的分案申请。

[0002] 相关应用的参考

[0003] 本发明要求提交于2001年7月6日的待审批美国临时专利申请60/202,732的优先权。为在美国和其它允许权限中实行起见，优先权申请全部和WO01/51616一起纳入本文作为参考。

技术领域

[0004] 本发明一般涉及胚胎细胞和间充质祖细胞的细胞生物领域。更具体的，本发明涉及人多能干细胞形成成骨细胞和其它细胞类型的定向分化，使用特殊培养条件和选择技术。

背景技术

[0005] 再生性药物是生物技术产业的重要新开端。开发了方法来产生特殊细胞的培养物，这些细胞计划用于促进组织修复和治愈以前药物治疗不满意的疾病。

[0006] 产生兴趣的领域是使用培养的细胞来提高或修复骨组织。有一些出版的报导关于正在研制中的成骨细胞祖细胞和间充质干细胞。

[0007] 美国专利5,691,175、5,681,701和5,693,511(Mayo基金会)描述了无限增殖的正常人胎儿成骨细胞，它们表达猿病毒40大T抗原的温度-敏感突变体。美国专利5,972,703(Michigan)报导了不是造血的骨前体细胞组成，它们可在暴露于骨生长因子的时候分化成成骨细胞，使钙沉积到胞外基质中。美国专利6,200,602(Du Puy矫形学)报导了来自造血和非造血细胞的软骨或骨前体细胞的分离以及建议它们用于骨和软骨再生。

[0008] 国际专利出版物WO95/22611(Michigan)报导了将核酸原位转移到骨细胞用于刺激骨祖细胞的方法。研究了II型胶原和亲骨基因用于动物模型中促进骨生长、修复和再生。国际专利出版物WO99/30724(Oregon)建议用成骨细胞祖细胞治疗骨缺陷。可转化细胞以表达骨形态发生蛋白，如BMP-2。

[0009] 骨干细胞的主题由J.E.Aubin综述(J.Cell Biochem.Suppl.30/31:73,1998)。干和原始骨原细胞和相关间充质前体有助于在骨更新和骨折治愈中置换成骨细胞。文章提出假设，成熟成骨细胞表型与表达已知成骨细胞标记亚型的成骨细胞亚群异源，提高多种平行分化途径和不同祖细胞库的可能性。

[0010] Joyner等(Bone21:1,1997)报导用分化阶段-特异单克隆抗体鉴定和富集人骨原细胞。特定抗原的选择是根据其与骨髓培养物的反应性和成骨细胞附近祖细胞区域的胎儿组织中免疫组织化学定位。在免疫淘选(immunopanning)中，抗体选择间质成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)。Thies等(Endocrinology130:1318,1992)报导骨形态发生蛋白-2诱导间质细胞系中成骨细胞分化，以剂量-依赖方式增加碱性磷酸酶活性而不影响细胞增殖。

[0011] Liechty等(Nature Med.6:1282,2000)报导了人间充质干细胞(MSC)移植并证明羊子宫移植后的位置-特异分化。通过髂嵴吸气从正常人供体获得MSC群，在产生免疫活性前移植到羊中。移植的细胞在多组织中持续13个月。文章报导它们经历位置-特异分化成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞、骨髓间质细胞和胸腺间质。

[0012] 美国专利5,908,784(Case Western Reserve)涉及获得人MSCs，这是通过取骨髓细胞、使它们生长在有胎牛血清的BGJb培养基中并用单克隆抗体鉴定它们。体外诱导软骨细胞包括使压紧的细胞沉淀接触软骨诱导剂。美国专利5,486,359(Osirls疗法)报道了分离可分化成骨、软骨、肌肉或骨髓间质的人间充质干细胞。国际专利出版物WO97/40137(Osirls)提出了一个使用间充质干细胞来再生和增加骨的系统。组合物包括MSCs或结合陶瓷材料或可再吸收生物聚合物的新鲜骨髓细胞。

[0013] 不清楚这些出版物中作为例子的任何细胞制备是否可以足够量产生作为骨修复治疗组合物大量上市。

[0014] 胚胎来源的未分化多能干细胞

[0015] 不同医学研究领域涉及不产生任何具体类谱系的后代的干细胞。近来许多发现提高了胚胎细胞系可成为再生性药物中有用细胞和组织来源的期望值，药物用于多种退化化情况。胚胎干细胞描述为多能，因为认为它们能分化成多种细胞类型(R.A.Pedersen,Scientif.Am.280(4):68,1999)。

[0016] 早期胚胎干细胞的工作用近交小鼠吕系作为模型(Robertson,Meth.Cell Biol.75:173,1997;Pedersen,Reprod.Fertil.Dev.6:543,1994综述)。然而，与小鼠ES细胞相比，猴和人多能细胞被证明更脆弱得多且对相同培养条件不起反应。影响它们在培养中的持续性和随后分化的因素显著不同。不过近来发现使灵长类动物胚胎细胞活体外培养。

[0017] Thomson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995)第一个用恒河猴和绒猴作为模型成功地从灵长类动物中培养了胚胎干细胞。他们随后从人胚泡中获得人胚胎干(hES)细胞系(Science282:1145,1998)，与小鼠胚胎成纤维细胞共培养以支持它们的维持和生长。hES细胞有多能干细胞的长久寻找的特性：它们能体外进行增殖而不分化，它们保持正常染色体组型，它们保持分化产生多种成熟细胞类型的能力。

[0018] Geron公司开发了新的组织培养环境，使多能干细胞在本质上没有饲养细胞的环境中连续增殖。参见澳大利亚专利AU729377和国际专利出版物WO01/51616。提供了能在没有饲养细胞的环境中培养干细胞的系统，其中可产生与调节人治疗需要相符的细胞组合物。

[0019] 为在人类健康和疾病控制中了解多能干细胞的潜力，现在必须发展新范例以推动这些细胞成治疗上重要组织类型的群体。

发明内容

[0020] 本发明提供一个系统用于有效产生灵长类动物细胞，它们从多能细胞分化成间充质谱系的细胞。

[0021] 发明的一个实施方案是体外培养中的分离细胞或细胞群，通过分化灵长类动物多能干(pPS)细胞获得。细胞群可包括至少~10%、~30%或~60%不同类型的间充质细胞，具有此公开中其它地方所列性质。例如，成骨细胞和它们的前体可表达骨钙蛋白、1型胶原和碱性磷酸酶。成熟成骨细胞可表达骨钙蛋白，且能形成含钙的胞外基质。

