发明背景

成纤维细胞生长因子(FGF)家族包括至少9个不同的成员(Basilico 等，Adv.Cancer Res.59：115-165，1992和Fernig等，Prog.Growth Factor Res.5(4)：353-377，1994)，它们一般作为广谱细胞类型的促有 丝分裂剂。例如碱性FGF(即FGF-2)体外对内皮细胞、血管平滑肌细 胞、成纤维细胞是促有丝分裂的，并且一般用于中胚层或神经外胚层 起源的细胞，包括心肌和骨骼肌细胞(Gospodarowicz等，J.Cell.Biol. 70：395-405，1976；Gospodarowicz等，J.Cell.Biol.89：568-578， 1981和Kardami，J.Mol.Cell.Biochem.92：124-134，1990)。在体内 已证明bFGF在鸟类心脏的发育中起作用(Sugi等，生物学发展， 168：567-574，1995和Mima等，美国国家科学院院报92：467-471， 1995)，并在狗中诱导冠状侧枝的发育(Lazarous等，循环，94：1074- 1082，1996)。此外，证明FGF家族的许多成员具有非促有丝分裂的活 性。与酸性和/或碱性FGF相关的非增生性活性包括：增加组织纤溶酶 的激活物的内皮释放、促进细胞外基质的合成、对内皮细胞的趋化 性、在心肌细胞中诱导胎儿收缩基因的表达(Parker等，临床研究杂志 85：507-514，1990)并增强对垂体激素的反应性(Baird等，细胞生理学 杂志5：101-106，1987)。

FGF家族的几个成员没有信号序列(aFGF、bFGF和可能的FGF- 9)，因此预期不能分泌。此外FGF家族的几个成员具有迁移到细胞核 的能力(Friesel等，美国实验生物学会联合会9：919-925，1995)。根据 结构的相似性，FGF家族的所有成员都结合肝素。结构的同源性贯穿物 种间，表明它们结构/功能关系的保守(Ornitz等，生物化学杂志 271(25)：15292-15297，1996)

有四个已知的细胞外FGF受体(FGFR)，它们都是酪氨酸激酶。一般 情况下，FGF家族成员与所有已知的FGFR结合，然而特异的FGF与具 有更高亲和度的特异受体结合。FGF家族内特异性的另一形式是胚胎 发育过程中配体和它们的受体的空间及时间表达。证据表明由于它们 的肝素结合亲和性限制了从释放位点的扩散，FGFs最有可能只能以自 分泌和/或旁分泌的方式作用(Flaumenhaft等，细胞生物学杂志， 111(4)：1651-1659，1990)。碱性FGF缺少信号序列，因而只限制于旁分 泌或自分泌的作用方式。已推测碱性FGF在细胞内储藏，一旦组织损伤 就释放出来。已表明碱性FGF具有两个不同于肝素结合位点的受体结 合区域(Abraham等，欧洲分子生物学组织杂志5(10)：2523-2528， 1986。)

已证明FGFR-3在骨骼生长中起作用。FGFR-3纯合隐性小鼠(-/ -)导致出生后骨骼异常(Colvin等，Nature Genet.12：309-397，1996和 Deng等，细胞84：911-921，1996)。突变表型表明在正常小鼠中， FGFR-3在调控骨生长面区域软骨细胞分裂中起作用(Goldfarb，细胞 因子和生长因子评论7(4)：311-325，1996)。骨生长面中FGFR-3的配 体还未得到鉴定。

尽管已鉴定了四种FGFR，并表明四种都有功能性剪接变体，但新 FGF受体存在的可能是有希望的。例如还未鉴定FGF-8a同种型的受 体(MacArthur等，病毒学杂志，69(4)：2501-2507，1995)。

FGF-8是最初作为雄激素诱导的促有丝分裂剂从乳腺癌细胞分离的 FGF家族的一员。已定位在人染色体10q25-q26(White等，基因组 30：109-111，1995)。FGF-8参与胚胎四肢发育(Vogel等，发育， 122：1737-1750，1996和Tanaka等，Current Biology 5(6)：594-597， 1995)。胚胎发育过程中FGF-8在心脏、泌尿生殖和神经组织中的表 达表明它在这些组织的发育中起作用(Crossley等，发育121：439-451， 1995)。有一些证据表明尖头并指(趾)畸形，以尖头和有蹼的手指或脚趾 为特征的先天疾病，与FGF-8的点突变有关(White等，1995，ibid)。

与其它已知只具有三个外显子的FGF相比，FGF-8有五个外显子。 FGF-8的头三个外显子对应于其它FGF的第一个外显子(MacArthur 等，发育121：3603-3613，1995)。与产生8个FGF-8同种型的鼠基因 相比，对应FGF-8的人基因编码四个N-末端区域有差异的同种型： FGF同种型a、b、e和f；(Crossley等，1995，ibid.)。人FGF-8a和FGF -8b与鼠蛋白有100％同源性，FGF-8e和FGF-8f蛋白在人和小鼠之 间具有98％的同源性(Gemel等，基因组35：253-257，1996)。

在美国，心脏病是死亡的主要原因，达到总死亡的30％。在美国每年 因心肌梗死(MI)有750000人入院，超过5百万人被诊断为冠心病。MI 的危险因素包括糖尿病、高血压、身体肥胖、吸烟、血浆中高水平的 低密度脂蛋白或遗传性易患病的体质。

心脏增生是心肌细胞增殖的增加，并已表明在人和大鼠中随正常老化 (Olivetti等，J.Am.Coll.Cardiol.24(1)：140-9，1994和Anversa等， 循环研究67：871-885，1990)及在大鼠儿茶酚胺诱导的心肌病 (Deisher等，美国心血管病理杂志5(1)：79-88，1994)中发生。肌细胞 的增加是起源于一些前体细胞，还是进一步终未分化细胞类型增殖的结 果仍在争论中。

然而，因为梗死和其它心肌坏死的原因是不可修复的，所以心脏增生 的正常机制不能补偿大量的肌细胞死亡，仍需要能够促进增生并最终 使心脏功能复原的外源因子。

骨重建是动力学过程，由此来保持组织物质和骨骼结构。此过程是骨 再吸收和骨形成之间的平衡，并认为两种细胞类型起重要作用。这些细 胞是成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞合成和储存基质以形成新骨。成 骨细胞和破骨细胞的活性受许多因子，系统的和局部的，包括生长因子 的调节。

尽管局部和系统因子之间的相互作用还未完全阐明，但一致认为生长 因子在正常骨骼重建和骨折修复的调节中起关键作用。在骨中已鉴定 的一些生长因子包括：IGF-I、IGF-II、TGF-β1、TGF-β2、 bFGF、aFGF、PDGF和骨形态发生蛋白的家族(Baylink等，骨无机物 研究杂志8(增刊2)：S565-S572，1993)。

当骨再吸收超过骨形成时，在骨中产生净丢失，骨折的倾向增加。骨 形成减少与老化与某些病理状态相关。单在美国，每年大约有1.5百万归 因于骨疏松的骨折。这些骨折对患者生活质量的影响是巨大的。在美 国除去长期护理费用，健康治疗系统的相关费用估计每年是5-10亿美 元。

生长因子影响骨重建的其它治疗应用包括例如治疗需要成骨细胞增 殖而愈合的损伤如骨折和刺激间质细胞增殖及膜内骨的合成，这些已证 明为骨折修复的表现(Joyce等，第36届年会，矫形研究学会，2月5-8日， 1990年，New Orleans，LA)。

本发明提供这样的用于这些和其它用途的多肽，这些用途对于本领域 技术人员可从本文所述的显而易见。

发明概述

一方面，本发明提供编码成纤维细胞生长因子(FGF)同系物多肽的分 离的多核苷酸分子，选自：a)包含如SEQ ID NO：1的82位至621位核苷 酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位变体；c)编码与 SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸残基的氨基酸序 列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO：6的 82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子。

在一实施方案中，分离的多核苷酸分子包含如SEQ ID NO：1的1位至 621位核苷酸所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：6的1位至621位核苷酸 所示的核苷酸序列。

在另一实施方案中，分离的多核苷酸分子包含如SEQ ID NO：1的 82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供含有下列可操作连接元件的表达载体：转 录启动子；DNA片段，选自：a)包含如SEQ ID NO：1的82位至621 位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位变体；c) 编码与SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸残基的 氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO：6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及 转录终止子。

另一本发明提供已导入表达载体的培养细胞，表达载体包含下列 可操作连接元件：转录启动子；DNA片段，选自：a)包含如SEQ ID NO：1 的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a) 的等位变体；c)编码与SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨 酸)氨基酸残基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和 d)包含如SEQ ID NO：6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的 多核苷酸分子；及转录终止子，其中所述细胞表达DNA片段编码的多 肽。

另一方面，本发明提供合成FGF同系物多肽的方法，包括：培养 已导入表达载体的细胞，表达载体包含下列可操作连接元件：转录启 动子；DNA片段，选自：a)包含如SEQ ID NO：1的82位至621位核 苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位变体；c)编 码与SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸残基的氨 基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO：6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及 转录终止子，其中所述细胞表达DNA片段编码的FGF同系物多肽；并 回收FGF同系物多肽。

另一方面，本发明提供分离的FGF同系物多肽，选自：a)包含如 SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至175位(甲硫氨酸)残基所示的氨基酸 序列的多肽分子；b)(a)的等位变体；和c)与SEQ ID NO：2的28位 (谷氨酸)至175位(甲硫氨酸)氨基酸残基至少60％相同的多肽分子。

另一方面，本发明提供分离的FGF同系物多肽，选自：a)包含如 SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至196位(赖氨酸)残基所示的氨基酸序 列的多肽分子；b)(a)的等位变体；和c)与SEQ ID NO：2的28位(谷 氨酸)至196位(赖氨酸)氨基酸残基至少60％相同的多肽分子。

在另一实施方案中，本发明提供分离的FGF同系物多肽，选自： a)包含如SEQ ID NO：2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)残基所示 的氨基酸序列的多肽分子；b)(a)的等位变体；和c)与SEQ ID NO：2 的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸残基至少60％相同的多肽分 子。

在其它实施方案中，本发明进一步提供包含信号序列的FGF同系 物多肽。

在另一实施方案中，本发明进一步提供包含如SEQ ID NO：2的1 位(甲硫氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸残基所示的信号序列的FGF同 系物多肽。

本发明也提供了与药学上可接受的载体结合的纯化的FGF同系物 多肽的药物组合物。

另一方面，本发明提供与包含如SEQ ID NO：2的1位(甲硫氨酸) 至207位(丙氨酸)残基所示的氨基酸序列的多肽分子表位结合的抗 体。

在另一实施方案中，本发明提供与包含如SEQ ID NO：2的28位(谷 氨酸)至196位(赖氨酸)残基所示的氨基酸序列的多肽分子结合的抗 体。

在另一方面，本发明提供促进肌细胞或肌细胞前期细胞增殖的方 法，包括向需要其的哺乳动物以足够在所述哺乳动物中使肌细胞或肌 细胞前期细胞数量临床上显著增加的量施用FGF同系物多肽。

在另一实施方案中，本发明提供了促进肌细胞或肌细胞前期细胞 增殖的方法，其中肌细胞或肌细胞前期细胞是心肌细胞或心肌细胞前 期细胞。

在另一方面，本发明提供离体刺激肌细胞前期细胞或肌细胞的方 法，包括与缺少FGF同系物多肽时培养的心脏组织肌细胞前期细胞或 肌细胞相比，在存在FGF同系物多肽时将心脏组织细胞与足以使培养 的心脏组织细胞中肌细胞前期细胞或肌细胞数量增加的用量的FGF同 系物多肽一起培养。

在另一实施方案中，本发明提供了离体刺激肌细胞前期细胞或肌 细胞的方法，其中肌细胞或肌细胞前期细胞是心肌细胞或心肌细胞前 期细胞。

在另一方面，本发明提供了将药剂或药物选择性转移至心脏组织 的方法，包括：将含有FGF同系物多肽的第一个分子与含有药剂或药 物的第二个分子连接以形成嵌合体；并且将此嵌合体施用给心脏组 织。 附图简述

图1和图2说明人成纤维细胞生长因子同源因子1(FHF-1)、人 肌细胞活化因子(FGF-10)、成纤维细胞生长因子同源因子4(FHF- 4)、人成纤维细胞生长因子同源因子2(FHF-2)、人成纤维细胞生 长因子同源因子3(FHF-3)、人FGF-4、人FGF-6、人FGF-2(碱性)、 人FGF-1(酸性)、人角质化细胞生长因子2(KGF-2)、人角质化细胞 生长因子前体(FGF-7)、人zFGF-5、人FGF-8、人FGF-5、人FGF -9和人FGF-3的多序列比较。“*”表示保守氨基酸；“：”表示保 守的氨基酸置换；而“·”表示更不严谨的保守的氨基酸置换。

图3是家族内相似性矩阵，说明人FGF-5、人FGF-6、人FGF- 7、人FGF-8、人FGF-9、人zFGF-5、人FGF-10、人FGF-1、人 FHF-1、人FGF-2、人FHF-2、人FHF-4、人FGF-3、人KGF-2、 人FHF-3和人FGF-4之间的相同百分率。 发明详述

术语“ortholog”(或“种同系物”)表示从一个种获得的蛋白或 多肽，它与不同种来源的相似多肽或蛋白有同源性。

术语“paralog”表示来自给定物种的多肽或蛋白，它与来自相同种 的不同多肽和蛋白有同源性。

术语“等位变体”表示占据相同染色体位点的基因的两种或多种可 互换形式的任一种。等位变体通过突变自然产生，并在种群内导致表型 多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或编码含有改 变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体此处也用于表示由基因的等位 变体编码的蛋白。

