一种得自海洋无脊椎动物的天然无毒多色荧光蛋白染料和含有所述染料的组合物及其应用
阅读：885发布：2020-12-17
专利汇可以提供一种得自海洋无脊椎动物的天然无毒多色荧光蛋白染料和含有所述染料的组合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从非 生物 荧光 海产棘皮动物明玉参中提取、纯化和鉴定天然环境友好无毒细胞渗透的多色荧光 蛋白质 染料的方法，以及含有此染料的组合物和此染料的各种用途。，下面是一种得自海洋无脊椎动物的天然无毒多色荧光蛋白染料和含有所述染料的组合物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种生物活性半纯化提取液，其中含有得自海洋生物明玉参其的雌性 性腺亦即卵巢组织的无毒蛋白荧光染料，所述海洋生物明玉参出现在潮 水间、浸没水中、浅滩处和深水中、通常大量出现在背阴处，例如acloves、 裂缝处、暗礁处、悬突处、岩石和多砂的栖息地；具有暗至亮色、有或 无外和内骨骼，固着的、定栖的漂流物，有各种游动力量的自游生物， 通常习惯于夜间活动，易于活跃地捕食，有或没有荧光，具有体外受精 的卵，并且荧光染料产生UVB、UVA、可见光和红外光部分至所有波长范 围的发射。
2.权利要求1中所述的染料用作天然荧光染料并具有下列特征：
1.为不可还原的染料，
2.不是合成化合物而是天然化合物，
3.染料的粗提物是淡黄橙色的，
4.裸眼在日光灯下观察时，部分纯化的染料是亮黄色的，
5.在管灯下，发出多色的色彩，
6.以液体形式存在，
7.溶于70％的乙醇，
8.在试验中70％的乙醇可以进一步被水稀释，
9.带负电荷，
10.醇溶液的pH为6.8-7.5，
11.不存在还原性荧光基团，
12.染液实际上是蛋白质，
13.染料对大肠杆菌无毒，
14.染料对例如牡蛎卵和精子的真核细胞无毒，
15.染料是细胞膜渗透的，
16.可以渗透细胞核膜，
17.染色染色质，
18.染液的TLC显示四种化合物具有Rf值：0.917、0.818、0.661、 0.463，
19.HPLC中蛋白质的停留时间通过UV检测器在280nm显示7个峰值，
20.峰1的停留时间为2.1，并且其面积为116103，
21.峰2的停留时间为2.5，并且其面积为38205，
22.峰3的停留时间为3.7，并且其面积为7332，
23.峰4的停留时间为6.1，并且其面积为31924，
24.峰5的停留时间为6.8，并且其面积为535，
25.峰6的停留时间为7.6，并且其面积为3684，
26.峰7的停留时间为8.8，并且其面积为89653，
27.缩氨酸的停留时间通过HPLC使用UV检测器在205nm具有10个峰 值，
28.其中具有碳水化合物，
29.其中具有糖蛋白，
30.其导致外源凝集素类凝聚，
31.其凝聚大肠杆菌
32.凝聚群落不死，并显示荧光性，
33.染料将精子凝聚到牡蛎的卵膜，
34.其促进精子授精并提高牡蛎卵的受精率，
35.染液在4℃储存，
36.一旦其粘附到细胞膜，其荧光性保持几天，
37.一旦在细胞着色，其不会发生光致退色，
38.染料不染色原核生物的死细胞，
39.染料不染色牡蛎的死细胞，
40.即便是在-20℃下冷冻，染料的荧光也不会改变，在此温度下 分子不可能象在从发光生物体得到的提取物中那样获得活化所必 须的能量，
41.色素和染料是在分光光度计不同波长的紫外线和可见光激发下 发出荧光的荧光染料，
42.紫外线、可见光谱激发的波长在351nm、580nm、720nm有峰值， 并且当在351nm激发时，荧光发射光谱分析为400-600nm，
43.发射在450nm和550nm有两个峰值，
44.蘸有浓度为1∶20000稀释的染液的Whatman Filter no.1通过具 有260-280nm范围紫外灯泡的紫外透照器和Gel Documentation系 下的物理检查，发出蓝绿色的荧光，
45.在外部荧光显微镜荧光立方晶体三种不同波长的紫外线和可见 光范围，染料发出三种不同颜色的荧光，
46.当附着于细胞膜时，在外部荧光显微镜荧光立方晶体三种不同 波长的紫外线和可见光范围，染料发出三种不同颜色的荧光，
47.染液在330nm-385nm的UV立方晶格激发时，在450nm-470nm存在 蓝色荧光发射，
48.染液在450nm-480nm的WB立方晶格激发时，在510nm-570nm存在 绿色荧光发射，
49.染液在510nm-550nm的WG立方晶格激发时，在610nm-650nm存在 橙色荧光发射，
50.在外部荧光显微镜的通常透射灯泡下以100倍物镜观察，染料 发出淡黄灰色色彩，
51.当染料黏附到细胞膜时以WU 330nm-385nm激发范围的紫外线立 方晶格激发时，产生470nm-500nm范围的蓝色荧光发射，
52.当染料黏附到细胞膜时以450nm-480nm激发范围的WB立方晶格 激发时，产生570nm-610nm范围的绿色荧光发射，
53.当染料黏附到细胞膜时以510nm-550nm激发范围的WG立方晶格 激发时，产生610nm-650nm范围的橙色荧光发射，
54.当染料黏附到细胞膜时，在外部荧光显微镜的通常透射灯泡下 以100倍物镜观察，黏附到细胞膜上的染料发出淡黄灰色色彩，
55.甚至在1∶400000倍的稀释比例染料还发出荧光色，
56.细胞膜染色后染料的荧光性是非常光稳定的，其不能在直射光 的长时间照射下变质，并且即便是在-20℃下冷冻，染料的荧光 也不会改变，在该温度下分子不可能象在从发光生物体得到的提 取物中那样获得活化所必须的能量。
3.权利要求1所述的染料，其中染料在不同激发波长处的多色发射都可 以与市场已有的荧光染料显微着色剂相比。
4.权利要求1所述的染料，其中当前染料的蓝色荧光可以与DAPI荧光染 料在同样激发波长范围的同样颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物 学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记试剂盒的组分。
5.权利要求1所述的染料，其中所述染料在可见范围的黄色荧光可以与 金胺的同样颜色发射颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫 化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
6.权利要求1所述的染料，其中所述染料在可见范围的黄色荧光可以与 FITC的同样颜色发射颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫 化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
7.权利要求1所述的染料，其中橙色荧光发色可以与碘化钾锭荧光染料 的橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
8.权利要求1所述的染料，其中橙色荧光发色可以与若丹明荧光染料的 橙色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物 学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
9.权利要求1所述的染料，其中橙色荧光发色可以与TRITC荧光染料的橙 色荧光相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
10.权利要求1所述的染料，其中该染料在室温稳定并具有长的搁置寿命。
11.权利要求1所述的染料，其中所述染料的分子和放射性试剂盒可以在 室温下出口。
12.权利要求1所述的染料，其中该单一染料有至少100种不同的市场现 有的明确荧光染料(DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、 吖啶、金胺、若丹明、TRITC、和碘化甲锭)的特点。
13.权利要求1所述的染料，其中它可以用在目前所有使用藻胆蛋白的用 途中，与其不同的是该染料直到冷冻也不损失荧光。
14.权利要求1所述的染料，其中在显微镜的亮视野下，当在10倍物镜下 观察时，蓝灰色色调产生相差效果，这对于快速筛选细胞遗传、细胞学 和组织化学载物片是有用的，并可以节省在显微镜相差附件的额外花费。
15.权利要求1所述的染料，其中在通常的透射光显微镜的100倍油镜下 观察，蛋黄的蛋白质、活跃分裂细胞的核原生质和染色质显示着色的不 同颜色，前者为棕黄色，后者为黄色，最后的细胞组分为深蓝色，这对 可以在细胞的各种组织化学组分上看到的效果进行快速生物测定是有用 的。
16.权利要求1所述的染料，其中荧光颜色的发射服从荧光的斯托克定律。
17.权利要求1所述的染料，其中用柯达胶卷的显微照相显示相邻的颜色 发射波长的色调，如在外部荧光显微镜下的蓝色荧光。
18.权利要求1所述的染料，其中用柯达胶卷的显微照相显示相邻的颜色 发射波长的色调，例如通过外部荧光显微镜在显微照相看到黄色荧光时， 还出现绿色色调。
19.权利要求1所述的染料，其中通过外部荧光显微镜在显微照相看到橙 色荧光时，还出现红色色调。
20.权利要求1所述的染料，其中在所有荧光下看到的细胞遗传载物片产 生细胞和细胞组分与并无样片而仅有染料的背景颜色对比的复染色效 果。
21.权利要求1所述的染料，其中染料用水稀释1∶400,000倍以上，可以 在不同波长得到6种颜色的荧光。
22.权利要求1所述的染料，其中染料用水稀释1∶400,000倍以上，无论 是部分纯化的染液还是着色的细胞，都可以在3种不同波长得到6种颜色 的荧光。
23.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于制备涂料组合物和油墨。
24.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于泄漏检查。
25.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于海底探针。
26.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于分子诊断所使用的荧光分子探针原位杂交试剂盒。
27.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非 放射性标记和检测试剂盒的组分。
28.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于免疫荧光探测中。
29.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片断的复染 剂。
30.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于单和多色流式细胞计应用中的单或多细胞荧光定量中。
31.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，可以用在处于0℃以下的田间条件的试验中。
32.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，可以用作外部荧光显微镜的荧光染料着色剂。
33.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于快速检查健康食品工业、化妆品工业、制药工业和化 学工业的生物污染物。
34.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于快速测定实验室培养物中的生物污染物。
35.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于在田间条件下快速检查生物污染物。
36.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于胆碱酯酶的竞争性抑制剂。
37.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于细胞渗透的染料组合物。
38.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，用于提高受精率。
39.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及 1∶20000的合适的添加剂，以得到不同波长下的三色荧光。
40.一种荧光组合物，其中含有权利要求1所述的生物活性提取物以及合 适的添加剂，以在透射光下使细胞的不同生物化学组分得到相位差和组 织化学复染色效果。
41.一种皮肤护理组合物，含有生物活性提取物和生理学和化妆品可接 受的赋形剂，例如稀释剂、分散体或载体。
42.一种含有得自海洋生物卵巢组织的荧光染料的生物活性提取液，用 于：
1.用于各种涂料、油墨、纺织品中的荧光色；
2.一种荧光染料组合物，用于漂白和增亮聚合物；
3.用于全光谱的荧光染料进行泄漏检测；
4.用于自动化学计量系统中；
5.用于标记坠毁飞机、救生船和军事装备如火箭的位置；
6.海底探测器；
7.作为美容霜和洗液中色素细胞的防晒组分；
8.用于分子诊断的荧光原位杂交应用试剂盒组分；
9.作为标记DNA、RNA、蛋白质和酶的生物化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的非放射性标记和探测试剂盒的组分；
10.免疫荧光检测；
11.DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片断的复染剂；
12.外部荧光显微镜的荧光染料着色剂；
13.快速检查健康食品工业、化妆品工业中、药物和化学工业中的 生物污染物；
14.快速测定实验室培养基中的生物污染物；
15.在田间条件下快速检测生物污染物；
16.凝集组合物；
17.天然着色剂；
18.海生染料在超纯水中1∶20000的生物活性组合物，从而在6个不 同波长产生三色荧光，和在透射光下的相差效果；
19.用于各种在零下温度范围进行的荧光应用的染料；
20.在水产养殖中用于提高受精率；
21.用于细胞膜渗透染料组合物；
22.用于在组织培养物中辨别死细胞和活细胞；
23.用于生物探测器染料组合物；和
24.用于分子和微生物试剂盒的染料组合物。
43.一种从海参明玉参中提取天然荧光染料的方法，所述方法包括下列步 骤：
a)从海边采集材料，换海水并保存在实验室的缸中，不经过任何机 械换气而过夜，
b)剖开步骤a)中的动物并除去雌性性腺，
c)用70％的乙醇萃取步骤(c)中的性腺至少3次，而没有匀化组织，
d)得到含有荧光染料的溶液并标记为“染料的储备溶液”。
44.权利要求43所述的方法，其中染料以1∶400,000倍或更高的比例稀释， 其在三个不同波长得到六种颜色的荧光。
45.权利要求43所述的方法，其中染料的染色部分连接到带负电荷的蛋白 组分。
46.权利要求43所述的方法，其中染料用70％的醇稀释9000倍，并且对于 每25-50微升海水另外滴加1微升，海水中以1∶225,000-1∶400000和更 高的比例存在卵和细菌，以在三种不同的激发波长得到六种颜色的荧 光。
47.权利要求43所述的方法，其中生物检验通过使用在1∶40000、1∶20000、 1∶10000、1∶5000和1∶2500的稀释度的稀释液通过真核细胞和原核细 胞的存活率评价染料的无毒特性。
技术领域
本发明涉及一种从海洋无脊椎动物，明玉参(Holothuria scabra) 的卵巢组织中提取的天然无毒多色荧光蛋白染料。本发明还提供了一种提 取、部分纯化和鉴定此新天然染料的方法。还报告了海洋动物无毒、细胞 膜渗透的、外源凝集素类胶结的、易于授精和受精的性能。提及的海洋无 脊椎动物尤其是海参。海参是棘皮动物，属于棘皮动物类群的成员，棘皮 动物也包括海星和海胆。科学上称谓的海参具有伸长的管状身体，其具有 弹性并且没有骨质骨架。它们具有以下分类学位置。
背景技术
所述海参具有以下分类学位置：
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
枝手亚纲(Dendrochirotacea)
无足亚纲(Apodacea)
目：枝手目(Dendrochirota)
盾手目(Aspidochirota)
板足海参目(Elasipoda)
芋海参目(Molpadonia)
无足目(Apoda)
在这些目中，海参明玉参属于：
目：盾手目(Aspidochirota)
科：海参科
属：海参属
种：Scabra
棘皮动物是腔肠无脊椎动物，仅产于海中，从未有陆生，成年的形态 是未分节的，呈五基数的放射状辐射对称，没有头或脑，与所有其它动物 的区别在于骨骼和体腔的结构特点。海参纲有身体两侧对称的动物，通常 沿口面-远口面的轴延长，在一端或接近一端的地方有口，在另一端或接 近另一端的地方有肛门。其体表是粗糙的，内骨骼缩小成细的针状或片状， 深入体表中，附着于水的维管系统的一副触须环绕口周围；通常有吸足或 管状足并且是运动的；消化道为长的并是盘绕的，并且泄殖腔通常有呼吸 树；性别通常是分开的，并且生殖腺为单一或成对丛生的细管。它们是定 栖型，通过前端或后端的放射突出体或者附着于硬的基层上，或者穴居于 软的沉积物内。存在超过1000种的holothuroids。其长度从2cm到2米。其 中还存在其栖息地不受海洋深度限制的动物。据报道一些物种50％的生活 方式在4000m，90％的生活方式在8000m深度。也有人将明玉参这一种称为 糙海参(Metriatyla scabra Jaegea)，它广泛分布于东非、红海、孟加 拉湾、东印度、澳大利亚、日本、南太平洋、菲律宾、印度洋和其它印度 洋-太平洋区域。在沙巴洲、马来西亚和印度尼西亚和其它印度洋-太平洋 国家它被用作人/动物的消费品(consumption)。
色素属于无机和有机类。前者是用于各种装饰和绘画等目的的无机化 合物。有机色素如有机染料要追溯到古代。即使是在圣经时代(Biblical times)之前，近东和远东国家报道了由植物如巴西木(Brazil wood)、 log-wood、波斯浆果靛蓝(Persian berry indigo)和茜草得到的染料的 用途(George L.Clark，1966，《化学百科全书》(“Encyclopaedia of chemistry”)，第2版，833-835页)。Debra K.Hobson和David S.Wales描 述了“绿色染料”，它是作为一些活的生物体如真菌、蓝绿藻类、海胆、 海星类节肢动物和珊瑚礁类腔肠动物的第二代新产物而产生的(Journal of the Society of Dyers and Colourists(JSDC)，114，42-44，1998)。 这些是蒽醌化合物，历史上它们在染料工业中非常重要。着色剂档案-染 料A卷(Stainsfile-Dyes A)给出了264种染料的染料索引(Dye Index)。 它们之中仅6种是从所有种类的生物体得到的天然染料。 Http：//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyts.htm
非常需要细胞渗透的荧光染料用于活细胞功能、药物传递的研究和各 种细胞器官的研究。真核细胞可以具有几个由薄膜隔开的层，然而细菌细 胞可以由单层组成。渗透性是细胞膜的特征。好的染料可以在一个激发和 不同激发以不同的颜色显示细胞的不同部分。附着于各种蛋白的荧光基团 已经合成并公开在Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》 (Handbook of fluorescent probes and Research chemicals)中，1996. 第126-128页。阐述了包括蓝色荧光Cascade blue和新式的AMCA-S染料到 红的荧光Texas Red染料和藻胆蛋白。其包括高亮度Oregon绿共轭物、 Rhodol绿共轭物；bodipy共轭物；称为Eosin的中级试剂；Red荧光 Rhodamine Rd-X和Texas Red-X共轭物；藻胆蛋白共轭物；Cascade蓝和AMCA -S共轭物。
所有这些染料是合成物质并且它们中的一个发出特定的光谱范围。综 合2-3种染料然后进行多色染色实验。
相同的染料还产生jasplakinolide，由细胞渗透F-肌动蛋白探针从海 绵Jaspis johnstoni中析出的大环肽。然而它有毒并显示出杀菌、杀虫、 抗增殖活性。
市场上目前使用的大部分染料都是合成物质。着色剂档案-染料A卷给 出了264种染料的染料索引。其中258种染料是合成物质，仅仅6种为天然 染料(http：//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyes)。合成染料的 生产通常需要在高温下使用强酸、碱金属和贵金属作为催化剂。这使得该 方法和排出的废液引起环境退化。对于现有的染料，染料工业不断地在寻 求便宜和对环境无害的生产路线。(Hobson和Wales，1998。绿色染料， Journal of the Society of Dyers and colourists (JSDC)，1998，114，42-44)。
然而所有这些染料并不是荧光性的。Bitplane产物已经显示出市场上 123种荧光色素的目录及其激励和发射光谱 (http：//www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.ht m)。
荧光染料广泛地用于分子探针的标记，通过荧光显微术用于定位生物 学结构，例如用于免疫测定、原位杂交研究中标记核苷酸和低聚核苷酸， 粘合在聚合微球和影像研究中的细胞染色。染料还用于例如光动力学治疗 方法中细胞的选择性破坏。(Haughland，R.P和Kang，H.C.，US 4,774,339；1988年9月27日；Haughland，R.P和Kang，H.C.，US 5,248,782；1993年9月28日)。
荧光是原子或分子在由较高电子态转变到较低电子态发出辐射线的现 象。其遵循斯托克定律，根据该定律荧光辐射的波长总是比激励辐射的波 长要长。荧光过程与磷光和生物荧光相当不同。术语荧光在激励和辐射发 射之间的间隔很小(10-8-10-3秒)的时候使用。磷光现象中吸收与辐射之 间的时间间隔可以为10-3秒至几小时(R.Norman Jones，1966，《化学百科 全书》，第2版，1966，第435-436页)。术语生物荧光用于生物机体中特定细 胞在特定时间化学反应产生的光线。
Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》(第6版，美 国1996年印刷)中报导了很多种荧光染料。在该书中第1-6页，Ian D. Johnson(1996)详细描述了在特定的称为荧光团或荧光染料(通常为多 芳香烃或杂环)的分子中发荧光的方法以及检测方法。目前最常用的荧光 染料为荧光素和基于荧光素的和BODIPY染料及其衍生物。作者已经提及了 所有这些染料的缺陷，并公开了染料特征的选择。许多荧光染料的衍生物 及其合成已经公开在美国专利中(Haughland，R.P和Kang，H.C.US 4,774,339，1988年9月27日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,248,782，1993年9月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,187,288，1993年2月16日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,274,113，1993年12月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,433,896，1995年7月18日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,451,663，1995年9月19日出版)。
Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C 和Graham Ronald J在WO0058406(公开日2000年10月5日)报导了可以作 为分子探针的4，7-二氯若丹明染料。Collin，P.D.在其1998年6月23日、1999 年3月2日和1999年11月16日的美国专利US 5,770,205，US 5,876,762和US 5,985,330中已经公开了海参各个身体部分的治疗学特性。
R.Norman Jones在The encycopaedia of chemistry，1996年第2版的 第435-436页中已经公开了良好的荧光特性。根据该文所述，荧光分子必 须具有良好的发色系以吸收激发能，并且在荧光迟延作用之前具有屏蔽机 制以避免激发能快速消散为振动移动。他还指出，虽然分子结构与化合物 的荧光之间的关系还没有为人们透彻的理解，但是其中存在着与荧光作用 有关的某些基团。例如，有机分子中存在的酞和芳族结构例如蒽和萘并萘 尤其与明亮的荧光作用有关。少数无机化合物在液态或固态较强的发荧 光，荧光作用常常通过微量杂质的存在而改性。
各种类胡萝卜素色素据报道得自生产类胡萝卜素的细菌种(美国专利 US 5,935,808，1999年8月10日公开，发明人：Hirschberg等和US 5.858,761，1999年1月12日公开，发明人：Tsubokura等)。Collin；Peter Donald在其2000年5月2日公开的美国专利US 6,055,936中公开了海参类胡 萝卜素脂类级分及其方法。Bandaranayake，W.M.和Des Rocher，A 1999(海 洋生物学133；163-169)中描述了得自澳大利亚的Holothuiria atra体壁、 卵巢和内脏的类胡萝卜素色素。
很少报道有用的荧光天然染料。Shimomura，O，Johnson，F.H.和 Saiga，Y在《细胞和比较生理学杂志》，59，223-239，1962，Chalfie M在 1：Photochem Photobiol 1995年10月62(4)：651-6《未淬火的荧光蛋白》 中描述了从太平洋海蜇Aequora aequora中得到的绿色荧光蛋白GFP； Youvan DC，Michel-Beyerie ME在国家生物工艺学1996年10月 14(10)：1219-20《GFP的结构和荧光作用机制》，Chalfie M，Yuan Tu，Ghia Euskirchen，William W.Ward，Douglas C Prasher在《科学》 263(1994)802-805报道了纯化的GFP为238胺酸蛋白。纯化的GFP在395nm吸 收最大并在470nm有一个次级峰的蓝光，并在509nm的发射峰发出绿光并在 540纳米具有肩峰。这些荧光非常稳定并且几乎没有观察到光致漂白。
在红和黄范围内的其它波长具有荧光作用的GFP公开自非生物荧光的 珊瑚虫，尤其Discosoma珊瑚。Gurskaya NG，fradkov声频，terskikh一 个，matz MV，labas YA，Martynov VI，Yanushevich YG，Lukyanov KA， Lukyanov SA在1：FEBS Lett 2001年10月19日；507(1)：16-20中公开了作 为远红外荧光蛋白来源的GFP类色蛋白。Wachter RM，Elsliger MA，Kallio K，Hanson GT，Remington SJ.在1：Structure 1998年10月15 日；6(10)：1267-77中公开了“绿色荧光蛋白发黄光变体中结构碱的谱移”。 Fradkov AF，Chen Y，Ding L，Barsova EV，Matz MV，Lukyanov SA“得 自Discosoma珊瑚的新型荧光蛋白及其具有均匀远红外荧光作用的突变 种”。在1：FEBS Lett 2000年8月18日：479(3)：127-30。其中描述了一种新 基因，用于改进在593纳米具有发射极点的红外移动蛋白，该新基因由 discosoma珊瑚克隆。名为dsFP593的蛋白与最近公开的GFP类蛋白drFP583 非常相同，在583纳米具有发射极点。它们开发了这些基因的各种突变种。 杂化突变种变体产生在616纳米具有唯一再移动发射极点的突变种变体。 Matz MV，Fradkov AF，Labas YA，Savitsky AP，Zaraisky AG，Markelov ML，Lukyanov SA.1：Nat Biotechnolo 1999年12月：17(10)：969-73。
在东南和南大平洋国家，海参纲在保健食品和药物工业作为食品或各 种药物组合物的组分，尤其是关节炎、挫伤及其他治疗剂的应用中是为大 家所熟知的。一些美国和国际专利已经记载并筛选出来。(Fan Hui-Zeng， Yu Song，Yamanaka E，Numata K，Oka T，Suzuki N，muranaka Y在US 5519010 公开日1996年5月21日公开；Weiman，Bernard等的US 5,888,514，1999年 3月30日公开；Katsukura，Kitazato，Kenji Yamazaki，Yasundo的US 5,993,797，1999年11月30日公开；Henderson，R.W；Henderson，T和Hammd，T 的US6255295，2001年7月3日公开；Shinya的US6203827，2001年3月20日 公开；Collin Peter Donald的US 5770205，1998年6月23日公开和2000年 1月13日公开的WO 0001399；Kovalev V G，Sementsov V K，Slutskaja t n，Akulin V N，Timchishina G N的RU 2147239，2000年4月10日公开；李 兆明、朱蓓薇的CN 1286926，2001年3月14日公开；Qu Jianhong，Song Xiuqin，Zheng Fuqiang的CN1223131，1999年7月21日公开；曲建红、宋 秀芹、郑富强的CN 1142365，1997年2月12日公开；方华的CN 1312031，2001 年9月12日公开和丁存义的CN1173290，1998年2月18日公开；Collin Peter Donald的WO9937314，1999年7月29日公开。)已经公开了得自海参的组分 在抗HIV药物中的应用(Hoshino Hiroo的EP410002，公布日1991年1月30日 和Hoshino Hiroo EP495116，公布日1992年7月22日)。考虑到其重要性， 这些动物被尝试着人工培养(Annie Mercier，S C Battaglene和Jean- Francois Hamel在Journal of experimental Marine Biology and Ecology， 第249卷，第1期，89-110，2000年“热带海参明玉参的繁殖区选择和初期 移栖”)。周玮、王树海、顾在时发表的“刺参生态增殖方法”，专利号为CN 1179261，公开日1998年4月22日。
但是所有这些专利没有与本专利的主题直接相关，所以我们没有将它 们包括在给出的参考中。