[0022] 这些细胞可从人胚胎干(hES)细胞系中获得，因此与它们从中获得的细胞系共享相同基因组，带有任何诱导的遗传改变。在发明的一个实施方案中，间充质细胞通过在培养基中分化pPS细胞获得，培养基含骨形态发生蛋白(BMP)、人TGF-β受体的配体或人维生素D受体的配体。培养基可进一步包括地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸和钙及磷酸源。如果需要，可遗传改变本发明细胞以提高增殖能力：例如，用于端粒酶反转录酶的表达载体。也可遗传改变细胞以表达骨形态发生蛋白。

[0023] 发明的另一个实施方案是筛选化合物用于间充质细胞或成骨细胞毒性或调节的方法，其中化合物结合本发明细胞或细胞群，确定来自化合物的任何间充质细胞毒性或调节。

[0024] 发明的进一步实施方案是包括本发明细胞群的药物用于治疗人或动物体。药物可任选地含有或伴随附加成分，如基质或陶瓷载体、钙或骨形态发生蛋白。

[0025] 本发明组合物可用于再生需要修复的组织。例如，骨组织可通过使骨组织接触本发明成骨细胞或前体细胞群来修复。以类似的方式，组合物可用于在个体中再构建或补充肌骨骼细胞功能。组合物也可用于在人患者中提高活动性，这是通过在病人中移植假体装置或结合本发明细胞群的夹板。

[0026] 发明的这些和其它实施方案从下列描述中是显而易见的。本公开中所述组合物、方法和技术可用于诊断、药物筛选和治疗应用。

[0027] 说明书附图

[0028] 图1是显示用未分化人胚胎干(hES)细胞的免疫细胞化学检测的标记表达的显微照片的复制。培养物根据小鼠胚胎饲养细胞的常规方法生长，或者在无饲养细胞的环境中生长，此环境含胞外基质或条件培养基中的层粘连蛋白。生长在无饲养细胞培养中的hES细胞具有的表型标记类似于生长在原代小鼠成纤维细胞饲养细胞层上的hES。

[0029] 图2显示名为HEF1的人细胞系特征，它分化自hES细胞。A组是相差显微照片的复制，显示HEF1细胞系有成纤维细胞的形态特征。B组(下面)是TRAP试验结果的复制，显示用端粒酶反转录酶(hTERT)的逆转录病毒载体转导的HEF1细胞获得端粒酶活性。

[0030] 图3是显示细胞系标记表达的显微照片的复制，细胞系经受分化以产生骨前体细胞和成骨细胞。培养物培养基用成骨细胞诱导培养基(OIM)替换，然后分化11天。OIM制备自间充质细胞生长培养基，且添加有0.1μM地塞米松、5μM抗坏血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸和100ng/mL BMP-4。所用细胞是hES细胞系H1、端粒化hES-衍生的分化细胞系HEF1、人间充质干细胞和BJ5ta成纤维细胞。

[0031] A和B组显示用于标记骨钙蛋白、胶原-1的免疫细胞化学。C组显示用于碱性磷酸酶活性的染色。这些特征是成骨细胞谱系的细胞特征，表明hES细胞和HEF1细胞体外经受适当分化操作时，产生成骨细胞。

具体实施方式

[0032] 本发明提供的技术可用于制备和表征一些类型的间充质细胞，包括参与骨更新和修复的细胞。

[0033] 如果pPS细胞可以不定向方式分化，获得的异源细胞群表达许多不同组织类型的标记(WO01/51616;Shamblott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:113,2001)。使用pPS细胞用于治疗目的或用于体外研究具体细胞类型的重要问题是获得特征相对统一的包含大量亚群的细胞群。本公开背景部分的综述文章没有教授或提供方法用于从任何种类的胚胎干细胞中获得成骨细胞或它们的前体。

[0034] 现在发现基本上同源的间充质谱系的细胞群可通过在最优化于此类细胞的条件中培养多能胚胎细胞来获得。实施例2(下面)阐述了人胚胎干(hES)细胞可如何分化成早期中胚层细胞系。引起HES细胞形成胚胎样小体，它们随后在适合选择携带中胚层细胞的表型特征细胞系的条件下平板培养。然后用端粒酶反转录酶转导分离的细胞系以提高增殖能力。此细胞系有自身更新和形成不同成熟间充质细胞类型的后代的能力。

[0035] 在实施例3中，依次引起间充质细胞系分化成成骨细胞谱系的细胞，通过染色胶原-1骨钙蛋白和碱性磷酸酶活性来鉴定。实施例3也阐明了具有成骨细胞特征的细胞也可通过在合适培养环境中培养人胚胎干(hES)细胞来直接获得。具体是，细胞在可商业获得的间充质细胞生长培养基中培养11天，添加有0.1μM地塞米松、5μM抗坏血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸和100ng/mL BMP-4。

[0036] 根据本发明方法获得的一些细胞群含有高比例成骨细胞和它们的前体。不知道培养条件是否诱导hES细胞采用成骨细胞表型，它们是否促进此类细胞长出或它们是否抑制其它类型细胞生长-确实很可能一些这种机制协同作用以富集所需类型细胞。当然，引起成骨细胞谱系的细胞富集的机制令人感兴趣，但不需要理解机制以实践发明。

[0037] 根据此系统产生细胞的显著统一性和功能性质使它们有助于开发新的治疗形式和作为体外研究间充质组织的工具。

[0038] 定义

[0039] 原型“灵长类动物多能干细胞”(pPS细胞)是多能细胞，具有能在合适条件下产生不同细胞类型的后代的特征，细胞类型是所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物，这是根据标准的技术上接受的测试如在8-12周令SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或组织培养中形成所有三个胚层可鉴定细胞的能力。

[0040] pPS细胞定义中包括不同类型的胚胎细胞，例子是来自其它灵长类动物的胚胎干细胞如恒河猴干细胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995)和绒猴干细胞(Thomson等,Biol.Reprod.55:254,1996)。其它类型多能细胞也包括再此术语中。包括任何能产生所有三个胚层衍生物后代的灵长类动物来源的细胞。pPS细胞不获得自恶性来源。理想的是(但不总是必需的)细胞染色体组型正常。

[0041] 当群体中大部分干细胞群和它们的衍生物表现出未分化细胞的形态特征时，pPS细胞培养描述为“未分化”，它们与胚胎或成熟来源的分化细胞明显区分。未分化pPS细胞可容易地被本领域技术人员识别，它们通常出现在二维微观观察中有高核/细胞质比例和突出核仁的细胞集落中。要理解的是，群体内未分化细胞集落通常度邻近的分化细胞包围。