术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，包含与提供用于转录 的其它片段可操作连接的编码目的多肽的片段。这样的其它片段可以 包括启动子和终止子序列，并且可以选择性包括一个或多个复制起点、 一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸信号等。表达载体一般 起源于质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。

术语“分离的”，当用于多核苷酸分子时，表示多核苷酸已从其天然 的遗传环境中取出，因而不含有其它外源或不需要的编码序列，并且是 适合于遗传工程蛋白合成系统中使用的形式。如此分离的分子是那些 与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的 DNA分子不含有正常与它们结合的其它基因，但可以包含天然存在的5′ 和3′非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定很明显是本领域常规 技术之一(见例如Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。当用于蛋 白时，术语“分离的”表示发现蛋白处于非天然环境的状态，如从血液 和动物组织分离。以优选的形式，分离蛋白基本上不含其它蛋白，尤其 是动物起源的其它蛋白。优选提供高度纯化形式，即大于95％纯度，更 优选地大于99％纯度的蛋白。

术语“可操作连接的”当用于DNA片段时表示对片段进行安排使它 们的功能与预期目的相协调，如转录在启动子起始并延伸通过编码片段 至终止子。

术语“多核苷酸”指从5′末端读至3′末端的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸碱基的单链和双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可以 从天然来源中分离、体外合成或从天然和合成分子的组合制备。

术语“多核苷酸分子的互补”表示与参考序列相比具有互补碱基 序列和反方向的多核苷酸分子。如序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。

术语“简并核苷酸序列”表示包含一个或多个简并密码子的核苷 酸序列(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)。简并密码子含有不同 的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都 编码Asp)。

术语“启动子”表示含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA 序列的基因部分。启动子序列一般，但并不总是，位于基因的5’非编 码区。

术语“分泌信号序列”表示编码作为更大多肽的组成部分指导更 大的多肽通过合成此多肽的细胞分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA 序列。在通过分泌通路传递的过程中通常对更大的多肽进行切割以除 去分泌肽。

术语“受体”表示与生物活性分子(即配体)结合并在细胞上调节 配体效应的细胞相关蛋白。膜结合受体的特征在于多结构域结构，包 括细胞外配体结合结构域和一般参与信号传导的细胞内效应器结构 域。配体和受体结合导致受体构象改变，引起效应器结构域和细胞内 其它分子间的相互作用。此相互作用继而引起细胞代谢的变化。和受 体-配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷 酸化作用、环AMP合成的增加、细胞钙的动员、膜脂的动员、细胞粘 附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。大多数核受体也表现为多结构域结 构，包括氨基末端、反式激活结构域、DNA结合结构域和配体结合结 构域。一般情况下，受体可以是膜结合的、细胞质或核的；单体的(如 促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、 生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞 生成素受体和IL-6受体。

术语“互补/反互补对”表示在适宜条件下形成非共价连接、稳定 对的非相同组分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白链霉 素)是互补/反互补对的典型成员。其它典型互补/反互补对包括受体/配 体对、抗体/抗原(或半抗原或抗原决定基)对、正义/反义多核苷酸对 等。在需要互补/反互补对随后解离的地方，互补/反互补对优选地具有小 于109M-1结合亲和性。

本发明部分基于编码与FGF-8同源的成纤维细胞生长因子(FGF)同 系物多肽的新DNA序列的发现。对应于此新DNA的mRNA的组织分布 分析表明其表达在胎儿心脏组织和成人心脏组织中最高，接下来在胎儿 肺、骨骼肌、平滑肌组织如小肠、结肠和气管中有明显但降低的表达 水平。FGF同系物多肽已命名为zFGF-5。

通过检索生长因子的EST数据库，初步鉴定了本发明的新zFGF-5多 肽。发现了一个单独EST序列并预测与FGF家族相关。由全长cDNA编 码的新FGF同系物多肽含有具结构式：CXFXEX{6}Y的模式，其中X是 任意氨基酸，X{}是大于1的X氨基酸的数目。此结构域在FGF家族所有 已知成员中存在并且是这些蛋白特有的。

zFGF-5cDNA的核苷酸序列描述于SEQ ID NO：1，所推测的氨基酸 序列描述于SEQ ID NO：2。当将SEQ ID NO：2的28位(Glu)至181位 (Gln)氨基酸残基与FGF-8的相应区域比较时(见图1和2)，匹配的和推 测的氨基酸序列有大约56％的相同性。

此处描述的多核苷酸编码的新多肽含有在FGF家族所有成员中都存 在的CXFXE{6}Y结构域。CXFXE{6}Y结构域是高度保守的。具有 CXFXEX{6}Y结构域的保守氨基酸序列包括人成纤维细胞生长因子同 源因子1(FHF-1；Smallwood等，美国国家科学院院报93：9850- 9857，1996)、人肌细胞活化因子(FGF-10；HSU76381，GENBANK标 识符，http：//www.nebi.nlm.nih.gov/)、人成纤维细胞生长因子同源因 子4(FHF-4；Smallwood等，1996，ibid.)、人成纤维细胞生长因子同 源因子2(FHF-2；Smallwood等，1996，ibid.)、人成纤维细胞生长因 子同源因子3(FHF-3；Smallwood等，1996，ibid.)、人FGF- 4(Basilico等，肿瘤研究进展59：115-165，1992)、人FGF-6(Basilico 等，1992，ibid.)、人FGF-2(碱性；Basilico等，1992，ibid.)人FGF- 1(酸性；Basilico等，1992，ibid.)人角质形成细胞生长因子2(KGF-2； HSU67918 GENBANK标识符，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、人角 质形成细胞生长因子前体(FGF-7；Basilico等，1992，ibid.)人zFGF -5、人FGF-8(Gemel等，基因组35：253-257，1996)、人FGF- 5(Basilico等，1992，ibid.)、人FGF-9(Miyamoto等，分子细胞生物学 13：4251-4259，1993)和人FGF-3(Basilico等，1992，ibid.)

编码zFGF-5多肽的cDNA(SEQ ID NO：1)的分析揭示了编码207个 氨基酸的开放阅读框架(SEQ ID NO：2)，此开放阅读框架包含180个氨 基酸(SEQ ID NO：2的28位至207位残基)的成熟多肽。zFGF-5和其它 已知的FGFs的多重序列对比揭示对应于SEQ ID NO：2的127位(Cys)至 138位(Tyr)氨基酸残基的有高百分率相同性的一段，并显示于图中。几 个FGF家族的成员不含有信号序列。

FGF家族成员的特征在于肝素结合结构域。已在SEQ ID NO：2的148 位(Gly)至169位(Gln)氨基酸残基的区域中鉴定了推测的zFGF-5肝素 结合结构域。推测一旦FGF配体与细胞表面肝素硫酸蛋白聚糖结合， 就启动受体介导的信号。根据它们的结构和功能，可以将许多FGF家 族成员放入两个相关家族之一。aFGF和bFGF含有由两个可变长度内 含子分开的三个外显子。FGF-8含有五个外显子，头三个对应于 aFGF和bFGF的第一个外显子。所有已知FGF家族成员得到剪接形成 单一多肽。

SEQ ID NO：6是简并多核苷酸序列，包含能编码SEQ ID NO：2的 zFGF-5多肽(氨基酸1或28至207)的所有多核苷酸。因此，本发明包括 SEQ ID NO：6的1位或82位至621位编码zFGF-5多肽的核苷酸。本发 明也包括编码成熟zFGF-5分子的如上述与SEQ ID NO：1相关从ESQ ID NO：6相似区域形成的片段和融合体，其中SEQ ID NO：6的82位至 621位核苷酸对应于SEQ ID NO：1的82位至621位核苷酸。

SEQ ID NO：6中的符号总结在下面的表1中。

                         表1 核苷酸       分辨率          互补        分辨率   A            A              T            T   C            C              G            G   G            G              C            C   T            T              A            A   R           A|G             Y           C|T   Y           C|T             R           A|G   M           A|C             K           G|T   K           G|T             M           A|C   S           C|G             S           C|G  C|G          A|T             W           A|T   H          A|C|T            D          A|G|T   B          C|G|T            V          A|C|G   V          A|C|G            B          C|G|T   D          A|G|T            H          A|C|T   N         A|C|G|T           N         A|C|G|T

在下面表2中列出了SEQ ID NO：6中所使用的简并密码子，包括 对于给定氨基酸的所有可能的密码子。

                          表2 氨基酸    字母    密码子                      简并密码子   Cys      C      TGC TGT                     TGY   Ser      S      AGC AGT TCA TCC TCG TCT     WSN   Thr      T      ACA ACC ACG ACT             ACN   Pro      P      CCA CCC CCG CCT             CCN   Ala      A      GCA GCC GCG GCT             GCN   Gly      G      GGA GGC GGG GGT             GGN   Asn      N      AAC AAT                     AAY   Asp      D      GAC GAT                     GAY   Glu      E      GAA GAG                     GAR   Gln      Q      CAA CAG                     CAR   His      H      CAC CAT                     CAY   Arg      R      AGA AGG CGA CGC CGG CGT     MGN   Lys      K      AAA AAG                     AAR   Met      M      ATG                         ATG   Ile      I      ATA ATC ATT                 ATH   Leu      L      CTA CTC CTG CTT TTA TTG     YTN   Val      V      GTA GTC GTG GTT             GTN   Phe      F      TTC TTT                     TTY   Tyr      Y      TAC TAT                     TAY   Trp      W      TGG                         TGG   Ter      .      TAA TAG TGA                 TRR Asn|Asp    B                                  RAY Glu|Gln    Z                                  SAR   Any      X                                  NNN   Gap      -      ---

本领域普通技术人员将会理解在确定简并密码子，代表编码每一 氨基酸的所有可能密码子时引入的某些错读。例如，丝氨酸(WSN)的简 并密码子在某些情况下编码精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的简并密码子 在某些情况下编码丝氨酸(AGY)。相似的关系在编码苯丙氨酸和亮氨酸 的密码之间也存在。因此，简并序列所包含的某些多核苷酸可能有一 些不正确的氨基酸，但本领域普通技术人员参考SEQ ID NO：2的氨基 酸序列可以容易地鉴定这些错误的序列。

zFGF-5中高度保守的氨基酸可以用作鉴定新家族成员的工具。可 以使用保守的CXFXEX{6}Y结构域EST数据库中的鉴定新家族成员。 在另一方法中使用多核苷酸探针和杂交方法，从许多组织来源得到的 RNA可以用于制备cDNA文库中探测这些文库中新的家族成员。具体 地，可以使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增从对应于SEQ ID NO：2的127位(Cys)至138位(Tyr)氨基酸残基的序列设计的编码高简并 DNA引物的序列。

在本发明优选的实施方案中，分离的多核苷酸将作为探针，并在严格 条件下与SEQ ID NO：1的相似大小的区域或与其互补的序列杂交。一 般来说，在规定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特异序列的热熔 点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列和完全匹配的探针杂交时的温度 (在规定的离子强度和pH下)。典型的严格条件是pH7时盐浓度是至少 约0.02M，并且温度是至少约60℃

如前面所指出，本发明的分离的多核苷酸包括DNA和RNA。分离 DNA和RNA的方法是本领域内熟知的。一般优选从心脏组织中分离 RNA，尽管使用来自其它组织的RNA或分离基因组DNA也可以制备 DNA。使用盐酸胍抽提接着通过CsCl梯度离心分离可以制备总 RNA(Chirgwin等，生物化学，18：52-94，1979)。使用Aviv和Leder的 方法(美国国家科学院院报，69：1408-1412，1972)从总RNA制备 Poly(A)+RNA。使用已知的方法从Poly(A)+RNA制备互补 DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR鉴定和分离编码zFGF-5多肽 的多核苷酸。

本发明进一步提供来自其它物种的相似多肽和多核苷酸(Orthologs或 Paralogs)。尤其感兴趣的是来自其它哺乳物种包括小鼠、大鼠、猪、 羊、牛、狗、猫、马和其它灵长类蛋白的zFGF-5多肽。人序列的 Paralog的鉴定尤其令人感兴趣，因为尽管已鉴定了小鼠FGF-8的8个 Paralog，但仅有4个人Paralogs是已知的。使用本发明提供的信息和组 合物结合传统克隆技术可以克隆人Paralog或人蛋白的物种同系物。例 如使用从表达此蛋白的组织或细胞类型获得的mRNA可以克隆cDNA。 通过用从此处公开的序列设计的探针探测Northern印迹可以鉴定 mRNA的适当来源。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然 后可以一系列通过方法如通过用完整或部分人cDNA或用基于公开序列 的一套或多套简并探针探查来分离编码的cDNA。用从此处公开的序列 设计的引物，使用聚合酶链反应或PCR(Mullis，美国专利4 683 202)也可 以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞， 用抗zFGF-5的抗体检测目的cDNA的表达。相似的技术也可以应用于 基因组克隆的分离。

本领域技术人员将意识到SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列 代表人zFGF-5基因的单一等位基因和多肽，预期会发生等位变体和选 择性的剪接。根据标准方法通过探查来自不同个体的cDNA或基因组文 库可以克隆等位变体。显示于SEQ ID NO：1的DNA序列的等位变体， 包括那些含有沉默突变的变体和那些突变导致氨基酸序列变化的变体， 在本发明的范围之内，SEQ ID NO：2的等位变体的蛋白也在本发明的范 围之内。