Goswami，Usha和Ganguly，Anutosh已经申请了有关得自海洋无脊椎动 物的天然荧光染料的专利(CSIR，NF-140，2001年3月30号提交的美国专利 申请09/820,654)。其涉及到得自明玉参的粗提物，当其在光谱不同的紫 外区和可见区激发时具有三种不同波长的荧光品质。本发明还提供了一种 新型染料的萃取、纯化及其表征的方法，该染料为得自海参的部分纯化的 天然染料。除了该染料作为药物的性质之外，还公开了该染料作为外部荧 光(epifluorescent)着色剂和非放射性荧光染料用于原位杂交研究中分 子探针标记的用途。在这些专利现有技术中已经详述了得自陆生植物和微 生物的色素、合成染料和天然染料。(1984年6月5日公开的US 4,452,822， 发明人Shrikhande，Anil J；1994年6月14日公开的US 5,321,268，发明 人Crosby David A和Ekstrom Philip A；1995年4月11日公开的US 5,405,416，作者Swinton；Robert J；1999年1月12日公开的US 5,858,761， 发明人Tsubokura等；1999年5月11日公开的US 5,902,749，发明人 Lichtwardt等；1999年6月1日公开的US 5,908,650，发明人Lenoble等；1999 年7月6日公开的US 5,920,429发明人Burns等；1999年8月9日公开的US 5,935,808，发明人Hirschberg等；1999年11月23日公开的US 5,989,135， 发明人Welch，David Emanuel；2000年5月2日公开的US 6,055,936，发明 人collin，Peter Donald；2000年5月2日公开的US 6,056,162，发明人 Leighley，Kenneth C；2000年8月15日公开的US 6,103,006，发明人 DiPietro，Thomas C.；2000年8月29日公开的US 6,110,566，发明人White 等；2000年10月31日公开的US 6,140,041，发明人LaClai r，James J；2000 年12月26日公开的US 6,165,384，发明人Cooper等；2001年1月30日公开 的US 6,180,154，发明人Wrolstad等；1986年12月30日公开的EPO206718， 发明人Cramer Randall J；1991年1月30日公开的IE901379，发明人Lee Linda G，Mize Patrick D；1990年7月7日公开的WO9010044，发明人Robert J；1997年10月7日公开的AU704112，发明人Burns David M，Pavelka Lee A； 1999年6月24日公开的DE19755642，发明人weimer Thomas DR；1999年9月 28日公开的WO9938919，发明人Laclair James J；2000年10月5日Rosenblum Barnett B等公开的WO0058406；2000年8月15日DiPietro，Thomas C公开 的WO993891615；2000年8月29日Pavelka Lee等公开的WO9920688；2000年 8月29日White等公开的WO9920688。)还公开了荧光染料在分子生物学研 究、工业应用和救生装置等中的多种应用。
Collin，P.D在其1998年6月23日、1999年3月2日和1999年11月16日公 开的美国专利5,770,205、5,876,762和5,985,330中已经公开了海参各个 身体部分的治疗学特性。所有这些参考文献也属于本专利。
在另一专利Goswami，Usha和Anutosh Ganguly(申请号)中已经公开 了一种新型的有机硅Si-O-R型化合物和由海洋无脊椎动物明玉参的体壁萃 取液纯化得到的多色荧光天然染料。该化合物为具有酚荧光团部分并通过 硫酸酯键连接到硅母体的多糖荧色物。该硅部分是核心分子的主要部分并 参与动物的新陈代谢。该化合物中富含硫。该发明还提供了一种用于该新 化合物萃取、纯化及其表征的方法，以及得自海洋生物尤其是海参的多色 荧光染料。该专利还首次公开了新荧光化合物的化学结构，其中硅成为有 机分子和荧光基团酚类的主要部分。该专利此外提供该化合物的不平常特 性和染料的特征，并公开了其优点。染料的一些衍生物具有高或低的分子 量和用于荧光探测器中所期望的单色和多色染色应用的理想特性。此外该 化合物可以作为染料工业、化妆品工业和药物工业组合物中的易混合组 分。
Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》(美国第6版 印刷，1996)中提到的荧光染料有关的许多文献合并到该专利。在美国专 利和国际专利中已经公开了许多该荧光染料衍生物及其合成。 (Haughland，R.P和Kang，H.C.1988年9月27日公开的US4,774,339； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年9月28日公开的US5,248,782； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年2月16日公开的US5,187,288； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年12月28日公开的US5,274,113和 Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年7月18日公开的US 5,433,896； Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年9月19日公开的US 5,451,663； Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C和Graham Ronald J在2000年10月5日公开的国际申请WO0058406中报道了一种可用作 分子探针的4，7-二氯若丹明染料。)所有这些参考文献也属于本发明。
通过其早期专利和其他人的报道，申请人已经采用了不同的方法。在 我们的早期专利中报导的染料是天然染料，但是其是有毒的。不同激发波 长的光的光谱范围也是不同的。该染料是非蛋白质的液体并且不能有效地 用于活体细胞的原位研究。其在生物医学和工程科学中的应用和使用也是 不同的。
当前报道的染料虽然也是天然染料，但是其为直接从非生物荧光无脊 椎动物的卵巢细胞中提取的无毒多色荧光蛋白质。海产动物来源于海参 属，称为明玉参的海参是无毒荧光蛋白染料的一个新的来源。不同于合成 染料，在其制造中不需要使用强酸和碱金属的步骤。不同于早期公开的得 自海参卵巢的类胡萝卜素色素，这些染料并非类胡萝卜素色素。而是荧光 蛋白。当前染料中的荧光蛋白也不同于来自Jellyfish Aequorea aequorea 的发出淡色绿光的绿色荧光蛋白(GFP)。虽然具有红色或黄色范围转变的 各种不同GFPs已经公开得自其它动物。我们的方法不同于那些GFPs。我们 具有在不同紫外线和可见光频谱波长激发时发出浅和深蓝色、绿色、黄色、 橙色和红色范围内荧光的淡色荧光蛋白染料。
与大多数合成荧光染料最为不同的是，为以不同波长得到不同荧光色 调，我们的染料无须与另一种染料混合。它在三种不同激发波长发出6种 不同颜色的荧光，可以具有多重用途。当仅仅存在染液时，细胞成分显示 与基底不同的对比染色。在我们的染料中，荧光基团连在蛋白上并产生荧 光，其此外也不同于通过成环作用由第一氨基酸序列得到的GFPs载色体。 在我们的染料中，当单独的荧光基团和连在蛋白的荧光基团受到紫外线、 蓝色波长和绿色波长激发时，遵循斯托克定律发出三种不同颜色的光。
本发明的染料还是细胞渗入的并渗透入内部细胞成分的各种细胞膜 中。
只要该染料附着在细胞膜中，其在室温下可以稳定几个月并且不会在 微生物的作用下光退色和污染。不同于某些藻类和发光生物的萃取液，其 荧光没有在高温和低温下变质。
该染料对大肠杆菌和性细胞以及河口和海洋动物的幼虫是无毒的。所 以其废液不会杀死海洋和河口动物的幼虫。其为无毒性和生态友好的染 料。
本染料的另一个重要方面是其仅仅在活的和固定组织中显示荧光性。 死的个体不会被染色。本染料的一个重要方面是制备用于分子探针的非放 射就地标记和复染色的组合物和试剂盒。在不同波长的激发给出等同于 DAPI、FITC和PI以及其它市场荧光探测器的颜色效果。该染料为天然多色 荧光染料。实际上，此单一的染料包括市场上已知的123种荧光染料的波 谱的颜色(参见因特网上的Bitplane产品(荧光染料) (http：//www.bitplane.ch/public/standard/fluorochrome.htm))。
然而，本发明的另一方面是具有胶结性质的染料。
然而，本发明的另一方面是提高牡蛎精子授精和卵受精比例的染料。
然而另一方面是其在外部荧光显微镜检查法(epiflourescence microscopy)中作为无毒荧色物着色剂的应用。染料为天然染料并非合成 物质，其通过各种膜渗入并将其区别着色。本申请提供了简单而快速的检 查用于多种用途-如用于荧光的原位杂交技术的分子诊断，组织培养物的 生物污染的快速诊断、食品工业和工业制剂中的生物，流式细胞计等的方 法。
然而染料的另一方面是它作为非放射性标记试剂盒的组分，用于先进 的分子生物学用途，其中蛋白质染料用于活体细胞功能的研究。
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
枝手亚纲(Dendrochirotacea)
无足亚纲(Apodacea)
目：枝手目(Dendrochirota)
盾手目(Aspidochirota)
板足海参目(Elasipoda)
芋海参目(Molpadonia)
无足目(Apoda)
在这些目中，海参明玉参属于：
目：盾手目(Aspidochirota)
科：海参科
属：海参属
种：Scabra
棘皮动物是腔肠无脊椎动物，仅产于海中，从未有陆生，成年的形态 是未分节的，呈五基数的放射状辐射对称，没有头或脑，与所有其它动物 的区别在于骨骼和体腔的结构特点。海参纲有身体两侧对称的动物，通常 沿口面-远口面的轴延长，在一端或接近一端的地方有口，在另一端或接 近另一端的地方有肛门。其体表是粗糙的，内骨骼缩小成细的针状或片状， 深入体表中，附着于水的维管系统的一副触须环绕口周围；通常有吸足或 管状足并且是运动的；消化道为长的并是盘绕的，并且泄殖腔通常有呼吸 树；性别通常是分开的，并且生殖腺为单一或成对丛生的细管。它们是定 栖型，通过前端或后端的放射突出体或者附着于硬的基层上，或者穴居于 软的沉积物内。存在超过1000种的holothuroids。其长度从2cm到2米。其 中还存在其栖息地不受海洋深度限制的动物。据报道一些物种50％的生活 方式在4000m，90％的生活方式在8000m深度。也有人将明玉参这一种称为 糙海参(Metriatyla scabra Jaegea)，它广泛分布于东非、红海、孟加 拉湾、东印度、澳大利亚、日本、南太平洋、菲律宾、印度洋和其它印度 洋-太平洋区域。在沙巴洲、马来西亚和印度尼西亚和其它印度洋-太平洋 国家它被用作人/动物的消费品(consumption)。
色素属于无机和有机类。前者是用于各种装饰和绘画等目的的无机化 合物。有机色素如有机染料要追溯到古代。即使是在圣经时代(Biblical times)之前，近东和远东国家报道了由植物如巴西木(Brazil wood)、 log-wood、波斯浆果靛蓝(Persian berry indigo)和茜草得到的染料的 用途(George L.Clark，1966，《化学百科全书》(“Encyclopaedia of chemistry”)，第2版，833-835页)。Debra K.Hobson和David S.Wales描 述了“绿色染料”，它是作为一些活的生物体如真菌、蓝绿藻类、海胆、 海星类节肢动物和珊瑚礁类腔肠动物的第二代新产物而产生的(Journal of the Society of Dyers and Colourists(JSDC)，114，42-44，1998)。 这些是蒽醌化合物，历史上它们在染料工业中非常重要。着色剂档案-染 料A卷(Stainsfile-Dyes A)给出了264种染料的染料索引(Dye Index)。 它们之中仅6种是从所有种类的生物体得到的天然染料。 Http：//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyts.htm
非常需要细胞渗透的荧光染料用于活细胞功能、药物传递的研究和各 种细胞器官的研究。真核细胞可以具有几个由薄膜隔开的层，然而细菌细 胞可以由单层组成。渗透性是细胞膜的特征。好的染料可以在一个激发和 不同激发以不同的颜色显示细胞的不同部分。附着于各种蛋白的荧光基团 已经合成并公开在Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》 (Handbook of fluorescent probes and Research chemicals)中，1996. 第126-128页。阐述了包括蓝色荧光Cascade blue和新式的AMCA-S染料到 红的荧光Texas Red染料和藻胆蛋白。其包括高亮度Oregon绿共轭物、 Rhodol绿共轭物；bodipy共轭物；称为Eosin的中级试剂；Red荧光 Rhodamine Rd-X和Texas Red-X共轭物；藻胆蛋白共轭物；Cascade蓝和AMCA -S共轭物。
所有这些染料是合成物质并且它们中的一个发出特定的光谱范围。综 合2-3种染料然后进行多色染色实验。
相同的染料还产生jasplakinolide，由细胞渗透F-肌动蛋白探针从海 绵Jaspis johnstoni中析出的大环肽。然而它有毒并显示出杀菌、杀虫、 抗增殖活性。
市场上目前使用的大部分染料都是合成物质。着色剂档案-染料A卷给 出了264种染料的染料索引。其中258种染料是合成物质，仅仅6种为天然 染料(http：//members.pgonline.com/-bryand/dyes/dyes)。合成染料的 生产通常需要在高温下使用强酸、碱金属和贵金属作为催化剂。这使得该 方法和排出的废液引起环境退化。对于现有的染料，染料工业不断地在寻 求便宜和对环境无害的生产路线。(Hobson和Wales，1998。绿色染料， Journal of the Society of Dyers and colourists (JSDC)，1998，114，42-44)。
然而所有这些染料并不是荧光性的。Bitplane产物已经显示出市场上 123种荧光色素的目录及其激励和发射光谱 (http：//www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.ht m)。
荧光染料广泛地用于分子探针的标记，通过荧光显微术用于定位生物 学结构，例如用于免疫测定、原位杂交研究中标记核苷酸和低聚核苷酸， 粘合在聚合微球和影像研究中的细胞染色。染料还用于例如光动力学治疗 方法中细胞的选择性破坏。(Haughland，R.P和Kang，H.C.，US 4,774,339；1988年9月27日；Haughland，R.P和Kang，H.C.，US 5,248,782；1993年9月28日)。
荧光是原子或分子在由较高电子态转变到较低电子态发出辐射线的现 象。其遵循斯托克定律，根据该定律荧光辐射的波长总是比激励辐射的波 长要长。荧光过程与磷光和生物荧光相当不同。术语荧光在激励和辐射发 射之间的间隔很小(10-8-10-3秒)的时候使用。磷光现象中吸收与辐射之 间的时间间隔可以为10-3秒至几小时(R.Norman Jones，1966，《化学百科 全书》，第2版，1966，第435-436页)。术语生物荧光用于生物机体中特定细 胞在特定时间化学反应产生的光线。
Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》(第6版，美 国1996年印刷)中报导了很多种荧光染料。在该书中第1-6页，Ian D. Johnson(1996)详细描述了在特定的称为荧光团或荧光染料(通常为多 芳香烃或杂环)的分子中发荧光的方法以及检测方法。目前最常用的荧光 染料为荧光素和基于荧光素的和BODIPY染料及其衍生物。作者已经提及了 所有这些染料的缺陷，并公开了染料特征的选择。许多荧光染料的衍生物 及其合成已经公开在美国专利中(Haughland，R.P和Kang，H.C.US 4,774,339，1988年9月27日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,248,782，1993年9月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,187,288，1993年2月16日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,274,113，1993年12月28日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,433,896，1995年7月18日出版；Haughland，R.P和Kang，H.C.US 5,451,663，1995年9月19日出版)。
Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C 和Graham Ronald J在WO0058406(公开日2000年10月5日)报导了可以作 为分子探针的4，7-二氯若丹明染料。Collin，P.D.在其1998年6月23日、1999 年3月2日和1999年11月16日的美国专利US 5,770,205，US 5,876,762和US 5,985,330中已经公开了海参各个身体部分的治疗学特性。
R.Norman Jones在The encycopaedia of chemistry，1996年第2版的 第435-436页中已经公开了良好的荧光特性。根据该文所述，荧光分子必 须具有良好的发色系以吸收激发能，并且在荧光迟延作用之前具有屏蔽机 制以避免激发能快速消散为振动移动。他还指出，虽然分子结构与化合物 的荧光之间的关系还没有为人们透彻的理解，但是其中存在着与荧光作用 有关的某些基团。例如，有机分子中存在的酞和芳族结构例如蒽和萘并萘 尤其与明亮的荧光作用有关。少数无机化合物在液态或固态较强的发荧 光，荧光作用常常通过微量杂质的存在而改性。
各种类胡萝卜素色素据报道得自生产类胡萝卜素的细菌种(美国专利 US 5,935,808，1999年8月10日公开，发明人：Hirschberg等和US 5.858,761，1999年1月12日公开，发明人：Tsubokura等)。Collin；Peter Donald在其2000年5月2日公开的美国专利US 6,055,936中公开了海参类胡 萝卜素脂类级分及其方法。Bandaranayake，W.M.和Des Rocher，A 1999(海 洋生物学133；163-169)中描述了得自澳大利亚的Holothuiria atra体壁、 卵巢和内脏的类胡萝卜素色素。
很少报道有用的荧光天然染料。Shimomura，O，Johnson，F.H.和 Saiga，Y在《细胞和比较生理学杂志》，59，223-239，1962，Chalfie M在 1：Photochem Photobiol 1995年10月62(4)：651-6《未淬火的荧光蛋白》 中描述了从太平洋海蜇Aequora aequora中得到的绿色荧光蛋白GFP； Youvan DC，Michel-Beyerie ME在国家生物工艺学1996年10月 14(10)：1219-20《GFP的结构和荧光作用机制》，Chalfie M，Yuan Tu，Ghia Euskirchen，William W.Ward，Douglas C Prasher在《科学》 263(1994)802-805报道了纯化的GFP为238胺酸蛋白。纯化的GFP在395nm吸 收最大并在470nm有一个次级峰的蓝光，并在509nm的发射峰发出绿光并在 540纳米具有肩峰。这些荧光非常稳定并且几乎没有观察到光致漂白。
在红和黄范围内的其它波长具有荧光作用的GFP公开自非生物荧光的 珊瑚虫，尤其Discosoma珊瑚。Gurskaya NG，fradkov声频，terskikh一 个，matz MV，labas YA，Martynov VI，Yanushevich YG，Lukyanov KA， Lukyanov SA在1：FEBS Lett 2001年10月19日；507(1)：16-20中公开了作 为远红外荧光蛋白来源的GFP类色蛋白。Wachter RM，Elsliger MA，Kallio K，Hanson GT，Remington SJ.在1：Structure 1998年10月15 日；6(10)：1267-77中公开了“绿色荧光蛋白发黄光变体中结构碱的谱移”。 Fradkov AF，Chen Y，Ding L，Barsova EV，Matz MV，Lukyanov SA“得 自Discosoma珊瑚的新型荧光蛋白及其具有均匀远红外荧光作用的突变 种”。在1：FEBS Lett 2000年8月18日：479(3)：127-30。其中描述了一种新 基因，用于改进在593纳米具有发射极点的红外移动蛋白，该新基因由 discosoma珊瑚克隆。名为dsFP593的蛋白与最近公开的GFP类蛋白drFP583 非常相同，在583纳米具有发射极点。它们开发了这些基因的各种突变种。 杂化突变种变体产生在616纳米具有唯一再移动发射极点的突变种变体。 Matz MV，Fradkov AF，Labas YA，Savitsky AP，Zaraisky AG，Markelov ML，Lukyanov SA.1：Nat Biotechnolo 1999年12月：17(10)：969-73。
在东南和南大平洋国家，海参纲在保健食品和药物工业作为食品或各 种药物组合物的组分，尤其是关节炎、挫伤及其他治疗剂的应用中是为大 家所熟知的。一些美国和国际专利已经记载并筛选出来。(Fan Hui-Zeng， Yu Song，Yamanaka E，Numata K，Oka T，Suzuki N，muranaka Y在US 5519010 公开日1996年5月21日公开；Weiman，Bernard等的US 5,888,514，1999年 3月30日公开；Katsukura，Kitazato，Kenji Yamazaki，Yasundo的US 5,993,797，1999年11月30日公开；Henderson，R.W；Henderson，T和Hammd，T 的US6255295，2001年7月3日公开；Shinya的US6203827，2001年3月20日 公开；Collin Peter Donald的US 5770205，1998年6月23日公开和2000年 1月13日公开的WO 0001399；Kovalev V G，Sementsov V K，Slutskaja t n，Akulin V N，Timchishina G N的RU 2147239，2000年4月10日公开；李 兆明、朱蓓薇的CN 1286926，2001年3月14日公开；Qu Jianhong，Song Xiuqin，Zheng Fuqiang的CN1223131，1999年7月21日公开；曲建红、宋 秀芹、郑富强的CN 1142365，1997年2月12日公开；方华的CN 1312031，2001 年9月12日公开和丁存义的CN1173290，1998年2月18日公开；Collin Peter Donald的WO9937314，1999年7月29日公开。)已经公开了得自海参的组分 在抗HIV药物中的应用(Hoshino Hiroo的EP410002，公布日1991年1月30日 和Hoshino Hiroo EP495116，公布日1992年7月22日)。考虑到其重要性， 这些动物被尝试着人工培养(Annie Mercier，S C Battaglene和Jean- Francois Hamel在Journal of experimental Marine Biology and Ecology， 第249卷，第1期，89-110，2000年“热带海参明玉参的繁殖区选择和初期 移栖”)。周玮、王树海、顾在时发表的“刺参生态增殖方法”，专利号为CN 1179261，公开日1998年4月22日。
但是所有这些专利没有与本专利的主题直接相关，所以我们没有将它 们包括在给出的参考中。
Goswami，Usha和Ganguly，Anutosh已经申请了有关得自海洋无脊椎动 物的天然荧光染料的专利(CSIR，NF-140，2001年3月30号提交的美国专利 申请09/820,654)。其涉及到得自明玉参的粗提物，当其在光谱不同的紫 外区和可见区激发时具有三种不同波长的荧光品质。本发明还提供了一种 新型染料的萃取、纯化及其表征的方法，该染料为得自海参的部分纯化的 天然染料。除了该染料作为药物的性质之外，还公开了该染料作为外部荧 光(epifluorescent)着色剂和非放射性荧光染料用于原位杂交研究中分 子探针标记的用途。在这些专利现有技术中已经详述了得自陆生植物和微 生物的色素、合成染料和天然染料。(1984年6月5日公开的US 4,452,822， 发明人Shrikhande，Anil J；1994年6月14日公开的US 5,321,268，发明 人Crosby David A和Ekstrom Philip A；1995年4月11日公开的US 5,405,416，作者Swinton；Robert J；1999年1月12日公开的US 5,858,761， 发明人Tsubokura等；1999年5月11日公开的US 5,902,749，发明人 Lichtwardt等；1999年6月1日公开的US 5,908,650，发明人Lenoble等；1999 年7月6日公开的US 5,920,429发明人Burns等；1999年8月9日公开的US 5,935,808，发明人Hirschberg等；1999年11月23日公开的US 5,989,135， 发明人Welch，David Emanuel；2000年5月2日公开的US 6,055,936，发明 人collin，Peter Donald；2000年5月2日公开的US 6,056,162，发明人 Leighley，Kenneth C；2000年8月15日公开的US 6,103,006，发明人 DiPietro，Thomas C.；2000年8月29日公开的US 6,110,566，发明人White 等；2000年10月31日公开的US 6,140,041，发明人LaClai r，James J；2000 年12月26日公开的US 6,165,384，发明人Cooper等；2001年1月30日公开 的US 6,180,154，发明人Wrolstad等；1986年12月30日公开的EPO206718， 发明人Cramer Randall J；1991年1月30日公开的IE901379，发明人Lee Linda G，Mize Patrick D；1990年7月7日公开的WO9010044，发明人Robert J；1997年10月7日公开的AU704112，发明人Burns David M，Pavelka Lee A； 1999年6月24日公开的DE19755642，发明人weimer Thomas DR；1999年9月 28日公开的WO9938919，发明人Laclair James J；2000年10月5日Rosenblum Barnett B等公开的WO0058406；2000年8月15日DiPietro，Thomas C公开 的WO993891615；2000年8月29日Pavelka Lee等公开的WO9920688；2000年 8月29日White等公开的WO9920688。)还公开了荧光染料在分子生物学研 究、工业应用和救生装置等中的多种应用。
Collin，P.D在其1998年6月23日、1999年3月2日和1999年11月16日公 开的美国专利5,770,205、5,876,762和5,985,330中已经公开了海参各个 身体部分的治疗学特性。所有这些参考文献也属于本专利。
在另一专利Goswami，Usha和Anutosh Ganguly(申请号)中已经公开 了一种新型的有机硅Si-O-R型化合物和由海洋无脊椎动物明玉参的体壁萃 取液纯化得到的多色荧光天然染料。该化合物为具有酚荧光团部分并通过 硫酸酯键连接到硅母体的多糖荧色物。该硅部分是核心分子的主要部分并 参与动物的新陈代谢。该化合物中富含硫。该发明还提供了一种用于该新 化合物萃取、纯化及其表征的方法，以及得自海洋生物尤其是海参的多色 荧光染料。该专利还首次公开了新荧光化合物的化学结构，其中硅成为有 机分子和荧光基团酚类的主要部分。该专利此外提供该化合物的不平常特 性和染料的特征，并公开了其优点。染料的一些衍生物具有高或低的分子 量和用于荧光探测器中所期望的单色和多色染色应用的理想特性。此外该 化合物可以作为染料工业、化妆品工业和药物工业组合物中的易混合组 分。
Richard P.Haughland的《荧光探测器和化学研究手册》(美国第6版 印刷，1996)中提到的荧光染料有关的许多文献合并到该专利。在美国专 利和国际专利中已经公开了许多该荧光染料衍生物及其合成。 (Haughland，R.P和Kang，H.C.1988年9月27日公开的US4,774,339； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年9月28日公开的US5,248,782； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年2月16日公开的US5,187,288； Haughland，R.P和Kang，H.C.1993年12月28日公开的US5,274,113和 Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年7月18日公开的US 5,433,896； Haughland，R.P和Kang，H.C.1995年9月19日公开的US 5,451,663； Rosenblum Barnett B，Spurgeon S，Lee Linda G，Benson Scott C和Graham Ronald J在2000年10月5日公开的国际申请WO0058406中报道了一种可用作 分子探针的4，7-二氯若丹明染料。)所有这些参考文献也属于本发明。
通过其早期专利和其他人的报道，申请人已经采用了不同的方法。在 我们的早期专利中报导的染料是天然染料，但是其是有毒的。不同激发波 长的光的光谱范围也是不同的。该染料是非蛋白质的液体并且不能有效地 用于活体细胞的原位研究。其在生物医学和工程科学中的应用和使用也是 不同的。
当前报道的染料虽然也是天然染料，但是其为直接从非生物荧光无脊 椎动物的卵巢细胞中提取的无毒多色荧光蛋白质。海产动物来源于海参 属，称为明玉参的海参是无毒荧光蛋白染料的一个新的来源。不同于合成 染料，在其制造中不需要使用强酸和碱金属的步骤。不同于早期公开的得 自海参卵巢的类胡萝卜素色素，这些染料并非类胡萝卜素色素。而是荧光 蛋白。当前染料中的荧光蛋白也不同于来自Jellyfish Aequorea aequorea 的发出淡色绿光的绿色荧光蛋白(GFP)。虽然具有红色或黄色范围转变的 各种不同GFPs已经公开得自其它动物。我们的方法不同于那些GFPs。我们 具有在不同紫外线和可见光频谱波长激发时发出浅和深蓝色、绿色、黄色、 橙色和红色范围内荧光的淡色荧光蛋白染料。