[0042] 为了本公开的目的，“间充质细胞”可以是末端分化细胞或定型形成间充质组织细胞的增殖性前体细胞，如骨、牙组织、软骨、腱、骨髓间质、造血谱系或肌肉。间充质干细胞包括在术语中，也包括末端分化(有丝分裂后)细胞和更定型的有复制能力的细胞如成骨细胞前体细胞。间充质细胞都具有的性质是它们在间充质谱系中末端分化或者限制形成间充质谱系的后代或它们的前体。它们不形成内胚层或外胚层细胞，除非经受核转移或其它重编程序。

[0043] 在细胞个体发育方面，形容词“分化的”是一个相对术语。“分化细胞”是比较细胞在发育途径上更进一步向下发展的细胞。因此，多能胚胎干细胞可分化成谱系-限制的前体细胞(如间充质干细胞)，前体细胞依次可分化成其它类型途径上更下面的前体细胞(如成骨细胞前体)，然后成为在某些组织类型中起特征性作用的最后阶段分化细胞，它们可或可不保持进一步增殖的能力。

[0044] 如本公开所用，“分化剂”指本发明培养系统中所用的化合物的集合之一，用于产生间充质谱系的分化细胞(包括前体细胞和末端分化细胞)。对化合物作用方式没有限制。例如，试剂可协助分化过程，这是通过诱导或协助表型变化、促进具有特定表型的细胞的生长或阻碍其它细胞的生长、或与其它试剂通过未知机制协同作用。

[0045] 除非另有明确说明，本发明技术对能分化成骨的任何类型的祖细胞没有限制。

[0046] 术语“饲养细胞”或“喂养细胞”用于描述一种类型的细胞，它与另一类型的细胞共培养以提供第二种类型的细胞可生长的环境。如果细胞在分裂后生长至少一轮，其中不加入新鲜饲养细胞以支持pPs生长，则pPs细胞群被称为“本质上没有”饲养细胞。

[0047] “生长环境”是感兴趣细胞体外增殖、分化或成熟的环境。环境特征包括培养细胞的培养基、可存在的任何生长因子或分化-诱导因子、支持结构(如果存在，如固体表面上的底物)。

[0048] 当多核苷酸通过任何适当的人工操作方法转入细胞或细胞是遗传多核苷酸的原始改变的细胞后代时，细胞被称为“遗传改变”。多核苷酸通常包括编码感兴趣蛋白质的可转录序列，使细胞能以提高水平表达蛋白质。如果改变的细胞的后代有相同改变，遗传改变被称为“可遗传”。

[0049] 如本公开所用，术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体。术语范围不仅包括完整免疫球蛋白分子，也包括这些免疫球蛋白分子的片断和衍生物(如单链Fv构建物、双体分子和融合构建物)，它们可用本领域已知技术制备并保持所需抗体结合特异性。

[0050] 一般技术

[0051] 为进一步阐述本发明实践中有用的一般技术，操作者可参考细胞生物学、组织培养和胚胎学的标准教科书和综述。

[0052] 关于组织培养和胚胎干细胞，读者可参考《畸胎癌和胚胎干细胞：一种实践方法》(Teratocarcinomas and embryonic stem cells:A practical approach)(E.J.Robertson编,IRL Press Ltd.1987)；《小鼠发育中的技术指南》(Guide to Techniques in Mouse Development)(P.M.Wasserman等编,Academic Press1993)；《胚胎干细胞体外分化》(Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro)(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993)；《胚胎干细胞的性质和使用：应用于人类生物学和基因治疗的前景》(Properties and uses of Embryonic stem cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy)(P.D.Rathjen等,Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998)。

[0053] 制备和培养骨细胞的一般原理和骨损伤修复可发现于《骨：成骨细胞和骨细胞》(Bone:The Osteoblast and Osteocyte)(B.K.Hall,CRC Press1990)；《骨的分化和形态发生》(Differentiation and Morphogenesis of Bone)(B.K.Hall,CRC Press1994)；《骨生物学的原理》(Principles of Bone Bidogy)(J.P.Bilezikian等编,Academic Press1996)；《骨形成和修复的细胞和分子基础》(The Cellular and Molecular Basis of Bone Formation and Repair)(V.Rosen&S.Thies,R.G.Landes Co.1995)。其它感兴趣的读物包括《骨家族》(The Bone People)(K.Hulme,Viking Press1986)；《骨需求》(Bone Appetit)(B.E.Romano,West Coast Media Group1998)。

[0054] 分子遗传和遗传工程方法描述于《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloing:A Laboratory Manual)，第2版(Sambrook等,1989)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编,1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编,1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)系列(Academic Press)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vector for Mammalian Cell)(J.M.Miller&M.P.Calos编,1987)；《新编分子生物学实验指南》和《精编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology l),第3版(F.M.Ausubel等编,1987&1995)；《重组DNA方法II》(Recombinant DNA Methodology II)(R.Wu编,1995)。本公开参考的遗传操作试剂、克隆载体和试剂盒来自商业供应商如BioRad、Stratagene、Invitrogen和ClonTech。

[0055] 干细胞来源

[0056] 本发明可用不同类型的多能干细胞进行，具体是具有能产生所有三个胚层后代特征的干细胞。

[0057] 范例是用作现有细胞系的胚胎干细胞。

[0058] 繁殖未分化状态的pPS细胞

[0059] pPS细胞可在培养中连续繁殖，使用的培养条件促进增殖而不促进分化。范例含血清ES培养基用80%DMEM(如剔除DMEM，Gibco)、20%确定成分胎牛血清(FBS,Hyclone)或血清取代物(WO98/30679)、1%非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制成。使用前，加入人bFGF到4ng/mL(WO99/20741,Geron Corp.)。

[0060] 按常规，ES细胞在饲养细胞层上培养，通常成纤维细胞获得自胚胎或胎儿组织。胚胎收集自怀孕13天的CF1小鼠，转移到2mL胰蛋白酶/EDTA，精细切碎并在37℃培养5分钟。加入10%FBS，使碎片沉淀，细胞繁殖于90%DMEM、10%FBS和2mM谷氨酰胺中。为制备饲养细胞层，照射细胞以抑制增殖但允许支持ES细胞的因子合成(~4000拉德γ-福射)。培养平板用0.5%明胶包被过夜，用每孔375,000个照射mEFs平板培养，平板培养后5小时到4天使用。接种pPS细胞前培养基用新鲜hES培养基置换。

[0061] Geron的科学家发现pPS细胞即使没有饲养细胞可维持在未分化状态(WO01/51616)。没有饲养细胞培养物的环境包括合适的培养底物，具体是胞外基质如-2 -2 -2或层粘连蛋白。pPS细胞以>15,000个细胞cm (90,000 到170,000 最佳)
平板培养。通常，酶消化在细胞完全分散前停止(比如，用胶原酶IV~5到20分钟)。然后~10-2000个细胞的块直接在没有进一步分散的底物上平板培养。