本发明也提供了与SEQ ID NO：2的多肽及它们的物种同系物 /ortholog基本上同源的分离的zFGF-5多肽。术语“基本上同源”此 处用于表示与SEQ ID NO：2所示的序列或它们的Ortholog或Paralog有 50％、优选60％、更优选至少80％序列相同的多肽。这样的多肽与 SEQ ID NO：2或其Ortholog或Paralog将更优选至少90％相同，并且最 优选95％或更多的相同。通过传统的方法确定序列相同百分率。见例 如Altschul等，Bull.Math.Bio.，48：603-616，1986和Henikoff和 Henikoff，美国国家科学院院报，89：10915-10919，1992。简单地 说，使用缺口开放补偿(gap opening penaty)10、缺口延伸补偿(gap extension penalty)1比较两个氨基酸序列以最优化序列匹配，3并且 Henikoff和Henikoff(ibid.)的“blosum 62”评分矩阵在表3中表示(用 标准单字母符号表示氨基酸)。然后按以下公式计算相同百分率： 表3    A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V A  4 R -1  5 N -2  0  6 D -2 -2  1  6 C  0 -3 -3 -3  9 Q -1  1  0  0 -3  5 E -1  0  0  2 -4  2  5 G  0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 H -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 K -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5 M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 S  1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4 T  0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7 V  0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4

使用上述比率用相似方法测定多核苷酸分子的序列相同性。

基本上同源的蛋白和多肽以一个或多个氨基酸置换、删除或添加 为特征。优选次要性质的这些改变，即保守氨基酸的置换(见表4)和 不显著影响蛋白或多肽折叠或活性的其它置换；小的删除，一般1至 30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸如氨基末端甲硫氨酸残 基、长达20-25个残基的小接头肽或有助于纯化的小延伸(亲和标签) 如多组氨酸臂、蛋白质A(Nilsson等，欧洲分子生物学组织杂志， 4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法198：3，1991)、谷胱甘肽S 转移酶(Smith和Jahnson，基因，67：31，1988)、麦芽糖结合蛋白 (Kellerman和Ferenci，酶学方法，90：459-463，1982；Guan等，基 因67：21-30，1987)或其它抗原表位或结合结构域。见Ford等，蛋 白表达和纯化，2：95-107，1991，在此引用作为参考。编码亲和标 签的DNA可以从商业供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ； New Engl and Biolabs，Beverly，MA)获得。

                            表4

                      保守的氨基酸替换   碱性的：                精氨酸

                      赖氨酸

                      组氨酸   酸性的：                谷氨酸

                      天冬氨酸   极性的：                谷氨酰胺

                      天冬酰胺   疏水的：                亮氨酸

                      异亮氨酸

                      缬氨酸

芳香族的：            苯丙氨酸

                      色氨酸

                      酪氨酸   小的：                  甘氨酸

                      丙氨酸

                      丝氨酸

                      苏氨酸

                      甲硫氨酸

除了20个标准氨基酸，本发明的蛋白质也可以含有非天然存在的 氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反-3-甲基脯氨酸、 2，4-甲烷脯氨酸、顺-4-羟脯氨酸、反-4-羟脯氨酸、N-甲基- 甘氨酸、别-苏氨酸，甲基苏氨酸，羟乙基-半胱氨酸、羟乙基高半 胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、叔亮氨酸、正 缬氨酸、2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨、4-重氮苯丙氨酸、4- 氟苯丙氨酸、4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异 缬氨酸和α-甲基丝氨酸。将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白的几 种方法在本领域中已知。例如，可以使用其中使用化学氨酰化抑制 tRNA抑制无义突变的体外系统。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法在本 领域中已知。在含有大肠杆菌S30提取液和商业可获得的酶及其它试 剂的无细胞体系中进行含有无义突变的质粒的转录和翻译。通过层析 纯化蛋白。见例如Robertson等，J.Am.Chem.Soc.113：2722，1991； Ellman等，酶学方法202：301，1991；Chung等，科学259：806-09， 1993；和Chung等，美国国家科学院院报90：10145-49，1993)。 在第二种方法中，通过微注射突变的mRNA和化学氨酰化抑制tRNA在 非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，生物化学杂志271： 19991-98，1996)。在第三种方法中，在不含要置换的天然氨基酸和 含有所需要非天然存在的氨基酸(如2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙 氨酸、4-重氮苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细 胞。将非天然存在的氨基酸在其天然对应物位置掺入蛋白中。见Koide 等，生物化学，33：7470-76，1994。通过体外化学修饰可以将天然 存在的氨基酸残基转换成非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱 变结合以进一步扩展替换的范围(Wynn和Richards，蛋白质科学，2： 395-403，1993)。

根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变，可以鉴定 本发明zFGF-5多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科学，244： 1081-1085，1989)。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入单个 丙氨酸突变，并检测生成的突变分子的生物学活性(如心肌细胞或成 纤维细胞的增殖或骨形成的刺激作用)以鉴定对分子活性关键的氨基 酸残基。也见Hilton等，生物化学杂志，271：4699-4708，1996。通过结 构的物理分析，如通过这些技术即核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲 和标记并结合推测的接触位点氨基酸的突变也可以鉴定配体-受体相 互作用位点。见例如de vos等，科学，255：306-312，1992；Smith等， 分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett. 309：59-64，1992。也可以从相关FGF的同源性分析推断必需氨基酸的 性质，并显示在图1和2中。

zFGF-5氨基酸序列的分析揭示了多肽C-末端处的二碱性位点[氨 基酸残基196-197(赖氨酸-精氨酸)]。已证明包含显示于SEQ ID NO：2的28位(Glu)至196位(Lys)氨基酸残基的氨基酸序列的C-末端截 短的多肽具有生物学活性。二碱性氨基酸如Arg-X-X-Arg(其中X 是任何氨基酸残基)、Arg*Arg或Lys-Arg可由几个酶包括但不限于凝 血酶和羧肽酶切割。因此，在二碱性氨基酸残基，尤其是在SEQ ID NO：2的196和197位氨基酸残基(分别是Lys和Arg)的二碱性残基处进行 保守的改变在权利要求范围之内。

根据FGF家族的分析，包含SEQ ID NO：2的28位(Glu)至175位(Met) 氨基酸残基的C-末端截短分子可以有生物学活性。分子内二硫键预期 存在于SEQ ID NO：2的109位(Cys)和129位(Cys)氨基酸残基之间。

根据与FGF-1和FGF-2晶体结构的同源性比较(Eriksson等，Prot. Sci.，2：1274，1993)，zFGF-5β链结构的二级结构预测与SEQ ID NO：2的56-59、64-69、73-76、85-92、96-102、106-111、 115-119、128-134、138-144、149-155和173-177位氨基酸残基 有关。通过整个zFGF-5多肽的定点诱变鉴定对于zFGF-5与受体结 合关键的氨基酸。更具体地，使用zFGF-5多肽中对应于在酸性 FGF(FGF1)和碱性FGF(FGF2)中鉴定为对于这些FGFs与它们的受体 结合关键的氨基酸的定点诱变可以鉴定它们(Blaber等，生物化学 35：2086-2094，1996)。这些氨基酸包括人FGF2中的Tyr33，Arg53， Asn110，Tyr112，Lys119，Trp123，Leu149和Met151以及人FGF1 中的Tyr30，Arg50，Asn107，Tyr109，Lys116，Trp122，Leu148和 Leu150，如图1和图2中所示。如图1和图2中所示，zFGF-5中相应的 氨基酸是Tyr58，Gly77，Asn136，Tyr138，Lys145，Trp149，Met175和 Arg177。本领域熟练技术人员会认识到FGF家族的其它成员全部或部 分与zFGF-5有结构或生化相似性，可以替换做这些分析。这些区域 对分子的生物学功能是重要的。

用已知的诱变和筛选的方法，如那些由Reidhaar-Olson和Sauer(科 学，241：53-57，1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院院报，86： 2152-2156，1989)所公开的方法，可以制备和检测多个氨基酸的替换。 简要地说，这些作者公开了在多肽上同时随时选取两个或多个位置、选 择有功能的多肽和对诱突的多肽测序以确定每个位置允许置换的范围 的方法。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学 30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5223409；Huse， WIPO公开WO 92/06204)和定区域诱变(Derbyshire等，基因46：145， 1986；Ner等，DNA，7：127，1988)。

如上面所公开的诱变方法可以和高效率、自动筛选方法结合以在宿 主细胞中检测克隆的、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编 码活性多肽(如细胞增殖)的诱变的DNA分子并用现代仪器快速测序。 这些方法允许目的多肽中单个氨基酸重要性的快速测定，并可以应用于 未知结构的多肽。

使用上面讨论的方法，本领域的普通技术人员可以鉴定和/或制备与 SEQ ID NO：2的28位(Glu)至196位(Lys)残基或28位(Glu)至207位(Ala) 残基、其等位变体或其生物活性片段基本上同源的许多多肽，并保留 野生型蛋白的增殖特性。这些多肽也可以包括如上充分公开的其它多 肽片段。

本发明的多肽，包括全长蛋白、其片段和融合蛋白，可以根据传统技 术在遗传工程宿主细胞中合成。合适的宿主细胞可以是用外源DNA转 化或转染并在培养中生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞和 培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细 胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入许多宿主细胞的技术由 Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社， 冷泉港，纽约，1989和Ausubel等(编辑)，分子生物学常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，纽约，1987公开，在此引用作为参考。

总的来说，编码本发明的zFGF-5多肽的DNA序列可操作地与其 表达所需的其它基因元件上，一般包括表达载体内转录启动子和终止 子连接。载体一般也将含有一个或多个选择标记及一个或多个复制起 点，尽管本领域技术人员将认识到在某些系统内也可以在分开的载体 上提供选标记以及通过整合进宿主细胞基因组提供外源DNA的复制。 启动子、终止子、选择性标记、载体和其它元件的选择是本领域普通 技术水平内的常规设计。许多这样的元件在文献中得到描述并可通过 商业供应商得到。

为了将zFGF-5多肽导入宿主细胞分泌途径，在表达载体中提供 分泌信号序列(也已知为前导序列、早前肽或前肽)。分泌信号序列可 以是天然序列或是包含来自另一分泌蛋白(如t-PA和a-早前分泌引 导区)或从头合成的信号序列的嵌合体。分泌信号序列以正确的阅读框 架与zFGF-5 DNA序列连接。分泌信号序列一般定位于编码目的多肽 的DNA序列的5’端，尽管某些信号序列可以定位于目的DNA序列的别 处(见如Welch等，美国专利号5,037,743；Holl and等，美国专利号 5,143,830)。

公开了一个可以用于克隆编码任何目的多肽，包括多肽融合体的 DNA独特受体质粒。此受体质粒在制备双链环形DNA分子的方法中有 用。此方法包括如下步骤：(a)提供编码目的多肽的双链供体片段；(b) 提供有钝的第一和第二末端并含有在酿酒酵母中有功能的选择性标记 和复制序列的双链线性受体质粒，其中受体质粒基本上不含编码目的 多肽的DNA；(c)提供第一个双链DNA接头，包含在序列上与受体质粒 第一区域相同的第一片段和在序列上与供体DNA片段第一区域相同的 第二片段，其中第一个接头的第一和第二片段长至少10bp；(d)提供 第二个双链DNA接头，包含在序列上与受体质粒第二区域相同的第一 片段和在序列上与供体DNA片段的第二区域相同的第二片段，其中第二 个接头的第一和第二片段至少10bp；和(e)在酿酒酵母宿主细胞内结合 供体DNA片段、受体质粒、第一DNA接头和第二DNA衍接头，由此通 过供体DNA、受体质粒和接头的同源重组使供体DNA片段与受体质粒 连接以形成闭环质粒。受体质粒进一步包含邻近第一末端的转录启动 子和在闭环质粒内与转录启动子可操作地连接的供体DNA片段。受体 质粒进一步包含编码前导肽的DNA片段和/或编码肽标鉴的一个或多个 DNA片段，将它们定位使得这些DNA片段在闭环质粒内与供体DNA片 段可操作地连接。在优选的实施方案中，受体质粒进一步包括(a)启动 子、编码前导肽的DNA片段和编码第一肽标鉴的DNA区段，其中编码 前导肽的DNA片段定位于启动子和编码邻近受体质粒的第一末端的第 一肽标鉴的DNA片段之间，其中启动子、编码前导肽的DNA片段可编 码第一肽标鉴的DNA片段是可操作连接的；(b)邻近受体质粒的第二末 端的编码第二肽标鉴的DNA片段。

公开了制备双链环形DNA分子的方法，包括如下步骤，(a)提供许多 重叠的双链DNA供体片段，它们加在一起编码目的多肽；(b)提供具有 钝的第一和第二末端敢并含有在酿酒酵母中有功能的选择性标记和复 制序列的双链线性受体质粒，其中受体质粒基本上不含编码目的多肽的 DNA；(c)提供第一个双链DNA接头，包含在序列上与受体质粒第一区域 相同的第一片段和在序列上与供体DNA片段之一的第一区域相同的第 二片段，其中第一衍接头的第一和第二片段长至少10bp；(d)提供第二 个双链DNA接头，包含在序列上与受体质粒第二区域相同的第一片段和 在序列上与供体DNA片段的第二区域相同的第二片段，其中第二个接头 的第一和第二片段长至少10bp；和(e)在酿酒酵母宿主细胞内结合供体 DNA片段、受体质粒、第一DNA接头和第二DNA接头，由此通过同源 重组使供体DNA片段与受体质粒连接以形成含有编码目的多肽的区域 的闭环质位。受体质粒进一步包含如上所述的一个或多个转录启动 子、编码前导肽的DNA片段和一个或多个编码肽标鉴的DNA片段。