与大多数合成荧光染料最为不同的是，为以不同波长得到不同荧光色 调，我们的染料无须与另一种染料混合。它在三种不同激发波长发出6种 不同颜色的荧光，可以具有多重用途。当仅仅存在染液时，细胞成分显示 与基底不同的对比染色。在我们的染料中，荧光基团连在蛋白上并产生荧 光，其此外也不同于通过成环作用由第一氨基酸序列得到的GFPs载色体。 在我们的染料中，当单独的荧光基团和连在蛋白的荧光基团受到紫外线、 蓝色波长和绿色波长激发时，遵循斯托克定律发出三种不同颜色的光。
本发明的染料还是细胞渗入的并渗透入内部细胞成分的各种细胞膜 中。
只要该染料附着在细胞膜中，其在室温下可以稳定几个月并且不会在 微生物的作用下光退色和污染。不同于某些藻类和发光生物的萃取液，其 荧光没有在高温和低温下变质。
该染料对大肠杆菌和性细胞以及河口和海洋动物的幼虫是无毒的。所 以其废液不会杀死海洋和河口动物的幼虫。其为无毒性和生态友好的染 料。
本染料的另一个重要方面是其仅仅在活的和固定组织中显示荧光性。 死的个体不会被染色。本染料的一个重要方面是制备用于分子探针的非放 射就地标记和复染色的组合物和试剂盒。在不同波长的激发给出等同于 DAPI、FITC和PI以及其它市场荧光探测器的颜色效果。该染料为天然多色 荧光染料。实际上，此单一的染料包括市场上已知的123种荧光染料的波 谱的颜色(参见因特网上的Bitplane产品(荧光染料) (http：//www.bitplane.ch/public/standard/fluorochrome.htm))。
然而，本发明的另一方面是具有胶结性质的染料。
然而，本发明的另一方面是提高牡蛎精子授精和卵受精比例的染料。
然而另一方面是其在外部荧光显微镜检查法(epiflourescence microscopy)中作为无毒荧色物着色剂的应用。染料为天然染料并非合成 物质，其通过各种膜渗入并将其区别着色。本申请提供了简单而快速的检 查用于多种用途-如用于荧光的原位杂交技术的分子诊断，组织培养物的 生物污染的快速诊断、食品工业和工业制剂中的生物，流式细胞计等的方 法。
然而染料的另一方面是它作为非放射性标记试剂盒的组分，用于先进 的分子生物学用途，其中蛋白质染料用于活体细胞功能的研究。
发明内容
本发明公开了一种得自海洋棘皮动物卵巢提取物的荧光颜料的萃取、 提纯以及表征的方法。该颜料是一种天然染料并且是带负电的荧光蛋白， 其连有非极性荧光基团。该染料在紫外线和可见光的多种荧光激励范围放 出荧光。本发明还公开了该染料的化学、物理、光谱、外部荧光细微性质。 测试无毒性、细胞膜可透性和胶结品质。
本发明的主要目的是提供一种天然无毒环境友好的多色荧光蛋白染 料，该蛋白染料得自海参明玉参的卵巢组织。
本发明的另一个目的是提供一种得自海洋动物明玉参(其为一种非生 物发光海洋动物)的所述荧光蛋白的萃取、部分纯化以及表征的方法。
本发明的另一个目的是提供一种染料，其为细胞膜可渗透的、为细胞 部分提供区分，并在紫外线和可见光频谱波长范围的单色和多色辐射下具 有视觉效果。
本发明的另一目的是提供一种较长时间不感光的染料。
本发明的另一目的是利用该染料检查幸存者以及真核细胞和原核细胞 的生长。
本发明的另一目的是使用该染料提高养殖业和生态学上重要的动物例 如牡蛎的增殖能力和细胞增殖率。
本发明的又一目的是提供使用从明玉参组织中得到的染料的组合物。
本发明还有一个目的是提供一种染料，其在具有三种波长的特定激发 发射在紫外光谱和可见光谱的6个不同波长范围的荧光。
本发明的另一目的是观察荧光和可见光谱分析和发射波长的范围。
本发明的另一目的是观察染料在外部荧光显微镜立方晶格的紫外和可 见光范围的3种不同的荧光色发射。
本发明的另一目的是观察用本发明的染料对筛选染色体、细胞和组织 使用的细胞遗传载物片的荧光染色效果。
本发明的另一目的是观察染料的烧结性。
本发明的又一目的是查看染液中是否存在糖蛋白。
本发明的又一目的是通过用细菌和真核下颌角细胞和幼虫进行试验查 看其无毒性质。
本发明的又一目的是其在食品工业检查细菌污染的应用。
本发明的又一目的是观察荧光和可见光光谱分析及其发射波长的范 围。
本发明的又一目的在于该染料可以用作荧光分子探针的非放射性标 签。
本发明的另一目的在于染料在激发光下没有得到快速灭弧，并且由于 筛选载物片的存在没有发生光致退色。
本发明的又一目的是观察荧光和可见光光谱分析及其发射波长的范 围。
本发明的又一目的在于该染料可以用作荧光分子探针的非放射性标 签。
本发明的又一目的是，虽然染料本质上是含水蛋白液体，但是其一旦 附着于细胞膜上在室温下仍然非常稳定。
本发明还有一个目的是，其甚至在极高或极低的温度下荧光质量也没 有恶化。
本发明的另一目的是制备用于分子探针的非放射标记和复染色的组合 物和试剂盒。
本发明的另一目的是该化合物用于合成流式细胞计、微序列 (microarrays)、免疫测定和其它分子应用中使用的荧光染料衍生物中 的工业用途。
本发明的另一目的是提供一种含有作为原位杂交非放射标签的试剂盒 的荧光材料，作为分子探针。
相应的，本发明提供了一种得自称为海参明玉参的非生物发光的海洋 生物卵巢提取物的新的无毒、细胞渗透性天然多色荧光蛋白染料。本发明 也提供了提取、分离和鉴定所述蛋白染料的方法。另外，本发明也公开了 所述以溶液形式存在的染料中至少四种化合物的存在。所述染料中的荧光 基团与带负电的蛋白有关。染料的溶液中还至少存在一种糖蛋白。该糖蛋 白显示出外原凝集素类凝集性质。测试的染料由于凝集素的存在，受精率 提高并且在真核和原核活体细胞中无毒。该染料组合物将在活体细胞中或 细胞间作为原位目视跟踪中发荧光的外部荧光精微着色剂。
因此，本发明提供了一种生物活性部分提纯的提取物，其中含有得自 雌性性腺(亦即海洋生物明玉参的卵巢组织，存在于潮水之间、水中、浅 水和深水中，通常大量存在于阴暗区域，如洞中凹处、缝隙、暗礁、突出 物、岩石沙质聚集处、具有暗色到良色有或没有外部和桥骨骼、固着的、 固定漂流物，具有各种浮游内功率通常夜间活动的浮游生物，易于活跃地 捕食，具有或没有荧光、具有体外受精的卵和发出UVB、UVA、可见光和红 外光部分至所有发光的荧光染料)的无毒蛋白荧光染料。
经过许多研究以后，本申请已经鉴定出一种从海洋生物，特别是从无 脊椎生物，尤其是从海参明玉参得到的新的无毒荧光蛋白染料。
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
目：盾手目(Aspidochirota)
科：海参科
属：海参属
种：Scabra
本发明还提供了一种得自动物卵巢的天然细胞穿透性的多色荧光蛋白 染料，并且其对活体细胞是无毒的。本发明还描述了此染料的物理和化学 性质及其在直射光、高和低温下的稳定性。该染料在紫外和可见光谱的3 个不同激发波长处有3种颜色的荧光发射。本发明也涉及在荧光显微镜下 筛选细胞以快速检查污物、残余的细胞和存在或不存在凝集作用。本发明 也涉及到使用本染料作为蛋白、DNA和RNA分子探针的非放射性标记，用于 先进的分子诊断及染色体、细胞和组织的单和双着色的外部荧光显微镜 法，用于荧光外部杂交应用、检查生物污染、在水产养殖和生物医学中用 于受精能力的增强，作为研究活体细胞所需要的试剂盒组分、新的遥感装 置、水下探测器、救生设备及标记坠毁飞机、救生筏和军事装备如火箭， 还有在低于0℃温度的条件下荧光的应用以及许多更多的应用。该染料环 境友好，其不杀死河口和海洋生物的幼虫。本发明描述了从海洋动物得到 的荧光染料，它们吸收阳光完成生理功能或暴露于阳光下更长的时间并显 示有不同波长处的荧光进化的机制。如浮游植物、浮游微生物和光合细菌 吸收阳光以完成其光合功能，在化学途径中使用光谱的必须波长，而额外 光的发射遵循斯托克定律。
无脊椎动物没有另外的外甲，如壳和显著的防卫器官，它有硬和多刺 的皮肤，有由小骨形成的强的内骨骼，它们是定栖的或缓慢移动，长时间 暴露于直射阳光下，生活在沙中或裂缝中，可以显现荧光。本发明通过提 供高效和高选择性的提取、纯化和鉴定由海产无脊椎动物得到的染料的方 法，及其在制备使用非放射性标记的分子诊断的试剂盒、分子标记、外部 荧光显微镜法、光化学疗法、新的土地测试设备和水下探测器的组成部分、 化妆品工业、食品工业和军队等方面的多种用途，以克服在先技术的缺点。
所述的海洋无脊椎动物是棘皮动物，分类学上称为明玉参，属于海参 纲。本发明的产品是一种首次报道的新的无毒多色荧光蛋白染料。在落潮 时从印度西海岸中部收集动物，带到实验室并保存在有海水的玻璃缸中， 海水的盐度为30-32％/par。动物为成年动物并处于性成熟期。如上所述 确定分类学位置。
实际上，大多数可得到的染料实质上是合成的。仅有6类天然染料。 包括从所有活的生物体得到的染料。本发明报道的荧光染料是特征为多色 荧光无毒和活细胞膜可透过物中仅有的，其从海参卵巢组织中提取。
此处所用的术语染料用于指不被还原剂退色的色素。所述的染料使纤 维、纤维素等染色。它称为天然染料，因为来源于通常发现在自然界中沿 着地球的海岸、浅水和深水分布的海洋动物，而不是合成色素。荧光染料 在从高到低电子状态的非常短时间内的跃迁过程中，在特定波长激发从而 发光。
多色荧光意味着当在不同波长范围内被激发时发出不同颜色的光。它 在通过紫外和可见光的不同光谱激发时，发射蓝、黄绿色和橙红色的荧光 色彩。
细胞膜渗透性指的是染料通过活细胞的微孔和细胞的核膜，并根据 UV、蓝色和绿色波长激发使其发出青白色、黄色和橙色的阴影的多色荧光。
对活细胞无毒指的是对真核细胞和原核细胞的活细胞测试时，这些细 胞没有死亡。
附着于细胞膜后染料的光稳定性指的是用所述染料对活细胞和固定细 胞染色后发出荧光的连续性。
此处使用的分子诊断指的是使用染料作为用于分子探针的非放射性标 记，用于分子细胞遗传学中的荧光原位杂交应用，并作为微阵列的标记物 和用于分子生物学研究中。此处的外部荧光显微镜法属于对细胞遗传标本 的载物片进行显微研究，通过用本发明的染料作为着色剂，并在用于已知 荧光染料激发而发射特定颜色的发射光的不同立体构型下观察时，记录不 同颜色的荧光。
荧光染料立方晶格WUB、WB、WG是用于不同波长的Olympus EX-FLA反 射光荧光附件指定的滤光器立方晶格构型。对于各自的立方晶格通过显微 镜其记录为WU、WB、WG和BF，此后相同的缩写用于整个专利中。
市场上已经存在的各种染料的名称以其根据Stains File染色指标、 Bitplarne产品和Molecular探针给出的商品名而提及。这些公司的参考已 经在先有技术中提到。
相应地，本发明提供了一种天然无毒细胞膜可穿透的多色荧光染料的 提取、部分纯化以及鉴定的方法。本发明进一步提供了染料导致凝集、提 高牡蛎下颌细胞授精受精率，并不杀死真核细胞和原核细胞的组合物，其 中包括：
i.从野外采集材料并保存在实验室条件下，
ii.从棘皮动物海参明玉参的皮肤中提取色素，和
iii.部分纯化此染料
iv.测试生物活性
从海产的海参明玉参的卵巢组织中提取得到本发明的生物活性提取 物。此提取物作为天然荧光染料并具有以下特征：
i.不被还原剂脱色
ii.不是合成化合物
iii.染料的粗提物是黄橙色的
iv.部分纯化的染料滤液保持相同的颜色
v.染料为溶液形式
vi.酒精提取物保持在4℃
vii.在管灯下发出各种颜色的可见光谱
viii.色素不直接溶于水
ix.纯色素溶于70％的乙醇
x.根据其应用可以用超高纯/海水进一步稀释
xi.带负电荷
xii.pH值为6.8-7.5
xiii.没有醌型的环
xiv.性质上是蛋白质的
xv.如HPLC数据所示，染料的溶液中含有至少一种糖蛋白
xvi.染料溶液中至少存在4种化合物
xvii.通过HPLC证实含有碳水化合物和蛋白质
xviii.荧光基团与蛋白质有关
xix.荧光光谱分析显示：激发的最大波长在351nm、580nm和720nm
xx.荧光发射光谱分析显示：在450nm和550nm的两个峰值最大发射
xxi.根据其是否为单独的燃料溶液或其附着的细胞，溶液中的染料 在外部荧光显微镜荧光立方晶格的UV和可见区的3种不同波长发射6种不同 颜色的荧光
xxii.当在超紫外线立方晶格WU-330-385nm的激发范围激发时，在 450nm-470nm范围发出蓝色荧光
xxiii.当在450-480nm激发范围的WB立方晶格激发时，在510-570nm 范围发射黄绿色荧光
xxiv.当在510-550nm激发范围的WG立方晶格激发时，在610-650nm 范围发射橙色荧光
xxv.当在100倍的油镜下观察时，在通常的外部荧光显微镜的透射光 灯泡下，染料发射黄灰色色调
xxvi.甚至在稀释范围为1∶20000倍时，这些染料仍发射这些荧光颜色
xxvii.甚至在4℃放置至少一年后，提取物的荧光仍然存在
xxviii.染料的荧光是非常光稳定性的，并且一旦细胞被着色甚至是 在室温下长时间暴露于直射光下也不会被破坏
xxix.即使是在-20℃冷冻，染料的荧光也不会改变，在此温度下分 子不可能象在从发光生物体得到的提取物中那样获得活化所必须的能量
xxx.染料对于真核生物的活细胞是无毒的
xxxi.染料对原核生物(E.coli)的活细胞也是无毒的
xxxii.染料在细菌中导致外原凝集素类凝集
xxxiii.染料在牡蛎的精液中导致外原凝集素类凝集
xxxiv.染料在更短的周期促进精液的授精和受精，然后控制
xxxv.染料是细胞膜透过的
xxxvi.染料对于死真核细胞是细胞膜透过的
xxxvii.染料对于死原核细胞是细胞膜透过的
xxxviii.一旦染料染色了细胞部分，其是不可降解的。
以下列步骤评价染料的物理和其它特性：
i.染料的结构分析
ii.无毒性测试
iii.凝集试验
iv.细胞膜选择染色测试
v.染料的可见光谱
vi.染料的荧光光谱
vii.在UV透照器260-280nm范围进行发射的物理检查
viii.具有活牡蛎卵和精液的载物片的制备
ix.活细菌载物片的制备
x.用风干法制备固定细胞载物片
xi.用染料使载物片着色
xii.无需加入染料对每个试验保持控制
xiii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选活真核细胞载物片
xiv.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选固定真核细胞
xv.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微镜 法筛选死真核细胞
xvi.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选活细菌细胞
xvii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选死细菌细胞
xviii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，不使用染料用 外部荧光显微镜法筛选活控制单元
xix.在没有任何细胞的载物片区域内对发射的荧光进行显微照相
xx.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内对细胞生成载物片 发射的荧光进行显微照相，和
xxi.使用染料检查发射的荧光色彩的波长范围和荧光染料立方晶格 的激发范围的波长范围
xxii.使用染料着色的细胞检查发射的荧光色彩的波长范围和荧光染 料立方晶格的激发范围的波长范围
xxiii.检查质膜、细胞质、核膜、核质和染色体的细胞膜渗透性
因此本发明提供来源于海产动物的天然荧光染料，当用外部荧光显微 镜的紫外和可见光谱立方晶格的3种不同范围的波长激发时，它发射蓝、 黄和橙红6种不同颜色的荧光。染液的发射范围和用该染料着色的细胞的 发射范围不同。本发明还涉及此染料作为外部荧光显微镜法的着色剂，在 原核和真核活、固定和死细胞制剂的外部荧光显微镜法。染料可以用于制 备非放射性标记试剂盒，在各种分子、生物医学和工程科学中通过荧光原 位杂交用于分子诊断。
在本发明的一个实施例中，染料的来源是无脊椎海产动物，属于后生 动物亚界、棘皮动物门、Eleutherozoa亚门，海参纲，名称为明玉参。
在另一实施例中，明玉参选自海参并广泛分布于全世界特别是印度洋 太平洋的海滨、浅水、深水域。已知与海参有最接近的亲缘关系的是海胆 和海星。
在另一实施例中，明玉参被解剖，分离其卵巢并称重。向1克(湿重) 卵巢组织中加入3ml 70％的酒精。
在另一实施方案中，提取物通过Whattman No.1滤纸过滤。
在另一实施方案中，具有螺旋盖的管形瓶储存被称为“染液”的染料溶 液，并且于4℃在低温室中储存直到进一步应用。
在另一实施方案中，染液的颜色用肉眼和管灯记录。
在另一实施方案中，发现染液可溶于70％的乙醇。为了试验可以在水 中进一步稀释。
在另一实施方案中，记录了染料室温下在溶液中和在着色细胞上的耐 光性。显示其一旦附着在细胞膜上该染料是不可降解的。
在另一实施方案中，通过电泳进行了该染料的电荷测试。观察到黄色 斑点到正极接线柱的漂流。这表明含有有色化合物的染料是带负电荷的。
在另一实施方案中，颜料为使滤纸产生颜色的染料。在另一个实施方 案中该染料pH为6.8-7.5。
在另一实施方案中，取1ml该乙醇卵巢提取物的染液并加入0.2克二硫 代丁四醇。该溶液没有脱色。这表明该荧光化合物的颜色部分是不可还原 的，其中不存在任何可还原的环状醌。这个试验的结果表明该有色化合物 为不可还原染料。
在另一实施方案中，5ml提取物在100℃的水浴中加热。观察到了凝聚。 这证实了该染料的酒精提取物中蛋白质的存在。
在另一实施方案中，染色部分通过凝聚和仅仅在非极性溶剂的醚中解 聚而与蛋白质分离。当进行纸上电泳时，该染色溶液不向任一电极移动。 这表明该荧光染料的非极性特性。
在另一实施方案中，该染料通过使用4ml硫酸和蒽酮测糖试剂进行蒽 酮测试(Ref)。1ml水、4ml浓硫酸和蒽酮测糖试剂作为空白组。5分钟 后空白组为轻微绿色，然而5分钟后该提取物变成鲜绿色。该试验证明染 液中存在碳水化合物。
在另一实施方案中，使用硅胶-G板对所述染料(5微升)进行薄层色 层分析。使用的溶剂为2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅胶-G板在容 器中用碘蒸汽染色。发现4个斑点。该试验表明粗提物中至少含有4种不同 的化合物。斑点及其各自的Rf值如表1所示。
在另一实施方案中，纯化合物的荧光特性通过荧光分光光度法观察。 该化合物(凝胶过滤后冻干)溶于水(浓度为0.001克/毫升)并进行荧光 分光光度法。其首先进行激发扫描，然后在351nm、580nm和720nm发现该 化合物被激发。
在另一实施方案中，所述染料然后进行荧光发射分光光度分析。当在 351nm激发时，发射处于400-600。在450nm和550nm波长发射有两个峰值。 (图2和3)。
在另一实施方案中，进行HPLC分析以检测蛋白质和碳水化合物的存 在。
在另一实施方案中，通过等浓度模式的反向HPLC用80％乙酰和20％水在 C18反向柱中进行染液的HPLC。
在另一实施方案中，UV检测器在280nm和205nm的波长检测到蛋白质的 存在。图17和表2显示出通过在280nm的UV检测器蛋白质存在的结果。可以 看出：7种蛋白质的停留时间在2.1-8.8分钟之间变化。覆盖的面积为535- 116103之间。峰1的最大百分数面积具有2.1分钟的保留时间。由此可见样 品中蛋白质在峰1的量最多。
在另一实施方案中，UV检测器在205nm的波长检测到缩氨酸的存在。 图18和表3通过UV检测器在205nm显示出10种缩氨酸的存在。停留时间在 2.1-14.8分钟之间变化。覆盖的面积为63482-3218965。并且缩氨酸在峰3 的最大百分数面积具有3.9分钟的停留时间。
在另一实施方案中，折光检测器检测到碳水化合物的存在。使用的标 准为葡萄糖、蔗糖和果糖。结果如图19、22和表4所示。
在另一实施方案中，根据HPLC数据分析和电泳表明了荧光基团与蛋白 质的结合。由于荧光基团是非极性的，在乙醇的卵巢提取物中看来好像可 以与带负电的组分结合。因为其在电泳的时候向正极移动。并且如表1、2、 3和4的HPLC数据所示，仅仅检测出蛋白质和碳水化合物。其要求染色荧光 fluoropore与某些带负电的蛋白质相结合。可以说，染液的荧光活性应归 于含有附着于带负电蛋白质上的非极性荧光基团的组分，当该蛋白质凝聚 时，该荧光基团容易分离。
在另一实施方案中，进行凝聚测试以证实糖蛋白的存在。由于提取物 中至少一种糖蛋白指标的存在，由于凝集的存在进行生物测定。
在另一实施方案中，染料的凝集生物活性测试通过进行两组试验在革 兰氏阴性细菌(大肠杆菌)进行。在试验1中，50微升所述染料加入到100ml 的Muller Hilton′s培养基流体(culture broth)中。产生没有海产动物 提取物的空白组。0.1ml的新鲜大肠杆菌inauculum加入到该培养基流体 中。培养基流体在自转为150rpm的定轨振荡器中孵化。8小时后在两个培 养基流体中都发现混浊。然而含有提取物(染液)的培养基流体显示出丛 生生长。细胞形成凝集。没有染料的正向空白组显示出正常生长。
在另一实施方案，在第二组试验中，一圈活大肠杆菌载玻片上的25微 升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台 阶上30秒使酒精挥发。然后一个盖片放于细菌制剂上并密封。同样制备没 有任何染料的对照细菌制剂。
在另一实施方案中，两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10 倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查凝集生物活性和荧光。已经发现用染 料处理的载物片上的细菌形成丛生，然而对照组中没有出现这种现象。这 证明该染料具有引起凝集的生物活性。还注意到细菌以特定的丛生形状凝 集。丛生中的细菌自始至终都是活的。它们仅仅在载物片变干时死亡(图 4和5)。
在另一实施方案中，在染液的存在下细胞形成凝聚的趋向表明其中含 有外原凝集素类糖蛋白。这也进一步支持了我们关于HPLC数据的解释，亦 即海参卵巢粗提物中至少存在一种糖蛋白。
在另一实施方案中，对真核生物精液进行的凝集试验。1毫升牡蛎精 液溶液置于用于浮游植物计数的sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5 μl)酒精提取物。载物片在40倍物镜和10倍目镜的显微镜下筛选。可以 看出精液形成集合体、粘附并形成丛生。没有聚集的特定形式。这种特性 在对照实验中没有出现。
在另一实施方案中，显现了牡蛎精液和卵的授精和受精率的增加。牡 蛎的优质精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物计数的 sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后载物片 立即在显微镜下筛选并观察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。进行没 有提取物的对照组。图6显示出几秒内和以绿色激发滤光器(WG)观察到的 极体挤出。
在另一实施方案中，产生了在测试组和对照组之间授精和受精率之间 的百分比差异。可以看出30秒后，处理的细胞有80％的卵受精，然而在对 照组中仅仅有40％的细胞受精。我们注意到大量的精液黏着到卵膜。在我 们的早期试验中我们注意到，这些卵受精作用通常的实际时间约为10-15 分钟。第一个极体的形成发生在增加染料的1分钟之内(图6)。当前的染 液看来具有一些因素，其促进精液通过卵膜的授精，并最终在更短的时间 间隔内增加受精率。
在另一实施方案中，进行了染料对真核细胞村活的无毒测试。
染料测试了对牡蛎精液的细胞毒性。试验中精液的存活率被认为显示 无毒的参数。牡蛎的雄性生殖腺被除去并且精液释放在100％的海水中。
其通过muscline布过滤以除去所有有机物残渣。取1毫升(ml)精液溶 液并加入不同浓度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小时 通过显微镜观测精液的存活率。试验进行24小时。不加入染料进行对照组。 发现加入染料对精液的存活率没有任何影响。这表明该染料无毒特性。
在另一实施方案中，通过原核生物的存活率进行染料的无毒测试。通 过观察其存活率或者死亡量测试了提取物对革兰氏阴性大肠杆菌的细胞毒 性。一滴水(25μl)中的活大肠杆菌置于载玻片上。向其加入2μl酒精 提出物。暂时封闭该载物片以防止蒸发。在显微镜下昼夜观察到直到，细 菌保持在溶液中能存活24小时。如果溶液蒸干，它们死亡。进行对照试验。 证明染料对原核生物也是无毒的。
申请人研究了染料的性质并发现在不同激发波长产生多种颜色的发 射，它能够与已进入市场的荧光染料显微着色剂相比。本染料的蓝色荧光 可以与DAPI荧光染料在同样激发波长发射的同样颜色相比，后者作为生物 化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记试剂盒的组分。
本染料在可见范围的黄色荧光可以与FITC的同样颜色的发射相比，后 者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和 检测试剂的组分。
橙色荧光发射可以与碘化甲锭(Propidium Iodide)荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物 学的非放射性标记和探测试剂盒的组分。橙色发光的发射能够与TRITC荧 光染料的橙色荧光颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射性标记和探测试剂盒的组分。该染料在室温是稳定 的，并有长的搁置寿命。本染料的分子和放射性试剂盒可以在室温下出口。 该染料有至少123种市场已有的不同荧光染料的特性，这些市售(位面产 品)荧光染料确切地DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖 啶橙、金胺、若丹明、TRITC和碘化甲锭。染料在显微镜的通常光下，灰 色的色彩产生相差效果，这对快速筛选细胞遗传学、细胞学和组织化学载 物片是有用的，并可以节省额外的补充显微镜相位差的成分的费用。荧光 颜色的发射服从荧光的斯托克定律。
在另一实施方案中，用此染料的1∶20000的稀释液作为着色剂进行外 部荧光显微镜法研究，并记录用不同立方晶格激发时光的发射，并与已知 荧光染料比较颜色色调(图7-10)。
在另一实施方案中，载物片的筛选使用Olympus显微镜BX-60的olympus bx-FLA反射荧光附加器在WU、WB、WG和BF荧光染料立方晶格使用紫外线和 可见光进行。
在另一实施方案中，WU立方晶格的波长范围是330nm-385nm。
在另一实施方案中，WB立方晶格的波长范围是450nm-480nm。
在另一实施方案中，WG立方晶格的波长范围是510nm-550nm。
在另一实施方案中，BF用于亮视野，其中普通的钨灯泡发光。
在另一实施方案中，发现了染料在不同激发范围的发射范围。外部荧 光显微镜法中卵的背景显示了染料的发色。
在另一实施方案中，WU 330nm-385nm范围的激光发射的荧光在450nm- 470nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发发射 的荧光在510nm-570nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发发射 的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个使用BF的实施方案中，发现黄灰色半点斑点。在另一实施方 案中，发现染料对细胞膜染色后不同激发范围的发射范围。
在另一实施方案中，染料用作牡蛎死、活和固定卵的荧光性微小着色 剂。载物片在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到死细胞没有接受染料并 且没有显示荧光(图11和12)。
在另一实施方案中，染料用作牡蛎活卵的荧光性微小着色剂。载物片 在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到活细胞显示荧光。激发光谱范围和 放射荧光严格地遵循斯托克定律。这些范围与表示荧光细胞背景的染料发 射范围不同(图4-16)。
在另一实施方案中，染料在3∶1的乙醇和乙酸固定剂中用作牡蛎固定 卵的荧光性微小着色剂。载物片在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到固 定细胞显示荧光。激发光谱范围和放射荧光严格地遵循斯托克定律。这些 范围与表示荧光细胞背景的染料发射范围不同(图4a-16a)。
在另一实施方案中，用WU 330nm-385nm范围激发，在细胞中以470nm- 500nm范围发射荧光。
在另一实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发，发 射的荧光在570nm-610nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发，发 射的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选死卵，产生淡黄灰色类相 差效果的色彩。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选活卵，产生淡黄灰色类相 差效果的色彩。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选固定卵(3∶1的乙醇∶乙酸 固定液)，产生淡黄灰色类相差效果的色彩。
在另一个实施方案中，染料用作大肠杆菌的显微着色剂。一圈活大肠 杆菌载玻片上的25微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通 过将载物片放置在台阶上10-15秒使提取物中的酒精挥发。然后一个盖片 放于水中的细菌悬浮液上并密封。同样制备没有任何染料的对照细菌制 剂。
在另一个实施方案中，两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10 倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查荧光。我们注意到死细胞没有吸收染 料并且没有显示荧光(图11-12)。
在另一个实施方案中活细菌细胞显示荧光(图4-5)。激发光谱范围 和发射荧光波长严格地遵循斯托克定律。这与染液不同，给出如下：
在另一个实施方案中，以WU 330nm-385nm范围激发，在470nm-500nm 范围发出荧光。
在另一个实施方案中，以波长范围为450nm-480nm的WB滤光器激发， 在570nm-610nm范围发出荧光。
在另一个实施方案中，以波长范围为510nm-550nm的WG滤光器激发， 在610nm-650nm范围发出荧光。
在另一个实施方案中，没有任何染料的对照大肠杆菌也没有显示荧 光。