[0062] 没有饲养细胞的培养物由营养培养基支持，通常条件培养照射的原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或衍生自pPS细胞的成纤维细胞样细胞。培养基可在4 -2
无血清培养基如KO DMEM中以~5-6×10cm 密度平板条件培养饲养细胞，无血清培养基添加有20%血清取代物和4ng/mL bFGF。处于正常状态24小时的培养基滤过0.2μm膜，进一步添加~8ng/mL bFGF并用于支持pPS细胞培养1-2天。

[0063] 在显微镜下，ES细胞具有高核/细胞质比例、突出核仁和有较差分辨细胞连接的致密集落形成。灵长类动物ES细胞可表达一种或多种阶段-特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及用名为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体可检测的标记(Thomsom等,Science282:1145,1998)。未分化hES细胞也通常表达RT-PCR检测的Oct-4和TERT。hES细胞体外分化通常导致这些标记(如果存在)损失和增加SSEA-1表达。

[0064] 制备间充质细胞和成骨细胞的材料和步骤

[0065] 本发明的细胞可通过在特殊生长环境中培养、分化或重编程干细胞来获得，此环境富集具有所需表型的细胞(通过长出所需细胞或者通过抑制或杀死其它细胞类型)。这些方法可应用于许多类型的干细胞，包括前面部分所述灵长类动物多能干(pPS)细胞。

[0066] 分化可任选地通过形成胚胎样小体或聚集体来起始：例如，通过过度生长供体pPS细胞培养物或在培养容器中的悬浮液中培养pPS细胞，培养容器有允许EB形成的低粘附性质的底物。pPS细胞通过短暂胶原酶消化收集，分离成块，平板培养于非粘附细胞培养板中。聚集体每几天喂给，然后在适当时间段后收集，通常4-8天。另外或此外，分化过程可通过培养非特异分化范例来起始：通过在培养基中包括视黄酸(RA)或二甲基亚砜(DMSO)；或通过从常见的胞外基质中取出，细胞在胞外基质上培养。参见美国专利申请60/213,740和国际专利出版物WO01/51616。

[0067] 产生相对同源的间充质细胞群，具体是可通过在生长环境中培养pPS细胞(未分化，或分化起始后)获得的成骨细胞谱系，生长环境含有益于这些细胞的因子，如一种或多种下列因子：

[0068] ·骨形态发生蛋白，例子是BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6和BMP-7。

[0069] ·TGF-β，例子是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3和它们的类似物，以及结合TGF-β受体的TGF-β超家族的其它成员

[0070] ·维生素D受体的配体。例子是1,25-二羟基维生素D3。其它类似物是已知的(参见例如Tsugawa等,Biol.Pharm.Bull.23:66,2000)

[0071] 认识到对任何这些因子的受体的特异抗体是可用于取代(或除了)所列因子的功能相当配体。其它可使用的添加物包括：

[0072] ·其它形态发生素，如成纤维细胞生长因子像碱性FGF

[0073] ·糖皮质激素

[0074] ·地塞米松或其它小分子成骨细胞成熟因子

[0075] ·抗坏血酸(或其类似物，如抗坏血酸-2-磷酸)，它是胶原合成过程中发生脯氨酸羟基化的辅因子。

[0076] ·β-甘油磷酸或矿化过程中碱性磷酸酶的其它底物

[0077] ·钙源(可或可不以足够浓度存在于碱性培养基中)

[0078] 细胞也可支持在包被有助于所需细胞表型生长的适当物质的底物上，或培养在含这种物质成分的培养基中。

[0079] 层粘连蛋白、胶原(特别是I型胶原)、糖胺聚糖、骨钙蛋白和骨粘连蛋白本身或以不同组合都适合作为胞外基质。同样适合生长的成骨细胞谱系细胞是凝胶衍生的玻璃、硅胶和溶胶衍生的二氧化钛(Saravanapavan等,J.Biomed Mater.Res.54:608,2001;Dieudonne等,Biomaterials34:3041,2002)。

[0080] 根据本发明获得的细胞可按一些表型标准表现特征。相对未分化的间充质细胞可通过它们的特征性单核卵形物、星形或纺锤形来识别，有圆到椭圆的核以及较差确定的细胞边界。椭圆伸长核通常有突出核及异和常染色质的混合物。这些细胞有少的细胞质但有许多似乎延伸自核的薄突起。它们通常染色一个、两个、三个或多个下列标记：CD106(VCAM)、CD166(ALCAM)、CD29、CD44、GATA-4和碱性磷酸酶，而对于造血谱系细胞标记(CD14或CD45)是阴性的。间充质干细胞也可表达STRO-1。

[0081] 在合适条件下，早期间充质细胞可进一步分化成许多成熟结缔组织细胞类型，如成纤维细胞、成软骨细胞、成骨细胞、成牙本质细胞、网状细胞或脂肪细胞。因此，间充质干细胞可通过它们形成一个或多个特殊间充质谱系的能力来鉴定。

[0082] 成骨细胞和骨前体细胞通常有下列的至少一个特征(一般至少三或五个特征)：

[0083] ·~1.050和~1.090g cm-3之间的密度

[0084] ·骨粘连蛋白阳性(成骨细胞和前体中阳性)

[0085] ·骨钙蛋白阳性(对成熟成骨细胞特异)

[0086] ·~8到~70μm的细胞直径

[0087] ·立方形形状

[0088] ·正调节产生碱性磷酸酶，尤其是对BMP存在的反应

[0089] ·I型胶原(前胶原)或波形蛋白阳性

[0090] ·成骨细胞特异标记阳性，如BMP受体、PTH受体或CD105(内皮糖蛋白)[0091] ·矿物化外部环境或合成含钙胞外基质的能力

[0092] 技术人员知道软骨细胞通常表达II型胶原、聚集蛋白聚糖或用艾西蓝染色的蛋白聚糖。在成熟形式中，软骨细胞对于弹性蛋白、I型胶原、X型胶原或成钙蛋白阳性小于1%。造血细胞群和它们的前体携带这种标记如re CD45、CD34、CD13、AC133、血红蛋白、表面抗体和II类组织相容性抗原。在合适情况下，复制性造血细胞在造血集落形成单位(CFU)试验中形成集落。心肌细胞和它们的前体通常表达心脏肌钙蛋白I(cTnI)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心钠素(ANF)和α心脏肌球蛋白重链(MHC)。成纤维细胞有易鉴定的形态且通常表达胶原酶I和金属蛋白酶I的组织抑制剂(TIMP-1)。横纹肌细胞通常表达收缩蛋白如骨骼α-肌动蛋白、骨骼肌球蛋白重链和轻链以及原肌球蛋白。早期生肌标记是myoD和成肌素。腱和韧带组织以单向纤维排列染色I型胶原。早期腱和软骨细胞祖细胞通常表达scleraxis。脂肪细胞通常用显示脂质积聚的油红O染色，且表达过氧化物酶体增殖-活化受体γ2(PPARγ2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)和脂肪酸结合蛋白(aP2)。