真菌细胞，包括酵母细胞和具体地酵母属或毕赤酵母属的细胞， 是合成zFGF-5片段或多肽融合体的宿主的特别优选的细胞。

其它用外源DNA转化酵母细胞以及从其生产重组多肽的方法公开 于例如Kawasaki，美国专利号4599311；Kawasaki等，美国专利号 4931372；Brake，美国专利号4870008；Welch等，美国专利号5 037 743；和Murray等，美国专利号4845075，此处引用作为参考。通过由 选择性标记，通常是抗药性或在缺少特定营养(如亮氨酸)时生长的能 力确定的表型来选择转化的细胞。在酵母中使用的可选择的优选载体 系统是由Kawasaki等，(美国专利号4931373)公开的POT1载体系统， 它允许通过在含葡萄糖的培养基上的生长选择转化的细胞。在酵母中 使用的合适启动子和终止子包括那些来自糖酵解基因(见如Kawasaki， 美国专利号4 599 311；Kingsman等，美国专利号4 615 974；和Bitter， 美国专利号4 977 092，此处引用作为参考)和醇脱氢酶基因的启动子 和终止子。也见美国专利号4990446；5063154；5139936和4661454， 此处引用作为参考。用于其它酵母包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、 乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、 季也蒙毕赤酵母和Candida maltosa的转化系统在本领域内以知。一 个特别优选的系统使用甲醇毕赤酵母。(见PCT申请WO 9717450)。对 另一转化系统见例如Gleeson等，遗传微生物学杂志，132：3459-3465， 1986和Cregg，美国专利号4 882279。根据Mcknight等，美国专利 号4 935349的方法可以使用曲霉属细胞，此处引用作为参考。转化 Acremonium chrysogenum的方法由Sumino等，美国专利号5162228 公开，此处引用作为参考。转化脉孢菌的方法由Lambowitz，美国专利 号4486533公开，此处引用作为参考。

在本发明内培养的哺乳动物细胞也是优选的宿主。将外源DNA导 入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细 胞，14：725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学，7：603，1981； Graham和Van der Eb，病毒学，52：456，1973)、电穿孔(Neumann 等，欧洲分子生物学杂志，1：841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介导 的转染(Ausubel等编辑，分子生物学常用方法，John Wiley和Sons，Inc.， 纽约，1987)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点，15：73， 1993；Ciccarone等，焦点，15：80，1993)，此处引用作为参考。在培养的 哺乳动物细胞中重组多肽的合成公开于Levinson等，美国专利号 4713339；Hagen等，美国专利号4 784 950；Polmiter等，美国专利号 4579821；和Ringold，美国专利号4656134，此处引用作为参考。优选的 培养哺乳动物细胞包括COS-1(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 1650)、COS-7(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 1651)、 BHK570(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 10314)、293(美国典型 培养物保藏中心保藏号CRL 1573；Graham等，遗传病毒学杂志， 36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-K1，美国典型培养 物保藏中心保藏号CRL 61)。其余合适的细胞系在本领域内公知，并可 以从公共保藏处如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryl and获 得。一般优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。 见例如，美国专利号4956288。其它合适的启动子包括那些来自金属硫 蛋白基因(美国专利号4579821和4601978，此处引用作为参考引入)的启 动子以及腺病毒主要晚期启动子。

一般使用药物选择来选择已插入外源DNA的培养的哺乳动物细胞。 这些细胞通常称作“转染子”。在选择性药物存在时培养的并能够将 目的基因传递给子代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择性标记 是编码对抗生素新霉有抗性的基因。在新霉素型药物如G-418等存在 时进行选择。选择系统也可以用于增加目的基因的表达水平，称之为 “扩增”的过程。通过在低水平选择药物存在时培养转染子，然后增加 选择性药物的量以选择合成高水平导入基因产物的细胞来进行扩增。 优选的可扩增的选择性标记是赋于对氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原 酶。也可以使用其它药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉 素乙酰转移酶)。

也可以使用其它更高等的真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、植物细 胞和鸟类细胞。昆虫细胞的转化和其中外源多肽的合成公开于 Guarino等，美国专利号5162222；Bang等，美国专利号4775624； 和WIPO公开WO 94/06463，此处引用作为参考。发根农杆菌作为在植 物细胞中表达基因的载体已在Sinkar等，生物科学杂志 (Bangalore)，11：47-58，1987中综述。

根据传统方法，在含有营养物以及选择的宿主细胞生长所需的其 它成份的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。许多合适的培养基， 包括规定的培养基和复杂培养基在本领域内公知并且一般包含碳源、 氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基也可以含有 诸如生长因子或血清的成份。生长培养基一般将对含有外加DNA的细 胞进行选择，例如通过药物选择或缺失必需营养物，而这些可以由表 达载体所携带的或共转染进宿主细胞的选择性标记来补偿。

使用分级分离和/或传统纯化方法及介质可以纯化表达的重组 zFGF-5多肽(或嵌合的zFGF-5多肽)。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽 提物可以用作分级分离的样品。典型的纯化步骤可以包括羟基磷灰石 层析、大小排阻层析、FPLC和反相高效液相层析。合适的阴离子交换 介质包括衍生葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石 等。优选的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其优选的是带有DEAE 快速流动Sepharose的(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析 介质包括那些用苯基、丁基或辛基衍生化的那些介质，如苯基- SepharoseFF(Pharmacia)、东洋珍珠丁基650(Toso Haas， Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose琼脂糖(Pharmacia)等；或 聚丙烯树脂如Amberchrom CG71(Toso Haas)等。合适的固体支持物包 括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯 乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等，它们在所用的条件下是不可溶的。 这些支持物可以用反应性基团进行修饰，使蛋白可以通过氨基、羧 基、硫氢基、羟基和/或碳水化合物组分结合。偶联化学法的例子包括 溴化氰活化、N-羟琥珀酰胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活 化及对碳二亚胺偶联化合物的羧基和氨基衍生物。这些和其它固体介 质在本领域内公知并广泛应用，并可以从商业供应商获得。将受体多 肽与支持物介质结合的方法在本领域内众所周知。特定方法的选择是 一种常规设计，部分决定于所选支持物的特性。见例如亲和层析：原理 和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。

利用其肝素连接特性也可以分离本发明的多肽。作为综述，见 Burgess等，生物化学年鉴，58：575-606，1989。通过肝素- Sepharose亲和层析(Gospodaroicz等，美国国家科学院院报，81：6963 -6967，1984)，并用氯化钠线性梯度洗脱[Ron等，生物化学杂志， 268(4)：2984-2988，1993；层析：原理和方法，77-80页，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1993；in“固定亲和配体技 术”，Hermanson等编辑165-167页，Academic Press，San Diego，1992； Kjellen等，生物化学年鉴，60：443-474，1991；和Ke等，蛋白实验纯 化，3(6)：496-507，1992.]可以将FGF家族成员纯化至显著均质。

其它纯化方法包括用固定金属离子吸附(IMAC)层析来纯化富集组 氨酸的蛋白。简单地说，首先用二价金属离子使凝胶带电以形成螯合物 (E.Sulkowski，生物化学趋势，3：1-7，1985)。依靠所使用的金属离子， 富集组氨酸的蛋白以不同的亲和力吸附在此基质上，并通过竞争性洗 脱、降低pH值或使用强螯合剂来洗脱。其它纯化方法包括通过凝集素 亲和层析和离子交换层析的糖基化蛋白的纯化(酶学方法，182卷，“蛋 白纯化指南”，M.Deutscher(编辑)，学术出版社，San Diego，1990，529 -39页)。此外，可以构建目的多肽和亲和标签(如多聚组氨酸、麦芽糖 结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合体以利于纯化。

也可以有利地使用蛋白重折叠(和选择性地重氧化)方法。优选纯化 蛋白至＞80％纯度，更优选至＞90％纯度，甚至更优选＞95％，尤其优选 的是药物纯化状态，就污染的大分子，尤其是其它蛋白和核酸来说，纯度 ＞99.9％，没有感染和致热因子。优选地，纯化的蛋白基本上不含其它蛋 白，尤其是动物来源的其它蛋白。

zFGF-5多肽或其片段也可以通过化学合成制备。zFGF-5多肽可 以是单体或多聚体；糖基化或非糖基化；pegylated或non-pegylated； 可以包含或不包含起始的甲硫氨酸残基。

本发明分子的活性可以使用许多测定法测定，例如根据成年心脏中的 组织特异性测定心脏细胞的新生或增生(即增殖)。其它可能与本发明多 肽相关的活性包括直接或间接通过其它生长因子的内皮细胞、心肌细 胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞的增殖；作用为内皮细胞、成纤维细胞 和/或吞噬细胞的趋化因子；骨生成因子；和扩大间充质干细胞和前体 细胞群体的因子。

使用培养的心脏细胞或体内通过给适当的动物模型施用本发明的分 子来测定增殖。一般来说，增殖效应可以看作细胞数目的增加，因而可 以包括细胞程序性死亡的抑制和有丝分裂的发生。培养的细胞包括来 源于原代培养的心脏成纤维细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、人脐静脉 内皮细胞。建立的细胞系包括：NIH373成纤维细胞(美国典型培养物保 藏中心保藏号CRL-1658)、CHH-1 chum心脏细胞(美国典型培养物 保藏中心保藏号CRL-1680)、H9c2大鼠心肌细胞(美国典型培养物保 藏中心保藏号CRL-1446)、Shionogi乳房癌细胞(Tanaka等，美国国 家科学院院报，89：8928-8932，1992)和LNCap.FGC腺癌细胞(美国 典型培养物保藏中心保藏号CRL-1740)。测定细胞增殖的分析法在本 领域内公知。例如，测定增殖的实验包括诸如对中性红染料的化学敏 感性(Cavanaugh等，研究的新药物，8：347-354，1990，此处引用作为 参考)、放射性标记核苷酸的掺入(Cook等，分析生物化学，179：1-7， 1989，此处引用作为参考)、增殖细胞的DNA中5-溴-2′-脱氧尿苷 (BrdU)的掺入(Porstmann等，免疫学方法杂志，82：169-179，1985，此 处引用作为参考)、四氮唑盐的使用(Mosmann，免疫学方法杂志， 65：55-63，1983；Alley等，肿瘤研究，48：589-601，1988；Marshall等， 生长调节，5：69-84，1995；和Scudiero等，肿瘤研究，48：4827-4833， 1988；此处此用作为参考)的实验。

分化是渐进的和动力学的过程，开始于多潜能干细胞并结束于终末分 化的细胞。未定型于细胞谱系能再生的多潜能干细胞表达一套分化标 记，当定型于细胞谱系时这些分化标记丢失。前期细胞表达一套 分化标记，当细胞进入通向成熟细胞谱系途径时这些分化标记可以或 可以不继续表达。由成熟细胞专门表达的分化标记一般是功能特性如 细胞产物、产生细胞产物的酶和受体。细胞群体分化阶段由细胞群体 中存在的标记的鉴定来监控。据认为肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、 软骨细胞、成纤维细胞和网状细胞起源于共同的间充质干细胞(Owen 等，Ciba Fdn.Symp.，136：42-1988)。间充质干细胞的标记还未 得到很好鉴定(Owen等，细胞科学杂志87：731-738，1987)，所以经 常在祖细胞和成熟细胞阶段进行鉴定。已推测但并未证明早期心肌祖 细胞(经常称作心肌干细胞)在成年心脏中的存在。本发明的新多肽对 于研究体内和离体分离间充质干细胞和心肌细胞前期细胞是有用的。

有证据表明刺激特异细胞类型进入通向终末分化或脱分化途径的 因子影响起源于共同前体或干细胞的整个细胞群体。因此本发明包括 刺激肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和内皮细 胞的抑制或增殖。通过对它们共同前体/干细胞的影响，本发明的分子 虽然促进心肌细胞的增殖或分化时，却可以抑制脂肪细胞的增殖或分 化。因此，本发明的分子已用于抑制软骨肉瘤、动脉粥样硬化、再狭 窄和肥胖。

测定分化的实验包括测定与组织阶段特异表达相关的细胞表面标 记、酶活性、功能活性或形态学改变(Watt，美国实验生物学会联合 会，5：281-284，1991；Francis，分化57：63-75。1994；Raes，动 物细胞生物技术生物加工进展，161-171，1989；在此所有这些作为 参考)。

体内评估心脏新生或增生的实验包括用本发明的分子处理新生和 成熟大鼠。测量动物心脏功能如心率、血压和心输出量以测定左心室 的功能。死后估计心脏改善的方法包括：增加的心脏重量、核/细胞质 体积、测定增殖细胞核抗原(PCNA)对细胞质肌动蛋白的水平的心脏组 织切片染色(Quaini等，循环研究75：1050-1063，1994和Reiss等， 美国国家科学院院报93：8630-8635，1996)。

体内测定骨形成率改变的方法包括进行骨组织学(见Recker，R. 编辑，骨组织形态测量学：技术和解释，Boca Raton：CRC出版公司， 1983)和定量计算的X射线断层术(QCT；Ferretti，J.骨17：353S -364S，1995；Orphanoludakis等，放射学研究14：122-130，1979 和Dur and等，医学物理19：569-573，1992)。离体测定骨形成改变 的实验可以是例如如calavarial实验(Gowen等，免疫学杂志 136：2478-2482，1986)。

就调控能量平衡而言，尤其当涉及脂肪细胞的代谢、增殖和分化 时，zFGF-5多肽调控对代谢反应的影响。这些代谢反应包括脂肪形 成、糖原异生、糖原分解、脂肪生成、葡萄糖吸收、蛋白合成、产热、 氧利用等。在本领域已知或此处描述的其它方法中，可以通过监控一 个或多个上述代谢功能来评估哺乳动物能量平衡。通过本领域普通技 术人员已知的技术(实验或动物模型)来监控这些代谢功能，这些在下 面得到全面描述。例如，胰岛素的糖调控效应主要在肝、骨骼肌和脂 肪组织中发生。在骨骼肌和脂肪组织中，胰岛素作用是促进葡萄糖的 吸收、储藏和利用。