在另一个实施方案中，对具有用于外部荧光显微镜法着色剂染料的载 物片进行缩微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WU330nm-385nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WB 450nm-480nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WB 510nm-550nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在亮视野，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料发色的围绕背景 区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，发现了染料在细胞膜的透过。牡蛎的未受精、 受精卵和幼体用染料染色，卵悬浮比为1∶50微升，并且在荧光显微镜下筛 选(图7-10，7a-10a；14-16，14a-16a)。已经发现质膜、核膜和染色质 中的荧光是显著的。虽然发射的波长范围相同并且颜色为相同色调的彩 色，在细胞的这些部分之间存在显著的界限(图7-10，7a-10a)。这证明 染料能够透过卵质膜、细胞质、核膜、核质和染色质的活细胞和固定细胞 膜。
在另一个实施方案中，死细胞中细胞部分不存在荧光表明染料没有穿 透死细胞的膜(图11-12，11a-12a)。
不同的着色剂用于荧光显微镜的不同的激发立方晶格。例如在330nm- 385nm激发立方晶格的激发下看DAPI(DNA染色，发射蓝色)、荧光-dUTP、 Hoechest 33258、33342；在用450nm-480nm激发立方晶格时看FITC、吖啶 橙(用于DNA、RNA发色绿色/黄色色彩)、金胺；在用510nm-550nm激发立 方晶格时看若丹明、TRITC和碘化甲锭(DNA、发射橙色色彩)。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为330nm-385nm波长的WU滤光器 激发。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为450nm-480nm波长的WB滤光器 激发。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为510nm-550nm波长的WG滤光器 激发。
在另一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，使用此染 料，在亮视野物镜下通过透射光观察。
在另一个筛选此染料着色的细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案 中，观察各自的激发所发射的荧光颜色的色彩。
在另一个实施方案中，WU 330nm-385nm范围的激光发射的荧光在 470nm-500nm范围。
在另一个实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发发 射的荧光在570nm-610nm范围。
在另一个实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发发 射的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个在亮视野下筛选细胞载物片的外部荧光显微镜法的实施方案 中，使用透射光，这种透射光根据细胞成分的密度所发射的光在可见光谱 的整个白光范围内，从而产生相差结果。
在本发明的另一方面，在70％的乙醇中制备1∶400000倍及以上稀释的 染料，并作为着色剂，在外部荧光显微镜法的紫外和可见区域发生有色的 荧光发射。
在另一个实施方案中，染料在70％的乙醇中以1∶9000倍稀释，然后在 水中以1∶50倍稀释，其意味着总共稀释1∶450000倍，这使荧光在三种不同 的波长产生三色的荧光。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生物活性组合物，其含有得 自海参明玉参的提取物，在超纯水中的比例为1∶40000倍得到的提取物， 从而得到在3个不同波长产生三色荧光，和在透射光下的相差效果。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于制备涂料组合物和墨 水。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于泄漏的检测。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于水下探测器。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于分子诊断中所用的原位 杂交试剂盒中的荧光探针。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于免测荧光检测。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的复染剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，在流动血细胞计数中用于单 一和多细胞荧光定量。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用作外部荧光显微镜法的荧 光着色剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业中快速检查生物污染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于快速估计实验室培养下 的生物污染物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于快速测定田间条件下的 生物污染物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于细菌引发的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用作天然着色剂。
表格说明
表1由薄层色层分析法(TLC)检测得到的染料四个部分迁移距离和 Rf值的表列数据。
表2由UV检测器在280nm显示染料中蛋白质的存在的分析模式HPLC数 据。按照色谱(图17)蛋白质的停留时间、面积和面积百分数如表所示。
表3由UV检测器在205nm显示染料中缩氨酸的存在的分析模式HPLC数 据。按照色谱(图18)缩氨酸的停留时间、面积和面积百分数如表所示。
表4通过折光检测器显示染料中碳水化合物的存在的表格。给出了 样品碳水化合物的停留时间和标准。
表5当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器 立方晶格激发，并且当附着于原核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧 光的发射。
表6当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器 立方晶格激发，并且当附着于真核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧 光的发射。
表7本申请与申请人早期提交的待审的美国专利申请US09/820,654 各种特征的比较表格。
附图说明
图1多色荧光染料提取、纯化和表征的流程图。
图2荧光分光光度法显示激发波长在351nm、580nm、720nm发现最大 值。
图3荧光分光光度法显示发射波长在400-600发现。
图4当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料绿色荧光发射和细菌细胞(其中附着有染料 (箭头))黄色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。也观察到了 染料在细菌上使其丛生的凝集特性。
图4a图4的有色照片。
图5当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和细菌细胞(其中附着有染 料(箭头))橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。也观察到 了染料在细菌上使其丛生的凝集特性。
图5a图5的有色照片。
图6当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和牡蛎卵细胞(其中附着有 染料)橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。箭头表示极体挤 出。
图6a图6的有色照片。
图7当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料绿色荧光发射和活卵细胞(其中染料已经渗 透(箭头))黄色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。染料的细 胞渗透特性显示染色的卵膜和核膜以及细胞质和核质。
图7a图7的有色照片。也观察到精核的染色质。
图8当染料以具有330-385nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WU 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活卵细胞(其中染料已 经渗透(箭头))蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。染料 的细胞渗透特性显示染色的卵膜和核膜以及细胞质和核质。
图8a图7的有色照片。也观察到精核的染色质。
图9当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和牡蛎卵细胞(其中染料已 经附着)橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。
图9a图6的有色照片。
图10在亮视野下染料荧光发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。
图10a图10的有色照片。
图11当以BX-60 Olympus显微镜的WG滤光器激发时死牡蛎卵细胞表 明没有荧光。
图11a图11的有色照片。
图12当以BX-60 Olympus显微镜的亮视野激发时死牡蛎卵细胞表明 没有荧光。
图12a图12的有色照片。
图13当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和大肠杆菌的无荧光性的外 部荧光显微镜法结果的黑和白图形。
图13a图13的有色照片。
图14当染料以具有330-385nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WU 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中 染料已经渗透(箭头))的蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图14a图14的有色照片。也观察到原子核内部的染色质。
图15当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中 染料已经渗透(箭头))的蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图15a图15的有色照片。也观察到极体内部的染色质。
图16当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗橙色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中染 料已经渗透(箭头))的亮橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图16a图16的有色照片。也观察到极体内部的染色质。
图17染料在280nm UV检测器得到的色谱图。
图18染料在205nm UV检测器得到的色谱图。
图19蔗糖的标准色谱图。
图20葡萄糖的标准色谱图。
图21果糖的标准色谱图。
图22在折光检测器中显示染料中存在碳水化合物的色谱图。
本发明涉及提取、部分纯化和鉴定一种新的色素的方法，该色素是世 界上沿着印度和印度洋-太平洋区域的中西海岸分布的棘皮动物(海参纲∶ 明玉参)得到的天然无毒荧光蛋白染料。
本发明还提供了从动物的卵巢组织得到的一种新的荧光蛋白染料，通 过在-4℃存储在70％的乙醇的条件下，可以从同一个样品中重复提取3-4 次，因而避免了对自然资源的过渡开采。
本发明发现，此染料在紫外和可见光谱范围的3个不同的激发波长下， 有6种不同颜色的荧光发射，等同于当前用于多色荧光检测的6种不同的荧 光染料(DAPI、FITC和PI)和pycobiliproteins和若丹明产生的发射。该 染料覆盖当前市售的用于荧光显微探针的约123种荧光染料发射光谱的波 长。着色的细胞在相同的激发显示不同颜色的发射，但是严格遵守斯托克 定律。这样，在olympus BX 60显微镜滤光器相同的激发下该染料总共发 射6种颜色。该染料对活大肠杆菌和真核细胞是无毒的。该染料渗入各种 细胞组分膜并将其荧光染色。一旦其通过着色附着于细胞膜，该染料是不 可降解的。
该染料是荧光蛋白，其具有附着于蛋白质的荧光基团。
该染料具有凝集特性，由于其在活有机体的筛选作用，其在水产养殖 和组织培养中可用于人工授精和受精。
凝集的细胞保持荧光性，因而该染料可被用于活细胞功能研究。
因而，该染料可以在商业上作为外部荧光显微镜法的天然无毒细胞渗 透的多色荧光蛋白染料，按简单程序用于染色体、细胞和组织的单重、双 重和三重染色。
本发明也涉及染料在非放射性标记蛋白、DNA和RNA探针方面的用途， 用于分子生物学的荧光原位杂交应用中。
因此在用途的优选方式中，该染料可以是分子标记和检测试剂盒的一 种组分，它们多数是进口的并且售价很高。
曾广泛探寻这些标记试剂盒，用于采用快速分子细胞遗传和微观分析 技术的分子诊断中。
然而，该染料的另一优势是即使在非常稀(1∶200000-400000)或更 浓的溶液中其荧光也是可见的。
染料的这种特性以及无毒环境友好特性可以用于救生设备中作为救生 夹克的一个组分，和标记坠毁的飞机、救生筏和军事装备如火箭的位置， 还可以用于工业泄漏检查。
本发明对于单和多细胞所用的流动血细胞计数器的荧光定量测定将是 有用的。
本发明在快速测定自然和控制环境中，例如组织培养物中、污染物中， 以及卫生、食品和化妆品工业的工业污染物中的生物污染方面具有优势。
在另一用途的优选方式中，经用荧光显微镜分析法检查，一旦细胞被 染色该染料在室温具有长的搁置寿命。
本荧光染料的另一用途是作为新的远程测向装置和水下探测器的组成 部分，其中要求了以光波长灵敏度为基础的数据。
本发明的主要目的是提供一种天然无毒环境友好的多色荧光蛋白染 料，该蛋白染料得自海参明玉参的卵巢组织。
本发明的另一个目的是提供一种得自海洋动物明玉参(其为一种非生 物发光海洋动物)的所述荧光蛋白的萃取、部分纯化以及表征的方法。
本发明的另一个目的是提供一种染料，其为细胞膜可渗透的、为细胞 部分提供区分，并在紫外线和可见光频谱波长范围的单色和多色辐射下具 有视觉效果。
本发明的另一目的是提供一种较长时间不感光的染料。
本发明的另一目的是利用该染料检查幸存者以及真核细胞和原核细胞 的生长。
本发明的另一目的是使用该染料提高养殖业和生态学上重要的动物例 如牡蛎的增殖能力和细胞增殖率。
本发明的又一目的是提供使用从明玉参组织中得到的染料的组合物。
本发明还有一个目的是提供一种染料，其在具有三种波长的特定激发 发射在紫外光谱和可见光谱的6个不同波长范围的荧光。
本发明的另一目的是观察荧光和可见光谱分析和发射波长的范围。
本发明的另一目的是观察染料在外部荧光显微镜立方晶格的紫外和可 见光范围的3种不同的荧光色发射。
本发明的另一目的是观察用本发明的染料对筛选染色体、细胞和组织 使用的细胞遗传载物片的荧光染色效果。
本发明的另一目的是观察染料的烧结性。
本发明的又一目的是查看染液中是否存在糖蛋白。
本发明的又一目的是通过用细菌和真核下颌角细胞和幼虫进行试验查 看其无毒性质。
本发明的又一目的是其在食品工业检查细菌污染的应用。
本发明的又一目的是观察荧光和可见光光谱分析及其发射波长的范 围。
本发明的又一目的在于该染料可以用作荧光分子探针的非放射性标 签。
本发明的另一目的在于染料在激发光下没有得到快速灭弧，并且由于 筛选载物片的存在没有发生光致退色。
本发明的又一目的是观察荧光和可见光光谱分析及其发射波长的范 围。
本发明的又一目的在于该染料可以用作荧光分子探针的非放射性标 签。
本发明的又一目的是，虽然染料本质上是含水蛋白液体，但是其一旦 附着于细胞膜上在室温下仍然非常稳定。
本发明还有一个目的是，其甚至在极高或极低的温度下荧光质量也没 有恶化。
本发明的另一目的是制备用于分子探针的非放射标记和复染色的组合 物和试剂盒。
本发明的另一目的是该化合物用于合成流式细胞计、微序列 (microarrays)、免疫测定和其它分子应用中使用的荧光染料衍生物中 的工业用途。
本发明的另一目的是提供一种含有作为原位杂交非放射标签的试剂盒 的荧光材料，作为分子探针。
相应的，本发明提供了一种得自称为海参明玉参的非生物发光的海洋 生物卵巢提取物的新的无毒、细胞渗透性天然多色荧光蛋白染料。本发明 也提供了提取、分离和鉴定所述蛋白染料的方法。另外，本发明也公开了 所述以溶液形式存在的染料中至少四种化合物的存在。所述染料中的荧光 基团与带负电的蛋白有关。染料的溶液中还至少存在一种糖蛋白。该糖蛋 白显示出外原凝集素类凝集性质。测试的染料由于凝集素的存在，受精率 提高并且在真核和原核活体细胞中无毒。该染料组合物将在活体细胞中或 细胞间作为原位目视跟踪中发荧光的外部荧光精微着色剂。
因此，本发明提供了一种生物活性部分提纯的提取物，其中含有得自 雌性性腺(亦即海洋生物明玉参的卵巢组织，存在于潮水之间、水中、浅 水和深水中，通常大量存在于阴暗区域，如洞中凹处、缝隙、暗礁、突出 物、岩石沙质聚集处、具有暗色到良色有或没有外部和桥骨骼、固着的、 固定漂流物，具有各种浮游内功率通常夜间活动的浮游生物，易于活跃地 捕食，具有或没有荧光、具有体外受精的卵和发出UVB、UVA、可见光和红 外光部分至所有发光的荧光染料)的无毒蛋白荧光染料。
经过许多研究以后，本申请已经鉴定出一种从海洋生物，特别是从无 脊椎生物，尤其是从海参明玉参得到的新的无毒荧光蛋白染料。
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
目：盾手目(Aspidochirota)
科：海参科
属：海参属
种：Scabra
本发明还提供了一种得自动物卵巢的天然细胞穿透性的多色荧光蛋白 染料，并且其对活体细胞是无毒的。本发明还描述了此染料的物理和化学 性质及其在直射光、高和低温下的稳定性。该染料在紫外和可见光谱的3 个不同激发波长处有3种颜色的荧光发射。本发明也涉及在荧光显微镜下 筛选细胞以快速检查污物、残余的细胞和存在或不存在凝集作用。本发明 也涉及到使用本染料作为蛋白、DNA和RNA分子探针的非放射性标记，用于 先进的分子诊断及染色体、细胞和组织的单和双着色的外部荧光显微镜 法，用于荧光外部杂交应用、检查生物污染、在水产养殖和生物医学中用 于受精能力的增强，作为研究活体细胞所需要的试剂盒组分、新的遥感装 置、水下探测器、救生设备及标记坠毁飞机、救生筏和军事装备如火箭， 还有在低于0℃温度的条件下荧光的应用以及许多更多的应用。该染料环 境友好，其不杀死河口和海洋生物的幼虫。本发明描述了从海洋动物得到 的荧光染料，它们吸收阳光完成生理功能或暴露于阳光下更长的时间并显 示有不同波长处的荧光进化的机制。如浮游植物、浮游微生物和光合细菌 吸收阳光以完成其光合功能，在化学途径中使用光谱的必须波长，而额外 光的发射遵循斯托克定律。
无脊椎动物没有另外的外甲，如壳和显著的防卫器官，它有硬和多刺 的皮肤，有由小骨形成的强的内骨骼，它们是定栖的或缓慢移动，长时间 暴露于直射阳光下，生活在沙中或裂缝中，可以显现荧光。本发明通过提 供高效和高选择性的提取、纯化和鉴定由海产无脊椎动物得到的染料的方 法，及其在制备使用非放射性标记的分子诊断的试剂盒、分子标记、外部 荧光显微镜法、光化学疗法、新的土地测试设备和水下探测器的组成部分、 化妆品工业、食品工业和军队等方面的多种用途，以克服在先技术的缺点。
所述的海洋无脊椎动物是棘皮动物，分类学上称为明玉参，属于海参 纲。本发明的产品是一种首次报道的新的无毒多色荧光蛋白染料。在落潮 时从印度西海岸中部收集动物，带到实验室并保存在有海水的玻璃缸中， 海水的盐度为30-32％/par。动物为成年动物并处于性成熟期。如上所述 确定分类学位置。
实际上，大多数可得到的染料实质上是合成的。仅有6类天然染料。 包括从所有活的生物体得到的染料。本发明报道的荧光染料是特征为多色 荧光无毒和活细胞膜可透过物中仅有的，其从海参卵巢组织中提取。
此处所用的术语染料用于指不被还原剂退色的色素。所述的染料使纤 维、纤维素等染色。它称为天然染料，因为来源于通常发现在自然界中沿 着地球的海岸、浅水和深水分布的海洋动物，而不是合成色素。荧光染料 在从高到低电子状态的非常短时间内的跃迁过程中，在特定波长激发从而 发光。
多色荧光意味着当在不同波长范围内被激发时发出不同颜色的光。它 在通过紫外和可见光的不同光谱激发时，发射蓝、黄绿色和橙红色的荧光 色彩。
细胞膜渗透性指的是染料通过活细胞的微孔和细胞的核膜，并根据 UV、蓝色和绿色波长激发使其发出青白色、黄色和橙色的阴影的多色荧光。
对活细胞无毒指的是对真核细胞和原核细胞的活细胞测试时，这些细 胞没有死亡。
附着于细胞膜后染料的光稳定性指的是用所述染料对活细胞和固定细 胞染色后发出荧光的连续性。
此处使用的分子诊断指的是使用染料作为用于分子探针的非放射性标 记，用于分子细胞遗传学中的荧光原位杂交应用，并作为微阵列的标记物 和用于分子生物学研究中。此处的外部荧光显微镜法属于对细胞遗传标本 的载物片进行显微研究，通过用本发明的染料作为着色剂，并在用于已知 荧光染料激发而发射特定颜色的发射光的不同立体构型下观察时，记录不 同颜色的荧光。
荧光染料立方晶格WUB、WB、WG是用于不同波长的Olympus EX-FLA反 射光荧光附件指定的滤光器立方晶格构型。对于各自的立方晶格通过显微 镜其记录为WU、WB、WG和BF，此后相同的缩写用于整个专利中。
市场上已经存在的各种染料的名称以其根据Stains File染色指标、 Bitplarne产品和Molecular探针给出的商品名而提及。这些公司的参考已 经在先有技术中提到。
相应地，本发明提供了一种天然无毒细胞膜可穿透的多色荧光染料的 提取、部分纯化以及鉴定的方法。本发明进一步提供了染料导致凝集、提 高牡蛎下颌细胞授精受精率，并不杀死真核细胞和原核细胞的组合物，其 中包括：
i.从野外采集材料并保存在实验室条件下，
ii.从棘皮动物海参明玉参的皮肤中提取色素，和
iii.部分纯化此染料
iv.测试生物活性
从海产的海参明玉参的卵巢组织中提取得到本发明的生物活性提取 物。此提取物作为天然荧光染料并具有以下特征：
i.不被还原剂脱色
ii.不是合成化合物
iii.染料的粗提物是黄橙色的
iv.部分纯化的染料滤液保持相同的颜色
v.染料为溶液形式
vi.酒精提取物保持在4℃
vii.在管灯下发出各种颜色的可见光谱
viii.色素不直接溶于水
ix.纯色素溶于70％的乙醇
x.根据其应用可以用超高纯/海水进一步稀释
xi.带负电荷
xii.pH值为6.8-7.5
xiii.没有醌型的环
xiv.性质上是蛋白质的
xv.如HPLC数据所示，染料的溶液中含有至少一种糖蛋白
xvi.染料溶液中至少存在4种化合物
xvii.通过HPLC证实含有碳水化合物和蛋白质
xviii.荧光基团与蛋白质有关
xix.荧光光谱分析显示：激发的最大波长在351nm、580nm和720nm
xx.荧光发射光谱分析显示：在450nm和550nm的两个峰值最大发射
xxi.根据其是否为单独的燃料溶液或其附着的细胞，溶液中的染料 在外部荧光显微镜荧光立方晶格的UV和可见区的3种不同波长发射6种不同 颜色的荧光
xxii.当在超紫外线立方晶格WU-330-385nm的激发范围激发时，在 450nm-470nm范围发出蓝色荧光
xxiii.当在450-480nm激发范围的WB立方晶格激发时，在510-570nm 范围发射黄绿色荧光
xxiv.当在510-550nm激发范围的WG立方晶格激发时，在610-650nm 范围发射橙色荧光
xxv.当在100倍的油镜下观察时，在通常的外部荧光显微镜的透射光 灯泡下，染料发射黄灰色色调
xxvi.甚至在稀释范围为1∶20000倍时，这些染料仍发射这些荧光颜色
xxvii.甚至在4℃放置至少一年后，提取物的荧光仍然存在
xxviii.染料的荧光是非常光稳定性的，并且一旦细胞被着色甚至是 在室温下长时间暴露于直射光下也不会被破坏
xxix.即使是在-20℃冷冻，染料的荧光也不会改变，在此温度下分 子不可能象在从发光生物体得到的提取物中那样获得活化所必须的能量
xxx.染料对于真核生物的活细胞是无毒的
xxxi.染料对原核生物(E.coli)的活细胞也是无毒的
xxxii.染料在细菌中导致外原凝集素类凝集
xxxiii.染料在牡蛎的精液中导致外原凝集素类凝集
xxxiv.染料在更短的周期促进精液的授精和受精，然后控制
xxxv.染料是细胞膜透过的
xxxvi.染料对于死真核细胞是细胞膜透过的
xxxvii.染料对于死原核细胞是细胞膜透过的
xxxviii.一旦染料染色了细胞部分，其是不可降解的。
以下列步骤评价染料的物理和其它特性：
i.染料的结构分析
ii.无毒性测试
iii.凝集试验
iv.细胞膜选择染色测试
v.染料的可见光谱
vi.染料的荧光光谱
vii.在UV透照器260-280nm范围进行发射的物理检查
viii.具有活牡蛎卵和精液的载物片的制备
ix.活细菌载物片的制备
x.用风干法制备固定细胞载物片
xi.用染料使载物片着色
xii.无需加入染料对每个试验保持控制
xiii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选活真核细胞载物片
xiv.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选固定真核细胞
xv.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微镜 法筛选死真核细胞
xvi.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选活细菌细胞
xvii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，用外部荧光显微 镜法筛选死细菌细胞
xviii.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内，不使用染料用 外部荧光显微镜法筛选活控制单元
xix.在没有任何细胞的载物片区域内对发射的荧光进行显微照相
xx.在荧光立方晶格WU、WB、WG和Bright范围内对细胞生成载物片 发射的荧光进行显微照相，和
xxi.使用染料检查发射的荧光色彩的波长范围和荧光染料立方晶格 的激发范围的波长范围
xxii.使用染料着色的细胞检查发射的荧光色彩的波长范围和荧光染 料立方晶格的激发范围的波长范围
xxiii.检查质膜、细胞质、核膜、核质和染色体的细胞膜渗透性
因此本发明提供来源于海产动物的天然荧光染料，当用外部荧光显微 镜的紫外和可见光谱立方晶格的3种不同范围的波长激发时，它发射蓝、 黄和橙红6种不同颜色的荧光。染液的发射范围和用该染料着色的细胞的 发射范围不同。本发明还涉及此染料作为外部荧光显微镜法的着色剂，在 原核和真核活、固定和死细胞制剂的外部荧光显微镜法。染料可以用于制 备非放射性标记试剂盒，在各种分子、生物医学和工程科学中通过荧光原 位杂交用于分子诊断。
在本发明的一个实施例中，染料的来源是无脊椎海产动物，属于后生 动物亚界、棘皮动物门、Eleutherozoa亚门，海参纲，名称为明玉参。
在另一实施例中，明玉参选自海参并广泛分布于全世界特别是印度洋 太平洋的海滨、浅水、深水域。已知与海参有最接近的亲缘关系的是海胆 和海星。
在另一实施例中，明玉参被解剖，分离其卵巢并称重。向1克(湿重) 卵巢组织中加入3ml 70％的酒精。
在另一实施方案中，提取物通过Whattman No.1滤纸过滤。
在另一实施方案中，具有螺旋盖的管形瓶储存被称为“染液”的染料溶 液，并且于4℃在低温室中储存直到进一步应用。
在另一实施方案中，染液的颜色用肉眼和管灯记录。
在另一实施方案中，发现染液可溶于70％的乙醇。为了试验可以在水 中进一步稀释。
在另一实施方案中，记录了染料室温下在溶液中和在着色细胞上的耐 光性。显示其一旦附着在细胞膜上该染料是不可降解的。
在另一实施方案中，通过电泳进行了该染料的电荷测试。观察到黄色 斑点到正极接线柱的漂流。这表明含有有色化合物的染料是带负电荷的。
在另一实施方案中，颜料为使滤纸产生颜色的染料。在另一个实施方 案中该染料pH为6.8-7.5。
在另一实施方案中，取1ml该乙醇卵巢提取物的染液并加入0.2克二硫 代丁四醇。该溶液没有脱色。这表明该荧光化合物的颜色部分是不可还原 的，其中不存在任何可还原的环状醌。这个试验的结果表明该有色化合物 为不可还原染料。
在另一实施方案中，5ml提取物在100℃的水浴中加热。观察到了凝聚。 这证实了该染料的酒精提取物中蛋白质的存在。
在另一实施方案中，染色部分通过凝聚和仅仅在非极性溶剂的醚中解 聚而与蛋白质分离。当进行纸上电泳时，该染色溶液不向任一电极移动。 这表明该荧光染料的非极性特性。
在另一实施方案中，该染料通过使用4ml硫酸和蒽酮测糖试剂进行蒽 酮测试(Ref)。1ml水、4ml浓硫酸和蒽酮测糖试剂作为空白组。5分钟 后空白组为轻微绿色，然而5分钟后该提取物变成鲜绿色。该试验证明染 液中存在碳水化合物。
在另一实施方案中，使用硅胶-G板对所述染料(5微升)进行薄层色 层分析。使用的溶剂为2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅胶-G板在容 器中用碘蒸汽染色。发现4个斑点。该试验表明粗提物中至少含有4种不同 的化合物。斑点及其各自的Rf值如表1所示。
在另一实施方案中，纯化合物的荧光特性通过荧光分光光度法观察。 该化合物(凝胶过滤后冻干)溶于水(浓度为0.001克/毫升)并进行荧光 分光光度法。其首先进行激发扫描，然后在351nm、580nm和720nm发现该 化合物被激发。
在另一实施方案中，所述染料然后进行荧光发射分光光度分析。当在 351nm激发时，发射处于400-600。在450nm和550nm波长发射有两个峰值。 (图2和3)。
在另一实施方案中，进行HPLC分析以检测蛋白质和碳水化合物的存 在。
在另一实施方案中，通过等浓度模式的反向HPLC用80％乙酰和20％水在 C18反向柱中进行染液的HPLC。
在另一实施方案中，UV检测器在280nm和205nm的波长检测到蛋白质的 存在。图17和表2显示出通过在280nm的UV检测器蛋白质存在的结果。可以 看出：7种蛋白质的停留时间在2.1-8.8分钟之间变化。覆盖的面积为535- 116103之间。峰1的最大百分数面积具有2.1分钟的保留时间。由此可见样 品中蛋白质在峰1的量最多。
在另一实施方案中，UV检测器在205nm的波长检测到缩氨酸的存在。 图18和表3通过UV检测器在205nm显示出10种缩氨酸的存在。停留时间在 2.1-14.8分钟之间变化。覆盖的面积为63482-3218965。并且缩氨酸在峰3 的最大百分数面积具有3.9分钟的停留时间。
在另一实施方案中，折光检测器检测到碳水化合物的存在。使用的标 准为葡萄糖、蔗糖和果糖。结果如图19、22和表4所示。