[0093] 组织-特异标记可用任何合适的免疫学技术检测-如流式免疫细胞化学或亲和吸收细胞表面标记、用于胞内或细胞表面标记的免疫细胞化学(例如固定细胞或组织切片)、细胞提取物的蛋白质印迹分析和用于细胞提取物或分泌入培养基的产物的酶联免疫测定。如果明显可检测量的抗体在标准免疫细胞化学或流式细胞仪测定中结合抗原，细胞的抗原表达被称为“抗体-可检测”，任选地在细胞固定后且任选使用标记的第二抗体或其它缀合物(如生物素-抗生物素蛋白缀合物)以扩大标记。

[0094] 组织-特异基因产物的表达也可通过RNA印迹分析、斑点杂交分析或反转录酶起始的聚合酶链式反应(RT-PCR)在mRNA水平检测，使用标准扩增方法中的序列-特异引物。参见美国专利5,843,780的一般技术细节和国际专利出版物WO99/339724的成骨细胞-特异PCR引物。本公开所列其它标记的序列数据可获得自公共数据库如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)。如果在典型控制实验中根据标准步骤在细胞样品上试验产生可清楚分辨的杂交或扩增产物，根据本公开所述试验之一的mRNA水平表达被称为“可检测”。如果水平比对照细胞如未分化pPS细胞或其它不相关细胞类型至少高2倍，优选高
10或50倍，在蛋白质或mRA水平检测的组织-特异标记表达被认为是阳性。

[0095] 如厂商所述(Vector Laboratories,Burlingame CA)，检测碱性磷酸酶活性的存在可通过用4%多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显现。细胞内钙积聚和基45 ++
质蛋白内沉积的测量可通过在 Ca 培养、洗涤和再培养，然后确定细胞内存在任何放射性++
或沉积入胞外基质内(美国专利5,972,703)；或通过用Ca 测试试剂盒(Sigma Kit#587)测定用于矿化的培养底物。

[0096] 一旦标记在所需表型的细胞表面上鉴定，它们可用于免疫选择以通过技术如免疫淘选或抗体-倡导的荧光-活化细胞分选来进一步富集细胞群。

[0097] 由于现已证明间充质细胞和成骨细胞可从pPS细胞产生，调节本公开所述分化范例以适合他们自己的目的在读者的范围内。读者可试验一些培养条件的适宜性，例如通过在与根据本公开所述获得的细胞和其它对照细胞类型(如原代人间充质干细胞、肝细胞或成纤维细胞)平行的试验条件下培养pPS细胞或它们的衍生物，然后比较根据上面所列标记获得的细胞表型。调节培养和细胞分离条件以包括、去除或替换具体成分是本发明正常预期的常规最佳化的事情，且不背离权利要求的发明精神。

[0098] 分化细胞的遗传改变

[0099] 需要细胞具有在一些药物筛选和治疗应用中复制及提供用于产生间充质细胞和成骨细胞贮备的能力。本发明的细胞在它们进展成限制发育谱系细胞或末端分化细胞之前或之后，可任选地端粒化以提高它们的复制能力。端粒化的pPS细胞可从上述分化途径下部取出或分化细胞可直接端粒化。

[0100] 细胞通过遗传改变来端粒化，用合适的载体、同源重组或其它合适技术转染或转导，这样它们表达端粒酶催化成分(TERT)，通常在异源启动子下使端粒酶表达超过内源启动子下所产生的表达。具体合适的是国际专利申请WO98/14592提供的人端粒酶催化成分(hTERT)。对于一些应用，种同系物像小鼠TERT(WO99/27113)也可使用。人细胞中端粒酶的转染和表达描述于Bodnar等,Science279:349,1998和Jiang等,Nat.Genet.21:111,1999。在另一个例子中，hTERT克隆(WO98/14592)用作hTERT编码序列的来源，剪接成MPSV启动子控制下的PBBS212载体的EcoRI位点或剪接成LRT启动子控制下的市场上可买到的pBABE反转录病毒载体的EcoRI位点。

[0101] 分化或未分化pPS细胞用含上清液的载体遗传改变超过8-16小时，然后交换到生长培养基中1-2天。遗传改变的细胞用0.5-2.5μg/mL嘌呤霉素选择并再培养。然后可通过RT-PCR评估它们的hTERT表达、端粒酶活性(TRAP试验)、免疫细胞化学染色hTERT或复制能力。下列测试试剂盒可商业购买用于研究目的：端粒酶检测试剂盒(目录号s7707;Intergen Co.,Purchase NY)；和TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目录号2,013,89;Roche Diagnostics,Indianapolis IN)。商业购买用于研究目的的是LightCycler TeloTAGGG hTERT定量试剂盒(目录号3,012,344;Roche Diagnostics)。连续复制的集落通过在支持增殖的条件下进一步培养来富集，且具有所需表型的细胞可任选通过有限稀释来克隆。

[0102] 在本发明的一些实施方案中，pPS细胞分化成多能或定型间充质细胞，然后遗传改变以表达TERT。在本发明的其它实施方案中，遗传改变pPS细胞以表达TERT，然后分化成成骨细胞前体或末端分化细胞。增加TERT表达的成功修饰可通过TRAP试验确定，或通过确定细胞的复制能力是否改进。

[0103] 视应用而定，也可使用其它无限增殖方法，如用编码myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA转化细胞(美国专利5,869,243、国际专利申请WO97/32972和WO01/23555)。当细胞用于治疗目的时，用癌基因或致癌病毒产物转染不太合适。本发明应用中对端粒化细胞特别感兴趣，其中有可增殖和维持它们染色体组型的细胞有优势-例如在药物筛选和治疗方案中，施用分化细胞给个体以增强肌骨骼功能。

[0104] 也可遗传改变本发明的细胞以提高它们参与组织再生或传递治疗基因给施用部位的能力。用已知用于所需基因的编码序列设计载体，操作性地连接于分化细胞类型中pan-特异或专一活性的启动子。特别感兴趣的是遗传改变以表达骨形态发生蛋白如BMP-2或BMP-4的细胞。参见WO99/39724。在施用部位产生这些或其它生长因子可提高被施用细胞的有益作用，或者增加邻近治疗部位的宿主细胞的增殖或活性。