存在监控上面列举的所有代谢功能的本领域公知的方法。这样， 本领域普通技术人员能评估zFGF-5多肽、片段、融合蛋白、抗体、 激动剂和拮抗剂的代谢调节功能。典型的调控技术在下面陈述。

胰岛素刺激的脂肪生成可以例如通过测量14C-乙酸盐在甘油三酯 中的掺入(Mackall等生物化学杂志，251：6462-6464，1976)或甘 油三酯的积累(Kletzien等，分子药理学，41：393-398，1992)来监 控。

在测定胰岛素刺激的葡萄糖转运的实验中评估zFGF-5刺激的吸 收。将原代脂肪细胞或NIH3T3 L1细胞(美国典型培养物保藏中心保藏 号CCL-92.1)放入含1g/L葡萄糖、0.5或1.0％BSA、20mM Hepes和 2mM谷氨酰胺的DMEM中。2-5小时培养后，用新鲜的含0.5或1.0BSA、 20mMHepes、1mM丙酮酸和2mM谷氨酰胺的无葡萄糖的DMEM换培养基。 加入合适浓度的zFGF-5、胰岛素或IGF-1或连续稀释的待测物质， 温育细胞20-30分钟。加入3H或14C-标记的脱氧葡萄糖至约50 1M终 浓度，温育细胞约10-30分钟。然后用冷缓冲液(如PBS)快速冲洗细 胞，用合适的裂解剂(如1％SDS或1N NaoH)裂解细胞。通过在闪烁计 数器中计数评估细胞裂解液。减去非特异连接后细胞相关的放射活性 作为葡萄糖转运的测定，非特异连接通过在细胞松弛素b，一种葡萄 糖转运的抑制剂中培养细胞来确定。其它方法包括例如由Manchester 等，美国生理学杂志，266(内分泌代谢29)：E326-E333，1994(胰岛 素刺激的葡萄糖转运)所描述的方法。

使待测细胞与35S-甲硫氨酸以及35S-甲硫氨酸和蛋白合成的推 测调节剂一起培养后，通过比较35S-硫氨酸标记的蛋白沉淀评估蛋白 合成。

按照在B.Stanley，神经肽Y和相关肽生物学，W.Colmers和 C.Wahlestedt(编辑)，Humana Press，Ottawa，1993，457-509 页；C.Billington等，美国生理学杂志260：R321，1991；N. Zarjevski等，内分泌，133：1753，1993；C.Billington等，美国 生理学杂志266：R1765，1994；Heller等，美国生理学杂志 252(4Pt2)：R661-7，1987；和Heller等，美国生理学杂志，245(3)： R321-8，1983中所述的评估产热。可以通过一系列技术测定的代谢 率也是产热的间接测量。

如Heller等，Pflugers Arch，369(1)：55-9，1977所述的评 估氧利用。此方法也涉及下丘脑温度和代谢热产生的分析。氧利用和 热调控也已在人体中按照Haskell等，应用生理学杂志51(4)：948 -54，1981所描述的已得到评估。

zFGF-5多肽也可以用于制备zFGF-5表位、肽或多肽特异结合 与的抗体。制备多克隆和单克隆抗体的方法在本领域内公知的(见如 Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，1989； 和Hurrell，J.G.R.编辑，单克隆杂交瘤抗体：技术和应用，CRC出版 社，Inc.，Boca Raton，FL，1982，此处引用作为参考)。多克隆抗体 可以从许多温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大 鼠中产生，这一点对本领域普通的技术人员是很明显的。

通过使用佐剂如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂可以增 加zFGF-5多肽的免疫原性。对免疫有用的多肽也包括融合多肽如与 免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的zFGF-5或其部分的融合体。 多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”， 为了免疫此部分可以有利地与大分子载体[如Keyhole limpet hemocyanin(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素]连接。

如本文所述，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆 抗体、单克隆抗体和抗原结合片段如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。 也包括遗传工程完整的抗体或片段如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等， 以及合成的抗原结合肽和多肽。通过只将非人类CDR嫁接到人框架和 稳定区，或通过掺入整个非人可变结构域(通过置换暴露的残基用人 样表面选择性“覆盖”它们，其中结果是“覆盖的”抗体)使非人类抗 体人类化。在一些例子中，人类化抗体可以在人可变区域框架区内保 留非人残基以加强正确的结合特性。通过人类化抗体，可以提高生物 半衰期，并且在用于人体时减少不利免疫反应的可能。此处对于产生 或选择抗体有用的其它技术包括体外使淋巴细胞与zFGF-5蛋白或肽 接触以及在噬菌体或类似载体(例如，通过固定的或标记的zFGF-5蛋 白或肽的使用)中选择抗体展示文库。

如果抗体与zFGF-5多肽用106M-1或更高的、优选地107M-1或更 高、更优选地108M-1或更高、最优选109M-1或更高的结合亲和性(Ka) 结合，那么抗体定义为特异性结合。抗体结合亲和性很容易由本领域 普通技术之一(如通过Scatchard分析)得到测定。

本领域技术人员已知的许多实验可以用于检测与zFGF-5蛋白或 肽特异结合的抗体。典型的实验在抗体：实验室手册，Harlow和 Lane(编辑)，冷泉港实验室出版社，1988中得到具体描述。这些实验 的代表性例子包括：共存的免疫电泳、放射免疫试验、放射免疫沉淀、 酶联免疫吸附实验(ELISA)、点杂交或Western杂交实验、抑制或竞争 实验、和三明治实验。此外也可以筛选与野生型/突变型zFGF-5蛋白 或肽结合的抗体。

针对zFGF-5的抗体可以用于标记表达zFGF-5的细胞；将另一 蛋白、小分子或化合物靶向心脏组织；通过亲和纯化分离zFGF-5； 用于测定zFGF-5多肽循环水平的诊断分析；检测或定量测定可溶的 zFGF-5作为潜在病理学或疾病的标记；采用FACS的分析方法，筛选 表达文库；制备抗基因型抗体；以及作为体外和体内阻断zFGF-5介 导的增殖的中和抗体或拮抗剂。合适的直接标签或标记包括放射性核 素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁粒子 等；间接标签或标记涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互补/反互 补对作为中间体。此处抗体也可以直接或间接与药物、毒素、放射性 核素等等偶联，并且将这些偶联物用于体内诊断或治疗应用。

本发明的分子可以用于鉴定和分离参与心肌增生的受体。例如将 本发明的蛋白和肽固定在柱上，并使膜制品流过柱子(固定的亲和配 体技术Hermanson等，编辑，学术出版社，San Diego，CA，1992，195 -202页)。也可以对蛋白和肽进行放射性标记(酶学方法，182卷，“蛋 白纯化指南”，M.Deutscher编辑，学术出版社，San Diego，1990， 721-737)或光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴，62：483-514， 1993和Fedan等，生物化学药理学，33：1167-1180，1984)，并可 以鉴定特异的细胞表面蛋白。

拮抗剂将对在细胞类型如心脏细胞，包括肌细胞、成纤维细胞和 内皮细胞；成骨细胞和软骨细胞中抑制zFGF-5分子的增殖活性有 用。通过筛选在噬菌体(噬菌体显示)或细菌如大肠杆菌上展示的随机 肽文库获得编码zFGF-5多肽结合结构域的基因。可以用许多方法如 通过随机诱变和随机多核苷酸合成获得编码多肽的核苷酸序列。这些 随机肽展示文库可用于筛选与已知靶分子相互作用的肽，靶分子可以 是蛋白或多肽如配体或受体、生物或合成的大分子、或有机或无机物 质。制备和筛选这样的随机肽展示文库的技术在本领域内公知 (Ladner等，美国专利号5,223,409：Ladner等，美国专利号 4,946,778；Ladner等，美国专利号5,403,484和Ladner等，美国 专利号：5,571,698)并且随机肽展示文库和筛选这样文库的试剂盒可 例如从Clontech(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)， New Engl and Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商业获得。可以使用此处公 开的zFGF-5序列筛选随机肽展示文库以鉴定与zFGF-5结合的蛋 白。这些与zFGF-5多肽相互作用的“结合蛋白”可以用于标签细胞； 通过亲和纯化分离同系物多肽；可以直接或间接与药物、毒素、放射 性核素等体外和体内。这些结合蛋白也可用于分析法如筛选表达文库 和中和活性。结合蛋白也可用于测定多肽循环水平的诊断分析；检测 或定量测定可溶的多肽作为潜在病理学或疾病的标记。这些结合蛋白 也可以作用为zFGF-5的“拮抗剂”以阻断zFGF-5体外和体内的结 合和信号转导。这些抗zFGF-5的结合蛋白对抑制导致增殖或分化的 基因的表达有用。这些抗zFGF-5的结合蛋白单独或与其它治疗结合 可用于治疗例如横纹肌肉瘤、心脏粘液瘤、成骨细胞起源的骨癌、侏 儒症、关节炎、韧带和软骨修补。

本发明的分子将对体外心脏组织细胞如心肌细胞或成肌细胞；骨 骼肌细胞或成肌细胞和平滑肌细胞；软骨细胞；内皮细胞；脂肪细胞 和成骨细胞的增殖有用。例如，本发明的分子可用作规定的细胞培养 基成分，并可以单独或和其它细胞因子和激素结合使用以替换通常在 细胞培养中使用的血清。本发明的分子在特异促进培养中肌细胞生长 和/或发育中尤其有用，也可以证明在心脏肌细胞增生和再生的研究中 有用。

本发明的多肽、核酸和/或抗体可以用于治疗与心肌梗死、充血的 心力衰竭、肥大心肌病和扩张心肌病相关的疾病。本发明的分子也对 限制心脏病发作后梗死面积、促进血管成形术或幼脉内切除术后血管 发生和伤口愈合、发展冠状侧支循环、眼中的重新血管化、和不良循 环如糖尿病足溃疡相关的并发症、使用药理法冠状再灌注后的中风以 及血管再生是有益的其它指征也是有用的。本发明的分子对通过诱导 心肌细胞新生和/或增生、诱导冠状侧支形成或诱导环死心肌面积的重 塑来促进心脏功能是有用的。本发明的其它治疗用途包括骨骼肌新生 和/或增生、肾再生的诱导和/或用于治疗系统的和肺动脉高压。

使用慢性冠状闭合的模型在兔、狗或猪中测定zFGF-5诱导的冠 状侧支发育(L和au等，美国心脏杂志29：924-931，1995；Sellke 等，外科学120(2)：182-188，1996和Lazarous等，1996，ibid.)。 在大鼠中使用双侧颈动脉闭合并测定组织变化以及迷津行为，体内检 测zFGF-5对治疗中风的益处(Gage等，老化的神经生物学9：645- 655，1988)。使用对系统高血压自发的高血压大鼠(SHR)体内检测zFGF -5治疗高血压的效能(Marche等，药理学和生理学临床实验增刊1： S114-116，1995)。

本发明的分子也和于定向将药剂或药物传递给心脏。例如利用 zFGF-5启动子指导的心脏特异表达，本发明的分子将对限制到心脏 的表达是有用的。例如使用zFGF-5腺病毒discistronic结构可以 获得心脏特异表达(Rothman等，基因治疗3：919-926，1996)。通 过连接zFGF-5多肽至另一蛋白(Franz等，循环研究73：629-638， 1993)通过连接含有zFGF-5同系物多肽到第二个药剂或药物上形成 嵌合体，zFGF-5多肽可用于其它药剂或药物限制于心脏组织上。蛋 白，例如抗体，可以与本发明的zFGF-5分子形成嵌合体(Narula等， J.Nucl.Cardiol.，2：26-34，1995)。药剂或药物的例子包括但 不限于生物活性多肽、基因、毒素、放射性核素、小分子药物等。连 接可以是直接或间接(如脂质体)，可以通过重组方法、化学键合、强 非共价相互作用等发生。

在本发明的一个实施方案中，包含zFGF-5蛋白的组合物可以用 作治疗试剂以加强成骨细胞介导的骨形成。组合物和使用本发明组合 物的方法可用于促进骨缺损和缺失的修补，例如发生在闭合、开放和 不结合骨折中的骨缺损和缺失；用于促进整形外科学中骨愈合；促进 骨向内生长进入非粘合假关节和牙移植物内；用于治疗牙周疾病和缺 损；在内脱位骨生成过程中增加骨形成；和用于治疗其它可以通过促 进成骨细胞活性来治疗的骨骼疾病，如骨质疏松和关节炎。由本发明 的方法提供的从头骨形成将用于修补天生的、创伤诱导的、骨肿瘤切 除，或放射诱导的骨坏死后骨愈合(Hart等，肿瘤，37：2580-2585， 1976)。本发明的分子可以在整形外科学中找到用途。