在另一实施方案中，根据HPLC数据分析和电泳表明了荧光基团与蛋白 质的结合。由于荧光基团是非极性的，在乙醇的卵巢提取物中看来好像可 以与带负电的组分结合。因为其在电泳的时候向正极移动。并且如表1、2、 3和4的HPLC数据所示，仅仅检测出蛋白质和碳水化合物。其要求染色荧光 fluoropore与某些带负电的蛋白质相结合。可以说，染液的荧光活性应归 于含有附着于带负电蛋白质上的非极性荧光基团的组分，当该蛋白质凝聚 时，该荧光基团容易分离。
在另一实施方案中，进行凝聚测试以证实糖蛋白的存在。由于提取物 中至少一种糖蛋白指标的存在，由于凝集的存在进行生物测定。
在另一实施方案中，染料的凝集生物活性测试通过进行两组试验在革 兰氏阴性细菌(大肠杆菌)进行。在试验1中，50微升所述染料加入到100ml 的Muller Hilton′s培养基流体(culture broth)中。产生没有海产动物 提取物的空白组。0.1ml的新鲜大肠杆菌inauculum加入到该培养基流体 中。培养基流体在自转为150rpm的定轨振荡器中孵化。8小时后在两个培 养基流体中都发现混浊。然而含有提取物(染液)的培养基流体显示出丛 生生长。细胞形成凝集。没有染料的正向空白组显示出正常生长。
在另一实施方案，在第二组试验中，一圈活大肠杆菌载玻片上的25微 升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台 阶上30秒使酒精挥发。然后一个盖片放于细菌制剂上并密封。同样制备没 有任何染料的对照细菌制剂。
在另一实施方案中，两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10 倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查凝集生物活性和荧光。已经发现用染 料处理的载物片上的细菌形成丛生，然而对照组中没有出现这种现象。这 证明该染料具有引起凝集的生物活性。还注意到细菌以特定的丛生形状凝 集。丛生中的细菌自始至终都是活的。它们仅仅在载物片变干时死亡(图 4和5)。
在另一实施方案中，在染液的存在下细胞形成凝聚的趋向表明其中含 有外原凝集素类糖蛋白。这也进一步支持了我们关于HPLC数据的解释，亦 即海参卵巢粗提物中至少存在一种糖蛋白。
在另一实施方案中，对真核生物精液进行的凝集试验。1毫升牡蛎精 液溶液置于用于浮游植物计数的sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5 μl)酒精提取物。载物片在40倍物镜和10倍目镜的显微镜下筛选。可以 看出精液形成集合体、粘附并形成丛生。没有聚集的特定形式。这种特性 在对照实验中没有出现。
在另一实施方案中，显现了牡蛎精液和卵的授精和受精率的增加。牡 蛎的优质精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物计数的 sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后载物片 立即在显微镜下筛选并观察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。进行没 有提取物的对照组。图6显示出几秒内和以绿色激发滤光器(WG)观察到的 极体挤出。
在另一实施方案中，产生了在测试组和对照组之间授精和受精率之间 的百分比差异。可以看出30秒后，处理的细胞有80％的卵受精，然而在对 照组中仅仅有40％的细胞受精。我们注意到大量的精液黏着到卵膜。在我 们的早期试验中我们注意到，这些卵受精作用通常的实际时间约为10-15 分钟。第一个极体的形成发生在增加染料的1分钟之内(图6)。当前的染 液看来具有一些因素，其促进精液通过卵膜的授精，并最终在更短的时间 间隔内增加受精率。
在另一实施方案中，进行了染料对真核细胞村活的无毒测试。
染料测试了对牡蛎精液的细胞毒性。试验中精液的存活率被认为显示 无毒的参数。牡蛎的雄性生殖腺被除去并且精液释放在100％的海水中。
其通过muscline布过滤以除去所有有机物残渣。取1毫升(ml)精液溶 液并加入不同浓度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小时 通过显微镜观测精液的存活率。试验进行24小时。不加入染料进行对照组。 发现加入染料对精液的存活率没有任何影响。这表明该染料无毒特性。
在另一实施方案中，通过原核生物的存活率进行染料的无毒测试。通 过观察其存活率或者死亡量测试了提取物对革兰氏阴性大肠杆菌的细胞毒 性。一滴水(25μl)中的活大肠杆菌置于载玻片上。向其加入2μl酒精 提出物。暂时封闭该载物片以防止蒸发。在显微镜下昼夜观察到直到，细 菌保持在溶液中能存活24小时。如果溶液蒸干，它们死亡。进行对照试验。 证明染料对原核生物也是无毒的。
申请人研究了染料的性质并发现在不同激发波长产生多种颜色的发 射，它能够与已进入市场的荧光染料显微着色剂相比。本染料的蓝色荧光 可以与DAPI荧光染料在同样激发波长发射的同样颜色相比，后者作为生物 化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记试剂盒的组分。
本染料在可见范围的黄色荧光可以与FITC的同样颜色的发射相比，后 者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和 检测试剂的组分。
橙色荧光发射可以与碘化甲锭(Propidium Iodide)荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物 学的非放射性标记和探测试剂盒的组分。橙色发光的发射能够与TRITC荧 光染料的橙色荧光颜色相比，后者作为生物化学、细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射性标记和探测试剂盒的组分。该染料在室温是稳定 的，并有长的搁置寿命。本染料的分子和放射性试剂盒可以在室温下出口。 该染料有至少123种市场已有的不同荧光染料的特性，这些市售(位面产 品)荧光染料确切地DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖 啶橙、金胺、若丹明、TRITC和碘化甲锭。染料在显微镜的通常光下，灰 色的色彩产生相差效果，这对快速筛选细胞遗传学、细胞学和组织化学载 物片是有用的，并可以节省额外的补充显微镜相位差的成分的费用。荧光 颜色的发射服从荧光的斯托克定律。
在另一实施方案中，用此染料的1∶20000的稀释液作为着色剂进行外 部荧光显微镜法研究，并记录用不同立方晶格激发时光的发射，并与已知 荧光染料比较颜色色调(图7-10)。
在另一实施方案中，载物片的筛选使用Olympus显微镜BX-60的olympus bx-FLA反射荧光附加器在WU、WB、WG和BF荧光染料立方晶格使用紫外线和 可见光进行。
在另一实施方案中，WU立方晶格的波长范围是330nm-385nm。
在另一实施方案中，WB立方晶格的波长范围是450nm-480nm。
在另一实施方案中，WG立方晶格的波长范围是510nm-550nm。
在另一实施方案中，BF用于亮视野，其中普通的钨灯泡发光。
在另一实施方案中，发现了染料在不同激发范围的发射范围。外部荧 光显微镜法中卵的背景显示了染料的发色。
在另一实施方案中，WU 330nm-385nm范围的激光发射的荧光在450nm- 470nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发发射 的荧光在510nm-570nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发发射 的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个使用BF的实施方案中，发现黄灰色半点斑点。在另一实施方 案中，发现染料对细胞膜染色后不同激发范围的发射范围。
在另一实施方案中，染料用作牡蛎死、活和固定卵的荧光性微小着色 剂。载物片在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到死细胞没有接受染料并 且没有显示荧光(图11和12)。
在另一实施方案中，染料用作牡蛎活卵的荧光性微小着色剂。载物片 在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到活细胞显示荧光。激发光谱范围和 放射荧光严格地遵循斯托克定律。这些范围与表示荧光细胞背景的染料发 射范围不同(图4-16)。
在另一实施方案中，染料在3∶1的乙醇和乙酸固定剂中用作牡蛎固定 卵的荧光性微小着色剂。载物片在外部荧光显微镜下筛选。我们注意到固 定细胞显示荧光。激发光谱范围和放射荧光严格地遵循斯托克定律。这些 范围与表示荧光细胞背景的染料发射范围不同(图4a-16a)。
在另一实施方案中，用WU 330nm-385nm范围激发，在细胞中以470nm- 500nm范围发射荧光。
在另一实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发，发 射的荧光在570nm-610nm范围。
在另一实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发，发 射的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选死卵，产生淡黄灰色类相 差效果的色彩。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选活卵，产生淡黄灰色类相 差效果的色彩。
在另一个实施方案中，以可见光的整个白光范围并根据细胞组分的密 度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选固定卵(3∶1的乙醇∶乙酸 固定液)，产生淡黄灰色类相差效果的色彩。
在另一个实施方案中，染料用作大肠杆菌的显微着色剂。一圈活大肠 杆菌载玻片上的25微升水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通 过将载物片放置在台阶上10-15秒使提取物中的酒精挥发。然后一个盖片 放于水中的细菌悬浮液上并密封。同样制备没有任何染料的对照细菌制 剂。
在另一个实施方案中，两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10 倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查荧光。我们注意到死细胞没有吸收染 料并且没有显示荧光(图11-12)。
在另一个实施方案中活细菌细胞显示荧光(图4-5)。激发光谱范围 和发射荧光波长严格地遵循斯托克定律。这与染液不同，给出如下：
在另一个实施方案中，以WU 330nm-385nm范围激发，在470nm-500nm 范围发出荧光。
在另一个实施方案中，以波长范围为450nm-480nm的WB滤光器激发， 在570nm-610nm范围发出荧光。
在另一个实施方案中，以波长范围为510nm-550nm的WG滤光器激发， 在610nm-650nm范围发出荧光。
在另一个实施方案中，没有任何染料的对照大肠杆菌也没有显示荧 光。
在另一个实施方案中，对具有用于外部荧光显微镜法着色剂染料的载 物片进行缩微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WU330nm-385nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WB 450nm-480nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在WB 510nm-550nm范围内，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料 发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶 片，在亮视野，在具有细胞的载物片区域和仅仅表现染料发色的围绕背景 区域进行发射荧光的显微照相。
在另一个实施方案中，发现了染料在细胞膜的透过。牡蛎的未受精、 受精卵和幼体用染料染色，卵悬浮比为1∶50微升，并且在荧光显微镜下筛 选(图7-10，7a-10a；14-16，14a-16a)。已经发现质膜、核膜和染色质 中的荧光是显著的。虽然发射的波长范围相同并且颜色为相同色调的彩 色，在细胞的这些部分之间存在显著的界限(图7-10，7a-10a)。这证明 染料能够透过卵质膜、细胞质、核膜、核质和染色质的活细胞和固定细胞 膜。
在另一个实施方案中，死细胞中细胞部分不存在荧光表明染料没有穿 透死细胞的膜(图11-12，11a-12a)。
不同的着色剂用于荧光显微镜的不同的激发立方晶格。例如在330nm- 385nm激发立方晶格的激发下看DAPI(DNA染色，发射蓝色)、荧光-dUTP、 Hoechest 33258、33342；在用450nm-480nm激发立方晶格时看FITC、吖啶 橙(用于DNA、RNA发色绿色/黄色色彩)、金胺；在用510nm-550nm激发立 方晶格时看若丹明、TRITC和碘化甲锭(DNA、发射橙色色彩)。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为330nm-385nm波长的WU滤光器 激发。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为450nm-480nm波长的WB滤光器 激发。
在一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，筛选是在载 物片上滴一滴稀释的提取物，用光谱范围为510nm-550nm波长的WG滤光器 激发。
在另一个筛选细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案中，使用此染 料，在亮视野物镜下通过透射光观察。
在另一个筛选此染料着色的细胞载物片的外部荧光显微法的实施方案 中，观察各自的激发所发射的荧光颜色的色彩。
在另一个实施方案中，WU 330nm-385nm范围的激光发射的荧光在 470nm-500nm范围。
在另一个实施方案中，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光器激发发 射的荧光在570nm-610nm范围。
在另一个实施方案中，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光器激发发 射的荧光在610nm-650nm范围。
在另一个在亮视野下筛选细胞载物片的外部荧光显微镜法的实施方案 中，使用透射光，这种透射光根据细胞成分的密度所发射的光在可见光谱 的整个白光范围内，从而产生相差结果。
在本发明的另一方面，在70％的乙醇中制备1∶400000倍及以上稀释的 染料，并作为着色剂，在外部荧光显微镜法的紫外和可见区域发生有色的 荧光发射。
在另一个实施方案中，染料在70％的乙醇中以1∶9000倍稀释，然后在 水中以1∶50倍稀释，其意味着总共稀释1∶450000倍，这使荧光在三种不同 的波长产生三色的荧光。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生物活性组合物，其含有得 自海参明玉参的提取物，在超纯水中的比例为1∶40000倍得到的提取物， 从而得到在3个不同波长产生三色荧光，和在透射光下的相差效果。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于制备涂料组合物和墨 水。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于泄漏的检测。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于水下探测器。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于分子诊断中所用的原位 杂交试剂盒中的荧光探针。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于免测荧光检测。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的复染剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，在流动血细胞计数中用于单 一和多细胞荧光定量。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用作外部荧光显微镜法的荧 光着色剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业中快速检查生物污染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于快速估计实验室培养下 的生物污染物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于快速测定田间条件下的 生物污染物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用于细菌引发的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有从海参明玉参 中得到的生物活性提取物以及常规的添加剂，用作天然着色剂。
表格说明
表1由薄层色层分析法(TLC)检测得到的染料四个部分迁移距离和 Rf值的表列数据。
表2由UV检测器在280nm显示染料中蛋白质的存在的分析模式HPLC数 据。按照色谱(图17)蛋白质的停留时间、面积和面积百分数如表所示。
表3由UV检测器在205nm显示染料中缩氨酸的存在的分析模式HPLC数 据。按照色谱(图18)缩氨酸的停留时间、面积和面积百分数如表所示。
表4通过折光检测器显示染料中碳水化合物的存在的表格。给出了 样品碳水化合物的停留时间和标准。
表5当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器 立方晶格激发，并且当附着于原核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧 光的发射。
表6当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器 立方晶格激发，并且当附着于真核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧 光的发射。
表7本申请与申请人早期提交的待审的美国专利申请US09/820,654 各种特征的比较表格。
附图说明
图1多色荧光染料提取、纯化和表征的流程图。
图2荧光分光光度法显示激发波长在351nm、580nm、720nm发现最大 值。
图3荧光分光光度法显示发射波长在400-600发现。
图4当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料绿色荧光发射和细菌细胞(其中附着有染料 (箭头))黄色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。也观察到了 染料在细菌上使其丛生的凝集特性。
图4a图4的有色照片。
图5当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和细菌细胞(其中附着有染 料(箭头))橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。也观察到 了染料在细菌上使其丛生的凝集特性。
图5a图5的有色照片。
图6当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和牡蛎卵细胞(其中附着有 染料)橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。箭头表示极体挤 出。
图6a图6的有色照片。
图7当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料绿色荧光发射和活卵细胞(其中染料已经渗 透(箭头))黄色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。染料的细 胞渗透特性显示染色的卵膜和核膜以及细胞质和核质。
图7a图7的有色照片。也观察到精核的染色质。
图8当染料以具有330-385nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WU 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活卵细胞(其中染料已 经渗透(箭头))蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。染料 的细胞渗透特性显示染色的卵膜和核膜以及细胞质和核质。
图8a图7的有色照片。也观察到精核的染色质。
图9当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和牡蛎卵细胞(其中染料已 经附着)橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图形。
图9a图6的有色照片。
图10在亮视野下染料荧光发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。
图10a图10的有色照片。
图11当以BX-60 Olympus显微镜的WG滤光器激发时死牡蛎卵细胞表 明没有荧光。
图11a图11的有色照片。
图12当以BX-60 Olympus显微镜的亮视野激发时死牡蛎卵细胞表明 没有荧光。
图12a图12的有色照片。
图13当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗红色荧光发射和大肠杆菌的无荧光性的外 部荧光显微镜法结果的黑和白图形。
图13a图13的有色照片。
图14当染料以具有330-385nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WU 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中 染料已经渗透(箭头))的蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图14a图14的有色照片。也观察到原子核内部的染色质。
图15当染料以具有450-480nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WB 滤光器立方晶格激发时，染料暗蓝绿色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中 染料已经渗透(箭头))的蓝色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图15a图15的有色照片。也观察到极体内部的染色质。
图16当染料以具有510-550nm激发范围的olympus BX-60显微镜的WG 滤光器立方晶格激发时，染料暗橙色荧光发射和活牡蛎胚胎细胞(其中染 料已经渗透(箭头))的亮橙色发射的外部荧光显微镜法结果的黑和白图 形。染料的细胞渗透特性显示染色的卵膜、极体细胞、细胞质和染色质。
图16a图16的有色照片。也观察到极体内部的染色质。
图17染料在280nm UV检测器得到的色谱图。
图18染料在205nm UV检测器得到的色谱图。
图19蔗糖的标准色谱图。
图20葡萄糖的标准色谱图。
图21果糖的标准色谱图。
图22在折光检测器中显示染料中存在碳水化合物的色谱图。
本发明涉及提取、部分纯化和鉴定一种新的色素的方法，该色素是世 界上沿着印度和印度洋-太平洋区域的中西海岸分布的棘皮动物(海参纲∶ 明玉参)得到的天然无毒荧光蛋白染料。
本发明还提供了从动物的卵巢组织得到的一种新的荧光蛋白染料，通 过在-4℃存储在70％的乙醇的条件下，可以从同一个样品中重复提取3-4 次，因而避免了对自然资源的过渡开采。
本发明发现，此染料在紫外和可见光谱范围的3个不同的激发波长下， 有6种不同颜色的荧光发射，等同于当前用于多色荧光检测的6种不同的荧 光染料(DAPI、FITC和PI)和pycobiliproteins和若丹明产生的发射。该 染料覆盖当前市售的用于荧光显微探针的约123种荧光染料发射光谱的波 长。着色的细胞在相同的激发显示不同颜色的发射，但是严格遵守斯托克 定律。这样，在olympus BX 60显微镜滤光器相同的激发下该染料总共发 射6种颜色。该染料对活大肠杆菌和真核细胞是无毒的。该染料渗入各种 细胞组分膜并将其荧光染色。一旦其通过着色附着于细胞膜，该染料是不 可降解的。
该染料是荧光蛋白，其具有附着于蛋白质的荧光基团。
该染料具有凝集特性，由于其在活有机体的筛选作用，其在水产养殖 和组织培养中可用于人工授精和受精。
凝集的细胞保持荧光性，因而该染料可被用于活细胞功能研究。
因而，该染料可以在商业上作为外部荧光显微镜法的天然无毒细胞渗 透的多色荧光蛋白染料，按简单程序用于染色体、细胞和组织的单重、双 重和三重染色。
本发明也涉及染料在非放射性标记蛋白、DNA和RNA探针方面的用途， 用于分子生物学的荧光原位杂交应用中。
因此在用途的优选方式中，该染料可以是分子标记和检测试剂盒的一 种组分，它们多数是进口的并且售价很高。
曾广泛探寻这些标记试剂盒，用于采用快速分子细胞遗传和微观分析 技术的分子诊断中。
然而，该染料的另一优势是即使在非常稀(1∶200000-400000)或更 浓的溶液中其荧光也是可见的。
染料的这种特性以及无毒环境友好特性可以用于救生设备中作为救生 夹克的一个组分，和标记坠毁的飞机、救生筏和军事装备如火箭的位置， 还可以用于工业泄漏检查。
本发明对于单和多细胞所用的流动血细胞计数器的荧光定量测定将是 有用的。
本发明在快速测定自然和控制环境中，例如组织培养物中、污染物中， 以及卫生、食品和化妆品工业的工业污染物中的生物污染方面具有优势。
在另一用途的优选方式中，经用荧光显微镜分析法检查，一旦细胞被 染色该染料在室温具有长的搁置寿命。
本荧光染料的另一用途是作为新的远程测向装置和水下探测器的组成 部分，其中要求了以光波长灵敏度为基础的数据。
具体实施方式
用以下实施例说明本发明，但在任何方式上不能理解为是对本发明范 围的限制。
以下公开了提取、部分纯化、鉴定染料的方法，和用分光镜分析法和 外部荧光显微镜法检查染料的无毒性、细胞渗透性、凝集和多色荧光特性 而进行的试验的细节。
实施例1：采集原料
本专利中的材料是海参，并具有下列分类学细节
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
目：盾手目(Aspidochirota)
属：海参属
种：Scabra
材料采集自落潮时的印度中西海岸。将其带到实验室并在使用前放在 装有盐度为30-32/par(30‰)海水的玻璃缸中。
实施例2：
从雌性生殖腺中分离染料
动物首先用自来水洗，然后用超纯水洗。用快剪切开动物体，并且分 拣雄/雌动物。找出雌性生殖腺并从内脏中小心除去。根据卵巢细胞的成 熟或半成熟，卵巢的颜色在黄色到橙色之间变化。称重卵巢组织并放在玻 璃烧杯中。以1∶3的比例(重量体积比)加入70％的乙醇。淡黄橙色的颜 料出现。有色溶液转移到其它容器中。向剩余的组织再次加入70％的乙醇 并除去有色溶液。这些步骤重复三次以萃取色素，而没有使卵巢组织匀化。 染料的部分纯化
提取物通过用whattman No.1滤纸过滤而部分纯化。装有染料溶液的 具有螺旋盖的管形瓶标记为“原染料溶液”，并且在4℃的低温下储存直 到进一步应用。带有来自于卵巢组织的淡黄和橙色色素的提取物通过以下 方法鉴定。发现特征相同。
1mg卵巢提取物：3ml 70％的乙醇(3次)，亦即1mg提取物在9ml 70 ％的乙醇，为9000微升(μl)70％的乙醇中。
实施例3：染料颜色和溶解性的物理性质
所述染液用肉眼观察是淡黄橙色。在日光/管灯下其产生变化的颜色 发射。染料不溶于水而溶于醇。
实施例4：光稳定性
染料的醇提取物在4℃是稳定的。一旦细胞用该染料标记，荧光性可 以在室温下保持几个月。
实施例5
根据卵巢中成熟卵和未成熟卵的数量，染料具有6.8-7.5的pH值。成 熟的卵越多pH越接近7.5，成熟的卵越少pH越接近6.8。
实施例6：通过纸电泳法测试染料的电荷
所述染料提取物进行纸上电泳测试。Whattman No.1滤纸吸收pH为7的 磷酸盐缓冲液(0.1M)，然后放入电泳槽。两个电极浸入磷酸盐缓冲液。用 5微升(μl)卵巢提取物形成一个斑点并在40伏进行纸上电泳测试。观察到 黄色斑点向正极接线柱的迁移。这证明含有有色化合物(色素)的提取物 带有负电荷。提取物是在滤纸上得到颜色的染料。
实施例7：染料的化学特性
取1ml卵巢的乙醇提取物染液并加入0.2克二硫代丁四醇。溶液没有退 色。这表示在荧光染料的颜色基中不存在可还原基团。
实施例8：测试蛋白质存在
5ml提取物在100℃的水浴中加热。观察到凝聚。这表明在染料的酒精 提取物中蛋白质的存在。
实施例9：测试碳水化合物的存在
使用4ml硫酸和蒽酮测糖试剂将该提取物进行蒽酮测试(Ref)。1ml水、 4ml浓硫酸和蒽酮测糖试剂形成空白组。5分钟后空白组为轻微绿色，然而 5分钟后该提取物变成鲜绿色。该试验证明提取物中存在碳水化合物
实施例10：提取物中组分的分离
使用硅胶-G板对所述提取物(5微升)进行薄层色层分析。使用的溶 剂为2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅胶-G板在容器中用碘蒸汽染色。 发现4个斑点。该试验表明粗提物中至少含有4种不同的化合物。
斑点及其各自的Rf值如表1所示。
实施例11：荧光光谱分析
所述提取物进行荧光光谱分析。在351nm、580nm和720nm发现最大激 发波长。
所述染液然后进行荧光发射分光光度分析。当在351nm激发时，发射 处于400-600。在450nm和550nm波长发射有两个峰值。(图2和3)
实施例12：HPLC分析模式以检查蛋白质和碳水化合物的存在
染料溶液的HPLC用逆HPLC的平均方式完成，使用的溶剂为在C18逆相 柱中的80％乙腈，和20％水。UV检测器在波长280nm和205nm检测出蛋白的存 在。图17和表2显示出通过在280nm的UV检测器蛋白质存在的结果。可以看 出：7种蛋白质的停留时间在2.1-8.8分钟之间变化。覆盖的面积为535- 116103之间。峰值1的最大百分数面积具有2.1分钟的保留时间。由此可见 样品中蛋白质在峰值1的量最多。图18和表3通过UV检测器在205nm显示出10 种缩氨酸的存在。停留时间在2.1-14.8分钟之间变化。覆盖的面积为 63482-3218965。并且缩氨酸在峰值3的最大百分数面积具有3.9分钟的停 留时间。折光检测器检测到碳水化合物的存在。使用的标准为葡萄糖、蔗 糖和果糖。结果如图19-22和表4所示。280nm和205nm的第七峰值以及碳水 化合物的第五峰值分别具有8.8和8.939分钟的停留时间。
实施例13：荧光基团和蛋白质结合的测试