[0105] 间充质干细胞、成骨细胞前体和末端分化细胞的使用

[0106] 本发明提供产生大量前体细胞和成熟细胞的方法。这些细胞群可用于一些重要研究、发展和商业目的。

[0107] 本发明的细胞可用于制备cDNA文库，此文库相对未污染在来自其它谱系的细胞中优先表达的cDNA。例如，间充质祖细胞或成骨细胞通过以1000rpm离心5分钟收集，然后通过标准方法从沉淀中制备mRNA(Sambrook等,同上)。反转录入cDNA后，制备可扣除来自未分化pPS细胞的cDNA、其它祖细胞、或来自成骨细胞或任何其它发育途径的终末期细胞。

[0108] 本发明的分化细胞也可用于制备对间充质细胞、成骨细胞和中间前体特异的抗体。多克隆抗体可通过将本发明细胞以免疫原性形式注射给脊椎动物来制备。单克隆抗体的产生描述于标准参考文献如美国专利4,491,632、4,472,500和4,444,887以及《酶学方法》(Methods in Enzymology)73B:3(1981)。也可通过使免疫活性细胞文库或病毒颗粒接触靶抗原并长出阳性选择克隆产生特异抗体分子。参见Marks等,New Eng.J.Med.335:730,1996和McGuiness等,Nature Biotechnol.14:1449,1996。另一种选择是如EP专利申请1,094,108A所述，将随机DNA片断重新装配入抗体编码区域。

[0109] 通过用本发明pPS阳性选择和用携带更广泛分布的抗原(如分化胚胎细胞)或成熟来源的干细胞阴性选择，可获得所需专一性。抗体可依次用于鉴定或从混合细胞群中援救有所需表型的间充质细胞，用于目的如在免疫诊断中用组织样品共染色以及分离来自末端分化成骨细胞的前体细胞和其它谱系的细胞。

[0110] 本发明的细胞在鉴定转录物的表达模式和新合成的间充质细胞特有蛋白中也感兴趣，且可协助指导分化途径或促进细胞间的相互作用。获得分化细胞的表达模式并与对照细胞系相比，如未分化pPS细胞、其它类型的定型前体细胞(如向其它谱系分化的pPS细胞)或末端分化细胞。

[0111] 在分析基因表达中使用微阵列由Firtz等Science288:316,2000;“微阵列生物芯片技术”(Microarray Biochip Technology),L Shi,www.Gene-Chips.com综述。示范方法TM是用遗传微系统阵列发生器和Axon GenePix 扫描器进行。制备微阵列首先扩增编码待分析标记序列的cDNA片断并直接点到载玻片上。为比较来自两种感兴趣细胞的mRNA制备，一种制备转变成Cy3-标记cDNA，而另一种转变成Cy5-标记cDNA。两种cDNA制备同时杂交到微阵列玻片，然后洗涤以去除非特异结合。玻片然后以适合各标记的波长扫描，量化所得荧光，排列结果以指示用于阵列上各标记的mRNA的相对丰度。

[0112] 药物筛选

[0113] 本发明的间充质细胞和成骨细胞可用于筛选影响这些细胞和它们不同后代的因子(如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或环境条件(如培养环境或操作)。

[0114] 在一些应用中，pPS细胞(未分化或分化)用于筛选促进成熟为稍后阶段的间充质细胞前体或末端分化细胞、或促进长期培养中这些细胞的增殖和维持的因子。例如，候选成熟因子或生长因子的测试是通过将它们加入不同孔中的细胞，然后根据进一步培养和使用细胞的所需标准，确定导致的任何表型变化。在一个例子中，有早期间充质细胞表型的pPS来源的细胞用于筛选因子指导向具体细胞类型分化的能力，如肌细胞、软骨或脂肪细胞。

[0115] 本发明的其它筛选应用涉及试验药物化合物对肌骨骼组织维持或修复的效果。在一个例子中，具有成骨细胞特征的pPS来源的细胞用于筛选因子影响钙沉积的能力。可进行筛选是因为设计的化合物为对细胞有药理学作用，或因为设计有其它作用的化合物可对此组织类型的细胞有未想到的副作用。可用本发明的任何前体细胞或末端分化细胞进行筛选。

[0116] 读者一般参考标准教课书《药物研究的体外方法》(In vitro Methods in Pharmaceutical Research)，Academic Press,1997和美国专利5,030,015。评估候选药物化合物的活性一般包括结合本发明分化细胞和单独或与其它药物组合的候选化合物。研究者确定了归因于化合物的细胞形态、标记表型或功能活性的任何变化(与未处理细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后使化合物效果与观察到的变化相关。

[0117] 细胞毒性可在第一个例子中通过对细胞生存力、存活、形态和一些标记和受体表3
达的作用确定。药物对染色体DNA的效果可通过测量DNA合成和修复确定。[H]-胸苷或BrdU掺入，尤其在细胞周期外中的末预定时间或高于细胞复制所需水平，与药物效果一致。
不需要的效果也可包括通过中期扩展确定的姐妹染色单体交换的不正常比率。读者可参考A.Vickers(《药物研究的体外方法》，375-440页，Academic Press,1997)的进一步阐明。

[0118] 可用任何标准试验评估细胞功能的效果以观察间充质细胞或成骨细胞样细胞的表型或活性，如受体结合、基质沉积或钙加工-在细胞培养中或合适动物模型中。

[0119] 治疗用途

[0120] 本发明也提供间充质细胞或成骨细胞的使用以提高组织维持或肌骨骼系统的修复用于任何感觉需要，如代谢功能中的先天性缺陷、疾病情况的效果或显著损伤的结果。

[0121] 为确定用于治疗施用的细胞组合物的适宜性，细胞可首先在合适动物模型中试验。可在一个水平评估细胞体内存活和维持它们表型的能力。细胞组合物施用给免疫缺陷动物(如裸鼠，或表现出化学上免疫缺陷的动物或通过辐射)。再生长一段时间后收集组织，评估pPS来源的细胞是否仍存在。

[0122] 这可通过施用表达可检测标记(如绿色荧光蛋白或β半乳苷酶)和预标记(例如3
用BrdU或[H]-胸苷)的细胞，或通过随后检测组成型细胞标记(例如用人-特异抗体)来进行。评估被施用细胞的存在和表型可通过免疫组织化学或用人-特异抗体的ELISA，或者通过用引物的RT-PCR和根据公开的序列数据引起特异于人多核苷酸扩增的杂交条件。