对于药物使用，根据传统方法本发明的蛋白可以配方用于胃肠外， 尤其是静脉内或皮下施用。静脉内施用将是通过一至几小时典型时段 的团注射或注入。总的来说，药物配方将包括与药物可接受载体如 盐、缓冲液盐水、水中5％葡萄糖等结合的zFGF-5蛋白。配方可以进 一步包括一个或多个赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止在小瓶 表面蛋白丢失的白蛋白等。配方的方法在本领域是熟知的，并显示在 如Remington’s药物科学，Gennar，编辑，Mack出版公司，Easton PA， 1990，中，此处作为参考引入。治疗剂量一般是每天在0.1至100μ g/kg患者体重范围内，优选每天0.5-20μg/kg，精确剂量由临床大 夫根据可接受的标准，考虑到要治疗情况的本性和严重性、患者特性 等等来确定。剂量的确定在本领域普通技术的水平内。蛋白可以施用 于急性治疗。经一周左右，经常经一至三天左右时间，或用于慢性治 疗，经过几个月或几年。zFGF-5的治疗有效量是足够在肌细胞增殖、 心脏功能、骨形成中产生临床显著改变或使和间充质干细胞以及肌细 胞、成骨细胞和软骨细胞的前体细胞相关的特异细胞类型产生增长的 量。尤其是，通过测量施用zFGF-5分子前后左心室射血组分，并通 过确定总射血组份至少有5％增加，优选10％或更多，可以确定肌细胞 或肌细胞祖细胞数目的临床显著增加。确定射血组分的试验，即测量 每次搏动射血量，对本领域熟练技术人员是熟知的。

通过下面非限制性实施例进一步说明本发明。 实施例 实施例1 EST序列的延伸

用生长因子的探测物扫描翻译的DNA数据库产生表达序列标签 (EST)序列的确定，此EST发现是FGF家族的新成员，并命名为zFGF -5。

从表达序列标签(EST)的序列中设计寡核苷酸引物ZC11,676(SEQ ID NO：3)和ZC11,677(SEQ ID NO：4)。此引物作为EST内的内部引物， 当PCR进行时使用来自成体心脏组织的MARATHON READY cDNA(Clontech，Palo Alto，(A)作为聚合酶链反应(PCR)的模板。

PCR的使用条件是94℃、90秒，一个循环，94℃、15秒；68℃、 1分钟；35个循环，接着72℃、10分钟，1个循环，4℃温育时间。 PCR反应重新制备了160bp的EST序列，并确定EST序列是正确的。

可以用寡核苷酸引物能扩增的其它文库包括骨骼肌、肺、胃、小 肠和甲状腺。 实施例2组织分布

使用来自Clontech(Palo Alto，CA)的人类多组织杂交进行 Northern杂交。实施例1中所描述的160bp DNA片段在1％琼脂糖凝胶 中电泳。然后用随机引物MEGAPRIME DNA标记系统(Amersham， Arlington Heights，IL)，根据生产商的说明书进行放射活性标记。 使用NUCTRAP推进柱(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)纯化探 针。EXPRESSHYB(Clontech，Palo Alto，CA)溶液用作预杂交，并作 为Northern杂交的杂交液。杂交于68℃过夜进行，然后杂交在2×SSC 和0.05％SDS中室温冲洗，接着50℃在0.1×SSC和0.1％SDS中洗。在 大约2.0kb处观察到单一条带。对成体心脏信号强度最高，在骨骼肌 和胃中具有相对较弱的信号。 实施例3测量zFGF-5的体外活性 A.

使用细胞系和原代培养的细胞测量zFGF-5的促有丝分裂活性。 来自表达重组蛋白的细胞的条件培养基和/或纯化蛋白加入下列细胞 系的培养物中：NIH3T3成纤维细胞(美国典型培养物保藏中心保藏号 CRL-1658)、CHH-1 chum心脏细胞(美国典型培养物保藏中心保藏号 CRL-1680)、H9C2大鼠心脏成肌细胞(美国典型培养物保藏中心保藏 号CRL-1446)、Shionogi乳房癌细胞(Tanaka等，1992，ibid)和 LNCap.FGC腺癌细胞。对检测zFGF-5增殖活性有用的新鲜分离细胞 包括：心脏成纤维细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和人脐静脉内皮细胞。

根据Raines和Ross的方法(酶学方法109：749-773，1985)通过 测量3H-腺苷掺入测量促有丝分裂活性。简单地说休眠细胞在合适的 培养基中以3×104细胞/ml的密度铺盘。典型的生长培养基是含10％胎 牛血清(FCS)的Dulbecco’s生长培养基(GIBCO-BRL，Gaithersburg， MD)。细胞培养在96-孔板上并允许生长3-4天。除去生长培养基，每 孔加入180μl含有1％FCS的DFC(表5)。一半的孔有zFGF-5蛋白加 入其中，另一半是负对照，没有zFGF-5。细胞37℃在5％CO2中培养 3天，并除去培养基。100μl含0.1％FCS和2uci/ml3H-腺苷的DFC 加入每一孔，细胞培养板在37℃培养另外的1-24小时。吸走培养基， 向每一孔加入150μl胰蛋白酶。培养板37℃温育直至细胞分开(至少 10分钟)。分开的细胞用LKB Wallac 1295-001细胞收获器(LKB Wallac，Pharmacia，Gaithersburg，MD)收获到滤膜上。滤膜在微波 炉中加热10分钟干燥，并在LKB β-板1250闪烁计数器(KB Wallac) 中按照供应商所述的计数。

               表5

250ml Dulbecco修改的Eagle培养基

(DMEM，Gibco-BRL)

250ml Ham’s F12培养基

0.29mg/ml L-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)

1mM丙酮酸钠(Sigma，St.Louis，MO)

25mM Hepes(Sigma，St.Louis，MO)

10μg/ml胎球蛋白(Aldrich，Milwallkee，WI)

50μg/ml胰岛素(Gibco-BRL)

3ng/ml硒(Aldrich，Milwaukee，WI)

20μg/ml转铁蛋白(JRH，Lenexa，KS) B. 从一天龄的新生小鼠中分离心脏，然后根据Br和等，(生物化学杂志 268：11500-11503，1993)的方法通过反复的胶原酶的消化来分裂。 通过Percoll梯度分离单个肌细胞，2ml以0.5×106细胞/ml铺盘 子6孔组织培养皿上。3天后用无钙和镁的PBS将孔冲洗3次，再加 入1ml无血清培养基(表6)。用每孔1011颗粒AdCMV-zFGF-5或者 AdCMV-GFP(绿色荧光蛋白)作为对照接种到孔中，37℃培养8小时。 然后每一孔再次用无钙和镁的PBS冲洗3次，然后加入2ml无血清培 养基。

用AdCMV-zFGF 5接种48小时内，培养的肌细胞已停止跳动，并 经历形态上的变化，而用AdCMV-GFP接种的孔继续自发跳动，形态上 未受接种的影响。48小时后用AdCMV-zFGF5接种的孔也含有一汇合 层可见的、未贴壁细胞，在贴壁肌细胞层的汇合中并无任何细胞丢失， 表明adCMV-zFGF5对培养的小鼠肌细胞的增殖作用。

                  表6 

DMEM

Ham’s营养混合液F12(Gibco-BRL；与DMEM的1∶1混合液)

17mM NaHCO3(Sigma)

2mM L-谷氨酰胺(Sigma)

1％PSN(Sigma)

1μg/ml胰岛素

5μg/ml转铁蛋白

1nM氯化锂(Sigma)

1nM硒

25μg/ml抗坏血酸(Sigma)

1nm甲状腺素(Sigma) C.

如实施例9A中所述的并按照实施例10中所描述纯化的、与麦芽 糖结合蛋白(MBP)融合的zFGF-5，以0.1/ng/ml的浓度加到肌细胞中 (实施例3B)，MBP-zFGF5也显示能促进肌细胞的增殖。 实施例4测量zFGF-5的离体活性

从新生或8周龄小鼠或大鼠上去除整个心脏离体测量心脏有丝分 裂的发生。离体的心脏在37℃、5％CO2中于Joklik’s(Sigma，St. Louis，MO)或Dulbeco’s培养基中放置4-24小时。在此培养时间内 以1pg/ml至100μg/ml的浓度范围加入zFGF-5多肽。负对照仅使用 缓冲液。加入3H-腺苷。样品培养1-4小时，此后切开心脏，通过放 射自显影测定有丝分裂的发生。切片用以组织形态计量法以确定核/ 质体积(McLaughlin，美国生理学杂志，271：R122-R129，1996)。

另一可选择的方法是冻干心脏并重悬于1ml 0.1N NaOH中。用冰 预冷的10％三氯乙酸(TCA)沉淀DNA。上清加入9ml闪烁液中测量非特 异3H-腺苷掺入。产生的沉淀重悬于1ml BTS-450组织溶解液 (Beckman，Fullerton，CAO，并加入9ml闪烁液以测定3H-腺苷的特 异的DNA掺入。

从一天龄CD-1小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)中分离左 右心室，并用3ng/ml zFGF5Hep2(n＝13；见实施例10)或对照(n＝10) 培养4小时。3H-腺苷加入1小时。心室冲洗几次，然后在Joklik’s培 养基中匀浆，产生的匀浆加入9ml闪烁混合液，并分析总的3H-腺苷 的吸收和DNA掺入。

zFGF-Hep2将3H-腺苷在DNA中的吸收和掺入比对照提高2.068 ±0.489倍，表明zFGF5对心脏细胞是有促有丝分裂作用的。 实施例5测量zFGF-5的体内活性

使用两周龄新生大鼠和/或两月龄成年大鼠体内测量zFGF-5的 增殖效应。大鼠急性或慢性心包内注射。 A.

新生大鼠用zFGF-5以50ng/天至100ng/天的剂量范围处理1至 14天。处理后，通过测量增加心脏体积、改善的体内和离体左心室功 能，并通过增加的核/质体积比，此体积比由组织形态计量法确定，来 评估zFGF-5处理的对假处理的动物的效应。 B.

具有心肌病的大鼠或心肌病的模型如金黄心肌病仓鼠(Sole等， 美国心脏学杂志62(11)：20G-24G，1988)也用以评估zFGF-5对心 脏功能和组织的效应，心肌病通过慢性儿茶酚胺的灌注、或冠状连接 而诱导。

使用儿茶酚胺来诱导心肌病，7周龄大鼠通过肩胛骨之间皮下移 植的微型渗透泵用肾上腺素连续灌注两周。肾上腺素灌注会产生左心 室纤维变性损伤的增加，损伤分数从0.005±0.005增至2.11±0.18， 等级从0增至3；增加的左心室肌细胞宽度，从17.36±0.46μM增加 至23.05±0.65μM；以及与盐灌注大鼠相比较对异丙基肾上腺素可忽 略的左心室乳头肌收缩反应(0.2对1.1克张力)处理两周后，大鼠每 天用载体、zFGF-5、bFGF、IGF-I或IGF-II心包内注射14天。杀 掉大鼠并进行组织形态计量法和组织细胞化学法。

在儿茶酚胺处理的以及生长因子再次处理以后评估如上述处理的 大鼠，此处测量心脏的再生，如下降的左心室纤维变性损伤分数、下 降的肌细胞宽度以及增加的对异丙基肾上腺素左心室乳头肌收缩反 应。 实施例6 zFGF-5的染色体作图

使用Whitehead研究所/MIT中心对基因组研究的“基因桥4放射 杂交组”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)商业可获得 版本，zFGF-5定位于染色体5。基因桥4放射杂交组含有来自93个 放射杂交克隆的适于PCR使用的DNA，再加上两个对照DNA(HFL供体 和A23受体)。一个可公共获得的www网址(http：//www- genome.wi.mit.edu/cgi - bin/contig/rhmapper.pl)允许和 Whitehead研究所/MIT中心对人类基因组的基因组研究放射杂交作图 “WICGR”放射杂交作图)相关的作图，而基因组研究的放射杂交作图 是用基因桥4放射杂交组建立起来的。

为了用“基因桥4放射杂交组”进行zFGF-5的作图，在96-孔 微滴定板(Stratagene，La Jolla，(A)中建立25μl反应，并在 “RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)中用于PCR。95 个PCR反应的每一个含有2.5μl50x“有利的Klentaq聚合酶混合 液”(Clontech)、2μl dNTPs混合液(每个2.5mM；Perkin-Elmer， Foster City，CA)、1.25μl正义引物ZC11677(SEQ ID NO：4)和1.25 μl反义引物ZC12053(SEQ ID NO：5)。

2.5μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc)、0.5μl“有利 的Klentaq聚合酶混合液”(Clontech Laboratories，Inc.)、来自 每个杂交克隆或对照的25ng DNA和ddH2O，总体积25μl。反应用等 量矿物油覆盖并封闭。PCR循环条件如下：94℃4分钟的一个初始循 环，94℃1分钟、66℃退火1.5分钟和72℃延伸1.5分钟，35个循环， 接着最后一个循环72℃延伸7分钟。反应在3％NuSieve GTG琼脂糖胶 (FMC Bioproducts，Rockl和，ME))中通过电泳分离。

结果显示在WICGR放射杂交图上zFGF-5定位于距离人染色体5 连锁组顶部541.12cR处。相对于着丝点，它的最邻近标记是WI- 16922，它的最远标记是WI：14692。使用周围的CHLC图标民也会帮助 将zFGF-5定位于CHLC染色体5版本V8C7整合标记图上的5q34-q35 区域(合作的人连锁中心，www网址 http：//www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html). 实施例7 zFGF-5对骨的影响 A.