如实施例8所示，蛋白质提取物在加热时凝聚。此刻如果加入乙醚溶 剂，颜色部分分解。当进行如实施例6所述的步骤时，染色溶液的纸电泳 中色斑没有向任何电极移动，这表明色素不带电荷。其仅仅在非极性溶剂 中分解。因此可以说染料的染色部分是非极性的。
然而，在实施例6中使用染料的酒精提出物时，色斑向正极移动，这 表明其带有负电荷。看来好像该非极性色素可以与某些带负电的组分结 合。如实施例12中HPLC数据所示，其中仅仅检测到蛋白质和碳水化合物， 这表明染色fluoropore与带负电的某些蛋白质结合。可以说，染液的荧光 作用是由于含有附着于带负电的蛋白质的非极性荧光团的组分，当染料加 热和蛋白质凝聚时其分离。
实施例14：在原核和真核生物系统进行凝集生物活性生物测定染料在革兰 氏阴性细菌(大肠杆菌)的凝集生物活性测试：
两个分离试验进行如下：
1)50微升所述提取物加入到100ml的Muller Hilton′s培养基流体 (culture broth)中。产生没有海产动物提取物的空白组。0.1ml的新鲜 大肠杆菌inauculum加入到该培养基流体中。培养基流体在自转为150rpm 的定轨振荡器中孵化。8小时后在两个培养基流体中都发现混浊。然而含 有提取物(染液)的培养基流体显示出丛生生长。细胞形成凝集。没有海 洋提取物的正向空白组显示出正常生长。
2)一圈活大肠杆菌置于显微镜载玻片上的50微升水中并混合。再向 其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台阶上15-30秒使酒精挥 发。然后一个盖片放于细菌制剂上并密封。同样制备没有任何染料的对照 细菌制剂。两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10倍目镜)的油 浸物镜下筛选，以检查凝集生物活性，并且在WU、WB、WG和BF下检查荧光。 已经发现用染料处理的载物片上的细菌形成丛生(图4，6和4a，5a)，然 而对照组中没有出现这种现象。
这证明该染料具有引起凝集的生物活性。还注意到细菌以特定的丛 生形状凝集。丛生中的细菌自始至终都是活的。它们仅仅在载物片变干时 死亡，死细菌不染色。
在染液的存在下细胞形成凝聚的趋向表明其中含有外原凝集素类 糖蛋白。HPLC证实在染料溶液中存在蛋白质和碳水化合物。
实施例15：真核精液的凝聚生物活性测试
1毫升牡蛎精液溶液置于用于浮游植物计数的sedgewick计数器的空腔 中。加入5微升(5μl)酒精提取物。载物片在40倍物镜和10倍目镜的显 微镜下筛选。可以看出精液形成集合体、粘附并形成丛生。没有聚集的特 定形式。这种特性在对照实验中没有出现。
实施例16：牡蛎卵授精和受精率的增加
牡蛎的优质精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物计数的 sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后载物片 立即在显微镜下筛选并观察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。进行没 有提取物的对照组。图6和图6a显示出几分钟内和以绿色激发滤光器(WG) 观察到的极体挤出。
可以看出30秒后，处理的细胞有80％的卵受精，然而在对照组中仅仅 有40％的细胞受精。我们注意到大量的精液黏着到卵膜。在我们的早期试 验中我们注意到，这些卵受精作用通常的实际时间约为10-15分钟。第一 个极体的形成发生在增加染料的1分钟之内(图6和图6a)。
当前的染液看来具有一些因素，其促进精液授精速率，并最终在更短 的时间间隔内增加受精率。
实施例17：染料在真核细胞的无毒测试
通过牡蛎精液对提取液进行细胞毒性测试。精液的存活率一般为一个 参数以显示毒性。牡蛎除去雄性生殖腺，并且精液释放在100％的海水中。 通过muscline布过滤以除去所有有机物残渣。取1毫升(ml)精液溶液并加 入不同浓度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小时通过显微镜 观测精液的存活率。试验24小时进行。不加入染料进行对照组。发现加入 染料对精液的存活率没有任何影响。这表明该染料无毒特性。
实施例18：染料在原核生物的无毒测试
通过观察其存活率或者死亡量测试了提取物对革兰氏阴性大肠杆菌的 细胞毒性。一滴水中的活大肠杆菌(25μl)置于载玻片上。向其加入2μl 酒精提出物。暂时封闭该载物片以防止蒸发。在显微镜下昼夜观察剩余的 活细菌，直到其保持在溶液中。如果溶液蒸干，它们死亡。进行对照试验。 证明染料对原核生物也是无毒的。
实施例19：染料的外部荧光显微镜法
外部荧光显微镜研究通过使用该染料的1∶100稀释液作为着色剂，并 记录用不同的立方晶格激发时产生的光线发射，与已知荧光染料的色调进 行比较(图7和图7a-图10和10a)。用Olympus反射光的WU、WB、WG和BF立 方晶格发出的紫外线和可见光谱的激发进行扫描。立方晶格的细节如下：
WU立方晶格的波长范围为330nm-385nm。
WB立方晶格的波长范围为450nm-480nm。
WG立方晶格的波长范围为510nm-550nm。
亮视野的BF，其中普通的钨灯发光。
实施例20
找出染料在不同激发范围的发射范围。外部荧光显微镜法照片中卵的 背景显示染料的发光颜色。看到：WU 330nm-385nm范围的激发发射在 450nm-470nm，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光片产生的激发发射 510nm-570nm范围的荧光，用光谱范围为510nm-550nm的WB滤光片产生的激 发发射610nm-650nm范围的荧光，使用BF看到淡黄灰色的色调。
实施例21：牡蛎细胞的荧光发射
染料用作牡蛎死、活和固定卵的荧光性微小着色剂。载物片在外部荧 光显微镜下筛选。我们注意到死细胞没有接受染料并且没有显示荧光(图 11、11a和12、12a)。活细胞和固定细胞都显示荧光。激发光谱范围和放 射荧光严格地遵循斯托克定律。这些范围与表示荧光细胞背景的染料发射 范围不同。用光谱范围为330nm-385nm的WU滤光片产生的激发发射470nm- 500nm范围的荧光，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光片产生的激发发射 570nm-610nm范围的荧光，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光片产生的激 发发射610nm-650nm范围的荧光。以可见光的整个白光范围并根据细胞组 分的密度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选死、活和固定卵， 产生淡黄灰色类相差效果的色彩。
实施例22：大肠杆菌细胞的荧光发射
染料用作大肠杆菌的显微着色剂。一圈活大肠杆菌载玻片上的25微升 水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台阶 上10-15秒使提取物中的酒精挥发。然后一个盖片放于在水中的细菌悬浮 液上并密封。同样制备没有任何染料的对照细菌制剂。两个载物片在外部 荧光显微镜(100倍物镜，10倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查荧光。 我们注意到死细胞没有吸收染料并且没有显示荧光(图13、13a)。活细 菌细胞和固定细菌细胞显示荧光。激发光谱范围和发射荧光波长严格遵循 斯托克定律。这与如下给出的染液不同：
以WU 330nm-385nm范围激发，在470nm-500nm范围发出荧光。以波长 范围为450nm-480nm的WB滤光器激发，在570nm-610nm范围发出荧光。以波 长范围为510nm-550nm的WG滤光器激发，在610nm-650nm范围发出荧光。没 有任何染料的对照大肠杆菌也没有显示荧光。
实施例23：用染料作为外部荧光显微镜法的着色剂而对载物片进行显微照 相
用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶片，在WU330nm-385nm 范围、WB450nm-480nm范围、WG510nm-550nm范围和亮视野，在具有细胞的 载物片区域和仅仅表现染料发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照 相。
实施例24：染料在细胞膜的渗透性
牡蛎的未受精、受精卵和幼体用染料染色，卵悬浮比为1∶50微升，并 且在荧光显微镜下筛选(图4，4a-16，16a)。已经发现质膜、核膜和染 色质中的荧光是显著的。虽然发射的波长范围相同并且颜色为相同色调的 彩色，在细胞的这些部分之间存在显著的界限(图7，7a-10，10a)。这 证明染料能够透过卵质膜、细胞质、核膜、核质和染色质的活细胞和固定 细胞膜。死细胞中细胞部分不存在荧光表明染料没有穿透死细胞和固定细 胞膜的膜。同样，仅仅在活大肠杆菌细胞而非在死细胞中看到荧光发射的 存在。
实施例25
染料的生物活性提取物装在microfuge管并保持在-20摄氏度，并且在 冻结状态于紫外线下观察。在另一试验中，蘸有染液的Whatman滤纸保持 在-20摄氏度并在紫外线透视镜下观察。荧光没有变质。
与市售染料相比的优点
1.由于其是来源于天然并且非合成的，该染料无毒。
2.该染料对河口、海洋动物和革兰氏阴性大肠杆菌无毒。
3.该染料是细胞膜渗透性的，并且其黏附到核膜和染色质。
4.该染料对细胞质和核质是渗透性的。
5.该染料是得自非生物荧光海洋动物的荧光蛋白染料。
6.染料在其单一模式相当于6种合成荧光染料，其覆盖了紫外线和可见光 谱发射荧光色的绝大部分。
7.该染料可以用于快速显微着色剂，在没有增加显微镜的相差附件额外 开支的情况下产生相差效果，也没有任何固定和保存样品的过长规程，尤 其是用于活样品的当场质量检查。
8.在较长时间内染色细胞的荧光品质是不可降低的，当出口染色载物片 时其不需要冷冻。染液可以在4摄氏度销售。当前市场上的荧光染料在相 当于-20摄氏度的冷冻出口。
9.染料具有6.8-7.5的pH，其接近于中性，所以组合物中产品的pH不会激 烈变化。
10.与早期得自海生海蜇的已知绿色荧光蛋白(GFP)不同，我们的染料 没有报告基因。荧光基团直接附着于蛋白质并且没有任何氨基酸的环化步 骤而发出荧光。
11.所述荧光结果是直的。
12.GFP在395nm吸收蓝光并且在470nm具有较小的峰值，发出绿光。我们 的染料在3种不同荧光波长发射6种荧光色。
13.染料溶于70％的乙醇。
14.染料带有负电荷。
15.部分纯化的染液至少含有4种化合物。
16.染料含有碳水化合物和蛋白质。
17.荧光基团是非极性的但是染料基本上带负电。这表明荧光基团附着于 蛋白质。
18.染料包含至少一种糖蛋白并具有外原凝集素类活性。
19.其显示细菌的凝集，可以用于除去有害细菌。
20.凝集的细菌细胞仍然具有荧光性。这种特性可以在食品工业用于细菌 计数。
21.染料在真核精液和卵细胞引起凝集，这在非常短的时间提高了授精和 受精率并增加增殖能力。该染料可以用于水产养殖业并在人类性别细胞中 尝试。
22.染料实际上是蛋白质，但一旦其附着于细胞膜，在自然条件不可降解。 这对于研究活细胞功能、细胞器构造、细胞分选和流式细胞计具有巨大的 价值。
23.染液对于活细胞和牡蛎精液和卵无毒。
24.染料的无毒特性可以作为进行活细胞分析试剂盒的染料组分。
25.染料的无毒特性可以作为海洋学中进行原位操作研究的试剂盒的染料 组分。
26.染料在死细菌没有染色并且不显示荧光。这可以在组织培养中用于检 查活细胞和死细胞。
27.对活细胞是无毒的染料可以用于追踪细胞系。
28.染料在活细胞和固定细胞是细胞膜渗透的。其为天然染料，因此由于 其将更加环境友好而比合成染料更具有优点。
29.染料在选定的激发覆盖更宽范围的发射波长。这使其成为当前用于加 入第三发色色域的市售双重发射染料试剂盒的非常可接受的组分。
30.一旦染料对载物片上的细胞染色，其没有显示光致退色。这使其可以 用于组织化学研究。
31.染料即使是在1∶200000-1∶400000的稀释液中也能发射荧光色。
32.染料在不同激发波长的多色发色可以与市场上的早期荧光显微着色剂 相比。
33.本发明染料的蓝色荧光可以与通过DAPI荧光染料在相同波长激发的相 同颜色的发射相比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和测试试剂盒的组分。
34.本发明染料的蓝色荧光可以与通过Hoechest 33258的颜色的发射相 比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记 和检测试剂盒的组分。
35.本发明染料的蓝色荧光可以与通过Hoechest 33342荧光染料在相同波 长激发的颜色的发射相比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
36.所述染料在可见区的黄色荧光可以与吖啶橙的相同颜色发射相比，用 于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测 试剂盒的组分。
37.所述染料在可见区的黄色荧光可以与金胺的相同颜色发射相比，用于 生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试 剂盒的组分。
38.所述染料在可见区的黄色荧光可以与FITC的相同颜色发射相比，用于 生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试 剂盒的组分。
39.橙色荧光发射可以与碘化甲锭荧光染料的橙色荧光色相比，用于生物 化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒 的组分。
40.所述染料的橙色荧光发射可以与甲锭荧光染料的橙色荧光色相比，用 于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测 试剂盒的组分。
41.橙色荧光发射可以与TRITC荧光染料的橙色荧光色相比，用于生物化 学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的 组分。
42.与用于相同目的的合成直接染料不同，本发明的染料在室温下稳定并 具有较长的储藏寿命。所述染料的分子非放射性试剂盒可以在室温下出 口。
43.所述单一染料具有当前市场上至少123种不同荧光染料(DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶、金胺、若丹明、TRITC、和碘化甲 锭)的特征。
44.在显微镜的普通光下灰色色彩产生相差效果，其可以用于 cytogentical、cytological和组织化学载物片的快速筛选，并且可以节 省显微镜相差附件的额外投资。荧光色发射遵循荧光的斯托克定律。
45.柯达胶片显微照片显示邻近色发射波长的色彩。因此，当通过外部荧 光显微镜看到蓝色荧光时，在显微照相中也出现绿色色彩。
46.柯达胶片显微照片显示邻近色发射波长的色彩。因此，当通过外部荧 光显微镜看到黄色荧光时，在显微照相中也出现绿色色彩。当通过外部荧 光显微镜看到橙色荧光时，在显微照相中也出现红色色彩。
47.当背景中没有样品而仅仅存在染料时，在所有的荧光下观察，细胞遗 传学载物片产生细胞的染色效果。
48.染料可以用于各种涂料、油墨、纺织的荧光色。
49.染料可以用于漂白和增亮聚合体的荧光染料组分。
50.染料可以用于全谱荧光染料的泄漏检查。
51.其也可以用于自动化学测量系统。其也可以用于标记坠毁飞机、救生 艇和军事装备如火箭的位置。并且其可以用于海底探测器。
52.染料的无毒和细胞渗透特性可以用于生物化学、细胞生物学、免疫化 学和分子生物学的非放射性标记和探测试剂盒的组分，用于DNA、RNA、蛋 白质和酶的标记、免疫荧光法探测、DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片断的染色、流动血细胞计数中用于单一和多细胞荧光定量、外部荧 光显微镜法的荧光着色剂。
53.染料还可以用于在健康食品工业、化妆品工业、药物和化学工业中快 速检查生物污染，用于快速判断实验室条件下的生物污染物，用于快速测 定田间条件下的生物污染物。
54.染料可以用于需要无毒环境友好特性的组合物。
55.染料可以用于天然着色剂。以1∶20000-1∶40000比例的海生染料的生 物活性组合物，在3个不同波长得到6种颜色的荧光，和在透射光下的相差 效果。
表1斑点及其各自的Rf值
溶解前 混合后迁移距离 Rf值
12.1cm 11.1cm 0.917
9.9cm 0.818
8.0cm 0.661
5.6cm 0.463
表2蛋白质的停留时间：280nm
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 2.1 116103 40.39
2 2.5 38205 13.29
3 3.7 7332 2.55
4 6.1 31924 11.11
5 6.8 535 0.19
6 7.6 3684 1.28
7 8.8 89653 31.19
表3蛋白质的停留时间：205nm
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 2.1 981758 10.44
2 2.8 800877 8.52
3 3.9 3218965 34.23
4 4.4 117882 1.25
5 5.1 2404982 25.57
6 6.1 106728 1.13
7 8.8 1477895 15.71
8 10.4 63482 0.67
9 13.7 119113 1.27
10 14.8 113586 1.21
表4折光检测器以检测碳水化合物的存在
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 5.494 5718 19.79
2 5.973 1707 5.91
3 6.441 1637 5.66
4 6.995 3192 11.05
表5
当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器立方 晶格激发，以及当附着于原核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧光的 发射。 在 Olympus 光学有限 公司目录 中给出的 荧光立方 晶格的名 称 荧光立方 晶格的激 发范围 染液的发 射范围 当染料 附着于 细胞膜 时染料 的发射 范围 染料发射 颜色 当染料附着于 细胞膜时染料 的发射颜色 M MU 330- 385nm 450- 470nm 470- 500nm 蓝 蓝 M MB 450- 480nm 510- 570nm 570- 610nm 绿 绿 M MG 510- 550nm 610- 650nm 610- 650nm 橙红 橙红 亮视野 透射光 白光 白光 淡黄灰色 淡黄暗灰色调
表6
当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器立方 晶格激发，以及当附着于真核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧光的 发射。 在 Olympus 光学有限 公司目录 中给出的 荧光立方 晶格的名 称 荧光立方 晶格的激 发范围 染液的发 射范围 当染料 附着于 细胞膜 时染料 的发射 范围 染料发 射颜色 当染料附着 于细胞膜时 染料的发射 颜色 M MU 330- 385nm 450- 470nm 470- 500nm 蓝 蓝 M MB 450- 480nm 510- 570nm 570- 610nm 绿 黄 M MG 510- 550nm 610- 650nm 610- 650nm 橙红 橙红 亮视野 透射光 白光 白光 淡黄灰 色 淡黄暗灰色 调
表7
表中显示通过本发明从海参明玉参中提取的三种天然荧光染料的各种 商业上的重要特性(特性按照如第1栏所示的标题排列)。 标题 2001年3月30日提交的美国 专利申请号为09/820,654的 荧光染料(CSIR NF 140/2001) 本美国专利申请的荧光染料 (CSIR NF 152/2002) 动物名称 /种类 海参明玉参(参见实施例 1) 海参明玉参(参见实施例 1) 生物活性 提取物 色素，其为用50％醇从动物 的表皮中提取的荧光染料 (参见实施例2-5) 色素，其为用70％醇从动物 的活雌性性腺(卵巢组织) 提取并通过过滤纯化的荧光 染料(参见实施例2) 化学特性 无蛋白质(参见实施例7) 蛋白质(参见实施例6，8， 13) 药物特性 在杀虫、昆虫、兽医学和化 妆品的药物组合物中用于遮 光剂(参见实施例19-23) 对动物细胞和细菌无毒。在 生物测定期间以不同的浓度 处理各组，牡蛎精液和细菌 仍然是活的。染料可以在原 位应用中用于给药研究。(参 见实施例17，18) 细胞膜穿 透性 染色和发荧光活、死、冷冻 和固定组织。染料是细胞膜 渗透的。其对细胞膜是穿透 性的。其也可以着色染色质 (参见实施例21) 染色和发荧光活和固定组 织。不能染色死动物和细菌 细胞。染料是细胞膜渗透 的。其对细胞膜是穿透性 的。其也可以着色染色质(参 见实施例24) 凝集诱导 没有导致凝集 在牡蛎精液、卵和细菌细胞 中导致凝集但没有将其杀死 (参见实施例14，15) 牡蛎配子 受精率的 影响 对细胞系没有影响 提高受精率(参见实施例 16) 生物表面 活性特性 存在生物表面活性特性(参 见实施例9) 不存在生物表面活性特性 活/死细 菌污染测 试 所有细胞和纤维素染色和发 荧光(参见实施例12-17) 仅仅活细胞和固定细胞染色 和发荧光。死细菌不染色并 不发出荧光(参见实施例 22) 组织培养 中活/死 动物细胞 选择 所有细胞和纤维素染色和发 荧光(参见实施例12-17) 由于其并非合成染料而是天 然染料，染料是非放射性 的。 由于其并非合成染料而是天 然染料，染料是非放射性 的。 光致退色 /光稳定 性 i.在筛选载物片上没有光 致退色 ii.室温下1年内光稳定 iii.即使是在-25℃(荧 光有机体提取物中分子不 能获得活化所需的能量的 温度)冷冻染料的荧光性 也没有改变。 i.在筛选载物片上没有光 致退色 ii.在4℃光稳定，但是 染色细胞后，室温下其甚 至在几个月后仍然保持不 可降低 iii.染色的载物片没有退 色并保持荧光性 iv.即使是在-20℃(荧 光有机体提取物中分子不 能获得活化所需的能量的 温度)冷冻染料的荧光性 也没有改变。 荧光量 甚至稀释到1∶40000也非常 亮(参见实施例14) 甚至稀释到1∶400000和以 上也非常亮(参见实施例 18、19、22) 抗菌/杀 虫/杀虫 生物活性 存在抗菌/杀虫/杀虫生物活 性(参见实施例10) 存在抗菌/杀虫/杀虫生物活 性(参见实施例17、18) 当以日本 olympus 有限公司 的不同激 发范围的 BX-60显 微镜的立 方晶格激 发时，染 料的发射 范围 i.染料发出3种不同颜色的 发射 ii.当在WU 330nm-385nm 激发范围的紫外线立方晶 格激发时，产生380nm- 400nm范围的UVA蓝色荧光 发射 iii.当在450nm-480nm激 发范围的WB立方晶格激发 时，产生500nm-570nm范围 的黄色荧光发射 iv.当在510nm-550nm激 发范围的WG立方晶格激发 时，产生570nm-610nm范围 的橙色荧光发射 v.亮视野下产生相差效果 (参见实施例14-17) i.在外部荧光显微镜荧光 立方晶格紫外线和可见光 的3种不同波长下，染料发 出6种不同颜色的荧光 ii.当黏附到细胞膜上时 在外部荧光显微镜荧光立 方晶格紫外线和可见光的3 种不同波长下，染料发出6 种不同颜色的荧光。这三 个发射范围与染料本身的 范围不同。 iii.当溶液中的染料以 WU330nm-385nm激发范围 的紫外线立方晶格激发 时，产生450nm-470nm范围 的蓝色荧光发射 iv.当溶液中的染料以 450nm-480nm激发范围的 WB立方晶格激发时，产生 510nm-570nm范围的绿色荧 光发射 v.当溶液中的染料以510 nm-550nm激发范围的WG立 方晶格激发时，产生 610nm-650nm范围的橙色荧 光发射 vi.在外部荧光显微镜的 通常透射灯泡下以100倍物 镜观察，染料发出淡黄灰 色色彩 vii.当染料黏附到细胞膜 时以WU330nm-385nm激发 范围的紫外线立方晶格激 发时，产生470nm-500nm范 围的蓝色荧光发射 viii.当染料黏附到细胞膜 时以450nm-480nm激发范 围的WB立方晶格激发时， 产生570nm-610nm范围的绿 色荧光发射 ix.当染料黏附到细胞膜 时以510nm-550nm激发范 围的WG立方晶格激发时， 产生610nm-650nm范围的橙 色荧光发射 x.在外部荧光显微镜的通 常透射灯泡下以100倍物镜 观察，黏附到细胞膜上的 染料发出淡黄灰色色彩 染料的其 它物理化 学特性 i.在还原剂下脱色 ii.非合成化合物 iii.染料的粗提物为淡黄 绿色 iv.当在日光下以肉眼观 察时，纯化后的染料为红 棕色粉末 v.在管灯下发出绿色色彩 vi.本质上为无定形的 vii.溶于水 viii.不溶于乙醇、甲醇和 丙酮的有机溶剂 ix.带有负电荷 x.pH为6.5 xi.存在酚基 i.为不可还原的染料 ii.非合成化合物 iii.染料的粗提物为淡黄 橙色 iv.当在日光下以肉眼观 察时，部分纯化的染料为 亮黄橙色 v.在管灯下发出多色色彩 vi.不能形成粉末 vii.处于溶液形式 viii.溶于70％的乙醇，可 以用水/海水稀释 ix.带有负电荷 x.pH为6.8-7.5 xi.不存在醌型环 xii.不存在醌型环 xiii.不存在芳族胺基团 xiv.不存在还原糖 xv.色素和染料是在分光 光度计不同波长的紫外线 和可见光激发下发出荧光 的荧光染料。 xvi.测定300nm-700nm波 长范围的紫外线和可见光 谱，并且在379nm和439nm 处标记有峰。 xvii.测定250nm-350nm波 长范围的紫外线和可见光 谱，并且在272nm和299nm 处标记有峰。 xviii.在可见和紫外光 谱的不同波长范围进行荧 光分光光度测定，当以 UV270nm波长激发时，在 324nm-380nm范围发射的荧 光在阳光紫外线的UVA波长 范围。 xix.在荧光分光光度法 中，用激发波长450nm，发 生在550nm-580nm的荧光有 最大强度 xx.在荧光分光光度法 中，用激发波长540nm，发 生在500nm-620nm的荧光有 最大强度 xxi.在荧光分光光度法 中，用激发波长555nm，发 生在575nm-620nm的荧光有 最大强度 xii.实质上为蛋白质的 xiii.TLC的溶剂前沿是 12.1，，存在4个斑点 xiv.化合物1斑点具有 11.1的迁移距离，其Rf值 为0.917。 xv.化合物2斑点具有9.9 的迁移距离，其Rf值为 0.818。 xvi.化合物3斑点具有8.0 的迁移距离，其Rf值为 0.661。 xvii.化合物4斑点具有5.6 的迁移距离，其Rf值为 0.463。 xviii.其具有碳水化合 物 xix.其具有蛋白质 xx.其中至少一种蛋白质 为醣蛋白 xxi.激发波长的紫外线、 可见光谱的具有峰值 351nm、580nm、720nm。 xxii.当在351nm激发时， 荧光发射光谱分析为400- 600nm。 xxiii.发射在450nm和 550nm具有两个峰值。 (参见实施例1-25) xxii.蘸有稀释比例 1∶40000的染料的Whatman no.1滤纸，在260-280nm范 围的紫外灯泡的紫外透照 器和Gel Documentation系 下注意到了蓝绿色荧光色 彩(参见实施例1-23) 与市售染 料和所有 三种染料 相比的优 点 1.染料是天然而非合成 的，所以不需要对环境 有害的酸和碱的处理步 骤(实施例1，2) 2.该染料符合良好的染 料所应满足的在相同的 激发范围下可以区分细 胞的不同部分的标准(实 施例21) 3.由于该染料得自天然 产物并非合成的，其不 具有放射性(参见实施 例1，2) 4.染料具有抗微生物活 性(参见实施例10) 5.染料具有沙虫效果 (参见实施例19) 6.染料具有沙虫效果， 其能够杀死犬蚤和犬蜱 (参见实施例23) 7.染料可以用于制药工 业，用于制备兽药和杀 虫剂组合物 8.染料可以用于需要基 于脱馏分研究的医学应 用。甚至不将其暴露于X 射线底片，其也可以为 1.染料是天然而非合成 的，所以不需要对环境 有害的酸和碱的处理步 骤(实施例1，2) 2.该染料符合良好的染 料所应满足的在相同的 激发范围下可以区分细 胞的不同部分的标准(实 施例24) 3.由于该染料得自天然 产物并非合成的，其不 具有放射性(参见实施 例1，2) 4.染料可以用于制药工 业，用于制备检查细菌 污染的试剂盒(参见实 施例17-18) 5.由于该染料为细胞膜 渗透的并且对细胞无 毒，染料可以用于基于 荧光的药物或分子的原 位追踪的医学应用。 6.该染料在其单一形式 相当于6种发出相同荧光 色的不同合成荧光染 料。而早期的荧光染料 必须将这些染料混合才 视觉可见的。 9.该染料在其单一形式 相当于3种发出相同荧光 色的不同合成荧光染料 (参见实施例14-17) 10.染料可以用于快速显 微镜着色，以产生相差 效果而没有显微镜相差 部件的额外开支，并且 没有任何过分的样品固 定和保存(参见实施例 21) 11.很长时间内其荧光性 质不降低，出口时不需 要冷冻。而当前市售荧 光染料在在-20℃冷却 下出口(参见实施例18) 12.与早期得自海生海蜇 的已知绿色荧光蛋白 (GFP)不同，我们的染 料虽然也是蛋白，但非 受体基因。结果是直接 的。GFP在395nm吸收蓝 光并且在470nm的较小峰 值发出绿光。我们的染 料在三种激发波长下产 生三种荧光色(参见实 施例7) 13.染料可以溶于水，所 以可以用于需要水溶性 染料的组分。染料溶于 例如乙醇、甲醇和丙酮 的有机溶剂(参见实施 例2) 能显示这些效果(参见 实施例19-23) 7.染料可以用于快速显 微镜着色，以产生相差 效果而没有显微镜相差 部件的额外开支，并且 没有任何过分的样品固 定和保存(参见实施例 19-23) 8.很长时间内其荧光性 质不降低，出口时不需 要冷冻。而当前市售荧 光染料在在-20℃冷却 下出口(参见实施例4， 25) 9.与早期得自海生海蜇 的已知绿色荧光蛋白 (GFP)不同，我们的染 料虽然也是蛋白，但非 受体基因。结果是直接 的，并且在三种激发波 长下产生6色发射(参见 实施例6，8，13) 10.染料溶于70％乙醇 (参见实施例2) 11.该染料为负电荷蛋白 染料(参见实施例6，8， 13) 12.染料的pH值为6.8- 7.5，其几乎为中性，并 因而不会影响组合物中 最终产物的pH特性(参 见实施例6) 13.染料具有蛋白质特性 14.染料带负电荷(参见 实施例8) 15.染料的pH值为6.5， 其几乎为中性，并因而 不会影响组合物中最终 产物的pH特性(参见实 施例24) 16.染料实质上不是蛋白 质，所以在自然条件下 不可降解(参见实施例 18) 17.染料具有生物表面活 性，因而可以用于肥皂 和化妆品组合物(参见 实施例9) 18.染料具有抗微生物特 性(参见实施例10) 19.甚至在1∶40000倍的 稀释范围(亦即1g染料 粉末溶于40升超纯水 中)染料发出这些荧光 色。提取物的荧光可以 在室温下持续至少一 年。