[0123] 也可通过评估用间充质细胞群处理产生的恢复程度来确定适宜性。例如，骨和软骨的再生能力可用大鼠颅盖缺陷模型确定(美国专利6,200,606)。有确立的动物模型用于治疗兔、狗和猴中的下颌缺陷、上颌牙槽裂和骨切除裂(WO99/39724)。可用X-射线分析和其它技术监控骨沉积到模型损伤中。重构建的骨组织可用标准生物机械试验评估功能。参见Minamide等,Spine24:1863,1999;Takahashi等,J.Neurosurg.90(4suppl.):224,1999;Helm等,J.Neurosurg.88:354,1997。

[0124] 适当试验后，本发明的分化细胞可用于人患者或需要这种治疗的其它对象中的组织重构建或再生。细胞施用方式使它们移植或移到预期的组织部位并重构建或再生功能缺陷区域。这种治疗的医学指示包括再生肌骨骼缺陷、骨折修复、脊髓复原、安装假体和修复骨质疏松症相关的损伤。

[0125] 组合物施用取决于修复的肌骨骼部位。例如，骨生成可促进与手术过程重塑组织或插入裂片或者假体装置如髋取代物一致。在其它情况中，不需侵入的手术，可通过注射或(为修复脊柱)用可引导内诊镜施用组合物。

[0126] 本发明的间充质细胞和成骨细胞可以药物组合物形式提供，包括在充分无菌条件下制备的等渗赋形剂用于人类施用。对于药用制剂的一般原理，读者可参考《细胞治疗：干细胞移植、基因治疗和细胞免疫治疗》(CellTherapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy)，G.Morstyn&W.Sheridan 编 ,Cambridge University Press,1996；《造血干细胞细胞治疗》(Hematopoietic Stem Cell Therapy),E.D.Ball,J.Lister&P.Law，Churchill Livingstone,2000。选择细胞赋形剂和任何伴随的组合物成分根据用于施用的装置改变。

[0127] 如果需要，细胞制备可进一步包括或与补充生物活性因子共施用，如合成糖皮质激素像地塞米松、或骨形态发生蛋白如BMP-2或BMP-4。其它可能的伴随成分包括适合协助骨再生的钙或磷酸的无机源(WO00/07639)。如果需要，细胞制备可施用在载体基质或材料上以提供改进的组织再生。例如，材料可以是粒状陶瓷或生物聚合物如明胶、胶原、骨粘连蛋白、血纤蛋白原或骨钙蛋白。多孔基质可根据标准技术合成(如Mikos等 ,Biomaterials14:323,1993;Mikos 等 ,Polymer35:1068,1994;Cook 等 ,J.BioMed.Mater.Res.35:513,1997)。

[0128] 组合物可任选地包装在合适的容器中，根据书面说明用于所需目的，如再构建间充质细胞功能以改进一些肌骨骼畸形。

[0129] 提供下列例子作为发明具体实施方案的进一步非限制阐明。

[0130] 实施例

[0131] 实施例1：没有饲养细胞的胚胎干细胞繁殖

[0132] 未分化人胚胎干(hES)细胞的确立系维持在本质上没有饲养细胞的培养环境中。

[0133] 没有饲养细胞的培养用条件培养基维持，条件培养基用根据标准步骤++ ++(WO01/51616)分离的原代小鼠胚胎成纤维细胞制备。成纤维细胞通过用没有Ca /Mg 的PBS洗涤一次和在1.5-2mL胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中培养~5分钟从T150烧瓶中收集。成纤维细胞从烧瓶中分离后，它们在mEF培养基(DMEM+10%FBS)中收集。细胞以4000拉德照
2
射，计数并以~55,000个细胞cm-接种于mEF培养基(525,000个细胞/孔的6孔平板)。

[0134] 至少4小时后，培养基用SR交换，SR含ES培养基(80%剔除DMEM(Gibco BRL,Rockville MD)、20%剔除血清取代物(Gibco)、1%非必需氨基酸(Gibco)、1mML-谷氨酰胺(Gibco)和0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)，添加有4ng/mL重组人碱性成纤维2
细胞生长因子(bFGF;Gibco)。约0.3-0.4mL培养基以每cm平板表面积为条件。加入hES培养物前，条件培养基添加有4ng/mL人bFGF。

[0135] 培养ES细胞的平板包被 (Becton-Dickinson,Bedford MA)，这是通过2
在冷KO DMEM中稀释储存液~1:30、以0.75-1.0mL每9.6cm孔分散，且室温培养4小时或
4℃过夜。

[0136] HES培养物传代是通过在~200U/mL胶原酶IV中37℃培养约5-10分钟。通过用TMPipetman 在显微镜下取出单独集落或刮擦来收集细胞，接着在条件培养基中温和分离成小块，然后接种到包被的平板上。接种后约1周培养物汇合并可传代。培养物在这些条件下维持超过180天连续表现出ES样形态。

[0137] 通过用SSEA-4(1:20)、Tra-1-60(1:40)和Tra-1-81(1:80)的第一抗体培养样品孔进行免疫细胞化学，在剔除DMEM中37℃稀释30分钟。细胞用温和剔除DMEM洗涤并在2%多聚甲醛中固定15分钟，然后用PBS。细胞用PBS中的5%山羊血清室温培养30分钟，接着用FITC-结合的山羊抗小鼠IgG(1:25)(Sigma)培养30分钟。洗涤细胞，用DAPI染色并封固。

[0138] 也检测细胞的碱性磷酸酶表达，碱性磷酸酶是未分化ES细胞的标记。这是通过在腔式载玻片上培养细胞，4%多聚甲醛中固定15分钟然后用PBS洗涤进行的。细胞然后用碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame CA)室温黑暗培养1小时。载玻片封固前在100%乙醇中漂洗2-5分钟。

[0139] 图1显示组织化学检测的hES细胞上标记表达。如饲养细胞上的细胞所见，SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81和碱性磷酸酶由hES集落表达-但不由集落之间的分化细胞表达。

[0140] 未分化hES细胞标记的表达通过反转录酶PCR扩增分析。为放射性相对定量单独TM基因产物，根据厂商说明使用QuantumRNA Alternate18S内部标准引物(Ambion,Austin TX,USA)。简要地，确定具体引物对扩增的线性范围，然后用合适的alternate 18S引物:竞争物(competimer)的混合物共扩增以产生具有一致线性范围的PCR产物。
TM TM
AmpllTaq (Roche)加入到PCR反应前，根据厂商说明酶用TaqStart (ProMega)预培养。放射性PCR反应在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析、干燥和暴露于phosphoimage屏TM
(Molecular Dynamics)1小时。屏用Molecular Dynamics Storm860扫描且用ImageQuant 软件量化带强度。结果表示为掺入到hTERT或Oct-4带的放射性比例，按掺入到18s带的放射性标准化。此实验所用引物序列可在PCT出版物WO01/51616中找到。