使用Becker等，(细胞生物学方法43：161-189，1994)所描述的 方法构建含有zFGF-5cDNA的腺病毒载体。简单地说，zFGF-5的 cDNA(如SEQ ID NO：1所显示)作为XbaI-SalI片段克隆进 pACCMV(Gluzman等，在真核病毒载体中Gluzman(编辑)，187-192 页，冷泉港出版，冷泉港，纽约，1982)。pACCMV载体含有部分腺病 毒5基因组、CMV启动子和SV40终止序列。含有载体和cDNA插入子 的质粒和含有腺病毒5基因组的质粒。其命名为pJM17(McGrory等，病 毒学163：614-617，1988)共转染进入293细胞(美国典型培养物保 藏中心保藏号CRL-1573；美国典型培养物保藏中心，Rockville， MD)，导致了重组事件的发生，并产生含有zFGF-5的重组腺病毒，命 名为AdCMV-zFGF5。zFGF-5 cDNA的存在由PCR确定。

通过1×1011和5×1011颗粒/小鼠之间的静脉内注射腺病毒载体 AdCMV-zFGF5用于体内基因转移。已表明静脉内注射后，大部分病毒 靶向肝脏，非常有效地转导肝细胞(Herz等，美国国家科学院院刊90： 2812-2816，1993)。已表明细胞合成由cDNA编码的蛋白，在分泌蛋 白的情况下，将它们分泌进循环。已显示高水平的表达和生理效应 (Ohwada等，血液88：768-774，1996；Stevenson等，动脉厚化、 血栓形成和血管生物学15：479-484，1995；Setoguchi等，血液 84：2946-2953，1994和Sakamoto等，美国国家科学院院报91： 12368-12372，1994)。

通过尾静脉的IV或心包内(IPC)注射用不含cDNA插入子(AdCMV -裸)的腺病毒或AdCMV-zFGF5处理6周龄CD-1小鼠(Jackson Labs， Bar Harbor，ME)。总共注射5×1011病毒颗粒/100μl/小鼠。注射后 14天，杀掉动物，去除并未分开的胫骨和股骨，以检查任何在的发炎 反应。将骨固定在10％中性缓冲福尔马林中并加工。它们在带有10％ 柠檬酸钠的5％甲酸中脱钙，在水中冲洗，在一系列70％-100％乙醇中 脱水，在二甲苯中清洗，包埋于石蜡中。样品纵切经过胫骨和股骨的 干骺端，并用hemotoxylin和伊红染色以辨别骨细胞。通过中心阴性 高尔基区和偏心的细胞核定成骨细胞，通过多核、非均匀形状和与这 些吸收细胞相关的Howship胞隙鉴定破骨细胞。

对于骨的组织形态计量法，选择股骨样品。由于取样点的变化(即 在相同平面上股骨样品并未精确切片)不能测量骨松质体积。三个骨参 数用于评估组织形态计量的改变。

1.骨内成骨细胞的数量：在邻近生长板的1.22mm面积内180x放 大倍数沿骨松质骨内表面测量。

2.骨内破骨细胞的数量：在邻近生长板的1.22mm面积内以180x 放大倍数沿骨松质骨内表面测量。

3.生长板宽度：除了外周端沿整个生长板以90x放大倍数以每72 μM测量，以确定生长板的活性。

数据的分析(平均±SD，n＝4-7/组)表明：

1.在胫骨和股骨之间的关节没有可检测到的炎症反应。

2.小鼠中IV或IPC注射AdCMV-zFGF5，当第二周检查时，显著 提高了远侧股骨干骺端的骨生成活性。由下来表示骨生成活性：

a)和只是对照的相关载体比较，AdCMV-zFGF5 IV灌注或IPC注 射后，在远侧股骨的骨松质中骨内成骨细胞的数量分别显著提高530％ 和263％；

b)在骨表面观察到骨生成组织的增加，表明骨髓基质细胞向成骨 细胞系分化的增加。

3.与只是对照的相关载体比较，通过IV或IPC施用AdCMV-zFGF5 并未显著骨内破骨细胞的数量。

4.通过AdCMC-zFGF5的IV灌注，而非IPC注射可以显著降低生 长板的慷痊表明IV灌注后抑制生长板活性。还未阐明AdCMV-zFGF5 施用的分化效应。

这些结果表明zFGF-5是促进成骨细胞增殖的强促有丝分裂原， zFGF-5有能力诱导新骨的形成。 B.

用和上述7.A.中描述的基本相同的步骤，对雌性CD-1(Jackson Labs)进行QCT，这些CD-1每只小鼠注射了1×1011颗粒AdCMV- zFGF5。注射后30天杀掉小鼠，和对照(用空腺病毒或盐水注射)相比 心脏/胫骨长度比率提高。之间在胫骨长度没有差异以解释此改变， 在组中间任何其它器官重量也没有差异。这样如QCT所测量，表明zFGF -5腺病毒选择性提高整个骨密度、小染骨密度和股骨皮质厚度。 实施例8 zFGF-5对心脏的影响

如7.B中所描述，给CD-1小鼠一次AdCMV-zFGF5的IV注射，4 周后杀掉，和空载体或盐水处理的小鼠相比发现心脏/胫骨长度比率 增加。结果表明在胫骨长度上组之间没有差异以解释这个变化，在组 之间任何其它器官重量上也没有差异。此结果表明当作为一个IV腺病 毒构建物施用时AdCMV-zFGF5选择性提高心脏生长。 实施例9zFGF-5的表达 A.编码zFGF5的质粒的构建

使用来自新英格兰生物实验室(NEB；Beverly，MA)的MBP(麦芽糖 结合蛋白)融合系统在大肠杆菌中一达zFGF5，一个成纤维细胞生长因 子同系物。在这个系统中，zFGF5 cDNA连到Mal E基因的3′端形成 MBP-zFGFr融合蛋白。融合蛋白的表达由tac启动子驱动；表达是 “关闭”的，直至加入1mmol IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱 导启动子生此融合蛋白的三个变种，只是从MBP上释放zFGF5的切割 位点存在差异。一个构建物在MBP和zFGF5结构域之间具有凝血酶切 割位点。第二个构建物有因子Xa切割位点。而不是凝血酶切割位点。 第三个构建物具有肠激酶切割位点，而不是凝血酶切割位点。

根据生产商的说明，按照pMAL-C2载体(NEB)的多克隆位点将此构 建物构造为具有MBP的框架内融合物。使用能引入方便的克隆位点以 及切割位点的引物通过PCR扩增zFGF5，使用以下引物： 1)对于凝血酶构建物：

ZC12,652(SEQ ID NO：7)和ZC12,631(SEQ ID NO：8)；2)对因子Xa 构建物ZC15,290(SEQ ID NO：9)和ZC12,631(SEQ ID NO：8)；和3)对 肠激酶构建物：ZC15,270(SEQ ID NO：10)AND zc12,631(SEQ ID NO：8)。在每一种情况，不扩增天然zFGF5信号序列；zFGF5在SEQ ID NO：2的26位氨基酸残基(缬氨酸变成丙氨酸)处开始表达。通过将XbaI -SalI zFGF5片段插入pMAL-C2的XbaI-SalI位点构建凝血酶构建 物。通过将平端-SalI片段插入MCS的XmnI-SalI位点构建因子Xa构 建物。通过将XbaI-SalI片段插入pMAL-C2的XbaI-SalI位点构建 肠激酶构建物。一旦构建了构建物，它们可以转化进许多大肠杆菌菌株， 并分析高水平表达。凝血酶构建物(命名为pSDH90.5)转染进DH10B细 胞(GIBCO-BRL)，而因子Xa构建物(命名为pSDH117.3)和肠激酶构建 物(命名为pSDH116.3)转染进TOP10细胞(Invitrogen，San Diego，CA)， 三个MBP融合蛋白大约都是63KD(MBP结构域中43KD，zFGF5结构中 约20KD)。 B.同源重组/zFGF5

在甲醇毕赤酵母中zFGF5的表达使用共同转让的PCT WO 9717450 中所描述的表达系统，在此处作为参考引入。通过同源重组构建含有编 码zFGF5全部或部分多核苷酸的质粒pCZR204构建表达载体， pCZR204含有AUG1启动子、接着是αFpp前导肽、接着是氨基末端肽 标鉴、平末端SmaI限制性位点、羧基末端肽标鉴、翻译终止密码子、 接着是AUG1终止子、ADE2选择性标记、和最终的AUG1 3′未翻译区 域。此载体也包括在啤酒酵母中选择和复制所需的URA3和CEN- ARS序列以及在大肠杆菌中选择和复制所需的AmpR和colE1 on序 列。插入载体的zFGF5序列以zFGF氨基酸序列的第27位残基(丙氨酸) 开始。

为了构建pSDH114，一个在甲醇毕赤酶母中表达zFGF5的质粒，下列 DNA片段转化进啤酒酵母：100ng已用SmaI消化的‘受体载体’ pCZR204；1μg以pSDH90.5中释放出的并包括zFGF5编码序列的 XbaI-SalI限制性片段；1μg合成的、PCR产生的、双链衍接物区段， 此衍接物片段一端跨越αFpp编码序列的70碱基对，另一端和来自成熟 zFGF5序列的氨基末端编码序列的70个碱基对相连接，它是从4个寡核 苷酸ZC13,497(SEQ ID NO：11)；ZC15,131(SEQ ID NO：12)： ZC15,132；(SEQ ID NO：18)；ZC15,134(SEQ ID NO：13)中产生，双链 序列的正义链显示于SEQ ID NO：19(5′衍接物序列(αFpp→zFGF5 N -末端))；以及1μg合成的、PCR产生的、双链衍接物段，此衍接物片 段用AUG1终止序列的70个碱基对一端跨越来自zFGF5的羧基末端编码 序列的70个碱基对，它是从4个寡核苷酸13,529(SEQ ID NO：14)； ZC13,525(SEQ ID NO：15)  AC13,526(SEQ ID NO：16)； ZC13,528(SEQ ID NO：17)中产生，双链序列的正义链显示于SEQ ID NO：20(3′衍接物序列(zFGF5 C-末端→AUG1终止子))。挑选Ura+克 隆，提取来自酵母克隆的DNA，并转化进大肠杆菌。用寡核苷酸 ZC13,497(SEQ ID NO：11)和ZC13,528(SEQ ID NO：12)通过PCR筛选 确认含有正确表达构建物的单个克隆，接着通过限制性消化证实zFGF5 插入子的存在，并通过DNA测序确认所要的DNA序列已与另一个连接 在一起。对正确克隆中的一个分离大量质粒DNA，用SfiI消化DNA以从 载体骨干上释放毕赤-zFGF5表达DNA序列组件。SfI所切割DNA转化 进毕赤甲醇酵母表达宿主，命名为PMAD16，并在ADE D盘上铺盘以选 择克隆。挑出许多克隆，并通过Western杂交筛选高水平的zFGF表达。

更特异地，为了小量蛋白合成(如盘或振荡烧瓶合成)，带有含有甲醇调 控启动子(如AUG1启动子)的表达DNA序列组件的毕赤甲醇酵母转化子 在存在甲醇并缺少干扰量的其它碳源(如葡萄糖)的条件下生长。为了小 量实验，包括表达水平的初步筛选，转化子可以于30℃，在含有20g/L细 菌培养用琼脂(Difco)、6.7g/L无氨基酸酵母氮基(Difco)、10g/L甲醇、 0.4mg/L生物素和0.56g/L Ade-Thr-Trp粉末的固态培养基上生长。 因为甲醇是易挥发的碳源，它很容易在延长的培养中丢失。通过在倒置 盘的盖上放置在水中的50％甲醇溶液来提供持续来源的甲醇，由此通 过蒸发转移甲醇转到生长的细胞中。一般来说，每100mm盘中用不超过 1ml甲醇。使用生长在振荡烧瓶中的培养中进行稍微更大量的实验。在 典型的方法中，细胞在上述最少限度甲醇的盘中30℃生长两天，然后克 隆从大约1×106细胞/ml的细胞密度接种于小体积的最少限度甲醇培养基 中(6.7g/L无氨基酸酵母氮基、10g/L甲醇、0.4mg/L生物素)。细胞于30 ℃生长。生长在甲醇中的细胞对高氧气水平的需要，使培养过程中剧烈 振荡成为必要。每天补充甲醇(一般每天1/100体积的50％甲醇)。

为了生产量培养，在振荡烧瓶中制备高产克隆的新鲜培养物。产生的 培养物用于接种发酵罐中的培养基。一般情况下，在剧烈振荡条件30℃ 于YEPD中生长1-2天的500ml培养物用于接种5升发酵罐。细胞在含 有盐、葡萄糖、生物素、和微量元素的合适培养基中，于28℃、pH5.0 以及＞30％溶解氧气下生长。在葡萄糖最初投料消耗后(由氧气消耗的 降低来显示)，葡萄糖/甲醇转移至溶器中以诱导目的蛋白的合成。因为 大量发醇是在限制碳的条件下进行，饲料中葡萄糖的存在并不抑制甲醇 诱导的启动子。 实施例10 zFGF-5的纯化

从以麦芽糖结合蛋白融合体形式(pSDH90.5，如上述)表达zFGF5的菌 株中获得大肠杆菌发酵培养基。使用含20mM Hepes、0.4M Nacl、 0.01M EDTA、10mM DTT、pH7.4的缓冲液在超声处理或Fench压力 破碎过程中溶解MBP-zFGF-5融合体。提取缓冲液也可以包括5μ g/ml胃酶抑制剂、亮抑酶肽、抑酶肽、苯丁抑制素。也可以包括 0.5mM最终浓度的苯甲基磺酰氟(PMSF)。

提取物于4℃以18000xg离心30分钟。得到的上清经过直链淀粉树脂 (Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)，此树脂结合融合 体的MBP结构域。一旦冲洗柱子，在与提取缓冲液相同的缓冲液，无 DTT和蛋白酶抑制剂，但含10mM麦芽糖中洗脱结合的MBPzFGF5融 合体。

以1∶100(w/w)牛凝血酶对MBPzFGF5融合体处理MBPzFGF5的洗 脱集合。切割反应允许在室温进行6至8小时，此后使用和上述直链淀 粉亲和层析相同的洗脱缓冲液，反应混合物经过苯基淀粉溶素琼脂糖床 (Pharmacia LKB Biotechnology，Piscatawaym，NJ)以除去凝血糖。