染料在不同波长激 发下的多色发射可以与 市场上的荧光显微着色 剂相比(参见实施例14) 20.该染料的蓝色荧光可 以与DAPI荧光染料在同 样激发波长发射的同样 颜色相比，后者作为生 物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记试剂盒 并且在4℃是稳定的，一 旦细胞用染料标记，细 胞的荧光性几个月内不 可降低(参见实施例4， 25) 14.染料甚至在1∶400000 或更高倍稀释下发出这 些荧光色。提取物的荧 光可以在室温下持续好 几个月。染料在不同波 长激发下的多色发射可 以与市场上的荧光显微 着色剂相比(参见实施 例19，19，22) 15.染料的蓝色荧光可以 与DAPI荧光染料在同样 激发波长发射的同样颜 色相比，后者作为生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记试剂盒的 组分(参见实施例19- 23) 16.染料的蓝色荧光可以 与Hoechest 33258发射 的颜色相比，后者作为 生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和检测 试剂盒的组分(参见实 施例19-23) 17.所述染料的蓝色荧光 可以与Hoechest 33342 荧光染料在同样激发波 的组分(参见实施例14- 17) 21.染料的蓝色荧光可以 与Hoechest 33258发射 的颜色相比，后者作为 生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和检测 试剂盒的组分(参见实 施例14-17) 22.所述染料的蓝色荧光 可以与Hoechest 33342 荧光染料在同样激发波 长发射的同样颜色相 比，后者作为生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和检测试剂盒的 组分(参见实施例14- 17) 23.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 24.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 长发射的同样颜色相 比，后者作为生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和检测试剂盒的 组分(参见实施例19- 23) 18.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与吖 啶橙的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分。(参见实 施例19-23) 19.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例19-23) 20.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与 FITC的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例19-23) 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 25.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与 FITC的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 26.橙色荧光发射可以与 碘化甲锭荧光染料的橙 色荧光色相比，后者可 以用于生物化学、细胞 生物学、免疫化学和分 子生物学的非放射性标 记和探测试剂盒的组分 (参见实施例14-17) 27.橙色荧光发射可以与 若丹明荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以 用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记 和探测试剂盒的组分(参 见实施例14-17) 28.橙色荧光发射可以与 TRITC荧光染料的橙色荧 光色相比，后者可以用 于生物化学、细胞生物 学、免疫化学和分子生 21.橙色荧光发射可以与 碘化甲锭荧光染料的橙 色荧光色相比，后者可 以用于生物化学、细胞 生物学、免疫化学和分 子生物学的非放射性标 记和探测试剂盒的组 分。(参见实施例19-23) 22.橙色荧光发射可以与 若丹明荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以 用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记 和探测试剂盒的组分(参 见实施例19-23) 23.橙色荧光发射可以与 TRITC荧光染料的橙色荧 光色相比，后者可以用 于生物化学、细胞生物 学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和 探测试剂盒的组分(参 见实施例19-23) 24.与用于相同目的的商 用染料不同，本染料在 室温是稳定的，并有长 的搁置寿命。本染料的 分子放射性试剂盒可以 在室温下出口(参见实 施例19-23) 25.所述单一染料具有至 少123种当前市场已有的 不同荧光染料的特性 物学的非放射性标记和 探测试剂盒的组分(参 见实施例14-17) 29.与用于相同目的的商 用染料不同，本染料在 室温是稳定的，并有长 的搁置寿命。本染料的 分子放射性试剂盒可以 在室温下出口(参见实 施例18) 30.所述单一染料具有至 少123种当前市场已有的 不同荧光染料的特性 (DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、 金胺、若丹明、TRITC和 碘化甲锭等)。 31.染料在显微镜的通常 光下，灰色的色彩产生 相差效果，这对快速筛 选细胞遗传学、细胞学 和组织化学载物片是有 用的，并可以节省额外 的补充显微镜相位差的 成分的费用。荧光颜色 的发射服从斯托克定 律。 32.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到蓝色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。 (DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、 金胺、若丹明、TRITC和 碘化甲锭等)(参见实 施例19-23) 26.染料在显微镜的通常 光下，灰色的色彩产生 相差效果，这对快速筛 选细胞遗传学、细胞学 和组织化学载物片是有 用的，并可以节省额外 的补充显微镜相位差的 成分的费用。荧光颜色 的发射服从斯托克定 律。(参见实施例19-23) 27.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到蓝色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩(参见实 施例19-23) 28.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到黄色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。当通过 外部荧光显微镜看到橙 色荧光时，在显微照相 中也出现红色色彩(参 见实施例19-23) 29.细胞遗传载物片在所 33.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到黄色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。当通过 外部荧光显微镜看到橙 色荧光时，在显微照相 中也出现红色色彩。 34.细胞遗传载物片在所 有荧光下观察产生具有 背景的细胞染色效果， 其中没有样本仅仅存在 染料。 35.染料可以用于制备显 示荧光色的聚乙烯氯 膜。也可以用于各种涂 料、油墨、织物的荧光 染色。 36.染料可以用于漂白和 增亮聚合体的荧光染料 组分。染料可以用于全 谱荧光染料的泄漏检 查。染料可以用于自动 化学测量系统。其也可 以用于标记坠毁飞机、 救生艇和军事装备如火 箭的位置。并且也可以 用于海底探测器。染料 可以用于皮肤癌的照相 化疗。 37.染料可以作为美容霜 和洗液中色素细胞的防 晒组分。 有荧光下观察产生具有 背景的细胞染色效果， 其中没有样本仅仅存在 染料(参见实施例19- 23) 30.染料可以用于制备显 示荧光色的聚乙烯氯 膜。也可以用于各种涂 料、油墨、织物的荧光 染色。 31.染料可以用于漂白和 增亮聚合体的荧光染料 组分。染料可以用于全 谱荧光染料的泄漏检 查。染料可以用于自动 化学测量系统。其也可 以用于标记坠毁飞机、 救生艇和军事装备如火 箭的位置。并且也可以 用于海底探测器。染料 可以用于皮肤癌的照相 化疗。 32.染料可以在原位杂交 应用试剂盒的荧光材 料，作为分子探针。其 也可以用于生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和探测试剂盒的 组分，用于DNA、RNA、 蛋白质和酶的标记、免 疫荧光法探测、DIG-标 记的低聚核苷酸探针和 抗DIG Fab-片断的染 38.染料的水溶性特性可 以使其易于在补湿器中 混合。染料可以在原位 杂交应用试剂盒的荧光 材料，作为分子探针。 其也可以用于生物化 学、细胞生物学、免疫 化学和分子生物学的非 放射性标记和探测试剂 盒的组分，用于DNA、 RNA、蛋白质和酶的标 记、免疫荧光法探测、 DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断 的染色、流动血细胞计 数中用于单一和多细胞 荧光定量、外部荧光显 微镜法的荧光着色剂。 39.染料可以用于健康食 品工业、化妆品工业、 药物和化学工业中快速 检查生物污染，用于快 速测定田间条件下的生 物污染物。其也可以用 于胆碱酯酶的竞争性抑 制物。 40.染料可以用于抗微生 物组合物 41.染料可以在化妆品组 合物中用作生物表面活 性剂 42.染料可以用于天然着 色剂。 色、流动血细胞计数中 用于单一和多细胞荧光 定量、外部荧光显微镜 法的荧光着色剂。 33.染料可以用于健康食 品工业、化妆品工业、 药物和化学工业中快速 检查生物污染，用于快 速测定田间条件下的生 物污染物(参见实施例 24) 34.染料可以用于天然着 色剂 35.染料可以在医学、生 物化学、农业和水产养 殖科学中用于提高受精 率(参见实施例14，15) 此处所述 a.制备显示荧光色的韧性 a.在各种涂料、油墨。织 3种天然 荧光染料 的特定用 途 聚乙烯氯薄膜 b.在各种涂料、油墨。织 物中用作荧光色素 c.用于漂白和增亮聚合体 的荧光染料组分 d.用于全谱荧光染料的泄 漏检查 e.用于自定化学测量系统 f.标记坠毁的飞机、救生 船和军事装备如火箭的位 置 g.水下探测器 h.UVA用于皮肤癌的照相化 疗 i.美容霜和洗液中色素细 胞的防晒组分 j.水溶性特性可以使其易 于在补湿器中混合 k.在原位杂交应用试剂盒 的荧光材料，作为分子探 针 l.用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和探 测试剂盒的组分，用于 DNA、RNA、蛋白质和酶的 标记 m.荧光免疫检测 n.DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的 复染色 o.单或多重流式细胞计应 用 p.用于外部荧光显微镜的 物中用作荧光色素 b.在各种涂料、油墨。织 物中用作荧光色素 c.用于全谱荧光染料的泄 漏检查 d.用于自定化学测量系统 e.标记坠毁的飞机、救生 船和军事装备如火箭的位 置 f.水下探测器 g.在原位杂交应用试剂盒 的荧光材料，作为分子探 针 h.用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和探 测试剂盒的组分，用于 DNA、RNA、蛋白质和酶的 标记 i.荧光免疫检测 j.DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的 复染色 k.单或多重流式细胞计应 用 l.用于外部荧光显微镜的 荧光染色(参见实施例 19-23) m.在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业 中快速检查生物污染(参 见实施例22)。 n.在实验室条件下生物污 染的快速判断(参见实施 荧光染色 q.在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业 中快速检查生物污染。 r.在实验室条件下生物污 染的快速判断 s.在田间条件下生物污染 的快速测定 t.胆碱酯酶的竞争性抑制 物 u.用于抗微生物组合物(参 见实施例10) v.作为化妆品组合物中的 生物表面活性剂 w.天然着色剂 x.海产染料在超纯水中以 1∶400000的比例得到的生 物活性组合物，以得到六 种不同波长的六色荧光和 投射光下的相差效果(参 见实施例14) y.用于各种在零下温度范 围进行的荧光应用的染料 例22) o.在田间条件下生物污染 的快速测定(参见实施例 22) p.凝集组合物(参见实施 例12，15) q.天然着色剂 r.海产染料在超纯水中以 1∶400000的比例得到的生 物活性组合物，以得到六 种不同波长的六色荧光和 投射光下的相差效果(参 见实施例18，19，22) s.用于各种在零下温度范 围进行的荧光应用的染料 t.在水产养殖中用于增加 受精率(参见实施例14， 15) u.用于细胞渗透膜染料组 合物 v.在组织培养中用于识别 死细胞和活细胞(参见实 施例24) w.在食品工业中用于识别 死细胞/细菌和活细胞/细 菌(参见实施例24) x.用于生物传感器中的染料 组合物 y.作为分子和微生物试剂盒 中的燃料组合物(参见实施 例24)
以下公开了提取、部分纯化、鉴定染料的方法，和用分光镜分析法和 外部荧光显微镜法检查染料的无毒性、细胞渗透性、凝集和多色荧光特性 而进行的试验的细节。
实施例1：采集原料
本专利中的材料是海参，并具有下列分类学细节
亚界：后生动物
门：棘皮动物门
亚门：游移棘皮动物
纲：海参纲
亚纲：盾手亚纲(Aspidochirotacea)
目：盾手目(Aspidochirota)
属：海参属
种：Scabra
材料采集自落潮时的印度中西海岸。将其带到实验室并在使用前放在 装有盐度为30-32/par(30‰)海水的玻璃缸中。
实施例2：
从雌性生殖腺中分离染料
动物首先用自来水洗，然后用超纯水洗。用快剪切开动物体，并且分 拣雄/雌动物。找出雌性生殖腺并从内脏中小心除去。根据卵巢细胞的成 熟或半成熟，卵巢的颜色在黄色到橙色之间变化。称重卵巢组织并放在玻 璃烧杯中。以1∶3的比例(重量体积比)加入70％的乙醇。淡黄橙色的颜 料出现。有色溶液转移到其它容器中。向剩余的组织再次加入70％的乙醇 并除去有色溶液。这些步骤重复三次以萃取色素，而没有使卵巢组织匀化。 染料的部分纯化
提取物通过用whattman No.1滤纸过滤而部分纯化。装有染料溶液的 具有螺旋盖的管形瓶标记为“原染料溶液”，并且在4℃的低温下储存直 到进一步应用。带有来自于卵巢组织的淡黄和橙色色素的提取物通过以下 方法鉴定。发现特征相同。
1mg卵巢提取物：3ml 70％的乙醇(3次)，亦即1mg提取物在9ml 70 ％的乙醇，为9000微升(μl)70％的乙醇中。
实施例3：染料颜色和溶解性的物理性质
所述染液用肉眼观察是淡黄橙色。在日光/管灯下其产生变化的颜色 发射。染料不溶于水而溶于醇。
实施例4：光稳定性
染料的醇提取物在4℃是稳定的。一旦细胞用该染料标记，荧光性可 以在室温下保持几个月。
实施例5
根据卵巢中成熟卵和未成熟卵的数量，染料具有6.8-7.5的pH值。成 熟的卵越多pH越接近7.5，成熟的卵越少pH越接近6.8。
实施例6：通过纸电泳法测试染料的电荷
所述染料提取物进行纸上电泳测试。Whattman No.1滤纸吸收pH为7的 磷酸盐缓冲液(0.1M)，然后放入电泳槽。两个电极浸入磷酸盐缓冲液。用 5微升(μl)卵巢提取物形成一个斑点并在40伏进行纸上电泳测试。观察到 黄色斑点向正极接线柱的迁移。这证明含有有色化合物(色素)的提取物 带有负电荷。提取物是在滤纸上得到颜色的染料。
实施例7：染料的化学特性
取1ml卵巢的乙醇提取物染液并加入0.2克二硫代丁四醇。溶液没有退 色。这表示在荧光染料的颜色基中不存在可还原基团。
实施例8：测试蛋白质存在
5ml提取物在100℃的水浴中加热。观察到凝聚。这表明在染料的酒精 提取物中蛋白质的存在。
实施例9：测试碳水化合物的存在
使用4ml硫酸和蒽酮测糖试剂将该提取物进行蒽酮测试(Ref)。1ml水、 4ml浓硫酸和蒽酮测糖试剂形成空白组。5分钟后空白组为轻微绿色，然而 5分钟后该提取物变成鲜绿色。该试验证明提取物中存在碳水化合物
实施例10：提取物中组分的分离
使用硅胶-G板对所述提取物(5微升)进行薄层色层分析。使用的溶 剂为2∶2∶1的正丁醇、乙酸和水。TLC后，硅胶-G板在容器中用碘蒸汽染色。 发现4个斑点。该试验表明粗提物中至少含有4种不同的化合物。
斑点及其各自的Rf值如表1所示。
实施例11：荧光光谱分析
所述提取物进行荧光光谱分析。在351nm、580nm和720nm发现最大激 发波长。
所述染液然后进行荧光发射分光光度分析。当在351nm激发时，发射 处于400-600。在450nm和550nm波长发射有两个峰值。(图2和3)
实施例12：HPLC分析模式以检查蛋白质和碳水化合物的存在
染料溶液的HPLC用逆HPLC的平均方式完成，使用的溶剂为在C18逆相 柱中的80％乙腈，和20％水。UV检测器在波长280nm和205nm检测出蛋白的存 在。图17和表2显示出通过在280nm的UV检测器蛋白质存在的结果。可以看 出：7种蛋白质的停留时间在2.1-8.8分钟之间变化。覆盖的面积为535- 116103之间。峰值1的最大百分数面积具有2.1分钟的保留时间。由此可见 样品中蛋白质在峰值1的量最多。图18和表3通过UV检测器在205nm显示出10 种缩氨酸的存在。停留时间在2.1-14.8分钟之间变化。覆盖的面积为 63482-3218965。并且缩氨酸在峰值3的最大百分数面积具有3.9分钟的停 留时间。折光检测器检测到碳水化合物的存在。使用的标准为葡萄糖、蔗 糖和果糖。结果如图19-22和表4所示。280nm和205nm的第七峰值以及碳水 化合物的第五峰值分别具有8.8和8.939分钟的停留时间。
实施例13：荧光基团和蛋白质结合的测试
如实施例8所示，蛋白质提取物在加热时凝聚。此刻如果加入乙醚溶 剂，颜色部分分解。当进行如实施例6所述的步骤时，染色溶液的纸电泳 中色斑没有向任何电极移动，这表明色素不带电荷。其仅仅在非极性溶剂 中分解。因此可以说染料的染色部分是非极性的。
然而，在实施例6中使用染料的酒精提出物时，色斑向正极移动，这 表明其带有负电荷。看来好像该非极性色素可以与某些带负电的组分结 合。如实施例12中HPLC数据所示，其中仅仅检测到蛋白质和碳水化合物， 这表明染色fluoropore与带负电的某些蛋白质结合。可以说，染液的荧光 作用是由于含有附着于带负电的蛋白质的非极性荧光团的组分，当染料加 热和蛋白质凝聚时其分离。
实施例14：在原核和真核生物系统进行凝集生物活性生物测定染料在革兰 氏阴性细菌(大肠杆菌)的凝集生物活性测试：
两个分离试验进行如下：
1)50微升所述提取物加入到100ml的Muller Hilton′s培养基流体 (culture broth)中。产生没有海产动物提取物的空白组。0.1ml的新鲜 大肠杆菌inauculum加入到该培养基流体中。培养基流体在自转为150rpm 的定轨振荡器中孵化。8小时后在两个培养基流体中都发现混浊。然而含 有提取物(染液)的培养基流体显示出丛生生长。细胞形成凝集。没有海 洋提取物的正向空白组显示出正常生长。
2)一圈活大肠杆菌置于显微镜载玻片上的50微升水中并混合。再向 其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台阶上15-30秒使酒精挥 发。然后一个盖片放于细菌制剂上并密封。同样制备没有任何染料的对照 细菌制剂。两个载物片在外部荧光显微镜(100倍物镜，10倍目镜)的油 浸物镜下筛选，以检查凝集生物活性，并且在WU、WB、WG和BF下检查荧光。 已经发现用染料处理的载物片上的细菌形成丛生(图4，6和4a，5a)，然 而对照组中没有出现这种现象。
这证明该染料具有引起凝集的生物活性。还注意到细菌以特定的丛 生形状凝集。丛生中的细菌自始至终都是活的。它们仅仅在载物片变干时 死亡，死细菌不染色。
在染液的存在下细胞形成凝聚的趋向表明其中含有外原凝集素类 糖蛋白。HPLC证实在染料溶液中存在蛋白质和碳水化合物。
实施例15：真核精液的凝聚生物活性测试
1毫升牡蛎精液溶液置于用于浮游植物计数的sedgewick计数器的空腔 中。加入5微升(5μl)酒精提取物。载物片在40倍物镜和10倍目镜的显 微镜下筛选。可以看出精液形成集合体、粘附并形成丛生。没有聚集的特 定形式。这种特性在对照实验中没有出现。
实施例16：牡蛎卵授精和受精率的增加
牡蛎的优质精液和卵以10∶1的固定比率加入到用于浮游植物计数的 sedgewick计数器的空腔中。加入5微升(5μl)酒精提取物。然后载物片 立即在显微镜下筛选并观察黏附到卵膜、受精和不受精卵的精液。进行没 有提取物的对照组。图6和图6a显示出几分钟内和以绿色激发滤光器(WG) 观察到的极体挤出。
可以看出30秒后，处理的细胞有80％的卵受精，然而在对照组中仅仅 有40％的细胞受精。我们注意到大量的精液黏着到卵膜。在我们的早期试 验中我们注意到，这些卵受精作用通常的实际时间约为10-15分钟。第一 个极体的形成发生在增加染料的1分钟之内(图6和图6a)。
当前的染液看来具有一些因素，其促进精液授精速率，并最终在更短 的时间间隔内增加受精率。
实施例17：染料在真核细胞的无毒测试
通过牡蛎精液对提取液进行细胞毒性测试。精液的存活率一般为一个 参数以显示毒性。牡蛎除去雄性生殖腺，并且精液释放在100％的海水中。 通过muscline布过滤以除去所有有机物残渣。取1毫升(ml)精液溶液并加 入不同浓度(1μl、2μl、3μl、4μl和5μl)的染液。每半小时通过显微镜 观测精液的存活率。试验24小时进行。不加入染料进行对照组。发现加入 染料对精液的存活率没有任何影响。这表明该染料无毒特性。
实施例18：染料在原核生物的无毒测试
通过观察其存活率或者死亡量测试了提取物对革兰氏阴性大肠杆菌的 细胞毒性。一滴水中的活大肠杆菌(25μl)置于载玻片上。向其加入2μl 酒精提出物。暂时封闭该载物片以防止蒸发。在显微镜下昼夜观察剩余的 活细菌，直到其保持在溶液中。如果溶液蒸干，它们死亡。进行对照试验。 证明染料对原核生物也是无毒的。
实施例19：染料的外部荧光显微镜法
外部荧光显微镜研究通过使用该染料的1∶100稀释液作为着色剂，并 记录用不同的立方晶格激发时产生的光线发射，与已知荧光染料的色调进 行比较(图7和图7a-图10和10a)。用Olympus反射光的WU、WB、WG和BF立 方晶格发出的紫外线和可见光谱的激发进行扫描。立方晶格的细节如下：
WU立方晶格的波长范围为330nm-385nm。
WB立方晶格的波长范围为450nm-480nm。
WG立方晶格的波长范围为510nm-550nm。
亮视野的BF，其中普通的钨灯发光。
实施例20
找出染料在不同激发范围的发射范围。外部荧光显微镜法照片中卵的 背景显示染料的发光颜色。看到：WU 330nm-385nm范围的激发发射在 450nm-470nm，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光片产生的激发发射 510nm-570nm范围的荧光，用光谱范围为510nm-550nm的WB滤光片产生的激 发发射610nm-650nm范围的荧光，使用BF看到淡黄灰色的色调。
实施例21：牡蛎细胞的荧光发射
染料用作牡蛎死、活和固定卵的荧光性微小着色剂。载物片在外部荧 光显微镜下筛选。我们注意到死细胞没有接受染料并且没有显示荧光(图 11、11a和12、12a)。活细胞和固定细胞都显示荧光。激发光谱范围和放 射荧光严格地遵循斯托克定律。这些范围与表示荧光细胞背景的染料发射 范围不同。用光谱范围为330nm-385nm的WU滤光片产生的激发发射470nm- 500nm范围的荧光，用光谱范围为450nm-480nm的WB滤光片产生的激发发射 570nm-610nm范围的荧光，用光谱范围为510nm-550nm的WG滤光片产生的激 发发射610nm-650nm范围的荧光。以可见光的整个白光范围并根据细胞组 分的密度，在亮视野发射光外部荧光显微镜法微小筛选死、活和固定卵， 产生淡黄灰色类相差效果的色彩。
实施例22：大肠杆菌细胞的荧光发射
染料用作大肠杆菌的显微着色剂。一圈活大肠杆菌载玻片上的25微升 水中并混合。再向其中加入2微升(2μl)染液。通过将载物片放置在台阶 上10-15秒使提取物中的酒精挥发。然后一个盖片放于在水中的细菌悬浮 液上并密封。同样制备没有任何染料的对照细菌制剂。两个载物片在外部 荧光显微镜(100倍物镜，10倍目镜)的油浸物镜下筛选，以检查荧光。 我们注意到死细胞没有吸收染料并且没有显示荧光(图13、13a)。活细 菌细胞和固定细菌细胞显示荧光。激发光谱范围和发射荧光波长严格遵循 斯托克定律。这与如下给出的染液不同：
以WU 330nm-385nm范围激发，在470nm-500nm范围发出荧光。以波长 范围为450nm-480nm的WB滤光器激发，在570nm-610nm范围发出荧光。以波 长范围为510nm-550nm的WG滤光器激发，在610nm-650nm范围发出荧光。没 有任何染料的对照大肠杆菌也没有显示荧光。
实施例23：用染料作为外部荧光显微镜法的着色剂而对载物片进行显微照 相
用曝光时间变化为50-60秒的400ASA速柯达胶片，在WU330nm-385nm 范围、WB450nm-480nm范围、WG510nm-550nm范围和亮视野，在具有细胞的 载物片区域和仅仅表现染料发色的围绕背景区域进行发射荧光的显微照 相。
实施例24：染料在细胞膜的渗透性
牡蛎的未受精、受精卵和幼体用染料染色，卵悬浮比为1∶50微升，并 且在荧光显微镜下筛选(图4，4a-16，16a)。已经发现质膜、核膜和染 色质中的荧光是显著的。虽然发射的波长范围相同并且颜色为相同色调的 彩色，在细胞的这些部分之间存在显著的界限(图7，7a-10，10a)。这 证明染料能够透过卵质膜、细胞质、核膜、核质和染色质的活细胞和固定 细胞膜。死细胞中细胞部分不存在荧光表明染料没有穿透死细胞和固定细 胞膜的膜。同样，仅仅在活大肠杆菌细胞而非在死细胞中看到荧光发射的 存在。
实施例25
染料的生物活性提取物装在microfuge管并保持在-20摄氏度，并且在 冻结状态于紫外线下观察。在另一试验中，蘸有染液的Whatman滤纸保持 在-20摄氏度并在紫外线透视镜下观察。荧光没有变质。
与市售染料相比的优点
1.由于其是来源于天然并且非合成的，该染料无毒。
2.该染料对河口、海洋动物和革兰氏阴性大肠杆菌无毒。
3.该染料是细胞膜渗透性的，并且其黏附到核膜和染色质。
4.该染料对细胞质和核质是渗透性的。
5.该染料是得自非生物荧光海洋动物的荧光蛋白染料。
6.染料在其单一模式相当于6种合成荧光染料，其覆盖了紫外线和可见光 谱发射荧光色的绝大部分。
7.该染料可以用于快速显微着色剂，在没有增加显微镜的相差附件额外 开支的情况下产生相差效果，也没有任何固定和保存样品的过长规程，尤 其是用于活样品的当场质量检查。
8.在较长时间内染色细胞的荧光品质是不可降低的，当出口染色载物片 时其不需要冷冻。染液可以在4摄氏度销售。当前市场上的荧光染料在相 当于-20摄氏度的冷冻出口。
9.染料具有6.8-7.5的pH，其接近于中性，所以组合物中产品的pH不会激 烈变化。
10.与早期得自海生海蜇的已知绿色荧光蛋白(GFP)不同，我们的染料 没有报告基因。荧光基团直接附着于蛋白质并且没有任何氨基酸的环化步 骤而发出荧光。
11.所述荧光结果是直的。
12.GFP在395nm吸收蓝光并且在470nm具有较小的峰值，发出绿光。我们 的染料在3种不同荧光波长发射6种荧光色。
13.染料溶于70％的乙醇。
14.染料带有负电荷。
15.部分纯化的染液至少含有4种化合物。
16.染料含有碳水化合物和蛋白质。
17.荧光基团是非极性的但是染料基本上带负电。这表明荧光基团附着于 蛋白质。
18.染料包含至少一种糖蛋白并具有外原凝集素类活性。
19.其显示细菌的凝集，可以用于除去有害细菌。
20.凝集的细菌细胞仍然具有荧光性。这种特性可以在食品工业用于细菌 计数。
21.染料在真核精液和卵细胞引起凝集，这在非常短的时间提高了授精和 受精率并增加增殖能力。该染料可以用于水产养殖业并在人类性别细胞中 尝试。
22.染料实际上是蛋白质，但一旦其附着于细胞膜，在自然条件不可降解。 这对于研究活细胞功能、细胞器构造、细胞分选和流式细胞计具有巨大的 价值。
23.染液对于活细胞和牡蛎精液和卵无毒。
24.染料的无毒特性可以作为进行活细胞分析试剂盒的染料组分。
25.染料的无毒特性可以作为海洋学中进行原位操作研究的试剂盒的染料 组分。
26.染料在死细菌没有染色并且不显示荧光。这可以在组织培养中用于检 查活细胞和死细胞。
27.对活细胞是无毒的染料可以用于追踪细胞系。
28.染料在活细胞和固定细胞是细胞膜渗透的。其为天然染料，因此由于 其将更加环境友好而比合成染料更具有优点。
29.染料在选定的激发覆盖更宽范围的发射波长。这使其成为当前用于加 入第三发色色域的市售双重发射染料试剂盒的非常可接受的组分。
30.一旦染料对载物片上的细胞染色，其没有显示光致退色。这使其可以 用于组织化学研究。
31.染料即使是在1∶200000-1∶400000的稀释液中也能发射荧光色。
32.染料在不同激发波长的多色发色可以与市场上的早期荧光显微着色剂 相比。
33.本发明染料的蓝色荧光可以与通过DAPI荧光染料在相同波长激发的相 同颜色的发射相比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和测试试剂盒的组分。
34.本发明染料的蓝色荧光可以与通过Hoechest 33258的颜色的发射相 比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记 和检测试剂盒的组分。
35.本发明染料的蓝色荧光可以与通过Hoechest 33342荧光染料在相同波 长激发的颜色的发射相比，用于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记和检测试剂盒的组分。
36.所述染料在可见区的黄色荧光可以与吖啶橙的相同颜色发射相比，用 于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测 试剂盒的组分。
37.所述染料在可见区的黄色荧光可以与金胺的相同颜色发射相比，用于 生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试 剂盒的组分。