[0141] 转录因子Oct-4通常在未分化hES细胞中表达且对分化负调节。维持在条件培养基中的上21天的细胞表达hTERT和Oct-4。端粒酶活性通过TRAP试验测量(Kim等,Science266:2011,1997;Weinrich等,Nature Genetics17:498,1997)。维持在无饲养细胞培养环境中的细胞培养超过40天后显示阳性端粒酶活性。

[0142] 无饲养细胞培养的未分化细胞的多能性确定是通过在悬浮培养中4天形成胚胎样小体，然后在聚鸟氨酸包被的平板上培养7天。免疫细胞化学显示与神经元和心肌细胞谱系一致的染色模式，以及染色α-胎蛋白的细胞，α-胎蛋白是内胚层谱系的标记。也测试未分化细胞通过肌肉内注射到SCID小鼠形成畸胎瘤的能力。所得肿瘤78-84天后切除。来自所有三个胚层的细胞类型用组织学分析鉴定。

[0143] 实施例2：分化细胞系的确立

[0144] 胚胎样小体如下产生。通过在1mg/mL胶原酶中培养5-20分钟收集汇合的hES细胞单层培养物，细胞从平板上刮下。然后细胞分离成块并平板培养于非粘附细胞培养平板(Costar)，培养基包括80%KO(“剔除”)DMEM(Gibco)和20%非热灭活FBS(Hyclone)，添加有1%非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇。细胞以1:1或1:2比例接种于2mL培养基每孔中(6孔平板)。通过添加2mL培养基/孔每隔一天喂饲Ebs当培养基体积超过4mL/孔时，收集EBs并重悬浮于新鲜培养基中。悬浮4-8天后，EBs平板培养在底物上。

[0145] 分化细胞系通过收集胚胎样小体来源的细胞并使它们进一步分化来确立。通过在PBS中的2mg/mL II型胶原酶中37℃培养30分钟收集细胞。细胞分离、离心、重悬浮于分化培养基中并平板培养于6孔平板。增殖细胞传代于hEF培养基中(90%DMEM、10%热灭活FBS、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺)，每2-3天喂饲。两次传代后，细胞群与成纤维细胞的形态特征相似。此细胞系命名为HEF1。

[0146] 转导亚细胞群用于表达人端粒酶反转录酶(hTERT)。这伴随着用反转录病毒构建物pBABE puro hTERT感染，构建物含由MoLV LTR驱动的hTERT编码序列和由SV40早期启6
动子驱动的嘌呤霉素-抗性基因。生长培养基用含5mL反转录病毒储存液(1×10pfu/mL)和4μg/mL polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)的混合物替换，
37℃培养。8小时后，加入另外的5mL反转录病毒/polybrene混合物，细胞37℃培养。第二天，去除反转录病毒/polybrene混合物并用新鲜生长培养基替换。下一天，培养基用添加有0.5微克/mL嘌呤霉素的生长培养基替换。细胞以1:4的比例在令嘌呤霉素培养基中约一周一次分裂8周，然后测试细胞的端粒酶活性。

[0147] 图2(A组)显示端粒化HEF1细胞系的形态。B组(下面)显示TRAP试验中测量的端粒酶活性。用hTERT表达盒转导的细胞转导后20天或65天显示阳性端粒酶活性。未转导的细胞系或用对照载体转导的细胞没有显示端粒酶活性。HTERT-转导的HEF1细胞和用对照载体转导的细胞约每2天一次加倍直到第38天对照细胞停止分裂。HTERT-转染细胞以恒定生长速率连续增殖超过60天(30次加倍)。

[0148] ES细胞生长培养基用实施例8中的条件，使用6000拉德照射的HEF1细胞并以4 -2
~4.1到5.5×10个细胞cm 接种。测试培养基支持培养于底物上的H9hES细胞系生长的能力。用HEF1条件培养基维持hES细胞超过4次传代，表现出未分化ES细胞形态，且维持HTERT和Oct-4的表达。

[0149] 实施例3：成骨细胞样细胞的进一步分化

[0150] 如上所述，人ES细胞(H1细胞系，传代30次)维持在无饲养细胞的条件中。为用于此实验，hES细胞以~1×105cm-2接种于mEF条件培养基中的上。端粒化HEF13 -2
细胞以3.1×10cm 平板培养于含10%FBS、1%非必需氨基酸和2mML-谷氨酰胺的DMEM中。
正常人间充质干细胞(hMSC)获得自BioWhittaker Inc.,MD(Cambrex公司的子公司)。根据厂商说明它们维持在MSC生长培养基(BioWhittaker Part#PT-3001)中。BJ5ta成纤维细胞系(Bodnar等,Science279:349,1998)维持在从1:3M199/DMEM中的10%FBS制成的标准培养基中。

[0151] 最后一次传代后两天，各培养基用成骨细胞诱导培养基(OIM)置换以诱导分化。OIM以MSC生长培养基(ClonTech目录号#PT-3238)(美国专利5,486,359)为基础，培养基添加有0.1μM地塞米松、5μM抗坏血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸和100ng/mL BMP-4。
细胞每2-3天喂饲新鲜OIM。

[0152] 在OIM中11天后，所有细胞显示细胞形态的变化。HEF1细胞、hMSC和BJ细胞从纺锤形状变成立方形，一些细胞变得更扁平。hES细胞显示混合分化群的不同形态。

[0153] 细胞在含2%多聚甲醛的PBS中中固定20分钟，用PBS洗涤并分析成骨细胞标记。碱性磷酸酶(AP)用Vector底物(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)检测。AP的表达明显定位于分化H1细胞以及HEF1、BJ和hMSC细胞的细胞簇。

[0154] 通过成骨细胞、胶原-1和骨钙蛋白产生基质蛋白，通过免疫染色检测。用100%乙醇处理2分钟使培养物通透性增加。PBS洗涤后，培养物用含5%正常山羊血清的PBS培养2小时，然后用第一兔抗体抗胶原-1(1:10,Monosa目录号#P5041)或骨钙蛋白(1:50,Biomedical Technologies Inc.目录号#13T593)。染色用FITC-标记的第二山羊抗兔免疫球蛋白(1∶100,Southern Biotechnology Associate Inc.目录号#4050-02)显现。

[0155] 图3显示结果。A和B组显示标记骨钙蛋白和胶原-1的免疫细胞化学。C组显示碱性磷酸酶活性染色。这些特征是成骨细胞谱系细胞的特征。

[0156] 这些数据与体外经受合适分化操作时hES细胞和HEF1细胞具有产生成骨细胞能力的假设一致。

[0157] 要理解的是本公开所述发明的一些改变对本领域技术人员是常规最佳化的事情，且可不级离发明精神或所附权利要求书范围完成。

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来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞

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