将经过的组份，含有切割产物zFGF5和自由MBP结构域，加到Toso Haas肝素亲和基质中(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，此基质已在 0.5M Nacl、20mM Hepes、0.01M EDTA、pH7.4中平衡。在此条件下 MBP和zFGF5都结合到肝素上。用2至3柱体积在柱缓冲液中形成的 0.5M Nacl至2.0 Nacl之间的梯度洗脱结合蛋白。

MBP洗脱得早，在大约0.7M Nacl，切割的zFGF5在大约1.3M Nacl处 洗脱。收集的zFGF5组份经过直链淀粉步再一次去除任何残余的 MBPzFGF5，MBPzFGF5是次要污染物。纯化的物质命名为zFGF5- Hep2，在还原SDS-PAGE分析中在20KDa处显示单一高纯的种类。

氨基酸N-末端测序产生天然的N-末端序列，但质量分光光度测量 法数据揭示分子量，表明C-末端一害在SEQ ID NO：2的196位残基(赖 氨酸)处被截短，此处存在“二碱性位点”。

zFGF5蛋白在1.3M Nacl中非常稳定。一旦进PBS中透析，zFGF5聚 合并离开溶液相。因而包括肝素和其它“聚阴离子”的配方可以用以 防止纯zFGF5的聚合。 实施例11抗体的合成

使用本领域已知和以前描述的标准技术，用肽 QTRADDVSRKQLRLYC(SEQ ID NO：2 40位至56位氨基酸残基)，命 名为zFGF-1；YTTVTKRSRRIRPTHRAC(SEQ ID NO：2 191至207 位氨基酸残基，C-末端带有附加的胱氨酸)，命名为zFGF-5或SEQ ID NO：2中显示的全长zFGF5多肽，加上MPB融合蛋白，命名为MBP- FGF5，通过免疫豚鼠、兔和小鼠合成zFGF5的抗体。使用顺丁烯二酰 亚胺活化的KLH(Pierce chmical Co.，Rockford，IL)通过胱氨酸基使肽 偶联。

表7是动物、免疫水平和抗体分离的描述。

                               表7 肽或蛋白 zFGF5-1 动物  免疫水平            抗体产生 豚鼠  50μg/动物(初始)    亲和纯化和IgG分级分离的       250g/动物(加强) 兔    100μg/动物(初始)   亲和纯化和IgG分级分离的       50g/动物(加强) zFGF5-1 豚鼠  50μg/动物(初始)    亲和纯化和IgG分级分离的       250g/动物(加强) 兔    100μg/动物(初始)   亲和纯化和IgG分级分离的       50g/动物(加强) zFGF5 MBP 小鼠  20μg/动物(初始)    亲和纯化和IgG分级分离的       10g/动物(加强) 兔    200μg/动物(初始)   亲和纯化和IgG分级分离的       100g/动物(加强) 实施例12 zFGF5对ob/ob小鼠的影响

使用雌性ob/ob小鼠(C57B1/6J，Jackson Labs，Bar Harbor，ME)检 测zFGF5对脂肪细胞和脂肪代谢的影响。小鼠是肥胖的、具胰岛素抗 性的并有“脂肪骨”。对小鼠称重并发现所有都是相同重量，如实施例 7所述，给每只小鼠IV注射1011颗粒AdCMVzFGF5或盐水或Ad5CMV- GFP作为对照。注射后17天，注射Ad5CMV-GFP的对照小鼠比注射那 天增加5.342±0.5克体重，而AdCMVzFGF-5处理的小鼠丢失了3.183 ±0.743克体重。

从前面所述，可以理解尽管为了说明的目的已描述了本发明特殊的实 施方案，但在不背离本发明精神和范围的情况下，可以进行各种修改。 因此，本发明并不受除附加权利要求之外的限制。

              序列表 (1)基本信息

(i)申请人：ZymoGenetics，Inc.

           1201 Eastlake Avenue East

           Seattle，Washington 98102

           United States of America

(ii)发明名称：成纤维细胞生长因子同系物

(iii)序列数目：20

(iv)联系地址：

    (A)地址：ZymoGenetics，Inc.

    (B)街道：1201 Eastlake Avenue East

    (C)城市：Seattle

    (D)州名：WA

    (E)国家：USA

    (F)邮政编码：98102   (v)计算机可读形式

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：DOS

    (D)软件：FastSEQ，Windows版本2.0

(vi)目前申请资料：

    (A)申请号：

    (B)递交日：

    (C)分类：

(vii)在先申请资料：

    (A)申请号：

    (B)递交日：

(viii)律师/代理人信息：

    (A)名称：Sawislak，Deborah A

    (B)登记号：37,438

    (C)文件/著录号：96-20

(ix)电信信息：

    (A)电话：206-442-6672

    (B)传真：206-442-6678 (2)关于SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征

    (A)长度：917个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

    (A)名称/关键：编码序列

    (B)位置：1...621

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： ATG TAT TCA GCG CCC TCC GCC TGC ACT TGC CTG TGT TTA CAC TTC CTG      48 Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu  1               5                  10                  15 CTG CTG TGC TTC CAG GTA CAG GTG CTG GTT GCC GAG GAG AAC GTG GAC      96 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp

        20                  25                  30 TTC CGC ATC CAC GTG GAG AAC CAG ACG CGG GCT CGG GAC GAT GTG AGC     144 Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser

    35                  40                  45 CGT AAG CAG CTG CGG CTG TAC CAG CTC TAC AGC CGG ACC AGT GGG AAA     192 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys

50                  55                  60 CAC ATC CAG GTC CTG GGC CGC AGG ATC AGT GCC CGC GGC GAG GAT GGG      240 His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65                  70                  75                  80 GAC AAG TAT GCC CAG CTC CTA GTG GAG ACA GAC ACC TTC GGT AGT CAA      288 Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln

            85                  90                  95 GTC CGG ATC AAG GGC AAG GAG ACG GAA TTC TAC CTG TGC ATG AAC CGC      336 Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg

        100                 105                 110 AAA GGC AAG CTC GTG GGG AAG CCC GAT GGC ACC AGC AAG GAG TGT GTG      384 Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val

    115                 120                 125 TTC ATC GAG AAG GTT CTG GAG AAC AAC TAC ACG GCC CTG ATG TCG GCT      432 Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala

130                 135                 140 AAG TAC TCC GGC TGG TAC GTG GGC TTC ACC AAG AAG GGG CGG CCG CGG      480 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145                 150                 155                 160 AAG GGC CCC AAG ACC CGG GAG AAC CAG CAG GAC GTG CAT TTC ATG AAG      528 Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys

            165                 170                 175 CGC TAC CCC AAG GGG CAG CCG GAG CTT CAG AAG CCC TTC AAG TAC ACG      576 Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr

        180                 185                 190 ACG GTG ACC AAG AGG TCC CGT CGG ATC CGG CCC ACA CAC CCT GCC TAGGC    626 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala

    195                 200                 205 CACCCCGCCG CGGCCCTCAG GTCGCCCTGG CCACACTCAC ACTCCCAGAA AACTGCATCA    686 GAGGAATATT TTTACATGAA AAATAAGGAT TTTATTGTTG ACTTGAAACC CCCGATGACA    746 AAAGACTCAC GCAAAGGGAC TGTAGTCAAC CCACAGGTGC TTGTCTCTCT CTAGGAACAG    806 ACAACTCTAA ACTCGTCCCC AGAGGAGGAC TTGAATGAGG AAACCAACAC TTTGAGAAAC    866 CAAAGTCCTT TTTCCCAAAG GTTCTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTCGA G             917 (2)关于SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征

    (A)长度：207个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：蛋白质

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2： Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu  1               5                  10                  15 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp

        20                  25                  30     Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser

    35                  40                  45 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys

50                  55                  60 His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65                  70                  75                  80 Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln

            85                  90                  95 Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg

        100                 105                 110 Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val

    115                 120                 125 Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala

130                 135                 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145                 150                 155                 160 Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys

            165                 170                 175 Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr

        180                 185                 190 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala

    195                 200                 205 (2)关于SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC11676

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3： GGACTTGACT ACCGAAGGTG TCTG                                         24 (2)关于SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征

    (A)长度：23个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC11677

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： GTCGATGTGA GCCGTAAGCA GCT                                          23 (2)关于SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征

    (A)长度：26个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC12053

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5： GCATACTTGT CCCCATCCTC GCCGCG                                       26 (2)关于SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征

    (A)长度：621个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6： ATGTAYWSNG CNCCNWSNGC NTGYACNTGY YTNTGYYTNC AYTTYYTNYT NYTNTGYTTY     60 CARGTNCARG TNYTNGTNGC NGARGARAAY GTNGAYTTYM GNATHGAYGT NGARAARCAR    120 ACNMGNGCNM GNGAYGAYGT NWSNMGNAAR CARYTNMGNY TNTAYCARYT NTAYWSNMGN    180 ACNWSNGGNA ARCAYATHCA RGTNYTNGGN MGNMGNATHW SNGCNMGNGG NGARGAYGGN    240 GAYAARTAYG CNCARYTNYT NGTNGARACN GAYACNTTYG GNWSNCARGT NMGNATHAAR    300 GGNAARGARA CNGARTTYTA YYTNTGYATG AAYMGNAARG GNAARYTNGT NGGNAARCCN    360 GAYGGNACNW SNAARGARTG YGTNTTYATH GARAARGTNY TNGARAAYAA YTAYACNGCN    420 YTNATGWSNG CNAARTAYWS NGGNTGGTAY GTNGGNTTYA CNAARAARGG NMGNCCNMGN    480 AARGGNCCNA ARACNMGNGA RAAYCARCAR GAYGTNCAYT TYATGAARMG NTAYCCNAAR    540 GGNCARCCNG ARYTNCARAA RCCNTTYAAR TAYACNACNG TNACNAARMG NWSNMGNMGN    600 ATHMGNCCNA CNCAYCCNGC N                                              621 (2)关于SEQ ID NO：7的信息

((i)序列特征

    (A)长度：47个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC12652

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7： TATTTATCTA GACTGGTTCC GCGTGCCGCC GAGGAGAACG TGGACTT                  47 (2)关于SEQ ID NO：8的信息

(i)序列特征

    (i)序列特征

    (A)长度：33个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC12631

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8： GTATTTGTCG ACTCAGGCAG GGTGTGTGGG CCG                                  33 (2)关于SEQ ID NO：9的信息

(i)序列特征

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC15290

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9： GCCGAGGAGA ACGTGGACTT CC                                             22 (2)关于SEQ ID NO：10的信息

(i)序列特征

    (A)长度：47个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC15270

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10： TATTTATCTA GAGATGACGA TGACAAGGCC GAGGAGAACG TGGACTT                  47 (2)关于SEQ ID NO：11的信息

(i)序列特征

    (A)长度：41个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC13497

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11： AGCATTGCTA AAGAAGAAGG TGTAAGCTTG GACAAGAGAG A                        41 (2)关于SEQ ID NO：12的信息

(i)序列特征

    (A)长度：63个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC15131

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12： GGTGTAAGCT TGGACAAGAG AGAGGAGAAC GTGGACTTCC GCATCCACGT GGAGAACCAG    60 ACG                                                                  63 (2)关于SEQ ID NO：13的信息

(i)序列特征

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC15134

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13： CCGGCTGTAG AGCTGGTACA GCCGCAGCTG CTTACGGCT                           39 (2)关于SEQ ID NO：14的信息

(i)序列特征

    (A)长度：42个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC13529

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14： CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CC                       42 (2)关于SEQ ID NO：15的信息

(i)序列特征

    (A)长度：61个氨基酸

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC13525

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15： ACGACGGTGA CCAAGAGGTC CCGTCGGATC CGGCCCACAC ACCCTGCCTA GGGGGAATTC     60 G                                                                     61 (2)关于SEQ ID NO：16的信息

(i)序列特征

    (A)长度：61个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC13526

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16： CAAACAGGCA GCCCTAGAAT ACTAGTGTCG ACTCGAGGAT CCGAATTCCC CCTAGGCAGG     60 G                                                                     61 (2)关于SEQ ID NO：17的信息

(i)序列特征

    (A)长度：44个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC13528

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17： CTCAAAAATT ATAAAAATAT CCAAACAGGC AGCCCTAGAA TACT                     44 (2)关于SEQ ID NO：18的信息    

(i)序列特征

    (A)长度：62个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线形

(vii)中间来源：

    (B)克隆：ZC15132

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18： CAGCCGCAGC TGCTTAGCGC TCACATCGTC CCGAGCCCGC GTCTGGTTCT CCACGTGGAT GC   62 (2)关于SEQ ID NO：19的信息

(i)序列特征

    (A)长度：141个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19： AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGTGTAAGC TTGGACAAGA GAGAGGAGAA CGTGGACTTC       60 CGCATCCACG TGGAGAACCA GACGCGGGCT CGGGACGATG TGAGCCGTAA GCAGCTGCGG      120 CTGTACCAGC TCTACAGCCG G                                                141 (2)关于SEQ ID NO：20的信息

(i)序列特征

    (A)长度：144个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20： CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CCCGTCGGAT CCGGCCCACA    60 CACCCTGCCT AGGGGGAATT CGGATCCTCG AGTCGACACT AGTATTCTAG GGCTGCCTGT   120 TTGGATATTT TTATAATTTT TGAG                                          144

相关申请的参考

本申请和1996年10月16日申请的临时申请60/028 646相关。在 35U.S.C.§119(e)(1)下，本申请权利要求书受益于所述临时申请。