38.所述染料在可见区的黄色荧光可以与FITC的相同颜色发射相比，用于 生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试 剂盒的组分。
39.橙色荧光发射可以与碘化甲锭荧光染料的橙色荧光色相比，用于生物 化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒 的组分。
40.所述染料的橙色荧光发射可以与甲锭荧光染料的橙色荧光色相比，用 于生物化学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测 试剂盒的组分。
41.橙色荧光发射可以与TRITC荧光染料的橙色荧光色相比，用于生物化 学、细胞生物学、免疫化学和分子生物学的非放射性标记和检测试剂盒的 组分。
42.与用于相同目的的合成直接染料不同，本发明的染料在室温下稳定并 具有较长的储藏寿命。所述染料的分子非放射性试剂盒可以在室温下出 口。
43.所述单一染料具有当前市场上至少123种不同荧光染料(DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶、金胺、若丹明、TRITC、和碘化甲 锭)的特征。
44.在显微镜的普通光下灰色色彩产生相差效果，其可以用于 cytogentical、cytological和组织化学载物片的快速筛选，并且可以节 省显微镜相差附件的额外投资。荧光色发射遵循荧光的斯托克定律。
45.柯达胶片显微照片显示邻近色发射波长的色彩。因此，当通过外部荧 光显微镜看到蓝色荧光时，在显微照相中也出现绿色色彩。
46.柯达胶片显微照片显示邻近色发射波长的色彩。因此，当通过外部荧 光显微镜看到黄色荧光时，在显微照相中也出现绿色色彩。当通过外部荧 光显微镜看到橙色荧光时，在显微照相中也出现红色色彩。
47.当背景中没有样品而仅仅存在染料时，在所有的荧光下观察，细胞遗 传学载物片产生细胞的染色效果。
48.染料可以用于各种涂料、油墨、纺织的荧光色。
49.染料可以用于漂白和增亮聚合体的荧光染料组分。
50.染料可以用于全谱荧光染料的泄漏检查。
51.其也可以用于自动化学测量系统。其也可以用于标记坠毁飞机、救生 艇和军事装备如火箭的位置。并且其可以用于海底探测器。
52.染料的无毒和细胞渗透特性可以用于生物化学、细胞生物学、免疫化 学和分子生物学的非放射性标记和探测试剂盒的组分，用于DNA、RNA、蛋 白质和酶的标记、免疫荧光法探测、DIG-标记的低聚核苷酸探针和抗DIG Fab-片断的染色、流动血细胞计数中用于单一和多细胞荧光定量、外部荧 光显微镜法的荧光着色剂。
53.染料还可以用于在健康食品工业、化妆品工业、药物和化学工业中快 速检查生物污染，用于快速判断实验室条件下的生物污染物，用于快速测 定田间条件下的生物污染物。
54.染料可以用于需要无毒环境友好特性的组合物。
55.染料可以用于天然着色剂。以1∶20000-1∶40000比例的海生染料的生 物活性组合物，在3个不同波长得到6种颜色的荧光，和在透射光下的相差 效果。
表1斑点及其各自的Rf值
溶解前 混合后迁移距离 Rf值
12.1cm 11.1cm 0.917
9.9cm 0.818
8.0cm 0.661
5.6cm 0.463
表2蛋白质的停留时间：280nm
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 2.1 116103 40.39
2 2.5 38205 13.29
3 3.7 7332 2.55
4 6.1 31924 11.11
5 6.8 535 0.19
6 7.6 3684 1.28
7 8.8 89653 31.19
表3蛋白质的停留时间：205nm
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 2.1 981758 10.44
2 2.8 800877 8.52
3 3.9 3218965 34.23
4 4.4 117882 1.25
5 5.1 2404982 25.57
6 6.1 106728 1.13
7 8.8 1477895 15.71
8 10.4 63482 0.67
9 13.7 119113 1.27
10 14.8 113586 1.21
表4折光检测器以检测碳水化合物的存在
峰 停留时间 面积 面积百分比
1 5.494 5718 19.79
2 5.973 1707 5.91
3 6.441 1637 5.66
4 6.995 3192 11.05
表5
当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器立方 晶格激发，以及当附着于原核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧光的 发射。 在 Olympus 光学有限 公司目录 中给出的 荧光立方 晶格的名 称 荧光立方 晶格的激 发范围 染液的发 射范围 当染料 附着于 细胞膜 时染料 的发射 范围 染料发射 颜色 当染料附着于 细胞膜时染料 的发射颜色 M MU 330- 385nm 450- 470nm 470- 500nm 蓝 蓝 M MB 450- 480nm 510- 570nm 570- 610nm 绿 绿 M MG 510- 550nm 610- 650nm 610- 650nm 橙红 橙红 亮视野 透射光 白光 白光 淡黄灰色 淡黄暗灰色调
表6
当以具有染液的Olympus外部荧光显微镜的不同波长荧光滤光器立方 晶格激发，以及当附着于真核细胞的细胞膜时，荧光染料不同颜色荧光的 发射。 在 Olympus 光学有限 公司目录 中给出的 荧光立方 晶格的名 称 荧光立方 晶格的激 发范围 染液的发 射范围 当染料 附着于 细胞膜 时染料 的发射 范围 染料发 射颜色 当染料附着 于细胞膜时 染料的发射 颜色 M MU 330- 385nm 450- 470nm 470- 500nm 蓝 蓝 M MB 450- 480nm 510- 570nm 570- 610nm 绿 黄 M MG 510- 550nm 610- 650nm 610- 650nm 橙红 橙红 亮视野 透射光 白光 白光 淡黄灰 色 淡黄暗灰色 调
表7
表中显示通过本发明从海参明玉参中提取的三种天然荧光染料的各种 商业上的重要特性(特性按照如第1栏所示的标题排列)。 标题 2001年3月30日提交的美国 专利申请号为09/820,654的 荧光染料(CSIR NF 140/2001) 本美国专利申请的荧光染料 (CSIR NF 152/2002) 动物名称 /种类 海参明玉参(参见实施例 1) 海参明玉参(参见实施例 1) 生物活性 提取物 色素，其为用50％醇从动物 的表皮中提取的荧光染料 (参见实施例2-5) 色素，其为用70％醇从动物 的活雌性性腺(卵巢组织) 提取并通过过滤纯化的荧光 染料(参见实施例2) 化学特性 无蛋白质(参见实施例7) 蛋白质(参见实施例6，8， 13) 药物特性 在杀虫、昆虫、兽医学和化 妆品的药物组合物中用于遮 光剂(参见实施例19-23) 对动物细胞和细菌无毒。在 生物测定期间以不同的浓度 处理各组，牡蛎精液和细菌 仍然是活的。染料可以在原 位应用中用于给药研究。(参 见实施例17，18) 细胞膜穿 透性 染色和发荧光活、死、冷冻 和固定组织。染料是细胞膜 渗透的。其对细胞膜是穿透 性的。其也可以着色染色质 (参见实施例21) 染色和发荧光活和固定组 织。不能染色死动物和细菌 细胞。染料是细胞膜渗透 的。其对细胞膜是穿透性 的。其也可以着色染色质(参 见实施例24) 凝集诱导 没有导致凝集 在牡蛎精液、卵和细菌细胞 中导致凝集但没有将其杀死 (参见实施例14，15) 牡蛎配子 受精率的 影响 对细胞系没有影响 提高受精率(参见实施例 16) 生物表面 活性特性 存在生物表面活性特性(参 见实施例9) 不存在生物表面活性特性 活/死细 菌污染测 试 所有细胞和纤维素染色和发 荧光(参见实施例12-17) 仅仅活细胞和固定细胞染色 和发荧光。死细菌不染色并 不发出荧光(参见实施例 22) 组织培养 中活/死 动物细胞 选择 所有细胞和纤维素染色和发 荧光(参见实施例12-17) 由于其并非合成染料而是天 然染料，染料是非放射性 的。 由于其并非合成染料而是天 然染料，染料是非放射性 的。 光致退色 /光稳定 性 i.在筛选载物片上没有光 致退色 ii.室温下1年内光稳定 iii.即使是在-25℃(荧 光有机体提取物中分子不 能获得活化所需的能量的 温度)冷冻染料的荧光性 也没有改变。 i.在筛选载物片上没有光 致退色 ii.在4℃光稳定，但是 染色细胞后，室温下其甚 至在几个月后仍然保持不 可降低 iii.染色的载物片没有退 色并保持荧光性 iv.即使是在-20℃(荧 光有机体提取物中分子不 能获得活化所需的能量的 温度)冷冻染料的荧光性 也没有改变。 荧光量 甚至稀释到1∶40000也非常 亮(参见实施例14) 甚至稀释到1∶400000和以 上也非常亮(参见实施例 18、19、22) 抗菌/杀 虫/杀虫 生物活性 存在抗菌/杀虫/杀虫生物活 性(参见实施例10) 存在抗菌/杀虫/杀虫生物活 性(参见实施例17、18) 当以日本 olympus 有限公司 的不同激 发范围的 BX-60显 微镜的立 方晶格激 发时，染 料的发射 范围 i.染料发出3种不同颜色的 发射 ii.当在WU 330nm-385nm 激发范围的紫外线立方晶 格激发时，产生380nm- 400nm范围的UVA蓝色荧光 发射 iii.当在450nm-480nm激 发范围的WB立方晶格激发 时，产生500nm-570nm范围 的黄色荧光发射 iv.当在510nm-550nm激 发范围的WG立方晶格激发 时，产生570nm-610nm范围 的橙色荧光发射 v.亮视野下产生相差效果 (参见实施例14-17) i.在外部荧光显微镜荧光 立方晶格紫外线和可见光 的3种不同波长下，染料发 出6种不同颜色的荧光 ii.当黏附到细胞膜上时 在外部荧光显微镜荧光立 方晶格紫外线和可见光的3 种不同波长下，染料发出6 种不同颜色的荧光。这三 个发射范围与染料本身的 范围不同。 iii.当溶液中的染料以 WU330nm-385nm激发范围 的紫外线立方晶格激发 时，产生450nm-470nm范围 的蓝色荧光发射 iv.当溶液中的染料以 450nm-480nm激发范围的 WB立方晶格激发时，产生 510nm-570nm范围的绿色荧 光发射 v.当溶液中的染料以510 nm-550nm激发范围的WG立 方晶格激发时，产生 610nm-650nm范围的橙色荧 光发射 vi.在外部荧光显微镜的 通常透射灯泡下以100倍物 镜观察，染料发出淡黄灰 色色彩 vii.当染料黏附到细胞膜 时以WU330nm-385nm激发 范围的紫外线立方晶格激 发时，产生470nm-500nm范 围的蓝色荧光发射 viii.当染料黏附到细胞膜 时以450nm-480nm激发范 围的WB立方晶格激发时， 产生570nm-610nm范围的绿 色荧光发射 ix.当染料黏附到细胞膜 时以510nm-550nm激发范 围的WG立方晶格激发时， 产生610nm-650nm范围的橙 色荧光发射 x.在外部荧光显微镜的通 常透射灯泡下以100倍物镜 观察，黏附到细胞膜上的 染料发出淡黄灰色色彩 染料的其 它物理化 学特性 i.在还原剂下脱色 ii.非合成化合物 iii.染料的粗提物为淡黄 绿色 iv.当在日光下以肉眼观 察时，纯化后的染料为红 棕色粉末 v.在管灯下发出绿色色彩 vi.本质上为无定形的 vii.溶于水 viii.不溶于乙醇、甲醇和 丙酮的有机溶剂 ix.带有负电荷 x.pH为6.5 xi.存在酚基 i.为不可还原的染料 ii.非合成化合物 iii.染料的粗提物为淡黄 橙色 iv.当在日光下以肉眼观 察时，部分纯化的染料为 亮黄橙色 v.在管灯下发出多色色彩 vi.不能形成粉末 vii.处于溶液形式 viii.溶于70％的乙醇，可 以用水/海水稀释 ix.带有负电荷 x.pH为6.8-7.5 xi.不存在醌型环 xii.不存在醌型环 xiii.不存在芳族胺基团 xiv.不存在还原糖 xv.色素和染料是在分光 光度计不同波长的紫外线 和可见光激发下发出荧光 的荧光染料。 xvi.测定300nm-700nm波 长范围的紫外线和可见光 谱，并且在379nm和439nm 处标记有峰。 xvii.测定250nm-350nm波 长范围的紫外线和可见光 谱，并且在272nm和299nm 处标记有峰。 xviii.在可见和紫外光 谱的不同波长范围进行荧 光分光光度测定，当以 UV270nm波长激发时，在 324nm-380nm范围发射的荧 光在阳光紫外线的UVA波长 范围。 xix.在荧光分光光度法 中，用激发波长450nm，发 生在550nm-580nm的荧光有 最大强度 xx.在荧光分光光度法 中，用激发波长540nm，发 生在500nm-620nm的荧光有 最大强度 xxi.在荧光分光光度法 中，用激发波长555nm，发 生在575nm-620nm的荧光有 最大强度 xii.实质上为蛋白质的 xiii.TLC的溶剂前沿是 12.1，，存在4个斑点 xiv.化合物1斑点具有 11.1的迁移距离，其Rf值 为0.917。 xv.化合物2斑点具有9.9 的迁移距离，其Rf值为 0.818。 xvi.化合物3斑点具有8.0 的迁移距离，其Rf值为 0.661。 xvii.化合物4斑点具有5.6 的迁移距离，其Rf值为 0.463。 xviii.其具有碳水化合 物 xix.其具有蛋白质 xx.其中至少一种蛋白质 为醣蛋白 xxi.激发波长的紫外线、 可见光谱的具有峰值 351nm、580nm、720nm。 xxii.当在351nm激发时， 荧光发射光谱分析为400- 600nm。 xxiii.发射在450nm和 550nm具有两个峰值。 (参见实施例1-25) xxii.蘸有稀释比例 1∶40000的染料的Whatman no.1滤纸，在260-280nm范 围的紫外灯泡的紫外透照 器和Gel Documentation系 下注意到了蓝绿色荧光色 彩(参见实施例1-23) 与市售染 料和所有 三种染料 相比的优 点 1.染料是天然而非合成 的，所以不需要对环境 有害的酸和碱的处理步 骤(实施例1，2) 2.该染料符合良好的染 料所应满足的在相同的 激发范围下可以区分细 胞的不同部分的标准(实 施例21) 3.由于该染料得自天然 产物并非合成的，其不 具有放射性(参见实施 例1，2) 4.染料具有抗微生物活 性(参见实施例10) 5.染料具有沙虫效果 (参见实施例19) 6.染料具有沙虫效果， 其能够杀死犬蚤和犬蜱 (参见实施例23) 7.染料可以用于制药工 业，用于制备兽药和杀 虫剂组合物 8.染料可以用于需要基 于脱馏分研究的医学应 用。甚至不将其暴露于X 射线底片，其也可以为 1.染料是天然而非合成 的，所以不需要对环境 有害的酸和碱的处理步 骤(实施例1，2) 2.该染料符合良好的染 料所应满足的在相同的 激发范围下可以区分细 胞的不同部分的标准(实 施例24) 3.由于该染料得自天然 产物并非合成的，其不 具有放射性(参见实施 例1，2) 4.染料可以用于制药工 业，用于制备检查细菌 污染的试剂盒(参见实 施例17-18) 5.由于该染料为细胞膜 渗透的并且对细胞无 毒，染料可以用于基于 荧光的药物或分子的原 位追踪的医学应用。 6.该染料在其单一形式 相当于6种发出相同荧光 色的不同合成荧光染 料。而早期的荧光染料 必须将这些染料混合才 视觉可见的。 9.该染料在其单一形式 相当于3种发出相同荧光 色的不同合成荧光染料 (参见实施例14-17) 10.染料可以用于快速显 微镜着色，以产生相差 效果而没有显微镜相差 部件的额外开支，并且 没有任何过分的样品固 定和保存(参见实施例 21) 11.很长时间内其荧光性 质不降低，出口时不需 要冷冻。而当前市售荧 光染料在在-20℃冷却 下出口(参见实施例18) 12.与早期得自海生海蜇 的已知绿色荧光蛋白 (GFP)不同，我们的染 料虽然也是蛋白，但非 受体基因。结果是直接 的。GFP在395nm吸收蓝 光并且在470nm的较小峰 值发出绿光。我们的染 料在三种激发波长下产 生三种荧光色(参见实 施例7) 13.染料可以溶于水，所 以可以用于需要水溶性 染料的组分。染料溶于 例如乙醇、甲醇和丙酮 的有机溶剂(参见实施 例2) 能显示这些效果(参见 实施例19-23) 7.染料可以用于快速显 微镜着色，以产生相差 效果而没有显微镜相差 部件的额外开支，并且 没有任何过分的样品固 定和保存(参见实施例 19-23) 8.很长时间内其荧光性 质不降低，出口时不需 要冷冻。而当前市售荧 光染料在在-20℃冷却 下出口(参见实施例4， 25) 9.与早期得自海生海蜇 的已知绿色荧光蛋白 (GFP)不同，我们的染 料虽然也是蛋白，但非 受体基因。结果是直接 的，并且在三种激发波 长下产生6色发射(参见 实施例6，8，13) 10.染料溶于70％乙醇 (参见实施例2) 11.该染料为负电荷蛋白 染料(参见实施例6，8， 13) 12.染料的pH值为6.8- 7.5，其几乎为中性，并 因而不会影响组合物中 最终产物的pH特性(参 见实施例6) 13.染料具有蛋白质特性 14.染料带负电荷(参见 实施例8) 15.染料的pH值为6.5， 其几乎为中性，并因而 不会影响组合物中最终 产物的pH特性(参见实 施例24) 16.染料实质上不是蛋白 质，所以在自然条件下 不可降解(参见实施例 18) 17.染料具有生物表面活 性，因而可以用于肥皂 和化妆品组合物(参见 实施例9) 18.染料具有抗微生物特 性(参见实施例10) 19.甚至在1∶40000倍的 稀释范围(亦即1g染料 粉末溶于40升超纯水 中)染料发出这些荧光 色。提取物的荧光可以 在室温下持续至少一 年。染料在不同波长激 发下的多色发射可以与 市场上的荧光显微着色 剂相比(参见实施例14) 20.该染料的蓝色荧光可 以与DAPI荧光染料在同 样激发波长发射的同样 颜色相比，后者作为生 物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记试剂盒 并且在4℃是稳定的，一 旦细胞用染料标记，细 胞的荧光性几个月内不 可降低(参见实施例4， 25) 14.染料甚至在1∶400000 或更高倍稀释下发出这 些荧光色。提取物的荧 光可以在室温下持续好 几个月。染料在不同波 长激发下的多色发射可 以与市场上的荧光显微 着色剂相比(参见实施 例19，19，22) 15.染料的蓝色荧光可以 与DAPI荧光染料在同样 激发波长发射的同样颜 色相比，后者作为生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记试剂盒的 组分(参见实施例19- 23) 16.染料的蓝色荧光可以 与Hoechest 33258发射 的颜色相比，后者作为 生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和检测 试剂盒的组分(参见实 施例19-23) 17.所述染料的蓝色荧光 可以与Hoechest 33342 荧光染料在同样激发波 的组分(参见实施例14- 17) 21.染料的蓝色荧光可以 与Hoechest 33258发射 的颜色相比，后者作为 生物化学、细胞生物学、 免疫化学和分子生物学 的非放射性标记和检测 试剂盒的组分(参见实 施例14-17) 22.所述染料的蓝色荧光 可以与Hoechest 33342 荧光染料在同样激发波 长发射的同样颜色相 比，后者作为生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和检测试剂盒的 组分(参见实施例14- 17) 23.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 24.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 长发射的同样颜色相 比，后者作为生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和检测试剂盒的 组分(参见实施例19- 23) 18.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与吖 啶橙的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分。(参见实 施例19-23) 19.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与金 胺的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例19-23) 20.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与 FITC的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例19-23) 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 25.所述染料在可见光范 围的黄色荧光可以与 FITC的相同颜色发射相 比，后者可以用于生物 化学、细胞生物学、免 疫化学和分子生物学的 非放射性标记和探测试 剂盒的组分(参见实施 例14-17) 26.橙色荧光发射可以与 碘化甲锭荧光染料的橙 色荧光色相比，后者可 以用于生物化学、细胞 生物学、免疫化学和分 子生物学的非放射性标 记和探测试剂盒的组分 (参见实施例14-17) 27.橙色荧光发射可以与 若丹明荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以 用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记 和探测试剂盒的组分(参 见实施例14-17) 28.橙色荧光发射可以与 TRITC荧光染料的橙色荧 光色相比，后者可以用 于生物化学、细胞生物 学、免疫化学和分子生 21.橙色荧光发射可以与 碘化甲锭荧光染料的橙 色荧光色相比，后者可 以用于生物化学、细胞 生物学、免疫化学和分 子生物学的非放射性标 记和探测试剂盒的组 分。(参见实施例19-23) 22.橙色荧光发射可以与 若丹明荧光染料的橙色 荧光色相比，后者可以 用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子 生物学的非放射性标记 和探测试剂盒的组分(参 见实施例19-23) 23.橙色荧光发射可以与 TRITC荧光染料的橙色荧 光色相比，后者可以用 于生物化学、细胞生物 学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和 探测试剂盒的组分(参 见实施例19-23) 24.与用于相同目的的商 用染料不同，本染料在 室温是稳定的，并有长 的搁置寿命。本染料的 分子放射性试剂盒可以 在室温下出口(参见实 施例19-23) 25.所述单一染料具有至 少123种当前市场已有的 不同荧光染料的特性 物学的非放射性标记和 探测试剂盒的组分(参 见实施例14-17) 29.与用于相同目的的商 用染料不同，本染料在 室温是稳定的，并有长 的搁置寿命。本染料的 分子放射性试剂盒可以 在室温下出口(参见实 施例18) 30.所述单一染料具有至 少123种当前市场已有的 不同荧光染料的特性 (DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、 金胺、若丹明、TRITC和 碘化甲锭等)。 31.染料在显微镜的通常 光下，灰色的色彩产生 相差效果，这对快速筛 选细胞遗传学、细胞学 和组织化学载物片是有 用的，并可以节省额外 的补充显微镜相位差的 成分的费用。荧光颜色 的发射服从斯托克定 律。 32.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到蓝色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。 (DAPI、Hoechest 33258、Hoechest 33342、FITC、吖啶橙、 金胺、若丹明、TRITC和 碘化甲锭等)(参见实 施例19-23) 26.染料在显微镜的通常 光下，灰色的色彩产生 相差效果，这对快速筛 选细胞遗传学、细胞学 和组织化学载物片是有 用的，并可以节省额外 的补充显微镜相位差的 成分的费用。荧光颜色 的发射服从斯托克定 律。(参见实施例19-23) 27.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到蓝色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩(参见实 施例19-23) 28.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到黄色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。当通过 外部荧光显微镜看到橙 色荧光时，在显微照相 中也出现红色色彩(参 见实施例19-23) 29.细胞遗传载物片在所 33.柯达胶片显微照片显 示邻近色发射波长的色 彩。因此，当通过外部 荧光显微镜看到黄色荧 光时，在显微照相中也 出现绿色色彩。当通过 外部荧光显微镜看到橙 色荧光时，在显微照相 中也出现红色色彩。 34.细胞遗传载物片在所 有荧光下观察产生具有 背景的细胞染色效果， 其中没有样本仅仅存在 染料。 35.染料可以用于制备显 示荧光色的聚乙烯氯 膜。也可以用于各种涂 料、油墨、织物的荧光 染色。 36.染料可以用于漂白和 增亮聚合体的荧光染料 组分。染料可以用于全 谱荧光染料的泄漏检 查。染料可以用于自动 化学测量系统。其也可 以用于标记坠毁飞机、 救生艇和军事装备如火 箭的位置。并且也可以 用于海底探测器。染料 可以用于皮肤癌的照相 化疗。 37.染料可以作为美容霜 和洗液中色素细胞的防 晒组分。 有荧光下观察产生具有 背景的细胞染色效果， 其中没有样本仅仅存在 染料(参见实施例19- 23) 30.染料可以用于制备显 示荧光色的聚乙烯氯 膜。也可以用于各种涂 料、油墨、织物的荧光 染色。 31.染料可以用于漂白和 增亮聚合体的荧光染料 组分。染料可以用于全 谱荧光染料的泄漏检 查。染料可以用于自动 化学测量系统。其也可 以用于标记坠毁飞机、 救生艇和军事装备如火 箭的位置。并且也可以 用于海底探测器。染料 可以用于皮肤癌的照相 化疗。 32.染料可以在原位杂交 应用试剂盒的荧光材 料，作为分子探针。其 也可以用于生物化学、 细胞生物学、免疫化学 和分子生物学的非放射 性标记和探测试剂盒的 组分，用于DNA、RNA、 蛋白质和酶的标记、免 疫荧光法探测、DIG-标 记的低聚核苷酸探针和 抗DIG Fab-片断的染 38.染料的水溶性特性可 以使其易于在补湿器中 混合。染料可以在原位 杂交应用试剂盒的荧光 材料，作为分子探针。 其也可以用于生物化 学、细胞生物学、免疫 化学和分子生物学的非 放射性标记和探测试剂 盒的组分，用于DNA、 RNA、蛋白质和酶的标 记、免疫荧光法探测、 DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断 的染色、流动血细胞计 数中用于单一和多细胞 荧光定量、外部荧光显 微镜法的荧光着色剂。 39.染料可以用于健康食 品工业、化妆品工业、 药物和化学工业中快速 检查生物污染，用于快 速测定田间条件下的生 物污染物。其也可以用 于胆碱酯酶的竞争性抑 制物。 40.染料可以用于抗微生 物组合物 41.染料可以在化妆品组 合物中用作生物表面活 性剂 42.染料可以用于天然着 色剂。 色、流动血细胞计数中 用于单一和多细胞荧光 定量、外部荧光显微镜 法的荧光着色剂。 33.染料可以用于健康食 品工业、化妆品工业、 药物和化学工业中快速 检查生物污染，用于快 速测定田间条件下的生 物污染物(参见实施例 24) 34.染料可以用于天然着 色剂 35.染料可以在医学、生 物化学、农业和水产养 殖科学中用于提高受精 率(参见实施例14，15) 此处所述 a.制备显示荧光色的韧性 a.在各种涂料、油墨。织 3种天然 荧光染料 的特定用 途 聚乙烯氯薄膜 b.在各种涂料、油墨。织 物中用作荧光色素 c.用于漂白和增亮聚合体 的荧光染料组分 d.用于全谱荧光染料的泄 漏检查 e.用于自定化学测量系统 f.标记坠毁的飞机、救生 船和军事装备如火箭的位 置 g.水下探测器 h.UVA用于皮肤癌的照相化 疗 i.美容霜和洗液中色素细 胞的防晒组分 j.水溶性特性可以使其易 于在补湿器中混合 k.在原位杂交应用试剂盒 的荧光材料，作为分子探 针 l.用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和探 测试剂盒的组分，用于 DNA、RNA、蛋白质和酶的 标记 m.荧光免疫检测 n.DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的 复染色 o.单或多重流式细胞计应 用 p.用于外部荧光显微镜的 物中用作荧光色素 b.在各种涂料、油墨。织 物中用作荧光色素 c.用于全谱荧光染料的泄 漏检查 d.用于自定化学测量系统 e.标记坠毁的飞机、救生 船和军事装备如火箭的位 置 f.水下探测器 g.在原位杂交应用试剂盒 的荧光材料，作为分子探 针 h.用于生物化学、细胞生 物学、免疫化学和分子生 物学的非放射性标记和探 测试剂盒的组分，用于 DNA、RNA、蛋白质和酶的 标记 i.荧光免疫检测 j.DIG-标记的低聚核苷酸 探针和抗DIG Fab-片断的 复染色 k.单或多重流式细胞计应 用 l.用于外部荧光显微镜的 荧光染色(参见实施例 19-23) m.在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业 中快速检查生物污染(参 见实施例22)。 n.在实验室条件下生物污 染的快速判断(参见实施 荧光染色 q.在健康食品工业、化妆 品工业、药物和化学工业 中快速检查生物污染。 r.在实验室条件下生物污 染的快速判断 s.在田间条件下生物污染 的快速测定 t.胆碱酯酶的竞争性抑制 物 u.用于抗微生物组合物(参 见实施例10) v.作为化妆品组合物中的 生物表面活性剂 w.天然着色剂 x.海产染料在超纯水中以 1∶400000的比例得到的生 物活性组合物，以得到六 种不同波长的六色荧光和 投射光下的相差效果(参 见实施例14) y.用于各种在零下温度范 围进行的荧光应用的染料 例22) o.在田间条件下生物污染 的快速测定(参见实施例 22) p.凝集组合物(参见实施 例12，15) q.天然着色剂 r.海产染料在超纯水中以 1∶400000的比例得到的生 物活性组合物，以得到六 种不同波长的六色荧光和 投射光下的相差效果(参 见实施例18，19，22) s.用于各种在零下温度范 围进行的荧光应用的染料 t.在水产养殖中用于增加 受精率(参见实施例14， 15) u.用于细胞渗透膜染料组 合物 v.在组织培养中用于识别 死细胞和活细胞(参见实 施例24) w.在食品工业中用于识别 死细胞/细菌和活细胞/细 菌(参见实施例24) x.用于生物传感器中的染料 组合物 y.作为分子和微生物试剂盒 中的燃料组合物(参见实施 例24)
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